DIPLOMSKI SEMINAR

PROIZVODNJA TERAPEVTSKIH PROIZVODNJA TERAPEVTSKIH PROTEINOV V MLEKUPROTEINOV V MLEKU

(gene pharming) (gene pharming)

Avtorica: Urška DOLINAR Mentor: Peter DOVČAvtorica: Urška DOLINAR Mentor: Peter DOVČ

“Gene pharming” predstavlja proizvodnjo terapevtskih proteinov v transgenih živalih kot so: govedo, ovce, koze, svinje in kunci.

Terapevtski proteini imajo visoko biomedicinsko uporabnost v zdravljenju bolezni in vključujejo: hormone, rastne faktorje, protitelesa, cepiva in faktorje strjevanja krvi.

1987 - Proteini, ki običajno niso prisotni v mleku, se lahko izražajo v mlečni žlezi transgenih miši- tPA

1989 - prvo transgeno tele Herman z genom za človeški laktoferin.

1990 - Izražanje IL-2 v mleku transgenih kuncev. 1991 - Ovca Tracy z genom za človeški α-1-antitripsin 1997- Krava Rossie izloča človeški α- laktalbumin v mleko

MLEKO je najboljši bioreaktor : ni nevarnosti prenosa virusnih okužb (HIV, Hep.C) čist, enostaven in higieničen produkt čiščenje in izolacija poceni in nezahtevna enostavno zbiranje in dostopnost v velikih količinah količina izločenih proteinov večja kot v ostalih sistemih večje količine proteinov nimajo vpliva na zdravje živali

MLEČNA ŽLEZA je najboljše produkcijsko tkivo: visoka učinkovitost sinteze velika količina izraženih proteinov nižja cena sinteze v primerjavi s celičnimi kulturami

Z njim dosežemo izražanje tujega proteina specifično v mlečni žlezi transgene živali.

Sestavljen iz: tkivno specifičnega promotorja za mlečni protein tkivno specifičnega promotorja za mlečni protein (delujejo medvrstno)kodirajoče sekvence želenega proteina

ODVISNA OD: časa do 1. laktacije količine mleka stopnje ekspresije sekrecije proteinov izvedljivosti in cene gojenja

KunciKunci: najmanjši,najlažje vzdrževaniGovedoGovedo: najdražja, najdaljši čas vzrejeOvce in kozeOvce in koze: idealne za proizvodnjo večjih količin mleka, nezahtevne za rejo.

Lahko proizvedejo do 30g/L proteina, 100L letno = 3kg terapevtske učinkovine.

Superovulacija (LH, FSH) Mikroinjiciranje / lentiviralni vektorji Preverjanje integracije transgena (PCR, markerji GFP) Embrio transfer Ekspresija in sekrecija proteinov

Podrazred retrovirusov

Odstranimo gene za replikacijo in jih zamenjamo z želenim transgenom → virus po vgraditvi v genom ni infektiven.

Za proizvodnjo 3 komponente: vektorski konstrukt, konstrukt vektorski konstrukt, konstrukt pakiranja in konstrukt ovojnice.pakiranja in konstrukt ovojnice.

Plazmide vstavimo v celice odgovorne za pakiranje, ki producirajo lentiviruse.

Prednosti metode:Prednosti metode: velik genom in zmožnost prenosa večjih konstruktov, transfekcija več zarodkov hkrati, širok spekter tarčnih gostiteljskih celic, prenos DNA v občutljive celice in celice, ki se ne delijo 4X večja učinkovitost od mikroinjiciranja mestno specifična in stabilna integracija ene kopije transgena.

Slabosti metode:Slabosti metode: dolgotrajnost priprave velikih količin rekombinantnih lentivirusov, lahko povzročajo infekcijske bolezni, če niso pravilno oslabljeni, potrebna uporaba laboratorija 3. varnostne stopnje.

Proteini, proizvedeni v mlečni žlezi transgenih živali morajo biti: enostavni za identifikacijo, čisti, učinkoviti, skladni s predpisi in varni za uporabo.

