Upload
dodang
View
251
Download
5
Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERSITAS INDONESIA
Kajian Aktivitas Antioksidan, Modulasi Sitokin TNF- dan TGF-β1oleh Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa) pada Pencegahan Fibrosis Hati
pada Tikus yang diinduksi Karbon Tetraklorida
TESIS
NANIK SUNDARINPM: 1206330495
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS INDONESIAPROGRAM MAGISTER ILMU BIOMEDIK
KEKHUSUSAN FARMAKOLOGIJAKARTAJUNI 2014
UNIVERSITAS INDONESIA
Kajian Aktivitas Antioksidan, Modulasi Sitokin TNF- dan TGF-β1oleh Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa) pada Pencegahan Fibrosis Hati
pada Tikus yang diinduksi Karbon Tetraklorida
TESIS
Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelarMagister dalam Ilmu Biomedik
NANIK SUNDARINPM: 1206330495
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS INDONESIAPROGRAM MAGISTER ILMU BIOMEDIK
KEKHUSUSAN FARMAKOLOGIJAKARTAJUNI 2014
iiUniversitas Indonesia
iiiUniversitas Indonesia
ivUniversitas Indonesia
KATA PENGANTAR
Alhamdulillahi Rabbil ‘Alamin, segala puji dan syukur penulis panjatkan
kepada Allah SWT yang telah memberikan rahmat, hidayah, karunia, dan
pertolongan-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis dengan judul “Kajian
aktivitas antioksidan, modulasi sitokin TNF- dan TGF-β1 oleh mahkota dewa
(Phaleria macrocarpa) pada pencegahan fibrosis hati pada tikus yang diinduksi
karbon tetraklorida”. Tesis ini disusun dalam rangka memenuhi persyaratan untuk
memperoleh gelar Master Biomedik dari Program Magister Ilmu Biomedik Fakultas
Kedokteran Universitas Indonesia.
Dalam kesempatan ini, penulis mengucapkan terima kasih dan penghargaan
yang sebesar-besarnya kepada dr. Vivian Soetikno, PhD., Sp.FK selaku pembimbing I
dan Dr. Melva Louisa, SSi., Apt., M.Biomed. selaku pembimbing II dan ketua
akademis yang telah meluangkan waktunya untuk memberikan bimbingan, arahan,
kritik, saran, dukungan dan motivasi kepada penulis sehingga penelitian dan
penyusunan tesis ini dapat diselesaikan. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan
kepada dr. Nafrialdy, PhD., Sp.PD., Sp.FK., Prof. Dr. dr. Sri Widia A. Jusman, MS.,
dan Prof. Dr. dr. Erni Hernawati Purwaningsih, MS. selaku penyanggah yang telah
berkenan memeriksa dan memberikan saran untuk penyempurnaan penulisan tesis ini.
Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Dr. Wawaimuli Arozal,
M.Biomed., Ph.D selaku ketua Departemen Farmakologi dan Terapeutik Fakultas
Kedokteran Universitas Indonesia, serta seluruh staf pengajar dan staf administrasi
dalam departemen tersebut, atas dukungannya selama penulis mengerjakan penelitian
ini. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Bapak Raymond R.
Tjandrawinata, Ph.D yang telah memberikan kesempatan dan mendanai penelitian ini.
Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada dr. H. Ahmad Aulia Jusuf, AHK,
PhD dan dr. Vetnizah Juniantito, PhD yang telah menyediakan waktu dan tenaga
untuk memberikan bantuan, bimbingan dan saran kepada penulis untuk menilai
sediaan histologi.
Dalam melaksanakan penelitian ini, peneliti dibantu oleh para laboran di
Laboratorium Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Oleh karena
itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Arif Supriyadi, Bapak Dede,
Bapak Rukmana, Bapak Kanto, Saudari Chiswita Chaliana, Saudari Tya dan Mas
vUniversitas Indonesia
Nasip atas bantuannya dan waktu yang diluangkan untuk membantu dalam
pelaksanaan penelitian ini.
Ucapan terima kasih, penulis sampaikan kepada Prof. Dra. Arini Setiawati,
PhD, Ibu Dra. Lucky S. Slamet, MSc., Ibu Dra. Endang Woro T., MSc, Ibu Dra.
Nurma Hidayati, MEpid, Ibu Dra. Ratna Irawati, MKes., Ibu Dra. Ega Febrina, Ibu
Dra. Lela Amelia, MEpid., Ibu Dra. Herawati, M.Biomed., Ibu Juliati SSi. Apt.
M.Biomed., Ibu Ade Irma Haryani, SSi., Apt., dan temana-teman di Kasubdit
Penilaian Obat Baru Badan POM atas kesempatan dan dukungan yang telah diberikan
kepada penulis untuk mengikuti Program Magister Ilmu Biomedik.
Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan untuk kedua orangtuaku
tersayang yang telah mendoakan, mendidik, mendorong dan mendukung penulis
untuk selalu jujur, berdoa, belajar dan bekerja dengan sebaik-baiknya sehingga tesis
ini dapat diselesaikan. Terima kasih juga kepada adikku, Budi dan Puput, Lek
Hardiyo sekeluarga dan Lek Harni sekeluarga atas dukungan selama ini.
Terima kasih kepada teman mahasiswa di Program Studi Ilmu Biomedik,
khususnya teman-teman di kekhususan Farmakologi, Bantari dan Nurfitri atas
motivasi dan dukungan moral yang telah diberikan kepada penulis.
Penulis menyadari bahwa masih terdapat kekurangan pada tesis ini. Harapan
penulis, tesis ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan pada
umumnya dan farmakologi pada khususnya.
Jakarta, Juni 2014
Nanik Sundari
viUniversitas Indonesia
viiUniversitas Indonesia
ABSTRAK
Nama : Nanik SundariProgram Studi : Ilmu BiomedikJudul : Kajian aktivitas antioksidan, modulasi sitokin TNF- dan
TGF-β1 oleh mahkota dewa (Phaleria macrocarpa) padapencegahan fibrosis hati pada tikus yang diinduksi karbontetraklorida
Latar belakang: Mahkota dewa (Phaleria macrocarpa) merupakan salah satutanaman herbal di Indonesia dan ekstrak air buah mahkota dewa telah terbuktimemiliki efek hepatoprotektif. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitasdan mekanisme kerja ekstrak air buah mahkota dewa dalam mencegah terjadinyafibrosis hati.Metode: Penelitian dilakukan pada tikus Sprague-Dawley jantan yang diinduksikarbon tetraklorida (CCl4) secara intraperitoneal setiap 3 hari sekali selama 8 minggu.Hewan coba dibagi menjadi 6 kelompok: normal, CCl4, n-Acetyl cysteine (NAC)dosis 150 mg/kgBB, ekstrak air buah mahkota dewa dosis 50, 100 dan 150 mg/kgBB.Penilaian dilakukan terhadap parameter aspartat aminotransferase (AST), alaninaminotransferase (ALT), alkali fosfatase (ALP), histopatologi hati, kadarmalondialdehid (MDA), rasio GSH/GSSG, kadar Tumor Necrosis Factor (TNF)-αdan kadar Transforming Growth Factor (TGF)-β1Hasil: Hasil studi menunjukkan bahwa ekstrak air buah mahkota dewa dan NACsecara bermakna dapat melindungi hati dari cedera melalui penurunan aktivitas enzimALT, AST, ALP dan penurunan persentase jaringan ikat pada pemeriksaanhistopatologi. Ekstrak air buah mahkota dewa dan NAC dapat menghambat stressoksidatif melalui penurunan kadar MDA hati dan peningkatan rasio GSH/GSSG hati.Ekstrak air buah mahkota dewa dan NAC dapat menekan inflamasi melaluipenurunan kadar TNF-α dan menghambat aktivasi sel stelata hati (HSC) yangditandai dengan penurunan kadar TGF-β1.Kesimpulan: Ekstrak air buah mahkota dewa dapat mencegah fibrosis hati pada tikusyang diinduksi CCl4. Pencegahan terhadap fibrosis tersebut terutama melalui aktivitasantioksidan dan kemampuan menekan sitokin inflamasi TNF-α, serta menghambataktivasi HSC melalui penurunan sitokin fibrogenik TGF-β1.
Kata kunci: CCl4, fibrosis, mahkota dewa, TNF-α, TGF-β1.
viiiUniversitas Indonesia
ABSTRACT
Name : Nanik SundariStudy Program : Biomedical ScienceTitle : Antioxidant, TNF- α and TGF-β1 modulating properties of
Mahkota dewa (Phaleria macrocarpa) on the prevention ofcarbon-tetrachloride induced liver fibrosis in rats
Introduction: Mahkota dewa (Phaleria macrocarpa) is one of the Indonesian herbalplants. Hepatoprotective effect of aqueous extract of mahkota dewa fruits have beenstudied previously. This study was conducted to evaluate the activity of water extractof mahkota dewa in the prevention of liver fibrosis and its mechanism of action.Method: Male Sprague-Dawley rats were induced by carbon tertrachloride (CCl4)given every 3 days by intraperitoneal injection for 8 weeks. Rats were randomlyallocated into 6 groups: control group, n-acetyl cysteine/NAC (150 mg/kgBB),aqueous extract of mahkota dewa (50, 100 and 150 mg/kgBB). Aspartateaminotransaminase (AST), alanine aminotransferase (ALT), alkaline phosphatase(ALP), liver histopathology, malondialdehyde (MDA), ratio GSH/GSSG, TumorNecrosis Factor (TNF)-α and Transforming Growth Factor (TGF)-β1 wereexamined.Results: This study demonstrates that aqueous extract of mahkota dewa and NACsignificantly protects the liver from injury by reducing the activity of AST, ALT,ALP and by reducing fibrosis percentage in histopatological examination. Aqueousextract of mahkota dewa and NAC attenuates oxidative stress by reducing the levelsof MDA and increasing GSH/GSSG ratio. Aqueous extract of mahkota dewa andNAC suppresses inflammation by reducing the levels of TNF- α and inhibits hepaticstellate cells (HSC) activation by reducing the levels of TGF-β1.Conclusions: Aqueous extract of mahkota dewa prevents CCl4-induced fibrosis inrats. The prevention of liver fibrosis most possibly through its antioxidant activities,suppression of inflammatory cytokines TNF-α and inhibition of HSC activation byreducing fibrogenic cytokines TGF-β1.
Key words: CCl4, fibrosis, mahkota dewa, TNF-α, TGF-β1.
ixUniversitas Indonesia
DAFTAR ISI
HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ...........................................HALAMAN PENGESAHAN ...................................................................... ...KATA PENGANTAR .................................................................................. ...LEMBAR PERSETUJUAN PUBLIKASI ILMIAH .................................... ...ABSTRAK ........................................................................................................ABSTRACT .....................................................................................................DAFTAR ISI ...................................................................................................DAFTAR GAMBAR .......................................................................................DAFTAR TABEL ............................................................................................DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................DAFTAR SINGKATAN ..................................................................................
BAB 1. PENDAHULUAN ...........................................................................1.1. Latar Belakang……………………………………………………..1.2. Rumusan Masalah ............................................................................1.3. Tujuan Penelitian .............................................................................
1.3.1. Tujuan Umum ......................................................................1.3.2. Tujuan Khusus ..................................................................
1.4. Hipotesis Penelitian………………………………………………1.5. Manfaat Penelitian ...........................................................................
BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA .................................................................2.1. Hati ...................................................................................................
2.1.1. Fisiologi dan anatomi hati ....................................................2.1.2. Fungsi dan tipe sel hati..........................................................
2.2. Fibrosis Hati.....................................................................................2.2.1. Etiologi Fibrosis Hati...........................................................2.2.2. Patogenesis fibrosis hati........................................................2.2.3. Karbon tetraklorida sebagai model fibrosis hati in
vivo........................................................................................2.3. Strategi Antifibrosis..........................................................................
2.3.1. Reduksi inflamasi hati...........................................................2.3.2. Reduksi stress oksidatif.........................................................2.3.3. Modulasi produksi dan/atau aktivitas sitokin.......................
2.4. Mahkota Dewa...................................................................................2.4.1. Ekstrak air buah Mahkota dewa………………………...…2.4.2. Studi in vitro ekstrak air buah mahkota dewa…………….2.4.3. Studi in vivo ekstrak air buah mahkota dewa……………..2.4.4. Data toksisitas ekstrak air buah mahkota dewa…………..
2.5. Kerangka Teori……………………………………………………...2.6. Kerangka Konsep……………………………………………………
iiiiiivvi
viiviii
ixxii
xiiixivxv
11344444
557799
10
1314
15
15
1616171718182021
xUniversitas Indonesia
BAB 3. METODE PENELITIAN ..............................................................3.1. Disain Penelitian ……..................................................................3.2. Lokasi dan Waktu Penelitian………………………………………3.3. Hewan Coba… .................................................................................3.4. Etika Penelitian…………………………………………………….3.5. Obat Uji……………………...…………………………………….3.6. Bahan dan Alat..................................................................................3.7. Prosedur Penelitian ..........................................................................3.8. Pemeriksaan Kadar Protein Homogenat Hati................................
3.8.1. Prinsip…………………………………….......................3.8.2. Prosedur ..............................................................................
3.9. Penetapan Aktivitas ALT dan AST...................................................3.9.1. Prinsip…………………………………………………3.9.2. Prosedur ..............................................................................
3.10. Penetapan Aktivitas ALP…………………………………………3.10.1. Prinsip…………………………………………………….3.10.2. Prosedur…………………………………………………..
3.11. Pemeriksaan Histopatologi Hati…………………………………….3.12. Penetapan Kadar MDA……………………………………………
3.12.1. Prinsip…………………………………………………….3.12.2. Prosedur pembuatan homogenat hati……………………..3.12.3. Prosedur…………………………………………………..
3.13. Penetapan Rasio GSH/GSSG………………………………………3.13.1. Prinsip……………………………………………………3.13.2. Prosedur pembuatan homogenat hati……………………..3.13.3. Prosedur pemeriksaan rasio GSH/GSSG..………………..
3.14. Penetapan Kadar TNF-α…………………………………………..3.14.1. Prinsip…………………………………………………….3.14.2. Prosedur pembuatan homogenat hati pemeriksaan TNF-α…3.14.3. Prosedur pemeriksaan TNF-α ……………………………..
3.15. Penetapan Kadar TGF-β1…………………………………………..3.15.1. Prinsip…………………………………………………….3.15.2. Prosedur pembuatan homogenat hati pemeriksaan TGF-β1..3.15.3. Prosedur pemeriksaan TGF-β1……………………………..
3.16. Analisis Statistik…………………………………………………..
BAB 4. HASIL PENELITIAN ...................................................................4.1. Berat Badan Tikus…………………………………………………..4.2. Kadar Protein Homogenat Hati…………………………………….4.3. Aktivitas ALT, AST dan ALP……………………………………..4.4. Histopatologi Hati…………………………………………………..4.5. Kadar MDA Homogenat Hati……………………………….………4.6. Rasio GSH/GSSG Homogenat Hati………………………………
22
22
222222222225282828282829303030303333333334343535363637373838383940
41414242444748
xiUniversitas Indonesia
4.7. Kadar TNF-α Homogenat Hati……………………………………4.8. Kadar TGF-β1 Homogenat Hati…………………………………….
BAB 5. PEMBAHASAN .............................................................................
BAB 6. KESIMPULAN DAN SARAN ........................................................6.1. Kesimpulan ........................................................................................6.2. Saran ...................................................................................................
DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................LAMPIRAN .....................................................................................................DRAFT ARTIKEL ...........................................................................................BIODATA PENULIS .......................................................................................
4950
51
606060
616698
108
xiiUniversitas Indonesia
DAFTAR GAMBAR
Gambar 2.1. Anatomi hati 5
Gambar 2.2. Gambaran mikroskopik hati 6
Gambar 2.3. Dua model anatomi mikroskopik, lobular dan asinus 6
Gambar 2.4. Asinus hati terbagi menjadi 3 zona 7
Gambar 2.5. Mikroanatomi sel hati 9
Gambar 2.6. Perubahan pada arsitektur hati 11
Gambar 2.7. Stres oksidatif dan kerusakan hepatosit 12
Gambar 2.8. Patogenesis molekuler fibrosis hati 13
Gambar 3.1. Kerangka kerja penelitian 27
Gambar 3.2. Cara pemilihan lapang pandang preparat hati 32
Gambar 3.3. Prinsip pemeriksaan total glutation 34
Gambar 4.1. Perubahan berat badan tikus selama 8 minggu perlakuan 41
Gambar 4.2. Pengaruh CCl4, NAC dan ekstrak air buah mahkota dewaterhadap aktivitas enzim ALT plasma setelah 8 mingguperlakuan
43
Gambar 4.3. Pengaruh CCl4, NAC dan ekstrak air buah mahkota dewaterhadap aktivitas enzim AST plasma setelah 8 mingguperlakuan
43
Gambar 4.4. Pengaruh CCl4, NAC dan ekstrak air buah mahkota dewaterhadap aktivitas enzim ALP plasma setelah 8 mingguperlakuan
44
Gambar 4.5. Pengaruh CCl4, NAC dan ekstrak air buah mahkota dewaterhadap persentase jaringan ikat hati setelah 8 mingguperlakuan
45
Gambar 4.6. Gambaran histopatologi fibrosis hati setelah 8 mingguperlakuan dengan pewarnaan Masson’s trichrome
46
Gambar 4.7. Pengaruh CCl4, NAC dan ekstrak air buah mahkota dewaterhadap kadar MDA hati setelah 8 minggu perlakuan
47
Gambar 4.8. Pengaruh CCl4, NAC dan ekstrak air buah mahkota dewaterhadap rasio GSH/GSSG hati setelah 8 mingguperlakuan
48
Gambar 4.9. Pengaruh CCl4, NAC dan ekstrak air buah mahkota dewaterhadap kadar TNF-α hati setelah 8 minggu perlakuan
49
Gambar 4.10. Pengaruh CCl4, NAC dan ekstrak air buah mahkota dewaterhadap kadar TGF-β1 hati setelah 8 minggu perlakuan
50
xiiiUniversitas Indonesia
DAFTAR TABEL
Tabel 1. Faktor genetik dan nongenetik yang berhubungan denganprogresi fibrosis pada berbagai jenis penyakit hati kronik
10
Tabel 2. Pembagian kelompok tikus dan perlakuan 26
Tabel 3. Perubahan berat badan dan persentase kematian hewan coba 42
xivUniversitas Indonesia
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Keterangan Lolos Kaji Etik 66
Lampiran 2. Sertifikat Analisis Ekstrak Air Buah Mahkota Dewa(Proliverenol)
67
Lampiran 3. Perhitungan Parameter Biokimia 68
Lampiran 4. Berat Badan Tikus 77
Lampiran 5. Data Kadar Protein Homogenat Hati 79
Lampiran 6. Data dan Hasil Analisis Statistik Aktivitas ALT 81
Lampiran 7. Data dan Hasil Analisis Statistik Aktivitas AST 83
Lampiran 8. Data dan Hasil Analisis Statistik Aktivitas ALP 85
Lampiran 9. Data dan Hasil Analisis Statistik Persentase Jaringan Ikat 87
Lampiran 10. Data dan Hasil Analisis Statistik Kadar MDA Hati 89
Lampiran 11. Data dan Hasil Analisis Statistik Rasio GSH/GSSG Hati 91
Lampiran 12. Data dan Hasil Analisis Statistik Kadar TNF-α Hati 94
Lampiran 13. Data dan Hasil Analisis Statistik Kadar TGF-β1 Hati 96
xvUniversitas Indonesia
DAFTAR SINGKATAN
1. ALT Alanine aminotransferase
2. AST Aspartate aminotransferase
3. ALP Alkaline phosphatase
4. CCl4 Carbon tetrachloride
5. ECM Extracellular matrix
6. GGT γ-globulin transferase
7. HSC Hepatic stellate cells
8. HGF Hepatic growth factor
9. IL Interleukine
10. IFN-γ Interferon-γ
11. MMP Matrix of metalloproteinase
12. NAC N-acetyl cysteine
13. NADPH Nicotinamude adenie dinucleotide phosphatase
14. NAFLD Non alcoholic fatty liver disease
15. NASH Non alcoholic steatohepatitis
16. PDGF Platelet-derived growth factor
17. ROS Reactive oxygen species
18. TIMP tissue inhibitor of metalloproteinase
19. TNF-α Tumor necrosis factor-α
20. TGF-β Transforming growth factor-β
1
BAB 1
PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Fibrosis hati dapat timbul pada berbagai penyakit hati kronis yang dapat
disebabkan oleh infeksi virus hepatitis, penyalahgunaan alkohol, penyakit perlemakan
hati non alkoholik, penyakit autoimun, stasis empedu kronis, gangguan metabolisme,
cacat genetik atau hipoksia.1,2,3 Fibrosis hati ditandai dengan akumulasi berlebih
protein matriks ekstraseluler termasuk kolagen atau jaringan parut yang terjadi setelah
berbagai penyakit hati yang kronis.1,2,4
Aktivasi sel stelata hati merupakan hal utama pada fibrosis hati. Pada hati
normal, sel tersebut terletak di space of disse dan berfungsi sebagai tempat utama
penyimpanan vitamin A dalam tubuh. Bila hati mengalami cedera kronis, sel stelata
hati teraktivasi dan berdiferensiasi menjadi sel seperti miofibroblas. Proses aktivasi
sel stelata hati adalah proses yang kompleks dan diperantarai oleh sitokin inflamasi
dan fibrogenik, diantaranya Tumor Necrosis Factor (TNF)-α dan Transforming
Growth Factor (TGF)-β.2,5 Fibrosis hati dapat berkembang lebih lanjut menjadi
sirosis yang ireversibel, gagal hati, hipertensi portal dan berkaitan dengan timbulnya
kanker hati. Sekitar 10-20% pasien mengalami progresivitas menjadi sirosis dan
kanker hati. Pada sebagian besar pasien, progresi fibrosis menjadi sirosis terjadi
dalam interval waktu 15 hingga 20 tahun.4
Karbon tetraklorida (CCl4) adalah hepatotoksin yang telah lazim digunakan
pada hewan coba sebagai penginduksi kerusakan hati termasuk fibrosis.6,7 CCl4
mengalami biotransformasi di hati menghasilkan radikal bebas sehingga
menyebabkan peroksidasi lipid membran. Radikal bebas dan peroksidasi lipid
memegang peran penting dalam patogenesis berbagai penyakit hati termasuk fibrosis.6
Obat yang digunakan sebagai standar terapi untuk fibrosis hati belum ada
sampai saat ini, meskipun telah dilakukan penelitian terhadap beberapa antioksidan
yang berpotensi sebagai antifibrosis. Antioksidan dapat mengurangi reactive oxygen
species (ROS) sehingga menghambat aktivasi sel stelata dan melindungi hepatosit
dari apoptosis. N-acetylcysteine (NAC) adalah satu satu obat yang memiliki aktivitas
antioksidan, dan beberapa penelitian telah membuktikan potensi antifibrosis NAC.
Narasimhanaidu dkk8 membuktikan bahwa potensi antioksidan NAC berperan dalam
memberikan efek hepatoprotektif pada tikus yang diinduksi CCl4 melalui peningkatan
2
Universitas Indonesia
kadar glutation dan aktivitas glutation peroksidase serta penurunan peroksidasi lipid.
Studi lain yang dilakukan oleh Demiroren dkk9 membuktikan bahwa NAC dapat
mencegah fibrosis hati pada tikus yang diinduksi CCl4 melalui peningkatan kadar
glutation dan penurunan level TNF-α serta interleukin (IL)-6. Studi klinik yang
dilakukan oleh Khoshbaten dkk10 menunjukkan bahwa NAC berperan dalam
memperbaiki fungsi hati pada pasien perlemakan hati non alkoholik.
Pengobatan dengan prinsip kembali ke alam berkembang dengan cukup pesat
di dunia termasuk Indonesia. Saat ini telah banyak dilakukan penelitian terkait terapi
antifibrosis dengan menggunakan bahan alam. Studi yang dilakukan di Cina oleh
Wang dkk4 menunjukkan bahwa aktivitas antioksidan Saururus chinensis berkaitan
dengan aktivitas mencegah fibrosis hati pada tikus yang diinduksi CCl4. Studi lain
yang dilakukan Cháved E dkk5 menunjukkan bahwa resveratrol, senyawa phytoalexin
yang terdapat di anggur dan kacang, memiliki efek mencegah fibrosis hati melalui
penurunan aktivitas NF-κB dan sitokin profibrogenik TGF-β pada tikus yang
diinduksi CCl4.
Mahkota dewa (Phaleria macrocarpa) merupakan tanaman asli Indonesia
yang berasal dari Papua dan digunakan sebagai tanaman obat. Di Jawa Barat, tanaman
ini disebut buah simalakama, di Jawa disebut Makutodewo.11,12 Mahkota dewa
tergolong tanaman perdu yang tumbuh di dataran rendah hingga ketinggian 1200
meter di atas permukaan air laut. Buah mahkota dewa berwarna merah marun dan
berbentuk bulat dengan ukuran yang bervariasi dari sebesar bola pingpong sampai
sebesar apel dengan ketebalan kulit 0.1-0.5 mm.13
Secara empiris, sebagian masyarakat telah menggunakan mahkota dewa untuk
alergi, jerawat, penyakit hati dan jantung, kanker, diabetes melitus, tekanan darah
tinggi, stroke, migrain, wasir dan penyakit lainnya.13,14 Manfaat yang menguntungkan
tersebut disebabkan kandungan kimia dari tanaman mahkota dewa seperti alkaloid,
flavonoid, saponin, tanin dan sebagainya yang memberikan efek antiinflamasi,
antioksidan, antikanker, antihipoglikemik, antihipertensi, dan hepatoprotektif.15-21
Secara umum, proses isolasi senyawa kimia yang terkandung dalam tanaman
termasuk mahkota dewa dilakukan menggunakan pelarut organik yang bersifat toksik
dan dapat membahayakan kesehatan manusia seperti metanol, etanol dan n-heksan.
Saat ini telah dikembangkan proses ekstraksi menggunakan subcritical water pada
suhu dan tekanan tertentu. Kim dkk14 telah berhasil melakukan proses ekstraksi buah
makhota dewa menggunakan pelarut air pada suhu 100°C dan tekanan 30 bar selama
3
Universitas Indonesia
5 jam. Ekstrak air buah mahkota dewa (Proliverenol) tersebut diketahui mengandung
mangiferin sebesar 21.7 mg/g, yang setara dengan ekstrak metanol (25.0 mg/g) dan
lebih besar dari ekstrak etanol (13.2 mg/g).14
Ekstrak air buah mahkota dewa tersebut telah diuji secara in vitro maupun in
vivo. Hasil studi pendahuluan secara in vitro yang dilakukan oleh Berlian dkk22
menunjukkan bahwa efek hepatoprotektif ekstrak air buah mahkota dewa terjadi
melalui down-regulation NFkB-TNF-α-lipid peroksidasi dengan hasil akhir
meningkatnya waktu hidup sel. Studi lain secara in vivo pada tikus yang diinduksi
etanol selama 4 minggu menunjukkan bahwa ekstrak air buah mahkota dewa dengan
dosis 37,5; 50 dan 75 mg/kgBB dapat menurunkan level aspartat aminotransferase
(AST), alanin aminotransferase (ALT), total bilirubin dan γ-globulin transferase
(GGT).23
Berdasarkan hasil pendahuluan tersebut di atas, ekstrak air buah mahkota
dewa diketahui mempunyai aktivitas hepatoprotektif. Namun, untuk mengetahui
apakah ekstrak air buah mahkota dewa dapat digunakan untuk mencegah fibrosis hati
serta mekanisme kerja yang mendasari hal tersebut diperlukan studi lebih lanjut. Hal
ini didasarkan pada upaya untuk mencegah terjadinya fibrosis hati sedini mungkin.
1.2. Rumusan Masalah
Fibrosis hati dapat terjadi akibat berbagai penyakit hati kronis, dan jika tidak
ditangani sedini mungkin dapat berkembang lebih lanjut menjadi sirosis yang
ireversibel dan timbulnya kanker hati. Obat yang digunakan sebagai standar terapi
untuk fibrosis hati belum ada sampai saat ini. Mahkota dewa merupakan salah satu
tanaman herbal asli Indonesia dan ekstrak air buah mahkota dewa telah terbukti
memiliki efek hepatoprotektif melalui down-regulation NFkB-TNF-α-lipid
peroksidasi. Akan tetapi sampai saat ini belum ada penelitian yang membuktikan
apakah ekstrak air buah mahkota dewa dapat mencegah terjadinya fibrosis hati yang
diinduksi CCl4, terutama melalui mekanisme antioksidan, penghambatan sitokin
inflamasi (TNF-α) dan penghambatan sitokin fibrogenik (TGF-ß).
4
Universitas Indonesia
1.3. Tujuan Penelitian
1.3.1. Tujuan Umum
Menilai aktivitas ekstrak air buah mahkota dewa dalam mencegah fibrosis hati
pada tikus.
1.3.2. Tujuan Khusus
1. Menganalisis aktivitas ekstrak air buah mahkota dewa sebagai pencegah
fibrosis hati melalui pemeriksaan penanda fungsi hati yaitu aktivitas enzim
ALT, AST dan alkali fosfatase (ALP) pada tikus jantan yang diinduksi CCl4.
2. Menganalisis aktivitas ekstrak air buah mahkota dewa s ebagai pencegah
fibrosis hati melalui gambaran histopatologi hati pada tikus jantan yang
diinduksi CCl4.
3. Menganalisis aktivitas ekstrak air buah mahkota dewa sebagai pencegah
fibrosis hati melalui pemeriksaan penanda stres oksidatif (malondialdehid
dan rasio GSH/GSSG) pada tikus jantan yang diinduksi CCl4.
4. Menganalisis aktivitas ekstrak air buah mahkota dewa sebagai pencegah
fibrosis hati melalui pemeriksaan sitokin inflamasi (TNF-α) pada tikus jantan
yang diinduksi CCl4.
5. Menganalisis aktivitas ekstrak air buah mahkota dewa sebagai pencegah
fibrosis hati melalui pemeriksaan sitokin fibrogenik (TGF-ß) pada tikus
jantan yang diinduksi CCl4.
1.4. Hipotesis Penelitian
Ekstrak air buah mahkota dewa dapat mencegah fibrosis hati pada tikus yang
diinduksi CCl4 melalui mekanisme antioksidan, penghambatan sitokin inflamasi
(TNF-α) dan penghambatan sitokin fibrogenik (TGF-ß).
1.5. Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan manfaat berupa data non
klinik dalam hal penemuan kandidat obat pencegahan fibrosis hati yang berasal dari
ekstrak air buah mahkota dewa. Selain itu, mahkota dewa merupakan salah satu
tanaman asli Indonesia sehingga hasil positif penelitian ini diharapkan dapat
memperkaya khasanah tanaman obat tradisional Indonesia.
5
BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Hati
2.1.1. Fisiologi dan anatomi hati
Hati adalah organ dalam terbesar manusia dengan berat hati orang dewasa
sekitar 1.5 kg.2 Hati terletak diantara sirkulasi portal dan umum, yaitu antara organ
saluran cerna dan jantung.24
Jaringan hati merupakan unit fungsional terdiri dari sel-sel yang terangkai
sekitar pembuluh portal (titik masuk) dan vena sentral (titik keluar) darah. Hati
menerima suplai darah dari dua tempat yang berbeda. Pertama dari sirkulasi portal
yang membawa sebagian darah kaya oksigen dari saluran cerna dan mengandung
berbagai senyawa hasil pencernaan. Kedua, sebanyak 30% darah hepatik masuk
melalui arteri hepatik (Gambar 2.1a). Darah dari kedua tempat tersebut akan
tercampur pada bagian akhir dari pembuluh portal yaitu tempat ditemukannya
sinusoid hati. Sinusoid adalah kapiler di hati yang tersusun dari sel endotel yang
berpori, berperan dalam mengontrol aliran berbagai senyawa ke- dan dari dalam ruang
diantara hepatosit dan space of Disse (Gambar 2.1b).2
Space of Disse mengandung protein matriks ekstraselular densitas rendah dan
sel stelata hati/sel Ito. Hepatosit adalah tipe sel epitelial utama di hati dan tersusun di
sepanjang sinusoid sampai daerah sentrilobular (lobule) atau zona 3 (acini) sebagai sel
epitel yang terpolarisasi. Makrofag hati (sel Kupffer) terletak diantara sinusoid.2
Gambar 2.1. Gambaran skematik anatomi hati 25
ba
6
Universitas Indonesia
Pada dasarnya terdapat 2 konsep berbeda terkait susunan 3 dimensi dan unit
fungsional hati. Konsep pertama yaitu lobul hati yang dikemukakan oleh Kiernan dan
konsep kedua yaitu asinus hati yang dikemukakan oleh Rappaport.26
Pertama, Kiernan atau lobul klasik yang tersusun sekitar vena sentral, terlihat
berbentuk heksagonal dan dibatasi oleh interlobular septa dari jaringan ikat pada
beberapa spesies (Gambar 2.2). Pada manusia, sublobulus digambarkan sebagai garis
imaginasi dengan saluran portal berada diantara sudut dari lobulus yang berdekatan.
