LUCRARE DE DIPLOM

Contribuii la studiul farmacognostic al speciei Pleurotus ostreatus

INTRODUCERE

Omul primitiv lua cele necesare din mediul nconjurtor i cuta s vindece toate bolile cu ajutorul plantelor , mineralelor i produselor animale pe care le avea la ndemn . Omul cuta mijluace curative n mod empiric ; de aceea , numeroase plante medicinale folosite de medicina tiinific actual au o istorie foarte veche . Deoarece cauzele bolilor i tratamentul lor erau nenelese de omul primitiv , pe lng tratamentul cu plante el cerea ajutorul zeilor i al duhurilor . Dupa trecerea multori ani de ncercri , experiene , nu s-au gsit de ctre medici i farmaciti metode de vindecare ( altele dect medicamente sintetice , chimioterapii , fioterapii pe baz de cureni etc.) care s nu fie nocive . Acestea aduc ameliorri , dar nu vindecri, atta timp ct nu se elimin cauza care a produs boala . Natura ne ofer avantaje clare . se elimin toxinele care cauzeaz boala i nu mai sunt afectate i alte organe . Inc din antichitate , nelepii duceau o via n armonie cu natura . Fitoterapia modern a devenit astzi o tiin interdisciplinar . Ea presupune o colaborare ct mai strs ntre medic , farmacist , chimist , fizician , biolog , matematician , psiholog , inginer sau tehnolog , avnd un unic scop : gsirea i aplicarea remediului cel mai potrivit bolnavului. Farmacognozia este cea care restabilete relaia ntre teoriile tiinifice i practicile medicinei tradiionale,ea cunoate plantele i

organele lor ntrebuinate n terapeutic,precum i posibilitaile de prelucrare n vederea extragerii principiilor active.

PLAN DE REDACTARE

PARTEA TEORETIC 1.Date generale privind specia Pleurotus ostreatus 2.Sinonime 3.ncadrare sistematic 4.Descriere 5.Origine i rspndire 6.Compoziie chimic 7.Aciune 8.ntrebuinri 9.Preparate farmaceutice

PARTEA EXPERIMENTAL 1.Obinere 2. Stabilirea identitii 2.1.Examenul macroscopic 2.2.Examenul microscopic 2.3.Analiza chmic calitativ 3. Determinarea calitii 3.1.Determinri preliminare 3.2.Dozarea principiilor active

4. Testarea aciunii asupra celulei vegetale

CONCLUZII BIBLIOGRAFIE

PLEUROTUS OSTREATUS

Fig.1.Pleurotus ostreatus

PARTEA TEORETIC

1.DATE GENERALE PRIVIND SPECIA PLEUROTUS OSTREATUSUna din cele mai cunoscute specii de ciuperci medicinale, cu regim nutritiv saprofit. Are o foarte mare valuare alimentar , utilizat n arta culinar n feluri variate : ( sup , cu umpltur , cu sos , salat ) se poate cultiva pe cale industrial folosindu-se ca substrat rumegu , coceni de porumb , ciocli . (1)

2.SINONIMESe mai numete : - burete negru - ginua pdurii - pstrav de fag - pstrvul cerului(1) - burete de fag - oyster (3)

3.NCADRARE SISTEMATICSpecia. Pleurotus ostreatus Gen. Pleurotus Fam. Pleurotaceae Ordin. Agaricales Clasa Basidiomycetae (2)

4.DESCRIREA SPECIEICiuperc comestibil, lignicol,prezent n grupuri mari,mbricate,pe

trunchiurile btrne de arbori foioi,ndeosebi pe fag.

Cresc etajate,aplicate unele peste altele. Fig 2 Dintr-o baz comun pot porni mai multe ciuperci cu lungima piciorului diferit, plria orizontal, n form de ureche sau scoic, diametrul 5-15 cm , cu margina rsucit. Faa superioar neted, cenuie, brun-cenuiu, cenuiu-maronie, negricioas , se decoloreaz cu vrsta. Faa inferioar cu lamele albicioase sau cenuii, foarte decurent, largi , anastomazate la baz. Piciorul lateral, scurt de 1-4 cm, gros de 1-3 cm , alb-zbrlit , pros la baz, adeseori lipsete. Carnea alb,moale,elastic,miros plcut,gust dulce. Sporii cilindrici sau ovoizi ( 8-12 x 3-4 microni ), hialini , netezi , albi n mas . duntoare, produce putregaiul alb al lemnului. n Romnia, primele culturi au fost organizate ncepnd cu anul 1973 Valorific celuloza i hemiceluloza din substrat,cu coninut bogat de lignin, cele mai bune rezultate s-au obinut pe fag,plop,carpen i nuc , exemplele obinute pe salcie,cire, stejar,arar,cedru sunt necorespunztoare. n cultura ntensiv se folosesc 8 cicluri pe an cu o producie de 90-100 kg pe metru ptrat,pentru 100 kg lemn lemnos se utilizeaz 2,5 litri miceliu soluie. ncepe s se formeze cnd n aer temperatura este cca.15 grade celsius.

Fig 2.Pleurotus ostreatus

Fig.3. Pleurotus ostreatus

Fig.4. Pleurotus ostreatus 5.ORIGINE I RSPNDIREPleurotus ostreatus este rspndit n toate regiunile mpdurite cu clima temperat i tropical ale globului.n ara noastr aceast specie se dezvolt cu predilecie pe suprafaa trunchiurilor de arbori din pdurile de foioase, producnd aa numitul putregai alb de lemn.(3)

6.COMPOZIIA CHIMIC

-mevinolin (lovastatin) n special n corpul fructifer de P. ostreatus, P. saca i P. sapidus ; P. ostreatus produce cantiti maxime de lovastatin cnd mediul de cultur conine nitrogen organic -poliholozide: - pleuran (-1,3-D-glucan) n majoritatea speciilor din genul Pleurotus sau diferii polimeri alctuii din xiloz, glucoz, manoza i galactoz n diferite raporturi molare n P. pulmonarius ; o polizaharid acid alctuit din glucoz, manoz, galactoz i acizi zaharici n P. ostreatus. -D-glucani au fost identificai i n P. tuberregium poliholozide n P. florida , P. sajor-caju -lectine: n corpii de fructificaie ai speciilor P. ostreatus i P. cornucopiae; lectinele din P. tuber-regium au specificitate pentru N-acetilglucozamin. - glicoproteine de tip ubiquitin cu aciune de ribonucleaz n P. ostreatus; din P. tuberregium a fost izolat proteina pleuturegin, peptida denumit eringin din P. eryngii cu masa molecular de 10 kDa. - aminoacizi eseniali n genul Pleurotus ; n corpul fructifer de P. ostreatus predomin alanina, acidul glutamic i ornitina; alturi de acestia se mai gsesc: acid glutamic, valin, glutamin, glicin, leucin lipide, acid oleic i ali acizi grai nesaturai n P. ostreatus; glicoinozitolfosfosfingolipide: ceramide i cerebrozide n P. ostreatus; steroli n P. eryngii - enzime: fenoloxidaze, de exemplu lacaze n P. eryngii, P. ostreatus, P. florida (i P. pulmonarius; glutamin-sintetaza n P. ostreatus, cisteinproteaza n P. ostreatus, Dglucoz-oxidaz n P. ostreatus , o proteaz fibrinolitic n P. ostreatus, lipoxigenaz n P. ostreatus , o proteaza antiviral (pleureryn) i peroxidaze n P. eryngi ; Mnperoxidaz n P. eryngi , ribonucleaze n P. tuber-regium , P. pulmonarius , P. eryngii, P. ostreatus, dou superoxid dismutaze (SODm i SODc) care conin mangan atomic i respectiv, trivalent n P. olearius. n P. pulmonarius au mai fost identificate

enzimele: benzo-[a]-piren hidroxilaz (Maspahy S. i colab., 1999), Mn-peroxidaz, xilanaz, celulaz, ligninperoxidaz, arilalcooloxidaz i o enzim implicat n degradarea aflatoxinei B1. Enzimele ligninolitice din P. sajor-caju degradeaz i juglona . Compuii 1-octen-3-ol, octan-3-ol i actan-3-ona imprim aroma corpului fructifer i miceliului proaspt de P. ostreatus Acid oxalic n P. ostreatus. Acid 5-O-(-D-xilopiranozil)-D-eritroascorbic , vitamine din grupul B: B1 sau tiamina, B2 sau riboflavina, B5 sau niacina, B6 sau piridoxina, B7 sau biotina, acid folic, - minerale: cantiti mari de Fe.

