Upload
others
View
1
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
EKSTRAK PROPOLIS SEBAGAIPREVENTIF PADA KULTURMAKROFAGYANG DIINFEKSI VIRUS Newcastle DiseaseBERDASARKAN PENURUNAN
TNF- (Tumor Necrosis Factor Alpha) DAN IL-6 (Interleukin-6)
SKRIPSI
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Kedokteran Hewan
Oleh : REYUDZKY PUTRI FITYANTI
125130100111029
PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER HEWAN FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG
2017
1
LEMBAR PENGESAHANSKRIPSI
Ekstrak PropolisSebagai Preventif Pada Kultur Makrofag Yang Diinfeksi Virus Newcastle Disease Berdasarkan Penurunan TNF-
(Tumor Necrosis Factor Alpha) Dan IL-6 (Interleukin-6)
Oleh :
REYUDZKY PUTRI FITYANTI 125130100111029
Setelah dipertahankan di depan Majelis Penguji pada tanggal
dan dinyatakan memenuhi syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Kedokteran Hewan
Pembimbing I Pembimbing II
Dr. Sri Murwani, drh., MP drh. Dahliatul Qosimah, M.kes NIP. 196301011989032001 NIP. 198201272015042001
Mengetahui, Dekan FakultasKedokteran Hewan
Universitas Brawijaya
Prof. Dr. NIP. 19600903 198802 2 001
ii
ii
LEMBAR PERNYATAAN
Saya yang bertanda tangan di bawah ini :
Nama : Reyudzky Putri Fityanti
NIM : 125130100111029
Program Studi : Kedokteran Hewan
Penulis skripsi berjudul :
Ekstrak PropolisSebagai Preventif Pada Kultur Makrofag Yang
Diinfeksi VirusNewcastle Disease Berdasarkan Penurunan TNF-
(Tumor Necrosis Factor Alpha) Dan IL-6 (Interleukin-6)
Dengan ini menyatakan bahwa :
1. Isi dari skripsi yang saya buat adalah benar-benar karya saya sendiri dan tidak
menjiplak karya orang lain, selain nama-nama yang termaktub di isi dan
tertulis di daftar pustaka dalam skripsi ini.
2. Apabila dikemudian hari ternyata skripsi yang saya tulis terbukti hasil
jiplakan, maka saya akan bersedia menanggung segala resiko yang akan saya
terima.
Demikian pernyataan ini dibuat dengan segala kesadaran.
Malang,April 2017
Yang menyatakan,
Reyudzky Putri Fityanti
NIM. 125130100111029
iii
iii
Ekstrak PropolisSebagai Preventif Pada Kultur Makrofag Yang Diinfeksi Virus Newcastle Disease Berdasarkan Penurunan TNF- (Tumor Necrosis
Factor Alpha) Dan IL-6 (Interleukin-6)
ABSTRAK
Newcastle Disease merupakan penyakit dengan mortalitas tinggi yang menyerang unggas disebabkan oleh strain virulen avian paramyxoviridae.Virus merupakan mikroorganisme intraseluler, sehingga keberadaannya dapat memicu timbulnya respon imun seluler seperti aktivasi dari makrofag dan meningkatnya produksi sitokin. Oleh karena itu diperlukan antivirus dan imunostimulator sebagai upaya pencegahan agar makrofag tidak terinfeksi virus.Propolis memiliki kandungan aktif yang dapat berperan sebagai antivirus dan imunostimulator. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui potensi ekstrak propolis sebagai preventif infeksi ND pada kultur makrofag berdasarkan penurunan produksi sitokin proinflamasi. Penelitian ini bersifat eksperimental dengan metode post test only control group design dan rancangan acak lengkap menggunakan kultur makrofag yang didapat dari peritoneum mencit strain Balb/Cjantan umur 6 minggu. Kultur makrofag dibagi menjadi 5 kelompok perlakuan, yaitu kontrol negatif (A) kultur makrofag tanpa perlakuan, kontrol positif (B) kultur makrofag tidak diberi ekstrak propolis tetapi diinduksi virus ND, (C) kultur makrofag diberi ekstrak propolis 25 µg/ml lalu diinduksi virus ND, (D) kultur makrofag diberi ekstrak propolis50µg/mllalu diinduksi virus ND, dan (E)kultur makrofag diberi ekstrak propolis 100µg/ml lalu diinduksi virus ND.Parameter yang diamati dalam penelitian ini adalah kadar TNF- -6. Masing-masing diukur dengan metode flowcytometry setelah melewati masa inkubasi dan panen sel. Analisa data dilakukan secara nonparametrik menggunakan Kruskal-Wallis yang dilanjutkan dengan uji |Ri-Rj|. Hasil dari penelitin ini adalah terjadi penurunan produksi TNF-
-6 pada kultur makrofag yang diberi preventif ekstrak propolis. Konsentrasi ekstrak propolis 25 µg/ml merupakan perlakuan terbaik yang memiliki efek paling besar untuk mencegah peningkatan produksi TNF- -6.
Kata kunci : Paramyxoviridae, Propolis, kultur makrofag, Sitokin
iv
iv
Propolis Extractasa Preventive InMacrophages CultureInfected By Newcastle DiseaseViruses Based On Declining of TNF- (Tumor
Necrosis Factor Alpha) and IL-6 (interleukin-6)
ABSTRACT
Newcastle Disease is a high mortality disease affecting poultry, caused by a virulent of avian Paramyxoviridae. Virus is intracellular microorganism, its presence can lead to cellular immune responses such as the activation of macrophages and increase production of cytokines. Thus antivirus immunostimulator needed as the preventive action for macrophages not to infected by virus. Propolis contains active substanceswhich can be acted as antivirus and immunostimulator. The purpose of this study was to determine the potential of propolis extract as a preventive in macrophage cultureinfected by NDV 64 HAU based on decreasing production of proinflamatory cytokines. This research was an experimental study with post test only control group design, completely randomized design, using macrophages culture of Balb/C miceperitoneal, male, age 6 weeks. Macrophages culture were divided into 5 groups: negative control (A), macrophages culture without treatment;positive control (B),macrophages culture were not not given the propolis extract but induced by NDV; induced virus ND (C), macrophages culture were given propolis extract 25 µg/ml then induced by NDV; (D) macrophages culture were given propolis extract 50 µg/ml then induced by NDV; (E) macrophages culture were given propolis extract 100 µg/ml then induced by NDV. The parameters observed in this researchwere the levels of TNF- -6. The parameters were measured using flowcytometry method after incubation and cell harvest period. Data analysis were done in nonparametric using Kruskal-Wallis test followed by |Ri-Rj|. The results of this researchshowed that there is a declining in the production of TNF-IL-6 in macrophages culture given a preventive action with propolis extract. Propolis extract concentration 50 µg/ml was the best treatment which has the biggest effect to prevent increasing production of TNF- -6.
key word : Paramyxoviridae, Propolis, macrophages cultured, cytokines
v
v
KATA PENGANTAR
Puji Syukur kehadirat Allah SWT yang telah memberikan nikmat,
limpahan rahmat, serta hidayah-Nya sehingga penulis mampu menyelesaikan
skripsi Ekstrak PropolisSebagai Preventif Pada Kultur
Makrofag Yang DiinfeksiVirus Newcastle Disease Berdasarkan Penurunan
TNF- Tumor Necrosis Factor Alpha) Dan IL-6 (Interleukin-6)
Penulis menyampaikan terima kasih kepada segenap pihak, yang secara
langsung maupun tidak langsung telah membantu dan membimbing dalam
menyelesaikan Skripsi ini. Secara khusus penulis menyampaikan terima kasih
kepada:
1. Dr. Sri Murwani, drh., MP.selaku pembimbing I dandrh. Dahliatul Qosimah,
M.Kes selaku pembimbing II yang telah memberikan bimbingan serta
nasehat kepada penulis.
2. drh. Ahmad fauzi, M.Sc dan drh. Yudit Oktanella, M.Si selaku dosen
penguji atas saran yang diberikan.
3.
atas kepemimpinan dan dukungan demi kemajuan FKH UB.
4. Drh. Dyah Ayu Oktavianie A. P., M. Biotech selaku Wakil Dekan 1
Fakultas Kedokteran Hewan atas kepemimpinan dan dukungan demi
kemajuan FKH UB.
5. Mama dan Ayah (Inda Rekyanti dan Tri Yudono) yang selalu memberikan
semangat, doa, kasih sayang, dukungan baik secara moril maupun materil
kepada penulis.
6. Teman-teman satu tim penelitian : Muhtamalia Riska F. D., Rakhmah Wira
W., Dien Ayu Utami, dan Didik Afif Sucitra.
7. Keluarga besar serta seluruh mahasiswa FKH UB yang telah menjadi kolega
baru selama proses pendidikan di Kedokteran Hewan.
8. Serta semua pihak yang telah membantu dalam penyelesaian penulisan
Skripsi ini yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu.
vi
vi
Penulis menyadari bahwa Skripsi ini masih jauh dari
kesempurnaan, maka saran dan kritik yang konstruktif dari semua pihak
sangat diharapkan demi penyempurnaan selanjutnya.
Semoga laporan Skripsi ini dapat bermanfaat bagi semua pihak,
khususnya bagi penulis dan para pembaca pada umumnya.