Konsep lobular ini adalah dasar untuk menggambarkan sentrilobular, perilobular
(peripheral) serta perubahan struktur sekitar venula hati atau saluran portal
(Gambar 2.3).26
Gambar 2.2. Gambaran mikroskopik hati babi yang menunjukkan lobulusheksagonal (Kiernan) yang dipisahkan oleh lapisan tipis interlobular septa. CV,vena sentral; PT, saluran portal.26
Gambar 2.3. Dua model anatomi mikroskopik, lobular hati dan asinus.Pada model lobular, vena hepatik terminal terletak pada pusat lobul (CV),sementara pembuluh portal (PV) terletak di peripheral. Model asinus dibagimenjadi 3 zona, zona 1 paling dekat dengan pembuluh darah dan zona 3terletak paling jauh. BD, duktus biliaris; HA, arteri hepatika.27
7
Universitas Indonesia
Kedua, pada tahun 1973 Rappaport menggambarkan unit organisasi hati
manusia sebagai asinus (Gambar 2.4). Pada model ini, 3 zona konsentrik mengelilingi
portal triad. Sel pada zona 1 digambarkan paling dekat dengan pembuluh darah
aferen dan tempat pertama di sinusoid yang menerima darah. Darah tersebut
mengandung banyak oksigen dan nutrisi. Sel pada zona 2 dan 3 makin menjauh dari
pembuluh darah aferen dan sel pada zona tersebut mendapatkan darah yang
mengandung sedikit oksigen. Sel pada zona ini paling cepat mengalami cedera karena
iskemia. Sebagai tambahan, hepatosit pada zona 3 secara aktif berperan dalam
metabolisme obat sehingga jika obat bersifat hepatotoksik maka akan menginduksi
nekrosis pada zona tersebut.26
Gambar 2.4. Asinus hati terbagi menjadi 3 zona. Darah masuk ke sinusoid dizona 1 dan selanjutnya mengalir ke zona 2 dan zona 3. Darah akan semakin sedikitmengandung oksigen dan nutrisi yaitu dari zona 1 ke zona 3. TPV, terminal portalvein; HA, hepatic artery; BD, bile ductule; HV, hepatic vein.28
2.1.2. Fungsi dan tipe sel hati
Hati tersusun atas berbagai macam tipe sel, antara lain hepatosit, sel
endotelial, sel Kupffer, sel stelata hati dan sel pit, yang masing-masing berperan
penting untuk mempertahankan fungsi hati normal (Gambar 2.5).29
Hepatosit menempati 80-88% dari total volume hati pada manusia. Hepatosit
merupakan sel epitel yang terpolarisasi dan memiliki diameter 30-40 m.26 Pada
bagian basolateral dari hepatosit terdapat space of Disse dan memiliki banyak
mikrovili. Bagian tersebut berperan dalam aktivitas endositosis dan pinositosis, yaitu
mengambil berbagai nutrisi, protein dan molekul lain, baik secara aktif maupun pasif.
Bagian apikal hepatosit membentuk membran kanikular yaitu tempat disekresikannya
komponen empedu. Hepatosit memiliki berbagai fungsi penting yaitu sintesis protein
serum esensial (albumin, faktor pembekuan, hormon dan faktor pertumbuhan),
8
Universitas Indonesia
produksi asam empedu, kolesterol, lesitin dan fosfolipid. Selain itu, hepatosit juga
berperan dalam regulasi berbagai nutrisi (glukosa, glikogen, lipid, kolesterol, asam
amino), metabolisme dan konjugasi senyawa lipofilik (bilirubin, anion, kation, obat)
sehingga dapat diekskresikan melalui empedu atau urin.26,29
Sel endotelial berjumlah 20% dari total sel hati, tetapi hanya sekitar 3.3% dari
total protein hati. Sel endotelial berbentuk pipih memanjang dan memiliki pori-pori
(fenestrae) sehingga sering disebut sebagai pelat saringan (sieve plates). Pori-pori
tersebut hanya sekitar 6-8% pada permukaan sel endotelial dan berperan sebagai
barier antara darah dan parenkim. Berbeda dengan sel endotelial vaskular, sel
endotelial hati memiliki sedikit membran dasar sehingga solut dan partikel kecil
memiliki akses ke ruang perisinusoidal. Sel endotelial dapat mensekresikan berbagai
macam protein, seperti interleukin, interferon dan TNF-α. Bersama sel Kupffer, sel
endotelial berperan dalam mekanisme pertahanan di hati.26
Sel Kupffer adalah anggota dari sistem mononuclear-phagocytic dan
membentuk sekitar 80-90% total populasi makrofag di tubuh. Sel kupffer merupakan
komponen dinding sinusoid hati dan berperan penting dalam mekanisme pertahanan
serta membuang berbagai partikulat seperti toksin, zat infeksius dan senyawa asing
dari pembuluh darah portal. Sel kupffer melepaskan berbagai mediator sebagai respon
terhadap infeksi, termasuk IL-1 dan 6, TNF-α, interferon dan eicosanoids.26
Sel stelata hati (perisinusoidal, sel Ito atau sel penyimpan lemak) terletak
dalam space of Disse. Sel stelata hati berjumlah sekitar 5-8% dari total seluruh sel
hati. Bagian sitoplasma sel stelata hati kaya vitamin A. Selain berperan sebagai
tempat penyimpanan vitamin A, pada sel stelata hati juga terdapat fibroblast yang
merupakan sumber utama matriks ekstraselular baik pada hati normal maupun pada
hati yang mengalami cedera. Sel stelata hati merupakan sumber potensial hepatocyte
growth factor (HGF) dan kontraktilitas sel tersebut berperan dalam mengatur aliran
darah sinusoidal. Sel stelata hati memiliki dua fenotip berbeda yaitu diam (quiescent)
pada hati normal dan aktif pada hati yang mengalami cedera. Perubahan fenotip
menyebabkan perubahan fungsi sel stelata hati, ditandai dengan hilangnya retinoid
dan terjadinya proses sintesa matriks ekstraselular dalam jumlah besar termasuk
kolagen, proteoglikan dan glikoprotein. 3,26,30,31
10
Universitas Indonesia
Tabel 1. Faktor genetik dan nongenetik yang berhubungan dengan progresi fibrosis pada berbagai jenispenyakit hati kronik32
Jenis penyakit hati Kandidat gen Faktor nongenetik
Infeksi virus hepatitis C HFE (Hereditary hemochromatosisgene)AngiotensinogenTGF- β1TNF- αApoE (Apolipoprotein E)
Konsumsi alkoholKoinfeksi HIV dan/atau virushepatitis BTransplantasi hatiDiabetes melitus
Diinduksi alkohol IL-10IL-1βADH (Alcohol dehydrogenase)ALDH (Aldehyde dehydrogenase)CYP2E1 (Cytochrome P450 2E1)TNF- α
Konsumsi alkoholEpisode hepatitis alkoholik
NASH HFEAngiotensinogenTGF- β1
UsiaBeratnya obesitasDiabetes melitusHipertrigliserida
Sirosis bilier primer IL-1βTNF- αApoE
Hepatitis autoimun HLA-II (Human leukocyte antigentype II haplotype)
Hepatitis autoimunTidak berespon terhadap terapi
2.2.2. Patogenesis fibrosis hati
Fibrosis hati merupakan suatu proses dinamik yang kompleks dan diperantarai
oleh kematian hepatosit dan aktivasi sel stelata hati.2,3,33 Setelah terjadi cedera hati
akut, sel parenkimal akan beregenerasi dan menggantikan sel yang mengalami
apoptosis atau nekrosis. Jika cedera hati terjadi secara terus menerus, maka proses
regenerasi mengalami kegagalan dan hepatosit akan digantikan oleh matriks
ekstraseluler (ECM) dalam jumlah berlebih termasuk kolagen fibrilar (Gambar
2.6).2,32
11
Universitas Indonesia
Gambar 2.6. Perubahan pada arsitektur hati (A) terkait dengan fibrosis hati tahaplanjut (B). Pada cedera hati kronis, limfosit masuk ke sel parenkim hati, hepatositmengalami apoptosis dan sel Kupffer teraktivasi melepaskan mediator fibrogenik. HSCberproliferasi dan teraktivasi, mensekresikan protein ECM dalam jumlah besar.32
Fibrosis hati diawali oleh kematian sel hepatosit. Hal ini disebabkan karena
terjadinya peroksidasi lipid termasuk pembentukan ROS, TGF-β dan TNF-α.33 Pada
penyakit infeksi oleh virus hepatitis C (HCV) atau virus hepatitis B (HBV), konsumsi
alkohol dalam jumlah besar, dan penyakit perlemakan hati non alkoholik, hepatosit
akan memproduksi radikal bebas superoksida (O2-), radikal hidroksil (HO-) dan non
radikal seperti H2O2 sehingga menyebabkan peroksidasi lipid. Produksi ROS secara
persisten tersebut akan mencetuskan respon inflamasi dan cedera hati. Sumber utama
ROS pada hepatosit adalah NADH dan nicotinamide adenine dinucleotide
phosphatase (NADPH) oksidase yang terletak di mitokondria (Gambar 2.7).33,34
Sel stelata hati, sel Kupffer, makrofag dan neutrofil juga menghasilkan ROS
ketika terjadi cedera hati. Pada sel Kupffer, NADPH oksidase diaktivasi oleh
beberapa stimuli seperti metabolit alkohol dan TNF-α sehingga menghasilkan ROS.
Sel Kupffer tersebut akan memberikan efek proinflamasi dan mensensitisasi hepatosit
sehinggga mengalami apoptosis. Adanya ROS juga berperan dalam proses aktivasi
dan aksi fibrogenik sel stelata hati.33,34
12
Universitas Indonesia
Gambar 2.7. Stress oksidatif dan kerusakan hepatosit. Sumber utama ROSadalah NADPH/NADH oksidase mitokondria. Adanya logam Fe, H2O2 dikonversimenjadi radikal hidroksil yaitu radikal yang sangat reaktif. Radikal hidroksil akanmenginduksi kerusakan DNA dan peroksidasi lipid pada struktur membranfosfolipid sehingga menyebabkan kematian sel.33
Sel stelata hati (hepatic stellate cells, HSC) adalah sel utama penghasil ECM
pada hati yang cedera dan merupakan efektor dalam respon fibrogenik. Bila hati
mengalami cedera kronis, HSC bertransformasi dari diam (quiescent) menjadi aktif,
dimana aktivasi tersebut merupakan komponen sentral dalam proses penyembuhan
cedera di hati. Proses aktivasi HSC adalah proses yang kompleks dan menyebabkan
perubahan selular dan karakteristik sel termasuk hilangnya vitamin A. Perubahan
paling penting dalam proses aktivasi tersebut adalah terjadinya peningkatan produksi
dan sekresi protein ECM, termasuk kolagen I, III dan IV, fibronektin, laminin,
proteoglikan dan lainnya.30,32
Proses aktivasi HSC terdiri dari 2 tahap yaitu inisiasi dan perpetuasi. Tahap
inisiasi ditandai dengan perubahan awal pada ekspresi gen dan fenotip sehingga sel
menjadi responsif terhadap sitokin dan stimuli lain. Tahap perpetuasi merupakan
tahap mempertahankan bentuk fenotip yang aktif sehingga menyebabkan fibrosis.
Inisiasi disebabkan stimulasi parakrin sedangkan perpetuasi melibatkan stimulasi
autokrin dan parakrin.3,35
Tahap inisiasi diawali dengan terjadinya aktivasi HSC, terutama disebabkan
adanya stimuli inflamasi dan oksidatif akibat cedera hati. Pada cedera hati tahap awal,
sel endotelial berperan dalam proses konversi laten TGF-β1 menjadi bentuk aktif.3
TGF-β1 merupakan sitokin fibrogenik utama yang mengatur produksi, degradasi dan
akumulasi ECM pada fibrosis hati. TGF- β1 juga diproduksi melalui jalur parakrin
dari sel Kupffer dan sel inflamasi selama cedera hati.33 Selain memproduksi TGF-β1,
13
Universitas Indonesia
sel Kupffer dan sel inflamasi juga melepaskan sitokin inflamasi (TNF-α dan IL-6),
radikal bebas dan platelet-derived growth factor (PDGF).3
Pada tahap perpetuasi, HSC yang teraktivasi akan mengalami serangkaian
perubahan fenotip yang mengarah ke proses akumulasi ECM. Pada tahap ini, HSC
teraktivasi akan membentuk miofibroblast yang ditandai dengan hilangnya retinoid,
meningkatnya proliferasi, kontraktilitas dan disekresikannya berbagai mediator
fibrogenesis seperti TGF-β dan PDGF.3,27,31,35,36 Pada HSC yang teraktivasi tersebut
akan terjadi penurunan ekspresi matrix of metalloproteinase (MMP) dan peningkatan
ekspresi tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP) yang pada akhirnya
menyebabkan akumulasi ECM dalam jumlah besar (Gambar 2.8).36
Gambar 2.8. Patogenesis molekuler fibrosis hati. Berbagai tipe hepatotoksik memproduksi mediatoryang menginduksi aktivitas inflamasi sel hepatik. Hepatosit rusak dan melepaskan sitokin inflamasidan ROS yang mengaktivasi sel Kupffer. Hal tersebut mengaktivasi HSC menjadi miofibroblasfibrogenik. HSC yang teraktivasi juga mensekresikan sitokin yang dapat mempertahankan bentukaktifnya. Jika kerusakan hati berlangsung terus menerus, maka terjadi akumulasi HSC teraktivasi danterjadi sintesa protein ECM dalam jumlah banyak sehingga menyebabkan terbentuknya jaringanfibrosis.37
2.2.3. Karbon tetraklorida sebagai model fibrosis hati in vivo
Beberapa senyawa kimia telah diidentifikasi dapat menginduksi inflamasi hati
dan fibrogenesis. CCl4 merupakan salah satu senyawa kimia yang lazim digunakan
untuk menginduksi fibrosis hati pada hewan coba. CCl4 memberi gambaran pola
fibrosis akibat hepatotoksik seperti yang terjadi pada manusia.38
Karakteristik CCl4 dalam menginduksi fibrosis hati yaitu dengan mengaktivasi
sel Kupffer dan mencetuskan respon inflamasi, sehingga melepaskan sitokin dan
faktor proinflamasi. Hal tersebut menyebabkan rekruitmen dan aktivasi monosit,
neutrofil dan limfosit yang berkontribusi terhadap terjadinya nekrosis hati.39
14
Universitas Indonesia
CCl4, seperti haloalkana lain, dimetabolisme oleh sitokrom P4502E1
(CYP2E1) dalam hepatosit hati menjadi radikal bebas triklorometil (CCl3*).38-40
Triklorometil dengan oksigen akan membentuk radikal triklorometilperoksi yang
kemudian menyerang lipid membran retikulum endoplasma dengan kecepatan yang
melebihi radikal bebas triklorometil. Triklorometil dan triklorometilperoksi tersebut
menyebabkan stress oksidatif, peroksidasi lipid, menginduksi kerusakan membran sel
dan struktur organel sel hati, menyebabkan cedera sel hati, degenerasi, nekrosis dan
fibrosis hati.41-43
Constandinou dkk38 melakukan penelitian terkait model fibrosis pada tikus
menggunakan CCl4 secara injeksi intraperitoneal. Berdasarkan hasil penelitian
tersebut diketahui bahwa injeksi intraperitoneal CCl4 secara berulang selama 4-6
minggu dapat menginduksi fibrosis hati, pemberian selama 8 minggu menyebabkan
sirosis reversibel tahap awal dan pemberian selama 12 minggu menyebabkan sirosis
tahap lanjut.38 CCl4 juga dapat diberikan secara oral. Berdasarkan hasil penelitian
yang dilakukan oleh Jang dkk39diketahui bahwa pemberian 50% larutan CCl4 pada
mencit dosis 2 mL/kgBB selama 10 minggu menyebabkan fibrosis dengan tingkat
kematian yang dapat diterima.
2.3. Strategi antifibrosis
Saat ini belum ada standar terapi untuk fibrosis hati. Walaupun uji non klinik
pada roden menunjukkan bahwa beberapa agen mempunyai potensi untuk mencegah
progresi fibrosis, namun efikasinya belum terbukti pada manusia. Hal ini disebabkan
oleh berbagai faktor seperti perlu dilakukannya beberapa kali biopsi hati untuk
menilai perubahan fibrosis hati secara akurat, perlu dilakukannya follow up studi
jangka panjang, dan fakta bahwa manusia mungkin kurang sensitif terhadap terapi
antifibrosis hati dibandingkan roden.
Antifibrosis yang ideal harus spesifik untuk hati, ditoleransi baik ketika
diberikan dalam jangka panjang dan efektif memperlambat deposisi kolagen yang
berlebihan tanpa mempengaruhi ECM normal.30 Strategi terapi yang saat ini
dikembangkan yaitu dengan menghambat inflamasi hati, mereduksi stress oksidatif
serta memodulasi produksi dan/atau aktivitas sitokin yang terlibat dalam proses
fibrogenesis.
15
Universitas Indonesia
2.3.1. Reduksi inflamasi hati
Inflamasi dapat menyebabkan progresi fibrosis hati, sehingga penggunaan
obat antiinflamasi merupakan hal yang rasional. Kortikosteroid adalah terapi pertama
pada autoimun hepatitis. Pemberian deksametason dapat mengurangi sinyal TGF-β
pada kultur sel HSC. Namun demikian, target deksametasone terhadap sel Kupffer
juga mempercepat fibrogenesis melalui peningkatan TIMP-1 pada tikus dengan bile
duct ligation. Kedua proses tersebut menggambarkan kompleksitas sinyal fibrosis dan
kesulitan ketika menggunakan obat seperti kortikosteroid yang memiliki banyak
target.35
Strategi antiinflamasi lain yaitu dengan meneutralisir sitokin inflamasi
menggunakan sitokin spesifik dan/atau reseptor antagonis. Pada hewan, anti TNF-α
efektif mengurangi kadar enzim hati dalam serum dan sitokin inflamasi termasuk IL-6
dan TGF-β1. Berkurangnya sitokin tersebut diikuti dengan hilangnya nekrosis dan
inflamasi jaringan. Pada penyakit hati alkoholik terjadi upregulation TNF-α, dan telah
dilakukan uji klinik menggunakan agen anti-TNF (contoh: pentoxifilline).34
Penggunaan anti TNF-α (Pentoxifilline) pada pasien hepatitis alkoholik diduga dapat
mengurangi inflamasi dan fibrosis, namun demikian data pendukung yang tersedia
saat ini masih belum cukup.30
IL-10, sitokin antiinflamasi dan imunomodulatori, menyebabkan down-
regulasi produksi sitokin proinflamasi seperti TNF-α, IL-1 dan IL-2 dari sel T. Ketika
diberikan pada pasien HCV, IL-10 dapat mengurangi inflamasi hati dan fibrosis,
namun level serum HCV-RNA meningkat selama terapi sehingga pendekatan terapi
dengan IL-10 tidak dilanjutkan.30
2.3.2. Reduksi stress oksidatif
Penggunaan agen yang memiliki target terhadap ROS juga dapat mengurangi
respon inflamasi yang berperan dalam aktivasi HSC dan fibrogenesis. Antioksidan
dapat menghambat efek ROS dan berpotensi sebagai antifibrosis. Antioksidan
terutama digunakan untuk memberikan efek preventif pada kerusakan hepatosit dan
diharapkan dapat berperan sebagai pencegah fibrosis hati. Salah satu antioksidan yang
telah diuji pada hewan coba dan manusia yaitu NAC.35
NAC adalah prekursor asetilasi asam amino L-cysteine dan glutation
tereduksi. NAC diindikasikan sebagai mukolitik, namun digunakan juga sebagai
antidot untuk kasus hepatotoksisitas karena asetaminofen.35,44
16
Universitas Indonesia
Studi non-klinik menunjukkan bahwa efek antifibrosis NAC terjadi dengan
cara pencegahan stres oksidatif dan downregulation sitokin profibrogenik TGF-β.44
Narasimhanaidu dkk45 melaporkan bahwa pemberian NAC (150 mg/kg/hari) secara
oral dapat memberikan efek protektif pada tikus yang diinduksi CCl4. NAC dapat
menurunkan aktivitas enzim penanda kerusakan hati (AST, γ-glutamyl transferase dan
ALP) dan peroksidasi lipid. Pemberian NAC (10 mg/kg/day secara ip) dapat
memberikan perlindungan terhadap fibrosis hati pada tikus, ditandai dengan
menurunnya peroksidasi lipid dan ekspresi iNOS, serta peningkatan level glutation.46
Studi klinik NAC menunjukkan bahwa kombinasi NAC dengan metformin
dapat memperbaiki NASH activity score, termasuk fibrosis pada pasien NASH.47
Studi lain menunjukkan bahwa NAC yang diberikan 600 mg tiap 12 jam dapat
memperbaiki fungsi hati pada pasien NAFLD.10
2.3.3. Modulasi produksi dan/atau aktivitas sitokin
Penghambatan terhadap produksi berlebihan sitokin fibrogenik yang terjadi
selama cedera hati sedang diteliti secara ekstensif. TGF-β diketahui memegang
peranan penting dalam kaskade fibrogenesis sehingga merupakan target terapeutik
yang penting.30 Berbagai strategi dikembangkan untuk menghambat efek TGF-β,
termasuk penggunaan antibodi yang meneutralisir TGF-β, small interfering RNA
(siRNA) dan menghambat oligonukleotida. Uji pra-klinik menunjukkan efek
antifibrosis, namun semua strategi itu tidak ada yang siap untuk diaplikasikan secara
klinik. Lebih lanjut, reseptor TGF-β diekspresikan pada banyak sel, sehingga
penghambatan terhadap TGF-β dikuatirkan dapat memicu penyakit autoimun atau
dediferensiasi sel, meskipun awalnya target yang diharapkan adalah HSC aktif.48
2.4. Mahkota dewa
Mahkota dewa atau Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl merupakan salah
satu tanaman asli Indonesia yang berasal dari Papua. Mahkota dewa adalah tanaman
perdu yang tumbuh dari dataran rendah hingga ketinggian 1200 meter di atas
permukaan laut.19-20
Secara empiris, bagian batang, daun dan buah mahkota dewa digunakan untuk
berbagai pengobatan seperti alergi, diabetes melitus, tekanan darah tinggi, penyakit
hati dan kanker.14,49-50 Manfaat bioaktivitas tersebut berasal dari kandungan kimia
mahkota dewa yang memiliki efek antiinflamasi, antioksidan dan antikanker.14,15
17
Universitas Indonesia
Hendra dkk15 melaporkan bahwa ekstrak metanol buah mahkota dewa
mengandung senyawa fenol dan flavonoid, yang memiliki aktivitas antioksidan dan
antiinflamasi. Aktivitas antioksidan dibuktikan melalui penurunan aktivitas 2,2-
diphenyl-1-picrylhydrazil (DPPH) dan NO scavenging activity. Aktivitas
antiinflamasi dibuktikan dengan adanya hambatan sintesa nitrit oksida pada makrofag
RAW 264.7 cell lines yang diinduksi LPS/IFN-γ.
Faried dkk49 berhasil mengisolasi asam galat dari buah mahkota dewa dan
membuktikan bahwa komponen tersebut secara selektif menginduksi kematian
berbagai sel kanker seperti kanker esofagus (TE-2), kanker lambung (MKN-28),
kanker kolon (HT-29), kanker payudara (MCF-7) dan kanker serviks (CaSki).
2.4.1. Ekstrak air buah Mahkota dewa
Proses isolasi senyawa kimia yang terkandung dalam mahkota dewa, termasuk
mangiferin, dilakukan menggunakan pelarut organik yang bersifat toksik seperti
metanol, etanol dan n-heksan. Residu pelarut yang terkandung pada ekstrak yang
dihasilkan merupakan masalah utama karena dapat mempengaruhi kualitas ekstrak
dan menyebabkan gangguan kesehatan manusia. Berdasarkan hal tersebut, saat ini
telah dikembangkan metode ekstraksi menggunakan pelarut non organik, misalnya
air.
Ekstraksi menggunakan air pada suhu dan tekanan subkritis (subcritical water
extraction) merupakan alternatif metode ekstraksi yang dinilai efisien, tidak toksik
dan ramah lingkungan. Kim dkk14 telah berhasil melakukan proses ekstraksi buah
makhota dewa dengan mengunakan pelarut air pada suhu 100°C dan tekanan 30 bar
selama 5 jam. Salah satu komponen yang terdapat dalam ekstrak air buah mahkota
dewa tersebut yaitu mangiferin, yang kadarnya (21.7 mg/g) setara dengan ekstrak
metanol (25.0 mg/g) dan lebih besar dari ekstrak etanol (13.2 mg/g).
2.4.2. Studi in vitro ekstrak air buah mahkota dewa
Studi pendahuluan secara in vitro yang dilakukan oleh Berlian dkk22
menunjukkan adanya efek hepatoprotektif ekstrak air buah mahkota dewa. Pertama
dilakukan pengujian terhadap parameter penanda kerusakan hati yaitu ALT dan AST.
Ekstrak air buah mahkota dewa dapat menurunkan ekspresi ALT pada sel HepG2
yang diinduksi etanol 5%, namun ekspresi AST tidak menurun secara signifikan.
Kedua dilakukan pengujian terhadap protein yang diketahui terlibat dalam proses
18
Universitas Indonesia
hepatotoksisitas yaitu NF-κB dan TNF-α. Ekstrak air buah mahkota dewa dapat
menurunkan ekspresi NF-κB dan TNF-α pada sel HepG2 yang diinduksi etanol 5%.22
Efek ekstrak air buah mahkota dewa terhadap peroksidasi lipid pada sel
HepG2 juga dievaluasi. Hasil studi menunjukkan adanya penurunan peroksidasi lipid.
Berdasarkan hasil studi tersebut disimpulkan bahwa efek hepatoprotektif ekstrak air
buah mahkota dewa terjadi dengan meningkatkan waktu hidup sel melalui down-
regulation NFkB-TNF-α-lipid peroksidasi.22
2.4.3. Studi in vivo ekstrak air buah mahkota dewa
Studi in vivo dilakukan pada tikus yang diinduksi etanol 20% menggunakan
ekstrak air buah mahkota dewa dosis 37,5; 50 dan 75 mg/kgBB. Ekstrak curcuma
domestica digunakan sebagai pembanding dengan dosis yang sama. Perlakuan
dilakukan selama 4 minggu.23
Hasil studi menunjukkan bahwa ekstrak air buah mahkota dewa dosis 37,5; 50
dan 75 mg/kgBB dapat menurunkan level AST, ALT, total bilirubin dan γ-globulin
transferase (GGT). Kondisi histopatologi kelompok yang diterapi ekstrak air buah
mahkota dewa dosis 50 dan 75 mg/kgBB sebanding dengan kelompok ekstrak
curcuma domestica dosis yang sama.23
2.4.4. Data toksisitas ekstrak air buah mahkota dewa
Penelitian toksisitas akut yang dilakukan pada mencit jantan dan betina,
menyimpulkan bahwa pemberian dosis tunggal ekstrak air buah mahkota dewa
(Proliverenol) sampai dosis 15 g/kgBB tidak mempengaruhi aktivitas dan perilaku
serta tidak menimbulkan kematian. Nilai LD50 ekstrak air buah mahkota dewa lebih
besar dari 15 g/kgBB yang termasuk kategori praktis non toksik.50
Pada pemeriksaan toksisitas subkronik pada tikus jantan dan betina
disimpulkan bahwa pemberian ekstrak air buah mahkota dewa dosis 134 mg/kgBB,
536 mg/kgBB dan 1000 mg/kgBB sekali sehari selama 90 hari tidak mempengaruhi
aktivitas motorik dan perilaku tikus. Parameter biokimia darah tidak dipengaruhi
kecuali adanya peningkatan kadar kolesterol yang bermakna pada tikus betina dengan
dosis 536 mg/kgBB dibandingkan kelompok kontrol. Hal tersebut bersifat reversibel
didasarkan hasil pengamatan pada kelompok satelit yang mengalami penurunan
kolesterol.51
19
Universitas Indonesia
Terjadi peningkatan eritrosit, angka hematrokit dan hematologi pada tikus
jantan dan betina dengan dosis 536 mg/kgBB. Bobot dan warna urin masih dalam
batas normal. Terdapat penurunan indeks organ hati yang bermakna pada tikus jantan
dengan dosis 536 mg/kgBB, sedangkan pada kelompok dosis 134 mg/kgBB dan 1000
mg/kgBB terjadi peningkatan indeks organ hati. Pada kelompok satelit dosis 1000
mg/kgBB indeks organ hati menurun kembali, yang menunjukkan sifat reversibel.
Peningkatan dosis tidak mempengaruhi aktivitas enzim ALT dan AST serta histologi
hati dibandingkan kelompok kontrol.51
20
Universitas Indonesia
2.5. Kerangka teori
Radikal bebas, TGF-β,TNF-α, Angiotensin II,
IL-8/IL-10
TGF-β, TIMP-1,TIMP-3,MCP-1 dan RANTES
FASE
INFLAMASI
FIBROGENESIS
Radikal bebas, TNF-αTGFβ, EGF, IGF
Radikal bebas, TGF-β,TNF-α, IL-6, IGF
Infeksi HBV& HCV
Kolestasis
Kerusakan hati berulang
Kerusakansel hati
Parasit
Alkohol
Obat & Racun
Obstruksivena
Obesitas,NAFLD
Penyakitmetabolik
Aktivasi sel T Aktivasi sel Kupffer
Aktivasi Sel StelataHati (HSC)
Miofibroblas
Sintesis matriks ekstraselular ↑
Fibrosis hati
PDGF
Proliferasi HSCteraktivasi
Inisiasi
perpetuasi
21
Universitas Indonesia
2.6. Kerangka konsep
Keterangan:: Parameter yang diperiksa
Karbon tetraklorida (CCl4)
Radikal bebas triklorometil (CCl3*)
CYP4502E1
Radikal bebas triklorometilperoksi
O2
Stres oksidatif ↓
Peroksidasi lipid ↓
Kerusakan sel hati ↓
Aktivasi sel Kupffer ↓
Aktivasi Sel Stelata Hati (HSC) ↓
Miofibroblas ↓
Sintesis matriks ekstraselular ↓
Fibrosis ↓
MDA, RasioGSH/GSSG
ALT, AST, ALP
TNF-α,TGF-β
TNF-α,TGF-β
histopatologi hati
Ekstrak air buahmahkota dewa
NAC(n-acetylcysteine)
22
BAB 3
METODE PENELITIAN
3.1. Disain penelitian
Desain penelitian ini berupa studi nonklinik eksperimental pada tikus dengan
rancangan berpembanding, acak dan paralel.
3.2. Lokasi dan waktu penelitian
Penelitian dilakukan di Departemen Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas
Indonesia selama bulan Oktober 2013 – Mei 2014.
3.3. Hewan Coba
Penelitian ini menggunakan tikus jantan galur Sprague-Dawley dengan berat badan
200-350 gram yang berasal dari Pusat Pengujian Obat dan Makanan Nasional (PPOMN),
Badan POM. Hewan uji ditempatkan pada ruangan yang suhu dan kelembaban ruangan yang
konstan, penerangan yang cukup, makanan pellet dan air minum ad libitum.
3.4. Etika Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan setelah mendapatkan persetujuan dari Komite Etik
Penelitian Kesehatan Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia.
3.5. Obat Uji
Obat yang digunakan dalam penelitian ini adalah ekstrak air`buah mahkota dewa
(DLBSProliverenol) yang diproduksi oleh PT. Dexa Medica. Pembanding positif yang
digunakan yaitu n-acetyl cysteine (Fluimucil) dengan dosis 150 mg/kg berat badan/hari.