Specifičnost čiščenja je odvisna od proteina in sprejemljivih stopenj čistosti, ki so določene z namenom uporabe.

Več kot 130 proteinov je odobrenih za klinično uporabo s strani FDA, veliko več jih je v razvoju.

FAKTORJI STRJEVANJA KRVI FAKTORJI STRJEVANJA KRVI (hFVII, hFVIII, hFIX)(hFVII, hFVIII, hFIX)uporaba v zdravljenju hemofilije A, B in Cv začetku izolirani iz človeške krvne plazme danes proizvedeni v transgenih živalih

ANTIKOAGULANTI ANTIKOAGULANTI (hPC, hAT-III, htPA)(hPC, hAT-III, htPA)preprečujejo strjevanje krvi. uporabni pri zdravljenju tromboze, pljučnega embolizma, miokardnega infarkta, kapi, sepse, ledvičnih in jetrnih bolezni.

RASTNI FAKTORJI IN HORMONI RASTNI FAKTORJI IN HORMONI (hGH, hEPO)(hGH, hEPO) stimulirajo celično rast, proliferacijo in diferenciacijo. običajno proteini ali steroidni hormoni. hematopoetski proteini omogočajo zorenje krvnih celic. Uporabljamo jih

pri zdravljenju anemij, ki so posledica kronične ledvične odpovedi, presaditve organov ali kemoterapije pri zdravljenju raka.

PLAZEMSKI IN PROTIVNETNI PROTEINI PLAZEMSKI IN PROTIVNETNI PROTEINI (hSA, hLF, hα1AT)(hSA, hLF, hα1AT) Imajo antibakterijsko, antivirusno, antiparazitsko, protitumorsko

antialergijsko, antioksidativno in imunomodulativno učinkovitost. Lahko se uporabljajo kot prehransko dopolnilo. hSA hSA ohranja osmotski tlak in obnavlja kroženje volumna krvi. Uporablja

se v terapiji šoka, hudih opeklin in nezgodni kirurgiji. Alfa-1- antitripsin Alfa-1- antitripsin deluje protivnetno, zdravi pljučne bolezni in ciroze,

emifizme in cistično fibrozo.

Pred administracijo mora biti potrjena njihova varnost in učinkovitost.

Predklinična testiranjaPredklinična testiranja: preverjanje biokemijskih, toksičnih in farmakinetičnih lastnosti. Zbiranje podrobnih informacij o viru in namenu proizvodnje.

Klinični testiKlinični testi : Faza IFaza I: testiranje na stranske učinke zdravila na majhnem številu zdravih

ljudi. Faza IIFaza II: pacienti in kontrolne skupine za nadaljnje vrednotenje varnosti in

učinkovitosti. Faza IIIFaza III: vrednotenje na veliko večjih skupinah pacientov in kontrol ter

določitev predlagane uporabe in doziranja.

Sledi odobritev za klinično uporabo. odobritev za klinično uporabo. Faza IVFaza IV: določanje vpliva dolgoročnega apliciranja na paciente.

Prvi transgeni produkt, odobren za terapevtsko uporabo je antitrombin III antitrombin III (2006, GTC Biotherapeutics).(2006, GTC Biotherapeutics). Zaključil je III. fazo kliničnega preizkušanja v ZDA .

Drugi je produkt PPL therapeutics, α-1- antitripsin. Prešel je II. fazo kliničnih testiranj pri pacientih s cistično fibrozno (vendar še ni bil potrjen s strani FDA).

Za proizvodnjo v smeri »pharminga« niso razlog le manjši stroški, ampak tudi dostopnost zdravila v zadostni količini.

HVALA ZA VAŠO POZORNOSTHVALA ZA VAŠO POZORNOST

Iskrena hvala g. mentorju prof. dr. Petru Dovču, ki me je usmerjal med pisanjem diplomskega seminarja.

Hvaležna sem družini in fantu za nesebično podporo, prijateljem, ki so me tolažili in me nasmejali, ko ni šlo vse kot po maslu.

Iz srca se zahvaljujem Vsem,ki ste me spremljali na poti mojega študija.