Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERZA V LJUBLJANI
FAKULTETA ZA FARMACIJO
MIA ŠPIRANEC
DIPLOMSKA NALOGA
VISOKOŠOLSKI STROKOVNI ŠTUDIJ LABORATORIJSKE
BIOMEDICINE
Ljubljana, 2011
UNIVERZA V LJUBLJANI
FAKULTETA ZA FARMACIJO
MIA ŠPIRANEC
PRIMERJAVA DVEH POSTOPKOV
IZOLACIJE DNA IZ VEČJIH VOLUMNOV
POLNE KRVI
COMPARISON OF TWO PROCEDURES
FOR DNA ISOLATION FROM LARGER
VOLUMES OF WHOLE BLOOD
Ljubljana, 2011
Diplomsko delo sem opravljala na Katedri za klinično biokemijo Fakultete za
farmacijo pod mentorstvom doc. dr. Barbare Ostanek, mag. farm.
Zahvale
Zahvaljujem se mentorici doc. dr. Barbari Ostanek, mag. farm. za uvajanje v
laboratorijsko delo, koristne nasvete pri praktičnem in pisnem delu. Zahvala
gre tudi vsem zaposlenim na Katedri za klinično biokemijo za pomoč pri
laboratorijskem delu.
Posebno zahvalo posvečam tudi svoji druţini, ki me je spodbujala skozi
celoten študij. Zahvaljujem se fantu Romanu, ki mi je stal ob strani in me
spodbujal pri samemu izvajanju diplomske naloge.
Izjava
Izjavljam, da sem diplomsko delo samostojno izdelala pod mentorstvom doc.
dr. Barbare Ostanek, mag. farm.
Mia Špiranec
Ljubljana, 2011
Predsednik diplomske komisije: izr. prof. dr. Vojko Kmetec
Članica diplomske komisije: doc. dr. Anamarija Zega
I
VSEBINA
KAZALO SLIK ............................................................................................................................................... III
KAZALO PREGLEDNIC ............................................................................................................................... IV
POVZETEK ...................................................................................................................................................... V
SEZNAM OKRAJŠAV ................................................................................................................................... VI
1 UVOD ....................................................................................................................................................... 1
1.1 STRUKTURA MOLEKULE DNA ......................................................................................................... 1
1.2 VLOGA DNA V ORGANIZMU ........................................................................................................... 2
1.2.1 PODVOJEVANJE DNA ALI REPLIKACIJA ....................................................................................... 2
1.2.2 PREPISOVANJE GENOV ALI TRANSKRIPCIJA ............................................................................... 3
1.2.3 PREVAJANJE ALI TRANSLACIJA ................................................................................................... 4
1.2.4 SPREMEMBE NUKLEOTIDNEGA ZAPOREDJA IN DIAGNOSTIČNI POMEN DNA .......................... 4
1.3 IZOLACIJA DNA ............................................................................................................................... 6
1.3.1 BIOLOŠKI VZORCI ZA IZOLACIJO ................................................................................................. 6
1.3.2 METODE ZA IZOLACIJO DNA Z VEČJIM VOLUMNOM POLNE KRVI ............................................ 7
1.3.3 SHRANJEVANJE VZORCEV PRED IZOLACIJO IN SHRANJEVANJE IZOLIRANE DNA ..................... 11
1.4 KARAKTERIZACIJA IZOLIRANE DNA ............................................................................................... 13
1.4.1 KONCENTRACIJA IN ČISTOTA IZOLIRANE DNA ......................................................................... 13
1.4.2 VELIKOST IZOLIRANE DNA ....................................................................................................... 13
2 NAMEN DELA ...................................................................................................................................... 16
3 MATERIALI IN METODE.................................................................................................................... 17
3.1 MATERIALI .................................................................................................................................... 17
3.1.1 BIOLOŠKI VZORCI ..................................................................................................................... 17
3.1.2 REAGENTI ................................................................................................................................. 17
3.1.3 LABORATORIJSKA OPREMA IN MATERIALI .............................................................................. 21
3.2 METODE ....................................................................................................................................... 24
3.2.1 IZOLACIJA VZORCEV GENOMSKE DNA Z REAGENČNIM KOMPLETOM FLEXIGENE DNA KIT ... 24
II
3.2.2 IZOLACIJA VZORCEV GENOMSKE DNA Z REAGENČNIM KOPLETOM DNA ISOLATION KIT FOR
MAMMALIAN BLOOD ............................................................................................................................. 26
3.2.3 OCENA VELIKOSTI IZOLIRANE DNA .......................................................................................... 29
3.2.4 MERJENJE KONCENTRACIJE IN ČISTOTE IZOLIRANE DNA ........................................................ 32
3.2.5 STATISTIČNA ANALIZA ............................................................................................................. 34
4 REZULTATI IN RAZPRAVA ............................................................................................................... 35
4.1 IZOLACIJA GENOMSKE DNA Z REAGENČNIM KOMPLETOM FLEXIGENE DNA KIT......................... 35
4.1.1 DODATEK 200 µL FG3 PUFRA IN PONOVNO INKUBIRANJE ZA 1 URO PRI 65°C ....................... 35
4.1.2 CENTRIFUGIRANJE PRI 2500 X G IN CENTRIFUGIRANJE PRI 4000 X G ..................................... 36
4.1.3 OPTIMIRANI POSTOPEK .......................................................................................................... 36
4.2 IZOLACIJA GENOMSKE DNA Z REAGENČNIM KOMPLETOM DNA ISOLATION KIT FOR
MAMMALIAN BLOOD .................................................................................................................................. 37
4.2.1 CENTRIFUGIRANJE PRI 4600 X G .............................................................................................. 37
4.2.2 OBARJANJE DNA PRI RAZLIČNIH TEMPERATURAH REAGENTOV ............................................. 39
4.2.3 OPTIMIRANI POSTOPEK ........................................................................................................... 40
4.3 ELKTROFOREZA IZOLIRANE DNA .................................................................................................. 41
4.3.1 IZOLIRANA GENOMSKA DNA Z REAGENČNIM KOMPLETOM FLEXIGENE DNA KIT .................. 41
4.3.2 IZOLIRANA GENOMSKA DNA Z REAGENČNIM KOMPLETOM DNA ISOLATION KIT FOR
MAMMALIAN BLOOD ............................................................................................................................. 42
4.4 PRIMERJAVA OBEH METOD ZA IZOLACIJO DNA ........................................................................... 42
5 SKLEP .................................................................................................................................................... 44
6 LITERATURA ....................................................................................................................................... 45
III
KAZALO SLIK
Slika 1: Kemijska struktura adenina, gvanina, timina in citozina ...................................................... 1
Slika 2: Prikaz dvojne vijačnice DNA . ............................................................................................. 2
Slika 3: Grafični prikaz podvojevanja ............................................................................................... 3
Slika 4: Pripomočki potrebni za izolacijo z reagenčnim kompletom Flexigene DNA kit.. ............. 19
Slika 5: Pripomočki potrebni za izolacijo z reagenčnim kompletom DNA isolation kit for
Mammalian Blood. ........................................................................................................................... 20
Slika 6: Centrifuga 5804 R (EPPENDORF). ................................................................................... 22
Slika 7: Vodna kopel ( BIOSAN). ................................................................................................... 22
Slika 8: Sušenje izolirane DNA na zraku. ........................................................................................ 26
Slika 9: Obarjanje proteinov. ........................................................................................................... 29
Slika 10: Elektroforeza izolirane DNA. ........................................................................................... 30
Slika 11: Naprava za merjenje koncentracije in čistosti izolirane DNA-spektrofotometer. ............ 33
Slika 12: Grafični prikaz meritve koncentracije izolirane DNA. ..................................................... 34
Slika 13: Elektroforeza izolirane DNA na 2% agaroznem gelu pri Flexigene DNA kit reagenčnem
kompletu. .......................................................................................................................................... 41
Slika 14: Elektroforeza izolirane DNA na 2% agaroznem gelu pri reagenčnem kompletu DNA
isolation kit for Mammalian Blood. ................................................................................................. 42
IV
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica I: Prikaz tipičnega izkoristka izolirane DNA pri reagenčnem kompletu
Flexigene DNA Kit……………………………………………………………………….10
Preglednica III: Prikaz izkoristka izolirane DNA pri reagenčnem kompletu DNA isolation
kit for Mammalian Blood…………………………………………………………………11
Preglednica III: Prikaz temperaturnih in časovnih zahtev za shranjevanje DNA………...12
Preglednica IV: Rezultati koncentracije in čistosti izolirane DNA pri valovni dolţini 260
nm in 280 nm in njunega razmerja A260/A280 pri optimiranem postopku z reagenčnim
kompletom Flexigene DNA kit…………………………………………………………...38
Preglednica V: Rezultati merjenja koncentracije in čistosti DNA pri valovni dolţini 260
nm in 280 nm in njunega razmerja A260/A280 po centrifugiranju pri 4600 x g z
reagenčnim kompletom DNA isolation kit for Mammalian Blood……………………….39
Preglednica VI: Rezultati merjenja koncentracije in čistosti DNA pri valovni dolţini 260
nm in 280 nm in njunega razmerja A260/A280 pri različnih temperaturah reagentov z
reagenčnim kompletom DNA isolation kit for Mammalian Blood……………………….41
Preglednica VII: Rezultati merjenja koncentracije in čistosti izolirane DNA pri valovni
dolţini 260 nm in 280 nm in njunega razmerja A260/A280 pri optimiranem postopku z
reagenčnim kompletom DNA isolation kit for Mammalian Blood……………………….41
V
POVZETEK
Predpogoj za uspešno genetsko preiskavo je izolacija zadostne količine čiste in kakovostne
DNA, na kar vplivajo vrsta in količina biološkega vzorca ter uporabljena metoda za
izolacijo. V osnovi pri vsaki izolaciji v prvi stopnji razbijemo posamezne celice ali celice
tkiva. V naslednji stopnji sprostimo DNA iz kompleksov s histonskimi proteini. Nato v
ločenih stopnjah odstranimo ostanke celic, proteine, majhne molekule in neţelene
nukleinske kisline. Postopki za izolacijo določenega tipa nukleinske kisline, plazmidne
DNA, virusne DNA, kromosomske DNA iz celic oziroma iz določenega tkiva so lahko
različni, imajo pa tudi nekatere skupne značilnosti.
Namen našega dela je, da iz vzorcev polne krvi pridobimo čimveč in čimbolj čisto in
kakovostno DNA, ki bo uporabna za nadaljnje genetske preiskave. Zato smo optimirali
postopek izolacije z reagenčnima kompletoma Flexigene DNA kit in DNA isolation kit for
Mammalian Blood. Z vsakim od reagenčnih kompletov smo z optimiranim postopkom
izolirali DNA iz 20 vzorcev polne krvi ter primerjali njeno količino in kakovost.
Primerjali smo tudi enostavnost izvedbe in čas, potreben za izvedbo postopka z enim in
drugim reagenčnim kompletom.
Uporabili smo zamrznjene vzorce polne krvi bolnikov odvzete z antikoagulantom EDTA.
Čistost in koncentracijo izolirane DNA smo določili z merjenjem absorbance na
spektrofotometru pri 260 nm in 280 nm ter z opredelitvijo razmerja A260/A280. Velikost
izolirane DNA smo določili z elektroforezo na agaroznem gelu.
Dobili smo razmerje absorbanc pri reagenčnem kompletu Flexigene DNA kit pri
A260/A280 od 1,77 do 1,87. Količina izolirane DNA je bila od 35,67 µg do 215,23 µg in
mediana (25 in 75 percentil) 97,01 (68,38−140,70). Pri reagenčnem kompletu DNA
isolation kit for Mammalian Blood pa je bilo razmerje absorbanc A260/A280 od 1,53 do
2,34. Količina izolirane DNA je bila od 1,14 µg do 70,74 µg in mediana (25 in 75
percentil) 42,27 (37,43−48,87).
Pri reagenčnem kompletu Flexigene DNA kit smo dobili višje koncentracije in večjo
količino izolirane DNA, na podlagi tega smo zaključili, da je za pridobitev čimveč in
čimbolj čiste izolirane DNA, primernejši komplet reagentov Flexigene DNA kit.
