UNIVERSITÄTSKLINIKUM HAMBURG-EPPENDORF · seltenen Lymphomsubgruppen und myeloproliferativen Syndromen sowie Autoimmun-erkrankungen und Amyloidose (Ljungman et al., 2010; Ljungman

UNIVERSITÄTSKLINIKUM HAMBURG-EPPENDORF

Zentrum für Diagnostik

Institut für Transfusionsmedizin

Direktor der Einrichtung Dr. med. Sven Peine

Immunzytometrische, volumetrische Single-Platform-Analytik von CD34+ Stammzellen und Progenitorzellen

Dissertation

Zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin

Der Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg

vorgelegt von

Alexander Nikolitsis

aus Hamburg

Hamburg 2014

Angenommen von der Medizinischen Fakultät am: 30.07.2014 Veröffentlicht mit Genehmigung der medizinischen Fakultät der Universität Hamburg Prüfungsausschuss, der Vorsitzende: PD Dr. Kai Gutensohn Prüfungsausschuss, 2. Gutachter: PD Dr. Andreas Humpe Prüfungsausschuss, 3. Gutachter: Prof. Dr. Thomas Renné

3

InhaltsverzeichnisInhaltsverzeichnis ......................................................................................................... 2

1. Einleitung .................................................................................................................. 4

1.1 Ziele der Studie ...................................................................................................... 5 1.2 Stammzellen .......................................................................................................... 5 1.2.1 Periphere Blutstammzellen ................................................................................. 6 1.2.2 Medizinische Indikationen peripherer Blutstammzelltransplante .......................... 6 1.2.3 Monitoring und Apheresate ................................................................................. 7 1.2.4 Knochenmarksstammzellen ................................................................................ 8 1.2.5 Nabelschnurblutstammzellen .............................................................................. 8 1.2.6 Kryokonservierung .............................................................................................. 8 1.3 Durchflusszytometrie............................................................................................ 10 1.3.1 Historische Entwicklung der Durchflusszytometrie ............................................ 10 1.3.2 Prinzip der Durchflusszytometrie ....................................................................... 11 1.3.3 CD34-Antigen ................................................................................................... 13 1.3.4 CD45-Antigen ................................................................................................... 13 1.3.5 Antikörper, Epitope und Fluorochrome .............................................................. 13 1.3.6 Stem-Kit ............................................................................................................ 14 1.3.7 Gating-Strategie und Auswertung der Durchflusszytometrie .............................. 15 1.3.8 Dual- und Single-Platform-Methode sowie ISHAGE-Protokoll ........................... 16 1.3.9 Colony Forming Units ........................................................................................ 18

2. Material und Methoden ........................................................................................... 19

2.1 Patientenkollektiv und Blutproben ........................................................................ 19 2.2 Probenvorbereitung: Apheresate, peripheres venöses Blut .................................. 20 2.3 Kryokonservierte Proben ...................................................................................... 21 2.4 Die verwendeten Durchflusszytometer ................................................................. 23 2.5 Statistische Analyse ............................................................................................. 23

3. Ergebnisse .............................................................................................................. 24

3.1 Analysen der peripheren Blutstammzellproben .................................................... 24 3.2 Analysen der Apheresatproben ............................................................................ 26 3.3 Analysen nach Kryokonservierung aus aufgetauten Proben ................................. 29 3.4 Kosten ................................................................................................................. 31 3.5 Zusammenfassung der Ergebnisse ...................................................................... 32

4. Diskussion .............................................................................................................. 33

5. Zusammenfassung ................................................................................................. 38

6. Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................... 39

7. Literaturverzeichnis ................................................................................................. 41

8. Danksagung ............................................................................................................ 48

9. Lebenslauf .............................................................................................................. 49

10. Eidesstattliche Erklärung ....................................................................................... 50

4

1. Einleitung Die Stamm- und Progenitorzellen des hämatopoetischen Systems (HPC =

hematopoietic progenitor cells) besitzen das muzinähnliche Oberflächenprotein CD34

(Cluster of Differentiation 34), welches mit Hilfe der Immunzytometrie gemessen

werden kann (Sutherland et al., 2009).

CD34+ Stammzellen kommen im peripheren Blut in sehr geringer Menge vor

(Wissenschaftlicher Beirat der BÄK, 1997), das heißt, mit etwa 0,05 % der Leukozyten

oder anders ausgedrückt, weniger als 5 CD34+ Stammzellen pro Mikroliter Blut

(Brando et al., 2000). Sie können aber durch Chemotherapie und/oder Wachstums-

faktoren aus dem Knochenmark ausgeschwemmt werden (Wissenschaftlicher Beirat

der BÄK, 1997) und von 0,05% zu einem Anteil von 6-8% der Leukozyten im peri-

pheren Blut steigen (Brando et al., 2000). Dort können sie für ein Transplantat mittels

Zytapherese gesammelt und bis zu ihrem therapeutischen Einsatz in gefrorenem

Zustand gelagert werden (Barnett et al., 2000). Die CD34+ Zellen werden, nach einer

myeloablativen Therapie für die Wiederherstellung des hämatopoetischen Systems

benötigt (Keeney et al., 2004a). Die Zahl dieser klinischen Anwendungen ist sowohl für

autologe als auch für allogene Stammzelltransplantationen in den vergangenen Jahren

kontinuierlich gestiegen (Copelan, 2006), so beispielsweise im Rahmen der dosisre-

duzierten Konditionierung von älteren Patienten, der Behandlung von soliden Tumoren,

seltenen Lymphomsubgruppen und myeloproliferativen Syndromen sowie Autoimmun-

erkrankungen und Amyloidose (Ljungman et al., 2010; Ljungman et al., 2006).

Für die autologe und allogene Stammzelltransplantation ist die Abschätzung des En-

graftmentpotentials eines Stammzellprodukts von zentraler Bedeutung (Sutherland et

al., 2009). Das Engraftment bezeichnet dabei den Zeitpunkt nach einer Transplanta-

tion, an dem es dem Transplantat möglich ist, eine für das Leben ausreichende Menge

an hämatopoetischen Zellen zu bilden. So führen periphere Stammzelltransplantate zur

Rekonstitution des Knochenmarks (Devetten et al., 2007). Die Eignung der Transplan-

tate wird heute meist anhand der Anzahl von CD34+ Zellen/kg Körpergewicht (KG)

festgelegt (Sutherland et al., 2009), dessen Quantifizierung mittels Durchflusszyto-

metrie erfolgt. Für die Abschätzung des klinischen Verlaufs ist die genaue Bestimmung

der CD34+ Stammzellen unabdingbar (Gratama et al., 2001; Watts, 1999).

Des Weiteren kann mit Hilfe des Durchflusszytometers das so genannte Monitoring am

Patienten durchgeführt werden, um die Anzahl von im peripheren Blut mobilisierten

5

CD34+ Zellen zu bestimmen und damit den optimalen Zeitpunkt für die Leukapherese

festzulegen, ferner um die Zahl der Leukapheresen, Zeit und Kosten abschätzen zu

können (Brando et al., 2000; Sutherland et al., 2009).

1.1 Ziele der Studie

Es hat sich gezeigt, dass die immunzytometrische Single-Platform-Methode zur

Messung von CD34+ Zellen der Dual-Platform-Methode überlegen ist. Aus diesem

Grund werden in dieser Studie zwei, auf Single-Platform-Verfahren basierte, Durch-

flusszytometer miteinander verglichen.

Zum einen handelt es sich um das Durchflusszytometer Epics XL (Beckman Coulter,

Krefeld, Deutschland). Dieses arbeitet Bead-basiert und erlaubt eine indirekte Messung

der absoluten CD34+ Zellzahl.

Zum anderen handelt es sich um das Durchflusszytometer C6 der Firma Accuri (Accuri

Cytometers, Ann Arbor, MI, USA [2011 aufgekauft durch Becton Dickinson, Franklin

Lakes, NJ, USA]). Dieses erlaubt volumetrische Messungen, was ein direktes Ergebnis

der absoluten CD34+ Zellzahl zur Folge hat. Dies wiederum kann zu schnelleren und

kostengünstigeren Ergebnissen führen.

Aus diesem Grund werden in dieser Studie als weitere Ziele sowohl die qualitativen

Leistungen beider Geräte erfasst, als auch der ökonomische Aspekt berücksichtigt.

1.2 Stammzellen

Stammzelltransplantationen werden seit den späten 50er Jahren erfolgreich für die Re-

konstruktion des hämatopoetischen Systems nach myeloablativen Therapien einge-

setzt (Thomas et al., 1957). Die Messung der Anzahl hämatopoetischer Stammzellen

ist entscheidend, um eine Aussage über das Engraftment und somit die Länge der

Wiederherstellung des hämatopoetischen Systems zu treffen (Lamb, 2002).

Heutzutage sind Stammzelltransplantationen ein unverzichtbarer Bestandteil in der

Behandlung von hämatologischen, onkologischen und schweren immunologischen

Erkrankungen. Für den klinischen Verlauf ist eine präzise Zählung von CD34+

hämatopoetischen Stammzellen vor der Stammzelltransplantation zwingend nötig

(Watts, 1999; Gratama et al., 2001). Die CD34+ Stammzellen hierfür kommen in

folgenden drei Kompartimenten vor und lassen sich aus diesen folgendermaßen

gewinnen:

6

1.2.1 Periphere Blutstammzellen

Im peripheren Blut eines gesunden Menschen befinden sich 0,01 - 0,1% CD34+ Zellen

(D´Arena et al. 1996; To et al. 1997). Vor etwa drei Jahrzehnten zeigten Patienten mit

Tumorleiden nach einer zytoreduktiven Therapie einen Anstieg an HPC. Dieser Zell-

zahlanstieg, auch Mobilisierung genannt, konnte durch rekombinante hämatopoetische

Wachstumsfaktoren wie G-CSF (granulocyte-colony stimulating factor) weiter erhöht

werden. Des Weiteren führen auch Radiotherapien und Sport zu einer Mobilisierung

der Stammzellen (Siena et al., 1989; Gianni et al., 1989; Gratama et al., 2001; Fritsch,

2012). Die hämatopoetischen Stammzellen werden daher seit vielen Jahren haupt-

sächlich aus dem peripheren Blut gewonnen (Levering et al., 2007).

Der Erfolg einer Transplantation mit Blutstammzelltransplantaten, Knochenmark oder

Nabelschnurblutstammzellen ist nicht nur abhängig von phänotypischen

Kompatibilitäten, sondern auch von der Anzahl der CD34+ Zellen/kg KG im

Transplantat oder der Körperoberfläche des Empfängers (Ngoma et al., 2011).

1.2.2 Medizinische Indikationen peripherer Blutstammzelltransplante

Viele klinische Studien haben bestätigt, dass Transplantationen mit CD34+ Zellen

sicher sind und einen langfristigen Effekt haben (Keeney et al., 2004b). Es existieren

drei wesentliche medizinische Anwendungsbereiche von peripheren Blut-

stammzelltransplantaten.

Bei der ersten Anwendung werden dem Patienten präventiv autologe Stammzellen

retransfundiert, sodass eine über die Norm dosierte zytostatische Chemotherapie

(und/oder Bestrahlung) ermöglicht wird, da die Toleranz des Knochenmarks gesteigert

wurde.

Der zweite Anwendungsbereich bezieht sich auf die myeloablative Therapie, wobei Zy-

tostatika und/oder Bestrahlung in einer Hochdosistherapie eingesetzt werden, die mit

hoher Wahrscheinlichkeit eine irreversible Zerstörung der Hämatopoese zur Folge ha-

ben. Nachfolgend ist eine Stammzelltransplantation dringend erforderlich.

Ein anderer Anwendungsbereich ist die allogene Stammzelltransplantation, wobei

einem HLA-identischen (Human Leukocyte Antigen) Spender periphere Blut-

stammzellen entnommen werden und diese nach ausreichender Konditionierung dem

Empfänger transplantiert werden (Wissenschaftlicher Beirat der BÄK, 1997).