3.6. Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan:
1. Ekstrak air buah mahkota dewa (PT. Dexa Medica) No. bets. RP130116
2. N-acetyl cysteine (Fluimucil oral solution 200 mg/Zambon S.p.A, Italia)
3. Karbon tetraklorida (Merck Cat. No. Em.222)
4. Minyak zaitun
23
Universitas Indonesia
5. CMC-Na
6. Akuabides (PT. Widarta Bakti)
7. NaCl 0.9% (PT. Widarta Bakti)
8. PBS pH 7.4 (Sigma Aldrich Cat. No. P4417)
9. Protease inhibitor cocktail (Boehringer Cat. No 1697498)
10. Penetapan kadar protein
a. Kit Coomassie PlusTM (Bradford) assay (Thermo Scientific, USA/Cat No. 23236)
11. Penetapan kadar ALT, AST dan ALP
a. Kit enzimatik Dyasis (International Holzheim, Jerman)
12. Penetapan kadar MDA
a. Asam tiobarbiturat, TBA (T5500-25G)
b. MDA standar: 1,1,3,3-tetrametoksipropan 99% (TMEP) (Aldrich 10838-3)
c. Asam trikloroasetat, TCA (Merck K40385207)
13. Penetapan rasio GSH/GSSG Sigma-Aldrich
a. OxyselectTM Total Glutathione (GSSG/GSH) (Cell biolabs Cat. No. STA-312)
b. GSH, standar (Sigma-Aldrich 66529)
14. Pembuatan homogenat jaringan hati
a. Pemeriksaan TNF-α
- PBS pH 7.4
- Protease inhibitor cocktail
b. Pemeriksaan TGF-β
- Tris(hidroksimetil)aminoten, pH 7.4 Trizma Base (Sigma-Aldrich T6791)
- NaCl (Sigma)
- Etilendiamnetetraasetat, EDTA (Sigma-Aldrich E6511)
- Natrium orthovanadate, Na3VO4 (Sigma-Aldrich S6508)
- Natrium fluorida, NaF (Merck)
- Natrium pirofosfat, Na4P2O7 (Sigma-Aldrich 221368)
15. Penetapan kadar TNF-α
a. ELISA kit (Sigma-Aldrich Cat. No RAB0480)
16. Penetapan kadar TGF-β
a. ELISA kit (Novateinbio Cat. No FM-E100129)
17. Pemeriksaan histopatologi dengan pewarnaan Masson’s trichrome
a. Xylol
24
Universitas Indonesia
b. Alkohol 100%, 90%, 95%, 70%
c. Larutan Boiun
d. Larutan wugertis iron hematoxylin
e. Larutan blenbrich-acid fuchsin
f. Larutan phosphomolibdic-phosphotungstic acid
g. Larutan aniline blue
h. Larutan asetat 1%
i. Entelan
Alat yang digunakan:
1. Spektrofotometer (Perkin-Elmer)
2. xMark microplate spectrophotometer (BioRad)
3. Homogenizer elektrik (Ultra Turrax)
4. Timbangan analitik (Precisa E220A)
5. Vortex mixer (Labinco)
6. Sentrifus berpendingin (Hitachi)
7. Freezer sampai -20°C dan -80°C (Panasonic)
8. Lemari es -2°C sampai -8°C (GEA laboratoires refrigerator)
9. pH meter (Inolab pH720)
10. Tabung heparin
11. Tabung Eppendrof
12. Tips dan mikropipet (Eppendrof, Finpippette)
13. Microplate 24 well (NuclonTM surface)
14. Microplate 96 well (TPP 92096)
15. Alat-alat gelas lain (Pyrex)
16. Mikroskop cahaya pembesaran 400x
17. Kamera digital (Optilab)
25
Universitas Indonesia
3.7. Prosedur Penelitian
Tikus terbagi dalam 6 kelompok dengan jumlah yang diharapkan hidup 5 ekor tiap kelompok.
I. Kelompok normal: tidak diberi perlakuan
II. Kelompok CCl4 (CMC Na 0.5% dan CCl4): diberikan CMC Na 0.5% per oral dan
diinjeksi intraperitoneal CCl4 setiap 3 hari sekali (0.2 mL/100 gram berat badan pada 2
minggu pertama dan dilanjutkan 0.1 mL/100 gram berat badan sampai 8 minggu). CCl4
dilarutkan dalam minyak zaitun dengan perbandingan 1:1.
III. Kelompok CCl4+NAC (NAC dan CCl4): diberikan NAC per oral dosis 150 mg/kgBB
yang dilarutkan dalam CMC Na 0.5% dan diinjeksi intraperitoneal CCl4 setiap 3 hari
sekali (0.2 mL/100 gram berat badan pada 2 minggu pertama dan dilanjutkan 0.1 mL/100
gram berat badan sampai 8 minggu). CCl4 dilarutkan dalam minyak zaitun dengan
perbandingan 1:1.
IV. Kelompok CCl4+T50 (ekstrak air buah mahkota dewa dan CCl4): diberikan ekstrak air
buah mahkota dewa per oral dosis 50 mg/kgBB yang dilarutkan dalam CMC Na 0.5%
dan diinjeksi intraperitoneal CCl4 setiap 3 hari sekali (0.2 mL/100 gram berat badan pada
2 minggu pertama dan dilanjutkan 0.1 mL/100 gram berat badan sampai 8 minggu).
CCl4 dilarutkan dalam minyak zaitun dengan perbandingan 1:1.
V. Kelompok CCl4+T100 (ekstrak air buah mahkota dewa dan CCl4): diberikan ekstrak air
buah mahkota dewa per oral dosis 100 mg/kgBB yang dilarutkan dalam CMC Na 0.5%
dan diinjeksi intraperitoneal CCl4 setiap 3 hari sekali (0.2 mL/100 gram berat badan pada
2 minggu pertama dan dilanjutkan 0.1 mL/100 gram berat badan sampai 8 minggu).
CCl4 dilarutkan dalam minyak zaitun dengan perbandingan 1:1.
VI. Kelompok CCl4+T150 (ekstrak air buah mahkota dewa dan CCl4): diberikan ekstrak air
buah mahkota dewa per oral dosis 150 mg/kgBB yang dilarutkan dalam CMC Na 0.5%
dan diinjeksi intraperitoneal CCl4 setiap 3 hari sekali (0.2 mL/100 gram berat badan pada
2 minggu pertama dan dilanjutkan 0.1 mL/100 gram berat badan sampai 8 minggu).
CCl4 dilarutkan dalam minyak zaitun dengan perbandingan 1:1.
26
Universitas Indonesia
Tabel 2. Pembagian kelompok tikus dan perlakuan
Kelompok TikusPerlakuan pada minggu ke-
1 2 3 4 5 6 7 8
Normal (N) Tidak diberi perlakuan
CCl4 CMC Na 0.5% per oral dan diinjeksi intraperitoneal CCl4
CCl4+NAC NAC per oral (dosis 150 mg/kgBB) dan diinjeksi intraperitoneal CCl4
CCl4+T50ekstrak air buah mahkota dewa per oral (dosis 50 mg/kgBB) dan
diinjeksi intraperitoneal CCl4
CCl4+T100ekstrak air buah mahkota dewa per oral (dosis 100 mg/kgBB) dan
diinjeksi intraperitoneal CCl4
CCl4+T150ekstrak air buah mahkota dewa per oral (dosis 150 mg/kgBB) dan
diinjeksi intraperitoneal CCl4
Aklimatisasi hewan coba dilakukan di kandang Departemen Farmakologi FKUI
selama 1 minggu. Kemudian, hewan coba dibagi menjadi 6 kelompok sesuai pembagian
tersebut secara acak. NAC dan ekstrak air buah mahkota diberikan bersamaan dengan
dilakukannya induksi fibrosis menggunakan CCl4 melalui injeksi intraperitonial.
Dosis CCl4, NAC dan ekstrak air buah mahkota dewa disesuaikan dengan
peningkatan berat badan setiap minggu. Selama periode penelitian, tikus diperlakukan sesuai
dengan standard perlakuan terhadap hewan coba yang berlaku dan dilakukan monitoring
tanda-tanda toksisitas umum seperti penurunan berat badan dan kematian.
Seluruh hewan coba diterminasi pada akhir masa studi dengan cara dekapitasi,
kemudian darah diambil dan dipisahkan plasmanya untuk dilakukan pemeriksaan ALT, AST
dan ALP. Seluruh jaringan hati segera dikeluarkan dan diambil untuk pemeriksaan
histopatologi dan biologi molekular yaitu malondialdehid (MDA), rasio GSH/GSSG, sitokin
inflamasi dan fibrogenik (TNF-α dan TGF-ß).
27
Universitas Indonesia
Gambar 3.1. Kerangka kerja penelitian
Pemberian NAC atau obat uji po+
injeksi ip CCl4 dosis 0.2 mL/100gBB
2 minggu
Timbang berat badan tikussetiap hari
6 minggu
Timbang berat badan tikussetiap hari
Tikus diterminasi dengan dekapitasi
Ambil plasma dan organ hatiTimbang organ hati
Organ hati
Pemeriksaanhistopatologi
Homogenat hati
PewarnaanMasson’sTrichrome
Pemeriksaan:1. Kadar Protein2. Kadar MDA3. Rasio GSH/GSSG4. Kadar TNF-α5. Kadar TGF-β
Plasma
Pemeriksaan:1. Aktivitas ALT2. Aktivitas AST3. Aktivitas ALP
Analisis statistikUji normalitas distribusi : Kolmogorov Smirnov
Uji homogenitas varias: Uji LeveneUji kemaknaan statistik: ANOVA satu arah
Perbandingan multipleTukey
Interpretasi hasil analisis statistik dan diskusi
Kesimpulan
Injeksi ip CCl4
dosis 0.2 mL/100gBB
Tidak diberiperlakuan
Pemberian NAC atau obat uji po+
injeksi ip CCl4 dosis 0.1 mL/100gBB
Injeksi ip CCl4
dosis 0.1 mL/100gBB
Tidak diberiperlakuan
28
Universitas Indonesia
3.8. Pemeriksaan kadar protein homogenat hati
3.8.1. Prinsip
Prosedur dilakukan untuk menentukan konsentrasi protein yaitu menggunakan reagen
Bradford. Prinsip reaksi berdasarkan pembentukan kompleks antara protein dalam sampel
dan Briliant Blue G. Kompleks yang terbentuk akan menghasilkan perubahan warna dari
coklat ke biru yang serapannya diukur pada panjang gelombang () 595 nm. Besar serapan
yang dihasilkan sebanding dengan konsentrasi protein.52
Perhitungan kadar protein jaringan hati dilakukan dengan tujuan sebagai faktor
pembagi dalam perhitungan kadar MDA, kadar total glutation, kadar GSH, TNF-α dan TGF-
β. Satuan kadar yang diperoleh untuk MDA, total glutation dan GSH menjadi nmol/mg
protein, sedangkan untuk TNF-α dan TGF-β menjadi pg/mg protein.
Reagan kit Coomassie PlusTM (Bradford) assay terdiri dari coomassie plus (Bradford)
assay reagent yang mengandung coomassie G-250 dye, metanol, phosphoric acid dan
pelarut, serta standar abumin 2 mg/mL.
3.8.2. Prosedur
a. Dibuat standar albumin menjadi 6 konsentrasi yang berbeda (blanko, 25-1000
g/mL)
b. Dipipet 10 L standar atau sampel ke dalam microplate 96 well.
c. Ditambahkan 300 L Coomassie Plus reagent ke dalam masing-masing well yang
berisi standar/sampel dan campur menggunakan plate shaker selama 30 detik.
d. Inkubasi plate selama 10 menit pada suhu kamar.
e. Ukur absorbansi pada =595 nm menggunakan plate reader.
f. Kadar protein didapatkan dari kurva standar dan dinyatakan dalam satuan g/mL
(dikonversi menjadi mg/mL).
3.9. Penetapan aktivitas ALT dan AST
3.9.1. Prinsip
ALT atau glutamat piruvat transaminase (GPT) dan AST atau glutamat oksaloasetat
transaminase (GOT) merupakan kelompok enzim aminotransferase atau transferase yang
paling representatif. Enzim ini bekerja mengkatalisis konversi asam keto menjadi asam amino
melalui transfer gugus amino.
29
Universitas Indonesia
Prinsip pemeriksaan ALT (GPT) berdasarkan International Federation of Clinical
Chemistry and Laboratory (IFCC ) adalah sebagai berikut:
ALATL-alanin + 2-oksoglutarat L-glutamat + Piruvat
LDHPiruvat + NADH + H+ D-laktat + NAD+
Reagen kit untuk pemeriksaan ALT ini terdiri atas reagen 1 (R1) dan reagen 2 (R2).
R1 mengandung dapar TRIS, L-alanin, dan LDH (laktat dehidrogenase). R2 mengandung 2-
oksoglutarat dan NADH.
Prinsip pemeriksaan AST (GOT) berdasarkan International Federation of Clinical
Chemistry and Laboratory (IFCC ) adalah sebagai berikut:
ASATL-aspartat + 2-oksoglutarat L-glutamat + Oksaloasetat
MDHOksaloasetat + NADH + H+ L-malat + NAD+
Reagen kit untuk pemeriksaan AST ini terdiri atas reagen 1 (R1) dan reagen 2 (R2).
R1 mengandung dapar TRIS, L-aspartat, MDH (malat dehidrogenase) dan LDH (laktat
dehidrogenase). R2 mengandung 2-oksoglutarat dan NADH.
3.9.2. Prosedur
a. Disiapkan campuran monoreagen yaitu 4 bagian R1 + 1 bagian R2 (misalnya
20 mL R1 + 5 mL R2). Monoreagen ini harus dilindungi dari cahaya.
b. Ke dalam tabung dimasukkan 100 L sampel aliquot ditambahkan dengan
1000 L monoreagen dan divorteks.
c. Campuran tersebut dipindahkan ke dalam microplate 24 well dan dibaca
serapannya pada =365 nm, suhu 37°C pada menit ke-1, 2, 3, dan 4.
d. Perhitungan aktivitas ALT dan AST digunakan rumus:
Aktivitas ALT/AST (IU/L) = ΔA sampel X faktor (3235)
A sampel =
30
Universitas Indonesia
3.10. Penetapan aktivitas ALP
3.10.1. Prinsip
ALP adalah enzim yang berperan dalam mempercepat hidrolisis fosfat organik
dengan melepaskan fosfat anorganik. Enzim ini terdapat dalam banyak jaringan, terutama di
hati, tulang, mukosa usus dan plasenta.7
Prinsip pemeriksaan ALP berdasarkan International Federation of Clinical Chemistry
and Laboratory (IFCC ) adalah sebagai berikut:
APp-nitrofenilfosfat + H20 fosfat + p-nitrofenol
Reagen kit untuk pemeriksaan ALP ini terdiri atas reagen 1 (R1) dan reagen 2 (R2).
R1 mengandung dapar diethanolamin, magnesium klorida. R2 mengandung p-
nitrofenilfosfat.
3.10.2. Prosedur
a. Disiapkan campuran monoreagen yaitu 4 bagian R1 + 1 bagian R2 (misalnya 20
mL R1 + 5 mL R2). Monoreagen ini harus dilindungi dari cahaya.
b. Ke dalam tabung dimasukkan 20 L sampel aliquot ditambahkan dengan 1000 L
monoreagen dan divorteks.
c. Campuran tersebut dipindahkan ke dalam microplate 24 well dan dibaca
serapannya pada =405 nm, suhu 37°C pada menit ke-1, 2, 3, dan 4.
d. Perhitungan aktivitas ALP digunakan rumus:
Aktivitas ALP (U/L) = ΔA sampel X faktor (2757)
A sampel =
3.11. Pemeriksaan histopatologi hati
Setelah dilakukan terminasi, sebagian lobus hati difiksasi dalam dapar formalin 10%
untuk dibuat sediaan histopatologi di Departemen Histologi FKUI. Proses pematangan
jaringan dilakukan sebelum pewarnaan jaringan. Tahapan yang dilakukan pada proses
pematangan jaringan yaitu dehidrasi, penjernihan, infiltrasi dan penanaman jaringan.
Dehidrasi dilakukan secara berurutan dengan alkohol 70% selama 30 menit kemudian
alkohol absolut selama 30 menit sebanyak tiga kali penggantian. Setelah dehidrasi, jaringan
dijernihkan dengan merendam dalam xylol selama 15 menit sebanyak dua kali pergantian.
31
Universitas Indonesia
Selanjutnya dilakukan proses infiltrasi dan penanaman jaringan yaitu dengan merendam
jaringan dalam parafin cair suhu 60°C selama 30 menit. Blok parafin yang terbentuk
kemudian dipotong dengan mikrotom setelan 5 μm. Potongan jaringan tersebut dimasukkan
dalam penangas air suhu 50°C agar mengembang dengan baik dan kemudian direkatkan pada
gelas obyek dan dikeringkan pada suhu 60°C selama 10 menit, dilanjutkan dengan pewarnaan
Masson’s trichrome.
Pewarnaan Masson’s trichrome dilakukan dengan urutan sebagai berikut:53
a. Dimasukkan ke dalam xylol I selama 5 menit, kemudian ke dalam xylol II selama 5
menit.
b. Dicelupkan masing-masing 10 kali secara berurutan ke dalam alkohol 100%, alkohol
95%, alohol 70% dan akuades.
c. Dibilas dengan akuades.
d. Direndam dalam larutan Bouin dan dioven selama 1 jam (56°C).
e. Dicuci dengan air mengalir selama 10 menit dan bilas dengan akuades.
f. Dimasukkan dalam larutan wugertis iron hematoxylin selama 10 menit.
g. Dicuci dengan air mengalir selama 10 menit dan bilas dengan akuades.
h. Dimasukkan dalam larutan blenbrich-acid fuchsin selama 15 menit.
i. Dibilas dengan akuades.
j. Dimasukkan dalam larutan phosphomolibdic-phosphotungstic acid selama 10 menit.
k. Dimasukkan dalam larutan aniline blue selama 5 menit.
l. Dibilas dengan akuades.
m. Dimasukkan dalam larutan acetic 1% selama 3 menit.
n. Dicelupkan masing-masing 10 kali secara berurutan ke dalam alkohol 95%, alkohol
100% ke-1 dan alkohol 100% ke-2.
o. Dimasukkan ke dalam xylol I dan xylol II, masing-masing selama 3 menit.
p. Ditutup dengan kaca penutup yang telah diberi entelan.
q. Preparat jaringan dibaca dengan mikroskop cahaya dengan pembesaran 400x.
Pemeriksaan histopatologi dilakukan secara tersamar oleh patolog dari Fakultas
Kedokteran Hewan IPB, Bogor. Pengamatan area fibrosis hati dilakukan pada daerah
periportal yaitu pada cabang arteri hepatika, cabang vena porta dan cabang duktus biliaris.
Pengamatan area fibrosis dilakukan berdasarkan hasil mikrofotografi menggunakan
mikroskop yang dilengkapi dengan kamera digital (Optilab) pada 5 lapang pandang dengan
32
Universitas Indonesia
luas 0.045 mm2 dan perbesaran 400x. Pengambilan lapang pandang dilakukan berlawanan
arah jarum jam sesuai Gambar 3.2 dan selanjutnya dilakukan kuantifikasi menggunakan
imageJ.
Gambar 3.2. Cara pemilihan lapang padang preparathati. Pembacaan dilakukan berlawanan arah jarum jamdengan urutan kanan atas, kiri atas, tengah, kanan bawahdan kiri bawah.
Prosedur kuantifikasi menggunakan imageJ dilakukan dengan urutan sebagai berikut:
1. Skala imageJ diatur terlebih dahulu sebelum dilakukan pengamatan jaringan.
Pertama, klik file kemudian bagian open dan dilanjutkan dengan membuka
fotometer. Kedua, klik “straight line selections” pada toolbar kemudian dibuat garis
lurus pada mikrometer yang menceriminkan skala/jarak tertentu (misal 50 μm),
selanjutnya diikuti dengan klik analyze dan set scale. Pada menu “set scale” ketik
jarak mikrometer yang digunakan pada kolom “known distance”, ketik “μm” pada
kolom unit of length, kemudian klik “global” dan “OK”. Pada sisi kiri atas akan
terlihat ukuran panjang dan lebar foto sesuai jarak yang ditentukan dalam satuan
mikrometer (μm).
2. Penentuan area fibrosis hasil pewarnaan Masson’s trichrome
Pertama, klik file kemudian open dan dibuka foto yang ingin diproses. Kedua,
pada bagian menu klik “image” pada toolbar, kemudian klik bagian “type” dan
selanjutnya pilih “RGB stack”. Pada layar akan muncul foto dalam format “gray
scale” dengan 3 separasi yang berbeda yairu red, green dan blue, kemudian pilih
tipe separasi foto “blue”. Ketiga, klik “open” dan buka kembali foto asli yang akan
diolah untuk digunakan sebagai pembanding. Pada bagian menu klik “image” pada
toolbar kemudian klik “adjust” dan “threshold” sehingga muncul fokus-fokus
berwarna merah yang merupakan “threshold area” pada foto. Area yang menjadi
fokus pengukuran diatur menggunakan “threshold bar” dan pada proses pengaturan
12
3
45
33
Universitas Indonesia
tersebut dilakukan perbandingan dengan foto asli. Pada tahap ini, “threshold area”
merupakan area yang positif fibrosis.
3. Pengukuran luas area fibrosis hasil pewarnaan Masson’s trichrome
Sebelum dilakukan pengukuran “threshold area”, klik menu imageJ toolbar
klik bagian “analyze” kemudian dipilih “set measurement”. Pada bagian tersebut
dipilih kolom area, area fraction, limit to threshold, display label kemudian klik
“OK”. Pengukuran “threshold area” dilakukan dengan klik bagian “analyze” dan
“measure”. Pada layar akan terlihat hasil pengukuran luas area fibrosis dalam satuan
μm dan persen (%) area fibrosis.
3.12. Penetapan kadar MDA
3.12.1. Prinsip
Metode ini digunakan untuk menentukan senyawa aldehid, termasuk malondialdehid
(MDA) yang terbentuk dari hasil peroksidasi lemak oleh radikal bebas. MDA dapat bereaksi
dengan asam tiobarbiturat (TBA) menghasilkan senyawa berwarna yang mengabsorpsi
cahaya pada =530 nm. Standar MDA yang digunakan adalah 1,1,3,3-tetrametoksipropan
(TMEP). Pemeriksaan MDA dilakukan terhadap homogenat hati.
3.12.2. Prosedur pembuatan homogenat hati
a. Jaringan hati ditimbang ± 100 mg dan ditambahkan PBS ± 1 mL.
b. Suspensi jaringan dihomogenisasi menggunakan ultraturax selama 3 menit pada
suhu 4°C.
c. Homogenat dipindahkan ke dalam tabung Eppendrof dan disentrifugasi pada 4°C,
3000 rpm selama 10 menit.
d. Supernatan dipindahkan dalam tabung Eppendrof sebelum dilakukan pemeriksaan
MDA.
3.12.3. Prosedur
a. Larutan stok MDA standar dibuat dalam aquabides. Pengenceran larutan stok
MDA standar dibuat setiap hari pengukuran untuk memperoleh larutan standar
MDA dengan 7 konsentrasi berbeda (blanko standar, 0.075 – 2.4 nmol/mL).
34
Universitas Indonesia
b. Berbagai reagen yang perlu disiapkan sebagai berikut:
Larutan TCA 20% (b/v) dalam akuabides.
Larutan TBA 0.67% (b/v) dalam akuabides.
c. Ke dalam tabung sentrifus berisi 200 L sampel aliquot atau larutan MDA
standar, ditambahkan dengan akuabides 1800 L.
d. Ditambahkan 1 mL larutan TCA 20%, divorteks dan ditambahkan 2 mL larutan
TBA 0.67% kemudian dicampur sampai homogen dengan vorteks dan dipanaskan
pada suhu 100°C selama 10 menit.
e. Setelah larutan mencapai suhu ruang, tabung sampel ditutup dengan parafilm dan
disentrifus pada 3000 rpm selama 10 menit menggunakan sentrifus berpendingin.
f. Supernatan dipindahkan ke dalam kuvet 1 mL dan diukur absorbansinya pada
= 530 nm terhadap blanko.
g. Kadar MDA dalam sampel ditentukan dengan menggunakan kurva standar MDA
dan hasil akhirnya dibagi dengan kadar protein homogenat sehingga diperoleh
kadar dengan satuan nmol/mg protein.
3.13. Penetapan rasio GSH/GSSG
3.13.1. Prinsip
Penetapan rasio GSH/GSSG dilakukan dengan mengukur kadar total glutation dan
glutation tereduksi (GSH) yang terdapat dalam homogenat hati. OxiselectTM assay kit
digunakan untuk mengukur kadar total glutation dan GSH yang terdapat dalam sampel
(GSH/GSSG). Glutation teroksidasi (GSSG) akan direduksi menjadi GSH oleh reaksi yang
secara spesifik dikatalisis oleh enzim glutation reduktase dan NADPH. Kromogen akan
bereaksi dengan gugus tiol dari GSH menghasilkan kompleks warna yang dibaca pada
=405 nm. Intensitas warna yang terbentuk sebanding dengan kadar total glutation dalam
sampel (Gambar 10).54,55
Gambar 3.3. Prinsip pemeriksaan total glutation54
35
Universitas Indonesia
Pada pemeriksaan GSH tidak dilakukan penambahan glutation reduktase. Gugus tiol
dari GSH yang terdapat dalam sampel akan bereaksi dengan kromogen menghasilkan
kompleks warna yang dibaca pada =405 nm. Intensitas warna yang terbentuk sebanding
dengan kadar GSH dalam sampel.
Kadar GSSG dalam sampel diperoleh dengan melakukan pengurangan kadar total
glutation terhadap kadar GSH dalam sampel. Rasio GSH/GSSG diperoleh dengan membagi
kadar GSH dengan kadar GSSG dalam sampel.
3.13.2. Prosedur pembuatan homogenat hati
a. Jaringan hati ditimbang ± 40 mg dan ditambahkan 400 L MPA 5%.
b. Suspensi jaringan dihomogenisasi menggunakan pestel kaca selama 3 menit pada
suhu 4°C.
c. Homogenat dipindahkan ke dalam tabung Eppendrof dan disentrifugasi pada 4°C,
12000 rpm selama 15 menit.
d. Supernatan dipindahkan dalam tabung Eppendrof sebelum dilakukan pemeriksaan
total glutation.
3.13.3. Prosedur pemeriksaan rasio GSH/GSSG
Penetapan rasio GSH/GSSG ditentukan setelah dilakukan pengukuran kadar total
glutation dan kadar GSH terlebih dahulu.
Prosedur penetapan kadar total glutation adalah sebagai berikut:
a. Larutan stok GSSG (1 μM) dibuat dalam 0.5% MPA. Pengenceran larutan stok
GSSG dibuat setiap hari pengukuran untuk mendapatkan larutan standar GSSG
dengan 6 konsentrasi berbeda (blanko standar, 0.0156-0.5 M).
b. Secara berurutan, ditambahkan 25 L glutation reduktase, 25 L NADPH, 100 L
sampel/standar dan 50 L kromogen ke dalam masing-masing sumur, campur dan
serapan segera dibaca pada =405 nm setiap 1 menit selama 10 menit.
c. Kadar total glutation dalam sampel ditentukan dengan menggunakan kurva standar
GSSG dan hasil akhirnya dibagi dengan kadar protein homogenat sehingga
diperoleh kadar dengan satuan nmol/mg protein.
36
Universitas Indonesia
Prosedur penetapan kadar GSH adalah sebagai berikut:
a. Larutan stok GSH (1 μM) dibuat dalam akuabides. Pengenceran larutan stok GSH
dibuat setiap hari pengukuran untuk mendapatkan larutan standar GSH dengan 6
konsentrasi berbeda (blanko standar, (0.0156 - 0.5 M).
b. Secara berurutan, ditambahkan 25 L NADPH, 100 L sampel/standard dan 50 L
kromogen ke dalam masing-masing sumur, campur dan serapan segera dibaca pada
=405 nm.
c. Kadar GSH dalam sampel ditentukan dengan menggunakan kurva standar GSH dan
hasil akhirnya dibagi dengan kadar protein homogenat sehingga diperoleh kadar
dengan satuan nmol/mg protein.
.
3.14. Pemeriksaan TNF-α
3.14.1. Prinsip
Human TNF-α adalah protein nonglikosilasi dengan berat molekul 17.5 kDa dan
tersusun dari 157 asam amino. TNF-α disekresikan oleh makrofag, monosit, neutrofil, sel T
dan sel NK. TNF-α memegang peran penting dalam proses inflamasi, apoptosis dan
perkembangan sistem imun.56
Rat TNF-α ELISA kit digunakan untuk pemeriksaan kuantitatif TNF-α dalam cell
lysate atau jaringan. Pemeriksaan ini menggunakan antibodi spesifik untuk TNF-α tikus yang
di-coating pada 96 well plate. Antibodi tersebut akan berikatan dengan TNF-α yang terdapat
dalam sampel sehingga membentuk komplek antigen-antibodi. Kompleks tersebut akan
berikatan dengan antibodi sekunder (biotinylated anti-rat TNF-α). Selanjutnya, ke dalam
sumur ditambahkan enzim (HRP-conjugated streptavidin) yang akan berikatan dengan
biotinylated anti-rat TNF-α. Substrat HRP (TMB/3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine) yang
ditambahkan berikutnya akan dihidrolisis oleh enzim sehingga terbentuk warna yang
intensitasnya sebanding dengan jumlah TNF-α yang terikat. Penambahan stop solution pada
akhir prosedur akan mengubah warna dari biru menjadi kuning dan intensitas warna yang
terbentuk dibaca pada =450 nm.
37
Universitas Indonesia
3.14.2. Prosedur pembuatan homogenat pemeriksaan TNF-αa. Jaringan hati ditimbang ± 10 mg dan ditambahkan PBS/protease inhibitor ± 500
L (1:50).
b. Suspensi jaringan dihomogenisasi menggunakan pestel kaca kemudian homogenat
dipindahkan ke dalam tabung.
c. Homogenat dipindahkan ke dalam tabung Eppendrof dan disentrifugasi pada 4°C,
10000 g selama 5 menit.
d. Supernatan dipindahkan dalam tabung Eppendrof sebelum dilakukan pemeriksaan
TNF-α.
3.14.3. Prosedur pemeriksaan TNF-αa. Semua reagen dan sampel diletakkan pada suhu ruang (18-25°C) sebelum
digunakan.
b. Persiapan standar:
i. Larutan standar Rat TNF-α dibuat dengan cara menambahkan 400 μl dapar
pelarut sampel ke dalam 1 vial rekombinan rat TNF-α sehingga diperoleh
larutan standar TNF-α dengan konsentrasi 100 ng/mL (100000 pg/mL).
ii. Dapar pelarut sampel sebanyak 400 μL ditambahkan ke dalam 7 tabung yang
berbeda.
iii. Standar TNF-α sebanyak 100 μL ditambahkan ke dalam tabung pertama
sehingga diperoleh larutan stok standar konsentrasi 20000 pg/mL.
iv. Serial dilusi dilakukan dengan menggunakan larutan stok standar sehingga
diperoleh larutan standar TNF-α dengan 6 konsentrasi berbeda. Dapar pelarut
sampel digunakan sebagai standar 0 (0 pg/ml).
c. Standar atau sampel sebanyak 100 μL dimasukkan pada masing-masing sumur.
Sumur ditutup dan inkubasi selama 2.5 jam pada suhu kamar.
d. Cairan kemudian dibuang dan dicuci sebanyak 4 kali dengan wash solution.
Pencucian dilakukan dengan mengisi tiap sumur dengan 300 μl wash solution
pada setiap tahapnya. Cairan dibuang dari sumur dengan cara membalikkan plate
dan diketuk di atas tisu.
e. Biotinylated anti-rat TNF-α sebanyak 100 μL dimasukkan pada masing-masing
sumur, kemudian diinkubasi selama 1 jam pada suhu kamar dan digoyang secara
perlahan.