VI
SEZNAM OKRAJŠAV
DNA deoksiribonukleinska kislina
RNA ribonukleinska kislina
EDTA etilendiamintetraocetna kislina
TRIS tris (hidroksimetil) aminometan
TRIS-HCl tris hidroklorid
PCR
veriţna reakcija s polimerazo (polymerase
chain reaction)
TE tris EDTA
TAE tris-acetat-EDTA
TBE tris-borat-EDTA
TPE tris-fosfat-EDTA
UV ultravijolična svetloba
DNA-za deoksiribonukleaza
RNA-za ribonukleaza
SDS
natrijev dodecilsulfat (natrium dodecyl
sulfate)
1
1 UVOD
1.1 STRUKTURA MOLEKULE DNA
Nukleinske kisline je prvič izoliral Friedrich Miescher leta 1869 in jih tako poimenoval
zaradi tega, ker jih je našel v jedru levkocitov. Končna potrditev osrednje vloge te
molekule v biologiji pa je prišla leta 1953, ko sta James Watson in Francis Crick
odkrila njeno strukturo, kar je pomenilo tudi rojstvo sodobne molekularne biologije (1).
Vsaka od obeh verig je sestavljena iz različnih zaporedij njenih gradbenih elementov,
štirih vrst nukleotidov, ki jih označujemo s črkami A, T , G in C. Iz energijskih in
prostorskih razlogov se med seboj lahko povezujejo le eni in isti komplementarni
nukleotidi A s T in G s C, ki na ta način sestavljajo bazne pare A-T in G-C. Med A in T
sta dve vodikovi vezi, med G in C pa tri vodikove vezi (2). V RNA (ribonukleinska
kislina) timin nadomešča uracil.
Nukleinske kisline so visokomolekularni linearni polinukleotidi. Njihovi osnovni
gradniki so nukleotidi. Vsak nukleotid je sestavljen iz sladkorja deoksiriboze, fosfata in
purinske ali pirimidinske baze (Slika1). Purina sta adenin in gvanin, pirimidina pa sta
citozin in timin (3, 4).
Slika 1: Kemijska struktura adenina, gvanina, timina in citozina (5).
2
Nukleotidi se v linearno polimerno verigo povezujejo preko fosfodiesterskih vezi. Te
nastanejo, ko se dva nukleotida poveţeta preko 5'-fosfata in 3'-hidroksilne skupine.
DNA običajno najdemo v obliki dvojne vijačnice (Slika 2) (6). Pari komplementarnih baz
so v istih ravninah ter so stopničasto razporejeni drug nad drugim, podobno kot si v
polţastem stopnišču v enaki razdalji in pod enakim kotom druga za drugo sledijo stopnice.
Taka struktura je najbolj stabilna, saj v njej ni napetosti, ki bi jih povzročale neenake
razdalje in različni koti. Verigi dvoveriţne DNA sta orientirani antiparalelno (5'-konec ene
verige se poveţe s 3'-koncem druge), njuni nukleotidni zaporedji pa sta komplementarni
(3, 4).
Slika 2: Prikaz dvojne vijačnice DNA (7).
1.2 VLOGA DNA V ORGANIZMU
1.2.1 PODVOJEVANJE DNA ALI REPLIKACIJA
Pred delitvijo celice si mora celica zagotoviti, da ji bosta hčerinski celici genetsko enaki.
Zato se vse molekule DNA pred delitvijo celice podvojijo. Ker sta rezultat podvajanja
molekule DNA dve enaki kopiji DNA, v katerih je ena veriga stara ena pa nova, tako
podvajanje imenujemo samoohranjevalno (semikonzervativno). Začetno mesto podvajanja
je krajše zaporedje nukleotidov v molekuli DNA, imenovano ori (iz angleške besede
origin-začetek) (8). Te odvijejo in razklenejo dvojno verigo DNA. Mesto razhajanja dvojne
verige DNA imenujemo podvojevalne vilice, področje razklenjene DNA za njo pa
podvojevalni mehurček. Sem najprej pride encim primaza in na eno od obeh sproščenih
verig DNA (vodilna veriga) doda kratek komplementaren košček RNA (ribonukleinska
3
kislina), oligonuklotidni začetnik, iz katerega nato iz dveh podenot sestavljeni encim
polimeraza DNA, ki začne slediti napredujočim podvojevalnim vilicam, s svojo prvo
podenoto nadaljuje sintezo komplementarne verige: na vodilne verige dodaja
komplementarne deoksinuklotide - kjer je v enojni DNA- verigi A, se bo vezal T; kjer je T
se bo vezal A; kjer je G, se bo vezal C; in kjer je C, se bo vezal G. Ob matrični DNA se
tako v smeri 5'→3' izgrajuje dvojna veriga DNA (Slika 3). Kot ţe rečeno, podvojevalni
proteini zagotavljajo, da se podvojevalne vilice, kjer sta matrični verigi DNA ločeni,
pomikajo naprej, pred napredujočo DNA-polimerazo − podobno kot bi odpirali zadrgo (4).
Slika 3: Grafični prikaz podvojevanja (9).
1.2.2 PREPISOVANJE GENOV ALI TRANSKRIPCIJA
Gen se začne izraţati s prepisovanjem. Samo izraţanje gena pomeni nastajanje njegovega
produkta, ki je funkcionalen, kar pomeni, da v celici ali izven nje opravlja svojo biološko
vlogo. Sproţilni dejavniki za izraţanje posameznega gena so molekule, ki se s svojo obliko
prilegajo k značilni obliki regulacijskega zaporedja gena (promotor), se tja veţejo in
izpostavijo začetek gena, da se nanj veţe encim polimeraza RNA. Sinteza RNA v celici
poteka prav tako po principu komplementarnosti baz, pri tem se informacija DNA prepiše
v zaporedje baz v RNA, zato ta proces imenujemo transkripcija (10). Pri transkripciji se
posamezne verige DNA ločijo v omejenem območju in prepiše se samo ena veriga,
imenovana kodogena veriga (3, 4).
4
1.2.3 PREVAJANJE ALI TRANSLACIJA
Prevajanje zaporedja nukleotidov v zaporedje aminokislin poteka na ribosomih.
Genska informacija (zaporedje deoksinukleotidov nekega gena), ki se je prepisala v
zaporedje mRNA (informacijska RNA), sluţi kot matrica za sintezo proteinov. Pri
prokariontih nastaja mRNA v citoplazmi, pri evkariontih pa pride vanjo iz celičnega jedra.
Njen začetek prepozna mala podenota ribosoma, jo pritegne k sebi in izpostavi njen triplet
nukleotidov-startno mesto sinteze proteina (11). Nato se nanjo veţe še velika ribosomska
podenota in ribosom je sestavljen. Začne se premikati vzdolţ matrične mRNA od prvega
nukleotidnega tripleta do naslednjega in tako naprej, in jih izpostavlja prihajajočim tRNA
(prenašalna RNA), ki prenašajo ustrezne aminokisline. Te se med seboj spajajo v peptidno
verigo, vse do končnega nukleotidnega tripleta mRNA, ki ne ustreza namreč nobeni od
aminokislin prinašajočih tRNA. Veriga aminokislin je sestavljena in sinteza proteina je
končana (3, 4).
1.2.4 SPREMEMBE NUKLEOTIDNEGA ZAPOREDJA IN DIAGNOSTIČNI
POMEN DNA
Spremembe nukleotidnega zaporedja delimo na mutacije in polimorfizme. V medicini se
za tiste spremembe, ki povzročajo bolezni, najpogosteje uporablja izraz mutacija. Mutacija
je vsaka sprememba v strukturi DNA (razen tistih, ki nastanejo zaradi normalne
rekombinacije med mejozo), ki je različni popravljalni mehanizmi ne odstranijo, in tako
postane stalna ter se prenaša na hčerinske celice ali celo na naslednje generacije potomcev.
Glede na velikost, delimo mutacije na:
genske mutacije: obsegajo manjše spremembe v zgradbi gena. Nukleotidi, ki ga
sestavljajo, se lahko zamenjajo, nekateri lahko izpadejo oziroma se vrinejo v verigo
nukleotidov (3,12).
kromosomske mutacije: povzročijo hude posledice v nadaljnjem razvoju
organizma, do njih pa največkrat pride med delitvijo celice (3,12). Vključujejo:
- Delecije segmenta z enega ali več kromosomov.
- Inverzija enega ali več kromosomskih segmentov.
- Premestitev (translokacija) segmenta kromosoma z enega mesta na drugo na
istem ali na drugem kromosomu.
5
- Podvojitev segmentov enega ali več kromosomov (13).
genomske mutacije: pri teh mutacijah pride do velikih sprememb genoma. Kadar
se pomnoţi celotna garnitura kromosomov, govorimo o poliploidiji. Bolj pogosto
pa se poveča ali zmanjša število le nekaterih kromosomov. Takrat govorimo o
anevploidijah (3,11,12,13).
Če do mutacije pride v telesni (somatski) celici in se ta med celično delitvijo prenese le na
hčerinske telesne celice, nastane skupek mutiranih celic, v organizmu omejeno, tako
imenovano mutirano območje (na primer tumor) in taki mutaciji pravimo somatska
mutacija. Govorimo o genetski oziroma genski okvari ali nepravilnost, ki ima za posledico
genetsko/gensko pogojene bolezni in motnje.
Če pa do mutacije pride v kličnih oziroma spolnih celicah, se ta prenese v vse celice
bodočega organizma, tako mutacijo imenujemo zarodna mutacija. Zarodna mutacija je
lahko pridobljena in bolezen, ki je njena posledica, do tega trenutka ni bila v bolnikovi
druţini. Lahko pa je podedovana, kar pomeni, da je navzoča v vseh telesnih in kličnih
celicah enega ali obeh staršev, govorimo torej o druţinski obliki bolezni. V primeru
prirojene genetske/genske okvare je tako posledica dedna genetska bolezen ali motnja, saj
izraz vsebuje tudi pojem dedovanja ( 14).
Analiza DNA postaja nepogrešljiv del laboratorijske diagnostike na številnih področjih.
Pomembna je za dokazovanje bolezenskih mutacij pri monogenskih boleznih, pri rakavih
obolenjih, za ugotavljanje nagnjenosti h kompleksnim boleznim, izbiro zdravil in
spremljanje uspešnosti zdravljenja z njimi, detekcijo himerizma pri spremljanju uspešnosti
transplantacije kostnega mozga, ugotavljanju spola, dokazovanju očetovstva (15,16).
6
1.3 IZOLACIJA DNA
1.3.1 BIOLOŠKI VZORCI ZA IZOLACIJO
DNA kot analit lahko izoliramo iz različnih bioloških vzorcev, kot so: polna kri, levkociti
plazma, krvne celice, serum, likvor, različna tkiva, kostni mozeg, blato, celične kulture,
bakterije, sekreti, ekskreti, celice bukalne sluznice. Pod pojmom izolacija razumemo
osamitev čiste nukleinske kisline iz prej naštetih vzorcev. Za potrebe sodne medicine lahko
DNA izoliramo tudi iz drugih bioloških materialov, kot so: krvni madeţi, slina, semenska
tekočina, vaginalne celice, kosti, zobje, lasje in urin (17).
Polna kri je najpogostejši vir DNA za genetske preiskave (18). Iz vzorca polne krvi lahko
izoliramo genomsko DNA z uporabo različnih postopkov. Klasičen način je z uporabo
organskih topil, lahko pa tudi z uporabo komercialno pripravljenih kolon ali pa z metodo
obarjanja z alkoholom po predhodni lizi celic. Kri je lahko sveţa ali zamrznjena. Kri je
tkivo iz tekoče medceličnine (plazme) s prosto gibljivimi celicami (eritrociti, levkociti,
trombociti), ki zavzemajo 45% volumna krvi. Največ DNA izoliramo iz levkocitov, ker
vsebujejo jedro in celične organele (8).