7. ACIUNE TERAPEUTICHipocolesterolemiant - majoritatea speciilor din genul Pleurotus (P. ostreatus, P. sapidus, P. sacca) produc mevinolin i lovastatin care inhib biosinteza colesterolului, cresc HDLcolesterolul i scad VLDL-colesterolul, acionnd asupra HMG-CoA-reductazei ; - P. ostreatus scade absorbia colesterolului, inhib HMG-CoA-reductaza, crete HLDL-colesterolul, activitatea 7-hidroxilazei hepatice, excreia prin materii fecale a sterolilor neutri i a acizilor biliari i scade valorile VLDL-colesterolului; Pulberea uscat, extractul apos i cel etanolic scad colesterolul i triacilglicerolii din ser - efectul hipocolesterolemiant al dietei cu P. ostreatus sau al fraciunii poliholozidice a fost demonstrat i la oareci sau hamsteri sirieni cu hipercolesterolemie ereditar sau care au primit n mod repetat alcool - administrarea zilnic de 15-20 g mas uscat de P. ostreatus conduce la scderea concentraiilor plasmatice de colesterol la majoritatea pacienilor. n cazul

oarecilor cu valori plasmatice normale ale colesterolului nu s-a observat aciunea asupra HDL-, LDL-colesterolului, trigliceridelor i colesterolului total. Efectul hipocolesterolemiant a fost demonstrat i pentru P. florida Eger. Hipoglicemiant P. ostreatus scade glicemia postprandial la oareci cu diabet insulino-dependent indus prin streptozocin, dar nu modific insulinemia. Efectul hipoglicemiant a fost demonstrat i pentru fraciunea poliholozidic solubil n ap din P. citrinopileatus . Antitumoral nc din 1969 a fost semnalat aciunea antineoplazic a poliholozidelor din P. ostreatus Ulterior s-a constatat c: - pulberea uscat obinut din aceast specie reduce incidena tumorilor de colon provocate cu dimetilhidrazin, prin scderea activitii ornitin-decarboxilazei din colon. Efectul antitumoral n acest tip de cancer este explicat i prin inducerea apoptozei - lectinele-dimeri extrase din corpurile de fructificaie ale speciei P. ostreatus sunt hemaglutinante i au inhibat dezvoltarea celulelor tumorale de tip Sarcoma 180 i Hepatoma H-22 implantate animalelor de experien; - pleuranul (un -glucan) previne apariia metastazelor ; - poliholozida de tip -glucan din miceliul de P. ostreatus are aciune antiproliferativ i pro-apoptotic n cancerul de colon experimental HT-29 . - fraciunile poliholozidice din corpii de fructificaie ai speciei P. sajor-caju (Fr.) Sing. (sin. P. pulmonarius), care conin manoz, galactoz, xiloz i glucoz n raport molar 2:12:42:42; xiloz, manoz i galactoz n raport molar 9:35:56; glucoz i xiloz n raport molar 40:44 sau 62:36 au efect antitumoral dovedit experimental n sarcomul 180. Ribonucleaza cu masa molar de 12 kDa, izolat din aceast specie are aciune antiproliferativ pe hepatomul HepG2 i leucemia L1210 .

- aciune antitumoral pe S180 au i poliholozidele din P. citrinopileatus , denumit popular yuhuangmo . Efectul antiproliferativ al poliholozidei bogate n glucoz i manoz este corelat cu aciunea imunostimulatoare . Fraciunea poliholozidic extras n mediu alcalin i la cald din P. tuber-regium are efect antiproliferativ pe liniile tumorale experimentale HL-60 i Hep G2. Imunomodulatoare - fraciunea poliholozidic (pleuranul) din P. ostreatus acioneaz in vivo asupra macrofagelor, efectul imunomodulator fiind mult crescut, n sensul stimulrii activitii fagocitare a leucocitelor, prin carboximetilarea acestui glucan. (1-3)- i (1-6)-glucanii din P. florida stimuleaz activitatea fagocitar a macrofagelor. Antioxidant - pleuranul (-D-glucan) din P. ostreatus crete activitatea superoxid dismutazei, glutation peroxidazei, glutation reductazei, glutation-S-transferazei, catalazei eritrocitare i inhib peroxidarea lipidic ; Extractul obinut din P. citrinopileatus i caracterizat prin prezena ergosterolului i acidului nicotinic n cantitate mare este antioxidant pe radicalii liberi de difenilpicrilhidrazil i antihiperlipidemic. - extractul alcoolic din P. pufmonarius inhib peroxidarea lipidic i acioneaz asupra radicalilor hidroxil liberi, dar nu i asupra celor superoxid ; - n cazul speciei P. abalones efectul antioxidant este asociat cu prezena compuilor fenolici ; - proprietile antioxidante i coninutul ridicat n fibre diminu riscul apariiei cancerului de colon.

Antiinflamatoare - extractele metanolice obinute din P. florida au efect antiinflamator asemntor diclofenacului, n modelul inducerii inflamaiei acute sau cronice a labei de obolan cu carrageen, respectiv formaldehid. Efectul benefic al -glucanului (pleuranul) n tratamentul colitei este explicat prin modificarea activitii mieloperoxidazei dinn segmentul de colon inflamat i scderea infiltrrii neutrofilelor. Acest pleuran are rol imunomodulator n colita ulcerativ indus cu acid acetic administrat intracolonic. Antimicrobian P. ostreatus acioneaz pe Bacillus subtilis, pe Staphylococcus aureus i Escherichia coli i antifungic pe Aspergillus niger. P. ostreatus nu este activ pe Candida albicans. Compui care inhib dezvoltarea Staphylococcus aureus se gsesc i n P. griseus, P. multilus (Fr.)Sacc. i P. passeckerianus Pilat. Aciunea speciei P. ostreatus pe P. aeruginosa, A. niger, B. subtilis i Fusarium oxysporum este explicat prin prezena p-anisaldehidei sau prin prezena seleniului care leag chitina coninut n structura pereilor celulari fungici. Din aceast specie a fost izolat i o peptid antifungic, cu masa molecular de 7 kDa; aceasta acioneaz pe F. oxysporum, Mycosphaerella arachidicola i Physalospora piricola . Ribonucleaza cu masa molecular de 12 kDa, izolat din P. sajor-caju inhib F. oxysporum, M. arachidicola, P. aeruginosa, S. aureus. Efectul antifungic pe F. oxysporum i M. arachidicola a fost dovedit i pentru peptida eryngin din corpul fructifer de P. eryngii .

Antiviral - fraciunea proteic din P. ostreatus a prezentat in vitro efect inhibitor pe HIV, prin inhibarea activitii revers-transcriptazei HIV-1 ; - din corpul fructifer proaspt de P. eryngii s-a izolat o proteaz (pleureryn) activ pe HIV-1 revers transcriptaza. -glucanii din P. tuber-regium nu sunt antivirali, dar derivaii sulfatai ai acestora inhib replicarea viral a virusurilor HSV-1 i -2, syncytal i influenza A. Antihipertensiv Extractul apos obinut din P. sajor-caju determin la administrare i.v. scderea tensiunii arteriale la obolanii de experien, probabil prin scderea filtrrii glomerulare. Efect antihipertensiv al extractului apos obinut la cald i manitolului din P. cornucopiae (Tamogi-take mushroom) este explicat prin inhibarea ACE. Antiaterogen Extractul etanolic din P. ostreatus sau ciuperca uscat au efect antiaterogen Administrarea la iepuri a unei diete bogate n aceast ciuperc previne formarea plcii de aterom i reduce incidena unor afeciuni coronariene. Acest efect a fost demonstrat i pentru P. florida. Antiagregant plachetar - extractul metanolic obinut din P. florida are aciune antiagregant plachetar ; De cretere a densitii osoase P. eryngii crete aciunea fosfatazei alcaline din osteoblaste i determin in vivo la obolanii cu osteoporoz indus prin ovariectomie, creterea densitii osoase.

Alte aciuni: Prin teste efectuate pe celule de mamifere CHO-K1 i pe Salmonella thyphimurium sa demonstrat c extractul alcoolic obinut din P. ostreatus are un slab efect mutagen n prezena sistemului activator metabolic S-9 .P. cornucopiae mpiedic apariia de mutaii prin tratarea cu radiaii UV a culturilor de S. thyphimurium i Escherichia coli sau cu benzo-[a]-piren pe S. thyphimurium TA98 . P. sajor-caju nu are efect protector mpotriva modificrilor produse de H2O2 asupra ADN-ului celular.

8. NTREBUINRIChiar dac astzi n Romnia aceste specii prezint numai interes gastronomic, menionm c pot constitui un adevrat tezaur terapeutic pentru persoanele cu hipercolesterolemie i pot fi un adjuvant preios pentru diabetici, avnd n vedere c valoarea HDL-colesterolulului este sczut la cei tratai cu hipoglicemiante. Medicina tradiional chinez menioneaz P. ostreatus ca diet ideal n prevenirea afeciunilor cardiovasculare, datorit coninutul ridicat n fibre, steroli, proteine i microelemente, precum i aportului caloric redus. Poliholozidele de tip -glucani din P. tuber-regium pot fi folosii ca supliment nutritiv . Valoarea alimentar deosebit, prin compoziie chimic, miros i gust plcut, superioare se folosesc medii sintetice pe suport de polipropilen). Efecte secundare Au fost semnalate alergii datorate inhalrii sporilor speciei P. ostreatus, P. cornucopiae, P. eringii i ai altor specii ale genului Pleurotus, dar i dermatite alergice a determinat cultivarea acestei ciuperci n toat lumea (pentru obinerea unor randamente

de contact. Pentru diagnosticarea i terapia acestor alergii se pot obine preparate standardizate din ciupercile respective. Aspecte toxicologice P. olearius poate produce intoxicaii . Proteina denumit pleurotolysin are proprieti hemolitice. n literatura de specialitate este menionat efectul toxic al speciei P. ostreatus recoltat din Bagdad (Irak) la 1 4 zile dup ploaie. S-a observat producerea de hemoragii intestinale, hepatice, pulmonare i renale la animale, doza toxic fiind de 3g/kg. Aceast specie poate acumula cantitai mari de cesiu radioactiv sau de mercur din mediul de cultur. P. eryngii poate acumula cantiti mari de plumb .