Malang, April 2017
Penulis
vii
vii
DAFTAR ISI
Halaman HALAMAN JUDUL .............................................................................................. i LEMBAR PENGESAHAN ................................................................................. ii LEMBAR PERNYATAAN ................................................................................. iii ABSTRAK ........................................................................................................... iv ABSTRACT ............................................................................................................ v KATA PENGANTAR .......................................................................................... vi DAFTAR ISI ....................................................................................................... viii DAFTAR GAMBAR .............................................................................................. x DAFTAR TABEL.......................................................................................xi DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xii DAFTAR SINGKATAN DAN LAMBANG...............................................xiii BAB 1 PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang ...................................................................................... 1 1.2. Perumusan Masalah............................................................................... 3 1.3. Batasan Masalah .................................................................................... 3 1.4. Tujuan Penelitian................................................................................... 4 1.5. Manfaat Penelitian................................................................................. 5
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Newcastle Disease (ND) ....................................................................... 6 2.2 TNF- (Tumor Necrosis Factor Alpha) .............................................. 12 2.3 IL-6 (Interleukin 6).............................................................................. 14 2.4 Makrofag ............................................................................................. 14 2.5 Propolis................................................................................................ 16
BAB 3 KERANGKA KONSEPTUAL 3.1 Kerangka konsep ................................................................................. 18 3.2 Hipotesis penelitian ............................................................................. 21
BAB 4 METODE PENELITIAN 4.1 Tempat dan Waktu Penelitian ............................................................. 22 4.2 Alat dan bahan
4.2.1 Alat penelitian ......................................................................... 22 4.2.2 Bahan penelitian ...................................................................... 23
4.3 Tahapan Penelitian .............................................................................. 24 4.4 Langkah Kerja
4.4.1 Persiapan Hewan Coba ............................................................ 24 4.4.2 Rancangan Penelitian .............................................................. 26 4.4.3 Variabel Penelitian .................................................................. 28 4.4.4 Pembuatan Ekstrak Propolis .................................................... 28 4.4.5 Pembuatan Kultur Makrofag ................................................... 29 4.4.6 Pemberian Ekstrak Propolis Pada Kultur Makrofag ............... 31 4.4.7 Preparasi Virus ND ................................................................. 31 4.4.8 Penentuan Produksi TNF- .............. 33 4.4.9 Penentuan Produksi IL-6 Dengan Flowcytometry .................. 34
4.5Analisis Data ........................................................................................... 34
viii
viii
BAB 5 HASIL DAN PEMBAHASAN 5.1 Pengujian Pengaruh Ekstrak Propolis Terhadap Kadar TNF-
IL-6 ....................................................................................................... 39 5.1.1 Pengujian Pengaruh Ekstrak Propolis Terhadap Kadar TNF- dengan Uji Kruskal-
5.1.2 Pengujian Pengaruh Ekstrak Propolis Terhadap Kadar IL-6 dengan Uji Kruskal-Wa
BAB 6 KESIMPULAN DAN SARAN 51 DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 52 LAMPIRAN .......................................................................................................... 58
ix
ix
DAFTAR GAMBAR Gambar Halaman 2.1 Struktur Virus Newcastle Disease ...................................................................... 7 4.4 Lokasi Injeksi Virus Newcastle Disease .......................................................... 32 5.1 Gambaran Kultur Makrofag ............................................................................. 37 5.2 Gambaran Kultur Makrofag Setelah Diberi Ekstrak Propolis Kemudian Diinkubasi Selama 24 Jam ..................................................................................... 38 5.3 Hasil Uji HA Diperoleh 64 HAU.....................................................................39 5.4 Histogram Rata-rata Kadar TNF- .................................................................. 41 5.5 Histogram Rata-rata Kadar IL-6 ...................................................................... 48
x
x
DAFTAR TABEL Tabel Halaman Tabel 2.5 Kandungan Kimia Propolis .................................................................... 16 Tabel 5.1 Pengujian Pengaruh Ekstrak Propolis Terhadap Kadar TNF- Uji Kruskal-Wallis dan Ri-Rj5% ........................................................... 44 Tabel 5.1 Pengujian Pengaruh Ekstrak Propolis Terhadap Kadar IL-6 dengan Uji Kruskal-Wallis dan Ri-Rj 5% .......................................................... 49
xi
xi
DAFTAR LAMPIRAN Lampiran Halaman Lampiran 1. Sertifikat Laik Etik ........................................................................... 58 Lampiran 2. Surat Keterangan Skrining Fitokimia Propolis ................................. 59 Lampiran 3. Surat Keterangan Kesehatan Mencit ................................................ 60 Lampiran 4. Kerangka Operasional ...................................................................... 61 Lampiran 5. Pembuatan Ekstrak Propolis ............................................................. 62 Lampiran 6. Pengenceran Propolis ........................................................................ 63 Lampiran 7. Preparasi Virus ND ........................................................................... 64 Lampiran 8. Pembuatan Kultur Makrofag ............................................................ 65 Lampiran 9. Perhitungan Makrofag ...................................................................... 66 Lampiran 10. Metode Flowcytometry .................................................................... 67 Lampiran 11. Gambar Hasil Flowcytometry ......................................................... 68 Lampiran 12. Data Hasil Analisa Statistik IL-6 dan TNF- ................................. 75
xii
xii
DAFTAR SINGKATAN DAN LAMBANG Simbol/singkatan Keterangan ND Newcastle Disease TNF- Tumor Necrosis Factor Alpha IL-6 Interleukin 6 HAU HA Unit RPMI 1640 Roswell Park Memorial Institute 1640 TAB Telur Ayam Berembrio HA Test Hemaglutination Test SN Serum Neutralization ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay FAT Flourescent Antibody Technique IFN Interferon DOC Day Old Chicken APP Acute Phaseprotein MCP Monocyte Recruitment Protein MMP Matrix Metalloproteinase ROS Reactive Oxygen Species GF Growth Factor PBS Phosphate Buffer Saline RBC Red Blood Cell FBS Fetal Bovine Serum TLR Toll Like Receptor
1
BAB 1
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Newcastle Disease merupakan penyakit infeksius menyerang
unggas yang mematikan. Penyakit ini disebabkan oleh NDV (Newcastle
Disease Virus) famili Paramyxoviridae yang merupakan virus RNA.Pada
tahun 1926, wabah ND pertama kali dilaporkan terjadi di pulau Jawa, dan
sekarang ND merupakan penyakit endemik di Indonesia. Laporan terakhir
mengenai isolasi virus ND di Indonesia adalah tahun 2009, isolat tersebut
dinamakan sebagai NDV/Bali-1/07. Meskipun sudah dilakukan vaksinasi
yang ketat pada peternakan ayam, akhir-akhir ini kasus ND masih
dilaporkan di lapangan. Hal ini mungkin disebabkan virus yang
bersirkulasi di lapangan tidak sesuai lagi dengan strain virus pad vaksin
yang tersedia(Adi et al., 2010).Kerugian yang ditimbulkan ND berupa
kematian yang tinggi, penurunan produksi telur dan daya tetas, serta
hambatan terhadap pertumbuhan (Pudjiatmoko et al., 2014).
Tindakan pencegahan harus dilakukan secara komprehensif, salah
satunya dengan meningkatkan sistem imun menggunakan senyawa atau
bahan tertentu sebagai imunostimulator. ND bersifat intraseluler, sehingga
dapat hidup di kultur makrofag. Dalam hal ini makrofag berperan dalam
fagositosis sertamemproduksi sitokin (Kaihena,2013). Interaksi antara
antibodi dan molekul antigen dapat mengaktifasi makrofag menginduksi
ekspresi sitokin proinflamasi. Sitokin proinflamasi yang berperan sebagai
2
indikator terjadinya inflamasi adalah sitokin TNF- -6. Infeksi yang
berat akan memicu produksi TNF- Hardyanto, 2013).
Sitokin IL-6 merupakan mediator penting dari respon inflamasi dan
terlibat dalam berbagai kegiatan seluler, termasuk proliferasi sel,
diferensiasi, dan apoptosis. Fungsi sitokin IL-6 selain sebagai indikator
inflamasi adalah bersama dengan TNF-
monosit ke tempat inflamasi untuk menyingkirkan antigen atau stimulus
terjadinya inflamasi (Bratawidjaja, 1998).
Tindakan preventif untuk kasus ND yang umum dilakukan adalah
dengan memberikan vaksinasi. Namun karena kasus ND masih terjadi di
lapangan, maka perlu dilakukan upaya alternatif. Kali ini kami akan
mencoba untuk menggunakan Ekstrak Propolis sebagai preventif pada
kultur makrofag yang diinfeksi virus ND. Propolis adalah salah satu jenis
bahan yang memiliki potensi sebagai imunostimulator alami (Herawati et
al, 2015).
Propolis adalah suatu zat yang dihasilkan oleh lebah madu dengan
cara mengumpulkan resin atau getah dari berbagai macam tumbuhan,
kamudian resin ini akan bercampur dengan saliva dan enzim yang ada
pada lebah. Bagi lebah, propolis bersifat desinfektan atau antimikroba
yang dapat membunuh bakteri atau virus yang masuk ke dalam sarangnya
(Lofty, 2006). Propolis mengandung senyawa kompleks seperti vitamin,
mineral, enzim, senyawa fenolik dan flavonoid. Flavonoid mempunyai
berbagai efek farmakologis antara lain sebagai imunostomulan, antikanker,
3
antioksidan, antiviral, antialergi, antihepatoksik (Koca, 2007); dan juga
memiliki aktivitas dalam hal meningkatkan respon imun (Wu et al, 2011).
Berdasarkan latar belakang di atas, penelitian ini dilakukan untuk
mengetahui pengaruh dari ekstrak etanol propolis terhadap ekspresi dari
TNF- -6.Diharapkanpada penelitian ini pemberian ekstrak etanol
propolismampu menurunkan produksi TNF- -6 pada kultur
makrofag yang didapatkan dari peritoneal mencit.
1.2. Perumusan masalah
Berdasarkan latar belakang yang telah diuraikan, maka perumusan
masalah dari penelitian ini adalah :
1. Apakah ekstrak propolis memiliki efek preventif terhadap kultur makrofag
yang diinfeksi virus Newcastle Disease melalui penurunan produksi
Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-
2. Apakah ekstrak propolis memiliki efek preventif terhadap kultur makrofag
yang diinfeksi virus Newcastle Disease melalui penurunan produksi
Interleukin 6(IL-6)?
1.3 Batasan Masalah
Berdasarkan latar belakang yang telah diuraikan, maka penelitian ini
dibatasi pada :
1. Hewan model yang digunakan adalah mencit jantan (Mus musculus) galur
Balb/C. Mencit yang digunakan berjumlah 4 ekor, usia 6-8minggu dengan
berat badan 20-30 gram (Rahayuningsih, 2010). Mencit didapatkan dari
Dinas Pertanian Kota Malang. Penggunaan hewan coba telah mendapatkan
4
sertifikat laik etik dari Komisi Etik Penelitian Universitas Brawijaya
Malang No: 610-KEP-UB.
2. Prosedur kultur makrofag dari peritoneum mencit menggunakan medium
Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) dilakukan dengan
menggunakan metode yang digunakan oleh Rahayuningsih (2010).
3. Virus Newcastle Disease diperoleh dari PUSVETMA yang kemudian
dikembangbiakan pada Telor Ayam Berembrio (TAB) dan dilakukan
Hemaglutination Test (HA) untuk mengetahui titer virus. Titer dari virus
yang diinfeksikan pada kultur makrofag adalah 64 HAU (Hoss et al,
1989).
4. Propolis didapatkan dari lebah jenis Trigona sp yang menghisap bunga
randu dan bunga hutan di Peternakan Lebah Lawang Rimba Raya.
Kemudian dilakukan ekstrak di Laboraturium Farmakologi Fakultas
Kedokteran Universitas Brawijaya Malang dengan menggunakan metode
dari Jaya et al (2008).
5. Penentuan perlakuan yang diberikan pada kultur makrofag dibedakan
menjadi lima (A) kontrol negatif, (B) kontrol positif, (C)pemberian ekstrak
propolis25µg/ml, (D) pemberian ekstrak propolis 50µg/ml, dan (E)
pemberian ekstrak propolis 100µg/ml(Herawati et al, 2015).
6. Variabel yang diamati dalam penelitian ini adalah kadar TNF- -6
5
1.4. Tujuan penelitian
Adapun tujuan dari penelitian ini adalah sebagai berikut :
1. Mengetahui potensi ekstrak propolis sebagai preventif terhadap kultur
makrofag yang diinfeksi virusNewcastle Disease melalui penurunan
produksi Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-
2. Mengetahui potensi ekstrak propolis sebagai preventif terhadap kultur
makrofag yang diinfeksi virus Newcastle Disease melalui penurunan
produksiInterleukin 6(IL-6).
1.5 Manfaat penelitian
Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi
mengenai potensi ekstrak propolissebagai preventif terhadap kultur
makrofag yang diinfeksi virus Newcastle Disease melalui penurunan
produksi sitokin proinflamasi, Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-
Interleukin-6 (IL-6). Selain itu juga sebagai referensi atau acuan dalam
penelitian selanjutnya terhadap tindakan preventif terhadap virus
Newcastle Disease.
5
BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
2.1Newcastle Disease (ND)
2.1.1 Etiologi
Newcastle disease (ND) merupakan suatu penyakit pernapasan dan
sistemik, yang bersifat akut dan mudah sekali menular, yang disebabkan
oleh virus dan menyerang berbagai jenis unggas, terutama ayam (Tabbu,
2000). ND disebabkan oleh virus berukuran 150-250 milimikron yang
memiliki amplop dan kapsid berbentuk heliks yang simetris.
Spesies : Newcastle Disease Virus
Genus : Avulavirus
Famili : Paramyxoviridae
Ordo : Mononegavirales
Grup : ss-RNA
Genom virus ini mempunyai enam protein utama yang
menyusunnya yaitu Nucleocapsid protein (N), Phosphoprotein (P), Matrix
protein (M), Fusion protein (F), Hemagglutininneuraminidase protein
(HN) dan Large polymerase protein (L) (Rout & Samal 2008). Gambar
2.1 merupakan gambaran struktur virus ND. Terdapat dua protein non-
struktural lainnya yang dihasilkan selama proses transkripsi gen P yaitu V
dan W. Protein N, P, HN dan F terletak di bagian luar envelope sedangkan
protein M terdapat di lapisan dalam virion (Peeters et al. 2004).Ada dua
protein penting pada virus ND, yakni HN dan F. Protein H merupakan
6
protein yang melekat dan mengikat pada reseptor pada bagian luar
membran sel inang, termasuk sel darah merah. Bagian N (neuraminidase)
merupakan enzim aktif yang membantu dalam pelepasan virus dari
membran sel inang. Aktivitas enzim ini mempengaruhi waktu yang
dibutuhkan bagi virus untuk mengelusi dari sel darah merah. Protein F
berfungsi untuk fusi antara amplop virus dengan membran sel inang
(Pudjiatmoko et al., 2014).