Poleg izolacije iz polne krvi, lahko izoliramo iz levkocitov, lahko pa izoliramo DNA tudi
iz krvnega strdka, kjer pa dobimo slab izkoristek izolirane DNA. Pomembna je tudi
izolacija iz tumorskih tkiv, vendar je odvzem zelo invaziven. Pred začetkom izolacije DNA
je potrebno vzorce homogenizirati, izpostavimo jih mehanskim silam, ki povzročajo
ločitev posameznih celic, vendar minimalno lizo. To mehansko razgradnjo po navadi
doseţemo s pomočjo homogenizatorja. Kadar potrebujemo visokomolekularno DNA
nukleaze inhibiramo tako, da vzdrţujemo vzorce pri ekstremno nizkih temperaturah
(T= -72°C) (19).
V prenatalni diagnostiki se uporablja DNA izolirana iz horionskih resic, ki jih dobimo s
postopkom vzorčenja horionskih resic. Pri tem postopku se odvzame majhen delček
horionske resice iz posteljice za kromosomske analize v prvem tromesečju nosečnosti.
Poleg horionskih resic se v prenatalni diagnostiki uporablja tudi DNA izolirana iz amnijske
tekočine ali celic amnijske tekočine (13).
7
1.3.2 METODE ZA IZOLACIJO DNA Z VEČJIM VOLUMNOM POLNE KRVI
Med osnovne metode izolacije spada izolacija z mešanico fenola in kloroforma, kasneje se
je razvila metoda z izsoljevanjem. Pri obeh si moramo sami pripraviti reagente, kar je
zamudno in lahko predstavlja vir napak, zato so bili razviti različni reagenčni kompleti, ki
so bolj primerni za diagnostične potrebe.
Za samo izolacijo DNA uporabljamo različne reagenčne komplete. Razlika je v tem, da se
nekateri uporabljajo za manjše, drugi pa za večje volumne vzorcev. Med komplete za večje
volumne spadajo naslednji kompleti: Flexigene DNA kit (Qiagen) (20), DNA isolation kit
for Mammalian Blood (Roche) (21), Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega)
(22), Gentra Puregene Blood Kit (Qiagen), DNAzol® Genomic DNA isolation reagent
(Invitrogen) (23), The GeneCatcher™ gDNA Blood Kits (Invitrogen) (24).
- Izolacija z mešanico fenola in kloroforma:
Za izolacijo lahko uporabimo klasično metodo z mešanico fenola in kloroforma, ki je
primerna za izolacijo DNA iz številnih bioloških materialov, tudi iz seruma ali plazme.
Postopek je sestavljen iz naslednjih stopenj:
- Vzorcu dodamo lizirajoči pufer, ki vsebuje EDTA, SDS (natrijev
dodecilsulfat) in proteinazo K. Proteinaza K, ki je aktivna v območju pH
7,5 do 12 denaturira in hidrolizira proteine, EDTA zaščiti molekulo DNA
pred DNA-zami, da je le-te ne bi razgradile. EDTA namreč veţe
dvovalentne katione, ki jih DNA-ze potrebujejo za svoje delovanje.
Detergent SDS ima pa denaturacijske sposobnosti in sodeluje pri
raztapljanju celične membrane in denaturaciji proteinov.
- Sledi ekstrakcija z organskimi topili, s katerimi odstranimo denaturirane
proteine. Pogosto se uporablja mešanica fenol/kloroform. Fenol denaturira
8
in raztaplja proteine, kloroform pa ima poleg denaturacije tudi funkcijo
stabilizacije meje med fenolno in vodno plastjo. Za boljše ločevanje med
vodno in organsko fazo, se kot ekstrakcijsko mešanico lahko uporablja tudi
fenol in kloroform in izoamilni alkohol. Nukleinske kisline se po ekstrakciji
nahajajo v vodni fazi, denaturirani proteini pa tvorijo plast med organsko in
vodno fazo. Ekstrakcijo večkrat ponovimo, dokler ne izgine plast proteinske
oborine.
- Nato obarjamo DNA z 99,8 % ledeno hladnim etanolom, da zagotovimo
odstranitev preostalega fenola in kloroforma iz deproteinizirane vodne
raztopine.
- Sledi še spiranje s 70 % etanolom, da se odstranijo še soli in majhne
organske molekule (17, 25).
- Izolacija z izsoljevanjem:
To je metoda za izolacijo DNA, pri kateri se izognemo uporabi organskih topil, hkrati pa je
enostavna in poceni. Prvi jo je leta 1987 v svojem članku objavil S. A. Miller s sodelavci
(26). Kri je bila odvzeta z antikoagulantom EDTA ali ACD, ki so jo 15 minut centrifugirali
na 1300 x g. Supernatant so odstranili in s Pasteurjevo pipeto prenesli levkocitno plast v
drugo polipropilensko epruveto, kjer so jo raztopili v 3 mL raztopine za liziranje jeder (10
mM Tris-HCl, 40 0mM NaCl, 2 mM Na2EDTA (diamintetraocetna kislina), pH=8,2).
Nato so jo skupaj z 10 % SDS in raztopino proteinaze K, inkuburali čez noč. Naslednji dan
so dodali nasičeno raztopino NaCl (~6 M), zmes stresali 15 sekund in centrifugirali 15
minut pri 2500 x g. Oborjeni proteini so ostali v peletki, supernatant, ki je vseboval DNA,
pa so prenesli v čisto polipropilensko epruveto. Nato so dodali dvakratni volumen
absolutnega etanola pri sobni temperaturi in epruveto obračali toliko časa, dokler DNA ni
postala vidna. DNA so navili na spatulo in jo prenesli v 100-200 µL TE pufra (10 mM
Tris-HCl, 0,2 mM Na2EDTA, pH=7,0). Nato so jo pustili, da se je 2 uri raztapljala pri
37°C. Sledilo je spektrofotometrično vrednotenje čistosti pri A260/A280, kjer so dobili
9
rezultate med 1,8-2,0, kar kaţe na dobro deproteinizacijo in zelo čisto DNA (26). Iz 1 mL
polne krvi, naj bi s to metodo izolirali 10-30 µg DNA.
Poleg klasičnega postopka izsoljevanja z Millerjevo metodo, obstaja še modificiran
Millerjev postopek izolacije DNA iz polne krvi. Venska kri je odvzeta z antikoagulantom
K3EDTA in zamrznjena pri -70°C. Ker pri tem pride do hemolize in levkocitna plast, ki je
nujno potrebna za izolacijo DNA, ni vidna, je najbolje, da se začetno centrifugiranje in
ločitev plazme od celic izpusti. S te se predhodno ne odstrani proteinov plazme, ki vplivajo
na čistost DNA. V predhodnih raziskavah je bilo namreč dokazano, da ni signifikantna
razlika v čistosti DNA med sveţimi in zamrznjenimi vzorci polne krvi (27).
Nadalje se vzorcem krvi se dvakrat doda pufer za liziranje eritrocitov (CLB), vmes se
centrifugira, supernatant odstrani in s tem izloči hemoglobin in proteine eritrocitov iz
nadaljnjega izolacijskega postopka. Preostali usedlini se doda pufer za liziranje levkocitov
(SLR), rahlo premeša in pazi, da se peletka ne razbije, saj so v njej levkociti iz katerih
ţelimo izolirati DNA. S centrifugiranjem se nato odstrani supernatant, v katerem so
proteini levkocitov, od usedline, ki vsebuje jedra levkocitov (27). Usedlini se nato doda
pufer za liziranje jeder levkocitov (NLB). S tem se odprejo jedra levkocitov in se sprostijo
nukleosomi- kompleks osmih histonskih molekul in pribliţno 200 bp DNA dolgi
fragmenti. Tej raztopini se doda še proteinazo K, ki razgradi proteine in detergent SDS, ki
raztopi celično membrano in denaturira proteine. Previdno se premeša in da na stresalnik
pri 42°C čez noč. V tem času poteka reakcija proteolize. Proteinaza K ima v prisotnosti
detrgenta SDS visoko aktivnost, ki inhibira delovanje DNA-az. EDTA iz (NLB) kelira
dvovalentne kovinske ione (27).
S postopkom se nadaljuje naslednji dan in sicer se doda nasičeno raztopino NaCl. S tem se
porušijo elektrostatske vezi med DNA, histoni in ostalimi proteini. Proteini se oborijo in s
centrifugiranjem se jih odstrani. Supernatant se odlije v drugo epruveto in se mu doda
dvakratno količino volumna ledeno hladnega absolutnega etanola. Epruvet se rahlo obrača,
dokler ne postane DNA vidna. DNA se nato navije na sterilno stekleno kapilaro in se jo da
v 1,5 mL plastično epruvetko in pusti odprto v predalu čez noč, da etanol izhlapi. Naslednji
dan se doda ustrezno količino avtoklavirane ultra čiste vode in se jo shrani v hladilniku.
Vsa centrifugiranja se izvajajo v hladilni centrifugi pri 4°C in tudi vsi reagenti so ohlajeni,
zato, da se omeji delovanje DNA-az med samo izolacijo (27).
10
- Flexigene DNA kit (Qiagen):
Komplet je namenjen za hitro in enostavno izolacijo DNA iz 0,1-10 mL človeške polne
krvi, plasti levkocitov (buffy coat) in kultiviranih celic. Izolacijo opravljamo v eni
epruveti, s čimer zmanjšamo moţnost zamenjave reagentov. Celoten postopek lahko
izvedemo v manj kot eni uri, pri čemer ni upoštevana 1 ura raztapljanja DNA po končanem
postopku. Za razliko od izolacije z mešanico fenola in kloroforma ne uporabljamo nobenih
toksičnih organskih reagentov. Ta komplet omogoča dober izkoristek izolirane DNA, kar
vidimo v preglednici I. Dobimo visoko molekularno DNA, ki jo lahko uporabljamo za
različne molekularne analize, vključno s PCR (reakcija veriţne polimerizacije).
K vzorcu dodamo lizirni pufer, da razbijemo jedra celičnih membran ter nato
centrifugiramo. Peletke, ki vsebuje celično jedro in mitohondrije so raztopimo in
inkubiramo v denaturacijskem pufru, ki vsebuje kaotropne soli in Qiagen proteazo. Ta
korak učinkovito odstrani proteine. DNA oborimo z dodatkom izopropanola, jo speremo s
70 % etanolom, posušimo in raztopimo v hidracijskem pufru (10mM Tris-Cl, pH 8,5) (20).
Preglednica III: Prikaz tipičnega izkoristka izolirane DNA pri reagenčnem kompletu Flexigene
DNA Kit (20).
Vzorec
Volumen
(ml)
DNA
izkoristek(µg)
kri 0,3 11-14
kri 2 75-90
kri 10 380-460
plasti
levkocitov 0,5 110-130
- DNA isolation kit for Mammalian Blood (Roche):
Komplet je zasnovan za izolacijo DNA iz 1-10 mL človeške polne krvi, limfocitov ali
plasti levkocitov (preglednica II). Prečiščena DNA je primerna za več aplikacij, za PCR,
sekvenciranje in analizo po Southernu. Celoten postopek lahko izvedemo v manj kot eni
uri, pri čemer ni upoštevano 30-60 minut raztapljanja DNA po končanem postopku. Ne
zahteva nobene organske ekstrakcije ali kolon. Komplet ne vsebuje nevarnih organskih
topil ali kaotropnih soli.
11
V prvi stopnji najprej s pomočjo reagenta razgradimo eritrocite in nato centrifugiramo.
Sledi razgradnja levkocitov ter ponovno centrifugiranje in inkubiranje. Potem proteine
odstranimo z dehidracijo in obarjanjem. Izolirano DNA pa raztapljamo v primernem pufru
(21).
Preglednica IVI: Prikaz izkoristka izolirane DNA pri reagenčnem kompletu DNA isolation kit for
Mammalian Blood (21).
Vrsta
Povprečni izkoristek na 10 ml
krvi
izkoristek v območju
(µg)
miš 570 µg 460-670
podgana 580 µg 350-680
pes 450 µg 350-600
prašiči 670 µg 520-780
morski
prašiček 160 µg 55-295
1.3.3 SHRANJEVANJE VZORCEV PRED IZOLACIJO IN SHRANJEVANJE
IZOLIRANE DNA
Pomembna je pravilna izbira antikoagulanta, saj lahko moti pri nadaljnjih analizah (PCR,
RFLP ( polimorfizem dolţine retsrikcijskih fragmenotov)). Priporočajo uporabo
antikoagulanta EDTA (etilendiamintetraocetna kislina) ali kisle citratne dekstroze (ACD).