38
Universitas Indonesia
f. Cairan dibuang dan dilakukan prosedur pencucian sesuai tahap d.
g. Larutan HRP-conjugated streptavidin sebanyak 100 μL dimasukkan pada masing-
masing sumur, kemudian diinkubasi selama 45 menit pada suhu kamar dan
digoyang secara perlahan.
h. Cairan dibuang dan dilakukan prosedur pencucian sesuai tahap d.
i. TMB one step substrate reagen sebanyak 100 μL dimasukkan pada masing-
masing sumur, kemudian diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar dan
digoyang secara perlahan.
j. Stop solution sebanyak 50 μL ditambahkan pada masing-masing sumur, kemudian
serapan dibaca pada =450 nm.
k. Kadar TNF-α dalam sampel ditentukan dengan menggunakan kurva standar
TNF-α dan hasil akhirnya dibagi dengan kadar protein homogenat sehingga
diperoleh kadar dengan satuan pg/mg protein.
3.15. Pemeriksaan TGF-β1
3.15.1. Prinsip
Rat TGF-β ELISA kit berdasarkan prinsip sandwich ELISA. Antibodi spesifik TGF-
β1 tikus di-coating pada 96 well plate. Antibodi tersebut akan berikatan dengan TGF-β1 yang
terdapat dalam sampel sehingga membentuk komplek antigen-antibodi. Kompleks tersebut
akan berikatan dengan antibodi sekunder (biotinylated anti-rat TGF-β1). Selanjutnya, ke
dalam sumur ditambahkan enzim (HRP-conjugated streptavidin) yang akan berikatan dengan
biotinylated anti-rat TGF-β1. Substrat HRP (TMB/3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine) yang
ditambahkan berikutnya akan dihidrolisis oleh enzim sehingga terbentuk warna yang
intensitasnya sebanding dengan jumlah TGF-β1 yang terikat. Penambahan stop solution pada
akhir prosedur akan mengubah warna dari biru menjadi kuning dan intensitas warna yang
terbentuk dibaca pada =450 nm.
3.15.2. Prosedur pembuatan homogenat pemeriksaan TGF-β1a. Berbagai reagen yang perlu disiapkan untuk pembuatan dapar homogenat yaitu:
100 mM Tris, pH 7.4
150 mM NaCl
5 mM EDTA
2 mM natrium orthovanadate (Na3VO4)
39
Universitas Indonesia
1 mM natrium fluorida (NaF)
20 mM natrium pirofosfat (Na4P2O7)
b. Jaringan hati ditimbang ± 10 mg dan ditambahkan dapar homogenat/protease
inhibitor ± 600 L (1:60).
c. Suspensi jaringan dihomogenisasi menggunakan pestel kaca, kemudian
homogenat dipindahkan ke dalam tabung.
d. Pestel kaca dibilas dengan 200 L sebanyak 2 kali dan cairan hasil bilasan
tersebut dikumpulkan dalam 1 tabung yang sama dengan suspensi c.
e. Tabung digoyang menggunakan orbital shaker (120-150 rpm) pada suhu 4°C
selama 60 menit.
f. Homogenat disentrifugasi pada 4°C, 13000 rpm selama 20 menit
g. Supernatan dipindahkan dalam tabung Eppendrof sebelum dilakukan pemeriksaan
TGF-β1.
3.15.3. Prosedur pemeriksaan TGF-β1a. Persiapan standar:
i. Larutan standar Rat TGF-β1 dibuat dengan menambahkan 1 mL pelarut
sampel ke dalam 1 tabung 10 ng rat TGF-β1 sehingga diperoleh larutan
standar stok TGF-β1 dengan konsentrasi 10000 pg/mL.
ii. Disiapkan 7 tabung dan ke dalam tabung pertama ditambahkan 0.9 mL pelarut
sampel dan 0.1 mL larutan stok standar TGF-β1 (10000 pg/mL) sehingga
diperoleh larutan standar konsentrasi 1000 pg/mL.
iii. Tabung 2 sampai 6 ditambahkan dengan 0.25 mL pelarut sampel.
iv. Serial dilusi dilakukan dengan menggunakan larutan standar dari tabung
pertama (1000 pg/mL) sehingga diperoleh larutan standar TGF-β1 dengan 6
konsentrasi berbeda. Pelarut sampel digunakan sebagai standar 0 (0 pg/mL).
b. Standar dan sampel sebanyak 100 μL ditambahkan ke dalam masing-masing
sumur. Sumur ditutup dan inkubasi selama 1.5 jam pada suhu 37°C.
c. Setiap sumur diaspirasi dan dicuci 3 kali dengan wash solution. Pencucian
dilakukan dengan mengisi tiap sumur dengan 300 μL wash solution pada setiap
tahapnya. Cairan dihilangkan dari sumur dengan cara membalikkan plate dan
diketuk di atas tisu.
40
Universitas Indonesia
d. Biotinylated anti-rat TGF-β1 sebanyak 100 μL ditambahkan pada masing-masing
sumur, kemudian diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37°C.
e. Setiap sumur diaspirasi dan dilakukan prosedur pencucian sesuai tahap c.
f. Larutan HRP-conjugated streptavidin sebanyak 100 μL ditambahkan pada
masing-masing sumur, kemudian diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37°C.
g. Setiap sumur diaspirasi dan dilakukan prosedur pencucian sesuai tahap c sebanyak
5 kali.
h. TMB one step substrate reagen sebanyak 100 μL dimasukkan pada masing-
masing sumur, kemudian diinkubasi selama 15 menit pada suhu kamar.
i. Stop solution sebanyak 100 μL ditambahkan pada masing-masing sumur dan
dicampur. Serapan segera dibaca pada =450 nm.
j. Kadar TGF-β1 dalam sampel ditentukan dengan menggunakan kurva standar
TGF-β1 dan hasil akhirnya dibagi dengan kadar protein homogenat sehingga
diperoleh kadar dengan satuan pg/mg protein.
3.16. Analisis statistik
Seluruh nilai disajikan sebagai mean ± SD. Perbandingan antara enam kelompok
dianalisis menggunakan ANOVA satu arah dengan batas kemaknaan p < 0.05, bila hasil
bermakna maka akan dilanjutkan dengan analisis Post hoc (least significant difference).
Homogenisitas varians dan normalitas distribusi data dinilai terlebih dahulu menggunakan uji
Levene dan uji Kolmogorov Smirnov. Apabila data tidak homogen dan tidak menggambarkan
distribusi yang normal, selanjutnya dilakukan trasformasi data. Bila setelah ditransformasi
data tetap tidak terdistribusi normal dan tidak homogen, dilakukan uji non-parametrik
Kruskal-Wallis dengan batas kemaknaan yang sama. Bila bermakna maka akan dilanjutkan
dengan uji Mann-Whitney. Seluruh data dianalisis dengan menggunakan program SPSS 16.
41
BAB 4
HASIL PENELITIAN
Penelitian ini telah lulus uji etik dari Komisi Etik Fakultas Kedokteran Universitas
Indonesia pada tanggal 23 Desember 2013 Nomor 785/H2.F1/ETIK/2013.
4.1. Berat badan tikus
Selama 8 minggu prosedur suplementasi dan pemberian injeksi intraperitoneal
CCl4, kelompok CCl4 mengalami kecenderungan penurunan berat badan dibandingkan
kelompok normal, kelompok NAC maupun kelompok ekstrak air buah mahkota dewa.
Namun secara keseluruhan, perubahan berat badan yang terjadi tersebut relatif tidak
berbeda. Selain pengamatan terhadap berat badan tikus, juga dilakukan pengamatan
terkait kematian hewan coba pada setiap kelompok perlakuan. Kelompok T150
memiliki persentase kematian yang sama dengan kelompok CCl4 sebesar 28%,
sedangkan untuk kelompok NAC, T50 dan 100 tingkat kematian yang terjadi lebih
rendah sebesar 14%. Perubahan berat badan tikus dan persentase kematian pada
masing-masing kelompok disajikan pada Gambar 4.1 dan Tabel 3.
Gambar 4.1. Perubahan berat badan tikus selama 8 minggu perlakuan. N: Normal,CCl4: Karbon tetraklorida, NAC: N-acetylcysteine dosis 150 mg/kgBB/hari, T50, T100,T150: ekstrak air buah mahkota dewa dosis 50, 100 dan 150 mg/kgBB/hari.
220
240
260
280
300
320
340
360
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Ber
at b
adan
(gr
am)
Minggu ke-
N
CCl4+T100
CCl4+T50CCl4+NACCCl4+T150
CCl4
42
Universitas Indonesia
Tabel 3. Perubahan berat badan tikus dan persentase kematian hewan coba
KelompokBerat badan (gram) Rasio berat
hati/beratbadan
Persentasekematian
Awal Akhir N (n=5) 278.80 354.20 75.40 (↑) 2.92 0
CCl4 (n=5) 279.60 275.53 -4.07 (↓) 3.60 28.57
CCl4+NAC (n=5) 284.00 293.88 9.88 (↑) 3.10 14.29
CCl4+T50 (n=5) 281.20 294.56 13.36 (↑) 3.11 14.29
CCl4+T100 (n=5) 278.80 320.93 42.13 (↑) 3.10 14.29
CCl4+T150 (n=5) 275.60 287.72 12.12 (↑) 3.14 28.57Keterangan :N: Normal, CCl4: Karbon tetraklorida, NAC: N-acetylcysteine dosis 150 mg/kgBB/hari, T50,T100, T150: ekstrak air buah mahkota dewa dosis 50, 100 dan 150 mg/kgBB/hari.
Perubahan berat badan setiap minggunya untuk masing-masing hewan coba
terdapat di Lampiran 4.
4.2. Kadar protein homogenat hati
Pemeriksaan kadar protein homogenat jaringan hati dilakukan untuk
menentukan kadar MDA, rasio GSH/GSSG, TNF-α dan TGF-β, sehingga kadar
MDA, GSH dan GSSG dalam satuan nmol/mg protein, sedangkan kadar TNF-α dan
TGF-β dalam pg/mg protein. Kadar protein homogenat untuk masing-masing hewan
coba disertakan dalam Lampiran 5.
4.3. Aktivitas ALT, AST dan ALP
Pemberian injeksi intraperitoneal CCl4 meningkatkan aktivitas ALT dan AST
sebesar 3 kali dan aktivitas ALP sebesar 6 kali dibandingkan kelompok N. Pemberian
NAC maupun ekstrak air buah mahkota dewa T50, T100 dan T150 menurunkan
aktivitas ALT dan AST secara bermakna dibandingkan kelompok CCl4 (p<0.05) dan
mendekati kelompok N (p>0.05) (Gambar 4.2 dan 4.3). Pemberian NAC maupun
ekstrak air buah mahkota dewa T50, T100 dan T150 menurunkan aktivitas ALP
secara bermakna dibandingkan kelompok CCl4 (p<0.05), namun belum dapat
mendekati kelompok N (p<0.05) (Gambar 4.4)
43
Universitas Indonesia
N C C l4 C C l4 + N A C C C l4 + T 5 0 C C l4 + T 1 0 0 C C l4 + T 1 5 00
5 0
1 0 0
1 5 0 a
b
bb
b
Akt
ivita
s A
LT (U
/L)
Rerata 36.68 123.87 42.10 44.99 46.98 56.44SD 9.722 13.241 5.692 7.577 11.293 14.036
Gambar 4.2. Pengaruh CCl4, NAC dan ekstrak air buah mahkota dewaterhadap aktivitas enzim ALT plasma setelah 8 minggu perlakuan. Datadisajikan dalam rata-rata ± SD (n=5). N: Normal, CCl4: Karbon tetraklorida,NAC: N-acetylcysteine dosis 150 mg/ kgBB/hari, T50, T100, T150: ekstrak airbuah mahkota dewa dosis 50, 100 dan 150 mg/kgBB/hari.a = p < 0.05 vs kelompok N, b = p < 0.05 vs kelompok CCl4 setelah uji ANOVAyang dilanjutkan dengan multiple comparison uji Tukey pada α=0.05.
N C C l4 C C l4 + N A C C C l4 + T 5 0 C C l4 + T 1 0 0 C C l4 + T 1 5 00
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
2 5 0
a
b
bb
b
Akt
ivita
s A
ST (U
/L)
Rerata 54.28 173.54 55.21 55.77 65.09 69.12SD 6.202 18.799 14.774 12.193 9.556 12.513
Gambar 4.3. Pengaruh CCl4, NAC dan ekstrak air buah mahkota dewaterhadap aktivitas enzim AST plasma setelah 8 minggu perlakuan. Datadisajikan dalam rata-rata ± SD (n=5). N: Normal, CCl4: Karbon tetraklorida,NAC: N-acetylcysteine dosis 150 mg/kgBB/hari, T50, T100, T150: ekstrak airbuah mahkota dewa dosis 50, 100 dan 150 mg/kgBB/hari.a = p < 0.05 vs kelompok N, b = p < 0.05 vs kelompok CCl4 setelah uji ANOVAyang dilanjutkan dengan multiple comparison uji Tukey pada α=0.05.
44
Universitas Indonesia
N C C l4 C C l4 + N A C C C l4 + T 5 0 C C l4 + T 1 0 0 C C l4 + T 1 5 00
5 0 0
1 0 0 0
1 5 0 0
b
b
b
b
a
Ak
tivi
tas
AL
P (
U/L
)
Rerata 180.12 1050.00 461.15 626.30 712.13 782.71SD 13.158 66.782 56.417 59.719 61.904 66.248
Gambar 4.4. Pengaruh CCl4, NAC dan ekstrak air buah mahkota dewaterhadap aktivitas enzim ALP plasma setelah 8 minggu perlakuan. Datadisajikan dalam rata-rata ± SD (n=5). N: Normal, CCl4: Karbon tetraklorida,NAC: N-acetylcysteine dosis 150 mg/kgBB/hari, T50, T100, T150: ekstrak airbuah mahkota dewa dosis 50, 100 dan 150 mg/kgBB/hari.a = p < 0.05 vs kelompok N, b = p < 0.05 vs kelompok CCl4 setelah uji ANOVAyang dilanjutkan dengan multiple comparison uji Tukey pada α=0.05.
Aktivitas ALT, AST dan ALP hewan coba pada masing-masing kelompok dan
hasil analisis statistik disertakan dalam Lampiran 6, 7 dan 8.
4.4. Histopatologi hati
Hasil pewarnaan Masson’s trichrome menunjukkan bahwa pemberian injeksi
intraperitoneal CCl4 selama 8 minggu menyebabkan terbentuknya jaringan ikat di
hati. Hal ini ditunjukkan oleh persentase jaringan ikat yang meningkat secara
bermakna dibandingkan kelompok N (12.83 ± 1.332 vs 2.03 ± 1.236, p<0.05).
Pemberian NAC dan ekstrak air buah mahkota dewa (T50, T100 dan T150)
menurunkan persentase jaringan ikat secara bermakna dibandingkan kelompok CCl4
(p<0.05), namun belum dapat mendekati kelompok N (p<0.05) (Gambar 4.5 dan 4.6).
Persentase jaringan ikat hati hewan coba pada masing-masing kelompok dan
hasil analisis statistik disertakan dalam Lampiran 9.
45
Universitas Indonesia
N C C l4 C C l4 + N A C C C l4 + T 5 0 C C l4 + T 1 0 0 C C l4 + T 1 5 00
5
1 0
1 5 a
bb
b
bP
erse
ntas
e ja
ring
an ik
at (%
)
Rerata 2.03 12.83 6.67 8.28 8.55 9.46SD 1.236 1.332 1.626 2.517 1.139 2.021
Gambar 4.5. Pengaruh CCl4, NAC dan ekstrak air buah mahkota dewaterhadap persentase jaringan ikat hati setelah 8 minggu perlakuan. Datadisajikan dalam rata-rata ± SD (n=5). N: Normal, CCl4: Karbon tetraklorida, NAC:N-acetylcysteine dosis 150 mg/kgBB/hari, T50, T100, T150: ekstrak air buahmahkota dewa dosis 50, 100 dan 150 mg/kgBB/hari.a = p < 0.05 vs kelompok N, b = p < 0.05 vs kelompok CCl4 setelah uji ANOVAyang dilanjutkan dengan multiple comparison uji Tukey pada α=0.
46
Universitas Indonesia
Gambar 4.6. Gambaran histopatologi fibrosis hati setelah 8 minggu perlakuan denganpewarnaan Masson’s trichrome. Warna biru menunjukkan akumulasi jaringan ikat yangterjadi di sekitar cabang vena porta, cabang duktus biliaris dan cabang arteri hepatika.A. Kelompok Normal (2.03%). B. Kelompok CCl4 (12.83%). C. Kelompok CCl4+NAC(6.67%). D. Kelompok CCl4+T50 (8.28%). E. Kelompok CCl4+T100 (8.55%). F. KelompokCCl4+T150 (9.46%).N: Normal, CCl4: Karbon tetraklorida, NAC: N-acetylcysteine dosis 150 mg/kgBB/hari, T50,T100, T150: ekstrak air buah mahkota dewa dosis 50, 100 dan 150 mg/kgBB/hari.
A B
C D
E F
47
Universitas Indonesia
4.5. Kadar MDA homogenat hati
Pemberian injeksi intraperitoneal CCl4 selama 8 minggu meningkatkan kadar
peroksidasi lipid di jaringan hati. Hal ini ditunjukkan oleh kadar MDA yang
meningkat secara bermakna dibandingkan kelompok N (0,119 ± 0,0254 vs 0,039 ±
0,0097, p<0.05). Pemberian NAC dan ekstrak air buah mahkota dewa (T50, T100 dan
T150) menurunkan kadar MDA secara bermakna dibandingkan kelompok CCl4
(p<0.05) dan mendekati kelompok N (p>0.05) (Gambar 4.7).
Kadar MDA hewan coba pada masing-masing kelompok dan hasil analisis
statistik disertakan dalam Lampiran 10.
N C C l4 C C l4 + N A C C C l4 + T 5 0 C C l4 + T 1 0 0 C C l4 + T 1 5 00 .0 0
0 .0 5
0 .1 0
0 .1 5 a
bbbb
Kad
ar M
DA
(nm
ol/m
g pr
otei
n)
Rerata 0.039 0.119 0.049 0.050 0.051 0.054SD 0.0097 0.0254 0.0073 0.0074 0.0126 0.0145
Gambar 4.7. Pengaruh CCl4, NAC dan ekstrak air buah mahkota dewa terhadapkadar MDA hati setelah 8 minggu perlakuan. Data disajikan dalam rata-rata ± SD(n=5). N: Normal, CCl4: Karbon tetraklorida, NAC: N-acetylcysteine dosis 150mg/kgBB/hari, T50, T100, T150: ekstrak air buah mahkota dewa dosis 50, 100dan 150 mg/kgBB/hari.a = p < 0.05 vs kelompok N, b = p < 0.05 vs kelompok CCl4 setelah uji ANOVAyang dilanjutkan dengan multiple comparison uji Tukey pada α=0.05.
48
Universitas Indonesia
4.6. Rasio GSH/GSSG homogenat hati
Pemberian injeksi intraperitoneal CCl4 secara bermakna menurunkan rasio
GSH/GSSG dibandingkan kelompok N. Rasio GSH/GSSG pada kedua kelompok
tersebut secara berurutan adalah 0.49 ± 0.064 dan 1.72 ± 0.370 (p<0.05). Pemberian
NAC maupun ekstrak air buah mahkota dewa (T50, T100 dan T150) meningkatkan
rasio GSH/GSSG secara bermakna dibandingkan kelompok CCl4 (p<0.05) dan
hasilnya mendekati kelompok N (p>0.05) (Gambar 4.8).
N C C l4 C C l4 + N A C C C l4 + T 5 0 C C l4 + T 1 0 0 C C l4 + T 1 5 00 .0
0 .5
1 .0
1 .5
2 .0
2 .5
a
bbb
b
Ras
io G
SH/G
SSG
Rerata 1.72 0.49 1.83 1.42 1.42 1.41SD 0.370 0.064 0.303 0.383 0.322 0.298
Gambar 4.8. Pengaruh CCl4, NAC dan ekstrak air buah mahkota dewa terhadaprasio GSH/GSSG hati setelah 8 minggu perlakuan. Data disajikan dalam rata-rata ±SD (n=5). N: Normal, CCl4: Karbon tetraklorida, NAC: N-acetylcysteine dosis150 mg/kgBB/hari, T50, T100, T150: ekstrak air buah mahkota dewa dosis 50,100 dan 150 mg/kgBB/hari.a = p < 0.05 vs kelompok N, b = p < 0.05 vs kelompok CCl4 setelah uji ANOVAyang dilanjutkan dengan multiple comparison uji Tukey pada α=0.05.
Rasio GSH/GSSG hewan coba pada masing-masing kelompok dan hasil
analisis statistik disertakan dalam Lampiran 11.
49
Universitas Indonesia
4.7. Kadar TNF-α homogenat hatiPemberian injeksi intraperitoneal CCl4 selama 8 minggu meningkatkan kadar
TNF-α di jaringan hati. Hal ini ditunjukkan oleh kadar TNF-α yang meningkat secara
bermakna dibandingkan kelompok N (2324.35 ± 376.090 vs 1412.96 ± 224.345,
p<0.05). Pemberian NAC dan ekstrak air buah mahkota dewa (T50, T100 dan T150)
menurunkan kadar TNF-α secara bermakna dibandingkan kelompok CCl4 (p<0.05)
dan mendekati kelompok N (p>0.05) (Gambar 4.9).
N C C l4 C C l4 + N A C C C l4 + T 5 0 C C l4 + T 1 0 0 C C l4 + T 1 5 00
1 0 0 0
2 0 0 0
3 0 0 0 a
bbb
b
Kad
ar T
NF
(pg/
mg
prot
ein)
Rerata 1412.96 2324.35 1418.71 1440.95 1441.81 1475.56SD 224.345 376.090 135.235 281.052 379.674 187.178
Gambar 4.9. Pengaruh CCl4, NAC dan ekstrak air buah mahkota dewaterhadap kadar TNF-α homogenat hati setelah 8 minggu perlakuan. Datadisajikan dalam rata-rata ± SD (n=5). N: Normal, CCl4: Karbon tetraklorida,NAC: N-acetylcysteine dosis 150 mg/kgBB/hari, T50, T100, T150: ekstrak airbuah mahkota dewa dosis 50, 100 dan 150 mg/kgBB/hari.a = p < 0.05 vs kelompok N, b = p < 0.05 vs kelompok CCl4 setelah uji ANOVAyang dilanjutkan dengan multiple comparison uji Tukey pada α=0.05.
Kadar TNF-α hewan coba pada masing-masing kelompok dan hasil analisis
statistik disertakan dalam Lampiran 12.
50
Universitas Indonesia
4.8. Kadar TGF-β1 homogenat hatiPemberian injeksi intraperitoneal CCl4 selama 8 minggu meningkatkan kadar
TGF-β1 di jaringan hati. Hal ini ditunjukkan oleh kadar TGF-β1 yang meningkat
secara bermakna dibandingkan kelompok N (2515.68 ± 471.885 vs 492.45 ± 227.813,
p<0.05). Pemberian NAC dan ekstrak air buah mahkota dewa (T50, T100 dan T150)
menurunkan kadar TGF-β1 secara bermakna dibandingkan kelompok CCl4 (p<0.05)
(Gambar 4.10).
N C C l4 C C l4 + N A C C C l4 + T 5 0 C C l4 + T 1 0 0 C C l4 + T 1 5 00
1 0 0 0
2 0 0 0
3 0 0 0
4 0 0 0
a
b b bb
Kad
ar T
GF
(pg/
mg
prot
ein)
Rerata 492.45 2515.68 1696.69 1749.25 1795.35 1821.75SD 227.813 471.885 189.939 365.714 232.980 297.028
Gambar 4.10. Pengaruh CCl4, NAC dan ekstrak air buah mahkota dewaterhadap kadar TGF-β hati setelah 8 minggu perlakuan. Data disajikan dalamrata-rata ± SD (n=5). N: Normal, CCl4: Karbon tetraklorida, NAC: N-acetylcysteine dosis 150 mg/kgBB/hari, T50, T100, T150: ekstrak air buahmahkota dewa dosis 50, 100 dan 150 mg/kgBB/hari.a = p < 0.05 vs kelompok N, b = p < 0.05 vs kelompok CCl4 setelah uji ANOVAyang dilanjutkan dengan multiple comparison uji Tukey pada α=0.05.
Kadar TGF-β1 hewan coba pada masing-masing kelompok dan hasil analisis
statistik disertakan dalam Lampiran 13.
51
BAB 5
PEMBAHASAN
Studi ini merupakan studi non klinik yang didesain untuk mengetahui
efektivitas ekstrak air buah mahkota dewa dalam mencegah terjadinya fibrosis hati.
Penelitian ini dilatarbelakangi oleh tidak tersedianya obat standar untuk pencegahan
fibrosis hati dan pemanfaatan salah satu tanaman asli Indonesia, yaitu mahkota dewa
sebagai kandidat obat pencegah fibrosis hati.
Studi dilakukan dengan menggunakan CCl4 sebagai penginduksi fibrosis hati.
Pemilihan CCl4 didasarkan pada karakteristik CCl4 yang memberikan pola terjadinya
fibrosis seperti pada manusia, baik dari parameter biokimia, perubahan molekuler
maupun gambaran histopatologi.38 Pemberian CCl4 untuk induksi fibrosis hati dapat
dilakukan dengan injeksi intraperitoneal atau subkutan. Cháved E dkk5 menggunakan
tikus galur Wistar yang diinjeksi intraperitoneal CCl4 dosis 0.4 g/kgBB tiga kali per
minggu selama 8 minggu. Studi yang dilakukan oleh Wang dkk4 menggunakan galur
yang sama dan diinjeksi subkutan CCl4 dengan dosis awal 4 ml/kgBB kemudian
30 ml/kgBB, dan dilakukan dua kali per minggu selama 14 minggu. Fu dkk57
menggunakan galur Sprague-Dawley dan diinjeksi intraperitoneal CCl4 (0.1 ml/100
gBB) setiap 2 hari sekali selama 8 minggu. Hal ini menunjukkan belum adanya
standar model fibrosis hewan coba menggunakan CCl4. Berdasarkan hal tersebut,
maka dilakukan studi pendahuluan untuk memperoleh metode induksi fibrosis hati
yang tepat.
Studi pendahuluan dilakukan sesuai prosedur yang dilakukan oleh
Constandinou dkk38 dengan sedikit modifikasi. Pemilihan metode tersebut didasarkan
pada pemilihan cara pemberian CCl4 dengan injeksi intraperitoneal dan kesamaan
galur tikus yang akan digunakan dalam penelitian saat ini yaitu tikus galur Sprague-
Dawley. CCl4 diberikan secara injeksi intraperitoneal dosis 0.2 mL/100 gBB pada 2
minggu pertama dan dilanjukan dosis 0.1 mL/100 gBB sampai 8 minggu.38 Pemberian
CCl4 dilakukan dengan interval waktu 3 hari. Pemeriksaan histopatologi Masson’s
trichrome menunjukkan terbentuknya jaringan ikat setelah 8 minggu perlakuan.
Selanjutnya dilakukan studi utama dengan menggunakan metode tersebut di
atas. Studi dilakukan dengan membagi hewan coba dalam 6 kelompok. Semua
kelompok tikus percobaan mendapat makanan, minuman dan lingkungan
pemeliharaan yang sama.
52
Universitas Indonesia
Penelitian ini menggunakan NAC dosis 150 mg/kgBB sebagai pembanding
positif. Pemilihan NAC didasarkan pada mekanisme antioksidan NAC yang
berpotensi dalam mencegah fibrosis hati dan telah terbukti secara non klinik melalui
studi in vivo menggunakan model hewan coba yang diinduksi CCl4.9,45,46 Pemilihan
dosis NAC didasarkan pada studi non klinik dan studi klinik. Studi non klinik yang
dilakukan oleh Narasimhanaidu dkk45 menggunakan NAC dosis 150 mg/kgBB. Studi
klinik yang dilakukan oleh Khosbaten dkk10 menggunakan NAC dosis 600 mg setiap
12 jam selama 3 bulan dan hasilnya menunjukkan adanya perbaikan fungsi hati pada
pasien non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD).10 Dosis pada tikus tersebut
ekuivalen dengan dosis pada manusia.58 Berdasarkan hal tersebut maka digunakan
NAC dosis 150 mg/kgBB tikus.
Mahkota dewa mengandung berbagai senyawa seperti alkaloid dan flavonoid
yang memberikan efek antioksidan, antiinflamasi dan hepatoprotektif. Dengan adanya
efek tersebut diharapkan dapat berperan dalam proses pencegahan fibrosis hati.
Pemilihan dosis ekstrak air buah mahkota dewa didasarkan pada studi pendahuluan
secara in vivo. Hasil studi yang dilakukan oleh Nailufar dkk23 tersebut menunjukkan
bahwa ekstrak air buah mahkota dewa dosis 50 mg/kgBB memberikan efek
hepatoprotektif pada tikus yang diinduksi etanol selama 4 minggu. Berawal dosis
tersebut di atas, pada penelitian ini juga digunakan dosis yang lebih besar yaitu 100
mg/kgBB dan 150 mg/kgBB. Hal ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas ekstrak air
buah mahkota dewa sebagai pencegah fibrosis hati pada kisaran dosis 50 hingga 150
mg/kgBB.
Penilaian efektivitas obat uji maupun obat pembanding diperoleh melalui
pemeriksaan serum biomarker, aktivitas antioksidan dan histopatologi jaringan hati.
Secara umum, biomarker fibrosis diklasifikasikan menjadi 2 kelas yaitu kelas I
dan II.59,60
Kelas I merupakan biomarker serum langsung yang terkait proses fibrogenesis
dan terdapat di serum sebagai hasil peningkatan matriks ekstraselular. TGF-β dan
TNF-α adalah sitokin yang terkait langsung dengan fibrogenesis sehingga digunakan
sebagai biomarker fibrosis hati. Kelas II merupakan biomarker serum tidak langsung
dan umumnya berupa pemeriksaan laboratorium rutin fungsi hati. Serum ALT, AST,
ALP merupakan marker yang sensitif terkait cedera hati dan progresi penyakit
hati.59,60 Penilaian juga dilakukan terhadap aktivitas antioksidan ekstrak air buah
mahkota dewa yaitu melalui pemeriksaan penanda stres oksidatif (MDA dan rasio
53
Universitas Indonesia
GSH/GSSG). Pemeriksaan histopatologi merupakan gold standar untuk mengetahui
derajat fibrosis hati yang terjadi.59,60
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa pemberian CCl4 selama 8 minggu
meningkatkan aktivitas ALT, AST dan ALP di plasma dibandingkan kelompok
normal. Peningkatan aktivitas ALT dan AST menunjukkan terjadinya pelepasan
enzim dari jaringan hati ke sirkulasi darah yang disebabkan oleh kerusakan sel hati.
Peningkatan aktivitas ALP terjadi akibat adanya kolestasis, dan pada obstruksi intra
maupun ekstrabiliar enzim ini akan meningkat 3-10 kali dari nilai normal. ALT
merupakan enzim yang terdapat di dalam sitosol sel hati, AST terdapat di dalam
sitosol serta mitokondria sel hati, sel otot rangka, jantung dan ginjal, sedangkan ALP
terdapat dalam banyak jaringan terutama di hati, tulang dan mukosa usus.7,58,61,62
Peningkatan aktivitas enzim ALT, AST dan ALP lebih dari 2 kali lipat pada
hewan coba dianggap menunjukkan adanya kelainan.63,64 Dari penelitian ini
didapatkan bahwa pemberian CCl4 selama 8 minggu meningkatkan aktivitas ALT dan
AST 3 kali dibandingkan kelompok normal, sedangkan aktivitas ALP meningkat 6
kali dibandingkan kelompok normal (p<0.05). Hasil ini menunjukkan bahwa
pemberian CCl4 menyebabkan terjadinya kerusakan sel hati. Hasil ini sejalan dengan
penelitian yang dilakukan oleh Cháved E dkk,5 Morsy dkk,6 Demiroren dkk,9 dan Fu
dkk57 yang memberikan hasil berupa peningkatan aktivitas ALT, AST dan ALP antara
3 kali hingga 10 kali pada tikus yang menggunakan CCl4 sebagai penginduksi fibrosis
hati.