Gambar 2.1 Struktur Virus Newcastle Disease (Chang and Dutch, 2012)
2.1.2 Gejala Klinis
Penyakit ini menyebar dengan cepat pada spesies ayam, kalkun dan
spesies unggas yang lain. Periode inkubasi dan gejala klinis ND
dipengaruhi oleh beberapa faktor. Masa inkubasi ND pada unggas antara
3-6 hari tergantung pada jenis spesies inang, kekebalan inang serta
konsentrasi dan strain virus ND. Gejala klinis non-spesifik yang
ditunjukkan oleh ND meliputi depresi, bulu rontok, sulit bernafas dengan
mulut terbuka, hipertermia, anoreksia, lesu dan hipotermia sebelum
kematian.Meskipun demikian, dugaan terhadap ND muncul apabila organ
7
limpa, timus, bursa fabricius dan saluran pencernaan unggas yang sakit
mengalami perdarahan dan nekrosis (Courtney et al. 2013).
Berdasarkan gejala klinis yang diperlihatkan ayam terinfeksi virus
ND dikelompokkan dalam lima patotipe yaitu viscerotropic velogenic,
sangat patogenik dengan ciri kematian yang tinggi dan lesi hemoragik
pada usus; neurotropic velogenic, dengan ciri kematian yang tinggi, gejala
pernafasan dan saraf; mesogenic, dengan kematian rendah, gejala
pernafasan dan saraf; lentogenic, dengan gejala klinis ringan dari saluran
pernafasan; dan asymptomatic enteritic, dengan bentuk infeksi subklinis
enteric (OIE, 2012).
Tekanan respon kekebalan inang oleh infeksi virus ND
menyebabkan kerusakan organ limfoid primer bersifat sementara atau
permanen (Nasser et al. 2000). Sistem kekebalan spesifik (humoral dan
seluler) tidak dapat berfungsi secara optimal pada ayam yang terinfeksi
virus ND karena jaringan limfoid tidak berkembang sehingga
menyebabkan kelainan patologi atau kerusakan pada organ limfoid seluler
seperti limpa dan timus (Rue et al, 2011).
2.1.3 Cara Penularan
Penularan virus ND yang utama terjadi secara per inhalasi atau
lewat saluran pernafasan. Virus ND dikeluarkan oleh ayam terutama lewat
berbagai ekskresi. Barang atau bahan-bahan yang ada di kandang,
termasuk alas kandang (liter), dapat tercemar virus ND dan terbawa angin
ke peternakan ayam yang jaraknya berdekatan. Penularan virus ND juga
8
dapat terjadi per os pada ayam yang berdekatan dalam satu kandang.
Ayam yang selamat dari serangan virus ND, tetapi masih meninggalkan
gejala saraf hendaknya disingkirkan (dipotong) agar tidak menularkan
penyakit pada ayam lain (Soeharsono, 2005).
2.1.4 Patogenesitas
Protein HN berperan dalam tahap penempelan virus ND pada
reseptor sel inang yang mengandung sialic acid yaitu glycoprotein dan
glycolipid (Iorio et al. 2009). Protein F sebagai perantara penempelan
virus dengan penyatuan virus dan membran sel inang. Selanjutnya, RNA
virus dilepaskan ke dalam sitoplasma kemudian terjadi replikasi. Proses
masuknya virus ke dalam sel melalui dua cara, yang pertama adalah
penyatuan secara langsung antara envelope virus dengan membran plasma
dan yang kedua adalah diperantarai oleh reseptor endositosis (Ferreira et
al, 2004).
Disamping mempunyai reseptor yang cocok dengan virus ND, sel
inang juga harus memiliki enzim tripsin yang fungsinya mirip protease
untuk memecah protein F0 menjadi F1 dan F2 pada infeksi ND avirulen
walaupun protease tidak selalu diperlukan untuk penempelan virus ND
virulen (Sakaguchi et al. 1991). Penyebaran reseptor sel pada ayam yang
peka terhadap virus ND avirulen bersifat terbatas dan hanya ditemukan
pada saluran pencernaan dan pernafasan atas, sedangkan replikasi virus
ND virulen terjadi di sebagian besar jaringan inang (Brown et al. 1999).
Virus ND avirulen yang diinokulasikan lewat mulut bereplikasi di
9
esofagus, tembolok dan proventrikulus satu hari pasca-inokulasi, lalu
bereplikasi di duodenum, jejunum, ileum dan sekum, kemungkinan terjadi
sebagai akibat dari viremia pada hari keempat hingga keenam pasca-
infeksi (Bouzari & Spardbrow, 2006).
2.1.5 Diagnosis
Diagnosa awal terhadap ND tipe velogenik viserotropik dapat
didasarkan atas gejala klinik yang diperkuat oleh pemeriksaan patologik.
ND tipe Velogenik Neurotropik bersifat kurang spesifik dibandingkan
dengan VVND. Diagnosa awal untuk bentuk ini dapat didasarkan atas
adanya gejala gangguan pernapasan dan gangguan saraf. Sedangkan untuk
infeksi virus ND yang disebabkan oleh galur mesogenik dan lentogenik,
sulit untuk didiagnosa berdasarkan gejala klinik dan perubahan patologik
tertentu. Diagnosa akhir didasarkan atas isolasi dan identifikasi virus
penyebab penyakit (Tabbu, 2000).
Menurut Pudjiatmoko et al. (2014), diagnosa penyakit Newcastle
Disease dapat didasarkan atas epizootiologi, tanda-tanda klinis, kelainan
patologi anatomi yang dikukuhkan dengan hasil pemeriksaan
laboratorium, sebagai berikut:
a) Isolasi dari swab trakea atau kloaka atau suspensi 10% dari otak
atau paru, dalam larutan NaCl fisiolofis yang mengandung
antibiotik diinokulasikan pada telur ayam berembrio (TAB) umur
9-11 hari.
10
b) Pemeriksaan serologi, dengan menguji adanya antibodi dalam
tubuh dengan uji HI, uji Serum Neutralization (SN) dan Enzyme
linked immunosorbent assay (ELISA).
c) Pengujian adanya antigen dapat dilakuukan pula dengan uji
Flourescent Antibody Technique (FAT) atau dengan rapid test.
2.1.6 Imunitas Terhadap Virus
Respon kekebalan non-spesifik (alamiah) terdiri dari faktor-faktor
yang sudah ada sejak lahir atau sebelum tubuh terinfeksi mikroorganisme.
Respon kekebalan ini bersifat cepat dan paling awal dalam pertahanan
terhadap infeksi mikroorganisme.Komponen sistem imun non spesifik
tidak mempunyai kemampuan untuk bereplikasi secara cepat, akan tetapi
selalu siap untuk melawan dan mencerna bahan-bahan asing dalam waktu
yang singkat. Sel-sel dalam sistem imun non spesifik meliputi granulosit
yang berfungsi memfagosit atau mencerna, natural killer cells khusus
untuk sel kanker, makrofag dan komplemen yang kesemuanya berfungsi
sebagai pertahanan pertama terhadap adanya infeksi(Ferdous et al.
2008)dan mediator peradangangan sitokin (Scott & Owens, 2008).
Menurut, ada beberapa mekanisme utama respons nonspesifik
terhadap virus, yaitu :
1. Infeksi virus secara langsung akan merangsang produksi IFN
oleh sel-sel terinfeksi; IFN berfungsi menghambat replikasi
virus (Sinthari, 2014).
11
2. IFN tidak akan bekerja sendirian. IFN akan merangsang
makrofag untuk meningkatkan sintesis dari sitokin lain seperti
TNF- -6 (Ishartadiati, 2008).
2.1.7 Pengendalian dan Pencegahan
Tujuan dari pengendalian ND adalah mencegah ayam yang peka agar tidak
terinfeksi oleh virus tersebut atau mengurangi jumlah ayam yang peka
dengan program vaksinasi. Untuk mencegah masuknya dan menyebarnya
virus ND ke dalam suatu peternakan, maka diperlukan pengamanan
biologis yang ketat dan pelaksanaan aspek manajemen lainnya secara
optimal untuk menghilangkan faktor pendukung / sumber infeksi virus.
Sistem perkandangan, sanitasi/desinfeksi, kualitas DOC, kualitas dan
kuantitas pakan, pengaturan pekerja atau pengujung dan system
transportasi sapronak/pronak juga penting untuk diperhatikan.
Pengamanan biologis yang ketat perlu didukung oleh program vaksinasi
terhadap ND yang sesuai untuk merangsang timbulnya kekebalan pada
suatu kelompok ayam yang peka (Tabbu, 2000).
2.2Tumor Necrosis Factor -
Tumor Necrosis Factor -
proinflamasi dalam sistem imun. TNF-
termasuk makrofag (Widegren, 2008). TNF-
memiliki susunan struktur trimer yang pada awalnya berbentuk prekursor
(pTNF-
12
bentuk terlarut (sTNF-
biologis dari TNF- diantaranya :
1. Mengerahkan neutrofil dan monosit ke tempat infeksi serta
mengaktifkan sel-sel tersebut untuk menyingkirkan mikroba.
2. Merangsangan yang multiple terhadap limfosit T teraktifkan, misalnya
respon proliferasi limfosit T terhadap antigen, peningkatan reseptor
untuk IL-2 dan IFN- tkan ekspresi antigen
MHC kelas 1 pada fibroblast dan sel endotel(Abbas et al., 2010).
3. Merangsang fagosit mononuklear untuk mensekresi IL-1 dengan efek
seperti TNF.
4. Menjadi reseptor pengatur respon kekebalan serta mampu
menimbulkan efek seluler yang beragam termasuk apoptosis, nekrosis,
efek keradangan, efek proliferasi atau yang mempromosikan
pertumbuhan dan efek hematopoietik.
5. Mengaktivasi produksi khemokin yang memiliki efek kemotaksis
terhadap sel-sel inflamasi.
Interaksi antara faktor-faktor tersebut merupakan mekanisme
efektor yang terjadi pada respon imun yang dapat bersifat protektif atau
bahkan menyebabkan kerusakan jaringan yang disebut reaksi
hipersensitifitas (Thomas, 2001).
Tumor Necrosis Factor dibentuk atas 212 asam amino diatur pada
homotrimers yang stabil dengan berat molekul 51 kD. Seperti sitokin 14
proinflamasi yang lain, ekspresi dan sintesa dari TNF-
13
dihasilkan oleh sel-sel hematopoetik saja (Raharjo, 2010). TNF-
mengalami peningkatan produksi pada keadaan inflamasi akut dan kronik
(Popa et al., 2007). Infeksi yang berat dapat memicu produksi TNF- dalam
jumlah besar. Peranan yang menguntungkan dari TNF-
sebagai respon imun terhadap bakteri, jamur, virus, dan invasi parasit
(Tracey and Cerami, 1994).