7

1.2.3 Monitoring und Apheresate

Um für eine Transplantation adäquate Leukaphereseprodukte zu erhalten, ist die Zahl

der im peripheren Blut mobilisierten CD34+ Zellen von entscheidender Bedeutung

(Gratama et al., 2001). Die Mobilisierung kann unter anderem durch Chemotherapie,

G-CSF oder Granulozyten-Makrophagen-CSF erfolgen (Humpe et al., 2005). Um

möglichst ergiebige Apheresate zu erhalten, spielt das tägliche Monitoring des

peripheren Blutes des Patienten vor der Apherese eine bedeutende Rolle (Gratama et

al., 2001). Wenn die abgenommene Blutprobe weniger als 10 CD34+ Zellen/ L enthält,

wird von einem unzureichenden Apheresat von weniger als 0,5 x 106 CD34+ Zellen/kg

KG ausgegangen (Gratama et al., 2001). Neuere Studien haben gezeigt, dass 5

CD34+ Zellen/ L eine Vorhersage eines Apheresats von mindestens 0,5 x 106

Zellen/kg KG erlauben (Sutherland et al., 2009). Werden im peripheren Blut 10–20

CD34+ Zellen/µL gemessen, führt diese Zellzahl im Allgemeinen zu einem Apheresat

von 0,5–1 x 106/kg KG. Ein Messergebnis im peripheren Blut von 20–40 CD34+

Zellen/kg erzeugt etwa 1–2 x 106 CD34+ Zellen/kg KG. Ein Monitoring mit mehr als 40

CD34+ Zellen/µL spricht für eine sehr gute Mobilisierung, die in den meisten Fällen ein

Transplantat von 2 x 106/kg sichert (Gratama et al., 2001; Keeney et al., 1998).

Für die Berechnung des Apheresats bei allogenen Blut- und Knochenmarkstransplan-

tationen in der klinischen Praxis wird empfohlen, Bezug auf das ideale Körpergewicht

zu nehmen und nicht auf das aktuelle Körpergewicht (Cilley et al., 2004).

Wird einem Patienten ein Apheresat von 2,5 x 106 Zellen/kg KG (vor der Kryokonser-

vierung gemessen) verabreicht, erfolgt voraussichtlich ein Engraftment des hämatopo-

etischen Systems 12 bis 14 Tage nach der Infusion (Sutherland et al., 2009). In einer

anderen Studie wurde gezeigt, dass sich das Engraftment bei Patienten, die weniger

als 2 x 106 CD34+ Zellen/kg KG erhalten haben, deutlich langsamer entwickelte

(Mittelwert 17 Tage) als bei Patienten, die mehr als 2 x 106 CD34+ Zellen/kg KG

(Mittelwert 12 Tage) beziehungsweise mehr als 5 x 106 CD34+ Zellen/kg KG (Mittelwert

10 Tage) erhalten haben (Sutherland et al., 2003).

Die PBSC-Transplantation (peripheral blood stem cells transplantation) führt im Gegen-

satz zur Knochenmarkstransplantation zu einer schnelleren Wiederherstellung des hä-

matopoetischen Systems. Dadurch entstehen neben einem geringeren Kontamina-

tionsrisiko durch Tumorzellen auch geringere Krankenhauskosten und eine erhöhte

Anzahl an T-Lymphozyten und Natural-Killer-Zellen (NK cells), was einem Post-

Transplantat-Rückfall und dem Gebrauch an Medikamenten entgegensteht (Barnett et

8

al., 1999). Die reduzierten Krankenhauskosten kommen unter anderem dadurch zu

Stande, dass die Entnahme peripherer Blutstammzellen hingegen der Gewinnung der

Knochenmarksstammzellen keiner Narkose bedarf (Wissenschaftlicher Beirat der BÄK,

1997). Darüber hinaus kann das PBSC-Produkt ex vivo besser bearbeitet werden, wie

beispielsweise die Selektion von CD34+ Zellen, die Elimination von Tumorzellen und

der Gen-Transfer (Barnett et al., 1999).

1.2.4 Knochenmarksstammzellen

Im Knochenmark befinden sich physiologischerweise ungefähr 1% CD34+ Zellen. Die

Gewinnung der Knochenmarksstammzellen wird in Vollnarkose durchgeführt, da das

Knochenmark aus dem Beckenkamm entnommen wird (Goldman, 1994), wobei es zu

Nebenwirkungen kommen kann. Wichtig bei der allogenen Knochmarkstransplantation

(KMT) ist es, einen passenden Spender, der die gleichen HLA-Oberflächenproteine

trägt, zu finden. Dies trifft nur in etwa 25% der Fälle zu. Wird ein HLA-Typ transplantiert

der nicht mit dem Empfänger übereinstimmt, steigt die Wahrscheinlichkeit für eine

Abstoßungsreaktion oder einer Graft-versus-Host-Krankheit stark an (Theilgaard-

Mönch et al., 1999). Die Knochenmarkstransplantationen werden seit Ende der

Fünfzigerjahre erfolgreich durchgeführt (Gratama et al., 2001).

1.2.5 Nabelschnurblutstammzellen

Nabelschnurblut hat in den letzten Jahren immer mehr an Bedeutung gewonnen. Es ist

zu einer wichtigen Quelle von HPC geworden und weltweit wurden Blutbanken einge-

richtet, in denen Nabelschnurblut mittels Kryokonservierung gelagert wird (Gratama et

al., 2001; Sutherland et al., 2009; Hunt et al., 2003). Die weltweit erste Nabelschnur-

bluttransplantation fand 1988 statt (Gluckman et al., 1989).

Zur Gewinnung der Nabelschnurblutstammzellen wird die Nabelschnur postpartal

punktiert und das Plazentarestblut in einem Sammelbeutel aufgefangen. In der

Blutbank wird die Probe für die Konservierung zentrifugiert und anschließend mittels

Zugabe einer Konservierungslösung zur Lagerung tiefgefroren (ZKRD, 2011).

1.2.6 Kryokonservierung

Die Anfänge der Kryokonservierung lassen sich auf das Jahr 1948 zurückführen, als

Polge et al. das Glycerin als Kryoprotektiv entdeckten. Smith beschrieb 1950 für Ery-

throzyten den Schutz vor Hämolyse während der Einfrier– und Auftauprozesse durch

9

Glycerin. 1951 entwickelte Solviter ein Dialyseverfahren zur Glycerinauswaschung und

führte zusammen mit Mollison die erste Transfusion mit aufgetauten Erythrozyten

durch. Barnes und Loutit gelang in einem Tierexperiment 1955 die erste erfolgreiche

Transfusion von zuvor kryokonservierten homologen Knochenmarksstammzellen.

Körbling et al. beschrieben 1986 die erste erfolgreiche Behandlung mit autologen

hämatopoetischen Stammzellen, die im Rahmen der Vorbehandlung mittels Leukaphe-

rese gewonnen, kryokonserviert und anschließend wieder aufgetaut worden waren

(Körbling et al., 1986).

Solange die Glasübergangstemperatur für reines Wasser unterschritten wird, spielt die

Lagerungstemperatur nur eine untergeordnete Rolle. Lovelock stellte 1953 anhand

zweier verschiedener Experimente fest, dass wahrscheinlich nicht die

„Eiskristallbildung selbst, sondern eher der damit verbundene ‚Anstieg der

Elektrolytkonzentration im Extrazellulärraum’ die Zellen schädigt.“ (Lovelock, 1953).

Der mittlere Prozentsatz für die Erholung lebensfähiger CD34+ Zellen nach der Kryo-

konservierung lag in einer Studie mit 52 Patienten bei 66.4% (Yang et al., 2005). Bei

vier der Patienten lag die Erholung der CD34+ Zellen bei unter 50%. Dies führte jedoch

zu keinem Unterschied des Engraftments im Vergleich zu den anderen Patienten (Yang

et al., 2005).

Es hat sich gezeigt, dass sich Stammzellen aus Nabelschnurblut, die kryokonserviert

und für 5, 10 und 15 Jahren in flüssigen Stickstoff gelagert wurden, keinen signifikan-

ten Unterschied in Zellproliferation und –lebensfähigkeit zeigten. Das weist darauf hin,

dass es während des Einfrierens und des Auftauens zum Zellverlust kommt und nicht

während der Lagerung (Yang et al., 2005). Eine Studie ergab, dass für eine optimale

Wiederherstellung der CD34+ Zellen eine aufeinander folgende Zugabe von Dimethyl-

sulfat (Me2SO4), eine langsame Kühlung zwischen 1°C und 2,5°C/min und eine serielle

Auswaschung des Kryoprotektivums erforderlich ist (Hunt et al., 2003). Eine andere

Studie zeigte, dass eine Lagerung über Nacht vor der Kryokonservierung keinen

nennenswerten Effekt auf die Viabilität zeigt. Des Weiteren wurde kein signifikanter

Unterschied in Bezug auf die Verträglichkeit durch die Beanspruchung des Einfrierens

und Auftauens zwischen den Zellen schwer vorbehandelter Patienten und gesunden

allogenen Spendern entdeckt (Fietz, et al., 2002). Letztendlich wurde bei den meisten

Proben kein Unterschied der CD34–Population aufgedeckt (Fietz et al., 2002).

Zunehmend wichtig wird die CD34+ Zellanalyse der postkryokonservierten Proben.

Denn es hat sich gezeigt, dass die Zahl der lebensfähigen Stamm– und Vorläuferzellen

10

des endgültigen Transplantats vor der Transfusion die hämatopoetische Rekonstitution

und den klinischen Erfolg beeinflussen (Allen et al., 2002; Yang et al., 2005).

1.3 Durchflusszytometrie

1.3.1 Historische Entwicklung der Durchflusszytometrie

Die Ära der Durchflusszytometrie begann 1953 als Wallace Henry Coulter ein Gerät

konstruierte, um Zellen in Kochsalzlösung einzeln zu zählen und ihre Größe zu be-

stimmen (whcf.org, 2013). Dieses Gerät ließ sich Wallace H. Coulter unter dem US Pa-

tent #2,656,508 patentieren (Coulter, 1953). Nach ihm ist das Coulter Prinzip benannt,

gemäß welchem in einer leitenden Flüssigkeit gelöste Partikel, z.B. Blutzellen, im elek-

trischen Feld anhand der elektrischen Impedanz gezählt und ihre Größe bestimmt

werden können. Die Innovation bestand darin, dass eine benutzerunabhängige Zell-für-

Zell-Zählung ermöglicht wurde und gleichzeitig die Volumenverteilung genau

gemessen werden konnte (Ruhenstroth-Bauer und Zang, 1960). 1965 wurde die

Zellseparierung auf der Basis des Coulter Prinzips von Fulwyler eingeführt, um Zellen

in einer Suspension zu sortieren. Das Gerät konnte 500–1000 Zellen pro Sekunde

analysieren und bis zu 50% isolieren (Fulwyler 1965).

Die fluoreszenzbasierte Durchflusszytometrie wurde 1968 von Göhde entwickelt und

kam als erster kommerzieller Durchflusszytometer 1969 als ICP 11 von Phywe,

Göttingen auf den Markt (cyto.purdue.edu, 2013). Ein weiterer Meilenstein in der

Entwicklung des Durchflusszytometers ist das fluorescence-activated cell sorting

(FACS), welches die Detektierung von Zellen mittels spezifischer Lichtstreuung und

Fluoreszenzcharakteristika und anschließend die Sortierung der Zellen anhand ihrer

Ladung im elektrischen Feld in verschiedene Behälter erlaubt. Die Analyse und

Sortierung von Zellen mit dem FACS von Herzenberg und Kollegen (Herzenberg et al.,

1976) ist seit der Erfindung in den 1970er Jahren bis heute im Wesentlichen

unverändert (Herzenberg et al., 2002). FACS ist ein geschützter Name von Becton,

Dickinson and Company.