9.PREPARATE FARMACEUTICEMYCODEFENSE MYCO DEFENSE este un amestec de ciuperci folosite de mii de ani in China i Japonia pentru proprietile lor medicinale excepionale, confirmate de cercetrile stiinifice din ultimele decenii: Cordyceps (Cordyceps sinensis), Maitake (Grifola Frondosa), Reishi (Ganoderma Lucidum), Yamabushitake (Hericium erinaceus), Himematsutake (Agaricus blazei Murrill), Shiitake (Lentinus Edodes), Zhu Ling (Polyporus umbellatus), Kawaratake (Coriolus versicolor), Hiratake (Pleurotus ostreatus), Chaga (Inonotus obliquus), Agarikon (Fomitopsis officinalis), Mesima (Phellinus linteu), vitamina C, ghimber. Partea utilizat: miceliu, primordiu, sclerotiu, stem, fruct (toate fazele de cretere ale ciupercilor), Ghimbir rdcin.

Componente bioactive: betaglucani, heteroglucani, proteoglucani, cordycepin, galactomanani, arabinoxilani, ergosteroli, glicoproteine, hericenone, triterpene, nucleotide, germaniu Efecte: imunostimulator puternic (activeaz celulele imunocompetente); adaptogen (stimuleaz selectiv funciile organismului ajutndu-l s se adapteze fizic, psihic, imunitar); tonific energia Qi (energia vital care susine ntregul organism); antitumoral excepional: protejeaz celulele sntoase, previne metastazele, inhib angiogeneza (util i in degenerescen macular), contracareaz efectul prostaglandinelor care produc inflamaii i impiedic maturizarea limfocitelor T; adjuvant in chimioterapie (ex. impiedic anemia prin susinerea hematopoiezei); hepatoprotector puternic (regenereaz celula hepatic, detoxifiant, stimuleaz producia endogen de interferon); antidiabetic (reduce rezistena la insulin); antiviral (ex: virusul Epstein-Barr care provoac mononucleoz i sindrom de oboseal cronic, hepatic B, herpetic, HIV, Human Papilloma, sindrom Kaposi) i antibacterian (ex: bacteria Borelia care provoac maladia Lyme), antifungic (micoze); neuroregenerator (stimuleaz factorul de cretere neuronal); scade nivelul colesterolului i al trigliceridelor, antihipertensiv; tonic cardiac, pulmonar; digestiv, renal; impiedic agregarea plachetar; antialergic (inhib producia de histamin); tonic sexual.

Prezentare: flacon cu 60 capsule a 1000mg amestec ciuperci, 60mg vitamina C, 45mg Ghimbir rdcin. Mod de administrare: 2 capsule/zi sau conform recomandrii consultantului de specialitate. Productor: Nature's Way S.U.A.

PARTEA PRACTIC

Fig.5. Pleurotus ostreatus

1. OBINEREDefiniie: corpii de fructificaie ai speciei Pleurotus ostreatus, pstrav, ginua pdurii, familia Pleurotaceae. Pentru aceast lucrare am folosit produsul vegetal comercializat prin supermarketul Selgros.

2. DETERMINAREA IDENTITIIS-a realizat prin aplicarea metodelor calitative de analiz (examen macroscopic, microscopic i chimic calitativ).

2.1. Examen macroscopicPrincipiul metodei Prin acest examen care reprezint primul stadiu de investigare al produselor vegetale noi sau cunoscute, s-a urmrit observarea caracterelor morfologice detectabile cu ochiul liber sau la lup i a celor organoleptice percepute prin gust sau miros. n acest mod este analizat ntreaga varietate de produse vegetale ale cror caracteristici sunt determinate de natura organelor din care sunt constituite, poziia taxonomic a plantelor de la care provin i de forma lor de prezentare: produse ntregi (in toto), fragmente (concissum) sau pulverizate (pulveratum). Examenul macroscopic se efectueaz n ordinea precizrii urmtoarelor elemente: Aspectul prin care se stabilesc: forma produsului (ntreg sau fragmentat)

particularitile feelor fractura consistena tipul seciunii transversale i raportul dintre esuturi (la lup) Dimensiunile se apreciaz n: cm pentru majoritatea produselor (folosind rigla)

mm pentru fructele i seminele mici (folosind hrtie milimetric) mm pentru celule, incluziuni celulare (granule de amidon, cristale etc. - folosind micrometrul ocular sau obiectiv). Culoarea se observ la exterior i la interior. Mirosul se percepe pe produsul ca atare, zdrobit ntre degete (frunze, flori) sau pulverizat. Gustul se determin pe produsul ca atare sau pe decoct (nu se nghite, se elimin i se cltete gura cu ap).

Examenele macroscopice de produse ntregi sunt de cele mai multe ori suficiente pentru determinarea identitii acestora. Caracterele organoleptice mai ofer i unele orientri asupra compoziiei chimice a produselor analizate prin culoare, gust, etc. Pentru produsele vegetale pulverizate, examenul macroscopic d unele informaii care uneori nu sunt suficiente identificrii, n care caz investigarea se continu prin examenul microscopic.

Astfel, culoarea galben, roie, albastr, portocalie a florilor i fructelor presupune prezena pigmenilor flavonoidici sau carotenoidici, culoarea portocalie la scoare i organe subterane indic prezena derivailor antrachinonici, culoarea brun la frunze, organe subterane i unele cotiledoane este explicat de coninutul n taninuri catehice al acestor produse. Gustul amar al produselor se poate datora prezenei substanelor amare, heterozidelor cardiotonice sau a unor alcaloizi; gustul astringent poate indica prezena taninurilor; gustul aromat este atribuit prezenei uleiurilor volatile i rezinelor; gustul dulce se identific cu prezena glucidelor. (4) REZULTATE Plria orizontal, n form de ureche sau scoic, diametrul 5-15 cm ,cu margina rsucit. Faa superioar neted, cenuie , brun-cenuiu , cenuiu-maronie, negricioas, se decoloreaz cu vrsta. Faa inferioar cu lamele albicioase sau cenuii, foarte decurent, largi, anastomazate la baz. Piciorul lateral,scurt de 1-4 cm, gros de 1-3 cm, alb-zbrlit, pros la baz, adeseori lipsete. Carnea alb,moale,elastic,miros plcut,gust dulce. Sporii cilindrici sau ovoizi ( 8-12 x 3-4 microni ), hialini, netezi, albi n mas .

CONCLUZII

Coincidena acestor rezultate cu datele din literatura de specialitate a condus la concluzia c produsul analizat este Pleurotus Ostreatus.

fig.5.Pleurotus Osteartus

2.2 Examen microscopicAcest examen, ce reprezint o faz mai avansat a analizei calitative a produsului vegetal, fragmentate. Caracterele anatomice ale diferitelor organe ale plantei servesc n unele cazuri i la precizarea poziiei taxonomice a speciilor productoare. urmrete identificarea esuturilor i elementelor anatomice caracteristice ale seciunilor preparatelor clarificate din pulberi sau produse

Principiul metodei Preparatele microscopice se realizeaz prin metode diferite n funcie de natura, starea produsului (ntreg, fragmentat sau pulverizat) consistena i chiar compoziia sa chimic. Examenul microscopic al produselor vegetale pulverizate: Produsul vegetal se pulverizeaz prin zdrobire sau mcinare, urmat de omogenizare prin cernerea pulberii (sita de 30 ochiuri/cm2). Preparatul microscopic se obine utilizndu-se un reactiv sau o soluie de clarificare a crui alegere se face fie pentru clarificarea pulberii vegetale, fie pentru obinerea unor reacii caracteristice cormpuilor chimici ai pereilor celulari sau ai coninutului celulelor. Pe o lam de microscop se aduc 2-3 picturi din soluia de clorhidrat (R), n care se presar pulberea vegetal cu un ac spatulat. Preparatul astfel obinut se nclzete uor deasupra une flcri pn se percepe un miros uor neptor. Dup rcire se acoper cu o lamel. Dac este necesar prelungirea nclzirii se mai adaug 1-2 picturi din soluia de clorhidrat. Pentru punerea n eviden a elementelor

lignificate se adaug preparatului, inainte de acoperirea cu lamela, 1-2 picturi de floroglucin n acid clorhidric (R). Examenul microscopic al unei pulberi vegetale are ca scop precizarea organului din care este constituit produsul vegetal respectiv, prin identificarea elementelor anatomice comune organulul i stabilirea celor caracteristice produsulul.[6] conform procedeului clasic i au fost examinate la microscopul Labophot-2 Nikon (ob. X1O, ob. X40). (4)

Rezultate miceliu cu hife filamentoase, pluricelulare, ramificate. Fig.6-7-8 hife himeniale cu numeroi bazidiospori. Fig.9 spori mici. Fig.10

Fig.6. Miceliu cu hife filamentoase, pluricelulare, ramificate. Ob.10X

Fig.7.Hife filamentoase.Ob.4X

Fig.8. Hife pluricelulare,celule seriate. Ob.40X

Fig.9 Hife himeniale cu numeroi bazidiospori.