2.3 Interleukin-6 (IL-6)
Interleukin-6 ini merupakan salah satu IL dengan berat molekul 22-29 kD
yang memegang peranan sangat penting pada reaksi inflamasi dan
menginduksi produksi antibodi (Silva et al., 2007).IL-6 berfungsi dalam
imunitas nonspesifik dan spesifik. Diproduksi fagosit momonuklear, sel
endotel vascular, fibroblast, dan sel lain sebagai respon terhadap mikroba
dan sitokin lain. IL-6 mempunyai berbagai fungsi. Dalam imunitas
nonspesifik, IL-6 merangsang hepatosit untuk memproduksiacute
phaseprotein(APP) dan bersama CSF merangsang progenitor di sumsum
tulang untuk memproduksi neutrofil. Dalam imunitas spesifik, IL-6
merangsang pertumbuhan dan diferensiasi sel B menjadi sel mast yang
memproduksi antibodi.Pelepasan IL-6 ini merangsang sel makrofag muda
menjadi matang dan sel makrofag yang sudah matang akan mampu
melakukan fagositosis lebih efisien (Martinez dan Dunn, 2011; Mosser,
2003).IL-6 bersama dengan TNF-a dan IL-1, meningkat pada kondisi
septik atau peradangan aseptik.
14
2.4 Makrofag
Makrofag adalah salah satu tipe sel darah putih yang memakan benda
asing. Makrofag mempunyai peranan kunci dalam respon imun yang
bereaksi terhadap benda asing. Makrofag terutama berasal dari sel dari
sum-sum tulang, dari promonosit yang akan membelah menghasilkan
monosit yang beredar dalam darah. Pada tahap kedua monosit berimigrasi
kedalam jaringan ikat tempat mereka menjadi matang dan inilah yang
disebut makrofag. Makrofag membantu dalam proses penghancuran
antigen. Makrofag juga mengeluarkan substansi yang menstimulasi sel
lainnya yang juga berperan dalam sistem imun, dan juga terlibat dalam
presentasi antigen, dalam hal ini makrofag membawa antigen di
permukaan sel dan mempresentasikan kepada sel T (Effendi, 2003).
Makrofag juga melepaskan TNF-
(Baratawidjaja, 2004).
Monosit berdiferensiasi menjadi makrofag yang memproduksi berbagai
macam sitokin (TNF- -1, IL-10, IL-6 TGF- -8, MCP-
1), growth facor, metalloproteinase dan dapat memodifikasi lipoprotein
melalui oksidasi. Monocyte recruitment protein-1 (MCP-1), berperan
dalam perekrutan monosit dari sirkulasi. (Osterud & Bjorklid, 2003; van
Haelst, 2005). Kerja kolektif dari macrophage-derived cytokine dan lipid-
mediator adalah menginduksi inflamasi lokal yang banyak mengandung
neutrofil yang akan memfagositosis dan menghancurkan patogen (Abbas
and Litchtman, 2003).
15
Makrofag memegang peranan utama dalam proses inflamasi dan
kekebalan alami. Aktivitasnya besar, tergantung pada kapasitasnya untuk
memproduksi free-oxygen radicals, protease, complement factor, dan
sitokin (Hansson, 2001). Pada umumnya makrofag atau monosit yang
diaktifkan dengan berbagai rangsangan, dengan cepat menginduksi
produksi sejumlah sitokin seperti TNF- - - -6.
Makrofag, limfosit, fibroblast, sel endotel, otot polos yang ditemukan
dalam vaskuler dengan inflamasi dapat mengekspresikan reseptor TNF
(Baratawidjaja,2004).
2.5 Propolis
Ada banyak produk yang dihasilkan dari lebah, diantaranya adalah
madu, royal jeli, polen, dan juga propolis. Propolis adalah kompleks dari
resin yang dikumpulkan dari berbagai tanaman oleh lebah madu yang
kemudian bercampur dengan air liur lebah madu. Lebah menggunakan
propolis dalam pembuatan, pemeliharaan, perlindungan, dan untuk
mensterilkan sarangnya (Marcucci et al, 2001). Komposisi dari propolis
sangat kompleks. Unsur utamanya adalah lilin lebah, resin, dan senyawa
volatil. Lilin lebah adalah hasil sekresi dari lebah itu sendiri, sedangkan
resin dan volatil berasal dari tanaman (Rachmadian, 2011). Beberapa
kandungan kimia telah diidentifikasi dalam propolis, diantaranya adalah
resin, lilin lebah, minyak esensial, protein, senyawa organik lainnya yang
akan ditampilkan pada Tabel 2.5. berikut :
16
Tabel 2.5 Kandungan Kimia Propolis (Sivasubramaniam & Seshadri, 2005)
Kelas Komponen Jumlah Group Komponen
Resin 45-55% Flavonoid, asam fenolat dan esternya Lilin dan asam lemak 25-53% Sebagian besar dari lilin lebah dan beberapa
dari tanaman Minyak esensial 10% Senyawa volatile Protein 5% Protein kemungkinan berasal dari polen dan
amino bebas Senyawa organik lain dan mineral
5%% Mineral yang paling terkenal adalah Fe dan Zn, selain itu adalah Au, Ag, Cs, Hg, La, dan Sb. Senyawa lain seperti keton, laktan, kuinon, asam benzoate, gula, vitamin B3
Senyawa yang terkandung dalam propolis secara garis besar
dikelompokkan dalam tiga kelompok yaitu flavonoid, turunan cinnamic
acid, dan terpenoid. Senyawa tersebut memiliki peran penting dalam
aktivitas biologis propolis, antara lain sebagai imunomodulator,
antimikrobial, antioksidan, antiinflamasi, antifungal, antiprotozoa,
antiparasit, dan antiproliferatif (Rachmadian, 2011).
35
BAB 3
KERANGKA KONSEPTUAL
3.1 Kerangka Konsep
Keterangan :
: Variabel Terikat : Induksi NDV
: Variabel Bebas : Pemberian Propolis
: Efek Pemberian Propolis
: Efek Pemberian NDV
Mencit
Kultur Makrofag Ekstrak Propolis
TNF- IL-6
Aktivitas Makrofag
KulturMakrofagDiinfeksi Virus ND (64 HAU)
Proliferasi dan Diferensiasi Makrofag Imunostimulator
Antivirus
ROS Sitokin MMP GF
Penurunan Aktivasi dari Makrofag
18
Ekstrak propolis mengandung flavonoid, tanin, dan saponin.
Flavonoid sebagai antioksidan dapat melindungi dari radikal bebas dengan
cara mentransfer ion hidrogen ke ion yang mengalami radikal bebas
sehingga menjadi stabil. Keadaan ion yang telah stabil menyebabkan
menurunnya keadaan stres oksidatif. Tannin atau polifenol bekerja
menghambat pelepasan mediator inflamasi dan menghentikan reaksi rantai
radikal bebas. Sedangkan saponin akan mencegah kerusakan membran sel
akibat radikal bebas. Telah dibuktikan bahwa flavonoid mampu
mempercepat fagositosis. Fagositois yang berlebih akan memerlukan O².
Hal ini akan menyebabkan terjadinya respiratory burst. Jika tidak
tergantung dengan O² maka fagositosis akan menggunakan enzim sebagai
antioksidan endogen (SOD, NO, H²O²). Pada saat terdapat antigen yang
harus difagositosis namun antioksidan endogen tidak tersedia dalam jumlah
yang cukup, maka diperlukan antioksidan tambahan untuk membantu
menurunkan produksi dari ROS. Radikal bebas yang banyak dan tidak
diimbangi dengan antioksidan yang cukup akan menyebabkan stres
oksidatif yang meningkat. Pemberian ekstrak propolis akan mencegah
terjadinya peningkatan produksi dari makrofag seperti ROS, Sitokin
proinflamasi (TNF- -6), MMP, dan Growth Factor. Sehingga fungsi
makrofag akan kembali normal.
Pada saat NDV diinfeksikan ke dalam kultur makrofag, akan terjadi
diferensiasi dan proliferasi dari makrofag. Hal ini akan menyebabkan
peningkatan dari sitokin proinflamasi diantaranya TNF- -6. TNF-
19
merupakan sitokin yang mengawali proses apoptosis dan menginduksi
sitokin-sitokin lainnya seperti IL-6. Sedangkan IL-6 akan membuat
makrofag mampu melakukan fagositosis dengan lebih efisien. Aktivitas dari
makrofag tergantung pada kapasitasnya untuk memproduksi free-oxygen
radicals (ROS), sitokin, matrix metalloprotease (MMP), dan growth factor
(GF).
ROS adalah beberapa jenis molekul dan radikal yang berasal dari
molekul oksigen (O2) yang digunakan dalam pernapasan. Efek toksik ROS
pada DNA adalah dapat modifikasi basa DNA atau pemotongan cincin
DNA sehingga mengakibatkan penuaan dan kanker. Sedangkan efek toksik
pada protein adalah inaktivasi enzim, depolarisasi protein yang dapat
mengakibatkan radang inflamasi. Sitokin merupakan protein sistem imun
yang mengatur interaksi antarsel dan memacu reaktivitas imun.
Metaloproteinase matriks atau MMP merupakan protease dengan aktivitas
degradasi terhadap proteinjaringan ikat seperti kolagen, elastin, proteoglikan
dan laminin. MMP telah dikenal perannya dalam pertumbuhan sel kanker
dan metastasisdan telah sering menjadi target terapi anti kanker karena
ekspresinya yang berlebih.Sedangkangrowth factor sebagian besar berperan
untuk memicu siklus sel dan menghambat apoptosis.Aktivasi makrofag
karena pemberian NDV juga akan menyebabkan peningkatan produksi dari
ROS, sitokin, MMP, dan GF. Sehingga akan menyebabkan kerusakan
jaringan.
20
3.2 Hipotesis Penelitian
Berdasarkan kerangka konseptual yang telah ada, maka hipotesis
yang
dapat diajukan adalah sebagai berikut ini :
1. Pemberian ekstrak propolis memiliki efek preventif terhadap kultur
makrofag yang diinfeksi virus ND dengan menurunkan produksi Tumor
Necrosis Factor Alpha (TNF-
2. Pemberian ekstrak propolis memiliki efek preventif terhadap kultur
makrofag yang diinfeksi virus ND dengan menurunkan produksi
Interleukin 6 (IL-6).
35
BAB 4
METODE PENELITIAN
4.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada bulan Oktober 2016. Pelaksanaan
penelitian terdiri atas beberapa tahapan meliputi :
1. Pembuatan ekstrak propolisdi Laboraturium Farmakologi Fakultas
Kedokteran Universitas Brawijaya.
2. Aklimatisasi mencit dilakukan di Laboratorium Farmakologi Universitas
Muhammadiah Malang.
3. Preparasi NDV di Laboraturium Imunologi Fakultas Kedokteran Hewan
Universitas Brawijaya.
4. Pembuatan kultur makrofag dilaksanakan di Laboratorium Biomedik
Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang.
5. Pengukuran Tumor Necrosis Factor (TNF- Interleukin-6 (IL-6)
menggunakan teknik flowcytometry dilaksanakan di Laboratorium
Fisiologi Hewan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan (MIPA)
Universitas Brawijaya Malang.
4.2 Alat dan Bahan
4.2.1 Alat Penelitian
Alat pemeliharaan hewan coba terdiri atas kandang kotak plastik
dengan ukuran 35 x 27,5 x 12 cm untuk setiap kelompok perlakuan, tutup
kandang yang terbuat dari kawat, meja untuk meletakkan kandang, tempat
22
pakan dan minum, lampu serta alas kandang berupa sekam. Alat yang
digunakan untuk preparasi dan pembuatan kultur makrofag terdiri atas
blade, spuit 10 cc, tabung sentrifuse steril, hemasitometer, microplate 24
sumuran, inkubator CO2. Alat preparasi virus ND adalah Peneropong
telur, Pengebor telur, Spuit 1 ml, Forceps, Gunting, Inkubator Telur (37°
C, 62% kelembaban), microplate 96 sumuran dengan dasar U, dan
Mikropipet. Alat untuk membuat ekstrak propolis adalah Erlenmeyer 500
ml dan 1000 ml, pengaduk, corong gelas, pipet, kertas saring, Rotary
evaporator, Thermostirer, Vortex-mixe, waterbath, Magnetic stirrer 5 cm,
aliminium foil, kulkas, Thermometer, dan botol untuk menyimpan dosis.