Pemberian NAC dosis 150 mg/kgBB dan ekstrak air buah mahkota dewa dosis
50, 100 dan 150 mg/kgBB dapat menurunkan aktivitas enzim ALT, AST dan ALP
secara bermakna dibandingkan kelompok CCl4. Penurunan aktivitas enzim ALT dan
AST pada pemberian ketiga dosis ekstrak air buah mahkota dewa tersebut dapat
mendekati kelompok normal dan sebanding dengan NAC. Penurunan aktivitas ALP
juga sebanding dengan NAC, walaupun belum dapat mendekati kelompok normal.
Hasil ini sejalan dengan penelitian yang dilakukan oleh Demiroren dkk9 dan
Kamalakkannan dkk45 yang menunjukkan bahwa penurunan aktivitas ketiga enzim
tersebut mendekati kelompok normal pada pemberian NAC. Secara keseluruhan,
penurunan aktivitas ALT, AST dan ALP mengindikasikan bahwa ekstrak air buah
mahkota dewa dapat melindungi sel hati akibat paparan CCl4 secara kronis.
54
Universitas Indonesia
Pemeriksaan secara akurat tingkat keparahan fibrosis hati merupakan hal
penting untuk menentukan rencana pengobatan yang akan diberikan dan respon
pasien terhadap terapi tersebut. Pada penelitian ini dilakukan pemeriksaan
histopatologi jaringan hati tikus, yaitu menggunakan teknik pewarnaan masson’s
trichrome yang bertujuan untuk mengidentifikasi jaringan ikat. Penilaian dilakukan
secara kuantitatif menggunakan imageJ yaitu dengan menghitung persentase jaringan
ikat (warna biru) yang terbentuk pada daerah periportal. Perhitungan dilakukan pada 5
lapang pandang untuk setiap hewan coba dan dilakukan secara tersamar.
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa pemberian CCl4 selama 8 minggu
menyebabkan terbentuknya jaringan ikat dengan persentase yang lebih besar
dibandingkan kelompok normal. Pemberian NAC dosis 150 mg/kgBB dan ekstrak air
buah mahkota dewa dosis 50, 100 dan 150 mg/kgBB dapat menurunkan persentase
jaringan ikat di hati walaupun belum dapat mendekati kelompok normal. Penurunan
persentase jaringan ikat pada pemberian ketiga dosis ekstrak air buah mahkota dewa
sebanding dengan kelompok NAC. Hal ini mengindikasikan adanya proses
penghambatan terjadinya fibrosis hati pada pemberian ekstrak air buah mahkota
dewa.
Penilaian terhadap parameter penanda fungsi hati dan histopatologi
memberikan hasil positif sehingga dilakukan pemeriksaan lebih lanjut untuk
mengetahui mekanisme kerja ekstrak air buah mahkota dewa dalam mencegah
terjadinya fibrosis hati. Hendra dkk15 melaporkan bahwa ekstrak etanol buah mahkota
dewa mengandung senyawa fenol dan flanovoid yang memiliki aktivitas antioksidan
dan antiinflamasi. Berdasarkan hal tersebut maka dilakukan penilaian terhadap
aktivitas antioksidan dan antiinflamasi ekstrak air buah mahkota dewa.
Penilaian aktivitas antioksidan ekstrak air buah mahkota dewa dilakukan
melalui pemeriksaan peroksidasi lipid dan rasio GSH/GSSG pada jaringan hati.
Peroksidasi lipid adalah penanda yang penting terhadap kerusakan jaringan karena
stres oksidatif dan dapat diimplikasikan sebagai penyebab fibrosis hati.
Malondialdehid (MDA) merupakan produk akhir peroksidasi lipid dan dikeluarkan
dari hepatosit ke dalam space of Disse.33 Pemeriksaan peroksidasi lipid in vivo secara
tidak langsung dapat dilakukan dengan mengukur kadar MDA, yaitu dengan uji asam
tiobarbiturat (TBA).
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa pemberian CCl4 selama 8 minggu
dapat meningkatkan meningkatkan kadar MDA dalam jaringan hati hingga 3 kali
55
Universitas Indonesia
dibandingkan kelompok normal. Hasil ini sejalan dengan penelitian yang dilakukan
oleh Cháved E dkk,5 Morsy dkk,6 Kamalakkannan dkk45 dan Pereira-Filho dkk46 yang
menggunakan CCl4 untuk menginduksi fibrosis hati pada tikus. Peningkatan kadar
MDA terjadi karena hasil metabolisme CCl4 berupa radikal triklorometil dan
triklorometilperoksi yang dapat menyerang lipid membran retikulum endoplasma
sehingga menyebabkan peroksidasi lipid dan akhirnya menginduksi kerusakan
membran sel, kerusakan struktur organel sel hati, degenerasi, nekrosis serta fibrosis
hati.41-43
Pemberian NAC dosis 150 mg/kgBB dan ekstrak air buah mahkota dewa dosis
50, 100 dan 150 mg/kgBB dapat menurunkan kadar MDA dalam jaringan hati hingga
mendekati kelompok normal. Penurunan kadar MDA pada pemberian ketiga dosis
ekstrak air buah mahkota dewa sebanding dengan kelompok NAC. Hasil ini sejalan
dengan penelitian yang dilakukan oleh Morsy dkk6 yang menunjukkan bahwa
penurunan kadar MDA tersebut mendekati kelompok normal pada pemberian NAC.
Kemampuan ekstrak air buah mahkota dewa dalam menurunkan kadar MDA dapat
disebabkan oleh aktivitas antioksidannya, yaitu kemampuan untuk melindungi
hepatosit terhadap radikal triklorometil dan triklorometilperoksi yang dihasilkan
akibat proses metabolisme CCl4.
Sel dalam tubuh memiliki serangkaian sistem penangkal (antioksidan) yang
berperan dalam meneutralisir efek negatif ROS, yaitu superoksida dismutase (SOD),
glutation peroksidase, glutation (GSH). GSH merupakan intraselular tripeptida yang
disintesa dari l-glutamate, l-sistein dan l-glisin, yaitu melalui 2 tahap reaksi yang
dikatalisis oleh enzim γ-glutamilsistein ligase dan glutation peroksidase. GSH
merupakan antioksidan non enzimatik yang dibutuhkan untuk menangkal terjadinya
stres oksidatif. 33,54,65
Dalam sel, glutation berada dalam bentuk tereduksi (GSH) dan teroksidasi
(GSSG). Pada sel dan jaringan sehat, lebih dari 90% glutation total berada dalam
bentuk GSH dan kurang dari 10% berada dalam bentuk GSSG. Dalam proses
oksidasi, GSH akan diubah menjadi glutation disulfida (GSSG). Mengukur rasio
GSH/GSSG pada model hewan coba dan membandingkannya dengan kelompok
kontrol merupakan cara terbaik untuk mengetahui potensi terapi suatu obat uji dalam
mempertahankan potensial redoks selular. Potensial redoks selular merupakan hal
yang kritikal pada fisiologi sel normal dan rasio GSH/GSSG merupakan indikator
terbaik untuk mengetahui potensial redoks tersebut.33,54,65
56
Universitas Indonesia
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa pemberian CCl4 selama 8 minggu
menurunkan rasio GSH/GSSG dalam jaringan hati hingga 3 kali dibandingkan
kelompok normal. Hasil ini sejalan dengan penelitian yang dilakukan oleh Cháved E
dkk5 dan Fu dkk58 yang menggunakan CCl4 untuk menginduksi fibrosis hati pada
tikus. Hal ini disebabkan karena pemberian CCl4 secara kronis menyebabkan
terjadinya peningkatan ROS, terutama radikal triklorometilperoksi. Gugus tiol pada
GSH akan dioksidasi oleh radikal triklorometilperoksi membentuk GSSG. Pada
paparan CCl4 kronis, peristiwa tersebut terjadi secara terus menerus sehingga
menyebabkan deplesi kadar GSH. Penurunan kadar GSH akan diikuti dengan
penurunan nilai rasio GSH/GSSG. Penurunan rasio GSH/GSSG tersebut
mengindikasikan terjadinya perubahan potensial redoks selular dan stres oksidatif,
yang pada akhirnya menyebabkan kerusakan struktur dan fungsi sel tubuh.54
Pemberian NAC dosis 150 mg/kgBB dan ekstrak air buah mahkota dewa dosis
50, 100 dan 150 mg/kgBB dapat meningkatkan rasio GSH/GSSG dalam jaringan hati
sehingga dapat mendekati kelompok normal. Peningkatan rasio GSH/GSSG pada
pemberian ketiga dosis ekstrak air buah mahkota dewa sebanding dengan kelompok
NAC. Peningkatan rasio GSH/GSSG pada penelitian ini mengindikasikan bahwa
ekstrak air buah mahkota dewa memiliki aktivitas antioksidan yaitu sebagai
penangkap ROS hasil metabolisme CCl4 yang dapat mengganggu sistem pertahanan
antioksidan.
TNF-α merupakan kunci utama yang berkontribusi dalam memicu kaskade
inflamasi yang melibatkan induksi sitokin setelah cedera hati. Ketika terjadi cedera
hati, sel Kupffer, makrofag dan neutrofil akan melepaskan TNF-α. Selain berperan
dalam menginduksi proliferasi hepatosit dan regenerasi hati, TNF-α juga berperan
sebagai mediator kematian hepatosit serta aktivasi HSC.33
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa pemberian CCl4 meningkatkan
secara bermakna kadar TNF-α dalam jaringan hati hingga 1,5 kali dibandingkan
kelompok normal. Hasil ini sejalan dengan penelitian yang dilakukan oleh Demiroren
dkk9 yang menunjukkan peningkatan kadar TNF-α hingga 2 kali pada tikus yang
menggunakan CCl4 untuk menginduksi fibrosis hati. Peningkatan kadar TNF-α
mengindikasikan terjadinya proses inflamasi akibat cedera hati kronis. Peran utama
TNF-α dalam fibrosis hati yaitu menginisiasi proses aktivasi HSC. Aktivasi HSC
menggambarkan tahap penting terjadinya fibrosis karena sel HSC merupakan sumber
utama ECM selama terjadinya cedera hati.9
57
Universitas Indonesia
Pemberian NAC dosis 150 mg/kgBB dan ekstrak air buah mahkota dewa dosis
50, 100 dan 150 mg/kgBB dapat menurunkan kadar TNF-α sehingga mendekati
kelompok normal. Penurunan kadar TNF-α pada pemberian ketiga dosis ekstrak air
buah mahkota dewa sebanding dengan kelompok NAC. Hasil ini sejalan dengan
penelitian yang dilakukan oleh Demoriren dkk9 yang menunjukkan bahwa penurunan
kadar TNF-α tersebut mendekati kelompok normal pada pemberian NAC. Hasil
penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak air buah mahkota dewa memiliki aktivitas
antiinflamasi. Adanya penurunan kadar TNF-α tersebut akan diikuti dengan
penurunan aktivasi HSC sehingga dapat menghambat terjadinya fibrosis hati. Hasil ini
sejalan dengan studi pendahuluan oleh Berlian dkk22 yang menunjukkan efek
hepatoprotektif ekstrak air buah mahkota dewa (Proliverenol) terjadi melalui down-
regulation NFkB-TNF-α-lipid peroksidasi.
Selain TNF-α, aktivasi HSC juga dikarenakan adanya TGF-β yang dilepaskan
oleh sel hepatosit yang rusak, sel Kuppfer yang teraktivasi, infiltrasi makrofag dan
neutrofil pada hati yang mengalami cedera. Peningkatan TGF-β dapat meningkatkan
produksi ROS oleh HSC, sementara peningkatan ROS tersebut akan mengaktivasi
HSC untuk memproduksi dan mensekresikan ROS serta TGF-β. Hal ini dikenal
sebagai stimulasi autokrin ROS dan TGF-β pada HSC. Peningkatan aktivasi HSC
tersebut berperan dalam proses akumulasi ECM akibat cedera hati.33
TGF-β superfamily terdiri dari berbagai multifungsional sitokin termasuk
TGF-β 1, 2, 3, activin dan bone morphogenic proteins (BMPs). TGF-β1 adalah
sitokin fibrogenik utama dan induser yang paling berperan dalam fibrosis, yaitu
pengaturan produksi, degradasi dan akumulasi ECM pada fibrosis hati.65
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa pemberian CCl4 meningkatkan kadar
TGF-β1 dalam jaringan hati hingga 5 kali dibandingkan kelompok normal. Hasil ini
sejalan dengan penelitian yang dilakukan oleh Cháved E dkk5 dan Galicia-Moreno
dkk67 yang menunjukkan peningkatan kadar TGF-β1 hingga 4 kali pada tikus yang
menggunakan CCl4 untuk menginduksi fibrosis hati. Peningkatan kadar TGF-β1
mengindikasikan terjadinya aktivasi HSC yang berperan dalam proses fibrogenesis
pada cedera hati kronis.
Pemberian NAC dosis 150 mg/kgBB dan ekstrak air buah mahkota dewa dosis
50, 100 dan 150 mg/kgBB dapat menurunkan kadar TGF-β1 dalam jaringan hati
walaupun belum dapat mendekati kelompok normal. Penurunan kadar TGF-β1 pada
pemberian ketiga dosis ekstrak air buah mahkota dewa sebanding dengan kelompok
58
Universitas Indonesia
NAC. Penurunan kadar TGF-β1 akan menyebabkan penurunan HSC yang teraktivasi
sehingga dapat menghambat terjadinya fibrosis hati. Berdasarkan hal tersebut
diketahui bahwa ekstrak air buah mahkota dewa memiliki aktivitas sebagai pencegah
fibrosis hati.
Berdasarkan pemeriksaan terhadap parameter biokimia diketahui bahwa
peningkatan dosis ekstrak air buah mahkota dewa tidak diikuti dengan penurunan
aktivitas enzim, penurunan kadar MDA, peningkatan rasio GSH/GSSG serta
penurunan kadar TNF-α dan TGF-β1. Hal ini ditunjukkan dari hasil penelitian,
dimana perbaikan parameter biokimia pada kelompok ekstrak air buah mahkota dewa
dosis 50 mg/kgBB relatif lebih baik dibandingkan dosis 100 dan 150 mg/kgBB,
walaupun secara statistik tidak berbeda bermakna. Hal ini dapat dikarenakan dosis
100 dan 150 mg/kgBB berada pada daerah plateu sehingga adanya peningkatan dosis
tidak diikuti dengan peningkatan aktivitas ekstrak air buah mahkota dewa.
Selain itu, senyawa fenolik yang terkandung dalam buah mahkota dewa juga
dapat berperan sebagai prooksidan pada kondisi tertentu seperti penggunaan dosis
tinggi atau adanya ion logam.68 Senyawa fenolik dapat berperan sebagai prooksidan
pada sistem yang mengandung ion logam. Dengan adanya oksigen, transisi ion metal
seperti Cu dan Fe akan mengkatalisis siklus redoks senyawa fenolik sehingga
menyebabkan terbentuknya radikal fenolik yang dapat merusak DNA, lipid membran
dan molekul biologi lainnya.69 Sebagai contoh, resveratrol, suatu senyawa fenolik,
diketahui bersifat prooksidan yang dapat menyebabkan kerusakan DNA. Mekanisme
yang mendasari hal tersebut yaitu adanya oksigen dan ion Cu2+ yang akan
mengoksidasi resveratrol sehingga membentuk radikal fenoksil yang dapat
menyebabkan kerusakan DNA.70 Radikal peroksil tersebut juga dapat menginduksi
peroksidasi lipid yang akhirnya menyebabkan kerusakan sel.71 Namun demikian,
untuk mengetahui aktivitas prooksidan ekstrak air buah mahkota dewa perlu
dilakukan penelitian lebih lanjut. Secara keseluruhan hasil yang diperoleh pada
pemberian ketiga dosis ekstrak air buah mahkota dewa tersebut memberikan hasil
yang sebanding dan dapat mendekati kelompok normal.
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak air buah mahkota dewa dapat
melindungi hepatosit dari cedera kronis akibat paparan CCl4. Hal ini terlihat melalui
penurunan aktivitas enzim penanda fungsi hati yaitu ALT, AST dan ALP. Hasil
positif terhadap parameter penanda fungsi hati tersebut dikonfirmasi lebih lanjut
dengan pemeriksaan histopatologi jaringan hati yang menunjukkan adanya penurunan
59
Universitas Indonesia
persentase jaringan ikat pada pemberian ekstrak air buah mahkota dewa. Hasil
tersebut mengindikasikan bahwa ekstrak air buah mahkota dewa berperan dalam
mencegah fibrosis hati.
Mekanisme kerja yang mendasari hal tersebut yaitu aktivitas antioksidan dan
antiinflamasi ekstrak air buah mahkota dewa. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa
ekstrak air buah mahkota dewa memiliki aktivitas antioksidan sehingga dapat
melindungi hepatosit terhadap kerusakan oksidatif yang diinduksi oleh CCl4, yaitu
ditandai dengan penurunan kadar MDA dan peningkatan rasio GSH/GSSG. Ekstrak
air buah mahkota dewa juga memiliki aktivitas antiinflamasi yang ditandai dengan
penurunan kadar TNF-α. Hal tersebut akan menghambat proses aktivasi HSC yang
berperan dalam proses fibrogenesis. Hambatan aktivasi HSC juga terlihat melalui
penurunan kadar TGF-β1. Secara keseluruhan, pemberian ekstrak air buah mahkota
dewa dapat memberikan perlindungan terhadap hepatosit serta menghambat proses
aktivasi HSC, sehingga tidak terjadi akumulasi ECM dan pada akhirnya mencegah
terjadinya fibrosis hati.
60
BAB 6
KESIMPULAN DAN SARAN
6.1. Kesimpulan
Berdasarkan hasil dari penelitian ini, maka disimpulkan hal-hal sebagai berikut:
1. Pemberian ekstrak air buah mahkota dewa dosis 50, 100 dan 150 mg/kgBB selama 8
minggu dapat melindungi sel hati tikus jantan yang diinduksi CCl4 yang ditandai
dengan penurunan aktivitas AST, ALT dan ALP.
2. Pemberian ekstrak air buah mahkota dewa dosis 50, 100 dan 150 mg/kgBB selama 8
minggu berperan dalam mencegah fibrosis hati pada tikus jantan yang diinduksi CCl4
yang ditandai dengan penurunan persentase jaringan ikat.
3. Pemberian ekstrak air buah mahkota dewa dosis 50, 100 dan 150 mg/kgBB selama 8
minggu dapat melindungi sel hati tikus jantan terhadap kerusakan oksidatif akibat
induksi CCl4 yang ditandai dengan penurunan kadar MDA dan peningkatan rasio
GSH/GSSG.
4. Pemberian ekstrak air buah mahkota dewa dosis 50, 100 dan 150 mg/kgBB selama 8
minggu dapat melindungi sel hati tikus terhadap kejadian inflamasi akibat induksi
CCl4 yang ditandai dengan penurunan kadar TNF-α.
5. Pemberian ekstrak air buah mahkota dewa dosis 50, 100 dan 150 mg/kgBB selama 8
minggu dapat menghambat proses fibrogenesis akibat induksi CCl4 yang ditandai
dengan penurunan kadar TGF-ß.
6.2. Saran
Mengingat adanya keterbatasan dan kekurangan dari penelitian ini, maka beberapa hal yang
perlu disarankan untuk penelitian selanjutnya adalah:
1. Penelitian untuk mengetahui potensi ekstrak air buah mahkota dewa dalam
menghambat aktivasi HSC melalui pemeriksaan sitokin IL-6, Angiotensin II, dan
alpha-smooth muscle actin (α-SMA).
2. Penelitian lebih lanjut untuk mengetahui aktivitas prooksidan ekstrak air buah
mahkota dewa menggunakan metode CUPRAC (Cupric Ion Reducing Antioxidant
Capacity)
3. Salah satu senyawa yang terkandung dalam ekstrak air buah mahkota dewa adalah
mangiferin, oleh karenanya perlu dilakukan penelitian dengan menggunakan
pembanding mangiferin.
61
DAFTAR PUSTAKA
1. Ramachandran P, Iredale JP. Reversibility of liver fibrosis. Ann Hepatol.2009;8:283-91.
2. Wallace K, Burt AD, Wright C. Liver fibrosis. Biochem J. 2008; 411: 1-183. Rockey DC, Friedman SL. Hepatic fibrosis and cirrhosis. In: Boyer TD, Wright
TL, Manns MP, editors. Zakim and Boyer's Hepatology. 5th ed. Philadelphia:Saunders Elsevier;2006.p.87-109.
4. Wang L, Cheng D, Wang H, Di L, Zhou X, Xu T. The hepatoprotective andantifibrotic effects of Saururus chinensis against carbon tertrachloride inducedhepatic fibrosis in rats. J of Ethnopharmacol. 2009;126:487-91.
5. Cháved E, Reyes-Gordillo K, Segovia J, Shibayama M, Tsutsumi V, Vergara P,Moreno MG, Muriel P. Resveratrol prevents fibrosis, NF-κB activation andTGF-β increases induced by chronic CCl4 treatment in rats. J Appl Toxicol.2008;28:35-43.
6. Morsy MA, Abdalla AM, Mahmoud AM, Abdelwahab SA, Mahmoud ME .Protective effects of curcumin, α-lipoic acid, and N-acetylcysteine againstcarbon tetrachloride-induced liver fibrosis in rats. J PhysiolBiochem. 2012;68:29-35.
7. Panjaitan RGP, Handharyani E, Chairul, Masriani, Zakiah Z, Manalu W.Pengaruh pemberian karbon tertraklorida terhadap fungsi hati dan ginjal tikus.Makara Kesehatan. 2007;11:11-6.
8. Maksimchik YZ, Lapshina EA, Sudnikovich EY, Zabrodskaya SV, ZavodnikIB. Protective effects of N-acetyl-L-cysteine against acute carbontetrachloride hepatotoxicity in rats. Cell Biochem Funct. 2008;26:11-8.
9. Demiroren K, Dogan Y, Kocamaz H, Ozercan IH, Ilhan S, Ustundag B, et al.Protective effects of L-carnitine, N-acetylcysteine and genistein in anexperimental model of liver fibrosis. Clin Res Hepatol Gastroenterol. 2014;38:63-72.
10. Khoshbaten M, Aliasgarzadeh A, Masnadi K, Tarzamani MK, Farhang S,Babaei H, et al. N-acetylcysteine improves liver function in patients with non-alcoholic fatty liver disease. Hepat Mon. 2010;10:12-6.
11. Harmanto N. Mahkota Dewa, Obat Pusaka Para Dewa. Jakarta: AgromediaPustaka; 2003. hal.19.
12. Widowati L. Kajian hasil penelitian mahkota dewa. Jurnal Bahan AlamIndonesia. 2005;4:223-7.
13. Simanjuntak P. Identifikasi senyawa kimia dalam buah mahkota dewa (Phaleriamacrocarpa). Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia. 2008;6:23-8.
14. Kim WJ, Veriansyah B, Lee YW, Kim J, Kim JD. Extraction of mangiferinfrom mahkota dewa (Phaleria macrocarpa) using subcritical water. J Ind EngChem. 2010;16:425-30.
15. Hendra R, Ahmad S, Oskoueian, Sukari A, Shukor MY. Antioxidant, anti-inflammatory and cytotoxicity of Phaleria macrocarpa (Boerl.) Scheff fruit.BMC Complement Altern Med. 2011;11:2-10.
16. Dewoto HR, Mariyana Y, Arif A. Uji efek hipoglikemik ekstrak daging buahmahkota dewa [Phaleria marcocarpa (Scheff) Boerl.] pada kelinci,dibandingkan glibenklamid. Jurnal Bahan Alam Indonesia. 2006;6:20-3.
62
Universitas Indonesia
17. Yanti AR, Widayanti, Ringoringo VS. Uji efek antihipertensi ekstrak etanoldaging buah mahkota dewa [Phaleria marcocarpa (Scheff) Boerl.] pada tikusputih jantan. Jurnal Bahan Alam Indonesia. 2010;7:63-7.
18. Sulistianto DE, Harini M, Handajani NS. The effect of Phaleria macrocarpa(Scheff) Boerl fruits extract on the histological structure of white rat (Rattusnorvegicus L.) liver after orally carbon tetrachloride (CCl4) exposure. Biosmart.2004;6:91-8.
19. Gotama IBI, Sugiarto S, Nurhadi M, Widiyastuti Y, Wahyono S, Prapti IJ.Inventaris Tanaman Obat Indonesia. Jilid V. Jakarta: Departemen KesehatanBadan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan;1999.hal.147-8.
20. Simanjuntak P. Identifikasi senyawa kimia dalam buah mahkota dewa (Phaleriamacrocarpa). Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia. 2008;6:23-28.
21. Stoilova I, Jirovetz L, Stoyanova A, Krastanov A, Gargova S, Ho L.Antioxidant activity of the polyphenol mangiferin. J Environ Agr Food Chem.2008;7:2706-16.
22. Berlian G, Tandrasasmita M, Tjandrawinata R. Bioactive fractionDLBSProliverenol possess hepatoprotective activity via antiinflammation, DNArepair and antiapoptosis activities. Unpublished report. DLBS. 2013:1-10.
23. Nailufar F, Kristiana H, Hardadi P, Sinambela J, Tjandrawinata R.Hepatoprotective effect: Cell toxicity, pharmacodynamic and antioxidant ofbioactive fraction DLBS1433.Unpublished report. DLBS. 2013:1-10.
24. Ramadori G, Moriconi F, Malik I, Dudas J. Physiology and pathophysiologyof liver inflammation, damage and repair. J Physiol Pharmacol. 2008;59:107-17.
25. Fan GG, Steer CJ. Cellular Biology of the Normal Liver. In: Bacon BR,O’Grady JG Bisceglie, Adrian MDi, Lake JR, ed. Comprehensive ClinicalHepatology. 2nd ed. Philadelphia: Elsevier Limited; 2006.p.17-41.
26. Portmann BC. Development and Anatomy of the Normal Liver. In: Bacon BR,O’Grady JG Bisceglie , Adrian MDi, Lake JR, editors. Comprehensive ClinicalHepatology. 2nd ed. Philadelphia: Elsevier Limited; 2006.p.1-15.
27. Crawford JM, Liu C. Liver and Biliary Tract. In: Robbins SL, Kumar V, CotranRS, editors. Robbins and Cotran Pathologic Basis of Disease. 8th ed.Philadelphia: Saunders Elsevier; 2010.p.833-90.
28. Luxon BA. Functions of the Liver. In: Bacon BR, O’Grady JG Bisceglie,Adrian MDi, Lake JR, editors. Comprehensive Clinical Hepatology. 2nd ed.Philadelphia: Elsevier Limited; 2006.p.43-59.
29. Ghany M, Hoofnagle JH. Approach to the patient with liver disease. In: LongoDL, Fauci AS, editors. Harrison’s Gastroenterology and Hepatology. 17th ed.New York: McGraw-Hill; 2010.p.322-31.
30. Rockey DC. Advances in translational science: Translating an understanding ofthe pathogenesis of hepatic fibrosis to novel therapies. Clin GastroenterolHepatol. 2013;11:224-31.
31. Ahmad A, Ahmad R. Understanding the mechanism of hepatic fibrosis andpotential therapeutic approaches. Saudi J Gastroenterol. 2012;18:155-67.
32. Bataller R, Brenner DA. Liver fibrosis. J Clin Invest. 2005;115:209–18.33. Shimizu I, Shimamoto N, Saiki K, Furujo M, Osawa K. Lipid peroxidation in
hepatic fibrosis. In: Catala A, editor. Lipid peroxidation. Rijeka. Intech; 2012.p.483-92.
34. De-Minicis S, Marzioni M, Saccomanno S, Rychlicki C, Agostinelli L, TrozziL, et al. Cellular and molecular mechanisms of hepatic fibrogenesis leading toliver cancer. Transl Gastrointest Cancer. 2012;1:88-94.
63
Universitas Indonesia
35. Cohen-Naftaly M, Friedman SL. Current status of novel antifibrotic therapies inpatients with chronic liver disease. Therap Adv Gastroenterol. 2011;4:391-417.
36. Lotersztajn S, Julien B, Teixeira-Clerc F, Grenard P, Mallat A. Hepatic fibrosis:molecular mechanisms and drug targets. Annu Rev Pharmacol Toxicol.2005;45:605–28.
37. Mormone E, George J, Nieto N. Molecular pathogenesis of hepatic fibrosis andcurrent therapeutic approaches. Chem Biol Interact. 2011;193:225–31.
38. Constandinou C, Henderson N, Iredale JP. Modeling liver fibrosis in rodents.Methods in Molecular Medicine. 2005;117:237-50.
39. Jang JH, Kang KJ, Kim YH, Kang YN, Lee IS. Reevaluation of experimentalmodel of hepatic fibrosis induced by hepatotoxic drugs: an easy, applicable, andreproducible model. Transplant Proc. 2008;40:2700-3.
40. Liedtke C, Luedde T, Sauerbruch T, Scholten D, Streetz K, Tacke F, et al.Experimental liver fibrosis research: update on animal models, legal issues andtranslational aspects. Fibrogenesis Tissue Repair. 2013;6:19.
41. Hayashi H, Sakai T. Animal models for the study of liver fibrosis: new insightsfrom knockout mouse models. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2011;300:G729-38.
42. Farber JL, Gerson RJ. Mechanisms of cell injury with hepatotoxic chemicals.Pharmacol Rev. 1984;36:71S-75S.
43. Li L, Hu Z, Li W, Hu M, Ran J, Chan P, et al. Establishment of a standardizedliver fibrosis model with different pathological stages in rats. Gastroenterol ResPract. 2012;2012:1-6.
44. Galicia-Moreno M, Rodríguez-Rivera A, Reyes-Gordillo K, Segovia J,Shibayama M, Tsutsumi V, Vergara P, et al. N-acetylcysteine prevents carbontetrachloride-induced liver cirrhosis: role of liver transforming growth factor-beta and oxidative stress. Eur J Gastroenterol Hepatol. 2009;21:908-14.
45. Kamalakkannan N, Rukkumani R, Aruna K, Varma PS, Viswanathan P, MenonVP. Protective effect of N-acetyl cysteine in carbon tetrachloride-inducedhepatotoxicity in rats. Iranian J Pharmacol Ther. 2005;4:118-23.
46. Pereira-Filho G, Ferreira C, Schwengber A, Marroni C, Zettler C, Marroni N.Role of N-acetylcysteine on fibrosis and oxidative stress in cirrhotic rats. ArqGastroenterol. 2008;45:156-62.
47. de Oliveira CP, Stefano JT, de Siqueira ER, Silva LS, de Campos Mazo DF,Lima VM, et al. Combination of N-acetylcysteine and metformin improveshistological steatosis and fibrosis in patients with non-alcoholic steatohepatitis.Hepatol Res. 2008;38:159-65.
48. Liu X, Hu H, Yin JQ. Therapeutic strategies against TGF-beta signalingpathway in hepatic fibrosis. Liver Int. 2006;26:8-22.
49. Faried A, Kurnia D, Faried L, Usman N, Miyazaki T, Kato H et.al. Anticancereffects of gallic acid isolated from Indonesian herbal medicine, Phaleriamacrocarpa (Scheff.) Boerl, on human cancer cell lines. Int J Oncol.2007;30:605.
50. Sukandar EY, Sigit JI, Adnyana IK. Uji Toksisitas Akut Sediaan DLBS 1433PT. Dexa Medica. Final report (unpublished). DLBS. 2012.
51. Sukandar EY, Sigit JI, Adnyana IK. Uji Toksisitas Subkronis Sediaan DLBS1433 PT. Dexa Medica. Final report (unpublished). DLBS. 2012.
64
Universitas Indonesia
52. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramquantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. AnalBiochem. 1976;72:248-54.
53. Gridley MF. Manual of Histologic and Special Staining Technics. 2nd ed. NewYork: McGraw-Hill;1960.p.63-4.
54. Owen JB, Butterfield DA. Measurement of oxidized/reduced glutathione ratio.Methods Mol Biol. 2010;648:269-77.
55. Rahman I1, Kode A, Biswas SK. Assay for quantitative determination ofglutathione and glutathione disulfide levels using enzymatic recycling method(Abstract). Nat Protoc. 2006;1:3159-65
56. Brouckaert P, Libert C, Everaerdt B, Takahashi N, Cauwels A, Fiers W. Tumornecrosis factor, its receptors and the connection with interleukin 1 andinterleukin 6 (Abstract). Immunobiology. 1993;187:317-29.