Fig.10.Hife i spori.Ob 40X

Fig.11. Hife cu celulele dispuse cap la cap

Fig.12.Zon himenial, bazidi cu bazidiospori

2.3. Examen chimic calitativ

Examenul chimic calitativ are ca scop stabilirea compoziiei chimice a unei plante folosind extracia succesiv cu solveni de polariti diferite. n primul rnd, produsul vegetal este extras cu un solvent nepolar :eter etilic,benzen, cloroform etc, apoi cu un solvent polar : etanol, metanol i n cele din urma cu ap. n extractul eteric se gsesc compui chimici lipofili ( uleiuri volatile, substane grase, acizi grai i rezinici, alcaloiyi baze , agliconi flavonici, antrachinonici i cumarinici, steroli, triterpene i carotenoide ), iar n extractele alcoolic i apos, comupi chimici hidrofili ( polifenoli, alcaloizi sruri, aminoaciyi,

glicozide polifenolice, sterolice i triterpenice, antociani i glucide ). Extractele respective sunt analizate separat, folosind metode corespunztoare proprietilor fizico-chimice ale fiecrui grup de principii active.

Principiul metodei : Examenul chimic calitativ a fost efectuat pe produs vegetal Pleurotus ostreatus. Pentru o extracie mai eficient a principiilor active, produsul vegetal a fost mai nti mrunit, aopi extracia s-a fcut succesiv folosind solveni cu polariti diferite eter etilic i ap obinndu-se o soluie extractiv eteric i una apoas. Fiecare dintre soluii a fost analizat chimic, urmrind constituenii solubili n mediul respective . Identificarea grupelor de principii active s-a fcut folosind reactivi de culoare sau de precipitare specifici pentru compuii respective menionai n literature de specialitate.

A. Analiza soluiei extractive eterice Tehnic de lucru : 5 g produs vegetal pulverizat se extrage cu eter etilic prin agitare manual, la temperatura mediului ambiant. Acest extract poate conine compui chimici liposolubili : ulei volatil, steroli, triterpene, carotenoide, acizi rezinici, alcaloizi baze, agliconi flavonici, agliconi ai antracenozidelor (emodoli), cumarine, clorofil. Identificarea acestor compui chimici se face dup urmtorul mers de analiza. * Identificarea agliconilor flavonici Flavonele sunt substane solide, cristalizate, colorate n galben de diferite intensiti. Heterozidele flavonice sunt solubile n ap, alcool diluat i concentrat, solubile specific n acetat de etil, aceton, insolubile n solveni apolari.

Agliconii sunt solubili n alcool, acetat de etil, aceton, insolubili n solveni apolari. Heterozidele hidrolizeaz numai n prezena acizilor minerali (nu hidrolizeaz enzimatic) n condiii diferite, n funcie de atomul de Iegtur dintre aglicon i partea glucidic: 0-heterozidele hidrolizeaz uor, C-heterozidele hidrolizeaz n prezena unor concentraii mari de acid, ntr-un timp mai ndelungat, la presiune ridicat i n prezena unor catalizatori. Datorit gruprii cetonice de la C flavonele se pot reduce cu hidrogen nscnd n mediu hidroalcoolic cnd se formeaz antocianidoli (reacia Shibata). Culoarea acestora poate fi roie (flavonoli) sau portocalie (flavone). Prezena gruprilor oxidril fenolice permite transformarea, n mediu alcalin, a flavonelor n fenoxizi de culoare galben mai intens dect flavona iniial. Gruprile oxidril alcoolice din vecintatea gruprii ceto permit formarea de chelai cu metale bi- i trivalente, colorai n galben mai intens dect flavona iniial.

a) Reacia Shibata (cianidolului) Principiul metodei: Reducerea gruprii cetonice a flavonelor cu hidrogen nativ (rezultat n reacia dintre magneziu i acid clorhidric concentrat). Se formeaz clorura de oxoniu colorat n rouOH OH HO O Mg HCl OH OH O OH O HO O+

OH OH

OH

quercetol (galben)

clorur de cianidol roie

Reactivi necesari: acid clorhidric concentrat magneziu metalic Tehnica de lucru: 1 ml soluie se introduce ntr-o eprubet cu cteva fragmente de magneziu metalic (span). La adugarea de 4-6 picturi de acid clorhidric concentrat apare o coloraie roie sau portocalie. b) Reacia cu hidroxidul de sodiu (NaOH) Principiul metodei: Dizolvarea flavonozidelor n alcalii cu obinerea de fenolai (flavoxizi) intens colorai n galben.OH OH HO O OH OH O OH O NaOH HO O OH ONa ONa

quercetol galben

fenoxid

Reactivi necesari: soluie hidroxid de sodiu 5%

Tehnica de lucru: La 1 ml soluie de analizat se adaug 1 ml soluie hidroxid de sodiu 5%. n cazul unei reactii pozitive coloraia galben a soluiei de analizat se intensific fa de cea a martorului n care nu s-a adugat soluie de NaOH 5%.

c) Reacia cu clorura de aluminiu (AlCl3) Principiul metodei: Chelatarea cu sruri ale metalelor bi- i trivalente. Flavonele cu grupri libere la C3 sau C5 formeaz mpreun cu gruparea ceto de Ia C4 chelai n poziia orto(I) sau para(II). Aceti compui se pot obine i atunci cnd pe nucleu exist dou grupri -OH vicinale, iar mediul de reacie este alcalin, pentru c n aceste condiii gruparea -OH din 4 se transform n grupare cetonic prin tautomerie -poziie para (III). Chelaii obinui sunt de culoare galben intens i au o fIuorescen galben-verzuie sau albastr n UV.

OH OH HO O O OH O Me O Me O Me O HO O O glucoza O O glucoza O HO O O

OH OH

glucoza

Reactivi necesari: soluie de acetat de sodiu 10%

soluie clorur de aluminiu 2,5%

Tehnica de lucru: La 1 ml soluie de analizat se adaug 0,5 ml acetat de sodiu (R) i 1 ml clorur de aluminiu 2,5%. Coloraia galben a soluiei de analizat se intensif

* Identificarea emodolilor Reacia Bontrager Principiul metodei: Se bazeaz pe proprietatea agliconilor forme oxidate (antrachinone) de a trece din emodoli n fenoxizi (emodinai) de culoare roie-viinie, n prezena soluiilor alcaline. Sensibilitatea reaciei este de10-5. Aceasta poate fi efectuat direct pe produsul vegetal, pe microsublimat sau n soluie apolar de agliconi. Agliconii cu funcie carboxilic formeaz fenoxizi chiar n prezena carbonatului acid de sodiu.

Reactivi necesari:

soluie HCI 10% soluie NaOH 10%

Tehnica de lucru: Soluia extractiv apoas se hidrolizeaz cu HCI 10 % i se extrage apoi cu eter. Se iau 3-4 ml soluie eteric ntr-o eprubet i se adaug 0,5-1 ml soluie NaOH 10%. n cazul unei reacii pozitive stratul inferior apos se coloreaz n rou iar cel superior, apolar, se decoloreaz.

* Identificarea sterolilor sau a triterpenelor Reacia Liebermann - Burchard: Principiul metodei: Formarea unei coloraii violet sau verde (datorit formrii unui dimer) n prezena H2SO4 concentrat i a anhidridei acetice. Reactivi necesari:

H2SO4 concentrat anhidrida acetic

Tehnica de lucru: Din soluiile hidrolizate, extrase cu eter, se iau 3-4 ml, se evapor la sicitate, pe baia de ap, iar reziduul se dizolv cu 1-2 ml soluie anhidrid acetic; 0,5-1 ml

servesc ca martor i restul se toarn cu grij peste un volum egal de H2SO4 concentrat. Apariia unei coloraii violet indic o reacie pozitiv. * Identificarea alcaloizilor Alcaloizii sunt substane organice cu caracter bazic ce conin n molecul un atom de N heterociclic i au activitate farmacodinamic specific i toxicitate ridicat. Dei prezint structuri chimice foarte variate, toi alcaloizii se comport aproape identic fa de anumii reactivi denumii reactivi generali ai alcaloizilor din care fac parte dou categorii: reactivi generali de precipitare i reactivi generali de culoare. Reaciile de precipitare se efectueaz pe srurile alcaloizilor (deci n mediu acid apos), iar cele de culoare pe rezidiile bazelor alcaloidice. Reacii de precipitare Principiul metodei: Toi alcaloizii, cu mici excepii, dau cu reactivii de precipitare precipitate albe, galbene, portocalii, brune i mai rar alte culori. Reactivi necesari: acid clorhidric 2% reactiv Mayer (soluie apoas de tetraiodomercuriat de potasiu cu

adaos de clorhidrat) reactiv Bertrand (soluie apoas de acid silicotungstic) Tehnica de lucru:

10 ml extract eteric se evapor ntr-o capsul de porelan pe baia de nisip. Reziduul se dizolv n 1,5 ml acid clorhidric 2% prin amestecare cu o mic baghet de sticl la cald (pe baia de ap). Soluia decantat se mparte n trei eprubete, n volume egale. La una din probe (eprubete) se adaug 2-3 picturi de reactiv Mayer (R), la a doua prob se adaug 2-3 picturi de reactiv Bertrand (R) i ultima eprubet servete ca prob martor. Dac probele tratate cu reactivi dau opalescene sau precipitate evidente (de culoare alb-glbuie), alcaloizii sunt prezeni. (5)

B. Analiza solutiei extractive apoase * Identificarea compuilor reductori Principiul metodei: Se bazeaz pe proprietatea lor de a reduce soluia de reactiv Fehling la oxid cupros.