Alat untuk pengujian flowcytometry terdiri atas spuit 5 mL, sentrifuge
tube, mikropipet 10 dan 1000 mikroliter, tabung dan rak eppendorf,
sentrifus, masker, sarung tangan dan tissue tabung propilen, microtube,
Pro
4.2.2 Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi mencit
Balb/C, bahan pemeliharaan hewan coba yaitu pakan, air minum dan
sekam. Bahan preparasi virus ND berupa Phospat Buffered Saline (PBS)
dan alkohol 70%. Bahan-bahan yang digunakan dalam pembuatan ekstrak
propolis adalah propolis yang diambil dari peternakan lebah Rimba Raya
Lawang, E-pure, etanol dan DMSO. Bahan yang dilakukan untuk
preparasi NDV adalah Telur Berembrio, Alkohol 70%, Lilin yang telah
23
dicairkan, RBC 10% (Washed red blood cells), PBS (Phosphat Buffer
Saline).Bahan yang digunakan untuk preparasi dan pembutan kultur
makrofag terdiri atas alkohol 70%,larutan RPMI dingin, PBS, medium
komplit (RPMI 1640, FBS 10%, penicillin, streptomycin dan glutamin),
asam asetat 3%. Bahan pada uji flowcytometry terdiri atas PBS steril,
antibodi intraseluler (TNF - -6).
4.3 Tahapan Penelitian
Berikut ini adalah tahapan penelitian yang dilakukan:
1. Persiapan hewan coba
2. Rancangan penelitian
3. Variabel penelitian
4. Pembuatan ekstrak propolis
5. Preparasi virus ND
6. Pembuatan kultur makrofag dari peritoneum mencit
7. Pemberian ekstrak propolis pada kultur makrofag
8. Pemberian virus ND pada kultur makrofag
9. Penentuan produksi TNF- -6 dengan flowcytometry
4.4. Langkah Kerja
4.4.1 Persiapan Hewan Coba
Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit
Balb/c jantan umur 6 minggu dengan berat badan 20-30 gram
(Rahayuningsih,2010). Strain yang dipilih adalah Balb/C sebab strain ini
dapat menimbulkan respon imuntias apabila diinokulasi dengan virus
24
Newcastle Disease (Hoss et al,1989). Penelitian ini menggunakan hewan
coba mencit Balb/c karena merupakan mencit yang sering digunakan pada
penelitian bertujuan umum maupun penelitian di bidang imunologi.
Sebelum perlakuan terlebih dahulu mencit diaklimatisasi selama
lima hari dengan cara ditempatkan pada sebuah kandang yang terbuat dari
plastik dan diberi pakan berupa susu PAP berbentuk pelet dan air minum
secara ad libitum (Mangkoewidjojo, 2006). PAP adalah pelet buatan
pabrik dan tebuat dari biji-bijian seperti jagung, wheat bran, tetes tebu,
palm olein, asam amino esensial, mineral esensial, premix, dan vitamin.
Kandungan protein pada susu PAP yang tinggi namun memiliki
kandungan serat yang rendah. PAP biasa digunakan sebagai pakan kelinci
dan pakan untuk menggemukkan anak sapi. Kandungan gizi susu PAP
adalah : Protein 16%, Lemak kasar 3-7%, Serat kasar 8%, Kalsium 0,9-
1,2%, dan Phosphor 0,6-1,0%. Menurut Harmita dan Maksum (2008),
mencit bersifat penakut, fotofobia, cenderung berkumpul dengan
sesamanya dan lebih aktif pada malam hari dibandingkan siang hari
sehingga perlu dilakukan aklimatisasi. Hal ini juga dijelaskan oleh
Institute of Laboratory Animal Resources Commision an Life Science
(2010) bahwa sebelum hewan coba digunakan dalam percobaan, diberikan
aklimatisasi atau masa adaptasi minimal selama lima hari untuk tujuan
meminimalisasi stress dan hewan coba dapat mengekspresikan tingkah
laku alaminya. Hewan coba dikandangkan dalam lima kandang kelompok
sesuai dengan kelompok perlakuan yang akan diberikan. Setiap kandang
25
berisi 4 ekor mencit.Kandang mencit diletakkan pada lokasi yang bebas
dari kebisingan dan polutan dengan suhu ruang 20-24ºC dan siklus gelap-
terang selama 12 jam.Kandang dibersihkan dan diganti alas kandang setiap
hari.
4.4.2 Rancangan Penelitian
Penelitian bersifat eksperimental dengan menggunakan Rancangan
Acak Lengkap (RAL) yaitu penggunaan media yang sama atau dianggap
seragam dalam penelitian (Kusriningrum, 2008). Penelitian menggunakan
metode Post test only control group design dimana percobaan
(eksperimen) yang dilakukan bertujuan untuk mengetahui pengaruh yang
timbul sebagai akibat dari adanya perlakuan tertentu. Pengukuran
parameter produksi TNF- -6 dilakukan untuk mengetahui pengaruh
pemberian ekstrak etanol propolis pada kultur makrofag yang diinduksi
virus ND. Hewan coba dalam penelitian ini dibagi menjadi lima kelompok
perlakuan yang berbeda, antara lain:
1. Kelompok A (kontrol negatif): Kultur makrofag yang tidak diberi
ekstrak propolis dan tidak diinduksi virus ND.
2. Kelompok B (kontrol positif): Kultur makrofag yang diinduksi virus
ND dosis 64.
3. Kelompok C (perlakuan satu): Kultur makrofag yang diberi ekstrak
propolis konsentrasi 25µg/ml kemudian diinduksi virus ND dosis 64
HAU.
26
4. Kelompok D (perlakuan dua): Kultur makrofag yang diberi ekstrak
propolis konsentrasi 50µg/ml kemudian diinduksi virus ND dosis 64
HAU.
5. Kelompok E (perlakuan tiga): Kultur makrofag yang diberi ekstrak
propolis konsentrasi 100µg/ml kemudian diinduksi virus ND dosis 64
HAU.
Jumlah hewan model yang diperlukan dalam penelitian ditentukan
dengan melakukan optimasi terlebih dahulu. Pada saat optimasi, dari satu
ekor mencit dapat diambil 2,5 ml yang mengandung 2.500.000 sel
makrofag. Jumlah sampel minimal dihitung menggunakan rumus
(Kusriningrum, 2008).
Sehingga:
P (n-1) 15 Keterangan:
5 (n-1) p = jumlah kelompok perlakuan
5n-5 n = jumlah ulangan yang diperlukan
5n
5n
n
Berdasarkan hasil perhitungan di atas, untuk lima kelompok perlakuan
diperlukan jumlah ulangan lebih besar sama dengan empat atau minimal
empat kali ulangan dalam setiap kelompok. Penelitian ini menggunakan
empat kali ulangan dalam setiap kelompok perlakuan sehingga jumlah
kultur makrofag yang diperlukan sebanyak 20 sumuran kultur makrofag.
27
Satu sumuran berisikan 500.000 sel makrofag (Akrom, 2013). Sehingga
satu ekor mencit dapat dipakai untuk satu kali pengulangan, jadi pada
penelitian ini dibutuhkan empat ekor mencit karena terdapat empat kali
pengulangan.
4.4.3 Variabel Penelitian
Variabel yang diamati dari penelitian ini adalah:
1. Variabel bebas
Variabel bebas dalam penelitian ini adalah ekstrak propolis dengan
konsentrasi bertingkat 25 µg/ml, 50µg/ml, 100µg/ml. Penetapan
konsentrasi yang digunakan didasarkan pada modifikasi dari
penelitian yang telah dilakukan oleh Herawati et al (2015). Variabel
bebas lainnya adalah virus ND yang diberikan dengan dosis 64
HAU.
2. Variabel tidak bebas (variabel terikat)
Variabel terikat dalam penelitian ini adalah TNF- -6.
3. Variabel kontrol (variabel kendali)
Variabel kontrol dalam penelitian ini adalah mencit strain Balb/C,
umur 6-8 minggu, jenis kelamin jantan, berat badan 20-25 gram,
pakan yang diberikan seragam yaitu pakan standar berbentuk pelet
(Mangkoewidjojo, 2006).
4.4.4Pembuatan Ekstrak Propolis
Langkah pertama adalah mengekstraksi propolis dengan etanol
sebagai pelarut memekai perbandingan propolis : etanol adalah 1 : 10. Alat
28
yang digunakan yaitu Thermostirer berkecepatan 150 rpm selama 4 jam
dan diputar dengan bantuan Magnetic Stirer 5 cm. Hasilnya disaring
dengan menggunakan kertas saring sehingga didapat filtrate propolis.
Filtrat dipisahkan dari pelarut dengan cara penguapan dalam rotary
evaporator pada suhu 70°C berkecepatan 2-3 rpm (Jaya et al, 2008).
4.4.4.1 Penentuan Konsentrasi Ekstrak Propolis
Penelitian ini menggunakan konsentrasi ekstrak propolis untuk
virus uji 0% (kontrol positif), 25µg/ml, 50µg/ml, dan100µg/ml. Menurut
Herawati et al (2015) pengencer yang digunakan adalah dimethyl sulfoxide
(DMSO). Alasannya adalah karena DMSO memiliki polaritas yang sama
dengan propolis. Jumlah ekstrak propolis yang dimasukkan kedalam
sumuran adalah 500 µl (Herawati et al, 2015). Jadi hel pertama yang
dilakukan adalah pembuatan stok propolis 1000 µg/ml DMSO. Kemudian
diencerkan kembali dengan medium komplit menggunakan rumus
V1.M1=V2.M2 sampai mendapatkan konsentrasi yang diinginkan.
Perhitungannya terdapat pada Lampiran 6 (halaman 64). Dalam media
perlakuan terdapat komposisi sebagai berikut:
Perlakuan C : 500 µl makrofag + 500 µl ekstrak propolis konsentrasi 25 µg/ml
+ suspensi virus ND 64 HAU 100 µl
Perlakuan D:500 µl makrofag + 500 µl ekstrak propolis konsentrasi 50 µg/ml
+ suspensi virus ND 64 HAU 100 µl
Perlakuan E : 500 µl makrofag + 500 µl ekstrak propolis konsentrasi 100
µg/ml + suspensi virus ND 64 HAU 100 µl
29
4.4.5 Pembuatan Kultur Makrofag
4.4.5.1 Isolasi Makrofag
Prosedur dibawah ini dilakukan untuk mendapatkan 5x105
sel/sumuran. Mencit dieuthanasia dengan dislokasi servikalis, kemudian
diletakkan dalam posisi terlentang, kulit abdomen dibuka sehingga tampak
peritoneum kemudian dibersihkan dengan alkohol 70%, kemudian
diinjeksi dengan 10cc larutan RPMI dingin ke dalam rongga peritoneum.
Peritoneum digoyang-goyangkan pelan untuk mendapatkan makrofag
yang cukup banyak. Setelah itu cairan disedot kembali sampai habis dan
dimasukkan dalam tabung sentrifuse steril. Cairan kemudian disentrifus
dengan kecepatan 800 rpm pada suhu ruang (25 °C) selama 8 menit.
Setelah supernatan dibuang, ditambahkan 1cc RPMI 1640, penicillin-
streptomycin sebanyak 10 µl. Sel-sel makrofag dihitung dengan
hemasitometer. Makrofag diwarnai dengan Trypan Blue 0,05% dengan
perbandingan 1:1. Campuran makrofag dan TB dimasukkan ke dalam
haemositometer dengan kemiringan 45°, sampel dimasukkan pada dua sisi
pengisian lalu didiamkan selama 1 menit sebelum dilakukan perhitungan
dibawah mikroskop inverted dengan perbesaran 400x. Sel yang hidup
tidak terwarnai dan sel yang mati berwarna biru (Rahayuningsih, 2010).