Ugotovili so, da uporaba ACD daje pri vzorcih shranjenih pri sobni temperaturi večje
količine izolirane DNA (8).
Vensko kri lahko do 3 dni hranimo v hladilniku, nato pa jo moramo do analize zamrzniti
na -20°C ali -70°C (Preglednica III). Dolgoročno shranjevanje DNA je potrebno za
številne genetske študije. DNA se lahko izolira iz vzorcev krvi shranjene pri -70°C za
najmanj 2 meseca ali pri 23°C za teden ali več, vendar pa s hranjenjem krvi pri teh
temperaturah lahko dobimo DNA z manj visoko molekulsko maso. Izolirana DNA ki je
shranjena v suhi obliki do 30 let, jo je teţko raztopiti, vendar pa vzorec, ki je shranjen v
suhi obliki do 13 let, nato pa hranjnen v raztopini pri -20°C za 7 let, bo ostal nespremenjen
12
(28). Učinki časa skladiščenja so (število dni od zbiranja krvi do ekstrakcije DNA) in
temperature so pomembni za kakovost in donos izolirane DNA (18).
Običajno se DNA shranjuje v raztopinah. Lahko se shrani v destilirani vodi, vendar se
mora uporabiti v roku nekaj dni. Primerna je za PCR ali za endonukleazno razgradnjo.
Kljub temu je Tris-Na2EDTA najbolj priporočen za shranjevanje DNA. V raztopini Tris-
Na2EDTA je povišana koncentracija EDTA. Tris pufer ne preprečuje prevelike
spremembe pH, zaradi katerih se lahko spontano razgradi DNA. Natrijeve soli stabilizirajo
dvojno vijačno strukturo. EDTA preprečuje delovanje nukleaz in kelira dvovalentne
kovinske ione. Poznamo dva načina shranjevanja DNA in sicer kratkoročno (do enega leta)
in dolgoročno shranjevanje (več let). Do danes je malo podatkov dostopnih o pogojih za
kratkotrajno in dolgotrajno shranjevanje in vpliva na kakovost ter količino DNA. DNA naj
bi zadrţala karakteristike pri dolgotrajnem shranjevanju, če bi bila zamrznjena.
Liofilizacija bi lahko bila dobra metoda za shranjevanje DNA, če bi razvili boljše metode
hidracije DNA (29).
Nizke temperature dodatno zmanjša dejavnost encima in izboljša stabilnost nukleinskih
kislin. Če je vzorec nukleinske kisline še vedno kontaminiran po čiščenju z nuklezami,
dodajanje kaotropskih reagentov izključi ostale encime. Na podlagi teh osnovnih smernic,
prečiščena DNA se lahko hrani dlje časa (30).
Najbolj je priporočeno, da se naredi genetska analiza iz sveţih vzorcev krvi.
Preglednica III: Prikaz temperaturnih in časovnih zahtev za shranjevanje DNA
Temperatura
shranjevanja DNA v TE pufru (10:1)
sobna
temperatura
ohranjena stabilnost do 2 meseca (s časoma se spremeni molekulska
masa DNA)
4˚C
stabilna od 1 do 12 mesecev (ni sprememb molekulske mase, primerna
za PCR, hibridizacijo)
-20˚C DNA je zaščitena pred razgradnjo z nukleazami pod 0˚C
-80˚C stabilna vsaj 10 let, primerna za PCR, hibridizacijo
13
1.4 KARAKTERIZACIJA IZOLIRANE DNA
1.4.1 KONCENTRACIJA IN ČISTOTA IZOLIRANE DNA
Koncentracijo DNA določimo z merjenjem absorbance pri valovni dolţini 260 nm zato,
ker pri tej valovni dolţini absorbirajo svetlobo predvsem heterociklične baze DNA,
intrerferirajo pa RNA molekule, aminokisline in proteini. Da se izognemo vplivu
aminokislin, proteinov ter RNA merimo absorbanco pri 280 nm, kjer absorbirajo proteini,
kar zniţa razmerje A260/A280; medtem ko z odčitavanjem absorbance ne moremo določiti
ali se v vzorcu nahaja RNA ali DNA (30). Če je izolirana DNA dovolj čista je razmerje
med 1,8 – 2,0 ali pa kot navajajo drugi viri je razmerje med 1,7-1,9. Če je razmerje pod 1,8
kaţe na prisotnost nečistot, kot so proteini, ki jih je potrebno odstraniti z mešanico
fenol:kloroform:izoamilni alkohol. Razmerje nad 2,0 kaţe na kontaminacijo z RNA.
Prisotna RNA lahko inhibira nekatere kasnejše aplikacije, vendar na reakcijo PCR ne
vpliva. Lahko jo odstranimo z encimom RNA-zo (31).
Raztopina DNA s koncentracijo 1µg/mL ima absorbanco pri 260 nm 0,020 oziroma
absorbanca 1,0 pri 260 nm pove, da je koncentracija DNA v vzorcu 50 µg/mL (3, 12).
1.4.2 VELIKOST IZOLIRANE DNA
1.4.2.1 ELEKTROFOREZA IZOLIRANE DNA
Elektroforeza je separacijska metoda, ki temelji na potovanju nabitih delcev v električnem
polju, glede na njihov naboj in obliko. Tako se za določanje velikosti izolirane DNA
uporabi elektroforeza. S to metodo ločimo odseke DNA na osnovi njihove različne
gibljivosti v električnem polju. Pri potovanju molekul DNA ima pomembno vlogo ionska
moč pufra. Molekule DNA so bogate s fosfatnimi skupinami, ki imajo pri nevtralnem ali
alkalnem pH negativen naboj in v električnem polju potujejo od katode proti anodi (30). Za
elektroforezo nukleinskih kislin se uporabljajo različni nosilci (geli) različnih poroznosti in
14
oblik. Elektroforezo lahko izvajamo na agaroznem ali polikarilamidnem gelu. Agarozni
geli so poroznejši in z uporabo različnih koncentracij lahko doseţemo ločevanje različnih
fragmentov (višja gostota gela, manjši fragmenti).
AGAROZNA GELSKA ELEKTROFOREZA:
Agaroza je linearni polimer s ponavljajočim dimerom D-galaktoze in 3,6-anhidro-L-
galaktoze. Gele pripravimo tako, da trdno agarozo s segrevanjem raztopimo v
elektroforeznem pufru (agaroza v obliki soli). Z agaroznimi geli lahko v električnem polju
ločujemo molekule, velike od 100 bp do pribliţno 50 kbp. Hitrost potovanja je odvisna od
več dejavnikov.
- Oblika DNA: dodatno zvita kroţna DNA, sproščena kroţna DNA in linearna DNA
enake velikosti potujejo skozi gel z različno hitrostjo. Relativna hitrost posamezne
oblike je sicer odvisna od koncentracije agaroze, jakosti električnega polja in
ionske jakosti pufra. Pod pogoji, ki jih običajno uporabljamo pri agarozni
elektroforezi, potuje najhitreje dodatno zvita kroţna molekula, nekoliko počasneje
linearna in najpočasneje molekule v sproščeni obliki.
- Velikost DNA: linerna dvoveriţna DNA potuje skozi gel s hitrostjo, ki je obratno
sorazmerna z logM. Krajše (manjše) molekule potujejo hitreje, ker se laţje
prebijejo skozi pore v gelu in ker imajo manjši upor trenja.
- Koncentracija agaroze: linearna DNA določene velikosti potuje skozi gele z
različnimi koncentracijami agaroze z različno hitrostjo. V gelu z visoko
koncentracijo agaroze se molekule gibajo počasneje. Zato lahko v gelu določene
gostote ločujemo molekule določenih velikosti. Večje molekule ločujemo v gelih z
niţjo koncentracijo agaroze.
- Sestava elektroforeznega pufra: sestava in ionska jakost pufra vplivata na hitrost
potovanja DNA v električnem polju. Če v pufru ni ionov, skozi gel ne teče tok in
molekule se ne premikajo. Preveč ionov v pufru pa povzroči veliko električno
prevodnost gela in sprošča se veliko toplote, ki lahko stopi gel. Za ločevanje
dvoveriţnih DNA uporabljamo kombinacijo EDTA in TAE (tris-acetat EDTA),
TBE (tris-borat EDTA) in TPE (tris-fosfat EDTA) s pribliţno 50 mM koncentracijo
ionov. TAE je najbolj pogosto uporabljen pufer. Njegova puferska kapaciteta je
15
nizka in se pri dolgih elektroforezah iztroši. Večjo pufersko kapaciteto imata pufra
TBE in TPE, vendar dvojnovijačni fragmenti DNA potujejo v TAE 10x hitreje kot
v TBE ali TPE (32). Za ločevanje enoveriţne DNA pa uporabljamo alkalno
agarozno elektroforezo.
- Napetost električnega polja: pri nizki napetosti je hitrost potovanja linearne DNA
proti anodi sorazmerna z uporabljeno jakostjo električnega polja. Pri višjih jakostih
se začnejo veliki fragmenti gibati relativno hitreje in njihovo ločevanje je slabše. Za
ločevanje molekul, večjih od 2 kb, moramo zato uporabljati napetost, ki je manjša
od 5 V/cm razdalje med elektrodama.
- Interkelirajoča barvila: etidijev bromid s svojim vgrajevanjem v DNA zmanjša
mobilnost molekul za pribliţno 15 %.
Nukleotidno zaporedje fragmentov DNA ne vpliva na hitrost potovanja v gelu. Prav
tako na hitrost ne vpliva temperatura, pri kateri teče elektroforeza (12).
16
2 NAMEN DELA
Osnova za uspešnost genetskih analiz je ustrezna kakovost in količina izolirane DNA, ki
sta v veliki meri odvisni od postopka izolacije DNA. Tako je zelo pomembno, katerega od
številnih postopkov, ki so na voljo, bomo izbrali. Za potrebe laboratorijev, ki izvajajo
preiskave na področju laboratorijske medicine, najpogosteje izberemo katerega od
reagenčnih kompletov, ki omogočajo preprosto in hitro izvedbo ter istočasno analizo
velikega števila vzorcev.
Namen našega dela bo iz vzorcev polne krvi izolirati čimveč in čimbolj kakovostno DNA,
ki bo uporabna za nadaljnje genetske analize.
S tem namenom bomo:
optimirali postopek izolacije z reagenčnima kompletoma Flexigene DNA kit in
reagenčnim kompletom DNA isolation kit for Mammalian Blood;
z vsakim od reagenčnih kompletov izolirali DNA iz 20 vzorcev polne krvi in
primerjali njeno količino in kakovost. Primerjali bomo tudi enostavnost izvedbe
in čas potreben za izvedbo postopka z enim in drugim reagenčnim kompletom.
17
3 MATERIALI IN METODE
3.1 MATERIALI
3.1.1 BIOLOŠKI VZORCI
Kot biološki vzorec za izolacijo DNA smo uporabili zamrznjene vzorce polne krvi, ki so
bili zamrznjeni en mesec pri -20°C . Kri je bila odvzeta bolnikom zdravljenim z
varfarinom iz Zdravstvenega doma Velenje. Odvzem krvi je bil v epruvetah z
antikoagulantom EDTA.
3.1.2 REAGENTI
* PRI POSTOPKU Z REAGENČNIM KOMPLETOM FLEXIGENE DNA KIT:
Reagenčni komplet Flexigene DNA kit (Qiagen) vsebuje (Slika 4):
- Pufer FG1(FlexiGene lysis pufer) : pufer FG1 proizvajalec pripravi sam in ne
navaja sestave pufra.
- Pufer FG2 (FlexiGene danaturation pufer): ravno tako ţe pripravljen pufer.