Positive Auswirkungen auf die Durchflusszytometrie hatte die Entwicklung und der Ein-

satz von Computern in den Sechzigerjahren. Heutzutage ist die Durchflusszytometrie

im hohen Grade computergesteuert. Leistungsstarke Rechner ermöglichen optimale

Messbedingungen, automatische Datenspeicherung, Darstellung der Messergebnisse

in Listen oder als Graphen, automatische Analysen und das Erstellen eines Reports

(Giaretti, 1997). Moderne Durchflusszytometer haben einen hohen Durchsatz, denn sie

11

analysieren mehrere tausend Zellen pro Sekunde in Echtzeit und können Zellen mit

bestimmten Eigenschaften aussortieren. Des Weiteren wurden Durchflusszytometer

mit mehreren Laserkomponenten und Fluoreszenzdetektoren entwickelt. So hat der

MoFlo Astrios HIGH Speed-Sorter 7 Laser und kann 49 Fluoreszenzen detektieren, 30

davon simultan. Der Image-Stream-X von Raytest ist in der Lage, mit integriertem

Fluoreszenzmikroskop eine visuelle Darstellung und Bildspeicherung der zu unter-

suchenden Zellen zu ermöglichen (Zähringer, 2011).

1.3.2 Prinzip der Durchflusszytometrie

Die Durchflusszytometrie ist die wichtigste Methode zur Erhebung von Informationen

über einzelne Zellen innerhalb einer heterogenen Probe. Darüber hinaus bietet sie eine

hohe Messgeschwindigkeit (Jahan-Tigh et al., 2012). Durchflusszytometrische

Messungen können an verschiedenen Geweben durchgeführt werden, u.a. an

peripheren Blutstammzellproben, Knochenmark und Zellkulturlinien (Macey, 2007).

Dabei ist die Durchflusszytometrie die Methode der Wahl zur Zählung von CD34+

hämatopoetischen Stamm– und Progenitorzellen (Macey, 2003). Die Quantifizierung ist

wichtig für die Bestimmung des Zeitpunktes der Apherese sowie für die Beurteilung

eines Apheresats, um ein erfolgreiches Engraftment zu sichern (Macey, 2003). Die

Durchflusszytometrie ist die zuverlässigste Methode zur korrekten Messung des

Engraftmentpotenzials, der Zusammensetzung der zellulären Transplantate und zum

Monitoring des Beginns der Zytapherese (Gutensohn et al., 2000; Gratama et al.,

2001; Lamb, 2002).

Um den wachsenden Anforderungen der klinischen Anwendungen gerecht zu werden,

wurde die Durchflusszytometrie in den vergangenen Jahren zunehmend verbessert

(Sutherland et al., 1996; Gratama et al., 2001).

Die Durchflusszytometrie ist in der Lage gleichzeitig mehrere Messungen an jeder Zel-

le durchzuführen und damit im Stande, eine Subpopulation in einer heterogenen Popu-

lation zu identifizieren, zudem sind die Messwerte hoch sensitiv und reproduzierbar

(De Rosa et al., 2001). Dabei handelt es sich um ein System, das aus drei funktio-

nellen Einheiten besteht:

1. Aus einem Laser und einem Detektor für die optische Umsetzung,

2. einem hydraulischen System, das die Passage jeder einzelnen Zelle für die

Messung sichert und den Probenstrom im Zentrum stabilisiert, was als hydro-

dynamische Fokussierung bezeichnet wird,

12

3. und einem Computersystem, das die elektrischen Signale umsetzt und die Da-

ten speichert.

Während sich eine Zelle in der Messkammer befindet und der Laserstrahl auf sie prallt,

werden mehrere Signale wie Forward Scatter (FSC), Sideward Scatters (SSC) und die

Fluoreszenzbanden gleichzeitig erzeugt und gemessen (Cho et al., 2010).

Sobald ein Laserstrahl auf eine Zelle trifft, wird dieser Strahl in alle Richtungen gestreut

(Macey, 2003). Die Größe einer Zelle wird mit Hilfe des FSC bestimmt (Darzynkiewicz

et al., 1990; Macey, 2003; Nguyen et al., 2007). Das Streulicht wird in einem Winkel

von 0,5–10° Grad mit einem Sensor gemessen, der sich auf der gegenüberliegenden

Seite der 488-nm/blue Laserquelle befindet (Jahan-Tigh et al., 2012). Dabei wird es

von der Querschnittsfläche der Zelle beeinflusst, das heißt, dass große Zellen einen

großen und kleine Zellen einen kleinen FSC besitzen (Giaretti, 1997). Da die Zellen

während der hydrodynamischen Fokussierung von einem Hüllstrom umschlossen und

zentriert werden, erlaubt dies die Messung jeder einzelnen Zelle.

Die Granularität, die die extra- und intrazellulären Bestandteile umfasst, wird mit Hilfe

des SSC bestimmt, wobei die Streuung des Laserlichts im rechten Winkel mittels einer

Serie an Sensoren detektiert wird. Des Weiteren können Antigene von Zellen mit an

Antikörper gekoppelten Fluorochromen bestimmt werden. Die Fluorochrome ab-

sorbieren die Laserenergie und emittieren es wieder in Form ihrer spezifischen

Wellenlänge. Diese so entstandenen Fluoreszenzen können mit dem optischen

System, den Photodetektoren, detektiert und in elektrische Impulse umgewandelt

werden, die dann von einer speziellen Software gelesen werden (Jahan-Tigh et al.,

2012).

Alle erfassten Signale werden im Computersystem abgespeichert und stehen zur Aus-

wertung bereit. In einem Dot-Plot, der graphischen Darstellung der Messergebnisse,

werden auf der X-Achse der Forward Scatter und auf der Y-Achse der Sideward

Scatter aufgetragen. Jeder Punkt in einem Dot-Plot entspricht einem Ereignis, wobei

anhand der Anhäufungen Zellen mit ähnlichen Streulichteigenschaften zu erkennen

sind. Aufgrund der großen Bandbreite der fluoreszierenden Signale werden die

Fluoreszenzmessungen hingegen normalerweise logarithmisch dargestellt

(Herzenberg et al., 2006).

13

1.3.3 CD34-Antigen

Das CD34-Antigen ist der bedeutendste Parameter zur durchflusszytometrischen

Messung hämatopoetischer Vorläuferzellen (Gutensohn und Serke, 1996). Es handelt

sich dabei um ein transmembranes, hochglykosyliertes Einzelketten Antigen vom Typ 1

mit einem Molekulargewicht von etwa 110kDa (Sutherland et al., 1992). Dieses Antigen

wird in unreifen hämatopoetischen Stammzellen gebildet und nimmt im Laufe der Zell-

differenzierung fortlaufend ab bis es schließlich völlig verschwindet (Civin et al., 1984).

Das CD34-Gen ist auf dem Chromosom 1q32 kodiert (Molgaard et al., 1989; Tenen et

al., 1990).

Über die genaue Funktion von CD34 ist bisher wenig bekannt (Furness et al., 2006).

Es ist bekannt, dass das CD34-Antigen vom Endothel der Lymphknoten exprimiert wird

und als wichtiges Adhäsionsmolekül für T-Zellen dient. Die T-Zellen können über eine

L-Selectin-CD34-Bindung in die Lymphknoten eintreten. Des Weiteren ist das CD34-

Antigen in vaskulären Endothelzellen, im areolären Gewebe und im fetalen und adul-

tem Nervengewebe nachzuweisen. Darüber hinaus blockiert CD34 die

Mastzelladhäsion und begünstigt zudem die Dilatation der Blutgefäße (Fina et al.,

1990; Lin et al., 1995; Wikipedia, 2011).

1.3.4 CD45-Antigen

Alle Zellen hämatopoetischen Ursprungs, ausgenommen sind Thrombozyten und Ery-

throzyten, exprimieren das Glykoprotein CD45-Antigen (Dalchau et al., 1980). Das

CD45-Antigen ist ein sogenannter Pan-Leukozyten-Marker, welcher in unterschiedlich-

er Intensität von polymorphkernigen Zellen, Monozyten und Lymphozyten exprimiert

wird (Brando et al., 2000). Die verschiedenen Moleküle dieser Antigenfamilie unter-

scheiden sich durch ihre Glykosylreste, die durch alternatives Splicing aus einem einzi-

gen Gen entstehen. Sie sind jeweils spezifisch für bestimmte Zelltypen (Streuli et al.,

1988; Thomas, 1989; Trowbridge, 1991).

1.3.5 Antikörper, Epitope und Fluorochrome

1984 produzierten Civin et al. den ersten monoklonalen Antikörper (My10) der das auf

der Oberfläche von hämatopoetischen Vorläuferzellen lokalisiertes CD34-Antigen

erkennt (Civin et al., 1984). CD34 monoklonale Antikörper erkennen Epitope, von

denen drei Klassen beschrieben worden sind, deren Basis die unterschiedlichen

Enzymsensitivitäten zu Grunde liegen. Klasse-1-Epitope sind gegenüber Glykoprotea-

14

sen, Chymopapain und Neuramidasen empfindlich, wobei Klasse-2-Epitope lediglich

gegen Glykoproteasen und Chymopapain empfindlich sind (Arseniev et al., 1999).

Klasse-3-Epitope zeigen für beide Enzyme eine Unempfindlichkeit. Da das CD34-Anti-

gen negativ geladen ist und unterschiedliche Glykoformen besitzt, eignen sich einige

monoklonale Antikörper und Fluorochrome nicht zum Nachweis des CD34-Antigens.

Daher eignen sich beispielsweise fluoreszierende Isothiocyanate (FITC), die selbst

negativ geladen sind, nicht zum Nachweis von Klasse-2-Epitopen, die ebenfalls negativ

geladen sind (Sutherland et al., 1992; Barnett et al., 1999; Gratama et al., 2001).

Die monoklonalen Antikörper (mab) 8G12 und 581 haben sich in der Praxis als repro-

duzierbar und gut vergleichbar erwiesen. Diese monoklonalen Antikörper reagieren mit

den Klasse-3-Epitopen des CD34-Antigens (Sutherland et al., 1992). PE-Konjugate

werden für die Darstellung von CD34+ Zellen empfohlen, da sie die stärkste Fluores-

zenz besitzen und sich aus diesem Grund sehr gut zur Darstellung von CD34+ Zellen

eignen (Arseniev et al., 1999; Johnsen, 1995). Der ideale Emissionsbereich der PE-

Konjugate von etwa 530nm interferiert mit dem der FITC-Konjugate, wobei die stärkste

zelluläre Autofluoreszenz erreicht wird (Gutensohn et Serke, 1996). Weitere Vorteile

von PE-Konjugaten sind die bessere Abgrenzung zwischen CD34+ und CD34– Zellen,

die reduzierte Bindung an FC-Rezeptoren und toten Zellen (Barnett et al., 1999). PE

wird im Verhältnis 1:1 an Antikörper gekoppelt, FITC im Verhältnis 1:5 bis 1:10, wobei

dieses Verhältnis die F/P-Ratio angibt, die abhängig von den Antikörperchargen

wechseln (Gutensohn et Serke, 1996).

Es sollten Pan-CD45 Antikörper konjugiert mit FITC genutzt werden, die alle Iso- und

Glykoformen auf dem CD45-Antigen erkennen, da sich das FITC-Konjugat durch eine

gute Unterscheidung zwischen CD45+ und CD45– Zellen bewährt hat (Keeney et al.,

1998; Barnett et al., 1999).

1.3.6 Stem-Kit

Bei dem Stem-Kit (Beckman Coulter, Krefeld, Deutschland) handelt es sich um ein Ver-

fahren, das auf dem ISHAGE Protokoll für die Identifizierung von hämatopoetischen

Stammzellen basiert. Es beinhaltet einen CD45-FITC monoklonalen Antikörper und ei-

nen CD34-PE monoklonalen Antikörper, die in einer Kombination zur Verfügung gestellt

werden. Darüber hinaus enthält das Kit den Vitalitätsfarbstoff 7-Amino-Actinomycin (7-

AAD). Dieser Vitalitätsfarbstoff erlaubt die Unterscheidung vitaler und toter Zellen, da

sich dieser bei beschädigter Zellmembran zwischen die Basenpaare der DNS, insbe-

15

sondere zwischen die Basenpaare Cytosin und Guanin, legt. Somit handelt es sich bei

7-AAD-positiven Zellen um beschädigte oder abgestorbene Zellen und bei 7-AAD-ne-

gativen Zellen um vitale Zellen. Des Weiteren enthält das Stem-Kit eine Lyselösung,

die auf zehnprozentiger NH4Cl-Lösung basiert.