Cara perhitungan sel adalah :
a) Sel yang menempel garis kanan dan bawah dimasukkan dalam
perhitungan, sedangkan yang menempel pada garis kiri dan atas tidak
dihitung. Sel yang menggumpal dihitung sebagai satu sel.
30
b) Diperkirakan jumlah sel dalam 1 kotak besar 20-60 atau 100-300 dalam
4 kotak besar. Apabila lebih banyak, harus dilakukan pengenceran lagi.
c) Jumlah sel per ml dan jumlah sel yang hidup per ml dalam suspensi
dapat dihitung dengan rumus :
Total sel/ml = total sel x faktor pengenceran x 104 4 Jumlah sel hidup = sel hidup x faktor pengenceran x 104 4
Setelah dilakukan perhitungan sel dalam suspensi sampel, maka
dilakukan pengenceran dengan densitas 5x105 sel/500 µl dengan rumus
V1xC1=V2xC2.
4.4.5.2 Kultur Makrofag
Suspensi sel yang didapat kemudian dikultur dalam medium
komplit (RPMI 1640, penicillin-streptomycin) di dalam microplate 24
sumuran dasar rata, masing-masing sumuran 500 mikroliter (kepadatan
5x105 sel/500 µl), kemudian diinkubasi dalam inkubator CO² pada suhu
370C selama 24 jam. Fungsi inkubator CO² adalah untuk mempertahankan
suhu optimal dengan tingkat CO² 5% (Rahayuningsih, 2010).
4.4.6Pemberian Ekstrak Propolis pada Kultur Makrofag
Penelitian ini menggunakan beberapa level konsentrasi ekstrak
propolis. Medium kultur diganti dengan medium komplit ditambah ekstrak
dengan konsentrasi 25µg/ml, 50µg/ml, dan 100µg/ml. Kultur makrofag
yang ada dalam sumuran sejumlah 500 µl di beri ekstrak propolis
31
sebanyak 500 µl. Kemudian diinkubasi selama 24 jam (Herawati et al,
2015).
4.4.7 Preparasi Virus ND
4.4.7.1 Membiakkan Virus Pada Telur Ayam Berembrio
Virus dibiakkan pada TAB berumur 9-11 hari. Telur diteropong terlebih
dahulu untuk memastikan tempat injeksi. Dilakukan candling untuk
mengetahui letak embrio ayam dan lokasi pembuluh darah, selanjutnya
diberi tanda dari cangkang telor supaya lokasi injeksi virus tidak mengenai
embrio dan pembuluh darah tersebut. Gambar 4.4 merupakan gambaran
lokasi injeksi virus Newcastle Disease di allantois sac.
Gambar 4.4 Lokasi Injeksi Virus Newcastle Disease (Murwani et al, 2013)
Kemudian telur disterilkan pada tempat injeksi. Setelah virus diinokulasikan,
lubang ditutup dengan menggunakan paraffin. Telur diamati setelah 16-18
jam untuk memastikan bahwa embrio sudah mati, kemudian telur dapat
disimpan dalam suhu 4° C. Cara memastikan bahwa embrio sudah mati
adalah dengan melakukan candling kembali dan embrio tidak akan
merespon terhadap cahaya (Suryana, 2001).
32
4.4.7.2 Hemaglutination (HA) Test
Uji HA dilakukan untuk mengetahui titer dari virus yang akan
diinduksikan pada kultur makrofag. Hal pertama yang dilakukan adalah
memasukkan 0,025 ml PBS dari sumuran 2-12. Suspensi virus dimasukkan
ke dalam sumuran 1 sebanyak 0,025 ml. Selanjutnya ambil 0,025 ml dari
sumuran 1 dan campurkan ke sumuran 2 sampai sumuran ke-11. Ambil
0,025 ml pada sumuran ke-11 untuk dibuang. Kemudian ditambahkan
0,025 ml RBC ke semua sumuran lalu campur hingga homogen. Sumuran
ke-12 hanya berisi PBS dan RBC karena digunakan sebagai kontrol
negatif. Jika sudah terjadi endapan eritrosit pada sumuran ke-12, maka
dapat diamati aglutinasi yang terjadi pada dasar sumuran dengan
memiringkan plat titermikro. Endapan yang tidak dapat mengalir
merupakan positif HA (OIE, 2012).
4.4.7.3 Pemberian Virus ND Pada Kultur Makrofag
Kultur makrofag yang sudah diberi ekstrak kemudian diinkubasi selama 24
jam diinduksi virus ND dengan dosis infeksi 64 HAU. Kemudian
dilakukan inkubasi kembali selama 30 menit (Herawati et al, 2015).
4.4.8Penentuan Produksi TNF- Flowcytometry
Kultur makrofag yang sudah diinduksi dengan NDV dan diberi
ekstrak propolis dengan berbagai macam dosis ditambahkan PBS
sebanyak 1 mL lalu dihomogenkan dengan cara pipetting.Fungsi dari PBS
ini adalah untuk pencucian dan pengenceran setelah panen dari kultur sel.
Setelah itu diambil 100 µl kemudian dimasukkan ke dalam microtube
33
baru. Selanjutnya ditambahkan 500 l PBS, kemudian disentrifugasi
dengan kecepatan 2500 rpm selama 5 menit dengan suhu 40C. Hasil dari
sentrifugasi diambil bagian peletnya kemudian ditambahkan antibodi cell
surface molecule yang digunakan untuk staining molekul permukaan sel
sebanyak 50 l, lalu diinkubasi selama 30 menit dengan suhu 40C. Setelah
itu ditambahkancytofix cytopermyang berfungsi untuk fiksasi dan
permeabilisasi sel untuk pewarnaan sitokin intraseluler dengan antibodi
anti-sitokin fluorochrome-terkonjugasisebanyak 100 µl, kemudian
diinkubasi selama 20 menit dengan suhu 40C, lalu ditambahkan
washpermuntuk mencuci sel-sel dan untuk mencairkan antibodi anti-
sitokin untuk pewarnaan 1 mL dan disentrifugasi lagi dengan kecepatan
2500 rpm selama 5 menit dengan suhu 40C. Setelah didapatkan pelet hasil
sentrifugasi ditambahkan antibodi intraseluler (TNF-
ditambahkan 300 l PBS, lalu dimasukkan dalam kuvet flowcytometry
4.4.9Penentuan Produksi IL-6 dengan Flowcytometry
Kultur makrofag yang sudah diinduksi dengan NDV dan diberi
ekstrak propolis dengan berbagai macam dosis ditambahkan PBS
sebanyak 1 mL lalu dihomogenkan dengan cara pipetting.Fungsi dari PBS
ini adalah untuk pencucian dan pengenceran setelah panen dari kultur
sel.Setelah itu diambil 100 µl, kemudian dimasukkan ke dalam microtube
baru. Selanjutnya ditambahkan 500 l PBS, kemudian disentrifugasi
dengan kecepatan 2500 rpm selama 5 menit dengan suhu 40C. Hasil dari
34
sentrifugasi diambil bagian peletnya kemudian ditambahkan antibodi cell
surface molecule yang digunakan untuk staining molekul permukaan sel
sebanyak 50 l, lalu diinkubasi selama 30 menit dengan suhu 40C. Setelah
itu ditambahkan cytofix cytoperm sebanyak 100 µl, kemudian diinkubasi
selama 20 menit dengan suhu 40C, lalu ditambahkan washperm 1 mL dan
disentrifugasi lagi dengan kecepatan 2500 rpm selama 5 menit dengan
suhu 40C. Setelah didapatkan pelet hasil sentrifugasi ditambahkan IL-6
sebanyak 50 µl, kemudian ditambahkan 300 l PBS, lalu dimasukkan ke
dalam kuvet flowcytometry
4.5 Analisis Data
Analisa data yang digunakan dalam penelitian ini adalah analisa
kuantitatif One Way ANOVA, a
One Way ANOVA dimaksudkan untuk melihat pengaruh terhadap
pemberian ekstrak propolis sebagai preventif pada kultur makrofag yang
diinfeksi virus ND, kemudian dilanjutkan dengan uji Tukey untuk melihat
perbedaan tiap perlakuan.
35
BAB 5
HASIL DAN PEMBAHASAN
Sebelum penelitian berlangsung, dilakukan optimasi terlebih dahulu untuk
mengetahui berapa jumlah sel makrofag yang dihasilkan dari satu ekor
mencit. Setiap sumuran dalam kultur berisi 500.000 sel makrofag. Setelah
dilakukan optimasi, dari satu ekor mencit mampu menghasilkan 2.500.000
sel. Peneitian ini memerlukan sebanyak 20 sumuran, sehingga jumlah
mencit yang dibutukan hanya 4 ekor. Makrofag diisolasi dari peritoneum
mencit dengan menginjeksikan medium RPMI 1640 kedalam rongga
peritoneum mencit. Selanjutnya makrofag dikultur dalam medium komplit
(RPMI 1640, penicillin-streptomycin) dalam microplate 24 sumuran dasar
rata. Masing-masing sumuran berisikan makrofag dengan kepadatan
500.000 sel. Kemudian kultur makrofag tersebut dibagi menjadi lima
perlakuan. Kontrol negatif berupa kultur makrofag tanpa ekstrak propolis
dan tanpa virus ND. Kontrol positif berupa kultur makrofag tanpa ekstrak
propolis tapi diberi virus ND. Perlakuan 1 adalah pemberian ekstrak
propolis konsentrasi 25 µg/ml, perlakuan 2 konsentrasi 50 µg/ml, dan
perlakuan 3 konsentrasi 100 µg/ml.
Makrofag merupakan sel yang memiliki peran utama dalam proses
fagositosis atau penghancuran antigen. Propolis memiliki kandungan
flavonoid, tanin atau polifenol, dan saponin. Kandungan-kandungan dari
propolis tersebut mampu meningkatkan proliferasi dari makrofag sehingga
dapat meningkatkan jumlah makrofag. Selain itu propolis juga mampu
36
menstimulasi fagostosis. Menurut Tyastuti et al (2006), propolis dapat
meningkatkan persentase fagositosis makrofag pada ayam yang terkena
ND. Propolis juga dapat membersihkan polutan dan racun dalam tubuh,
sehingga metabolisme sel dapat berlangsung optimal (Prasetyo et al,
2013).
Berikut ini merupakan gambar makrofag yang diambil setelah
dilakukan proses kultur, sehingga makrofag masih dalam keadaan hidup :
Gambar 5.1 Gambaran Kultur Makrofag Keterangan : Gambaran kultur makrofag yang tidak diberi ekstrak propolis, A : Perbesaran 100x, B : Perbesaran 400x, C : Sel Makrofag, D : Eritrosit
Perbesaran 100x
Perbesaran 400x
A
B
C
D
37
Gambar 5.2 Gambar Kultur Makrofag Setelah Diberi Ekstrak Propolis Kemudian Diinkubasi Selama 24 Jam (Perbesaran 100x).
Keterangan: A: Ekstrak Propolis 25 µg/ml, B: Ekstrak Propolis 50 µg/ml, C: Ekstrak Propolis 100 µg/ml. D: Makrofag. Terjadi peningkatan proliferasi dan diferensiasi dari makrofag pada kultur makrofag yang diberi ekstrak propolis. Sehingga jumlah makrofag pada kultur yang diberi ekstrak propolis akan meningkat.
Percesaran 100x
Perbesaran 100x
Perbesaran 100x
A
B
C
D
D
D
38
Makrofag berukuran 10-30 mm, berbentuk bulat, permukaan
mengkilat, kompak serta besarnya sama. Makrofag merupakan sel yang
panjang umurnya dan dapat bertahan berbulan-bulan bila berada di dalam
jaringan (Effendi, 2003). Setelah diinkubasi selama 24 jam, makrofag
diberi ekstrak propolis dengan beberapa tingkat konsentrasi yang berbeda.