- Qiagen proteaza: liofilizirano Qiagen proteinazo raztopimo v pufru FG3 in
sicer:
- 0,3 ml, če uporabimo 50 mL Flexigene DNA kit
- 1,4 ml, če uporabimo 250 mL Flexigene DNA kit
- Pufer FG3 (FlexiGene hydration pufer): sestavljen iz 10mM Tris-Cl, pH 8,5
- 100 % izopropanol (Merck)
- 70 % etanol: 14 mL 100 % etanola in 6 mL vode (Hyclone-Grade Water Nuclese-Free)
- 3 % hipoklorit (Kemika)
18
3.1.2.1 SHRANJEVANJE REAGENTOV IN KRVNIH VZORCEV ZA IZOLACIJO
DNA
Vse pufre in reagente hranimo pri sobni temperaturi (15-25°C) do 24 mesecev.
Liofilizirano Qiagen proteazo lahko hranimo pri sobni temperaturi do 24 mesecev. Za
shranjevanje za več kot 24 mesecev ali če temperatura pogosto presega 25°C, jo je
potrebno hraniti pri 2-8°C.
Pripravljena Qiagen proteaza je stabilna 2 meseca, če je shranjena pri temperaturi 2-8°C.
Shranjevanje pri -20°C podaljša njen čas uporabnosti, vendar se moramo izogniti
večkratnemu zamrzovanju in odtaljevanju. Zato je priporočljivo da jo shranjujemo v
alikvotih pri -20°C.
Vzorce polne krvi odvzete z EDTA, citratom ali heparinom lahko uporabljamo sveţe ali
zamrznjene. Izkoristek in kakovost izolirane DNA je odvisna od pogojev shranjevanja
krvi. Sveţi vzorci krvi dajejo boljše rezultate.
- Za kratkotrajno shranjevanje (do 10 dni): odvzem krvi je v epruvetah z
antikoagulanotom EDTA in shranjevanje pri 2-8°C. Vendar pa je za analize pri
katerih potrebujemo visoko molekularno DNA, kot je analiza po Southernu,
priporočeno hranjenje pri temperaturi 2-8°C največ do 3 dni.
- Za dolgoročno shranjevanje: odvzem krvi je v epruvetah s standardnim
antikoagulantom (po moţnosti EDTA, če se zahteva visoko molekularno masa
DNA) in shranjevanje pri -70°C (20).
19
Slika 4: Pripomočki potrebni za izolacijo z reagenčnim kompletom Flexigene DNA kit.
* REAGENTI PRI POSTOPKU Z REAGENČNIM KOMPLETOM DNA ISOLATION
KIT FOR MAMMALIAN BLOOD:
Reagenčni komplet DNA isolation kit for Mammalian Blood (Roche) vsebuje
(Slika 5):
- Red Blood Cell Lysis Buffer: pufer je ţe pripravljen
- White Blood Cell Lysis Buffer: tudi ta pufer je ţe pripravljen
- Protein Precipitation Solution: ta pufer je tudi ţe pripravljen
- TE pufer: za pripravo 1 x TE pufra, se najprej pripravi 1M Tris-Cl; pH 8,0 (Raztopimo
121,1 g Tris baze v 700 mL ultra čiste vode. V digestoriju dodamo 42 mL koncentrirane
HCl. Dopolnimo z ultra čisto vodo do volumna 1 L. Shranjujemo na sobni temperaturi.).
Nato sledi priprava EDTA; pH 8,0 (EDTA te pH vrednosti je ţe pripravljena. Če pa ni
pripravljena, pa jo pripravimo po naslednjem postopku: zatehtamo Na2EDTA-2H2O,
dodamo dH2O in močno mešamo na magnetnem mešalu in uravnamo pH na 8,0.
Razporedimo v alikovote in avtoklaviramo. Dinatrijeva sol se ne bo raztopila, dokler pH ni
pribliţno 8,0, uravnamo ga tako, da dodamo NaOH. Shranimo na sobni temperaturi. Na
koncu sledi priprava 1 x TE pufra (Za pripravo 100 mL 1 x TE pufra v bučki potrebujemo
500 µL Tris-Cl in 500 µL 0,1M EDTA; pH 8,0. Dopolnimo z ultra čisto vodo do oznake).
Pripravljene pufre avtoklaviramo na programu za tekočine.
- 100 % etanol (Merck)
20
- 70 % etanol: 14 mL 100 % etanola in 6 mL vode (Hyclone-Grade Water Nuclese-Free)
- 3 % hipoklorit (Kemika)
Slika 5: Pripomočki potrebni za izolacijo z reagenčnim kompletom DNA isolation kit for
Mammalian Blood.
* REAGENTI ZA PRIPRAVO 2% AGAROZNEGA GELA:
- Agaroza (Sigma-Aldrich)
- 1 x TAE pufer: ta je bil narejen iz 242 g Tris baze, 57,1 g ocetne kisline, 100 mL
0,5 M EDTA in dopolnjen do 1000 mL z ultra čisto vodo. 1 x TAE pufer smo
naredili tako, da smo 20 mL 50 x TAE pufra redčili z deonizirano vodo iz aparata
ELGA PURELAB Classic do 1000 mL. Premešamo z obračanjem merilnega valja.
- Sybr safe (Invitrogen)
* REAGENTI ZA ELEKTROFOREZO:
- 1 x TAE pufer
- Barvilo bromfenol modro (Fluka) : raztopina bromfenol modro je vsebovala
0,025 g bromfenol modro, 3 mL glicerola in 7mL destilirane vode.
- Označevalec dolţin Marker III (Boehringer Mannheim GmbH)
21
3.1.3 LABORATORIJSKA OPREMA IN MATERIALI
- Vodna kopel (BIOSAN Water Bath-termostat WB 4MS)
- Centrifuga (Eppendorf-Centrifuge 5804 R)
- Tehtnica (VIBROMIX 314 EVT)
- Vrtinčasto mešalo-Vortex (BIOSAN BioVortex V1)
- Centrifuga (sprout)
- Avtoklav (Laboklav 25)
- Aparat Bio RAD, POWER PAC 300
- Sušilnik (HERAEUS)
- Tehtnica
- Digestorij
- Mikrovalovna pečica (OPTIQUICK compact)
- Računalnik (program Gene Snap from Syn Gene)
- Komora G:BOX, SYNGENE
- Nanodrop 1000 (THERMO SCIENTIFIC)
- Računalnik (program Nanodrop 1000)
- Rokavice (KIMTECH)
- Led
- Plastične epruvetke (epice), (1,5mL; 2mL avtokalvirane) (SARSTEDT)
- Pipete (BIOHIT m200, m20; PROLINE 1-5mL; PROLINE 100-1000µL)
- Nastavki za pipete – avtokalvirani
- Sterilne vatirane palčke
- 15mL centrifugirke (falkonke) (SARSTEDT)
- Trak za avtoklaviranje
- Kadička za izdelavo gela
- Nosilec za gel
- Glavnički (BioRad)
- Erlenmajerica
- Merilni valj (75mL)
- Ţlička
- Urno steklo
- Elektroforezna kadička (BIO RAD)
22
- Skalpel
- Parafilm
- Podstavek
- Stresalnik (TEHTNICA)
Slika 6: Centrifuga 5804 R (EPPENDORF).
Slika 7: Vodna kopel ( BIOSAN).
23
3.1.3.1 AVTOKLAVIRANJE
Pred samim pričetkom dela je potrebno sterilizirati ves material, ki ga bomo potrebovali pri
laboratorijskem delu.
POSTOPEK:
- Obvezna je uporaba zaščitne halje in rokavic
- Delovno površino najprej obrišemo s 3 % hipokloritom, nato še s 70 % etanolom.
Pripravimo si posodice, v katerih shranjujemo nastavke za pipete in plastične
epruvetke. Tudi te obrišemo s hipokloritom in etanolom. Plastične posodice
napolnimo z nastavki za pipete,steklene pa s plastičnimi epruvetkami. Zapremo in
označimo s trakom za avtoklaviranje. Napišemo še ime in datum. Pazimo, da
steklene posodice niso popolnoma zaprte.
- Priţgemo avtoklav, tako, da prestavimo rdeč gumb na desni strani iz poloţaja 0 v 1.
- Odpremo vrata avtoklava in vanj zloţimo stvari, ki jih ţelimo avtoklavirat.
- Vrata zapremo in drţimo tipko↓, da se vrata popolnoma zaprejo sama. Vrata so
zaprta, ko se na ekranu pojavi simbol zaprte ključavnice.
- Pritisnemo tipko Program.
- Na okencu se nam izpišejo ţe vstavljeni programi: tlak je pri vseh metodah enak-
1,2 bara.
P1→Istruments→134˚C→(steklovina)
P2→Istruments→121˚C→(nastavki)
P3→Liquids→121˚C→(tekočine)
- S pritiskom na puščice izberemo ţelen program in potrdimo s tipko Enter.
- Ko smo izbrali program, pritisnemo na tipko Start.
- Med avtoklaviranjem ne odpiramo vrat.
- Vrata lahko odpremo, ko se luč obarva zeleno, odpremo jih s tipko↑ ali tipko Stop.
Če je na ekranu opozorilo….iztočimo vodo (iztok je pod aparatom) in nalijemo novo
(zgoraj na levi strani odpremo pokrov)
- Če po končanem avtoklaviranju posodice niso suhe, jih prenesemo še v sušilnik, da
se popolnoma posušijo.
24
3.2 METODE
3.2.1 IZOLACIJA VZORCEV GENOMSKE DNA Z REAGENČNIM
KOMPLETOM FLEXIGENE DNA KIT
- Obvezna je uporaba zaščitne halje in rokavic.
- Delovno površino in pipete, ki jih bomo uporabljali očistimo s 3 % hipokloritom.
- Iz hladilnika vzamemo vzorce krvi in jih hranimo na ledu do uporabe.
- Priţgemo centrifugo in jo nastavimo na 21˚C in 2000 x g (Slika 6).
- Pripravimo vodno kopel (Slika 7).
- Pripravimo reagente in ves ostali material.
- Iz zamrzovalnika vzamemo proteazo in jo damo v hladilnik.
- Označimo centrifugirke.
Vzorce moramo najprej odtaliti in sicer na hitro v vodni kopeli pri 37˚C. Potem jih
damo v led do uporabe.
OPTIMIRANI POSTOPEK STANDARDNI POSTOPEK
Enako kot pri standardnem. Pipetiramo 5 mL pufra FG1 v 15 mL centrifugirko.
Kri najprej premešamo z obračanjem (5x) in jo
odpipetiramo 2 mL v centrifugirko k pufru FG1.
Centrifugirke zapremo s pokrovčkom in premešamo
z obračanjem (5x).
Mešamo na stresalniku 10 minut pri 50
rpm.
Enako kot pri standardnem. Centrifugiramo 5 minut pri 2000 x g.
Enako kot pri standardnem. Supernatant previdno odlijemo v posodo za
odpadno kri, centrifugirko obrnemo na čisto
papirnato brisačko, da popivnamo tekočino in jo
25
pustimo obrnjeno 2 minuti, pazimo, da v
centrifugirki ostane peletka.
Enako kot pri standardnem. Proteazo vzamemo iz hladilnika, jo premešamo na
vrtinčastem mešalu in centrifugiramo, da se vsa
tekočina nabere na dnu.
Enako kot pri standardnem. V centrifugirko z vzorcem dodamo 1 mL pufra FG2
in 10 µL Qiagen proteaze in zapremo. Vsako takoj
močno premešamo na vrtinčastem mešalu (3-4x) 5
sekund, dokler ni homogenzirano. Pogledamo, če je
res homogenizirano.
Enako kot pri standardnem. Obrnemo centrifugirko (3x), namestimo vodno
kopel in inkubiramo 10 minut pri 65˚C.
Enako kot pri standardnem. Dodamo 1 mL 100 % izopropanola in temeljito
premešamo z obračanjem (vsaj 20x), dokler DNA
precipitat ne postane viden.
Enako kot pri standardnem. Centrifugiramo 3 minute pri 2000 x g.
Enako kot pri standardnem. Odlijemo supernatant v posodo za odpadno kri,
obrnemo na čisto papirnato brisačko, pazimo na
peletko.
Enako kot pri standardnem. Dodamo 1 mL 70 % etanola in mešamo na
vrtinčastem mešalu 5 sekund.
Enako kot pri standardnem. Centrifugiramo 3 minute pri 2000 x g.
Enako kot pri standardnem. Odlijemo supernatant v posodo za odpadno
kri,obrnemo na čisto papirnato brisačko in
pustimo vsaj 5 minut, pazimo na peletko.