Bei dem letzten Reagenz handelt es sich um StemCount-Beads. Diese ermöglichen ei-

ne indirekte Messung der absoluten CD34+ Zellzahl. Hierbei wird eine bekannte An-

zahl von fluoreszierenden Beads im Durchflusszytometer analysiert und das Zahlen-

verhältnis zwischen Beads und CD34+ Zellen ermittelt, wodurch die absolute CD34+

Zellzahl auf einer Single-Platform durchgeführt werden kann (Keeney et al., 2004b).

1.3.7 Gating-Strategie und Auswertung der Durchflusszytometrie

Die Triggerparameter Forward Scatter (FSC), Sideward Scatter (SSC), CD34 und

CD45 spielen die entscheidende Rolle in der durchflusszytometrischen Analyse.

Die CD45 Expression wird für die sequentielle Gating-Strategie genutzt, um CD34+

Zellen zu identifizieren (Keeney et al., 1998). Für die Kontrolle der korrekten Positio-

nierung des Triggers ist die korrelierende Darstellung von FSC gegen die CD45-Ex-

pression (Dot-plot) notwendig. Des Weiteren sind die Korrelationen SSC gegen CD45,

SSC gegen CD34, und CD45 gegen CD34 von Bedeutung. SSC gegen CD45 grenzt

die Zellen ein, die als Leukozyten definiert sind. Um die Region der CD34-exprimieren-

den Zellen zu erhalten, wird der PE-CD34-Antikörper im Dot-plot gegen den SSC auf-

getragen (Gutensohn et Serke, 1996).

In Zytaphereseprodukten finden sich häufig Thrombozyten, die durch den SSC nicht

wesentlich von kleinen Lymphozyten unterschieden werden können, jedoch einen

deutlichen Unterschied im Bezug zu ihrem FSC zeigen (Gutensohn et Serke, 1996).

Wird das Gate in der Durchflusszytometrie so eingestellt, dass Events, die unterhalb

des FSC Thresholds liegen, ausgeschlossen werden, hat dies zur Folge, dass keine

apoptotischen Zellen, subzelluläre Partikel, Thrombozyten und Erythrozyten gemessen

werden (Gisselo et al., 2002). Dies wiederum hat den Vorteil, dass apoptotische Zellen

und subzelluläre Partikel nicht fälschlicherweise als Leukozyten gezählt werden und so

zu einer falsch hohen Anzahl von CD34+ Zellen führen. Automatischen Zellzählungen

kann dieser Fehler jedoch unterlaufen (Gisselo et al., 2002).

Bei der Knochenmarkregeneration und der zytoreduktiven Therapie ist jedoch darauf

zu achten, dass einige CD34+ Zellen sehr niedrige CD45-Level exprimieren (Barnett et

al., 1999).

16

1.3.8 Dual- und Single-Platform-Methode sowie ISHAGE-Protokoll

Das erste Dual-Platform-Verfahren zur Zählung CD34+ Stammzellen wurde 1994 ent-

wickelt und als das Milan-Protokoll vorgestellt (Brando et al., 2000; Ngoma et al 2011).

Dieses Verfahren gebraucht neben dem Durchflusszytometer einen hämatologischen

Analysator für die absolute Leukozytenzählung und gibt somit den Prozentsatz einer

gegebenen Teilmenge von Zellen unter der gesamten Leuko- oder Lymphozytenzahl

an (Keeney et al., 1998; Gratama et al., 2001; Ngoma et al., 2011).

Im Gegensatz zum Dual-Platform-Verfahren bietet das Single-Platform-Verfahren die

Möglichkeit, die absolute CD34+ Zellzahl in einer Blutprobe anzugeben (Keeney et al.,

1998), indem es die Zellen von Interesse, in diesem Falle die CD34+ Stammzellen, in

einem genau bestimmten Volumen, mit Hilfe von Antikörpern oder eines Zellfarbstoffes,

identifiziert und kontaminierte Zellen ausschließt, ohne dabei eine Referenzgruppe zu

benutzen. Diese identifizierten CD34+ Stammzellen stehen somit in direkter Beziehung

zum originalen Blutvolumen (Brando et al., 2000; Gratama et al., 2001; Keeny et al.,

2000). Das Single-Platform-Verfahren kann entweder volumetrisch oder auf der Basis

von Mirkopartikeln (Beads) erfolgen (Gratama, 2001). Die Beads-basierte Technologie

wurde 1982 konzipiert (Stewart et Steinkamp, 1982).

Mitte der Neunzigerjahre haben etliche Studien die Notwendigkeit einer Standard-

isierung für die Zählung von CD34+ Zellen verdeutlicht. Eine 2-Farben Methode wurde

entwickelt, in der HPC als CD34 (hell), CD45 (dunkel), FSC (niedrig bis intermediär)

und SSC (niedrig) definiert wurde. Diese Methode wurde von der International Society

of Hematotherapy and Graft Engineering (ISHAGE) in ihre Leitlinien übernommen und

später für die Single-Platform-Methode modifiziert (Keeney et al., 1998; Keeney et al.,

2004a). Vor allem die Einführung des Single-Platform-Verfahrens und die Verwendung

von Viabilitäts-Farbstoffen erbrachten bessere Informationen für die Transplantations-

Zentren, da die Verwendung von automatisierten Hämatologieanalysatoren umgangen

und stattdessen die wichtigen Parameter allein von der durchflusszytometrischen

CD34+ Zell-Quantifizierung abgeleitet werden konnten (Sutherland, 1997; Keeney et

al., 1998; Sutherland et al., 2009). Das Single-Plattform-Verfahren wird mit fluoreszier-

enden Beads und unter der Ergänzung des Farbstoffes 7-Aminoactinomycin D (7-AAD)

durchgeführt (Sutherland et al., 2009), welche den Ausschluss von toten Zellen

während der Analyse erlauben (Keeney et al., 2004a), was nach heutigen Erkenntnis-

sen jedoch diskutiert wird (Fritsch, 2012). Eine bekannte Menge an fluoreszierenden

Beads wird einem bekannten Volumen von gefärbtem Blut beigemengt. Die Beads wer-

17

den zusammen mit den Zellen gezählt, um deren Anzahl pro Mikroliter zu berechnen.

Diese Methode ist von Lyse- und Antikörpervolumen unabhängig (Brando et al., 2000).

Das ISHAGE-Protokoll hat einen bedeutsamen Einfluss auf die Genauigkeit und Zuver-

lässigkeit gezeigt (Sutherland et al., 2009), jedoch garantiert die Implementierung von

standardisierten Protokollen keine genaue Messung (Lysak et al., 2010). Dieses Proto-

koll wurde von Anfang an, herstellerunabhängig, für den Gebrauch von Durchflusszyto-

metern entwickelt (Sutherland et al., 2009).

Studien bestätigen die Genauigkeit der CD34+ Zellzählung durch die auf fluoreszieren-

den Mikropartikeln basierte Single-Platform-Methode (Schlenke et al., 1999). Dabei

werden Beads – lyophilisierte fluoreszierende Kunststoffpartikel – in bekanntem Volu-

men und exakt überprüfter Konzentration in eine Blutprobe pipettiert und mit dem

Durchflusszytometer gemessen. Da die Konzentration der fluoreszierenden Beads

bekannt ist, kann die absolute CD34+ Zellzahl errechnet werden. Dabei kann dieses

Ergebnis vom Durchflusszytometer selbst hergeleitet werden, indem er das Verhältnis

von Beads zu CD34+ Zellen misst (Keeney et al., 1998).

Die Single-Platform-Analyse hat sich gegenüber der Dual-Platform-Analyse aufgrund

ihrer guten Vergleichbarkeit zwischen den Laboratorien bewährt (Gratama et al., 2001)

und wird unter anderem aus diesem Grund empfohlen (Moretti et al., 2002).

Hinsichtlich der fluoreszierenden Beads im Single-Platform-Verfahren kann hier auf ein

zweites Gerät, den hämatologischen Ana-lysator, verzichtet werden. Das Single-

Platform-Verfahren ist schnell, einfach, akkurat (Keeney et al., 1998) und besitzt

gegenüber der Dual-Platform-Methode eine geringere Möglichkeit abweichender

Ergebnisse (Brando et al., 2000).

Unter dem aktuellen Single-Plattform-Verfahren müssen die Proben allerdings noch

weiter verarbeitet werden, zudem müssen verschiedene Anpassungen für genaue

Messungen im Labor gewährleistet werden. Außerdem beruhen die aktuellen Single-

Platform-Verfahren auf der exakten Zugabe von Beads bei einer bestimmten Konzen-

tration. Kürzlich wurde ein Durchflusszytometer eingeführt, das direkte volumetrische

Zellanalysen und quantitative Analysen ermöglicht ohne den Zusatz von künstlichen

Beads (Accuri.com, 2010).

18

1.3.9 Colony Forming Units

Eine alternative Form der CD34-Zählung, die Abschätzung von hämatopoetischen Pro-

genitorzellen in sogenannten Colony-Forming-Units (CFU), steht zwar in Beziehung zu

dem CD34-Level, jedoch fehlt es ihr an Reproduzierbarkeit und die Analysezeit ist ver-

längert (Barnett et al., 1999). Intercenter-Variationskoeffizienten für die CFU-Zählung

betragen ca. 30%. Ferner gibt es keine geeignete Möglichkeit, die Ungenauigkeit in der

CFU-Zählung zu minimieren (Serke et al., 1997). Die CFU-GM (Colony-Forming-Units–

Granulocyte/Macrophage) unterscheiden sich von Patient zu Patient, nicht aber zwi-

schen Leukaphereseprodukten des gleichen Patienten (Yang et al., 2005).

19

2. Material und Methoden

2.1 Patientenkollektiv und Blutproben

In dieser Studie wurden drei verschiedene Materialien verwendet. Neben Restmaterial

der routinemäßigen Laboruntersuchung von Zytaphereseprodukten und kryokonser-

vierten Proben, die von Aphereseprodukten nach dem Auftauen stammten, wurden

Proben aus peripherem venösem Blut untersucht.

In der Gruppe, in welcher die Proben aus dem peripheren Blut der Patienten bzw.

Spender stammten, litten fünf Patienten an einem multiplen Myelom (MM) und sechs

an einem Non-Hodgkin-Lymphom (NHL). Die übrigen drei Proben stammten von

gesunden Spendern. Die Apheresat-Gruppe beinhaltete vier Proben von drei Patienten

mit einem multiplem Myelom, zwei Patienten mit einem Non-Hodgkin-Lymphom und

drei gesunden Spendern. In der Gruppe der aufgetauten Proben waren fünf Patienten

an einem Non-Hodgkin-Lymphom (NHL) und drei Patienten an einem multiplen

Myelom erkrankt.

Die 14 Proben, die vor der extrakorporalen Zellsammlung von Probanden aus dem

peripheren Blut gesammelt wurden, stammten von elf männlichen Patienten und drei

weiblichen gesunden Spendern. Das Durchschnittsalter der Patienten lag im Mittelwert

bei 52 Jahren (28 bis 67 Jahre), das Durchschnittsalter der gesunden Spender lag im

Mittelwert bei 45 Jahren (41 bis 54 Jahre).