Kultur makrofag yang telah digolongkan menjadi 5 perlakuan kemudian
diinduksi virus Newcastle Disease 64 HAU. Virus ND ditanam dalam telur
ayam berembrio. Kemudian setelah embrio mati, dilakukan uji HA untuk
mengetahui titernya. Gambar hasil uji HA adalah sebagai berikut :
Gambar 5.3 Hasil Uji HA diperoleh 64 HAU
Dari Gambar 5.3dapat dilihat bahwa hasil uji HA diperoleh titer 2
pangkat 6 yang setara dengan 64 HAU. Selanjutnya dilakukan panen sel
makrofag untuk diketahui pengaruh pemberian ekstrak propolis sebagai
preventif terhadap virus ND melalui produksi kadar TNF- -6. Pada
penelitian secara in vivo, kadar TNF- -6 meningkat pada hari
ketiga.
39
5.1 Pengujian Pengaruh Ekstrak Propolis Terhadap Kadar TNF-
IL-6
Ada beberapa prasyarat parametrik yang harus terpenuhi sebelum
sebuah data dapat dianalisa menggunakan One Way ANOVA. Diantaranya
adalah uji normalitas (Saphiro-Wilk) dan homogenitas (Levene). Pengujian
asumsi normalaitas dan homogenitas untuk kadar TNF- -6 tidak
terpenuhi (Lampiran 12). Oleh karena itu proses pengujian dilakukan
secara non parametrik dengan Kruskal-Wallis yang dilanjutkan dengan uji
|Ri-Rj|. Pengujian tidak dilakukan dengan Mann-Whitney karena akan
muncul permasalahan mendasar berupa penolakan terhadap hipotesis nol
yang benar (Daniel, 1989).
5.1.1 Pengujian Pengaruh Ekstrak Propolis Terhadap Kadar TNF-
dengan Uji Kruskal-Wallis
Tumor Necrosis Factor Alpha dalam keadaan normal berperan
dalam proses apoptosis (Thomas, 2001). Hal inilah yang menyebabkan
TNF-
adalah mekanisme kematian sel terprogram yang penting dalam berbagai
proses biologi. Ketika terjadi inflamasi, makrofag akan bekerjadanakan
memacu produksi sitokin. Seperti yang tampak pada kontrol positif, kadar
dari TNF- Hasil penelitian menunjukkan
bahwa pemberian ekstrak propolis yang mengandung zat aktif berupa
flavonoid dan tanin memberikan efek antiinflamasi dan antioksidan yang
ditandai dengan adanya rata-rata penurunan persentase TNF- pada
40
konsentrasi 25 µg/ml, 50 µg/ml, dan 100 µg/ml.Berdasarkan rata-rata pada
perlakuan 1 dengan konsentrasi preventif25 µg/ml, perlakuan 2dengan
konsentrasi preventif50 µg/ml, danperlakuan 3 dengan konsentrasi
preventif100 µg/ml terjadi penurunan produksi TNF- makrofag.
Namun, rata-rata penurunan produksi TNF- (P2) lebih mendekati
nilai persentase kontrol negatif.
Rata-rata kadarTNF- kelompok kontrol dan perlakuan secara
lengkap ditunjukkan dalam histogram berikut :
Gambar 5.4 HistogramRata-Rata KadarTNF- Keterangan : K (-) adalah kontrol negatif (kultur makrofag tanpa preventif
dengan propolis dan tanpa induksi virus ND); K (+) adalah kontrol positif (kultur makrofag yang diinduksi virus ND); P (1) adalah perlakuan 1 (kultur makrofag dengan preventif propolis konsentrasi 25 µg/ml dan diinduksi virus ND); P (2) adalah perlakuan 2 (kultur makrofag dengan preventif propolis konsentrasi 50 µg/ml dan diinduksi virus ND); dan P (3) adalah perlakuan 3 (kultur makrofag dengan preventif propolis konsentrasi 100 µg/ml dan diinduksi virus ND).
41
Pada Gambar 5.4 ditunjukkan histogram rata-ratakadar TNF-
pada semua kelompok kontrol dan perlakuan. Dimulai dari kelompok K+,
terlihat bahwa rata-rata kadarTNF- menurun pada semua kelompok
perlakuan pemberian ekstrak propolis. Namun secara statistik, penurunan
tersebut tampak tidak signifikan.
Menurut data yang diperoleh, terdapat peningkatan produksi TNF-
secara signifikan (p
42
Semakin berat infeksi, TNF- yang diproduksi juga akan semakin besar.
Pada kadar rendah TNF-
menginduksi inflamasi akut. Pada kadar sedang, TNF-
inflamasi sistemik. Sedangkan pada kadar tinggi, TNF-
peradangan, penyembuhan luka, remodelling jaringan dan dapat
menginduksi syok septik dan cachexia. Semakin meningkat jumlah TNF-
akan memicu terjadinya reaksi inflamasi sistemik yang berat.Aktivitas
makrofag secara berlebihan dalam proses inflamasi dapat mengakibatkan
produksi sitokin meningkat (Popa et al, 2007).
Ekstrak propolis memiliki kandungan aktif seperti flavonoid,
tannin atau polifenol, dan saponin. Flavonoid merupakan antioksidan dan
antiinflamasi. Mekanisme hambatan yang dilakukan oleh flavonoid
sebagai antioksidan bisa terjadi secara langsung yaitu dengan
mendonorkan ion hidrogen sehingga ion-ion yang mengalami radikal
bebas berubah menjadi stabil. Keadaan ion yang telah stabil menyebabkan
menurunnya keadaan stres oksidatif. Flavonoid juga akan mengurangi
pelepasan dari peroksidase, yang menghambat produksi reactive oxygen
species (Rachmadian, 2011).
Mekanisme antiinflamasi saponin adalah dengan mencegah
kerusakan biomolekul akibat radikal bebas karena saponin mengandung
gugus antioksidan. Hal ini memungkinkan saponin untuk menekan
aktivitas superoksida melalui pembentukan intermediate hidroperoksida.
Selain flavonoid dan saponin, polifenol merupakan zat aktif dari ekstrak
43
propolis yang memiliki peran mengurangi inflamasi. Polifenol berperan
melindungi sel tubuh dari kerusakan akibat radikal bebas sehingga
mencegah proses inflamasi dan peradangan (Rachmadian, 2011). TNF-
akan meningkat saat makrofag teraktivasi. Penurunan kadar TNF- terjadi
melalui penekanan kompleks antigen-antibodi dalam mekanisme infiltrasi
sel inflamasi sehingga dapat menurunkan aktivitas radikal bebas dan
enzim Matrix Metalloproteinase (MMP) sehingga reaksi inflamasi dapat
menurun (Lehner, 2011).
Pengujian asumsi normalitas dan homogenitas untuk variabel
kadarTNF- tidak terpenuhi (lampiran 12). Oleh karena itu dilakukan
pengujian untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak propolis
terhadap kadarTNF-
Kruskal-Wallis. Berikut hasil pengujian pengaruh pemberian ekstrak
propolisdengan beberapa level konsentrasi terhadap kadar TNF- dengan
menggunakan uji Kruskal-Wallis.
Tabel 5.1 Pengujian Pengaruh Ekstrak Propolis Terhadap KadarTNF-
dengan Uji Kruskal-Wallisdan |Ri-Rj| 5%
Perlakuan Mean ± SD p-value
K- 49.83 ± 11.87 a
0.022 K+ 68.04 ± 0.65 b P1 67.76 ± 0.94 b P2 61.45 ± 6.33 ab P3 63.29 ± 6.09 ab
Keterangan: Pada rata-rata ±sd jika memuat notasi yang berbeda berarti ada perbedaan yangbermakna (p0.05).
44
Berdasarkan pada hasil analisis dengan menggunakan uji Kruskal-
Wallis, didapatkan p-value sebesar 0.022, lebih kecil daripada
(p
45
sd kelompok P2 dan P3 memuat notasi yang sama dengan kelompok
kontrol negatif.Hal ini mengandung pengertian bahwa pemberian ekstrak
propolisdengan konsentrasi 50 dan 100 µg/ml (P2 dan P3) mampu
menurunkan kadarTNF- ultur makrofag kondisi
normal. Sehingga dapat dikatakan bahwa ekstrak propolis mampu
berperan sebagai antioksidan tambahan dari luar yang berfungsi untuk
menyeimbangkan sel yang mengalami radikal bebas sehingga menjadi
stabil dan ROS dihasilkan lebih sedikit. Sedangkan pada kelompok
pemberian ekstrak propolisdengan konsentrasi 25 µg/ml berbeda
signifikan dengan kelompok kontrol negatif tapi memiliki notasi sama
dengan kontrol positif. Hal ini membuktikan bahwa pemberian ekstrak
propolis konsentrasi 25 µg/ml (P1) belum mampu menghasilkan kadar
TNF-
5.1.2Pengujian Pengaruh Ekstrak PropolisTerhadap Kadar IL-6 dengan
Uji Kruskal-Wallis
Makrofag memiliki kemampuan menghasilkan sekresi sel yang
dikenal dengan interleukin seperti TNF- -1, IL-4, dan IL-6. Sitokin
dihasilkan oleh sel dalam reaksi radang atau imunologik yang berfungsi
sebagai isyarat antara sel-sel untuk berkomunikasi dalam respon imun.
Sitokinproinflamasi IL-6 merupakan salah satu interleukin yang
memegang peranan sangat penting pada reaksi inflamasi. Selain itu IL-6
dapat meningkatkan respon antibodi terhadap patogen yang mempercepat
46
pelenyapan patogen yang dicerna oleh makrofag. IL-6 juga berperan dalam
proses apoptosis, sehingga IL-6 juga masih dihasilkan pada kontrol negatif
(Titus et al, 1991).
Semakin meningkat aktivitas patogen akan menyebabkan adanya
infiltrasi sel inflamasi yang mengakibatkan IL-6 juga meningkat seperti
yang terdapat pada kontrol positif. Peningkatan kadar IL-6 berkolerasi
dengan kerusakan sel dan inflamasi. Makrofag berperan sebagai salah satu
sel dalam sistem pertahanan tubuh melawan invasi virus dengan cara
fagositosis. Sitokin IL-6 ini dapat memediatori makrofag mensintesis
reaksi inflamasi untuk melindungi terhadap virus. Menurut pendapat Silva
et al (2007), sitokin merupakan sinyal penting yang dihasilkan oleh sel-sel
tubuh untuk mengaktifkan kerja sel lain, sehingga jenis dari sitokin yang
disekresikan oleh sel akan memberikan efek pada sel target. Sitokin dapat
beraksi secara autocrine yaitu mempengaruhi lingkungan pada sel yang
melepaskannya, paracrine yaitu berpengaruh terhadap sel lain di
sekitarnya, dan endocrine yaitu berpengaruh terhadap lingkungan sel
sekitarnya.
Secara statistik diperoleh hasil bahwa kelompok perlakuan P (2)
dengan konsentrasi 50 µg/ml memiliki perbedaan yang signifikan
dibandingkan kelompok kontrol positif (
47
sebagai antiinflamasi dan antioksidan.Flavonoid sebagai antioksidan
melindungi tubuh terhadap efek radikal bebas dengan cara mentransfer
sebuah elektron ke senyawa radikal bebas sehingga menjadi stabil dan sel
terlindungi dari adanya peroksidasi lipid.
Fungsi tanin atau polifenol sebagai antiinflamasi bekerja dengan
cara menghambat pelepasan mediator inflamasi sedangkan sebagai
antioksidan, tanin memiliki kemampuan dalam menghentikan reaksi rantai
radikal bebas secara efisien (Pazil, 2009).Mekanisme antiinflamasi
saponin yaitu dengan mencegah kerusakan biomolekul akibat radikal
bebas karena saponin mengandung gugus antioksidan. Hal ini
memungkinkan saponin untuk merusak superoksida melalui pembentukan
intermediate hidroperoksida (Fitriyani et al, 2011).