57. Fu Y, Zheng S, Lin J, Ryerse J, Chen A. Curcumin protects the rat liver fromCCl4-caused injury and fibrogenesis by attenuating oxidative stress andsuppressing inflammation. Mol Pharmacol. 2008;73:399-409.
58. Reagen-Shaw S, Nihal M, Ahmad N. Dose translation from animal to humanstudies revisited. FASEB J. 2007;22:659-61.
59. Cohen-Naftaly M, Friedman SL. Current status of novel antifibrotic therapies inpatients with chronic liver disease. Therap Adv Gastroenterol. 2011;4:391-417.
60. Liu T, Wang X, Karsdal MA, Leeming DJ, Genovese F. Molecular serummarkers of liver fibrosis. Biomark Insights. 2012;7:105-17.
61. Boone L, Meyer D, Cusick P, Ennulat D, Bolliger AP, Everds N, et al.Selection and interpretation of clinical pathology indicators of hepatic injury inpreclinicalstudies. Vet Clin Pathol. 2005;34:182-8.
62. Ennulat D, Walker D, Clemo F, Magid-Slav M, Ledieu D, Graham M.Effects of hepatic drug-metabolizing enzyme induction on clinical pathologyparameters in animals and man. Toxicol Pathol. 2010;38:810-28.
63. Johnson-Delaney CA. Small rodents. In: Exotic Companion MedicineHandbook for Veterinarians. Florida: Zoological Education Network;2008.p.2-47.
64. Smith JB, Mangkoewidjojo S. Pemeliharaaan, Pembiakan dan PenggunaanHewan Percobaan di Daerah Tropis. Jakarta: UI Press;1988.hal.39.
65. El-Beshbishy HA, Tork OM, El-Bab MF, Autifi MA. Antioxidant andantiapoptotic effect of green tea polyphenols against azathioprine-induced liverinjury in rats. Pathophysiology. 2011;18:125-35.
66. Cong M, Iwaisako K, Jiang C, Kisseleva T. Cell signals influencing hepaticfibros. Int J Hepatol. 2012;2012:1-18.
67. Galicia-Moreno M, Rodríguez-Rivera A, Reyes-Gordillo K, Segovia J,Shibayama M, Tsutsumi V, et al. N-acetylcysteine prevents carbon tetrachlorideinduced liver cirrhosis: role of liver transforming growth factor beta andoxidative stress. Eur J Gastroenterol Hepatol. 2009;21:908-14.
68. Yordi EG, Pérez EM, Matos MJ, Villares EU. Antioxidant and Pro-OxidantEffects of Polyphenolic Compounds and Structure-Activity RelationshipEvidence. In: Catala A, editor. Lipid Peroxidation. Rijeka: Intech; 2012.p.23-48.
69. Kyselova Z. Toxicological aspects of the use of phenolic compound in diseaseprevention. Interdiscip Toxicol. 2011;4:173-83.
65
Universitas Indonesia
70. de la Lastra CA, Villegas I. Resveratrol as an antioxidant and pro-oxidant agent: mechanisms and clinical implications. Biochem Soc Trans. 2007;35:1156-60.
71. Sakihama Y, Cohen MF, Grace SC, Yamasaki H. Plant phenolic antioxidant andprooxidant activities: phenolics-induced oxidative damage mediated by metalsin plants (abstract). Toxicology. 2002;177:67-80.
66
Universitas Indonesia
Lampiran 1
Keterangan Lolos Kaji Etik
67
Universitas Indonesia
Lampiran 2
Sertifikat Analisis
Ekstrak Air Buah Mahkota Dewa (DLBS Proliverenol)
68
Universitas Indonesia
Lampiran 3
Perhitungan Parameter Penilaian
1. Perhitungan kadar protein homogenat hati
Kadar protein dihitung berdasarkan intrapolasi absorbans sampel terhadap
kurva standar protein BSA. Persamaan linier kurva standar BSA yaitu:y = a + bxdi mana:
y = nilai absorbans standar BSA
x = kadar standar BSA (μg/mL)
a = intercept kurva standar BSA
b = slope kurva standar BSA
Perhitungan kadar protein dalam sampel yaitu:
di mana:
x = kadar protein sampel berdasarkan kurva standar (μg/mL)
df = faktor pengenceran sampel
Contoh perhitungan:
y = 0.0008x + 0.0153r = 0.9978
0.0000.1000.2000.3000.4000.5000.6000.7000.8000.900
0 200 400 600 800 1000 1200
Abs
orba
nsi
Konsentrasi standar protein (μg/mL)
Kurva standar protein
( / ) = x. df1000
69
Universitas Indonesia
Persamaan yang diperoleh sesuai kurva standar:= ( − 0.0153)/0.0008Berdasarkan penelitian diketahui:
Absorbsi (A) blanko = 0.431
A sampel = 0.561
df = 1000x
maka:
y = A sampel – A blanko = 0.561 – 0.431 = 0.130
Nilai x = (0.130 - 0.0153) / 0.0008 =143.38 g/mLKadar protein dalam sampel = 143.38 x 10001000 = 143.38 mg/mL2. Perhitungan kadar MDA hati
Kadar MDA dihitung berdasarkan intrapolasi absorbans sampel terhadap
kurva standar MDA (1,1,3,3-TEMP). Persamaan linier kurva standar MDA yaitu:y = a + bxdi mana:
y = nilai absorbans standar MDA
x = kadar standar MDA (nmol/mL)
a = intercept kurva standar MDA
b = slope kurva standar MDA
Perhitungan kadar MDA dalam sampel yaitu:
di mana:
x = kadar MDA berdasarkan kurva standar (nmol/mL)
df = faktor pengenceran sampel
Cp = kadar protein sampel (mg/mL)
( / ) = x. dfCp
70
Universitas Indonesia
Contoh perhitungan:
Persamaan yang diperoleh sesuai kurva standar:= ( − 0.0057)/0.1046Berdasarkan penelitian diketahui:
Absorbsi (A) blanko = 0.0043
A sampel = 0.0179
df = 55x
Kadar protein sampel = 143.38 mg/mL
maka:
y = A sampel – A blanko = 0.0179 – 0.0043 = 0.0136
Nilai x = (0.0136 - 0.0057) / 0.1046 = 0.0755 nmol/mLKadar MDA sampel = 0.0755 x 55143.38 = 0.030 nmol/mg protein3. Perhitungan kadar total glutation, GSH dan rasio GSH/GSSG hati
3.1. Perhitungan kadar total glutation
Kadar total glutation dihitung berdasarkan intrapolasi absorbans sampel
terhadap kurva standar GSSG. Persamaan linier kurva standar GSSG yaitu:y = a + bxdi mana:
y = selisih nilai absorbansi standar GSSG/menit pengukuran
A/min =
y = 0.1046x + 0.0057r = 0.9998
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
Abs
orba
nsi
Konsentrasi Standar MDA (nmol/mL)
Kurva Standar MDA
71
Universitas Indonesia
x = kadar standar GSSG (μM)
a = intercept kurva standar GSSG
b = slope kurva standar GSSG
Perhitungan kadar GSSG dalam sampel yaitu:
di mana:
x = kadar GSSG berdasarkan kurva standar (μM)
df = faktor pengenceran sampel
v = volume sampel (mL)
Cp = kadar protein sampel (mg/mL)
Contoh perhitungan:
Persamaan yang diperoleh sesuai kurva standar:= ( − 0.0004)/0.0303Berdasarkan penelitian diketahui:
A blanko = 0.022
A sampel = 0.272
y (A/min sampel) = 0.272-0.022 / 10 = 0.025
df = 1000x
v = 0.1 mL
Kadar protein sampel = 116.50 mg/mL
y = 0.0303x + 0.0004r = 0.9935
00.0020.0040.0060.008
0.010.0120.0140.0160.018
0.0000 0.1000 0.2000 0.3000 0.4000 0.5000 0.6000
Abs
orba
nsi
Konsentrasi standar GSSG (μM)
Kurva Standar GSSG
( / ) = x. dfv. Cp
72
Universitas Indonesia
maka:
Nilai x = (0.025- 0.0004) / 0.0303 = 0.81188 μMKadar total glutation dalam sampel = 0.81188 x 10000.1 x 116.50 = 69.69 nmol/mg protein3.2. Perhitungan kadar GSH hati
Kadar GSH dihitung berdasarkan intrapolasi absorbans sampel terhadap kurva
standar GSH. Persamaan linier kurva standar GSH yaitu:
di mana:
y = nilai absorbans standar GSH
x = kadar standar GSH (μM)
a = intercept kurva standar GSH
b = slope kurva standar GSH
Perhitungan kadar GSH dalam sampel yaitu:
di mana:
x = kadar GSH berdasarkan kurva standar (μM)
df = faktor pengenceran sampel
v = volume sampel (mL)
Cp = kadar protein sampel (mg/mL)
Contoh perhitungan:
y = 4.0398x - 0.0125r = 0.9995
0
0.5
1
1.5
2
2.5
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
Abs
orba
nsi
Konsentrasi standar GSH (μM)
Kurva Standar GSH
y = a + bx
( / ) = x. dfv. Cp
73
Universitas Indonesia
Persamaan yang diperoleh sesuai kurva standar:= ( + 0.0125)/4.0398Berdasarkan penelitian diketahui:
A blanko = 0.104
A sampel = 0.328
y = 0.328 - 0.104 = 0.224
df = 5000x
v = 0.1 mL
Kadar protein sampel = 116.50 mg/mL
maka:
Nilai x = (0.224 + 0.0125) / 4.0398 = 0.0585 μMKadar GSH sampel = 0.0585 x 50000.1 x 116.50 = 25.11 nmol/mg protein3.3. Perhitungan rasio GSH/GSSG
Kadar GSSG (nmol/mg protein) = [kadar total glutation – kadar GSH] / 2
Contoh perhitungan:
Berdasarkan penelitian diketahui:
Kadar total glutation sampel = 69.69 nmol/mg protein
Kadar GSH sampel = 25.11 nmol/mg protein
Kadar GSSG = [69.69 – 25.11] / 2 = 22.29= 25.1122.29 = 1.13
/ = Kadar GSHKadar GSSG
74
Universitas Indonesia
4. Perhitungan kadar TNF-α hati
Kadar TNF-α dihitung berdasarkan intrapolasi absorbans sampel terhadap
kurva standar TNF-α. Persamaan linier kurva standar TNF-α yaitu:
di mana:
y = nilai absorbans standar TNF-α
x = kadar standar TNF-α (pg/mL)
a = intercept kurva standar TNF-α
b = slope kurva standar TNF-α
Perhitungan kadar TNF-α dalam sampel yaitu:
di mana:
x = kadar TNF-α berdasarkan kurva standar (pg/mL)
df = faktor pengenceran sampel
Cp = kadar protein sampel (mg/mL)
Contoh perhitungan:
Persamaan yang diperoleh sesuai kurva standar:= ( − 0.0685)/0.0007
y = 0.0007x + 0.0685r = 0.9942
00.20.40.60.8
11.21.41.61.8
0 500 1000 1500 2000 2500
Abs
orba
nsi
Konsentrasi standar TNF-α (pg/mL)
Kurva standar TNF-α
y = a + bx
TNF − α ( / ) = x. dfCp
75
Universitas Indonesia
Berdasarkan penelitian diketahui:
A blanko = 0.08
A sampel = 0.690
df = 250x
Kadar protein sampel = 134.63 mg/mL
maka:
y = A sampel – A blanko = 0.690 – 0.08 = 0.61
Nilai x = (0.61 - 0.0685) / 0.0007 = 773.57 pg/mLKadar TNF − α sampel = 773.57 x 250134.63 = 1436.47 pg/mg protein5. Perhitungan kadar TGF-β1 hati
Kadar TGF-β1dihitung berdasarkan intrapolasi absorbans sampel terhadap
kurva standar TGF-β1. Persamaan linier kurva standar TGF-β1 yaitu:
di mana:
y = nilai absorbans standar TGF-β1
x = kadar standar TGF-β1 (pg/mL)
a = intercept kurva standar TGF-β1
b = slope kurva standar TGF-β1
Perhitungan kadar TGF-β1 dalam sampel yaitu:
di mana:
x = kadar TGF-β1 berdasarkan kurva standar (pg/mL)
df = faktor pengenceran sampel
Cp = kadar protein sampel (mg/mL)
y = a + bx
TGF − β1 ( / ) = x. dfCp
76
Universitas Indonesia
Contoh perhitungan:
Persamaan yang diperoleh sesuai kurva standar:= ( − 0.0173)/0.0013Berdasarkan penelitian diketahui:
A blanko = 0.13
A sampel = 0.476
df = 750x
Kadar protein sampel = 93.10 mg/mL
maka:
y = A sampel – A blanko = 0.476 – 0.13 = 0.346
Nilai x = (0.346 - 0.0173) / 0.0013 = 252.85 pg/mLKadar TGF − β1 sampel = 252.85 x 75093.10 = 2036.92 pg/mg protein
y = 0.0013x + 0.0173r= 0.9975
0.0000.1000.2000.3000.4000.5000.6000.700
0 100 200 300 400 500 600
Abs
orba
nsi
Konsentrasi standar TGF-β1 (pg/mL)
Kurva standar TGF-β1
77
Universitas Indonesia
Lampiran 4
Berat Badan Tikus
1. Perubahan berat badan tikus setiap minggu
Kelompok TikusMinggu ke-
1 2 3 4 5 6 7 8
N 1 299.33 309.00 306.33 309.00 315.67 326.33 332.00 330.00
2 311.33 320.00 323.00 330.00 345.33 358.00 372.00 381.33
3 258.67 266.33 272.33 281.00 279.33 293.67 297.67 305.67
4 272.67 297.00 317.00 331.67 343.67 360.33 374.33 387.67
5 279.33 301.67 319.67 336.33 288.33 362.00 367.33 366.33
Rerata 284.27 298.80 307.67 317.60 314.47 340.07 348.67 354.20
SD 21.06 20.12 20.71 23.00 30.51 29.81 33.28 35.16
CCl4 1 261.33 297.67 296.00 293.67 294.33 292.00 290.33 276.33
2 234.00 281.00 292.00 297.00 295.33 299.33 305.00 312.33
3 198.00 237.67 243.33 242.33 241.00 246.00 236.33 250.67
4 209.67 247.67 258.00 256.67 239.67 241.00 247.67 232.00
5 298.67 293.33 269.67 270.33 296.33 320.67 321.67 306.33
Rerata 240.33 271.47 271.80 272.00 273.33 279.80 280.20 275.53
SD 40.67 27.22 22.36 23.52 30.14 34.82 36.81 34.70
CCl4+NAC 1 321.67 322.67 338.67 348.33 347.00 356.33 361.33 373.33
2 276.67 264.33 262.00 263.67 268.00 274.33 273.67 271.67
3 232.33 282.67 289.33 306.67 297.67 292.67 285.00 283.20
4 201.33 223.00 211.67 216.33 220.33 228.67 223.00 211.20
5 273.00 271.00 281.00 293.00 302.00 320.00 327.00 330.00
Rerata 261.00 272.73 276.53 285.60 287.00 294.40 294.00 293.88
SD 45.97 35.84 46.00 49.28 46.76 48.00 52.82 61.36
78
Universitas Indonesia
Kelompok TikusMinggu ke-
1 2 3 4 5 6 7 8
CCl4+T50 1 280.00 273.00 276.67 287.00 289.67 292.00 295.00 299.33
2 264.00 262.00 269.00 272.33 267.33 255.33 270.00 258.00
3 254.67 308.67 309.00 309.67 312.00 311.33 321.00 330.80
4 225.33 267.33 269.33 281.00 275.00 270.00 259.33 256.67
5 248.00 247.00 272.00 291.00 310.00 319.00 328.00 328.00
Rerata 254.40 271.60 279.20 288.20 290.80 289.53 294.67 294.56
SD 20.21 22.87 16.94 13.91 20.12 26.93 30.26 36.15
CCl4+T100 1 296.00 295.33 303.00 315.67 328.50 332.33 335.00 334.67
2 250.67 295.00 322.67 346.33 361.00 367.00 368.67 394.00
3 227.67 266.33 265.00 270.00 273.33 281.33 276.00 264.00
4 256.33 257.33 272.33 284.33 248.67 319.00 327.00 323.00
5 242.00 236.00 245.00 259.00 248.00 251.00 274.00 289.00
Rerata 254.53 270.00 281.60 295.07 291.90 310.13 316.13 320.93
SD 25.58 25.48 31.01 35.70 50.63 45.09 40.68 49.48
CCl4+T150 1 274.00 252.00 258.00 261.00 267.67 269.67 266.00 247.67
2 275.33 271.00 267.33 269.00 286.00 297.67 297.67 328.67
3 230.00 277.67 275.00 263.00 262.33 274.33 278.67 261.60
4 199.00 234.67 239.33 243.00 246.67 230.67 228.00 238.67
5 274.00 275.00 291.00 308.00 326.00 346.00 354.00 362.00
Rerata 250.47 262.07 266.13 268.80 277.73 283.67 284.87 287.72
SD 34.62 18.32 19.25 23.96 30.42 42.35 46.29 54.51
79
Universitas Indonesia
Lampiran 5
Data Kadar Protein Homogenat Hati
1. Kadar protein untuk pemeriksaan MDA
No. Kelompok
N CCl4 CCl4+ NAC CCl4+ T50 CCl4+ T100 CCl4+ T1501 199.51 154.41 201.58 116.11 126.50 154.41
2 124.16 155.10 171.33 125.28 212.06 122.83
3 129.66 164.04 219.04 150.94 206.66 146.16
4 146.85 188.10 183.98 155.22 157.06 248.60
5 166.10 92.26 216.98 182.11 206.56 123.48
Mean 153.26 150.78 198.58 145.93 181.77 159.10
SD 30.614 35.443 20.748 26.155 38.134 51.923
2. Kadar protein untuk pemeriksaan rasio GSH/GSSG
No. Kelompok
N CCl4 CCl4+ NAC CCl4+ T50 CCl4+ T100 CCl4+ T1501 147.15 114.63 151.50 116.50 118.38 112.132 122.75 137.13 120.88 134.00 122.13 101.503 178.11 116.50 138.38 95.88 113.38 167.754 158.46 110.88 148.38 87.75 116.50 112.135 146.14 95.25 109.00 128.38 227.13 135.88
Mean 150.52 114.88 133.63 112.50 139.50 125.88SD 20.162 14.991 18.225 20.120 49.086 26.579
3. Kadar protein untuk pemeriksaan TNF-αNo. Kelompok
N CCl4 CCl4+ NAC CCl4+ T50 CCl4+ T100 CCl4+ T1501 134.63 93.38 151.50 116.50 118.38 112.132 137.75 72.22 120.88 90.56 215.88 89.003 129.00 114.63 121.50 134.00 144.63 110.004 155.25 110.88 168.38 133.38 98.89 112.135 146.67 95.25 109.00 128.38 227.13 160.88
Mean 140.66 97.27 134.25 120.56 160.98 116.83SD 10.366 16.830 24.704 18.184 57.720 26.483
80
Universitas Indonesia
4. Kadar protein untuk pemeriksaan TGF-β1
No. Kelompok
N CCl4 CCl4+ NAC CCl4+ T50 CCl4+ T100 CCl4+ T1501 99.33 75.10 72.33 61.78 94.86 56.932 110.38 72.45 79.56 67.85 71.30 54.103 106.56 70.10 72.45 84.52 93.10 49.104 99.46 43.71 74.17 66.22 58.66 59.235 78.20 49.46 59.23 90.60 58.10 43.71
Mean 98.79 62.16 71.55 74.19 75.20 52.61
SD 12.443 14.474 7.486 12.586 17.947 6.249
81
Universitas Indonesia
Lampiran 6
Data dan Hasil Analisis Statistik Aktivitas ALT
1. Data aktivitas ALT
No. Kelompok
N CCl4 CCl4+ NAC CCl4+ T50 CCl4+ T100 CCl4+ T1501 46.80 104.44 45.83 50.68 49.06 37.74
2 30.73 119.16 37.96 33.43 56.07 61.79
3 47.66 123.47 42.59 46.53 58.34 66.86
4 30.73 135.87 35.05 42.06 31.22 70.09
5 27.50 136.41 49.06 52.25 40.22 45.72
Mean 36.68 123.87 42.10 44.99 46.98 56.44
SD 9.722 13.241 5.692 7.577 11.293 14.036
2. Perhitungan statistik data aktivitas ALT
2.1. Uji normalitas distribusi, homogenitas dan ANOVA
Tests of Normality
Kelompok Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk
Statistic df Sig. Statistic df Sig.
ALT Normal .330 5 .080 .790 5 .067
CCl4 .218 5 .200* .912 5 .477
CCl4+NAC .167 5 .200* .971 5 .882
CCl4+T50 .181 5 .200* .927 5 .574
CCl4+T100 .190 5 .200* .936 5 .638
CCl4+T150 .248 5 .200* .898 5 .399
a. Lilliefors Significance Correction
*. This is a lower bound of the true significance.
Test of Homogeneity of VariancesALT
Levene Statistic df1 df2 Sig.
1.610 5 24 .196
ANOVAALT
Sum of Squares df Mean Square F Sig.
Between Groups 26688.139 5 5337.628 46.813 .000
Within Groups 2736.492 24 114.021
Total 29424.631 29
82
Universitas Indonesia
2.2. Uji Tukey
Multiple ComparisonsALT
Tukey HSD
(I) Kelompok (J) Kelompok Mean Difference
(I-J) Std. Error Sig.
95% Confidence Interval
Lower Bound Upper Bound
d
i
m
e
n
s
i
o
n
2
Normal CCl4 -87.18600* 6.75338 .000 -108.0670 -66.3050
CCl4+NAC -5.41400 6.75338 .964 -26.2950 15.4670
CCl4+T50 -8.30600 6.75338 .818 -29.1870 12.5750
CCl4+T100 -10.29800 6.75338 .652 -31.1790 10.5830
CCl4+T150 -19.75600 6.75338 .071 -40.6370 1.1250
CCl4 Normal 87.18600* 6.75338 .000 66.3050 108.0670
CCl4+NAC 81.77200* 6.75338 .000 60.8910 102.6530
CCl4+T50 78.88000* 6.75338 .000 57.9990 99.7610
CCl4+T100 76.88800* 6.75338 .000 56.0070 97.7690
CCl4+T150 67.43000* 6.75338 .000 46.5490 88.3110
CCl4+NAC Normal 5.41400 6.75338 .964 -15.4670 26.2950
CCl4 -81.77200* 6.75338 .000 -102.6530 -60.8910
CCl4+T50 -2.89200 6.75338 .998 -23.7730 17.9890
CCl4+T100 -4.88400 6.75338 .977 -25.7650 15.9970
CCl4+T150 -14.34200 6.75338 .309 -35.2230 6.5390
CCl4+T50 Normal 8.30600 6.75338 .818 -12.5750 29.1870
CCl4 -78.88000* 6.75338 .000 -99.7610 -57.9990
CCl4+NAC 2.89200 6.75338 .998 -17.9890 23.7730
CCl4+T100 -1.99200 6.75338 1.000 -22.8730 18.8890
CCl4+T150 -11.45000 6.75338 .548 -32.3310 9.4310
CCl4+T100 Normal 10.29800 6.75338 .652 -10.5830 31.1790
CCl4 -76.88800* 6.75338 .000 -97.7690 -56.0070
CCl4+NAC 4.88400 6.75338 .977 -15.9970 25.7650
CCl4+T50 1.99200 6.75338 1.000 -18.8890 22.8730
CCl4+T150 -9.45800 6.75338 .726 -30.3390 11.4230
CCl4+T150 Normal 19.75600 6.75338 .071 -1.1250 40.6370
CCl4 -67.43000* 6.75338 .000 -88.3110 -46.5490
CCl4+NAC 14.34200 6.75338 .309 -6.5390 35.2230
CCl4+T50 11.45000 6.75338 .548 -9.4310 32.3310
CCl4+T100 9.45800 6.75338 .726 -11.4230 30.3390
*. The mean difference is significant at the 0.05 level.
83
Universitas Indonesia
Lampiran 7
Data dan Hasil Analisis Statistik Aktivitas AST
1. Data aktivitas AST
No. Kelompok
N CCl4 CCl4+ NAC CCl4+ T50 CCl4+ T100 CCl4+ T1501 58.07 185.15 43.67 71.17 68.04 74.41
2 59.31 174.47 42.06 48.53 76.78 67.23
3 55.00 186.93 63.08 54.94 50.68 70.85
4 43.67 180.08 77.10 40.33 62.49 83.57
5 55.37 141.05 50.14 63.89 67.45 49.55
Mean 54.28 173.54 55.21 55.77 65.09 69.12
SD 6.202 18.799 14.774 12.193 9.556 12.513
2. Perhitungan statistik data aktivitas AST
2.1. Uji normalitas distribusi, homogenitas dan ANOVA
Tests of Normality
Kelompok Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk
Statistic df Sig. Statistic df Sig.
AST Normal .346 5 .050 .806 5 .090
CCl4 .320 5 .105 .774 5 .049
CCl4+NAC .234 5 .200* .896 5 .391
CCl4+T50 .147 5 .200* .985 5 .961
CCl4+T100 .198 5 .200* .956 5 .779
CCl4+T150 .240 5 .200* .946 5 .710
a. Lilliefors Significance Correction
*. This is a lower bound of the true significance.
Test of Homogeneity of VariancesAST
Levene Statistic df1 df2 Sig.
.933 5 24 .477
ANOVAAST
Sum of Squares df Mean Square F Sig.
Between Groups 54721.980 5 10944.396 65.235 .000
Within Groups 4026.439 24 167.768
Total 58748.419 29
84
Universitas Indonesia
2.2. Uji Tukey
Multiple ComparisonsAST
Tukey HSD
(I) Kelompok (J)
KelompokMean Difference
(I-J) Std. Error Sig.
95% Confidence Interval
Lower Bound Upper Bound
d
i
m
e
n
s
i
o
n
2
Normal CCl4 -119.25200* 8.19191 .000 -144.5808 -93.9232
CCl4+NAC -.92600 8.19191 1.000 -26.2548 24.4028
CCl4+T50 -1.48800 8.19191 1.000 -26.8168 23.8408
CCl4+T100 -10.80400 8.19191 .772 -36.1328 14.5248
CCl4+T150 -14.83800 8.19191 .478 -40.1668 10.4908
CCl4 Normal 119.25200* 8.19191 .000 93.9232 144.5808
CCl4+NAC 118.32600* 8.19191 .000 92.9972 143.6548
CCl4+T50 117.76400* 8.19191 .000 92.4352 143.0928
CCl4+T100 108.44800* 8.19191 .000 83.1192 133.7768
CCl4+T150 104.41400* 8.19191 .000 79.0852 129.7428
CCl4+NAC Normal .92600 8.19191 1.000 -24.4028 26.2548
CCl4 -118.32600* 8.19191 .000 -143.6548 -92.9972
CCl4+T50 -.56200 8.19191 1.000 -25.8908 24.7668
CCl4+T100 -9.87800 8.19191 .830 -35.2068 15.4508
CCl4+T150 -13.91200 8.19191 .546 -39.2408 11.4168
CCl4+T50 Normal 1.48800 8.19191 1.000 -23.8408 26.8168
CCl4 -117.76400* 8.19191 .000 -143.0928 -92.4352
CCl4+NAC .56200 8.19191 1.000 -24.7668 25.8908
CCl4+T100 -9.31600 8.19191 .861 -34.6448 16.0128
CCl4+T150 -13.35000 8.19191 .588 -38.6788 11.9788
CCl4+T100 Normal 10.80400 8.19191 .772 -14.5248 36.1328
CCl4 -108.44800* 8.19191 .000 -133.7768 -83.1192
CCl4+NAC 9.87800 8.19191 .830 -15.4508 35.2068
CCl4+T50 9.31600 8.19191 .861 -16.0128 34.6448
CCl4+T150 -4.03400 8.19191 .996 -29.3628 21.2948
CCl4+T150 Normal 14.83800 8.19191 .478 -10.4908 40.1668
CCl4 -104.41400* 8.19191 .000 -129.7428 -79.0852
CCl4+NAC 13.91200 8.19191 .546 -11.4168 39.2408
CCl4+T50 13.35000 8.19191 .588 -11.9788 38.6788
CCl4+T100 4.03400 8.19191 .996 -21.2948 29.3628
*. The mean difference is significant at the 0.05 level.
85
Universitas Indonesia
Lampiran 8Data dan Hasil Analisis Statistik Aktivitas ALP
1. Data aktivitas ALP
No. Kelompok
N CCl4 CCl4+ NAC CCl4+ T50 CCl4+ T100 CCl4+ T1501 179.21 1066.04 408.96 672.71 720.04 811.942 179.21 1059.61 551.40 569.78 738.88 744.393 197.59 986.55 477.88 552.78 703.04 757.264 183.80 989.07 427.34 665.36 783.45 883.625 160.83 1148.75 440.20 670.87 615.27 716.36
Mean 180.12 1050.00 461.15 626.30 712.13 782.71SD 13.158 66.782 56.417 59.719 61.904 66.248
2. Perhitungan statistik data aktivitas ALP
2.1. Uji normalitas distribusi, homogenitas dan ANOVA
Tests of Normality
Kelompok Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk
Statistic df Sig. Statistic df Sig.
ALP Normal .272 5 .200* .942 5 .680
CCl4 .219 5 .200* .895 5 .385
CCl4+NAC .245 5 .200* .897 5 .394
CCl4+T50 .343 5 .054 .760 5 .037
CCl4+T100 .242 5 .200* .946 5 .709
CCl4+T150 .250 5 .200* .926 5 .566
a. Lilliefors Significance Correction
*. This is a lower bound of the true significance.
Test of Homogeneity of VariancesALP
Levene Statistic df1 df2 Sig.
1.623 5 24 .192
ANOVAALP
Sum of Squares df Mean Square F Sig.
Between Groups 2186013.402 5 437202.680 133.815 .000
Within Groups 78413.423 24 3267.226
Total 2264426.825 29
86
Universitas Indonesia
2.2. Uji Tukey
Multiple ComparisonsALP
Tukey HSD
(I) Kelompok (J)
KelompokMean Difference
(I-J) Std. Error Sig.
95% Confidence Interval
Lower Bound Upper Bound
d
i
m
e
n
s
i
o
n
2
Normal CCl4 -869.87600* 36.15094 .000 -981.6522 -758.0998
CCl4+NAC -281.02800* 36.15094 .000 -392.8042 -169.2518
CCl4+T50 -446.17200* 36.15094 .000 -557.9482 -334.3958
CCl4+T100 -532.00800* 36.15094 .000 -643.7842 -420.2318
CCl4+T150 -602.58600* 36.15094 .000 -714.3622 -490.8098
CCl4 Normal 869.87600* 36.15094 .000 758.0998 981.6522
CCl4+NAC 588.84800* 36.15094 .000 477.0718 700.6242
CCl4+T50 423.70400* 36.15094 .000 311.9278 535.4802
CCl4+T100 337.86800* 36.15094 .000 226.0918 449.6442
CCl4+T150 267.29000* 36.15094 .000 155.5138 379.0662
CCl4+NAC Normal 281.02800* 36.15094 .000 169.2518 392.8042
CCl4 -588.84800* 36.15094 .000 -700.6242 -477.0718
CCl4+T50 -165.14400* 36.15094 .002 -276.9202 -53.3678
CCl4+T100 -250.98000* 36.15094 .000 -362.7562 -139.2038
CCl4+T150 -321.55800* 36.15094 .000 -433.3342 -209.7818
CCl4+T50 Normal 446.17200* 36.15094 .000 334.3958 557.9482
CCl4 -423.70400* 36.15094 .000 -535.4802 -311.9278
CCl4+NAC 165.14400* 36.15094 .002 53.3678 276.9202
CCl4+T100 -85.83600 36.15094 .205 -197.6122 25.9402
CCl4+T150 -156.41400* 36.15094 .003 -268.1902 -44.6378
CCl4+T100 Normal 532.00800* 36.15094 .000 420.2318 643.7842
CCl4 -337.86800* 36.15094 .000 -449.6442 -226.0918
CCl4+NAC 250.98000* 36.15094 .000 139.2038 362.7562
CCl4+T50 85.83600 36.15094 .205 -25.9402 197.6122
CCl4+T150 -70.57800 36.15094 .397 -182.3542 41.1982
CCl4+T150 Normal 602.58600* 36.15094 .000 490.8098 714.3622
CCl4 -267.29000* 36.15094 .000 -379.0662 -155.5138
CCl4+NAC 321.55800* 36.15094 .000 209.7818 433.3342
CCl4+T50 156.41400* 36.15094 .003 44.6378 268.1902
CCl4+T100 70.57800 36.15094 .397 -41.1982 182.3542
*. The mean difference is significant at the 0.05 level.