Insgesamt wurden in der Apheresat-Gruppe neun Proben untersucht. Darunter

befanden sich sechs Proben aus sechs verschiedenen Aphereseprodukten von fünf

männlichen Patienten mit einem Durchschnittsalter von 54 Jahren (52 bis 67 Jahre)

sowie drei Proben von zwei gesunden weiblichen Spenderinnen und einem gesunden

männlichen Spender mit einem Durchschnittsalter von 41 Jahren (26 bis 54 Jahre).

Des Weiteren wurden in den Gruppe der kryokonservierten Proben 13 Proben aus 13

verschiedenen Produkten von neun Apheresaten, von acht verschiedenen Patienten

stammend, getestet, wobei es sich um eine weibliche Patientin und sieben männliche

Patienten mit einem Durchschnittsalter von 60,5 Jahren (53 bis 68 Jahre) handelte.

20

Tabelle 1: Tabellarische Darstellung der Patienten bzw. Spender.

Probenmaterial

Apherese- proben

kryokonservierte Proben

Periphere Blutproben

Multiples Myelom 4 3 5 Non-Hodgkin-Lymphom 2 5 6 Gesunder Spender 3 - 3

Insgesamt: 9 8 14

Die gesunden Spender erhielten zweimal täglich 5 µg/kg KG G–CSF (Neupogen®,

Amgen, Thousand Oaks, CA, USA) subkutan. Die erste Apherese wurde am fünften

Tag der Mobilisation durchgeführt.

Die Mobilisierung der hämatopoietischen Progenitorzellen vor Chemotherapie wurde

täglich mit 5-10 µg/kg KG G-CSF durchgeführt. Für die Chemotherapien wurde eine

Vielzahl an Medikamenten verwendet, die sich nach etablierten Studienprotokollen

richteten (z.B. Cyclophosphamid, Ifosfamid, Epirubicin, Etoposid, Carboplatin, Dexa-

methason, hochdosiertes Cytosinarabinosid [ara-C], Cisplatin, Carmustin oder Melpha-

lan).

2.2 Probenvorbereitung: Apheresate, peripheres venöses Blut

Die Patientenproben wurden sowohl mit dem Zytometer Epics XL (Beckman Coulter,

Krefeld, Deutschland) als auch mit dem Accuri C6 (Accuri Cytometers, Ann Arbor, MI,

USA [2011 aufgekauft durch Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA]) nach den für

die Single-Platform geltenden ISHAGE-Vorgaben analysiert (Sutherland et al., 1996;

Keeney et al., 1998). Die Proben wurden mit dem Stem-Kit (Beckman Coulter)

vorbereitet. Das Stem-Kit beinhaltet einen CD45-Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-

konjugierten monoklonalen Antikörper (mAb J33), einen CD34-Phycoerythrin-

Antikörper (mAb 581), sowie jeweils einen isoklonen Kontroll-Antikörper und den

Viabilitätsfarbstoff 7-Aminoactinomycin A (7-AAD).

Die identische Vorbereitung von drei Röhrchen erfolgte in mehreren Arbeitsschritten,

wobei das dritte Röhrchen der Kontrolle diente. Bei Prozessierung von Vollblut wurde

aufgrund der hohen Absorption durch Hämoglobin kein Lichtschutz benötigt

(Gutensohn et Serke, 1996). In den ersten beiden Schritten wurden den Röhrchen

21

jeweils 20µl CD45-FITC/CD34-PE und 7-AAD hinzugefügt. Daraufhin wurden je 100µl

Probelösung hinzugegeben. Danach wurden die Proben für fünf Sekunden gevortext

(Bio Vortex V1, lab4you GmbH, Berlin, Deutschland), wobei auf die eingestellte

Frequenz geachtet wurde, da diese Einfluss auf die Vitalität der Zellen und die Bindung

der Antikörper hat (Gutensohn et Serke, 1996). Anschließend wurde für 20 Minuten bei

Raumtemperatur (20±2°C) inkubiert. Im folgenden Schritt wurden 2ml einer Lyse,

bestehend aus 10-%iger Amoniumchlorid-Lösung (NH4Cl), die mit destilliertem Wasser

verdünnt worden war, hinzugegeben. Daraufhin wurden die Proben erneut für fünf

Sekunden gevortext (Bio Vortex V1) und für zehn Minuten inkubiert. Danach wurden

100µl StemCounts (Beckman Coulter) hinzugefügt. Da ein exakt definiertes Volumen in

die drei Röhrchen revers pipettiert wurde, kann das Volumen indirekt anhand der

Anzahl der Beads berechnet werden. Die Inkubationszeiten fanden zum Schutze der

fluoreszierenden Antikörper im Dunkeln statt.

Nachdem das Lyse-Reagenz in die Probe pipettiert worden war, erfolgte umgehend die

durchflusszytometrische Analyse. Sofern dies nicht möglich war, wurde die Probe

maximal eine Stunde kühl gelagert (Barnett et al., 1999). Die Fixation diente der

erhöhten Haltbarkeit der Probe, der Verbesserung der Zellstabilität und Streulichteigen-

schaften. Da es zu Veränderungen von Epitopen kommen kann, wurden die Zellen erst

nach der Antikörperbindung mit gepufferten Formaldehydlösungen fixiert.

Mithilfe der StemCount-Beads kann eine indirekte Messung der absoluten CD34+ Zell-

zahl durchgeführt werden. Dabei werden die Beads zusammen mit den Zellen gezählt,

deren Anzahl pro Mikroliter mit folgender Formel errechnet wird (Brando et al., 2000):

Anzahl der Zellen/µL = (Anzahl der gezählten Zellen x Konzentration der Beads) (Anzahl der gezählten Beads)

Bei der Justierung des Durchflusszytometers wurde beachtet, dass die Betriebstempe-

ratur erreicht wurde, da es sonst zu Messfehlern kommen kann (Gutensohn et Serke,

1996).

2.3 Kryokonservierte Proben

PBPC Transplantate wurden in Konzentrationen von 3.108–5.107 Zellen/ml auf -100°C

in einem so genannten controlled rate freezer (Kryo10/II, Messer Cryotherm, Siegthal,

Deutschland) nach der Zugabe eines gleichen Volumens aus 50% Hydroxyethylstärke

22

(HES 200/0.5 10%, Fresenius, Deutschland), 20% DMSO (WAK-Chemie, Deutsch-

land), 10% ACD-A (Fresenius) und 20% autologem Plasma kryokonserviert.

Das controlled rate freezing, welches bei +8°C begann, ist ein Gefriervorgang, das in

kontrollierten Intervallen die zu konservierenden Zellen einfriert, indem flüssiger

Stickstoff in eine geschlossene Kammer gebracht wird, in welcher sich die Zellen

befinden. Dieses Verfahren verhindert die zelluläre Dehydrierung und

Eiskristallformationen (Encyclopædia Britannica, 2011). Im ersten Schritt des controlled

rate freezings wurde die Kammer, bei einer Geschwindigkeit von -1°C/min, auf -18°C

herab gekühlt. Daraufhin kühlte das System bei -50°C/min auf -80°C herab, um im

anschließenden Schritt bei +50°C/min auf -34°C aufzuwärmen. Diese Temperatur

wurde für neun Minuten gehalten. Der weitere Kühlprozess verlief bei -2,1°C/min auf -

55°C und abschließend wurde bei einer Geschwindigkeit von -3,75°C/min auf eine

Temperatur von -100°C herabgekühlt. Nach Beendigung dieses

Kryokonservierungsverfahrens wurden der Transplantbeutel und die Satellitenöhrchen

in der Gasphase des flüssigen Stickstoffs gelagert. Sowohl die Temperatur im

Lagerbehältnis als auch die Menge an flüssigem Stickstoff wurden permanent

kontrolliert (Biosafe Control ® und Adurb Automatic Filling Device, Messer Cryotherm,

Siegthal, Deutschland), um zu gewährleisten, dass die Temperatur unter dem Deckel

stets unter -150°C lag.

Nach mindestens 24 Stunden Lagerung der Proben unter diesen Bedingungen wurden

sie einem Flüssigstickstoffbehälter entnommen und manuell in einem 37°C warmen

Wasserbad aufgetaut (Humpe, et al., 2005). Daraufhin wurden die Proben in einem

1:10 Verhältnis mit Hilfe einer Phosphat-gepufferten Salzlösung (PBS; Gibco,

Darmstadt, Deutschland) und eines zehnprozentigen AB-Serums (Institut für Transfu-

sionsmedizin, Universitätsklinikum Schleswig-Holstein, Campus Kiel) verdünnt. Die In-

kubationszeit der kryokonservierten Proben mit den monoklonalen Antikörpern CD34-

PE und CD45-FITC wurde hier auf zehn Minuten reduziert, da diese die

Wiederfindungsrate der CD34+ oder CD45+ Zellen nicht signifikant beeinflusst (Humpe

et al., 2005).

Unmittelbar nach der Zugabe des Fluoreszenzfarbstoffs wurde die Suspension aus je-

der der drei Röhrchen aufgeteilt. Die Proben wurden gevortext. Anschließend wurden

Datenerfassung und -analyse gestartet, wobei beide Durchflusszytometer parallel ar-

beiteten. Für die Auswertung der Dateien wurde der StemONE Algorithmus verwendet.

23

2.4 Die verwendeten Durchflusszytometer

In dieser Studie wurden zwei Durchflusszytometer verwendet. Dabei arbeitet der Epics

XL Bead-basiert, der Accuri C6 hingegen volumetrisch. Da der Accuri C6 eine direkte

volumetrische Messung ermöglicht, ohne dabei auf Beads angewiesen zu sein, sind ei-

ne direkte Kalkulation der Zellkonzentration möglich und die Bead-assoziierten Störfak-

toren der Messungen ausgeschlossen. Die Genauigkeit des Single-Platform-Verfah-

rens ist von der Technologie des Durchflusszytometers abhängig (Brando et al., 2000).

Das Durchflusszytometer von Accuri C6 hat die Maße 27,9 x 36,3 x 41,9 cm und ein

Gewicht von 13,6 kg, während der Epics XL 50,8 x 61,0 x 57,2 cm misst und 63,5 kg

wiegt.

Neben der Reagenzien und der Durchflusszytometer können sowohl die Software als

auch die Gating-Strategie zusätzlich Einfluss auf die Messergebnisse nehmen (Barnett

et al., 2000).

2.5 Statistische Analyse

Für die statistische Analyse wurden neben Excel (Microsoft, Redmond, WA, USA) das

Softwareprogramm GraphPad Prism 4.0 (GraphPad Software, Inc. La Jolla, CA, USA)

verwendet.

Sofern nicht anders angegeben, wurden die Daten als Minimum, Maximum, Median

und Range sowie als 95% Konfidenzintervall (CI) dargestellt. Die Analyse, inwiefern die

zu vergleichenden Methoden übereinstimmen, wurde gemäß der Bland-Altman-

Analyse (Bland et al., 1986) und durch Berechnung einer Spearman-Korrelation

durchgeführt, unter der Annahme, dass keine Gauss-Verteilung vorlag. Gegebenenfalls

wurden die Daten mit dem nichtparametrischen Wilcoxon-Test für gepaarte Daten

verglichen. Ein p-Wert von 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

24

3. Ergebnisse In dieser Studie wurden Messreihen von drei verschiedenen Materialien von CD34+

Zellen zum Vergleich der beiden durchflusszytometrischen Methoden herangezogen.

3.1 Analysen der peripheren Blutstammzellproben

In den 14 Blutstammzellproben aus peripherem venösem Blut betrug die Streubreite

auf dem Accuri C6 für CD34+ Ereignisse 0–88 Zellen/µL und mit dem Epics XL 0–100

Zellen/µL. Der Median betrug für den Accuri C6 41 Zellen/µL, für den Epics XL 41,5

Zellen/µL (s. Tabelle 2).

Die Werte der beiden Durchflusszytometer korrelierten signifikant miteinander (p <

0,01) mit r = 0,95. Die Bland-Altman-Analyse zeigte jedoch, dass sich die Mess-

ergebnisse zwischen den beiden Durchflusszytometern insbesondere in CD34+ Pro-

ben mit weniger als fünf Zellen/µL unterscheiden.