Enako kot pri standardnem. DNA sušimo na zraku dokler vsa tekočina ne
izgine,vsaj 5 minut (Slika 8). Vmes pobrišemo
notranje stene centrifugirke s sterilno vatirano
palčko. Pri tem pazimo, da se ne dotaknemo
26
peletke.
Dodamo 400 µL FG3 pufra, mešamo na
vrtinčastem mešalniku 5 sekund pri nizki
hitrosti in raztopimo DNA z inkubacijo 1
uro pri 65˚C.
Dodamo 200 µL FG3 pufra, mešamo na
vrtinčastem mešalniku 5 sekund pri nizki
hitrosti in raztopimo DNA z inkubacijo 1 uro
pri 65˚C.
Enako kot pri standardnem. Raztopljeno DNA prenesemo v označene plastične
epruvetke (datum, ime, št. vzorca-na pokrovček in
na nalepko). Shranimo v hladilniku do uporabe.
Slika 8: Sušenje izolirane DNA na zraku.
3.2.2 IZOLACIJA VZORCEV GENOMSKE DNA Z REAGENČNIM
KOPLETOM DNA ISOLATION KIT FOR MAMMALIAN BLOOD
POSTOPEK:
- Obvezna je uporaba zaščitne halje in rokavic.
- Delovno površino in pipete, ki jih bomo uporabljali očistimo s 3 % hipokloritom.
- Priţgemo centrifugo in jo nastavimo na 21˚C in 880 x g.
- Pripravimo vodno kopel.
27
- Pripravimo reagente in ves ostali material.
- Označimo centrifugirke.
Vzorce moramo najprej odtaliti in sicer na hitro v vodni kopeli pri 37˚C. Potem jih
pustimo pri sobni temperaturi do uporabe.
OPTIMIRANI POSTOPEK STANDARDNI POSTOPEK
Enako kot pri standardnem. Pipetiramo 6 mL lizrnega pufra ( Red Blood
Cell Lysis Buffer) v 15 mL centrifugirko. Kri
najprej premešamo z obračanjem (5x) in jo
odpipetiramo 2 mL v centrifugirko k pufru.
Centrifugirke zapremo s pokrovčkom in
premešamo z obračanjem (5x).
Enako kot pri standardnem. Mešamo na stresalniku 10 minut pri 50 rpm.
Centrifugiramo 10 minut pri 880 x g. Centrifugiramo 10 minut pri 875 x g.
Enako kot pri standardnem. Supernatant previdno odlijemo v posodo za
odpadno kri. Pustimo 1 cm supernatanta, v
kateri je peletka.
Enako kot pri standardnem. Temeljito premešamo oziroma razbijemo
belo peletko v preostalem supernatantu na
vrtinčastem mešalniku.
Enako kot pri standardnem. Dodamo 1 mL lizirnega pufra (White Blood
Cell Lysis Buffer),centrifugirko zapremo s
pokrovčkom in mešamo na vrtinčastem
mešalu (temno rdeče rjava peletka) in
inkubiramo pri 37˚C 15 -30 minut.
28
Dodamo 520 µL raztopine za obarjanje
proteinov (Protein Precipitation Solution),
mešamo na vrtinčastem mešalu 25 sekund
(rjav precipitat) in prestavimo v 2 mL
plastične epruvetke (Slika 9).
Vzorce prenesemo v sterilno 15 mL epruveto in
dodamo 520 µL raztopine za obarjanje
proteinov (Protein Precipitation Solution),
mešamo na vrtinčastem mešalu 25 sekund
(rjav precipitat).
Enako kot pri standardnem. Centrifugiramo 10 minut pri 12000 x g.
Enako kot pri standardnem. Supernatant previdno odlijemo v novo 15 mL
centrifugirko (pazimo da ne gre peletka
proteina zraven)
Enako kot pri standardnem. Dodamo 2 volumna (3mL) 100% etanola
(sobna temperatura) k supernatantu, neţno
premešamo z obračanjem da DNA precipitat
postane viden.
Centrifugiramo 10 minut pri 880 x g. Centrifugiramo 10 minut pri 875 x g.
Enako kot pri standardnem. Previdno odlijemo supernatant v posodo za
odpadno kri in centrifugirko obrnemo na
papirnato brisačko za 1 minuto.
Enako kot pri standardnem. Dodamo 600 µL 70% hladnega etanola in
premešamo z večkratnim obračanjem.
Centrifugiramo 5 minut pri 880 x g. Centrifugiramo 5 minut pri 875 x g.
Enako kot pri standardnem. Previdno odlijemo supernatant v posodo za
odpadno kri, obrnemo centrifugirko na
papirnato brisačko in sušimo DNA na zraku 5-
10 minut. Vmes pobrišemo notranje stene
centrifugirke s sterilno vatirano palčko, pri
tem pazimo, da se ne dotaknemo peletke.
Dodamo 400 µL TE pufra, pH 8.0,
temeljito premešamo in raztopimo DNA s
Dodamo 200 µL TE pufra, pH 8.0, temeljito
premešamo in raztopimo DNA s 30 minutno
29
30 minutno inkubacijo pri 65˚C. inkubacijo pri 65˚C.
Enako kot pri standardnem. Raztopljeno DNA prenesemo v označene
plastične epruvetke (datum,ime,št. vzorca-na
pokrovček in nalepko). Shranimo v hladilniku
do uporabe.
Slika 9: Obarjanje proteinov.
3.2.3 OCENA VELIKOSTI IZOLIRANE DNA
3.2.3.1 PRIPRAVA 2 % AGAROZNEGA GELA
POSTOPEK:
- Pripravimo vse potrebno za izdelavo gela.
- Pregledamo če je dovolj 1 x TAE pufra. Če ga ni, ga pripravimo z redčenjem ţe
pripravljenega 50 x TAE.
30
- V digestoriju pripravimo nosilec za gel tako, da damo kadičko v nastavek in
stisnemo skupaj da se ne premika. V kadičko damo merilec, s katerim poravnamo
kadičko.
- Pripravimo glavničke in Sybr safe v digestorij.
- V erlenmajerico natehtamo 1,5 g agaroze.
- V merilni valj nalijemo 75 mL pufra 1 x TAE, prelijemo v erlenmajerico k agarozi
in pokrijemo z urnim steklo ter stariramo. Premešamo s kroţenjem in damo v
mikrovalovno pečico za 2 minuti. Med segrevanjem v pečici 3 x premešamo
raztopino. Raztopina ne sme imeti mehurčkov, biti mora homogena.
- Potem postavimo erlenmajerico nazaj na tehtnico in dodajamo destilirano vodo do
ničle.
- V digestoriju dodamo 7,5 µL Sybr safe v erlenmajerico in premešamo z vrtenjem.
- Raztopino vlijemo v kadičko, previdno in počasi. Morebitne mehurčke odstranimo
z nastavkom za pipete.
- Vstavimo še glavničke.
- Gel pustimo v zaprtem digestoriju, da se strdi.
- Ko je gel strjen (poskusimo z rokavico, če je dovolj trden), odstranimo glavnička,
previdno vzamemo ven, razreţemo, shranimo v plastične vrečke, ter označimo
(ime, lastnost gela, datum priprave) in damo v hladilnik.
3.2.3.2 ELEKTROFOREZA IZOLIRANE DNA
Slika 10: Elektroforeza izolirane DNA.
31
POSTOPEK:
- Delamo z vijoličnimi rokavicami, ker so nitrilne in manj prepuščajo barvilo.
- Vzorec zmešamo na kratko na vrtinčastem mešalu, za nekaj sekund jih zavrtimo na
centrifugi,da se vzorec zbere na dnu plastične epruvetke.
- Gel vzamemo iz hladilnika in ga odreţemo na podstavku s skalpelom kolikor ga
potrebujemo.
- Gel poloţimo v kadičko, pazimo da je pokrit s pufrom 1xTAE. Če gel ni pokrit
dolijemo pufer.
- Vzamemo parafilm in nanj damo s pipeto kapljico barvila.
- V eno kapljico dodamo 2 µL označevalca dolţin (Marker III), premešamo s pipeto
in damo v ţepek na gelu.
- V ostale kapljice barvila zmešamo na isti način vzorce (2 µL) in vsakega posebej
prenesemo v ţepke na gelu.
- Ko prenesemo vse vzorce v ţepke, pokrijemo kadičko, priklopimo kable, nastavimo
program (napetost-90V; čas-25min.) in pritisnemo tipko za zagon elektroforeze.
- Preverimo ali v kadički ob elektrodah izhajajo mehurčki, če mehurčki ne izhajajo,
potem elektroforeza ne poteka (Slika 10).
3.2.3.3 SLIKANJE ELEKTROFOREZNEGA GELA
POSTOPEK:
- Priţgemo komoro (G:BOX, SYNGENE) na zadnji strani, odpremo vrata s
pritiskom na beli gumb ob strani aparata. Gel poloţimo na ploščo, čim bolj ravno.
- Na računalniku odpremo program Gene Snap from Syn Gene.
Na levi strani okna izberemo »Upper white« pri izbiri osvetlitve.
Velikost slike naj bo 1,38 MPixel-a.
Pri nastavitvah filtra izberemo »short wave band pass« pri nastavitvah filtra.
32
Na ekranu pritisnemo velik zeleni gumb. Po potrebi še poravnamo gel na
plošči.
- Slikanje gela:
Pri osvetlitvi izberemo »Transluminator«.
Pri filtrih izberemo EtBr/UV.
Pri nastavitvah časa izberemo gumb »series captures«, pojavi se okence v
katerem nastavimo ţeleno število slik (10) in čas osvetlitve (200 ms) ter
kliknemo OK.
Izberemo sliko gela, kjer so lise najbolj vidne.
- Shranjevanje podatkov: file→save as→napišemo ime in izberemo mesto, kjer
bomo shranjevali→kliknemo save.
- Po končanem delu zapremo program, gel vzamemo iz aparata in ga odvrţemo v
posebni odpad, aparat ugasnemo.
3.2.4 MERJENJE KONCENTRACIJE IN ČISTOTE IZOLIRANE DNA
3.2.4.1 MERJENJE KONCENTRACIJE NA NANODROPU 1000
Za merjenje koncentracije in čistosti izolirane DNA, smo vzorcem izmerili absorbanco pri
valovni dolţini 260 nm in 280 nm ter določili razmerje A260/280. Ustrezno čista DNA ima
razmerje A260/A280 med 1,8 in 2,0. Nanodrop 1000 natančno meri koncentracijo DNA do
3700 ng/µL brez da bi predhodno redčili vzorec (Slika 11). Spektrofotometer sam zazna
visoke koncentracije in zato uporabi 0,2 mm dolţino kivete za izračun absorbance (33).
33
Slika 11: Naprava za merjenje koncentracije in čistosti izolirane DNA-spektrofotometer.
POSTOPEK:
1. PRIPRAVA VZORCEV:
- Vsak vzorec premešamo na vrtinčastem mešalu za nekaj sekund.
- Premešane vzorce za nekaj sekund centrifugiramo, da se tekočina zbere na dnu
plastične epruvetke.
2. MERJENJE:
- Priţgemo program »Nanodrop 100«, kliknemo »Nucleic Acid«
- Nanodrop očistimo tako, da pipetiramo 1,5 µL deonizirane vode, obrišemo s
koščkom papirnate brisačke.
- Ko je nanodrop očiščen, še enkrat pipetiramo deonizirano vodo, zapremo nanodrop
in pritisnemo »Blank«, tako izmerimo slepo. Po končanem merjenju pobrišemo z
brisačko.
- Pipetiramo 1,5 µL vzorca, zapremo nanodrop, označimo ID vzorca in pritisnemo
»Measure«.
- Pobrišemo in tako ponovimo z vsemi vzorci.
- Ko končamo z merjenjem, očistimo nanodrop.
34
3. SHRANJEVANJE RAZULTATOV:
- Kliknemo »Show Report«,→«Reports«→«Save Reports«→«Export Report Table
Only«→save: NAME.xls
Slika 12: Grafični prikaz meritve koncentracije izolirane DNA.