Reactivi necesari: soluie Fehling I (soluie apoas de sulfat de cupru) soluie Fehling II (soluie apoas de tartrat de sodiu i potasiu n hidroxid de sodiu)

Tehnica de lucru:

Peste 3 ml soluie se adaug un amestec constituit din pri egale de soluie Fehling I i II i se nclzesc pe baia de ap. Apariia unui precipitat rou-brun care se depune n timp indic prezena compuilor reductori.

* Identificarea ozelor i poliholozidelor Ozele simple se identific datorit caracterului reductor prin reacia cu reactivii Fehling sau Tollens i prin cuplarea cu o-toluidina sau fenilhidrazinele. Poliholozidele se identific prin reacia de culoare cu hematoxilina sau prin precipitare n alcool.

a) Reacia Molish Este comun pentru ozele simple i pentru poliholozide. Principiul metodei: Condensarea furfuralului cu timol, n cazul poliholozidelor n urma depolimerizrii cu H2SO4 concentrat.

Reactivi necesari: H2SO4 concentrat timol Tehnica de lucru:

10 ml soluie extractiv apoas se concentreaz la sec ntr-o capsul de porelan. Peste reziduu se aduc 1- 2 picturi H2SO4 concentrat i dup 3-5 minute se aduce o pictur de timol. n cazul unel reacii pozitive apare o coloraie roie.

b) Precipitarea n alcool i colorarea cu hematoxilin Principiul metodei: Se bazeaz pe precipitarea poliholozidelor n alcool i colorarea precipitatului cu hematoxilin:

HO

OH

HO

O

OH HO OH O HO OH O

hematoxilina Reactivi necesari: metanol

hemateina

hematoxilin

Tehnica de lucru: 10-15 ml soluie extractiv apoas se concentreaz la 2 ml ntr-o capsul de porelan. Dup rcire, soluia concentrat se toan n fir subire peste 20 ml metanol. n cazul prezenei poliholozidelor se va obine un precipitat care, n prezena hematoxilinei se va colora n violet datorit hemateinei. * Identificarea compuilor polihidroxifenolici (ODP- uri) Reacia Arnow Principiul metodei: Const n proprietatea fenolilor de a forma cu acidul azotos nitrozoderivai care se izomerizeaz spontan n izonitrozoderivai sau oxime care, datorit caracterului lor slab acid, se dizolv n soluii alcaline dnd coloraii roii.OH HO + HONO - H2O COOH COOH COOH HO OH N O HO O N OH

acid cafeic

nitrozoderivat

oxima acidului cafeic- roie

Reactivi necesari: soluie HCI 0,1 N reactiv Arnow

soluie NaOH 0,1 N

Tehnica de lucru: La 0,5 ml soluie de analizat se adaug 1 ml HCI 0,1 N, 1 ml reactiv Amow i 1 ml soluie NaOH 0,1 N. n cazul unei reacii pozitive se obine o coloraie roie. *Identificarea flavonelor Identificarea flavonelor n soluie extractiv apoas se face pe baza reaciilor menionate mai sus ( r.Schibata. r. cu NaOH i r.AlCl3), acestea fiind reacii de identificare commune pentru flavonozide i agliconi flavonici.

*Identificarea antocianozidelor Principiul metodei Antocianozidele hidrolizeaz n mediu acid la nclzire cu eliberarea antocianidolilor care cristalizeaz sub form de sruri de flaviliu, solubil n ap, alcool, insolubil n solveni organici nepolari. Prin alcalinizare, se formeaz nti o pseudobaz care prin eliminare de ap trece ntr-o form chinonic violet, apoi n exces de alcalii se obine sarea chinonei respective colorat n albastru verde. Antocianii care posed 2 sau 3 grupri OH nvecinate formeaz compui chelatici cu ionii metalelor trivalente ( Al3+ , Fe3+ ) de culoare albastr. Tehnica de lucru

Peste 1 ml soluie apoas se adaug 1 ml NaOH rezultnd coloraii diferite n funcie de pH : coloraie roie la pH mai mic de 7, violet la pH= 7-8 , fenoxid albastru la pH= 8, i coloraie galben (calchon) la pH=12.

* Identificarea proantocianilor Antocianii sunt substane solide, cristalizate, colorate, solubile n alcool concentrat sau diluat i n solveni organici apolari; la pH=7, insolubili n ap. n apa acidulat (pH < 3) formeaz sruri de oxoniu solubite, colorate n rou Cu bazele formeaz fenoxizi solubili de diferite nuane, de la violet la albastru. Se presupune c la pH = 7, antocianii sunt derivai de 2-fenil- cromen-3-ol, labil, care se stabiIizeaz prin aromatizare n mediu acid, cnd trec n sruri de oxoniu.

O OH

H

+

O

+

OH

2 fenil--cromen

cation oxoniu

Heterozidele hidrolizeaz prin nclzire cu acizi diluai cu eliberarea antocianidolilor. Prin alcalinizare, dac se adaug soluii alcaline treptat i modificarea pH-ului este lent se obine mai nti o pseudobaz incolor (instabil la pH = 7) apoi forma chinonic violet (stabil la pH foarte slab bazic), fenoxid de culoare albastr (stabil Ia pH = 8-10); la pH = 12 se obin calchone colorate n galben.

n sucul vacuolar (pH 3); ar putea avea loc adiia nucleofil a apei care ar destabiliza structura oxonic. Se presupune ns c plantele pot preveni astfel de reacie prin acilare, co-pigmentare intermolecular cu flavonoidele, chelatare cu metalele i autoasocierea.O O O glucoza O O glucoza O glucoza O O glucoza O O

Fenoxid (albastru) pH =8

Fenoxid (albastru) pH =8

Principiul metodei: Se bazeaz pe proprietatea acestora de a se transforma n antociani prin refluxare n mediu acid, conform reaciei:

R1 OH HO O H OH OH R2 HCl H2 O RO Cl O+

R1 OH R2 OH OH OH

OH

Reactivi necesari: soluie de acid clorhidric 10 %

Tehnica de lucru: 10 ml soluie extractiv apoas nehidrolizat se concentreaz la reziduu. Acesta se reia cu 10 ml HCI i se divide n dou poriuni egale care se aduc n dou eprubete. Una dintre ele se menine ntr-o baie de ap n fierbere timp de 30 de minute pentru transformarea proantocianidolulul n antocian, cealalt servete drept martor. Dup rcire ambele soluii sunt agitate cu 3 ml butanol (pentru extracia antocianilor). Dac soluia butanolic obinut prin nclzire prezint o intensitate mai mare a culorii dect proba martor, n soluia de analizat exist proantociani.

* Identificarea saponozidelor Saponozidele triterpenice precipit cu acetatul neutru de plumb. Solubilitatea n ap a saponozidelor cu grupri carboxilice poate fi mrit prin alcalinizarea soluiei (cu hidrogenocarbonai, carbonai, fosfai). Se formeaz sruri mai solubile. Saponozidele triterpenice hidrolizeaz enzimatic, treptat, mai uor dect cele sterolice, cu formare de heterozide secundare sau prosapogenoli i oze. La nceput se scindeaz hexozele, apoi pentozele i n final acizii uronici. Hidroliza acid, dei total, este nespecific n mediu de reacie regsindu-se agliconii, ozele i eventual acizii uronici sau acizii organici care particip la structura saponozidei respective. a) Proba de spumefiere: se execut asupra soluiei extractive apoase care se agit timp de 15 sec ntr-o eprubet cu diametrul de 16 mm. Se formeaz o coloan de spum care persist cel puin 15 mm.

b) Reacia cu acetatul de plumb: saponozidele triterpenice reacionez cu acetatul de plumb 5% cnd se formeaz un precipitat alb. c) Reacia cu hidroxid de bariu: saponozidele formeaz cu hidroxidul de bariu un precipitat alb.

* Identificarea taninurilor Taninurile sunt substane solide, amorfe. Combinaiile cu mas molecular mic pot cristaliza, fiind incolore. Taninurile se dizolv n ap la cald, mai greu la rece, formnd soluii coloidale (solubilitatea variaz cu gradul de condensare) n alcool, aceton, acetat de etil; sunt insolubile n eter, cloroform, benzen, eter de petrol, sulfur de carbon i n ali solveni organici apolari. Au gust astringent, fiind lipsite de miros; au activitate optic i sunt higroscopice. Sunt absorbite de pulberea de piele, crbune, vat, oxid de aluminiu, caolin. Acizii i srurile minerale precipit taninurile din soluiile coloidale. Fiind fenoli cu caracter reductor (reduc reactivii Tollens, Fehling i KMnO4, H2O2, I2) dau coloraii caracteristice cu srurile de Fe (III): verde-negricios n cazul taninurilor catehice i albastru-negricios cnd sunt prezente taninurile galice. Caracterul acid se datoreaz gruprilor -COOH i -OH fenolice libere. Cu proteinele (substane amidice) taninurile formeaz combinaii

macromoleculare tridimensionale, impermeabile i impenetrabile (se stabilesc puni de hidrogen cu gruprile polare ale proteinelor).