87
Universitas Indonesia
Lampiran 9
Data dan Hasil Analisis Statistik Persentase Jaringan Ikat
1. Persentase jaringan ikat
No. Kelompok
N CCl4 CCl4+ NAC CCl4+ T50 CCl4+ T100 CCl4+ T1501 1.82 11.72 7.99 8.19 9.08 8.782 2.38 12.75 8.42 12.10 9.77 11.083 1.02 15.10 4.65 8.98 9.19 9.074 0.97 12.07 6.89 5.63 7.12 6.635 3.98 12.49 5.40 6.49 7.58 11.72
Mean 2.03 12.83 6.67 8.28 8.55 9.46SD 1.236 1.332 1.626 2.517 1.139 2.021
2. Perhitungan statistik persentase jaringan ikat
2.1. Uji normalitas distribusi, homogenitas dan ANOVA
Tests of Normality
Kelompok Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk
Statistic df Sig. Statistic df Sig.
Fibrosis N .195 5 .200* .887 5 .343
CCl4 .323 5 .097 .820 5 .117
CCl4+NAC .192 5 .200* .929 5 .592
CCl4+T50 .190 5 .200* .949 5 .729
CCl4+T100 .280 5 .200* .895 5 .382
CCl4+T150 .189 5 .200* .948 5 .725
a. Lilliefors Significance Correction
*. This is a lower bound of the true significance.
Test of Homogeneity of VariancesFibrosis
Levene Statistic df1 df2 Sig.
.845 5 24 .532
ANOVAFibrosis
Sum of Squares df Mean Square F Sig.
Between Groups 315.720 5 63.144 21.471 .000
Within Groups 70.581 24 2.941
Total 386.301 29
88
Universitas Indonesia
2.2. Uji Tukey
Multiple ComparisonsFibrosis
Tukey HSD
(I) Kelompok (J)
KelompokMean Difference
(I-J) Std. Error Sig.
95% Confidence Interval
Lower Bound Upper Bound
d
i
m
e
n
s
i
o
n
2
N CCl4 -10.79200* 1.08460 .000 -14.1455 -7.4385
CCl4+NAC -4.63600* 1.08460 .003 -7.9895 -1.2825
CCl4+T50 -6.24400* 1.08460 .000 -9.5975 -2.8905
CCl4+T100 -6.51400* 1.08460 .000 -9.8675 -3.1605
CCl4+T150 -7.42200* 1.08460 .000 -10.7755 -4.0685
CCl4 N 10.79200* 1.08460 .000 7.4385 14.1455
CCl4+NAC 6.15600* 1.08460 .000 2.8025 9.5095
CCl4+T50 4.54800* 1.08460 .004 1.1945 7.9015
CCl4+T100 4.27800* 1.08460 .007 .9245 7.6315
CCl4+T150 3.37000* 1.08460 .048 .0165 6.7235
CCl4+NAC N 4.63600* 1.08460 .003 1.2825 7.9895
CCl4 -6.15600* 1.08460 .000 -9.5095 -2.8025
CCl4+T50 -1.60800 1.08460 .678 -4.9615 1.7455
CCl4+T100 -1.87800 1.08460 .526 -5.2315 1.4755
CCl4+T150 -2.78600 1.08460 .144 -6.1395 .5675
CCl4+T50 N 6.24400* 1.08460 .000 2.8905 9.5975
CCl4 -4.54800* 1.08460 .004 -7.9015 -1.1945
CCl4+NAC 1.60800 1.08460 .678 -1.7455 4.9615
CCl4+T100 -.27000 1.08460 1.000 -3.6235 3.0835
CCl4+T150 -1.17800 1.08460 .882 -4.5315 2.1755
CCl4+T100 N 6.51400* 1.08460 .000 3.1605 9.8675
CCl4 -4.27800* 1.08460 .007 -7.6315 -.9245
CCl4+NAC 1.87800 1.08460 .526 -1.4755 5.2315
CCl4+T50 .27000 1.08460 1.000 -3.0835 3.6235
CCl4+T150 -.90800 1.08460 .957 -4.2615 2.4455
CCl4+T150 N 7.42200* 1.08460 .000 4.0685 10.7755
CCl4 -3.37000* 1.08460 .048 -6.7235 -.0165
CCl4+NAC 2.78600 1.08460 .144 -.5675 6.1395
CCl4+T50 1.17800 1.08460 .882 -2.1755 4.5315
CCl4+T100 .90800 1.08460 .957 -2.4455 4.2615
*. The mean difference is significant at the 0.05 level.
89
Universitas Indonesia
Lampiran 10Data dan Hasil Analisis Statistik Kadar MDA Hati
1. Data kadar MDA homogenat hati
No. Kelompok
N CCl4 CCl4+ NAC CCl4+ T50 CCl4+ T100 CCl4+ T1501 0.031 0.131 0.049 0.044 0.046 0.0632 0.042 0.122 0.059 0.043 0.058 0.0503 0.055 0.097 0.039 0.049 0.062 0.0494 0.033 0.153 0.052 0.055 0.056 0.0745 0.033 0.091 0.047 0.061 0.031 0.036
Mean 0.039 0.119 0.049 0.050 0.051 0.054SD 0.0097 0.0254 0.0073 0.0074 0.0126 0.0145
2. Perhitungan statistik data kadar MDA homogenat hati
2.1. Uji normalitas distribusi, homogenitas dan ANOVA
3.
Tests of Normality
Kelompok Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk
Statistic df Sig. Statistic df Sig.
log_MDA Normal .313 5 .122 .852 5 .202
CCl4 .203 5 .200* .942 5 .681
CCl4+NAC .251 5 .200* .954 5 .763
CCl4+T50 .180 5 .200* .952 5 .754
CCl4+T100 .284 5 .200* .830 5 .140
CCl4+T150 .187 5 .200* .971 5 .881
a. Lilliefors Significance Correction
*. This is a lower bound of the true significance.
Test of Homogeneity of Varianceslog_MDA
Levene Statistic df1 df2 Sig.
.810 5 24 .554
ANOVAlog_MDA
Sum of Squares df Mean Square F Sig.
Between Groups .704 5 .141 15.164 .000
Within Groups .223 24 .009
Total .927 29
90
Universitas Indonesia
3.1. Uji Tukey
Multiple Comparisonslog_MDA
Tukey HSD
(I) Kelompok (J) Kelompok Mean Difference
(I-J) Std. Error Sig.
95% Confidence Interval
Lower Bound Upper Bound
d
i
m
e
n
s
i
o
n
2
Normal CCl4 -.49000* .06095 .000 -.6785 -.3015
CCl4+NAC -.11000 .06095 .482 -.2985 .0785
CCl4+T50 -.12000 .06095 .388 -.3085 .0685
CCl4+T100 -.11400 .06095 .443 -.3025 .0745
CCl4+T150 -.14600 .06095 .198 -.3345 .0425
CCl4 Normal .49000* .06095 .000 .3015 .6785
CCl4+NAC .38000* .06095 .000 .1915 .5685
CCl4+T50 .37000* .06095 .000 .1815 .5585
CCl4+T100 .37600* .06095 .000 .1875 .5645
CCl4+T150 .34400* .06095 .000 .1555 .5325
CCl4+NAC Normal .11000 .06095 .482 -.0785 .2985
CCl4 -.38000* .06095 .000 -.5685 -.1915
CCl4+T50 -.01000 .06095 1.000 -.1985 .1785
CCl4+T100 -.00400 .06095 1.000 -.1925 .1845
CCl4+T150 -.03600 .06095 .991 -.2245 .1525
CCl4+T50 Normal .12000 .06095 .388 -.0685 .3085
CCl4 -.37000* .06095 .000 -.5585 -.1815
CCl4+NAC .01000 .06095 1.000 -.1785 .1985
CCl4+T100 .00600 .06095 1.000 -.1825 .1945
CCl4+T150 -.02600 .06095 .998 -.2145 .1625
CCl4+T100 Normal .11400 .06095 .443 -.0745 .3025
CCl4 -.37600* .06095 .000 -.5645 -.1875
CCl4+NAC .00400 .06095 1.000 -.1845 .1925
CCl4+T50 -.00600 .06095 1.000 -.1945 .1825
CCl4+T150 -.03200 .06095 .995 -.2205 .1565
CCl4+T150 Normal .14600 .06095 .198 -.0425 .3345
CCl4 -.34400* .06095 .000 -.5325 -.1555
CCl4+NAC .03600 .06095 .991 -.1525 .2245
CCl4+T50 .02600 .06095 .998 -.1625 .2145
CCl4+T100 .03200 .06095 .995 -.1565 .2205
*. The mean difference is significant at the 0.05 level.
91
Universitas Indonesia
Lampiran 11Data dan Hasil Analisis Statistik Rasio GSH/GSSH Hati
1. Data kadar total glutation homogenat hati
No. Kelompok
N CCl4 CCl4+ NAC CCl4+ T50 CCl4+ T100 CCl4+ T1501 52.20 67.09 52.39 70.26 72.07 39.442 53.98 58.24 62.93 70.32 55.53 78.693 42.93 68.70 41.26 50.09 71.03 45.944 50.01 72.93 51.94 52.28 55.67 66.235 48.89 90.61 47.69 52.57 35.38 47.49
Mean 49.60 71.51 51.24 59.10 57.94 55.56SD 4.215 11.939 7.918 10.255 14.923 16.327
2. Data kadar GSH homogenat hati
No. Kelompok
N CCl4 CCl4+ NAC CCl4+ T50 CCl4+ T100 CCl4+ T1501 23.43 15.17 24.71 24.75 29.43 18.272 22.44 11.37 29.34 25.86 25.03 26.553 22.08 13.97 22.14 23.90 22.54 17.084 19.92 13.62 22.08 25.18 26.13 28.265 24.98 15.53 22.83 19.57 14.55 21.27
Mean 22.57 13.93 24.22 23.85 23.54 22.28SD 1.859 1.638 3.053 2.497 5.601 4.952
3. Data Rasio GSH/GSSG
No. Kelompok
N CCl4 CCl4+ NAC CCl4+ T50 CCl4+ T100 CCl4+ T1501 1.63 0.58 1.79 1.09 1.38 1.732 1.42 0.49 1.75 1.16 1.64 1.023 2.12 0.51 2.32 1.83 0.93 1.184 1.32 0.46 1.48 1.86 1.77 1.495 2.09 0.41 1.84 1.19 1.40 1.62
Mean 1.72 0.49 1.83 1.42 1.42 1.41
SD 0.370 0.064 0.303 0.383 0.322 0.298
92
Universitas Indonesia
4. Perhitungan statistik rasio GSH/GSSG
4.1. Uji normalitas distribusi, homogenitas dan ANOVA
Tests of Normality
Kelompok Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk
Statistic df Sig. Statistic df Sig.
Rasio_ln N .242 5 .200* .876 5 .291
CCl4 .152 5 .200* .995 5 .994
CCl4+NAC .265 5 .200* .933 5 .620
CCl4+T50 .321 5 .102 .788 5 .065
CCl4+T100 .284 5 .200* .891 5 .364
CCl4+T150 .234 5 .200* .924 5 .559
a. Lilliefors Significance Correction
*. This is a lower bound of the true significance.
Test of Homogeneity of VariancesRasio_ln
Levene Statistic df1 df2 Sig.
1.260 5 24 .313
ANOVARasio_ln
Sum of Squares df Mean Square F Sig.
Between Groups 5.728 5 1.146 25.512 .000
Within Groups 1.078 24 .045
Total 6.806 29
93
Universitas Indonesia
4.1.1. Uji Tukey
Multiple ComparisonsRasio_ln
Tukey HSD
(I) Kelompok (J) Kelompok Mean Difference
(I-J) Std. Error Sig.
95% Confidence Interval
Lower Bound Upper Bound
d
i
m
e
n
s
i
o
n
2
N CCl4 1.24000* .13402 .000 .8256 1.6544
CCl4+NAC -.07400 .13402 .993 -.4884 .3404
CCl4+T50 .19800 .13402 .681 -.2164 .6124
CCl4+T100 .19200 .13402 .708 -.2224 .6064
CCl4+T150 .19800 .13402 .681 -.2164 .6124
CCl4 N -1.24000* .13402 .000 -1.6544 -.8256
CCl4+NAC -1.31400* .13402 .000 -1.7284 -.8996
CCl4+T50 -1.04200* .13402 .000 -1.4564 -.6276
CCl4+T100 -1.04800* .13402 .000 -1.4624 -.6336
CCl4+T150 -1.04200* .13402 .000 -1.4564 -.6276
CCl4+NAC N .07400 .13402 .993 -.3404 .4884
CCl4 1.31400* .13402 .000 .8996 1.7284
CCl4+T50 .27200 .13402 .356 -.1424 .6864
CCl4+T100 .26600 .13402 .379 -.1484 .6804
CCl4+T150 .27200 .13402 .356 -.1424 .6864
CCl4+T50 N -.19800 .13402 .681 -.6124 .2164
CCl4 1.04200* .13402 .000 .6276 1.4564
CCl4+NAC -.27200 .13402 .356 -.6864 .1424
CCl4+T100 -.00600 .13402 1.000 -.4204 .4084
CCl4+T150 .00000 .13402 1.000 -.4144 .4144
CCl4+T100 N -.19200 .13402 .708 -.6064 .2224
CCl4 1.04800* .13402 .000 .6336 1.4624
CCl4+NAC -.26600 .13402 .379 -.6804 .1484
CCl4+T50 .00600 .13402 1.000 -.4084 .4204
CCl4+T150 .00600 .13402 1.000 -.4084 .4204
CCl4+T150 N -.19800 .13402 .681 -.6124 .2164
CCl4 1.04200* .13402 .000 .6276 1.4564
CCl4+NAC -.27200 .13402 .356 -.6864 .1424
CCl4+T50 .00000 .13402 1.000 -.4144 .4144
CCl4+T100 -.00600 .13402 1.000 -.4204 .4084
*. The mean difference is significant at the 0.05 level.
94
Universitas Indonesia
Lampiran 12Data dan Hasil Analisis Statistik Kadar TNF-α Hati
1. Data kadar TNF-α homogenat hatiNo. Kelompok
N CCl4 CCl4+ NAC CCl4+ T50 CCl4+ T100 CCl4+ T1501 1260.91 2906.48 1354.31 1842.12 2063.36 1310.722 1107.08 2114.01 1536.12 1531.81 1141.20 1658.913 1664.73 2336.50 1238.98 1072.76 1531.79 1696.434 1515.53 2365.60 1568.35 1336.99 1175.56 1386.855 1516.56 1899.14 1395.81 1421.06 1297.11 1324.90
Mean 1412.96 2324.35 1418.71 1440.95 1441.81 1475.56SD 224.345 376.090 135.235 281.052 379.674 187.178
2. Perhitungan statistik data TNF-α homogenat hati2.1. Uji normalitas distribusi, homogenitas dan ANOVA
Tests of Normality
Kelompok Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk
Statistic df Sig. Statistic df Sig.
TNF Normal .276 5 .200* .928 5 .586
CCl4 .256 5 .200* .943 5 .684
CCl4+NAC .207 5 .200* .944 5 .695
CCl4+T50 .173 5 .200* .987 5 .967
CCl4+T100 .248 5 .200* .847 5 .185
CCl4+T150 .282 5 .200* .810 5 .098
a. Lilliefors Significance Correction
*. This is a lower bound of the true significance.
Test of Homogeneity of VariancesTNF
Levene Statistic df1 df2 Sig.
.827 5 24 .543
ANOVATNF
Sum of Squares df Mean Square F Sig.
Between Groups 3285551.152 5 657110.230 8.420 .000
Within Groups 1872961.647 24 78040.069
Total 5158512.799 29
95
Universitas Indonesia
2.2. Uji Tukey
Multiple ComparisonsTNF
Tukey HSD
(I) Kelompok (J) Kelompok Mean Difference
(I-J) Std. Error Sig.
95% Confidence Interval
Lower Bound Upper Bound
d
i
m
e
n
s
i
o
n
2
Normal CCl4 -911.38400* 176.68058 .000 -1457.6682 -365.0998
CCl4+NAC -5.75200 176.68058 1.000 -552.0362 540.5322
CCl4+T50 -27.98600 176.68058 1.000 -574.2702 518.2982
CCl4+T100 -28.84200 176.68058 1.000 -575.1262 517.4422
CCl4+T150 -62.60000 176.68058 .999 -608.8842 483.6842
CCl4 Normal 911.38400* 176.68058 .000 365.0998 1457.6682
CCl4+NAC 905.63200* 176.68058 .000 359.3478 1451.9162
CCl4+T50 883.39800* 176.68058 .001 337.1138 1429.6822
CCl4+T100 882.54200* 176.68058 .001 336.2578 1428.8262
CCl4+T150 848.78400* 176.68058 .001 302.4998 1395.0682
CCl4+NAC Normal 5.75200 176.68058 1.000 -540.5322 552.0362
CCl4 -905.63200* 176.68058 .000 -1451.9162 -359.3478
CCl4+T50 -22.23400 176.68058 1.000 -568.5182 524.0502
CCl4+T100 -23.09000 176.68058 1.000 -569.3742 523.1942
CCl4+T150 -56.84800 176.68058 .999 -603.1322 489.4362
CCl4+T50 Normal 27.98600 176.68058 1.000 -518.2982 574.2702
CCl4 -883.39800* 176.68058 .001 -1429.6822 -337.1138
CCl4+NAC 22.23400 176.68058 1.000 -524.0502 568.5182
CCl4+T100 -.85600 176.68058 1.000 -547.1402 545.4282
CCl4+T150 -34.61400 176.68058 1.000 -580.8982 511.6702
CCl4+T100 Normal 28.84200 176.68058 1.000 -517.4422 575.1262
CCl4 -882.54200* 176.68058 .001 -1428.8262 -336.2578
CCl4+NAC 23.09000 176.68058 1.000 -523.1942 569.3742
CCl4+T50 .85600 176.68058 1.000 -545.4282 547.1402
CCl4+T150 -33.75800 176.68058 1.000 -580.0422 512.5262
CCl4+T150 Normal 62.60000 176.68058 .999 -483.6842 608.8842
CCl4 -848.78400* 176.68058 .001 -1395.0682 -302.4998
CCl4+NAC 56.84800 176.68058 .999 -489.4362 603.1322
CCl4+T50 34.61400 176.68058 1.000 -511.6702 580.8982
CCl4+T100 33.75800 176.68058 1.000 -512.5262 580.0422
*. The mean difference is significant at the 0.05 level.
96
Universitas Indonesia
Lampiran 13
Data dan Hasil Analisis Statistik Kadar TGF-β1 Hati
1. Data kadar TGF-β1 homogenat hatiNo. Kelompok
N CCl4 CCl4+ NAC CCl4+ T50 CCl4+ T100 CCl4+ T1501 509.65 2215.62 1878.21 1982.34 2018.06 2122.872 108.72 2928.08 1588.18 1876.58 1469.67 1961.653 552.53 2557.06 1915.16 2147.49 1743.47 1629.724 576.87 1883.37 1619.41 1465.03 2025.69 1992.895 714.51 2994.28 1482.49 1274.83 1719.85 1401.64
Mean 492.45 2515.68 1696.69 1749.25 1795.35 1821.75SD 227.813 471.885 189.939 365.714 232.980 297.028
2. Perhitungan statistik data TGF-β1 homogenat hati
2.1. Uji normalitas distribusi, homogenitas dan ANOVA
Tests of Normality
Kelompok Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk
Statistic df Sig. Statistic df Sig.
TGF Normal .330 5 .079 .845 5 .180
CCl4 .209 5 .200* .930 5 .599
CCl4+NAC .258 5 .200* .886 5 .337
CCl4+T50 .236 5 .200* .929 5 .587
CCl4+T100 .230 5 .200* .898 5 .398
CCl4+T150 .281 5 .200* .911 5 .474
a. Lilliefors Significance Correction
*. This is a lower bound of the true significance.
Test of Homogeneity of VariancesTGF
Levene Statistic df1 df2 Sig.
1.941 5 24 .125
ANOVATGF
Sum of Squares df Mean Square F Sig.
Between Groups 1.074E7 5 2147086.234 21.950 .000
Within Groups 2347606.336 24 97816.931
Total 1.308E7 29
97
Universitas Indonesia
2.2. Uji Tukey
Multiple ComparisonsTGF
Tukey HSD
(I) Kelompok (J)
KelompokMean Difference
(I-J) Std. Error Sig.
95% Confidence Interval
Lower Bound Upper Bound
d
i
m
e
n
s
i
o
n
2
Normal CCl4 -2023.22600* 197.80488 .000 -2634.8251 -1411.6269
CCl4+NAC -1204.23400* 197.80488 .000 -1815.8331 -592.6349
CCl4+T50 -1256.79800* 197.80488 .000 -1868.3971 -645.1989
CCl4+T100 -1302.89200* 197.80488 .000 -1914.4911 -691.2929
CCl4+T150 -1329.29800* 197.80488 .000 -1940.8971 -717.6989
CCl4 Normal 2023.22600* 197.80488 .000 1411.6269 2634.8251
CCl4+NAC 818.99200* 197.80488 .004 207.3929 1430.5911
CCl4+T50 766.42800* 197.80488 .008 154.8289 1378.0271
CCl4+T100 720.33400* 197.80488 .015 108.7349 1331.9331
CCl4+T150 693.92800* 197.80488 .020 82.3289 1305.5271
CCl4+NAC Normal 1204.23400* 197.80488 .000 592.6349 1815.8331
CCl4 -818.99200* 197.80488 .004 -1430.5911 -207.3929
CCl4+T50 -52.56400 197.80488 1.000 -664.1631 559.0351
CCl4+T100 -98.65800 197.80488 .996 -710.2571 512.9411
CCl4+T150 -125.06400 197.80488 .987 -736.6631 486.5351
CCl4+T50 Normal 1256.79800* 197.80488 .000 645.1989 1868.3971
CCl4 -766.42800* 197.80488 .008 -1378.0271 -154.8289
CCl4+NAC 52.56400 197.80488 1.000 -559.0351 664.1631
CCl4+T100 -46.09400 197.80488 1.000 -657.6931 565.5051
CCl4+T150 -72.50000 197.80488 .999 -684.0991 539.0991
CCl4+T100 Normal 1302.89200* 197.80488 .000 691.2929 1914.4911
CCl4 -720.33400* 197.80488 .015 -1331.9331 -108.7349
CCl4+NAC 98.65800 197.80488 .996 -512.9411 710.2571
CCl4+T50 46.09400 197.80488 1.000 -565.5051 657.6931
CCl4+T150 -26.40600 197.80488 1.000 -638.0051 585.1931
CCl4+T150 Normal 1329.29800* 197.80488 .000 717.6989 1940.8971
CCl4 -693.92800* 197.80488 .020 -1305.5271 -82.3289
CCl4+NAC 125.06400 197.80488 .987 -486.5351 736.6631
CCl4+T50 72.50000 197.80488 .999 -539.0991 684.0991
CCl4+T100 26.40600 197.80488 1.000 -585.1931 638.0051
*. The mean difference is significant at the 0.05 level.
98
Kajian aktivitas antioksidan, modulasi sitokin TNF- dan TGF-β1 oleh mahkotadewa (Phaleria macrocarpa) pada pencegahan fibrosis hati pada tikus yangdiinduksi karbon tetraklorida
Nanik Sundari,1 Vivian Soetikno,2 Melva Louisa,2 Raymond R. Tjandrawinata3
1 Magister Program Ilmu Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia2 Departemen Farmakologi dan Terapeutik Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia3PT. Dexa Medica
AbstrakLatar belakang: Mahkota dewa (Phaleria marcocarpa) merupakan salah satutanaman herbal di Indonesia dan ekstrak air buah mahkota dewa telah terbuktimemiliki efek hepatoprotektif. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitasdan mekanisme kerja ekstrak air buah mahkota dewa dalam mencegah terjadinyafibrosis hati.Metode: Penelitian dilakukan pada tikus Sprague-Dawley jantan yang diinduksikarbon tetraklorida (CCl4) secara intraperitoneal setiap 3 hari sekali selama 8 minggu.Hewan coba dibagi menjadi 6 kelompok: normal, CCl4, n-Acetyl cysteine (NAC)dosis 150 mg/kgBB, ekstrak air buah mahkota dewa dosis 50, 100 dan 150 mg/kgBB.Penilaian dilakukan terhadap parameter aspartat aminotransferase (AST), alaninaminotransferase (ALT), alkali fosfatase (ALP), histopatologi hati, kadarmalondialdehid (MDA), rasio GSH/GSSG, kadar Tumor Necrosis Factor (TNF)-αdan kadar Transforming Growth Factor (TGF)-β1Hasil: Hasil studi menunjukkan bahwa ekstrak air buah mahkota dewa and NACsecara bermakna dapat melindungi hati dari cedera melalui penurunan aktivitas enzimALT, AST, ALP dan penurunan persentase jaringan ikat pada pemeriksaanhistopatologi. Ekstrak air buah mahkota dewa dan NAC dapat menghambat stressoksidatif melalui penurunan kadar MDA hati dan peningkatan rasio GSH/GSSG hati.Ekstrak air buah mahkota dewa dan NAC dapat menekan inflamasi melaluipenurunan kadar TNF-α dan menghambat aktivasi sel stelata hati (HSC) yangditandai dengan penurunan kadar TGF-β1.Kesimpulan: Ekstrak air buah mahkota dewa dapat mencegah fibrosis hati pada tikusyang diinduksi CCl4. Pencegahan terhadap fibrosis tersebut terutama melalui aktivitasantioksidan dan kemampuan menekan sitokin inflamasi TNF-α, serta menghambataktivasi HSC melalui penurunan sitokin fibrogenik TGF-β1.
Abstract:Introduction: Mahkota dewa (Phaleria marcocarpa) is one of the Indonesia herbalplant and hepatoprotective effect of aqueous extract of mahkota dewa fruits have beenstudied. This study was conducted to evaluate the protective effect of water extract ofmahkota dewa in liver fibrosis and its mechanism of action.Method: Male Sprague-Dawley rats were induced by carbon tertrachloride (CCl4) for8 weeks. Rats were randomly allocated into 6 group: control group, n-acetylcysteine/NAC (150 mg/kgBB), aqueous extract of mahkota dewa (50, 100 and 150mg/kgBB). Aspartate aminotransaminate (AST), alanine aminotransferase (ALT),alkaline phosphatase (ALP), liver histopathology, malondialdehide (MDA), ratioGSH/GSSG, Tumor Necrosis Factor (TNF)-α and Transforming Growth Factor(TGF)-β1 were studied.Results: This study demonstrates that aqueous extract of mahkota dewa and NACsignificantly protects the liver from injury by reducing the activity of AST, ALT,
99
Universitas Indonesia
ALP and by reducing fibrosis percentage in histopatological examination. Aqueousextract of mahkota dewa and NAC attenuates oxidative stress by reducing the levelsof MDA and increasing GSH/GSSG ratio. Aqueous extract of mahkota dewa andNAC suppresses inflammation by reducing the levels of TNF- α and inhibits hepaticstellate cells (HSC) activation by reducing the levels of TGF-β1.Conclusions: Aqueous extract of mahkota dewa prevents CCl4-induced fibrosis inrats. The prevention of liver fibrosis most possibly through their antioxidant activitiesand by suppressing inflammatory cytokines TNF-α and inhibits HSC activation byreducing fibrogenic cytokines TGF-β1.
Key words: CCl4, fibrosis, mahkota dewa, acetyl cysteine, TNF-α, TGF-β1.
LATAR BELAKANG
Fibrosis hati dapat timbul pada berbagaipenyakit hati kronis yang dapat disebabkan olehinfeksi virus hepatitis, penyalahgunaan alkohol,penyakit perlemakan hati non alkoholik,penyakit autoimun atau hipoksia.1,2,3 Fibrosishati ditandai dengan akumulasi berlebih proteinmatriks ekstraseluler termasuk kolagen ataujaringan parut yang terjadi setelah berbagaipenyakit hati yang kronis.1,2,4
Aktivasi sel stelata hati merupakan halutama pada fibrosis hati. Pada hati normal, seltersebut terletak di space of disse dan berfungsisebagai tempat utama penyimpanan vitamin Adalam tubuh. Bila hati mengalami cedera kronis,sel stelata hati teraktivasi dan berdiferensiasimenjadi sel seperti miofibroblas. Proses aktivasisel stelata hati adalah proses yang kompleks dandiperantarai oleh sitokin inflamasi danfibrogenik, diantaranya Tumor Necrosis Factor(TNF)-α dan Transforming Growth Factor(TGF)-β.2,5 Fibroris hati dapat berkembang lebihlanjut menjadi sirosis yang ireversibel, gagalhati, hipertensi portal dan berkaitan dengantimbulnya kanker hati. Sekitar 10-20% pasienmengalami progresivitas menjadi sirosis dankanker hati.4
Mahkota dewa (Phaleria macrocarpa)merupakan tanaman asli Indonesia yang berasaldari Papua dan digunakan sebagai tanaman obat.Kandungan kimia dari tanaman mahkota dewaseperti alkaloid, flavonoid, saponin, tanin dansebagainya diketahui memberikan efekantiinflamasi, antioksidan, antikanker,antihipoglikemik, antihipertensi, danhepatoprotektif.6-9
Secara umum, proses isolasi senyawakimia yang terkandung dalam tanaman termasukmahkota dewa dilakukan menggunakan pelarutorganik yang bersifat toksik dan dapatmembahayakan kesehatan manusia sepertimetanol, etanol dan n-heksan. Saat ini telahdikembangkan proses ekstraksi menggunakansubcritical water pada suhu dan tekanan
tertentu. Kim dkk10 telah berhasil melakukanproses ekstraksi buah makhota dewamenggunakan pelarut air pada suhu 100°C dantekanan 30 bar selama 5 jam. Ekstrak air buahmahkota dewa (DLBSProliverenol) tersebutdiketahui mengandung mangiferin sebesar 21.7mg/g, yang setara dengan ekstrak metanol (25.0mg/g) dan lebih besar dari ekstrak etanol (13.2mg/g).
Ekstrak air buah mahkota dewa tersebuttelah diuji secara in vitro maupun in vivo. Hasilstudi pendahuluan secara in vitro menunjukkanbahwa efek hepatoprotektif ekstrak air buahmahkota dewa terjadi melalui down-regulationNFkB-TNF-α-lipid peroksidasi dengan hasilakhir meningkatnya waktu hidup sel.11 Studi lainsecara in vivo pada tikus yang diinduksi etanolselama 4 minggu menunjukkan bahwa ekstrakair buah mahkota dewa dengan dosis 37,5; 50dan 75 mg/kgbb dapat menurunkan levelaspartat aminotransferase (AST), alaninaminotransferase (ALT), total bilirubin dan γ-globulin transferase (GGT).12
Berdasarkan hasil pendahuluan tersebut diatas, ekstrak air buah mahkota dewa diketahuimempunyai aktivitas hepatoprotektif. Namun,untuk mengetahui apakah ekstrak air buahmahkota dewa dapat digunakan untuk mencegahfibrosis hati serta mekanisme kerja yangmendasari hal tersebut diperlukan studi lebihlanjut. Hal ini didasarkan pada upaya untukmencegah terjadinya fibrosis hati sedinimungkin.
METODE PENELITIAN
Hewan CobaPenelitian ini menggunakan tikus jantan
galur Sprague-Dawley dengan berat badan 200-350 gram yang berasal dari Pusat PengujianObat dan Makanan Nasional (PPOMN), BadanPOM. Penelitian ini dilaksanakan setelahmendapatkan persetujuan dari Komite EtikPenelitian Kesehatan Fakultas KedokteranUniversitas Indonesia
100
Universitas Indonesia
Bahan dan AlatEkstrak air buah mahkota dewa
(DLBSProliverenol) dari PT. Dexa Medica, N-acetyl cysteine (Fluimucil oral solution 200mg/Zambon SpA, Italia), Karbon tetraklorida(Merck), Kit Coomassie PlusTM (Bradford) assay(Thermo Scientific, USA Cat No. 23236), Kitenzimatik ALT, AST, ALP (Dyasis, Jerman).Asam tiobarbiturat, MDA standar (Aldrich10838-3), Asam trikloroasetat (MerckK40385207) OxyselectTM Total Glutathione(GSSG/GSH) (Cell biolabs Cat. No. STA-312),GSH standar (Sigma-Aldrich 66529), ELISA kitTNF-α (Sigma-Aldrich Cat. No RAB0480),ELISA kit TGF-β (Novateinbio Cat. No FM-E100129).