Die Auswertung der Messergebnisse der CD45+ Proben ergab, dass die Ergebnisse

des Accuri C6 und des Epics XL signifikant miteinander korrelieren (p < 0,01) mit r =

0,996. Das Accuri C6 lag im Median bei 5.065 Zellen/µL mit einer Streubreite von 770–

68.996 Zellen/µL. Das Epics XL lag im Median bei 4.775 Zellen/µL mit einer Streubreite

807–70.782 Zellen/µL (s. Tabelle 2).

Das 95%-Konfidenzintervall zeigte eine fast vollständige Deckungsgleichheit sowohl für

die CD34+ als auch die CD45+ Zellen an den getesteten Durchflusszytometern:

CD34+ Zellen: 95% CI für Accuri C6 = 18–63 Zellen/µL; 95% CI für Epics XL = 19–67

Zellen/µL; CD45+Zellen: 95% CI für Accuri C6 = 3.525–26.755 Zellen/µL; 95% CI für

Epics XL = 3.320–27.148 Zellen/µL.

Die Daten aus Tabelle 2 sind in den Abbildungen 1 und 2 dargestellt.

25

Tabelle 2: Ergebnisse der peripheren Blutstammzellproben auf den Durchflusszyto-

metern Accuri C6 und Epics XL

CD34+

Zellen/µL (Accuri C6)

CD34+ Zellen/µL (Epics XL)

CD45+ Zellen/µL

(Accuri C6)


Minimum 0 0 770 807

Maximum 88 100 68.996 70.782

Median 41,0 41,5 5.065 4.775

95%–CI 18 – 63 19 – 67 3.525 – 26.755 3.320 – 27.148

Abbildung 1: Vergleich der Messdaten von Accuri C6 und Epics XL mit Blutstammzell-

proben aus peripherem venösem Blut. Korrelationsdarstellung der Messdaten von

Accuri C6 gegen Epics XL mit CD34+ Zellen/µL. Die Regressionskurve beträgt (y) =

0,93 * (x) + 0,68 (Gutensohn, Nikolitsis et al., 2012).

Gestrichelte Linie: 95% CI; durchgehende Linie: Regressionsgerade.

26

Abbildung 2: Vergleich der Messdaten von Accuri C6 und Epics XL mit CD34+ Blut-

stammzellproben aus peripherem venösem Blut. Darstellung der Bland-Altman-

Analyse (Gutensohn, Nikolitsis et al., 2012).


3.2 Analysen der Apheresatproben

In den neun Apheresatproben betrug die Streubreite auf dem Accuri C6 für CD34+

Ereignisse 543–24.500 Zellen/µL und auf dem Epics XL 600–24.660 Zellen/µL. Der

Median betrug für den Accuri C6 2.355 Zellen/µL und für den Epics XL 2.680 Zellen/µL.

Die Werte der beiden Durchflusszytometer korrelierten signifikant miteinander (p <

0,01) mit r = 0,933.

Das 95%-Konfidenzintervall zeigte eine fast komplette Deckungsgleichheit für beide

Parameter an den getesteten Durchflusszytometern: CD34+ Zellen: 95% CI für Accuri

C6 = (-)424–11.128 Zellen/µL; 95% CI für Epics XL = (-)313–11.244 Zellen/µL.

Die Bland-Altman-Analyse ergab eine gute Übereinstimmung der Messergebnisse der

beiden Durchflusszytometer. Es zeigte sich eine geringfügige Abweichung der Mess-

daten im Bereich von niedrigen CD34+ Zellzahlen.

Die Messdaten zwischen Accuri C6 und Epics XL für CD45+ Zellen korrelieren nicht

signifikant (p = 0,097) mit r = 0,60. Der 95%-Konfidenzintervall zeigte jedoch mehrheit-

lich Deckungsgleichheit auf: 95% CI für Accuri C6 = 270.285–560.808 Zellen/µL; 95%-

27

CI für Epics XL = 3.286.652–623.381 Zellen/µL. Die Bland-Altman-Analyse für CD45+

Messungen zeigte keine großen Deviationen.

Die Daten aus Tabelle 3 sind in den Abbildungen 3 und 4 veranschaulicht.

Tabelle 3: Ergebnisse der Apheresatproben auf den Durchflusszytometern

Accuri C6 und Epics XL.

CD34+ Zellen/µL (Accuri C6)


Minimum 543 600

Maximum 24.500 24.660

Median 2.355 2.680

95%–CI (-)424 – 11.128 (-)313 – 11.244

28

Abbildung 3: Vergleich der Messdaten von Accuri C6 und Epics XL mit Apheresatpro-

ben. Korrelationsdarstellung der Messdaten von Accuri C6 gegen Epics XL mit CD34+

Zellen/µL. Die Regressionskurve beträgt (y) = 1,0 * (x) 105,7 (Gutensohn, Nikolitsis

et al., 2012).


Abbildung 4: Vergleich der Messdaten von Accuri C6 und Epics XL mit CD34+

Apheresatproben. Darstellung der Bland-Altman-Analyse (Gutensohn, Nikolitsis et al.,

2012).


29

3.3 Analysen nach Kryokonservierung aus aufgetauten Proben

Nach dem Auftauen der acht kryokonservierten Proben aus Apheresaten betrug die

Streubreite auf dem Accuri C6 für CD34+ Ereignisse 650–6.544 Zellen/µL und auf dem

Epics XL 680–6.220 Zellen/µL. Der Median betrug für den Accuri C6 2.399 Zellen/µL

und für den Epics XL 2.170 Zellen/µL. Die Werte der beiden Durchflusszytometer

korrelierten signifikant miteinander (p < 0,01) mit r = 0,929.

Die Bland-Altman-Analyse ergab eine gute Übereinstimmung der Messergebnisse der

beiden Durchflusszytometer. Das 95%-Konfidenzintervall zeigte ebenfalls eine fast

komplette Deckungsgleichheit für beide Parameter an den getesteten Durchflusszyto-

metern (CD34+ Zellen: 95% CI für Accuri C6 = 1.562–4.224 Zellen/µL; 95% CI für

Epics XL = 1.646–4.195 Zellen/µL).

Die Auswertung der CD45+ Ereignisse ergab keine großen Unterschiede und die Kor-

relation zwischen den beiden Durchflusszytometern war signifikant (p < 0,01) mit r =

0,9.

Die Viabilität aller Ereignisse, die mit dem Accuri C6 gemessen wurden, betrug 74,61%

mit einer Streubreite von 70,27–88,78 %. Die Viabilität der CD45+ Zellen, die mit dem

Epics XL gemessen wurden, betrug 75,75 % mit einer Streubreite von 70,55–92,20 %.

Der 95%-Konfidenzintervall zeigte keine großen Unterschiede: 95% CI für Accuri C6 =

73,56–81,74 %; 95% CI für Epics XL = 74,53–83,88 %.

Die Daten aus Tabelle 4 sind in den Abbildungen 5, 6 und 7 veranschaulicht.

Tabelle 4: Ergebnisse der aufgetauten Apheresatproben auf den Durchflusszytometern

Accuri C6 und Epics XL

CD34+

Zellen/µL (Accuri C6)

CD34+ Zellen/µL

(Epics XL)

CD45+ Viabilität in %

(Accuri C6)

CD45+ Viabilität in %

(Epics XL)

Minimum 650 680 70,27 70,55

Maximum 6.544 6.220 88,78 92,20

Median 2.399 2.170 74,61 75,75

95% CI 1.562 – 4.224 1.646 – 4.195 73,56 – 81,74 74,53 – 83,88

30

Abbildung 5: Vergleich der Messdaten von Accuri C6 und Epics XL mit aufgetauten

Apheresatproben. Korrelationsdarstellung der Messdaten von Accuri C6 gegen Epics

XL mit CD34+ Zellen/µL. Die Regressionskurve beträgt (y) = 1,034 * (x) - 126.6

(Gutensohn, Nikolitsis et al., 2012). Gestrichelte Linie: 95% CI; durchgehende Linie: Regressionsgerade.

Abbildung 6: Vergleich der Messdaten von Accuri C6 und Epics XL mit CD34+ aufge-

tauten Apheresatproben. Darstellung der Bland-Altman-Analyse (Gutensohn, Nikolitsis

et al., 2012).


31

Abbildung 7: Viabilität der CD45+ Ereignisse in kryokonservierten und aufgetauten

Proben. Diese Graphik stellt die Bland-Altman-Analyse für die Viabilität gemessen an

den beiden Durchflusszytometern dar. (Gutensohn, K, Nikolitsis, A et al., 2012)


3.4 Kosten

Um den ökonomischen Aspekt zu berücksichtigen, wurde der Preis für eine Einzelmes-

sung ermittelt. Da der Accuri C6 seine Messungen volumetrisch durchführt, werden kei-

ne Beads benötigt. Dies wiederum erlaubt dem Anwender auf das Reagenzien–Kit zu

verzichten und die Reagenzien einzeln zu erwerben.

Die monoklonalen Antikörper für den Accuri C6 stammen von der Firma DIANOVA

GmbH (Hamburg, Deutschland). Das Stem-Kit für den Epics XL stammt von der Firma

Beckman Coulter (Krefeld, Deutschland). Da das System des Accuri C6 auf ent-

ionisiertes Wasser als Hüllflüssigkeit optimiert wurde, können somit die laufenden

Kosten weiter reduziert werden. Bei der Verwendung des Epics XL entstehen

zusätzliche Kosten durch den Flow-Check, der einmal täglich, und durch das FlowSet,

welches einmal wöchentlich auf dem Epics XL durchgeführt werden sollten.

32

Tabelle 5: Kostenkalkulation einer Einzelmessung für den Accuri C6

Accuri C6 Reagenz Listenpreis Testgröße Preis pro Analyse

CD45 FITC / IgG1 PE 595,00 € 100 5,95 €

CD45 FITC / CD34 PE 447,00 € 100 4,47 €

ADG-Lyse 388,00 € 1.000 0,39 €

7-AAD 134,00 € 400 0,34 €

Summe: 11,14 €

Tabelle 6: Epics XL, Kostenkalkulation für eine Einzelmessung

Epics XL Reagenz Listenpreis Testgröße Preis pro Analyse

Stem-Kit Reagenz 1.314,00 € 50 26,28 €

Summe: 26,28 €

3.5 Zusammenfassung der Ergebnisse

Die Ergebnisse dieser Studie zeigen eine gute Vergleichbarkeit der Messwerte aus den

Analysen der CD34+ und CD45+ Zellen in den peripheren Blutstammzellproben mit

geringen Konzentrationen an Zielzellen, genauso wie in den Apheresatprodukten mit

hohen Konzentrationen an Zielzellen und in den behandelten Zellprodukten wie den

kryokonservierten und aufgetauten Zellprodukten. Eine Ausnahme bilden die Vitalitäts-

messungen der CD45+ Zellen in den aufgetauten Apheresatproben. Ein Grund für

diese Ungenauigkeit könnte in der kleinen Probenanzahl liegen, denn der p-Wert, der

in einem zweiarmigen Design überprüft worden ist, zeigte bereits einen Trend in diese

Richtung mit p = 0,097. Die kleine Probenanzahl ließ sich aufgrund des kurzen

Zeitrahmens, in dem das Gerät für die Untersuchung zur Verfügung stand, nicht

vergrößern. Wegen der hier aufgezeigten Limitierung dieser Studie sollten weitere

Untersuchungen durchgeführt werden, um unsere Ergebnisse zu bestätigen.