Principiul metodei: Se bazeaz pe proprietatea taninurilor de a determina coloraii albastre (taninuri galice) sau verzi (taninuri catehice) n prezena srurilor de Fe+3. Pentru decelarea

exact a tipului de tanin existent se precipit taninurile catehice sub form de flobafene (precipitat rou) cu reactiv Styassny. Dup separarea precipitatului, n filtrat se execut reacia cu Fe+3 n scopul identificrii taninurilor galice. O coloraie albastru- negricioas indic o reacie pozitiv.

R HOOC N

O H R R N R

H N

H O R OR H

OH

O

HN H

Reactivi necesari reactiv Styassny (amestec HCI : CH2O = 1: 2) soluie FeCI3 1% sau alaun feric 1%

soluie acetat de sodiu 10% Tehnica de lucru: Peste 2 ml soluie apoas se adaug 0,5 ml soluie FeCl3 1%. Se formeaz o coloraie verde-brun datorit prezenei taninurilor catehice. Separat se nclzete la fierbere pe baia de ap, timp de 30 minute o prob de 4 ml soluie apoas i o cantitate echivalent de reactiv Styassny. Se formeaz un precipitat rou care se filtreaz prin hrtie de filtru. Filtratul se neutralizeaz cu soluie de acetat de sodiu10 % i se adaug 2- 4 picturi soIuie FeCI3 1%. Colorarea n albastru a soluiei indic prezena taninurilor galice.

* Identificarea alcaloizilor Alcaloizii sunt substane organice cu caracter bazic ce conin n molecul un atom de N heterociclic i au activitate farmacodinamic specific i toxicitate ridicat. Dei prezint structuri chimice foarte variate, toi alcaloizii se comport aproape identic fa de anumii reactivi denumii reactivi generali ai alcaloizilor din care fac parte dou categorii: reactivi generali de precipitare i reactivi generali de culoare. Reaciile de precipitare se efectueaz pe srurile alcaloizilor (deci n mediu acid apos), iar cele de culoare pe rezidiile bazelor alcaloidice.

Reacii de precipitare Principiul metodei: Toi alcaloizii, cu mici excepii, dau cu reactivii de precipitare precipitate albe, galbene, portocalii, brune i mai rar alte culori.

Reactivi necesari: acid clorhidric 2% reactiv Mayer (soluie apoas de tetraiodomercuriat de potasiu cu adaos de clorhidrat) reactiv Bertrand (soluie apoas de acid silicotungstic)

Tehnica de lucru:

10 ml extract eteric se evapor ntr-o capsul de porelan pe baia de nisip. Reziduul se dizolv n 1,5 ml acid clorhidric 2% prin amestecare cu o mic baghet de sticl la cald (pe baia de ap). Soluia decantat se mparte n trei eprubete, n volume egale. La una din probe (eprubete) se adaug 2-3 picturi de reactiv Mayer (R), la a doua prob se adaug 2-3 picturi de reactiv Bertrand (R) i ultima eprubet servete ca prob martor. Dac probele tratate cu reactivi dau opalescene sau precipitate evidente (de culoare alb-glbuie), alcaloizii sunt prezeni. (5)

Rezultate i discuii Rezultatele examenului chimic calitativ sint prezente n tabelele 1 3. se poate observa c n produsul vegetal studiat ( ciuperca Pleurotus ) am identificat: n soluie eteric agliconi sterolici i terpenici Alcoolic - compui azotai Apoas - triterpene - poliuranide - oze , polizaharide - compui azotai - compui reductori

Tabelul 1.Date experimentale obinute la examenul chimic calitativ pe soluii extractive eterice Nr. crt Compus cutat Reacia de identificare folosit Mayer 1. Alcaloizi baz Bertrand 3. Carotenoide Carr-Price + NaOH 10% n mediu alcoolic Borntrager galben glbui albastruviolet galbenportocaliu galben galben galben - inel: portocaliu -strat superior: verde-nchis++

Culoare

Intensitate

Rezultate

galben

-

Compui abseni

Compui abseni Compui abseni Compui abseni

4.

Cumarine

-

5.

Emodoli

-

6.

Flavone (agliconi)

Shibata NaOH AlCl3

-

Compui abseni

9.

Steroli i triterpene

LiebermannBurchard

Compui prezeni

Tabelul 2.Date experimentale obinute la examenul chimic calitativ pe soluie extractiv alcoolic

Nr . crt . 1.

Compus cutat

Soluie extractiv

Reacia de identificare folosit r.Mayer r.Bertrand

Culoare

Intensitate

Rezultate

Alcaloizi sare

alcoolic

galben

-

Compui abseni

2.

Antociani

alcoolic hirolizat

+ NaOH 10% n mediu alcoolic

albastruviolet

-

Compui abseni

3.

Flavonozi de

alcoolic hidrolizat

Shibata NaOH AlCl3 galben -

Compui abseni

6.

APFC (ODP-uri) Compui reductori

alcoolic

Arnow

galben precipitat rou crmizi u violet

-

Compui abseni Compui prezeni

7.

alcoolic

Fehling

++

8.

Compui reductori

alcoolic hirolizat

ninhidrin

++

Compui prezeni

Tabelul 3.Date experimentale obinute la examenul chimic calitativ pe soluie extractiv apoas

Nr. crt

Compus cutat Compui azotai

Soluie extractiv

Reacia de identificare folosit ninhidrin + hematoxilin; sol. alcoolic H2SO4 + timol sol. alcoolic Fehling LiebermannBurchard spumefiere FeCl3 R. Styasnny + FeCl3

Culoare

Intensitate Rezultate

1.

apoas

violet precipitat violet rou-brun precipitat rou crmiziu brun brun-rocat -

++

Compui prezeni Compui prezeni Compui prezeni Compui prezeni

2.

Poliuronide Oze i poliholozide Compui reductori

apoas

++

3.

apoas

++

4.

apoas apoas

++

5.

Saponozide

hidrolizat apoas apoas

+ -

Compui abseni

7.

Taninuri apoas

Compui abseni

3. Determinarea calitii

Pentru stabilirea calitii unui produs vegetal sunt necesare determinri preliminare (verificarea umiditii, determinarea reziduului prin calcinare i a substanelor solubile) i dozarea principiilor active.

3.1. Determinri preliminare Determinarea umiditii Pentru asigurarea conservrii produselor vegetate, acestea trebuie s aib un grad de umiditate care s se ncadreze n anumite limite. Cantitatea de ap din produsele vegetale este influenat de gradul de uscare, de mediul ambiant i de compoziia chimic a acestora.

Principiul metodei Procedeele de determinare a coninutului de ap din produsele vegetale sunt diferite (uscare la etuv, uscare la vid, uscare la exicator, antrenare cu vapori de solveni organici). Dintre aceste posibiliti s-a ales uscarea la etuv folosind produs vegetal uscat. Pentru uscare produsul vegetal trebuie meninut la temperatura ambiant timp de cteva zile.

Tehnica de lucru: ntr-o fiol de cntrire adus la greutate constant prin nclzire la etuv, la aceeai temperatur la care urmeaz s se fac i uscarea, i rcit n exicator, se

introduc 3-5 g prob de analizat; diametrul fiolei se alege astfel nct cantitatea de material luat n lucru s nu depeasc un strat mai gros de 5 mm. Fiola cu produs vegetal mrunit (sita IV) se menine patru ore la etuv la 100-105 C, se rcete n exicator i se cntrete. Se continu uscarea cte 60 de minute, rcirea n exicator i cntrirea pn la greutate constant.

Rezultate i discuii Prin aplicarea acestei metode am stabilit pentru produsul studiat o valoare a umiditii cuprins ntre 80 81,7 %

Determinarea substanelor solubile Substanele solubile reprezint cantitatea de constituieni chimici dintr-un produs vegetal, care se dizolv ntr-un anumit solvent (alcool, ap, eter). Am determinat substanele solubile n ap, n eter i n alcool datorit particularitilor observate n cadrul examenului chimic calitativ. Principiul metodei Pentru determinare am folosit metoda prevzut n Farmacopeea Romn ediia a X-a.

Tehnica de lucru 0,5-1,0 g produs vegetal pulverizat (VI) se cntrete la balana analitic i se aduc ntr-un flacon cu dop rodat; se adaug 10-20 g din solvent i se agit energic de

cteva ori. Se las la macerat 23 ore, se agit din nou timp de 1 or i se filtreaz, ndeprtnd primele poriuni de filtrat. 10,0 g filtrat se evapor la sicitate pe baia de ap, ntr-o fiol de cntrire n prealabit cntrit. Fiola de cntrire cu reziduu se usuc n etuv, la 1050C, timp de 3 ore, se rcete n exicator i se cntrete. Reziduu reprezint substane solubile i se raporteaz la 100 g produs vegetal.(7)

Rezultate i discuii Rezultatele obinute prin aplicarea acestei metode sunt urmtoarele: > substane solubile n ap: 23,3 23,8 g %

> substane solubile n alcool: 17,2 17,6 g % > substane solubile n eter: Concluzii Din rezultatele obinute prin aceast metod se observ c n produsul vegetal Pleurotus predomin substanele solubile n ap urmate de cele solubile n alcool i apoi cele solubile n eter. 12,6 12,8 g %

3.2. Dozarea principiilor active S-a considerat necesar s se determine coninutul n poliholozide.

Determinarea cantitativ a poliholozidelor Metoda gravimetric

Principiul metodei: Const n precipitarea poliholozidelor n mediu alcoolic.