3.2.5 STATISTIČNA ANALIZA
Za ugotavljanje korelacije med koncentracijo levkocitov in količino izolirane DNA, smo
uporabili Spearmanov test korelacije rangov.
Za ugotavljanje razlik med koncentracijo levkocitov, količino DNA in razmerjem
absorbanc pri 260 in 280 nm med vzorci, izoliranimi s Flexigene DNA in DNA isolation
kit for Mammalian Blood reagenčnima kompletoma, smo uporabili Mann-Whitneyev test.
V vseh analizah smo vrednost p 0,05 opredelili za statistično značilno. Za statistično
obdelavo podatkov smo uporabili računalniški programski paket SPSS 18.0 for Windows,
INC, USA.
35
4 REZULTATI IN RAZPRAVA
Namen našega dela je, da iz vzorcev polne krvi izoliramo čimveč in čimbolj kakovostno
DNA, ki bo uporabna za nadaljnje genetske analize.
Naredili smo optimizacijo obeh postopkov, kajti tako smo dobili boljše rezultate.
Vzorcem izolirane DNA iz polne krvi smo izmerili absorbanco pri 260 nm, kjer
absorbirajo UV svetlobo predvsem heterociklične baze DNA ( interferirajo pa RNA,
proteini in aminokisline) in pri 280 nm (kjer absorbirajo proteini, kar zniţa razmerje
absorbanc). Iz razmerja absorbanc smo določili čistost izoliranih nukleinskih kislin.
Za določitev velikosti izolirane DNA smo uporabili elektroforezo na agaroznem gelu.
Velikost oziroma število baznih parov smo določili s pomočjo uporabljenega standarda III
znane velikosti (0,12 −21,2 kbp).
4.1 IZOLACIJA GENOMSKE DNA Z REAGENČNIM KOMPLETOM
FLEXIGENE DNA KIT
4.1.1 DODATEK 200 µL FG3 PUFRA IN PONOVNO INKUBIRANJE ZA 1 URO
PRI 65°C
Po standardnem postopku smo izolirali DNA iz 21 vzorcev. Pri 7 vzorcih se DNA ni
popolnoma raztopila, zato smo jim ponovno dodali 200 µL FG3 pufra ter ponovno
inkubirali za 1 uro pri 65°C. Pri 4 vzorcih se kljub dodanemu FG3 pufru ter ponovnemu
inkubiranju DNA ni popolnoma raztopila. Pri vseh vzorcih nismo rešili problema, zato smo
se odločili da v nadaljnjem postopku raztapljamo izolirano DNA v 400 µL FG3 pufra.
Povprečna vrednost razmerja absorbanc A260/A280 je bila 1,86; standardna deviacija pa
0,16. Povprečna vrednost koncentracije DNA je bila 95,78 ng/µL; standardna deviacija pa
53,37 ng/µL.
36
4.1.2 CENTRIFUGIRANJE PRI 2500 X G IN CENTRIFUGIRANJE PRI 4000 X G
Po dodatku pufra FG3 in centrifugiranju smo ugotovili, da je peletka lezla iz centrifugirke,
ko smo jo obrnili na papirnato brisačko. Zato smo poskusili 4 vzorce centrifugirati pri
2500 x g in pri 4000 x g skozi celoten postopek. Izolirali smo iz enakih 4 vzorcev, za vsako
serijo smo uporabili 1 ml polne krvi. Pri centrifugiranju vzorcev pri 2500 x g se je DNA
popolnoma raztopila pri vseh vzorcih, samo pri enem je ostalo nekaj DNA neraztopljene.
Pri centrifugiranju vzorcev pri 4000 x g pa se je DNA raztopila pri vseh vzorcih razen pri
enem. Ugotovili smo, da se DNA po obeh centrifugiranjih ni raztopila pri istem vzorcu,
tako da je bilo ţe v samem postopku nekaj narobe.
4.1.3 OPTIMIRANI POSTOPEK
Pri optimiranem postopku smo izolirali DNA iz 20 vzorcev. Za te smo imeli podane tudi
vrednosti koncentracije levkocitov. K postopku smo dodali dodatno stresanje za 10 minut
pri 50 rpm na stresalniku, ker smo ugotovili, da je bila peletka po prvem centrifugiranju
bolj vidna in je manj lezla iz centrifugirke, ko smo jo obrnili na papirnato brisačko, kot pri
standardnem postopku. Izolirano DNA smo raztapljali v 400 µL FG3 pufra.
Preglednica IV: Rezultati koncentracije in čistosti izolirane DNA pri valovni dolţini 260 nm in 280
nm in njunega razmerja A260/A280 pri optimiranem postopku z reagenčnim kompletom Flexigene
DNA kit.
ID
Konc.
Lkci x
(109
L)
Konc.
DNA
(ng/uL)
količina
DNA
(µg) A260 A280
Razmerje
absorbanc
A260/A280
w5893 10,8 364,75 145,9 7,295 4,062 1,80
w6833 11,3 492,98 197,19 9,86 5,446 1,81
w4781 11,7 538,07 215,23 10,761 6,023 1,79
w5727 12,2 436,87 174,75 8,737 4,818 1,81
w6345 7,87 272,04 108,82 5,441 3,013 1,81
37
w5557 5,21 100,9 40,36 2,018 1,101 1,83
w5559 6,31 136,35 54,54 2,727 1,509 1,81
w5798 6,58 232,02 92,81 4,64 2,627 1,77
w5807 5,81 195,05 78,02 3,901 2,136 1,83
w5843 7,05 254,33 101,73 5,087 2,792 1,82
w5850 6,87 238,23 95,3 4,765 2,612 1,82
w5892 7,98 202,79 81,12 4,056 2,237 1,81
w5898 7,77 384,06 153,62 7,681 4,275 1,80
w5902 7,92 246,77 98,71 4,935 2,707 1,82
w6088 7,49 229,67 91,87 4,593 2,539 1,81
w6166 5,10 162,9 65,16 3,258 1,820 1,79
w6267 5,65 312,71 125,08 6,254 3,504 1,78
w6008 6,04 143,61 57,44 2,872 1,552 1,85
w5035 6,34 278,27 111,31 5,565 3,082 1,81
w6343 4,80 159,27 63,71 3,185 1,739 1,83
povp.vred. in
SD 7,54±2,26 269,08±120,2 107,63±48,1 / / 1,82±0,02
Mediana (25 in
75 percentil) 7,0 (5,9−8,0)
242,5
(170,9−351,7) 97,0
(68,4−140,7) / / 1,81 (1,80−1,82)
Povprečna vrednost pri A260/A280 je znašala 1,82; standardna deviacija 0,02 in mediana
( 25 in 75 percentil) 1,81 (1,80−1,82). Povprečna vrednost koncentracije DNA je znašala
245,15 ng/uL; standardna deviacija 112,12 ng/uL in mediana ( 25 in 75 percentil) 242,50
(170,94−351,74). Povprečna vrednost količine DNA je bila 107,63 µg; standardna
deviacija 48,07 µg in mediana ( 25 in 75 percentil) 97,01 (68,38−140,70), kar je razvidno
iz preglednice IV.
4.2 IZOLACIJA GENOMSKE DNA Z REAGENČNIM KOMPLETOM
DNA ISOLATION KIT FOR MAMMALIAN BLOOD
4.2.1 CENTRIFUGIRANJE PRI 4600 X G
V samem postopku je navedeno centrifugiranje pri 12000 x g, ker pa mi nismo imeli
centrifugirk, ki zdrţijo tolikšno moč, smo poskusili s centrifugiranjem pri 4600 x g skozi
celoten postopek. Uporabili smo posebne centrifugirke, ki zdrţijo tolikšno moč rotorja.
38
DNA se je popolnoma raztopila pri vseh vzorcih razen pri w6163 in w6115, kar je
razvidno iz preglednice V.
Preglednica V: Rezultati merjenja koncentracije in čistosti DNA pri valovni dolţini 260 nm in 280
nm in njunega razmerja A260/A280 po centrifugiranju pri 4600 x g z reagenčnim kompletom DNA
isolation kit for Mammalian Blood.
ID
Konc.
DNA
(ng/uL) A260 A280
Razmerje
absorbanc
A260/A280
w6089 129,2 2,584 1,457 1,77
w4932 117,56 2,351 1,363 1,73
w6314 144,61 2,892 1,596 1,81
w4697 108,56 2,171 1,239 1,75
w6163 8,960 0,179 0,117 1,53
w5064 126,43 2,529 1,450 1,74
w6115 3,970 0,079 0,045 1,75
w5507 111,86 2,237 1,238 1,81
w5840 105,14 2,103 1,208 1,74
w4762 132,82 2,656 1,508 1,76
povprečna vrednost 98,91 1,978 1,122 1,74
standardna deviacija 50,18 1,004 0,563 0,08
39
4.2.2 OBARJANJE DNA PRI RAZLIČNIH TEMPERATURAH REAGENTOV
Proizvajalec navaja v postopku, da se obarja DNA s 70 % hladnim etanolom in spira s 100
% etanolom pri sobni temperaturi. V drugih virih smo zasledili, da se lahko obarja s 100 %
hladnim etanolom in spira s 70 % hladnim etanolom ter obarja s 100 % hladnim etanolom
in spira s 70 % etanolom pri sobni temperaturi. Mi smo si pripravili zadostno količino
enakega vzorca krvi ter izvedli dvakrat po dve seriji. Vzorce 33a, 33b, 33d, 33e smo
izolirali po standardnem postopku. Vzorce 33c, 33č, 33f,33g pa smo obarjali s 100 %
hladnim etanolom in spirali s 70 % hladnim etanolom. Ugotovili smo, da se je v prvi seriji
DNA slabše raztapljala kot v drugi. Povprečna vrednost razmerja absorbanc A260/A280 je
bila 2,06; standardna deviacija pa 0,07. Povprečna vrednost koncentracije DNA je bila
58,24; standardna deviacija pa 52,72, kar je vidno iz preglednice VI.
Preglednica VI: Rezultati merjenja koncentracije in čistosti DNA pri valovni dolţini 260 nm in 280
nm in njunega razmerja A260/A280 pri različnih temperaturah reagentov z reagenčnim kompletom
DNA isolation kit for Mammalian Blood.
ID
Konc. DNA
(ng/uL) A260 A280
Razmerje absorbanc
A260/A280
33a 41,02 0,82 0,475 1,73
33b 34,94 0,699 0,403 1,73
33c 4,59 0,092 0,025 3,70
33č 2,49 0,05 0,02 2,42
33d 23,26 0,465 0,272 1,71
33e 118,07 2,361 1,334 1,77
33f 119,28 2,386 1,382 1,73
33g 122,26 2,445 1,42 1,72
povprečna
vrednost 58,24 1,165 0,666 2,06
standardna
deviacija 52,72 1,054 0,611 0,07
40
4.2.3 OPTIMIRANI POSTOPEK
Pri optimiranem postopku smo izolirali DNA iz 20 vzorcev. Za te smo imeli podane tudi
vrednosti koncentracije levkocitov. K postopku smo dodali stopnjo v kateri smo po
dodatku raztopine za obarjanje proteinov prenesli raztopino v 2 mL plastične epruvetke ter
nato centrifugirali. Ta stopnja je primerna, če izoliramo iz majhnih količin krvi. Izolirano
DNA smo raztapljali v 400 µL FG3 pufra.
Preglednica VII: Rezultati merjenja koncentracije in čistosti izolirane DNA pri valovni dolţini 260
nm in 280 nm in njunega razmerja A260/A280 pri optimiranem postopku z reagenčnim kompletom
DNA isolation kit for Mammalian Blood.
ID
Konc.