33

4. Diskussion Die Zahl der autologen und allogenen Stammzelltransplantationen ist über die Jahre

kontinuierlich gestiegen (Copelan, 2006; Lungman et al., 2006). Da die Qualität eines

Stammzelltransplantats von der Zahl der lebensfähigen CD34+ Stamm– und Progeni-

torzellen abhängt, ist die genaue Bestimmung dieser Zellen unerlässlich (Baech et al.,

2000; Gratama et al., 2001; Allen et al., 2002). Dies erfordert eine qualitätsgesicherte

laboranalytische Überprüfung der Transplantate. Hierfür stellt die Single-Platform-

Methode heutzutage ein modernes und zuverlässiges Verfahren zur CD34+ Zell-

zählung dar (Keeney et al., 1998; Chang et al., 2004; Sutherland et al., 2009; Dauber

et al., 2011). Das primäre Ziel dieser Studie war die Untersuchung der Vergleichbarkeit

der Messergebnisse eines neuen Durchflusszytometers, mit dem Potenzial zur direkten

volumetrischen Messung von CD34+ Stamm– und Progenitorzellen, mit denen einer

bewährten durchflusszytometrischen Single-Platform-Methode.

Im Folgenden werden zuerst die jeweiligen Verfahren der Dual- und Single-Platform-

Methoden diskutiert. Anschließend werden die Messergebnisse der Bead-basierten

denen der volumetrischen Methode, die für diese Studie erhoben worden sind, gegen-

übergestellt, verglichen und in den Kontext der alltäglichen Praxis gestellt.

Die Single-Platform-Methode, bei der nur ein Messgerät verwendet wird, entwickelte

sich auf der Basis der Dual-Platform-Methode. Während mit der Dual-Platform-

Methode der Prozentsatz einer Teilmenge von Zellen berechnet wird (Keeney et al.,

1998; Gratama et al., 2001; Ngoma et al., 2011), kann mit der Single-Platform-Methode

die absolute CD34+ Zellzahl ermittelt werden (Keeney et al., 1998). Die Single-

Platform-Methode hat sich gegenüber der Dual-Platform-Methode aufgrund ihrer guten

Vergleichbarkeit zwischen den Laboratorien bewährt (Gratama et al., 2001) und wird

unter anderem aus diesem Grund empfohlen (Moretti et al., 2002). Zudem ist die Dual-

Platform-Methode durch die Leistungsfähigkeit des hämatologischen Analysators be-

grenzt (Brando et al., 2000). Durch den hämatologischen Analysator kann es bei

Anwesenheit von kernhaltigen roten Blutzellen zu einer falsch hohen Leukozyten-

zählung kommen (Barnett et al., 1999; Gratama et al., 2001). Auch Proben mit

geringen Leukozytenzahlen zeigen unterschiedliche Ergebnisse (Brando et al., 2000).

Ein anderer Nachteil besteht darin, dass die Konfiguration des Durchflusszytometers

und des hämatologischen Analysators für die zu bestimmende Population an Zellen

exakt korrelieren muss, da es sonst zu Fehlern kommen kann (Brando et al., 2000).

Darüber hinaus beinhaltet die Dual-Platform-Methode generell ein Lyse-Wash-

34

Verfahren, was zum Verlust von Leukozyten führen kann (Keeney et al., 1998). Das

Single-Platform-Verfahren hingegen ist schnell, einfach, akkurat (Keeney et al., 1998)

und besitzt gegenüber der Dual-Platform-Methode eine geringere Möglichkeit für

abweichende Ergebnisse (Brando et al., 2000).

Insgesamt zeichnet sich das Single-Platform-Verfahren durch eine gute Reproduzier-

barkeit aus (Keeney et al., 1998). Es gilt daher seit Jahren als das zuverlässigste Ver-

fahren für die Messung von CD34+ Zellen (Sutherland et al., 2009; Chang et al., 2004)

und für einen Vergleich der Messergebnisse zwischen diversen Laboratorien (Gratam

et al., 1999). Die Resultate einer internationalen Multicenter-Studie zeigten beim

Einsatz der Single-Platform-Methode einen coefficient of variation (CV) von unter 9%

zwischen den beteiligten Laboratorien (Gratama et al., 2003).

Die Reproduzierbarkeit und Genauigkeit der Single-Platform-Methode wird jedoch auch

von einigen Faktoren beeinflusst, wobei das „Reverse-Pipettieren“ einen der

wichtigsten darstellt (Serke et Johnsen, 2001). Da es beim konventionellen Pipettieren

zum Einschluss von Luftbläschen kommen kann, wird der Einsatz eines „Reversen

Pipettierens“ empfohlen, wie es auch in dieser Studie durchgeführt wurde.

Es kann bei der Single-Platform-Methode zwischen einem volumetrischem oder einem

Bead-basiertem Verfahren unterschieden werden (Gratama, 2001). Die Bead-basierte

Technologie wurde 1982 konzipiert (Stewart et Steinkamp, 1982), während die volu-

metrische Methode bereits 1969 entwickelt wurde (Dittrich et Göhde, 1969).

Die Bead-basierte Single-Platform-Methode hat sich zur Zeit als „Goldstandard“ durch-

gesetzt (Keeney und Sutherland, 2000). Die direkte volumetrische Durchflusszyto-

metrie wurde schon früher angewandt, jedoch war aufwändiges Kalibrieren mit Mikro-

partikeln notwendig, um Operator-unabhängige Genauigkeit und Stabilität der Kalibra-

tion über einen längeren Zeitraum zu ermöglichen (Connelly et al., 1995).

Die Bead-basierte Methode kann neben der eigentlichen durchflusszytometrischen

Funktion auch Teil einer umfassenden Qualitätskontrolle im Labor für CD4-Zellzählung

sein. Lawrie et al. zeigten am EpicsXL-MCL für die CD4-Zellzählung, dass fehlerhafte

Werte der Bead-Count-Rate durch erneute Messung zeitnah revidiert werden konnten

ohne die Laborroutine zu unterbrechen (Lawrie et al., 2010). Des Weiteren bestätigen

Studien die Genauigkeit der CD34+ Zellzählung durch diese auf fluoreszierende

Mikropartikel basierte Single-Platform-Methode (Schlenke et al., 1999). Einige

Sachverhalte können jedoch die Genauigkeit der Bead-basierten Zählung beein-

flussen. Zu diesen gehören unter anderem, dass Beads dazu neigen entweder auf dem

35

Boden zu sedimentieren oder zur Oberfläche auf zu steigen. Darüber hinaus kann es

zu einer möglichen Überlappung der Fluoreszenzsignale kommen. Deshalb ist eine

sorgfältige Mischung und Dispersion der Beads und der Zellproben erforderlich sowie

die Vermeidung von Bläschen- oder Schaumbildung (Brando et al., 2000). Aufgrund

der Verdünnung der Proben, wie zum Beispiel in den Aphereseprodukten, kann die

Proteinkonzentration reduziert sein, was wiederum dazu führt, dass die Beads

verklumpen und es infolgedessen zu falschen Messungen kommt (Brando et al., 2001).

Deshalb kann der Einsatz einer direkten volumetrischen Bestimmung der CD34+ Er-

eignisse viele dieser Einflussfaktoren umgehen und von Vorteil sein. Vor diesem Hin-

tergrund wurde in dieser Studie das Durchflusszytometer Accuri C6 eingesetzt (Accuri

Cytometers, Ann Arbor, MI, USA [2011 aufgekauft durch Becton Dickinson, Franklin

Lakes, NJ, USA]). Es ermöglicht eine direkte volumetrische Messung, ohne dabei auf

Beads angewiesen zu sein. Hierdurch ist eine direkte Messung der Zellkonzentration

möglich. Bei dieser Technik sind die Bead-assoziierten Störfaktoren der Messungen

somit ausgeschlossen. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen eine gute Korrelation für

CD34+ und CD45+ Zellzählungen. Sie zeigen sowohl in den Monitoring-Proben, mit

niedrigen Konzentrationen der Zielzellen, und Apherese-Proben, mit hohen

Konzentrationen dieser Zellen, als auch in den aufgetauten kryokonservierten Proben

eine gute Vergleichbarkeit.

Heutzutage ist die Zählung der CD4 T-Zellen für die Antiretrovirale Therapie (ART)

kostengünstig möglich, indem volumetrische Single-Platform Durchflusszytometer ohne

teure Beads Verwendung finden. So wiesen unter anderem zwei Studien nach, dass

das volumetrische Auto40 Durchflusszytometer (Apogee Flow Systems Ltd., Hemel

Hempstead, Großbritannien) im Vergleich mit dem FACSCalibur (Becton Dickinson,

Franklin Lakes, NJ, USA) verwendbare Ergebnisse liefert. Die volumetrischen

Durchflusszytometer sind insbesondere in Entwicklungsländern von Bedeutung, da sie

neben der Kosteneinsparung einfach zu transportieren sind. Die Durchflusszytometer

Auto40 und CyFlow SL_3 können beispielsweise mit einer 12-Volt-Autobatterie genutzt

werden und somit auch an schwierig zugänglichen Orten, die nicht über die nötigen

Resourcen verfügen, betrieben werden (Mbopi-Keou et al., 2012b). Dies wurde beim

mobilen Einsatz des Auto40 mit einer guten Korrelation zu den Referenzwerten

bestätigt (Mbopi-Keou et al., 2012a). Möglicherweise findet die Technik daher auch

ihren Einsatz bei der Bestimmung von CD34+ Zellen.

In der Gegenüberstellung der beiden Single-Platform-Methoden – dem Bead-basierten

und dem volumetrischen Verfahren – zeigte sich in dieser Studie, dass eine direkte vo-

36

lumetrische Zählung von CD34+ und CD45+ Zellen in verschiedenen Proben möglich

ist, da sie eine gute Korrelation zur Bead-basierten Methode, dem derzeitigen „Gold-

standard“ der CD34+ und CD45+ Zellzählung, aufweist.

In mehreren Studien zeigte sich eine gute Vergleichbarkeit zwischen der volu-

metrischen und der Bead-basierten Single-Platform-Methode (Cassens et al., 2004;

Fryland et al., 2006; Mortazavi, 2012). In einer Vergleichsstudie, durchgeführt in einem

Entwicklungsland, zeigte sich eine gute Korrelation zwischen dem volumetrisch

messenden Cyflow SL blue (Partec GmbH, Münster, Deutschland) und den Bead-

basierten FACScan und FACSCount (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ USA)

(Dieye et al., 2005). Eine weitere Studie hatte andere Ergebnisse für CD34+

Zellzählung ergeben, jedoch war der dort verwendete Ortho CytotronAbsolute

Durchflusszytometer (Ortho Diagnostic Systems, Amersham, UK) für diese Aufgabe

nicht geeignet, da nur ein zu geringes Volumen der einzelne Proben verwendet und

analysiert werden konnte (Gratama et al., 1999). Technische Unterschiede zwischen

verschiedenen Durchflusszytometern tragen zu einem großen Teil zu den Unter-

schieden der Messergebnisse zwischen den Laboratorien bei (Parker et al., 1990;

Chance et al., 1995; Levering et al., 2007), was auch im Vergleich von Studien

beachtet werden sollte. In einer weiteren Studie zeigte sich die volumetrische Messung

ökonomischer und zeitsparender (Mbopi-Keou et al., 2012b).

In der Gegenüberstellung der Durchflusszytometer Epics XL und Accuri C6 zeigten ein-

zig die Vitalität von CD45+ Zellen in aufgetauten Proben und die Reproduzierbarkeit

Abweichungen zwischen den Geräten. So war die mit dem Accuri C6 gemessene Vita-

lität im Vergleich zum Epics XL signifikant erniedrigt. Eine Erklärung hierfür könnte die

erhöhte Viskosität kryokonservierter Proben im Vergleich zu Apheresaten sein. Somit

würde dies zu Messfehlern führen. Ferner wurde die Reproduzierbarkeit der

Messungen getestet. Die Reproduzierbarkeit ist ein Verfahren, in dem dieselbe Probe

mehrmals gemessen wird, mit dem Ziel wiederholt ein identisches Ergebnis zu

erhalten. Der Epics XL lieferte unter diesem Aspekt gute Werte. Der Accuri C6

hingegen zeigte sehr unterschiedliche Resultate. Der Grund für die nicht verwertbare

Reproduzierbarkeitsmessung mit dem Accuri C6 liegt daran, dass die Messung des

Accuri C6 sowohl von der Viskosität der Probe als auch von dem Level der Flüssigkeit

in einem Röhrchen abhängig ist. Wird die gleiche Probe beispielsweise viermal

gemessen, verliert diese jedes Mal ein bestimmtes Volumen, weshalb der Flüssig-

keitslevel sinkt, was somit zu Fehlmessungen führt, da von dem falschen Flüssig-

keitsstand ausgegangen wird.