Prepararea soluiei de analizat: 1,000 g produs vegetal s-a extras de dou ori cu cte 20 ml ap distilat, la fierbere, dup care s-a filtrat prin vat. Soluia extractiv obinut s-a concentrat la 20 ml.

Tehnica de lucru: Soluia extractiv apoas care s-a supus concentrrii dup rcire s-a tunat n fir subire ntr-un pahar Berzelius peste o cantitate de zece ori mai mare de metanol concentrat. Precipitatul obinut s-a lsat n repaus timp de 24 ore dup care s-a filtrat cantitativ printr-o hrtie de filtru anterior inut n exsicator i apoi cntrit. Hrtia de filtru cu precipitatul s-a meninut timp de 48 ore n exicator dup care s-a cntrit.

Calculul Se face diferena ntre cele dou mase cntrite (hrtia de filtru i hrtia de filtru cu precipitatul) i se raporteaz la 100 g produs vegetal (substan uscat).mb-ma g - umiditate

C% =

x 100

C% - concentraia n taninuri catehice exprimat n grame

mb - masa hrtiei de filtru cu precipitat ma - masa hrtiei de filtru g - cantitatea de produs vegetal cntrit

Rezultate i discuii Prin raportarea cantitii de precipitat obinut la 100 g produs vegetal (substan uscat) s-a determinat un coninut de 5,7 5,9 produsul Pleurotus g % poliholozide n

4.TESTAREA ACIUNII ASUPRA CELULEI VEGETALEMaterial i metod Testarea aciunii soluiei extractive apoase obinute din Pleurotus, asupra alungirii radiculare i asupra filmului mitotic al celulei vegetale, s-a realizat prin metoda profesorului dr Gr Constantinescu (metoda fitobiologic - testul Triticum). Principiul metodei: Const n determinarea diluiei maxime active a substanei studiate care, n funcie de durata de aciune, influeneaz alungirea radicular i filmul cariochinetic. Pentru testare s-a ntrebuinat o singur soluie extractiv.

Pregtirea soluiei de analizat S-a preparat o soluie apoas 5% prin refluxarea cu ap a produsului Pleurotus Osteartus.

Pentru a observa influena concentraiei asupra alungirii radiculare i mitozei, din soluia de analizat au fost obinute mai multe diluii, folosind volume diferite din soluia de testat i completnd la 15 ml cu ap distilat (tabelul nr. 4).

Tabelul nr. 4. Concentraia soluiilor de analizat Nr. crt. 1. 2. 3. 4. 5. 6. Volum sol. de analizat (ml) 15 10 7,5 5 2,5 1 Volum de ap (ml) 0 5 7,5 10 12,5 14 Concentraie g% (p.v./ml) 5 3,33 2,5 1,66 1,33 0,33

Soluia de analizat P1 P2 P3 P4 P5 P6

Volum total (ml) 15 15 15 15 15 15

Materialul biologic pe care s-au efectuat cercetrile a fost constituit din rdcini embrionare de gru (Triticum vulgare Mill, soiul Dropia, Gramineae, provenit de Ia ICCPT Fundulea).

Germinarea seminelor

Cariopsele de gru, selecionate pentru a fi ct mai omogene, se mbib cu ap distilat, timp de 24 ore, la temperatura din laborator (18- 25oC), dup care se pun la germinat n cutii Petri, cu diametrul de 15-20 cm, pe substrat de hrtie de filtru umectat cu ap. Cnd lungimea rdcinilor principale atinge 1 cm, se introduc cte 56 cariopse germinate ntr-o cutie Petri, cu diametrul de 10 cm, care conine 5 ml soluie de testat i se pstreaz la temperatura camerei.

Evaluarea creterii n lungime a rdcinilor Se folosete tehnica msurtorilor lineare, apreciind alungirea rdcinii principale din momentul iniial al tratamentulul, respectiv din prima zi, la intervale de 24 ore, pe parcursul a 5 zile, considernd aceast perioad drept faza cea mai activ de cretere. Rezultatele se exprim comparativ cu un martor M, unde s-a utilizat apa distlat n locul soluiei de cercetat. Se fac observaii asupra modificrilor morfologice: aspectul i numrul radicelelor, aspectul i lungimea epicotilulul.

Obinerea preparatelor microscopice Examenul microscopic urmrete modificrile filmului mitotic induse n vrfurile radiculare de Triticum vulgare. Studiul se face comparativ cu un martor (ap distilat) meninut n aceleai condiii cu probele. Rdcinile embrionare de gru au fost secionate la aproximativ 5 mm distan de vrf i colorate cu orcein acetic diluat, conform procedeulul La Cour. Orceina este un colorant natural extras din lichenii din genurile Racella i Lecanora. Procedeul se bazeaz pe afinitatea pentru cromatin a orceinei n mediu acid (pH- ul acid este necesar pentru hidroliza materialului aromatic din meristeme, care apoi se coloreaz n rou - violet).

Prepararea soluiei mam de orcein acetic Se nclzesc 100 ml acid acetic glacial p.a. la temperatura de fierbere i se adaug 2,2 g orcein p.a., apoi se las 2- 3 minute pe foc. Se rcete i se filtreaz. Se pstreaz la loc ntunecos, n flacoane bine nchise.

Prepararea soluiei standard de orcein acetic 1% Se amestec 45 pri soluie mam de orcein acetic cu 55 pri ap bidistilat. Prin adugarea unei pri de soluie HCI 1N la 10 pri soluie standard n momentul ntrebuinrii, se obine soluia diluat de orcein acetic utilizat la colorare.

Colorarea meristemelor radiculare Se folosesc creuzete mici de porelan, cu diametrul de 3 cm, n care se pipeteaz cte 1,5 ml din soluia diluat de orcein acetic. Se secioneaz vrfurile radiculare de 5 mm i se introduc n aceast soluie. Creuzetele se nclzesc 1-2 minute pe sit de azbest la bec de gaz pn la degajarea primilor vapori de acid acetic Se acoper i se las n repaus 10 minute - 2 ore Vrfurile radiculare astfel colorate se pun pe o lam de microscop, ntr-o pictur de soluie diluat de orcein, se acoper cu o lamel i se preseaz pn la strivirea materialului de cercetat. Preparatele se studiaz folosind un microscop Labophot 2 Nikon, cu obiectivele 40x i lOOx (n imersie de ulei de cedru).

Rezultate i discuii Rezultatele obinute prin msurarea lungimilor rdcinilor principale, timp de 5 zile consecutiv, sunt nregistrate n tabelele nr 5- 9

Alungirea rdcinilor embrionare de Triticum vulgare, exprimat n cm, n funcie de timpul de aciune exprimat n zile i de concentraia soluiei de testat este exprimat n graficul din figura nr Modificrile macroscopice ale rdcinilor embrionare i ale epicotilului, n funcie de tipul i concentraia soluiei testate, dup 120 de ore, sunt nregistrate n tabelul nr. 11

Tabelul nr. 5. Alungirea radicular la martor i dup meninerea n soluiile de testat (dup 24 ore)

Nr. Diluia crt. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. M P1 P2 P3 P4 P5 P6 1.9 1,0 1.4 1.3 1.3 1.2 2

Lungimea radcinii principale (cm) 2.5 1,0 1.5 1.3 1.2 1.2 2 3.3 1,0 1.1 1.2 1.2 1.4 1.8 1.8 1,0 1.3 1.3 1.3 1.3 2.3 2 1,0 1.3 1.2 1.5 1.7 2.2 2.5 1,0 1.1 1.4 1.4 1.1 1.9 2.2 1,0 1.2 1.1 1.2 1.5 1.5 1.9 1,0 1.1 1.5 1.3 1.4 1.8

Media lungimilor 2.2625 1,0000 1.2500 1.2875 1.3000 1.3500 1.9375

Tabelul nr.6. Alungirea radicular la martor i dup meninerea n soluiile de testat (dup 48 ore)

Nr. crt.