Pada Gambar 5.5ditunjukkan histogram rata-ratakadar IL-6semua
kelompok kontrol dan perlakuan. Dimulai dari kelompok K+, terlihat
bahwa rata-rata kadar IL-6menurun pada semua kelompok perlakuan
pemberian ekstrak Propolis. Secara statistik ditunjukkan bahwa pemberian
ekstrak propolis dengan konsentrasi 50 µg/ml (P2) dan 100 µg/ml (P3)
terbukti mampu menurunkan kadar IL-6 pada kultur makrofag yang
diinduksi virus ND secara signifikan.
48
Rata-rata kadar IL-6 kelompok kontrol dan perlakuan secara
lengkap ditunjukkan dalam histogram berikut :
Gambar 5.5HistogramRata-Rata Kadar IL-6 Keterangan : K (-) adalah kontrol negatif (kultur makrofag tanpa preventif
dengan propolis dan tanpa induksi virus ND); K (+) adalah kontrol positif (kultur makrofag yang diinduksi virus ND); P (1) adalah perlakuan 1 (kultur makrofag dengan preventif propolis konsentrasi 25 µg/ml dan diinduksi virus ND); P (2) adalah perlakuan 2 (kultur makrofag dengan preventif propolis konsentrasi 50 µg/ml dan diinduksi virus ND); dan P (3) adalah perlakuan 3 (kultur makrofag dengan preventif propolis konsentrasi 100 µg/ml dan diinduksi virus ND). Jumlah IL-6 pada kelompok perlakuan 2 (konsentrasi preventif 50
µg/ml)mengalami penurunan dibandingkan kelompok kontrol positif.
Kelompok P (2) yang diberi preventif ekstrak propolis dengan konsentrasi
50 µg/ml menunjukkan bahwa konsentrasi ini merupakan konsentrasi yang
paling baik untuk menurunkan produksi IL-6.
49
Berikut hasil pengujian pengaruh pemberian ekstrak
propolisdengan beberapa level konsentrasi terhadap kadar IL-6dengan
menggunakan uji Kruskal-Wallis.
Tabel 5.2 Pengujian Pengaruh Ekstrak Propolis Terhadap Kadar IL-6
dengan Uji Kruskal-Wallis dan |Ri-Rj| 5%
Perlakuan Mean ± SD p-value K- 42.38 ± 0.33 a
0.002 K+ 60.51 ± 7.35 c P1 54.34 ± 0.63 bc P2 50.3 ± 2.29 ab P3 51.18 ± 2.71 ab
Keterangan: Pada rata-rata ± sd jika memuat notasi yang berbeda berarti ada perbedaan yangbermakna (p0.05).
Berdasarkan pada hasil analisis dengan menggunakan uji Kruskal-
Wallis, didapatkan p-value sebesar 0.002, lebih kecil daripada
(p
50
Pada perbandingan antara kelompok kontrol positif (K+) dengan
perlakuan, ditunjukkan bahwa penurunan kadar IL-6 secara signifikan
ditunjukkan pada kelompok perlakuan pemberian ekstrak propolis
konsentrasi50 dan 100µg/ml (P2 dan P3).Hal ini ditunjukkan dari nilai
rata-rata ± sd kelompok perlakuan P2 dan P3 lebih rendah dan memuat
notasi yang berbeda jika dibandingkan dengan kelompok kontrol positif.
Pada perbandingan antara kelompok (K-) dengan perlakuan,
ditunjukkan bahwa pemberian ekstrak propolis konsentrasi50 µg/ml (P2)
dan 100 µg/ml (P3) mampu menurunkan kadar IL-6 hingga mendekati
kultur makrofag normal (K-). Hal ini ditunjukkan dari nilai rata-rata ± sd
kelompokperlakuantersebut memuat notasi yang sama dengan kelompok
kontrol negatif. Dapat diartikan bahwa pemberian ekstrak propolisdengan
konsentrasi 50 dan 100 µg/ml (P2 dan P3) mampu menurunkan kadarTNF-
dikatakan bahwa ekstrak propolis mampu berperan sebagai antioksidan
tambahan dari luar yang berfungsi untuk menyeimbangkan sel yang
menglami radikal bebas sehingga menjadi stabil dan ROS dihasilkan lebih
sedikit. Sedangkan pada kelompok pemberian ekstrak propolisdengan
konsentrasi 25 µg/ml berbeda signifikan dengan kelompok kontrol negatif
tapi memiliki notasi sama dengan kontrol positif. Hal ini membuktikan
bahwa pemberian ekstrak propolis konsentrasi 25 µg/ml (P1) belum
mampu menghasilkan kadar TNF- kultur makrofag kondisi
normal.
35
BAB 6
KESIMPULAN DAN SARAN
6.1 Kesimpulan Kesimpulan yang dapat diambil dari penelitian ini, yaitu :
1. Ekstrak propolis dapat digunakan sebagai tindakan preventif pada kultur
makrofag yang diinfeksi virus Newcastle Disease. Konsentrasi ekstrak
propolis 50 µg/ml merupakan perlakuan terbaik yang memiliki efek
paling besar untukmencegah peningkatan produksi kadar TNF- (Tumor
Necrosis Factor Alpha).
2. Ekstrak propolis dapat digunakan sebagai tindakan preventif pada kultur
makrofag yang diinfeksi virus Newcastle Disease. Konsentrasi ekstrak
propolis 50 µg/ml merupakan perlakuan terbaik yang memiliki efek
paling besar untukmencegah peningkatan produksi kadar IL-6 (Interleukin
6).
6.2 Saran 1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai variasi konsentrasi
ekstrak propolisuntuk mengetahui konsentrasi yang lebih efektif dalam
menurunkan kadar sitokin proinflamasi (TNF- -6).
2. Perlu adanya penelitian lebih lanjut terhadap pengaplikasian ekstrak
propolis untuk mengetahui efek klinis pada ayam sebagai preventif
terjadinya penyakit Newcastle Disease.
36
DAFTAR PUSTAKA
Abbas, A. K., Lichtman, A. H., and Pillai, S. 2010.Selular and Molecular Immunology, updated ed. 6 ed.Philadelphia. John E. Kennedy Blvd Ste 1800.
Abbas, A. K., Litchman, A. H. 2003. Chapter 12 Cytokines. Chapter 13 Effector
mechanism of cell-mediated immunity. Chapter 14 Effector mechanism of humoral immunity. In:Celluler and molecular Immunology. 21 ed. Philadelphia.
Adi, A. M., Astawa, N. M., Putra, K. S. A., Hayashi, Y. Matsumoto, Y. 2010.
Isolation and Characterization of a Pathogenis Newcastle Disease Virus From a Natural Case In Indonesia. J Vet Med Sci. 72 : 313-319.
Akrom, 2013. Mekanisme Kemopreventif MBJH pada Tikus Sprague dawley (SD)
yang Diinduksi 7,12 Dimethylbenza(a) Antracene (DMBA). Disertasi : Jogjakarta : Pasca Sarjana UGM.
Bouzari, M. and Spardbrow, P. 2006. Early Events Following Oral
Administration of Newcastle Disease Virus Strain V4. Journal Poult. Sci. 43 : 408-414.
Baratawidjaja, K. G. 2013. Imunologi Dasar. Edisi ke-10.Jakarta : FKUI. Brown, C., King, D. J., and Seal, B. S. 1999. Pathogenesis of Newcastle Disease
in Chickens experimentally Infected With Virusesof Different Virulence. Vet. Pathol. 36 : 125-132.
Chang, A. and Dutch, R. E. 2012. Paramyxovirus Fusion and Entry: Multiple
Paths to a Common End. USA : University of Kentucky. Courtney, S.C., Susta, L., Gomez, D., Hines, N., Pearson, J.E., Brown, C.C.,
Miller, P.J., Afonso, C.L., 2013. Highly divergent virulent isolates of Newcastle disease virus from the Dominican Republic are members of a new genotype that may have evolved unnoticed for over two decades. J. Clin. Microbiol. 51, 508 517.
Daniel., W., W. 1989. Statistika Nonparametrik Terapan. Georgia State
University. Jakarta : PT Gramedia. Edewor, T. I. 2016. A Review : Immunological Potential of Bioactive Flavonoids
And Flavonoids Containing Fractions Isolated From Medical Plants. Cibtech Journal of Bio-Protocol ISSN : 2319-3840 Vol. 5 (2). Ogbomoso : Ladoke Akintola University Of Technology.
37
Effendi, Z. 2003. Daya Fagositosis Makrofag Pada Jaringan Longgar Tubuh. Medan : Bagian Histologi FKUSU.
Ferdous, F., Maurice, D. & Scott, T. 2008. Broiler chick thrombocyte response to
lipopolysaccharide. Poultry Science, 87, 61_63. Ferreira, L., Villar, E. and Munoz-Barroso, I. 2004. Gangliosides and N-
glycoproteins function as Newcastle Disease Virus Reseptors. Int. J. Biochem. Cell Biol. 36 : 2344-2356.
Fitriyani, A., L. Winarti, S. Muslichah, dan Nuri. 2011. Uji Antiinflamasi Ekstrak
Metanol Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) pada Tikus Putih. Majalah Obat Tradisional, 16 (1), 34-42.
Hansson, G. K. 2011. Immune Mechanism in Artherosclerosis, Artherosclerosis,
Thrombosis, and Vascular Biology. 21:1876. Hardyanto, J., Pratiwi, T., Winarso, D. 2013. Efek Perasan Daun dan Tangkai
Semanggi Air (Marsilea Crenata) Terhadap Penurunan Kadar Tumor Necrosis Alpha Dan Interleukin 1 Beta Pada Tikus Putih (Rattus norvegicus) Urolithiasis. Malang : Program Kedokteran Hewan Universitas Brawijaya.
Harmita dan Maksum, R. 2008. Buku Ajar Analisis Hayati. Edisi Ketiga. Jakarta:
ECG pp: 63-67. Hayter, R. B. and Besch, E. L. 1974. Airborn Particle Deposition in the
Respiratory Tract of Chickens. Poult. Sci. 53, 1507-1511. Herawati, I., Husin, U. A., Sudigdoadi, S. 2015. Pengaruh Ekstrak Etanol
Propolis Terhadap Aktivitas & Kapasitas Fagositosis Pada Kultur Makrofag Yang Diinfeksi Enteropathogenic Escherichia Coli (EPEC). MKB Vol. 47 No. 2. Bandung : FK UNPAD.
Hoss, A., Zwarthoff, E. C., Zawatzky, R. 1989. Differential Expression of
Interferon Alpha and Bata Induced with Newcastle Disease Virus in Mouse Machrophage Cultures. J. gen Virol, 70. 575-589. Heidelberg : Institute of Virus Reseach.
Iorio RM, Syddall RJ, Sheehan JP, Bratt MA, Glickman RL, dan Riel AM. 2009.
Neutralization Map of the Hemagglutinin-Neuraminidase Glycoprotein of Newcastle Disease Virus: Domains Recognized by Monoclonal Antibodies That Prevent Receptor Recognition. Journal of Virology. 65(9): 4999-5006.
38
Institute of Laboratory Animal Resources Commision an Life Science. 2010. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Eight Edition. Washington: The National Academies Press.
Ishartadiati, K. 2008. Peranan TNF, Il-1, dan IL-6 Pada Respon Imun Terhadap
Protozoa. Surabaya : Fakultas Kedokteran Universitas Wijaya Kusuma Surabaya.
Jaya, F., Radiati, L. E., Awwaly, K. U., Kalsum, U. 2008. Pengaruh Pemberian
Ekstrak Propolis Terhadap Sistem Kekebalan Seluler Pada Tikus Putih (Rattus norvegicus) Strain Wistar. Malan