37

Ein anderer Nachteil des Accuri C6 ist die Tatsache, dass bei jedem Wechsel einer

Monitoring- oder Apheresatprobe auf eine kryokonservierte Probe oder umgekehrt eine

Kalibrierung notwendig wird. Hierbei muss ein Firmware Update durchgeführt werden.

Dabei wird mit Hilfe des Softwareprogramms CFlow Plus ein Firmware Update und die

Kalibrierung der Flüssigkeit durchgeführt, was insgesamt etwa 10 Minuten Zeit

beansprucht. Diese Prozedur ist notwendig, da die Flüssigkeits-Matrix des Accuri C6

nur auf eine Viskosität eingestellt ist.

Sowohl die Anschaffungskosten als auch die laufenden Kosten zeigten einen

ökonomischen Vorteil für den Accuri C6. Da für den Epics XL das Stem-Kit vorgesehen

ist, lässt dies wenig Spielraum für eine Kosteneinsparung. Im Gegensatz dazu können

die Reagenzien für den Accuri C6 einzeln erworben werden. Dies ermöglicht eine

Kostenreduzierung um mehr als 50 Prozent (siehe Tabellen 5 und 6).

Die Interpretation der Ergebnisse dieser Studie erfolgte unter Vorbehalt, da im relativ

kurzen Studienzeitraum, in der die beiden Durchflusszytometer zur Evaluierung instal-

liert worden waren, nur ein kleiner Stichprobenumfang untersucht werden konnte. Da

dies als Einschränkung der Studie betrachtet werden kann, sollten weitere Unter-

suchungen die vorliegenden Ergebnisse bestätigen.

Aus Gründen der günstigen Ökonomie und der geringeren Fehleranfälligkeit könnten

sich auf die volumetrische Methode basierende Durchflusszytometer als Alternative

zum bisherigen Bead-basierten Goldstandard etablieren.

38

5. Zusammenfassung Um ein Engraftment nach einer Stammzelltransplantation zu gewährleisten, ist eine

genaue CD34+ Zellzählung von hoher Priorität. Dabei muss das Monitoring eine zuver-

lässige Vorhersage für die zu erzielende CD34+ Zellmenge im Apheresat ermöglichen.

Des Weiteren ist die genaue Überprüfung der Qualität des Apheresats und des Pro-

duktes nach Kryokonservierung für den klinischen Verlauf der Transplantation essen-

tiell. In dieser Studie wurde die Bead-basierte Single-Platform-Methode für die CD34+

Zellanalyse mit einer Methode, welche eine direkte volumetrische Messung ermöglicht,

verglichen.

Die Studie beinhaltete 14 Proben aus peripherem Blut, neun Proben von Apheresaten,

und zehn kryokonservierte und anschließend aufgetaute Proben. Die Proben wurden

auf CD34+ und CD45+ Zellen analysiert. In den kryokonservierten Proben wurde zu-

sätzlich die 7-AAD-Viabilität der CD45+ Ereignisse untersucht.

Die Korrelation für die CD34+ Analysen der peripheren Blutstammzell-Proben betrugen

R2 = 0,96 (p=0,26), für die Apheresate R2 = 0,99 (p=0,34), und für die kryokonser-

vierten Proben R2 = 0,96 (p=0,22). Für die CD45+ Ereignisse in den Monitoringproben

zeigte sich eine Korrelation von R2 = 0,96 (p=0,46), für CD45+ Ereignisse in den

Apheresatproben R2 = 0,83 (p=0,22), und in den kryokonservierten Proben R2 = 0,62

(p=0.,46).

Die Ergebnisse dieser Studie, die auch 2012 im Transfusion Medicine veröffentlicht

worden sind (Gutensohn et al, 2012), bestätigen die technischen Möglichkeiten der

direkten volumetrischen Analyse von CD34+ und CD45+ Zellen unter einfachen und

ökonomisch vorteilhaften Bedingungen.

Die direkte volumetrische Messung stellt somit eine realistische Alternative zum

bisherigen Bead-basierten Goldstandard dar.

39

6. Abkürzungsverzeichnis

(rh)G-CSF (recombinant human) granulocyte colony stimulating factor

°C Grad Celsius

µL Mikroliter

µm Mikrometer

7-AAD 7-Amino-Actinomycin

ART Antiretrovirale Therapie

CD Cluster of differentiation

CFU Colony-Forming-Units

CFU-GM Colony-Forming-Units–Granulocyte/Macrophage

CV Coefficient of variation

EDTA Ethylen-Diamino-Tetraacetat

FC-Rezeptor Fragment crystallisable Rezeptor

F/P-Ratio FITC/PE –Konjugat Ratio

FITC Fluorescein-Isothiocyanat

FSC Forward Scatter (Vorwärtsstreulicht)

HLA Human leukocyte antigen

HPC Hematopoietic progenitor cells

ISHAGE International Society of Hematotherapy and Graft Engineering

IU International unit

kDa Kilodalton

kg KG Körpergewicht (KG) des Patienten in Kilogramm (kg)

40

KMT Knochenmarkstransplantation

L Liter

Laser Light amplification by stimulated emission of radiation

mAB Monoclonal antibody

mL Milliliter

nm Nanometer

NH4Cl Ammoniumchlorid

NK-cells Natural killer cells

p P-Wert, Signifikanzwert

PBPC Peripheral blood progenitor cells

PBSC Peripheral blood stem cells

PBST Peripheral blood stem cell transplant

PE-Konjugate Phycoerythrin-Konjugate

R Odds Ratio

SSC Sideward scatter (Seitwinkelstreulicht)

u.a. Unter anderem

z.B. Zum Beispiel

41

7. Literaturverzeichnis Accuri.com (2010) Accuri Cytometers Revolutionize Flow Cytometry. [Online am 01.12.2012] http://accuricytometers.com/files/Accuri_Revolutionizes_Flow_Cytometry.pdf. Allen D, Keeney M, Howson-Yan K, Popma J, Weir K, Bhatia M, Sutherland D, Chin-Yee I (2002) Number of viable CD34+ cells reinfused predicts engraftment in autologous hematopoietic stem cell transplantation. Bone Marrow Transplant. 29(12):967-72. Arseniev L, Pickerd N, Goudeva L, Hertenstein B, Ganser A (1999) Comparative evaluation of commonly used clones and fluorochrome conjugates of monoclonal antibodies for CD34 antigen detection. J Hematother Stem Cell Res. 8(5):547-59. Baech J, Johnsen H (2000) Technical aspects and clinical impact of hematopoietic progenitor subset qualification. Stem Cells. 18(2):76-86. Barnett D, Janossy G, Lubenko A, Matutes E, Neuland A, Reilly JT (1999) Guideline for the flow cytometric enumeration of CD34+ haematopoietic stem cells. Clin Lab Haem. 21(5):301-8. Barnett D, Granger V, Kraan J, Whitby L, Reilly J, Papa S, Gratama JW (2000) Reduction of intra- and interlaboratory variation in CD34+ stem cell enumeration using stable test material, standard protocols and targeted training. Br J Haematol. 108(4):784-92. Bland JM, Altman DG (1986) Statistical methods for assessing agreement between two methods of clinical measurement. Lancet. 1(8476):307-10. Brando B, Barnett D, Janossy G, Mandy F, Autran B, Rothe G, Scarpati B, D’Avanzo G, D’Hautcourt JL, Lenkei R, Schmitz G, Kunkl A, Chianese R, Papa S, Gratama JW (2000) Cytofluorometric Methods for Assessing Absolute Numbers of Cell Subsets in Blood. Cytometry, Part B. 42(6):327-46. Brando B, Göhde W Jr, Scarpati B, D’Avanzo G, European Working Group on Clinical Cell Analysis (2001) The "vanishing counting bead" phenomenon: effect on absolute CD34+ cell counting in phosphate-buffered saline-diluted leukapheresis products. Cytometry, Clinical Cytometry. 43(2):154-60 Cassens U, Göhde W, Kuling G, Gröning A, Schlenke P, Lehman LG, Traoré Y, Servais J, Henin Y, Reichelt D, Greve B (2004) Simplified volumetric flow cytometry allows feasible and accurate determination of CD4 T lymphocytes in immunodeficient patients worldwide. Antivir Ther. 9(3):395-405. Chance JT, Larsen SA, Pope V, Measel JW, Cox DL (1995) Instrument-dependent flurochrome sensitivity in flow cytometric analyses. Cytometry, Communications in Clinical Cytometry. 22(3):232-42. Chang A, Raik E, Marsden K, Ma DD (2004) Australasian CD34+ quality assurance program and rationale for the clinical utility of the single-platform method for CD34+ cell enumeration. Cytotherapy. 6(1):50-61. Cho SH, Godin JM, Chen CH, Qiao W, Lee H, Lo YH (2010) Review Article: Recent advancements in optofluidic flow cytometer. Biomicrofluidics. 4(4): 1932-1058. Cilley J, Rihn C, Monreal J, gordon LI, Singhal S, Tallman M, williams S, Winter J, Mehta J (2004) Ideal or actual body weight to calculate CD34+ cell doses for

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8. Danksagung Ich danke Herrn PD Dr. Kai Gutensohn herzlich für die zuverlässige Begleitung und

Unterstützung dieser Arbeit sowie für die wertvollen und freundschaftlichen Ratschläge

während meines Studiums und für mein weiteres Leben.

Des Weiteren möchte ich mich herzlich bei PD Dr. Andreas Humpe bedanken.

Ein ganz spezieller Dank gilt der Medizinisch Technischen Assistentin, Frau Dagmar

Spitzer des Dr. Mildred Scheel-Hauses (Kiel, Deutschland) für ihre hilfreiche und

geduldige Unterstützung.

Abschließend gilt mein Dank den Mitarbeitern des Aesculabors, (Hamburg, Deutsch-

land) insbesondere Frau Clasen und Herrn Dr. Krieger.

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9. Lebenslauf

Persönliche Daten

Name Nikolitsis

Vorname Alexander

Geburtsdatum 19.07.1983

Geburtsort Hamburg

Studium

2009-2013 Studium der Humanmedizin am Universitätsklinikum Hamburg

Eppendorf

2007-2009 Studium der Humanmedizin an der Georg-August-Universität

Göttingen mit Abschluss des Ersten Staatsexamens

Schulische Laufbahn

2004-2005 Zivildienst Kreuzkirche Wandsbek, Hamburg

2000-2003 Gymnasiale Oberstufe der GSM, Hamburg

Abschluss: Deutsche Hochschulreife

1996-2000 Matthias-Claudius-Gymnasium, Hamburg

1994-1996 Gymnasium Buckhorn, Hamburg

1990-1994 Grundschule Buckhorn, Hamburg

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10. Eidesstattliche Erklärung

Ich versichere ausdrücklich, dass ich die Arbeit selbstständig und ohne fremde Hilfe

verfasst, andere als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel nicht benutzt und

die aus den benutzten Werken wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen einzeln

nach Ausgabe (Auflage und Jahr des Erscheinens), Band und Seite des benutzten

Werkes kenntlich gemacht habe.

Ferner versichere ich, dass ich die Dissertation bisher nicht einem Fachvertreter an

anderen Hochschulen zur Überprüfung vorgelegt oder mich anderweitig um Zulassung

zur Promotion beworben habe.

Unterschrift: …………………………….….

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UNIVERSITÄTSKLINIKUM HAMBURG-EPPENDORF · seltenen Lymphomsubgruppen und myeloproliferativen Syndromen sowie Autoimmun-erkrankungen und Amyloidose (Ljungman et al., 2010; Ljungman