Diluia

Lungimea radcinii principale (cm)

Media lungimilor 3.7375 Media 1.1125 lungimilor 1.2625 4.6500 1.3500 1.1500 1.4625 1.3000 1.8750 1.3750 3.3125 1.7250 2.9375 3.3125

1. M 3.5 3.8 3.5 4.2 4.5 2.9 3.5 4 Nr. Diluia Lungimea radcinii principale (cm) 2. P1 1.1 1 1.3 1.1 1.1 1.1 1.2 1 crt. 3. P2 1.3 1.2 1.3 1.3 1.4 1.2 1.2 1.2 1. M 4.5 4 4.5 5 4.5 3 5 6.7 4. 2. 5. 3. 6. 4. 7. 5. 6. 7. P3 1 P4 2 P5 3 P6 4 P5 P6 1.3 1.1 1.7 1.4 1.4 1.3 3.7 2.3 2.2 4 1.4 1 1.2 1.9 1.5 3.7 2.5 3 2.2 1.3 1.7 1.2 1.4 1.3 3.9 1.9 2.7 4 1.3 1.1 1.3 2.1 1.3 3.4 1.3 3 6.3 1.2 1.9 1.4 2.1 1.3 2.2 1.9 3.7 2.2 1.4 1.2 1.4 1.2 2.2 1.4 2.2 1.4 2.3 6.5 1.4 1.1 1.2 2 1.4 3.4 1.2 2.9 2.3 1.5 1.2 1.3 1.2 1.9 1.5 4 1.3 2 4

Tabelul nr.7. Alungirea radicular la martor i dup meninere n soluiile de testat (dup 72 ore)

Tabelul nr.8. Alungirea radicular la martor i dup meni n soluiile de testat (dup 96 ore)

Tabelul nr.9. Alungirea radicular la martor i dup meninere Nr. Diluia Lungimea radcinii principale (cm) Diluia Lungimea radcinii principale (cm) crt. 1. M 4.5 5.3 4.7 6.9 4.5 4.7 7.5 8.6 5 5 1. M 4 5.2 6.7 4.5 6.8 10 2. 2. 3. 3. 4. 4. 5. 5. 6. 6. 7. 7. P1 P1 P2 P2 P3 P3 P4 P4 P5 P5 P6 P6 1.1 1.1 1.4 1.4 1.5 1.4 2.4 2.4 2.5 2.2 4.3 4 1.1 1 1.3 1.3 1.5 1.5 2.5 2.5 4.7 4.2 2.5 2.2 1.3 1.3 1.4 1.3 1.3 1.3 3.4 3.4 3.7 3.7 4.3 4.3 1.2 1.1 1.4 1.4 1.4 1.3 1.3 1.3 3.2 3.2 8.2 7.6 1.2 1.2 1.4 1.4 1.4 1.4 2 1.9 3.7 3.7 3.9 3.9 1.3 1.3 1.4 1.4 1.5 1.4 1.4 1.4 3.2 3.2 6.5 6.5 1.1 1.1 1.3 1.2 1.4 1.4 1.3 1.2 3.5 3.5 3.7 2.3 1.2 1.2 1.2 1.2 1.5 1.5 1.4 1.3 2.5 2.5 4 4 Media lungimilor 6.0875 5.6500 1.1875 1.1625 1.3500 1.3250 1.4375 1.4000 1.9625 1.9250 3.3750 3.2750 4.6750 4.3500

n soluiile de testat (dup 120 ore)

Tabelul nr. 10. Alungirea radicular la martor i dup meninerea n soluiile de testat

Nr. crt. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Proba M P1 P2 P3 P4 P5 P6

Media lungimilor rdcinii principale (cm) dup 24 h 2.2625 1,0000 1.2500 1.2875 1.3000 1.3500 1.9375 48 h 3.3775 1.1125 1.2625 1.3500 1.4625 1.8750 3.3125 72 h 4.6500 1.1500 1.3000 1.3750 1.7250 2.9375 3.3125 96 h 5.6500 1.1625 1.3250 1.4000 1.9250 3.2750 4.3500 120 h 6.0875 1.1875 1.3500 1.4375 1.9625 3.3750 4.6750

Figura nr.13. Aspectul plantulelor de Triticum dup 120 ore Tabelul nr. 11. Observaii macroscopice asupra plantulelor de gru meninute 120 de ore in soluiile testate Nr.crt. 1 Proba M concentraia g Observaii macroscopice % pv/100ml rdcini albe cu cretere normal fr tumefieri la baz sau la vrf trei rdcini secundare epicotil verde de 11-11,5 cm 5 creterea rdcinii principale inhibat total rdcina principal i rdcinile secundare sunt brunificate 2-3 rdcini secundare puin dezvoltate soluia este opalescent

2

P1

epicotilul este verde i are 6.5 com 3 P2 3,33 creterea rdcinii principale inhibat total rdcina principal i rdcinile secundare sunt brunificate 2-3 rdcini secundare puin dezvoltate soluia este opalescent epicotilul este verde i are 6.5 com creterea rdcinii principale inhibat total rdcina principal i rdcinile secundare sunt brunificate 2-3 rdcini secundare puin dezvoltate soluia este opalescent epicotilul este verde i are 6.5 com

4

P3

2,5

5

P4

1,66

6

P5

1,33

7

P6

0,33

creterea rdcinii principale este inhibat parial 3 rdcini secundare dezvoltate i contorsionate rdcina principal i cele secundare sunt puin brunificate epicotilul este verde i are 8 cm soluia este mai puin opalescent dect P1P3 creterea rdcinii principale a fost puin inhibat ( la din lungimea rdciniiprincipale a martorului ) 4 rdcini secundare foarte contorsionate, de culoare alb rdcina principal este alb epicotil verde de 9 cm soluia este opalescent creterea rdcinii primare este inhibat puin ( lungimea rdcinii principale atinge 2/3 din lungimea rdcinii principale a

martorului ) 4 rdcini secundare albe, ca i rdcina principal epicotil verde de 12 cm Din tabelele, graficele i fotografiile prezentate reiese c inhibarea creterii n lungime a rdcinii principale, de ctre soluia de analizat obinut din Pleurotus, este direct proporional cu concentraia. Astfel, la concentraii cuprinse n intervalul 5 i 2,5 are loc inhibarea total a alungirii radiculare, iar la concentraii mici de 0,33 se obin valori apropiate de cele ale martorului. Rezultatele studiului influenei extractelor testate asupra alungirii radiculare, precum i modificrile macroscopice evideniate de Testul Triticum, au impus necesitatea efecturii cercetrilor la nivel celular, prin examinare microscopic, conform tehnnicii menionate. Pentru a putea interpreta modificrile filmului mitotic induse de soluiile testate, s-au observat mai nti fazele mitozei normale ( la martor ): interfaz, profaz, metafaz, anafaz, telofaz.

n interfaz nucleul celulelor meristematice este bine conturat, are aspect granular, reticulat, se observ nucleolli; cromozomii nu sunt individualizai (cromatina este dispus sub form de reea). n profaz carioteca i nucleii nu se mai observ (se dezorganizeaz), se individualizeaz cromozomii (prin spiralizare i scurtarea filamentelor de cromatin), dar dispoziia lor este neregulat. n anafaz cromozomii onocromatidici migreaz spre cel doi poli, ajungnd la jumtatea distanei dintre ecuator i poli (aspect diaster).

n telofaz se formeaz nucleii fii (cromozomii monocromatidici ajuni la poli se despiralizeaz, refac reeaua de filamente de cromatin, carioteca i nucleolii se reorganizeaz). La sfritul acestei faze se observ apariiamembranei despritoare a celor dou celule fiice. Modificrile filmului mitotic induse de soluia de analizat sunt redate n tabelul nr. 12.

Tabelul nr. 12. Modificrile cariochinetice produse de extractele obinute din Pleurotus

Nr. crt . 1.

Proba

Observaii microscopice Frecvente mitoze normale n toate fazele

M

2.

P1

Inhibare de cineze Nuclei i nucleoli hipertrofiai Inhibare de cineze Nuclei i nucleoli hipertrofiai

3.

P2

4.

P4

Apar diviziuni Se observ interfaze i profaze Apar toate fazele diviziuni

5.

P6

Comparnd rezultatele examenului macroscopic cu cele ale examenului microscopic, putem afirma c efectul de inhibare aproape total a alungirii radiculare, observat la primele dou concentraii, se datoreaz aciunii asupra diviziunii celulare.

Discuii

Prin examinarea macroscopic a probelor timp de 120 de ore s-a observat c, n funcie de concentraie, are loc inhibarea total sau parial a creterii rdcinii principale. Prin examinarea microscopic a probelor dup 24 de ore s-au observat o serie de modificri constnd n : Efect mitoinhibitor i uor efect citotoxic evideniat prin nuclei cu nucleoli hipertrofiai. Efectul mitoinhibitor apare la primele trei concentraii n funcie de concentraie, dupa cum reiese din grafic.

CONCLOZII 1. Lucrarea cuprinde o parte teoretic, n care am reuit sistematizarea datelor gsite n literatura de specialitate cu privirea la specia Pleurotus ostreatus.

2. Partea experimental ncepe cu examenul macroscopic urmat de examenul microscopic, ce a permis stabilirea urmtoarelor elemente anatomice ale speciei Pleurotus ostreatus: - hife articulate, ramificate - spori mici, rotunzi - hife pluricelulare, septate 3. Prin efectuarea examenuluifitochimic am reuit identificarea n acest produs a urmtorilor compui : ageni sterolici i triptanici, compui azotai, saponozide, poliuronide, oze, polizaharide i compui reductori. 4. In cadrul analizei cantitative efectuate au fost dozate substantele solubile in eter, alcool, apa si polizaharidele 5. Prin testarea aciunii extractului apos asupra divizunii celulei vegetale am demonstrat c acest efect const n citotoxicitate uoar sau mitoinhibiie, n funcie de concentraia soluiei, i anume : efect mitoinhibitor la concentraii cuprinse ntre 5 2,5 % n urma cercetrilor efectuate putem spune c specia Pleurotus ostreatus comercializat n Romnia are o compoziie asemntoare celei din alte zone geografice (despre care exist date n literatura de specialitate).