Lkci x
(109
L)
Konc. DNA
(ng/uL)
količina
DNA (µg) A260 A280
Razmerje
absorbanc
A260/A280
w7071 4,31 102,74 41,1 2,055 1,14 1,80
w4676 5,00 93,53 37,41 1,871 1,015 1,84
w7229 5,36 123,71 49,48 2,474 1,396 1,77
w7084 5,38 58,87 23,55 1,177 0,641 1,84
w5118 5,63 74,08 29,63 1,482 0,831 1,78
w6810 5,84 93,73 37,49 1,875 1,052 1,78
w5874 6,20 98,37 39,35 1,967 1,105 1,78
w5045 6,43 99,55 39,82 1,991 1,113 1,79
w6079 6,79 106,15 42,46 2,123 1,178 1,80
w4600 6,83 106,92 42,77 2,138 1,218 1,76
w4762 6,91 132,82 53,12 2,656 1,508 1,76
w6163 7,86 8,96 3,58 0,179 0,117 1,53
w6115 8,11 3,97 1,59 0,079 0,045 1,75
w5507 8,19 111,86 44,74 2,237 1,238 1,81
w5840 8,21 105,14 42,07 2,103 1,208 1,74
w6314 8,37 144,61 57,84 2,892 1,596 1,81
41
w4932 8,93 117,56 47,02 2,351 1,363 1,73
w6089 9,87 129,2 51,68 2,584 1,457 1,77
w5064 7,06 126,43 50,57 2,529 1,45 1,74
w4697 7,39 108,56 43,42 2,171 1,239 1,75
povp.vred. in
SD 6,93±1,44 97,34±36,73 38,93±14,69 / / 1,77±0,06
Mediana (25 in
75 percentil) 6,9
(5,7-8,2)
105,65
(93,58-122,2)
42,27
(37,4-48,87) / /
1,78
(1,75-1,80)
Povprečna vrednost pri A260/A280 je znašala 1,79 ; standardna deviacija 0,12 in mediana
( 25 in 75 percentil) 1,78 (1,75−1,80). Povprečna vrednost koncentracije DNA je znašala
97,34 ng/uL; standardna deviacija 36,73 ng/uL in mediana ( 25 in 75 percentil) 105,65
(93,58−122,17). Povprečna vrednost količine DNA je bila 38,93 µg; standardna deviacija
14,69 µg in mediana ( 25 in 75 percentil) 42,27 (37,43−48,87), kar je razvidno iz
preglednice VII.
4.3 ELKTROFOREZA IZOLIRANE DNA
4.3.1 IZOLIRANA GENOMSKA DNA Z REAGENČNIM KOMPLETOM
FLEXIGENE DNA KIT
Slika 13: Elektroforeza izolirane DNA na 2% agaroznem gelu pri Flexigene DNA kit reagenčnem
kompletu.
42
Pri vseh vzorcih so lise dobro vidne in zbite skupaj, kar pomeni, da DNA ni fragmentirana.
Sama intenziteta nam, pove kolikšna je količina DNA. Na sliki 13 je vidno, da smo dobili
zadostno količino DNA, kar smo predhodno potrdili ţe z merjenjem koncentracije na
spektrofotometru.
4.3.2 IZOLIRANA GENOMSKA DNA Z REAGENČNIM KOMPLETOM DNA
ISOLATION KIT FOR MAMMALIAN BLOOD
Slika 14: Elektroforeza izolirane DNA na 2% agaroznem gelu pri reagenčnem kompletu DNA
isolation kit for Mammalian Blood.
Pri vseh vzorcih, razen pri w6163 in w6115, kar smo predhodno ugotovili z merjenjem
koncentracije, so lise dobro vidne. Integriteta je slabša kot pri reagenčnem kompletu
Flexigene DNA kit. S slike 14 je vidno, da so nekateri vzorci bolj razgrajeni.
4.4 PRIMERJAVA OBEH METOD ZA IZOLACIJO DNA
Za primerjavo obeh metod bi bilo najbolje, če bi izolirali iz istih vzorcev, vendar jih nismo
imeli na razpolago. Lahko bi izolirali iz 1 mL krvi, vendar se v laboratoriju najpogosteje
izolira iz 2 mL krvi. Mi smo izbrali 40 vzorcev, pri katerih smo imeli podano koncentracijo
43
levkocitov, in jih razdelili v dve skupini. Skupini se nista razlikovali v koncentraciji
levkocitov, kar smo tudi potrdili z Mann-Whitney testom (p=0,745). To pomeni, da razlika
med koncentracijama levkocitov ni signifikantna in lahko primerjamo obe skupini. Ker pa
vemo, da koncentracija levkocitov vpliva na količino DNA, ki jo dobimo, smo to tudi
potrdili: pri reagenčnem kompletu Flexigene DNA kit s Spearmanovim testom korelacije
(ρ=0,735; p < 0,001), pri reagenčnem kompletu DNA isiolation kit for Mammalian Blood s
Spearmanovim testom (ρ=0,430; p=0,058). Na podlagi teh rezultatov smo ugotovili, da je
imela koncentracija levkocitov vpliv pri reagenčnem kompletu Flexigene DNA kit, pri
reagenčnem kompletu DNA isolation for Mammalian Blood pa v manjši meri. Ugotovili
smo, da je signifikantna razlika količina izolirane DNA pri obeh reagentih (p=0,001).
Signifikantna razlika je tudi v čistosti izolirane DNA (p=0,001), pri čemer je razmerje višje
pri reagenčnem kompletu Flexigene DNA kit, kar je razvidno s slike 13 in slike 14.
Oba postopka sta namenjena izolaciji iz večjih volumnov krvi, vendar se med seboj
razlikujeta. Flexigene DNA reagenčni komplet vsebuje proteinazo K, ki inaktivira DNA-
zo, tako DNA postane manj fragmentirana. Običajno se uporablja v molekularni biologiji
za cepitev beljakovin in odstranjevanje nečistot v času izolacije nukleinskih kislin.
Reagenčni komplet DNA isolation kit for Mammalian Blood pa ne vsebuje proteinaze K,
kar pa lahko zmanjša kakovost in čistost izolirane DNA. Glede na čas, ki ga potrebujemo
za izolacijo DNA, sta postopka enako dolga, vendar je pri DNA isolation kit for
Mammalian Blood večja moţnost kontaminacije, ker moramo vzorec pipetirati v plastične
epruvetke, nato pa še v novo 15 mL epruveto. DNA isolation kit for Mammalian Blood je
cenovno bolj ugoden in ga uporabimo, kadar ne potrebujemo vzorcev za številne analize.
Izkoristek, ki smo ga dobili pri Flexigene DNA reagenčnem kompletu, se ujema z
izkoristkom, ki ga navaja proizvajalec. Pri reagenčnem kompletu DNA isolation kit for
Mammalian Blood pa smo dobili majhen izkoristek izolirane DNA, kar se ne ujema s
podatki, ki jih navaja proizvajalec kompleta. Vzorci, ki so bili optimirani z obema
reagenčnima kompletoma, so primerni za nadaljnje genetske preiskave, kar smo potrdili z
genotipizacijo s hidrolizirajočimi sondami pri drugi diplomski nalogi.
44
5 SKLEP
Postopek izolacije po protokolu z reagenčnim kompletom Flexigene DNA kit smo
optimirali za izolacijo DNA iz zamrznjene polne krvi.
- V postopku izolacije smo uvedli dodatno mešanje na stresalniku za 10 minut.
- Pri optimiranem postopku smo določili razmerje A260/A280 od 1,77 do 1,87. Mediana
(25 in 75 percentil) za razmerje absorbanc A260/A280 je bila 1,81 (1,80−1,82). Za
količino izolirane DNA pa je bila mediana 97,01 (68,38−140,70).
- Območje količine izolirane DNA je bila od 35,67 µg do 215,23 µg.
.
Postopek izolacije po protokolu z reagenčnim kompletom DNA isolation kit for
Mammalian Blood smo optimirali za izolacijo DNA iz zamrznjene polne krvi.
- V postopku izolacije smo po dodatku raztopine za obarjanje proteinov vsebino prestavili
v 2 mL plastične epruvetke in centrifugirali pri 12000 x g.
- Pri optimiranem postopku smo določili razmerje A260/A280 od 1,53 do 2,34. Mediana
(25 in 75 percentil) za razmerje absorbanc A260/A280 je bila 1,78 (1,75−1,80). Za
količino izolirane DNA pa je bila mediana 42,27 (37,43−48,87).
- Območje količine izolirane DNA je bila od 1,14 µg do 70,74 µg.
Pri samem delu in na podlagi statističnih rezultatov smo ugotovili, da je za pridobitev
čimveč in čimbolj čiste izolirane DNA, primernejši komplet reagentov Flexigene DNA kit.
45
6 LITERATURA
1. http://sl.wikipedia.org/wiki/Deoksiribonukleinska_kislina
2. Karlson P, Lebez D, Sernec-Avšič T, Belič I: Biokemija, Ljubljana 1980: 119-134.
3. Kuhelj R: Biokemija v praksi: načela in tehnike, Ljubljana 1996: 77-85.
4. Komel R, Sekulič Fo M: Genetika: od dvojne vijačnice do kloniranja, Učbenik za
gimnazije in srednje tehniške šole, 2006: 15-37.
5. http://www.zappa.com/messageboard/viewtopic.php?f=10&t=17406.
6. Komel R: Genske bolezni in genska preiskava; Proteus 1998, 8/60: 344-356.
7. http://www.druga.org/~inf10708/1f/1f1DensaIlka/1f1DensaIlka.pdf
8. Lodish H, Berk A, Kaiser AC, Krieger M, Scott PM., Bretscer A, Ploegh H, Matsudaira
P: Molecular cell Biology, Sixth edition, New York, 2008: 111-153.
9. http://www.svarog.si/biologija/MSS/index.php?page_id=10937
10. Raspor P,: Biotehnologija, Osnovna Znanja, 1996: 331-347
11. Herzog-Velikonja B, Gruden K, Pašić L: Praktikum iz molekularne biologije, Praktični
del, Ljubljana 2001: 9-19.
12. Herzog-Velikonja B, Gruden K: Praktikum iz molekularne biologije, Teoretični del,
Ljubljana 2000: 23-29.
13. Valjavec F. Izolacija DNA iz krvnega strdka: Diplomsko delo, Univerza v Ljubljani,
2004.
14. Bavdek S. Citologija z osnovami citogenetike za študente veterinarstva, VTOZD za
veterinarstvo VDO biotehniška fakulteta, Ljubljana 1980: 114-183.
15. Carl A. Burtis, Edward R. Ashwood, David E. Bruns. Tietz textbook of clinical
chemistry and molecular diagnostics, St. Louis (Missouri) : Elsevier Saunders, cop. 2006
16. www.mf.uni-lj.si/dokumenti/7fbe347e7d6a1a7ff9c92f535eb8d21e.doc
46
17. Program CEEPUS: DNA Tehnology: Forensic Applications. Summer school, Zagreb
1997.
18. Cushwa WT, Medrano JF. Bio Techniques. 1993; 14(2): 204-7.
19. Klug S. William, Cummings R. Michael: Concepts of Genetics, Sixth edition, Upper
Saddle River, New Jersey, 2000: 17-45, 283-349.
20. Qiagen: Flexigene DNA Handbook
21. https://e-labdoc.roche.com/LFR_PublicDocs/ras/11667327001_en_6.0.pdf
22. http://www.promega.com/resources/protocols/technical-manuals/0/wizard-genomic-
dna-purification-kit-protocol/
23. http://www.mrcgene.com/dnazol.htm
24. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/genecatcher_gdna_blood_man.pdf
25. Old JM. Fetal DNA analysis: Apractical approach, Paperback 2nd edition.1993: 1-19
26. Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple Salting out Procedure for Extracting
DNA from Human Nucleated Cells. Nucleic Acid Res, 1998; 16(3): 1215
27. Grabovec B. Optimiranje postopka iz polne krvi z izsoljevanjem, diplomska naloga,
Ljubljana, 2000
28. Madisen L, Hoar DI, Holroyd CD, Crisp M, Hodes ME. American Journal of Medical
Genetics, 1987; 27(2): 379-90
29. Visvikis S, Schlenck A, Maurice M. Clinical chemistry and laboratory medical. 1998;
36(8): 551-5
30. Coleman WB, Tsongalis GJ. Molecular diagnostics for the Clinical Laboratorian. New
Jersey. Humana, cop. Totowa 1997: 40-42.
31. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual, second
edition. Cold Spring Laboratory Press. New York 1989:
32. Stryer L. Biochemistry, 4th edition. W.H. Freeman and Company. New York, 1995:
75-93, 96-116.
47
33. http://www.nanodrop.com/Library/nd-1000-v3.7-users-manual-8.5x11.pdf