Prosedur PenelitianTikus terbagi dalam 6 kelompok dengan
rincian sebagai berikut:I. Kelompok normal: tidak diberi perlakuanII. Kelompok CCl4 (CMC Na 0.5% dan CCl4):
diberikan CMC Na 0.5% per oral dandiinjeksi intraperitoneal (ip) CCl4.
III. Kelompok CCl4+NAC (NAC dan CCl4):diberikan NAC per oral (dosis 150mg/kgBB) dan diinjeksi ip CCl4
IV. Kelompok CCl4+T50 (ekstrak air buahmahkota dewa dan CCl4): diberikan ekstrakair buah mahkota dewa per oral dosis 50mg/kgBB) dan diinjeksi ip CCl4
V. Kelompok CCl4+T100 (ekstrak air buahmahkota dewa dan CCl4): diberikan ekstrakair buah mahkota dewa per oral dosis 100mg/kgBB) dan diinjeksi ip CCl4.
VI. Kelompok CCl4+T150 (ekstrak air buahmahkota dewa dan CCl4): diberikan ekstrakair buah mahkota dewa per oral dosis 150mg/kgBB) dan diinjeksi ip CCl4
Pada kelompok II sampai VI, injeksi ipCCl4 dilakukan setiap 3 hari sekali yaitu dosis0.2 mL/100 gBB pada 2 minggu pertama dandilanjutkan 0.1 mL/100 gBB sampai 8 minggu).CCl4 dilarutkan dalam minyak zaitun denganperbandingan 1:1. Pada akhir studi, seluruhhewan coba diterminasi kemudian diambil darahdan jaringan hati.
Analisis BiokimiaPlasma dipisahkan dan dilakukan
pemeriksaan penanda fungsi hati ALT, AST danALP. Seluruh jaringan hati segera dikeluarkandan diambil untuk pemeriksaan biologimolekular yaitu malondialdehid (MDA), rasioGSH/GSSG, sitokin inflamasi dan fibrogenik(TNF-α dan TGF-ß).
Pemeriksaan HistopatologiSetelah terminasi, sebagian lobus hati
difiksasi dalam dapar formalin 10%, ditanam
dalam parafin, kemudian dilakukan pewarnaanmasson’s trichrome. Penilaian dilakukan secarakuantitatif menggunakan imageJ yaitu denganmenghitung persentase jaringan ikat (warnabiru) yang terbentuk pada daerah periportal.Perhitungan dilakukan pada 5 lapang pandanguntuk setiap hewan coba dan dilakukan secaratersamar.
Analisa statistikData disajikan sebagai rata-rata ± SD.
Analisis statistik dilakukan menggunakan SPSS16. Perbandingan antara enam kelompokdianalisis menggunakan ANOVA satu arahdengan batas kemaknaan p< 0.05, bila hasilbermakna maka akan dilanjutkan dengan analisisPost hoc (least significant difference).Homogenisitas varians dan normalitas distribusidata dinilai terlebih dahulu menggunakan ujiLevene dan uji Kolmogorov Smirnov.
HASIL
Aktivitas ALT, AST dan ALPPemberian injeksi intraperitoneal CCl4
meningkatkan aktivitas ALT, AST dan ALPsecara bermakna dibandingkan kelompok N(ALT 123.87 ± 13.241 vs 36.68 ± 9.722, p<0.05;AST 173.54 ± 18.799 vs 54.28 ± 6.202, p<0.05;dan ALP 1050.00 ± 66.782 vs 180.12 ± 13.158,p <0.05). Pemberian NAC maupun ekstrak airbuah mahkota dewa dosis 50 mg/kgbb (T50),100 mg/kgbb (T100) dan 150 mg/kgbb (T150)menurunkan aktivitas ALT, AST dan ALPsecara bermakna dibandingkan kelompok CCl4
(p<0.05) dan mendekati kelompok N (Gambar1-3).
Kadar MDA jaringan hatiPemberian injeksi intraperitoneal CCl4
selama 8 minggu meningkatkan kadarperoksidasi lipid di jaringan hati. Hal iniditunjukkan oleh kadar MDA yang meningkatsecara bermakna dibandingkan kelompok N(0,119 ± 0,0254 vs 0,039 ± 0,0097, p<0.05).Pemberian NAC dan ekstrak air buah mahkotadewa (T50, T100 dan T150) menurunkan kadarMDA secara bermakna dibandingkan kelompokCCl4 (p<0.05) dan mendekati kelompokN(p>0.05) (Gambar 4).
Rasio GSH/GSSG jaringan hatiPemberian injeksi intraperitoneal CCl4
secara bermakna menurunkan rasio GSH/GSSGdibandingkan kelompok N. Rasio GSH/GSSGpada kedua kelompok tersebut secara berurutanadalah 0.49 ± 0.064 dan 1.72 ± 0.370 (p<0.05).Pemberian NAC maupun ekstrak air buahmahkota dewa (T50, T100 dan T150)meningkatkan rasio GSH/GSSG secara
101
Universitas Indonesia
bermakna dibandingkan kelompok CCl4
(p<0.05) dan hasilnya mendekati kelompok N(p>0.05) (Gambar 5).
Kadar TNF-α jaringan hatiPemberian injeksi intraperitoneal CCl4
selama 8 minggu meningkatkan kadar TNF-α dijaringan hati. Hal ini ditunjukkan oleh kadarTNF-α yang meningkat secara bermaknadibandingkan kelompok N (2324.35 ± 376.090vs 1412.96 ± 224.345, p<0.05). Pemberian NACdan ekstrak air buah mahkota dewa (T50, T100dan T150) menurunkan kadar TNF-α secarabermakna dibandingkan kelompok CCl4
(p<0.05) dan mendekati kelompok N (p>0.05)(Gambar 6).
Kadar TGF-β1 jaringan hatiPemberian injeksi intraperitoneal CCl4
selama 8 minggu meningkatkan kadar TGF-β1di jaringan hati. Hal ini ditunjukkan oleh kadarTGF-β1 yang meningkat secara bermakna
dibandingkan kelompok N (2515.68 ± 471.885vs 492.45 ± 227.813, p<0.05). Pemberian NACdan ekstrak air buah mahkota dewa (T50, T100dan T150) menurunkan kadar TGF-β1 secarabermakna dibandingkan kelompok CCl4
(p<0.05) (Gambar 7).
Pemeriksaan histopatologiHasil pewarnaan masson’s trichrome
menunjukkan bahwa pemberian injeksiintraperitoneal CCl4 selama 8 minggumenyebabkan terbentuknya jaringan ikat di hati.Hal ini ditunjukkan oleh persentase jaringan ikatyang meningkat secara bermakna dibandingkankelompok N (12.83 ± 1.332 vs 2.03 ± 1.236,p<0.05). Pemberian NAC dan ekstrak air buahmahkota dewa (T50, T100 dan T150)menurunkan persentase jaringan ikat secarabermakna dibandingkan kelompok CCl4
(p<0.05), namun belum dapat mendekatikelompok N (Gambar 8 dan 9).
N C C l4 C C l4 + N A C C C l4 + T 5 0 C C l4 + T 1 0 0 C C l4 + T 1 5 00
5 0
1 0 0
1 5 0 a
b
bb
b
Ak
tivi
tas
AL
T (
U/L
)
Rerata 36.68 123.87 42.10 44.99 46.98 56.44SD 9.722 13.241 5.692 7.577 11.293 14.036
N C C l4 C C l4 + N A C C C l4 + T 5 0 C C l4 + T 1 0 0 C C l4 + T 1 5 00
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
2 5 0
a
b
bb
b
Ak
tivi
tas
AS
T (
U/L
)
Rerata 54.28 173.54 55.21 55.77 65.09 69.12SD 6.202 18.799 14.774 12.193 9.556 12.513
N C C l4 C C l4 + N A C C C l4 + T 5 0 C C l4 + T 1 0 0 C C l4 + T 1 5 00
5 0 0
1 0 0 0
1 5 0 0
b
b
b
b
a
Akt
ivita
s A
LP (U
/L)
Rerata 180.12 1050.00 461.15 626.30 712.13 782.71SD 13.158 66.782 56.417 59.719 61.904 66.248
Gambar 1-3. Pengaruh CCl4, NAC dan ekstrak air buah mahkota dewa terhadap aktivitas enzimALT, AST dan ALP plasma setelah 8 minggu perlakuan. Data disajikan dalam rata-rata ± SD (n=5).N: Normal, CCl4: Karbon tetraklorida, NAC: N-acetylcysteine dosis 150 mg/kgbb/hari, T50, T100,T150: ekstrak air buah mahkota dewa dosis 50, 100 dan 150 mg/kgbb/hari.a = p < 0.05 vs kelompok N, b = p < 0.05 vs kelompok CCl4 setelah uji ANOVA yang dilanjutkandengan multiple comparison uji Tukey pada α=0.05.
1
3
2
102
Universitas Indonesia
N C C l4 C C l4 + N A C C C l4 + T 5 0 C C l4 + T 1 0 0 C C l4 + T 1 5 00 .0 0
0 .0 5
0 .1 0
0 .1 5 a
bbbb
Ka
da
r M
DA
(n
mo
l/m
g p
rote
in)
Rerata 0.039 0.119 0.049 0.050 0.051 0.054SD 0.001 0.025 0.007 0.007 0.012 0.014
N C C l4 C C l4 + N A C C C l4 + T 5 0 C C l4 + T 1 0 0 C C l4 + T 1 5 00 .0
0 .5
1 .0
1 .5
2 .0
2 .5
a
bbb
b
Ras
io G
SH
/GS
SG
Rerata 1.72 0.49 1.83 1.42 1.42 1.41SD 0.370 0.064 0.303 0.383 0.322 0.298
Gambar 4-5. Pengaruh CCl4, NAC dan ekstrak air buah mahkota dewa terhadap kadar MDA danrasio GSH/GSSG hati setelah 8 minggu perlakuan. Data disajikan dalam rata-rata ± SD (n=5). N:Normal, CCl4: Karbon tetraklorida, NAC: N-acetylcysteine dosis 150 mg/kgbb/hari, T50, T100, T150:ekstrak air buah mahkota dewa dosis 50, 100 dan 150 mg/kgbb/hari.a = p < 0.05 vs kelompok N, b = p < 0.05 vs kelompok CCl4 setelah uji ANOVA yang dilanjutkandengan multiple comparison uji Tukey pada α=0.05.
N C C l4 C C l4 + N A C C C l4 + T 5 0 C C l4 + T 1 0 0 C C l4 + T 1 5 00
1 0 0 0
2 0 0 0
3 0 0 0a
bbb
b
Kadar
TNF (
pg/m
g prot
ein)
Rerata 1412.96 2324.35 1418.71 1440.95 1441.81 1475.56SD 224.345 376.090 135.235 281.052 379.674 187.178
N C C l4 C C l4 + N A C C C l4 + T 5 0 C C l4 + T 1 0 0 C C l4 + T 1 5 00
1 0 0 0
2 0 0 0
3 0 0 0
4 0 0 0
a
b b bb
Kadar
TGF (
pg/m
g prot
ein)
Rerata 492.45 2515.68 1696.69 1749.25 1795.35 1821.75SD 227.813 471.885 189.939 365.714 232.980 297.028
Gambar 6-7. Pengaruh CCl4, NAC dan ekstrak air buah mahkota dewa terhadapkadar TNF-α dan TGF-β hati setelah 8 minggu perlakuan. Data disajikan dalamrata-rata ± SD (n=5). N: Normal, CCl4: Karbon tetraklorida, NAC: N-acetylcysteine dosis150 mg/kgbb/hari, T50, T100, T150: ekstrak air buah mahkota dewa dosis 50, 100 dan150 mg/kgbb/hari.a = p < 0.05 vs kelompok N, b = p < 0.05 vs kelompok CCl4 setelah uji ANOVA yangdilanjutkan dengan multiple comparison uji Tukey pada α=0.05.
4 5
6
7
103
Universitas Indonesia
N C C l4 C C l4 + N A C C C l4 + T 5 0 C C l4 + T 1 0 0 C C l4 + T 1 5 00
5
1 0
1 5 a
bb
b
b
Perse
ntase
jaring
an ika
t (%)
Rerata 2.03 12.83 6.67 8.28 8.55 9.46SD 1.236 1.332 1.626 2.517 1.139 2.021
Gambar 8. Pengaruh CCl4, NAC dan ekstrak air buah mahkota dewaterhadap persentase jaringan ikat hati setelah 8 minggu perlakuan. Datadisajikan dalam rata-rata ± SD (n=5). N: Normal, CCl4: Karbon tetraklorida, NAC:N-acetylcysteine dosis 150 mg/kgBB/hari, T50, T100, T150: ekstrak air buahmahkota dewa dosis 50, 100 dan 150 mg/kgBB/hari.a = p < 0.05 vs kelompok N, b = p < 0.05 vs kelompok CCl4 setelah uji ANOVAyang dilanjutkan dengan multiple comparison uji Tukey pada α=0.
Gambar 9. Gambaran histopatologi fibrosis hati setelah 8 minggu perlakuan denganpewarnaan Masson’s trichrome. Warna biru menunjukkan akumulasi jaringan ikat yangterjadi di sekitar cabang vena porta, cabang duktus biliaris dan cabang arteri hepatika.A. Kelompok Normal B. Kelompok CCl4. C. Kelompok CCl4+NAC. D. KelompokCCl4+T50. E. Kelompok CCl4+T100. F. Kelompok CCl4+T150.N: Normal, CCl4: Karbon tetraklorida, NAC: N-acetylcysteine dosis 150 mg/kgBB/hari,T50, T100, T150: ekstrak air buah mahkota dewa dosis 50, 100 dan 150 mg/kgBB/hari.
A B
C D
E F
104
Universitas Indonesia
PEMBAHASAN
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwapemberian CCl4 selama 8 minggu meningkatkanaktivitas ALT, AST dan ALP di serumdibandingkan kelompok normal. Peningkatanaktivitas ALT dan AST menunjukkan terjadinyapelepasan enzim dari jaringan hati ke sirkulasidarah yang disebabkan oleh kerusakan sel hati.Peningkatan aktivitas ALP terjadi akibat adanyakolestasis, dan pada obstruksi intra maupunekstrabiliar enzim ini akan meningkat 3-10 kalidari nilai normal. ALT merupakan enzim yangterdapat di dalam sitosol sel hati, AST terdapatdi dalam sitosol serta mitokondria sel hati, selotot rangka, jantung dan ginjal, sedangkan ALPterdapat dalam banyak jaringan terutama di hati,tulang dan mukosa usus.13-15
Peningkatan aktivitas enzim ALT, ASTdan ALP sampai dua kali lipat masih dianggapnormal.16-17 Dari penelitian ini didapatkan bahwapemberian CCl4 selama 8 minggumeningkatkan aktivitas ALT dan AST 3 kalidibandingkan kelompok normal, sedangkanaktivitas ALP meningkat 6 kali dibandingkankelompok normal (p<0.05). Hasil inimenunjukkan bahwa pemberian CCl4
menyebabkan terjadinya kerusakan sel hati.Hasil ini sejalan dengan penelitian yangdilakukan oleh Cháved E dkk,5 Morsy dkk,18
Demiroren dkk,19 dan Fu dkk20 yangmemberikan hasil berupa peningkatan yangsignifikan terhadap aktivitas ALT, AST danALP pada tikus yang menggunakan CCl4
sebagai penginduksi fibrosis hati.Pemberian NAC dosis 150 mg/kgBB dan
ekstrak air buah mahkota dewa dosis 50, 100dan 150 mg/kgBB dapat menurunkan aktivitasenzim ALT, AST dan ALP secara bermaknadibandingkan kelompok CCl4. Penurunanaktivitas enzim ALT dan AST pada pemberianketiga dosis ekstrak air buah mahkota dewatersebut dapat mendekati kelompok normal.Pemberian ekstrak air buah mahkota dewa jugamenurunkan aktivitas ALP secara bermakna,walaupun belum dapat mendekati kelompoknormal. Secara keseluruhan, adanya penurunanaktivitas ketiga enzim tersebut mengindikasikanbahwa ekstrak air buah mahkota dewa dapatmelindungi sel hati akibat paparan CCl4 secarakronis.
Penilaian aktivitas antioksidan ekstrak airbuah mahkota dewa dilakukan melaluipemeriksaan peroksidasi lipid dan rasioGSH/GSSG pada jaringan hati. Peroksidasi lipidadalah penanda yang penting terhadap kerusakanjaringan karena stres oksidatif dan dapatdiimplikasikan sebagai penyebab fibrosis hati.
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwapemberian CCl4 dapat meningkatkan secarasignifikan meningkatkan kadar MDA dalamjaringan hati dibandingkan kelompok normal.Hasil ini sejalan dengan penelitian yangdilakukan oleh Cháved E dkk,5 Morsy dkk,18
Kamalakkannan dkk22 dan Pereira-Filho dkk23
yang menggunakan CCl4 untuk menginduksifibrosis hati pada tikus. Peningkatan kadar MDAterjadi karena hasil metabolisme CCl4 berupaROS (triklorometil dan triklorometilperoksi)yang dapat menyerang lipid membran retikulumendoplasma sehingga menyebabkan peroksidasilipid, menginduksi kerusakan membran sel danstruktur organel sel hati, degenerasi, nekrosisdan fibrosis hati.24-26
Pemberian NAC dosis 150 mg/kgBBdan ekstrak air buah mahkota dewa dosis 50,100 dan 150 mg/kgBB dapat menurunkan kadarMDA dalam jaringan hati secara bermaknadibandingkan kelompok CCl4. Penurunan kadarMDA pada pemberian ketiga dosis ekstrak airbuah mahkota dewa dapat mendekati kelompoknormal. Kemampuan ekstrak air buah mahkotadewa dalam menurunkan kadar MDA dapatdisebabkan oleh aktivitas antioksidannya, yaitukemampuan untuk melindungi sel parenkim hatiterhadap radikal triklorometil dantriklorometilperoxi yang dihasilkan akibat prosesmetabolisme CCl4.
GSH merupakan antioksidan nonenzimatik yang dibutuhkan untuk menangkalterjadinya stres oksidatif. Dalam sel, glutationberada dalam bentuk tereduksi (GSH) danteroksidasi (GSSG). Mengukur rasioGSH/GSSG pada model hewan coba danmembandingkannya dengan kelompok kontrolmerupakan cara terbaik untuk mengetahuipotensi terapi suatu obat uji dalammempertahankan potensial redoks selular.Potensial redoks selular merupakan hal yangkritikal pada fisiologi sel normal dan rasioGSH/GSSG merupakan indikator terbaik untukmengetahui potensial redoks tersebut. 21,27,28
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwapemberian CCl4 menurunkan rasio GSH/GSSGdalam jaringan hati secara bermaknadibandingkan kelompok normal. Hasil inisejalan dengan penelitian yang dilakukan olehCháved E dkk5 dan Fu dkk21 yang menggunakanCCl4 untuk menginduksi fibrosis hati pada tikus.Hal ini disebabkan karena pemberian CCl4secara kronis menyebabkan terjadinyapeningkatan ROS, terutama radikaltriklorometilperoksi. Gugus tiol pada GSH akandioksidasi oleh radikal triklorometilperoksimembentuk GSSG. Pada paparan CCl4 kronis,peristiwa tersebut terjadi secara terus menerussehingga menyebabkan deplesi kadar GSH.
105
Universitas Indonesia
Penurunan kadar GSH akan diikuti denganpenurunan nilai rasio GSH/GSSG. Penurunanrasio GSH/GSSG tersebut mengindikasikanterjadinya perubahan potensial redoks selulardan stres oksidatif, yang pada akhirnyamenyebabkan kerusakan struktur dan fungsi seltubuh.27
Pemberian NAC dosis 150 mg/kgBB danekstrak air buah mahkota dewa dosis 50, 100dan 150 mg/kgBB dapat meningkatkan rasioGSH/GSSG dalam jaringan hati sehingga dapatmendekati kelompok normal. Peningkatan rasioGSH/GSSG pada pemberian ketiga dosis ekstrakair buah mahkota dewa sebanding dengankelompok NAC. Peningkatan rasio GSH/GSSGpada penelitian ini mengindikasikan bahwaekstrak air buah mahkota dewa memilikiaktivitas antioksidan yaitu sebagai penangkapROS hasil metabolisme CCl4 yang dapatmengganggu sistem pertahanan antioksidan.
TNF-α merupakan kunci utama yangberkontribusi dalam memicu kaskade inflamasiyang melibatkan induksi sitokin setelah cederahati. Ketika terjadi cedera hati, sel Kupffer,makrofag dan neutrofil akan melepaskan TNF-α.Selain berperan dalam menginduksi proliferasihepatosit dan regenerasi hati, TNF-α jugaberperan sebagai mediator kematian hepatositserta aktivasi HSC.21
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwapemberian CCl4 meningkatkan secara bermaknakadar TNF-α dalam jaringan hati hingga 1.5 kalidibandingkan kelompok normal. Hasil inisejalan dengan penelitian yang dilakukan olehDemiroren dkk19 yang menunjukkan peningkatankadar TNF-α hingga 2 kali pada tikus yangmenggunakan CCl4 untuk menginduksi fibrosishati.. Peningkatan kadar TNF-αmengindikasikan terjadinya proses inflamasiakibat cedera hati kronis. Peran utama TNF-αdalam fibrosis hati yaitu menginisiasi prosesaktivasi HSC. Aktivasi HSC menggambarkantahap penting terjadinya fibrosis karena sel HSCmerupakan sumber utama ECM selamaterjadinya cedera hati.
Pemberian NAC dosis 150 mg/kgBB danekstrak air buah mahkota dewa dosis 50, 100dan 150 mg/kgBB dapat menurunkan kadarTNF-α sehingga mendekati kelompok normal.Penurunan kadar TNF-α pada pemberian ketigadosis ekstrak air buah mahkota dewa sebandingdengan kelompok NAC. Hasil penelitian inimenunjukkan bahwa ekstrak air buah mahkotadewa memiliki aktivitas antiinflamasi. Adanyapenurunan kadar TNF-α tersebut akanmenyebabkan penurunan HSC yang teraktivasisehingga dapat menghambat terjadinya fibrosishati.
Selain TNF-α, aktivasi HSC jugadikarenakan adanya TGF-β yang dilepaskan oleh
sel hepatosit yang rusak, sel Kuppfer yangteraktivasi, infiltrasi makrofag dan neutrofil padahati yang mengalami cedera. TGF-β superfamilyterdiri dari berbagai multifungsional sitokintermasuk TGF-β 1, 2, 3, activin dan bonemorphogenic proteins (BMPs). TGF-β1 adalahsitokin fibrogenik utama dan induser yang palingberperan dalam fibrosis, yaitu pengaturanproduksi, degradasi dan akumulasi ECM padafibrosis hati.29
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwapemberian CCl4 meningkatkan kadar TGF-β1dalam jaringan hati hingga 5 kali dibandingkankelompok normal. Hasil ini sejalan denganpenelitian yang dilakukan oleh Cháved E dkk5
dan Galicia-Moreno dkk30 yang menunjukkanpeningkatan kadar TGF-β1 pada tikus yangmenggunakan CCl4 untuk menginduksi fibrosishati. Peningkatan kadar TGF-β1mengindikasikan terjadinya aktivasi HSC yangberperan dalam proses fibrogenesis pada cederahati kronis.
Pemberian NAC dosis 150 mg/kgBB danekstrak air buah mahkota dewa dosis 50, 100dan 150 mg/kgBB dapat menurunkan kadarTGF-β1 dalam jaringan hati walaupun belumdapat mendekati kelompok normal. Penurunankadar TGF-β1 pada pemberian ketiga dosisekstrak air buah mahkota dewa sebandingdengan kelompok NAC. Penurunan kadar TGF-β1 akan menyebabkan penurunan HSC yangteraktivasi sehingga dapat menghambatterjadinya fibrosis hati. Berdasarkan hal tersebutdiketahui bahwa ekstrak air buah mahkota dewamemiliki aktivitas sebagai pencegah fibrosishati.
Hasil pemeriksaan histopatologimenunjukkan bahwa pemberian CCl4
menyebabkan terbentuknya jaringan ikat denganpersentase yang lebih besar dibandingkankelompok normal. Pemberian NAC dosis 150mg/kgBB dan ekstrak air buah mahkota dewadosis 50, 100 dan 150 mg/kgBB dapatmenurunkan persentase jaringan ikat yangterbentuk. Hal tersebut mengindikasikan adanyaproses penghambatan terjadinya fibrosis hatipada pemberian ekstrak air buah mahkota dewa.Hasil pemeriksaan histopatologi ini sejalandengan hasil pemeriksaan parameter biokimiayang secara keseluruhan menunjukkan perbaikanterhadap parameter yang telah dievaluasitersebut.
KESIMPULAN
Pemberian ekstrak air buah mahkota dewamemiliki aktivitas antioksidan dan antiinflamasi.Aktivitas tersebut berperan dalam memberikanperlindungan sel hati dan menghambat prosesaktivasi HSC, sehingga tidak terjadi akumulasi
106
Universitas Indonesia
ECM dan pada akhirnya mencegah terjadinyafibrosis hati.
SARAN
Mengingat adanya keterbatasan dankekurangan dari penelitian ini, maka beberapahal yang perlu disarankan untuk penelitianselanjutnya adalah dilakukannya penelitianuntuk mengetahui potensi ekstrak air buahmahkota dewa terhadap aktivasi HSC melaluipemeriksaan imunohistokimia HSC, alpha-smooth muscle actin (α-SMA).
DAFTAR PUSTAKA
1. Ramachandran P, Iredale JP. Reversibility ofliver fibrosis. Ann Hepatol. 2009;8:283-91.
2. Wallace K, Burt AD, Wright C. Liverfibrosis. Biochem J. 2008; 411: 1-18
3. Rockey DC, Friedman SL. Hepatic fibrosis andcirrhosis. In: Boyer TD, Wright TL, Manns MP,editors. Zakim and Boyer's Hepatology. 5th ed.Philadelphia: Saunders Elsevier;2006.p.87-109.
4. Wang L, Cheng D, Wang H, Di L, Zhou X,Xu T. The hepatoprotective and antifibroticeffects of Saururus chinensis against carbontertrachloride induced hepatic fibrosis in rats.J of Ethnopharmacol. 2009;126:487-91.
5. Cháved E, Reyes-Gordillo K, Segovia J,Shibayama M, Tsutsumi V, Vergara P,Moreno MG, Muriel P. Resveratrol preventsfibrosis, NF-κB activation and TGF-βincreases induced by chronic CCl4 treatmentin rats. J Appl Toxicol. 2008;28:35-43.
6. Hendra R, Ahmad S, Oskoueian, Sukari A,Shukor MY. Antioxidant, anti-inflammatoryand cytotoxicity of Phaleria macrocarpa(Boerl.) Scheff fruit. BMC ComplementAltern Med. 2011;11:2-10.
7. Dewoto HR, Mariyana Y, Arif A. Uji efekhipoglikemik ekstrak daging buah mahkotadewa [Phaleria marcocarpa (Scheff) Boerl.]pada kelinci, dibandingkan glibenklamid.Jurnal Bahan Alam Indonesia. 2006;6:20-3.
8. Yanti AR, Widayanti, Ringoringo VS. Ujiefek antihipertensi ekstrak etanol dagingbuah mahkota dewa [Phaleria marcocarpa(Scheff) Boerl.] pada tikus putih jantan.Jurnal Bahan Alam Indonesia. 2010;7:63-7.
9. Gotama IBI, Sugiarto S, Nurhadi M,Widiyastuti Y, Wahyono S, Prapti IJ.Inventaris Tanaman Obat Indonesia. Jilid V.Jakarta: Departemen Kesehatan BadanPenelitian dan PengembanganKesehatan;1999.hal.147-8.
10. Kim WJ, Veriansyah B, Lee YW, Kim J,Kim JD. Extraction of mangiferin from
mahkota dewa (Phaleria macrocarpa) usingsubcritical water. J Ind Eng Chem.2010;16:425-30.
11. Berlian G, Tandrasasmita M, TjandrawinataR. Bioactive fraction DLBSProliverenolpossess hepatoprotective activity viaantiinflammation, DNA repair andantiapoptosis activities. Unpublished report.DLBS. 2013:1-10.
12. Nailufar F, Kristiana H, Hardadi P,Sinambela J, Tjandrawinata R.Hepatoprotective effect: Cell toxicity,pharmacodynamic and antioxidant ofbioactive fraction DLBS1433.Unpublishedreport. DLBS. 2013:1-10
13. Panjaitan RGP, Handharyani E, Chairul,Masriani, Zakiah Z, Manalu W. Pengaruhpemberian karbon tertraklorida terhadapfungsi hati dan ginjal tikus. MakaraKesehatan. 2007;11:11-6.
14. Boone L, Meyer D, Cusick P, EnnulatD, Bolliger AP, Everds N, et al.Selection and interpretation of clinical pathology indicators of hepatic injury in preclinicalstudies. Vet Clin Pathol. 2005;34:182-8.
15. Ennulat D, Walker D, Clemo F, Magid-SlavM, Ledieu D, Graham M.Effects of hepatic drug-metabolizing enzymeinduction on clinical pathologyparameters in animals and man. ToxicolPathol. 2010;38:810-28.
16. Johnson-Delaney CA. Small rodents. In:Exotic Companion Medicine Handbook forVeterinarians. Florida: Zoological EducationNetwork;2008.p.2-47.
17. Smith JB, Mangkoewidjojo S.Pemeliharaaan, Pembiakan dan PenggunaanHewan Percobaan di Daerah Tropis. Jakarta:UI Press;1988.hal.39.
18. Morsy MA, Abdalla AM, Mahmoud AM,Abdelwahab SA, Mahmoud ME .Protective effects of curcumin, α-lipoic acid,and N-acetylcysteine against carbontetrachloride-induced liver fibrosis in rats. JPhysiol Biochem. 2012;68:29-35.
19. Demiroren K, Dogan Y, KocamazH, Ozercan IH, Ilhan S, Ustundag B, et al.Protective effects of L-carnitine, N-acetylcysteine and genistein in anexperimental model of liver fibrosis. ClinRes Hepatol Gastroenterol. 2014;38: 63-72.
20. Fu Y, Zheng S, Lin J, Ryerse J, Chen A.Curcumin protects the rat liver from CCl4-caused injury and fibrogenesis by attenuatingoxidative stress and suppressinginflammation. Mol Pharmacol. 2008;73:399-409.
21. Shimizu I, Shimamoto N, Saiki K, Furujo M,Osawa K. Lipid peroxidation in hepatic
107
Universitas Indonesia
fibrosis. In: Catala A, editor. Lipidperoxidation. Rijeka. Intech; 2012.p. 483-92.
22. Kamalakkannan N, Rukkumani R, Aruna K,Varma PS, Viswanathan P, Menon VP.Protective effect of N-acetyl cysteine incarbon tetrachloride-induced hepatotoxicityin rats. Iranian J Pharmacol Ther.2005;4:118-23.
23. Pereira-Filho G, Ferreira C, Schwengber A,Marroni C, Zettler C, Marroni N. Role of N-acetylcysteine on fibrosis and oxidativestress in cirrhotic rats. Arq Gastroenterol.2008;45:156-62.
24. Hayashi H, Sakai T. Animal models for thestudy of liver fibrosis: new insights fromknockout mouse models. Am J PhysiolGastrointest Liver Physiol. 2011; 300:G729-38.
25. Farber JL, Gerson RJ. Mechanisms of cellinjury with hepatotoxic chemicals.Pharmacol Rev. 1984;36:71S-75S.
26. Li L, Hu Z, Li W, Hu M, Ran J, Chan P, etal. Establishment of a standardized liverfibrosis model with different pathologicalstages in rats. Gastroenterol Res Pract.2012;2012:1-6.
27. Owen JB, Butterfield DA. Measurement ofoxidized/reduced glutathione ratio. MethodsMol Biol. 2010;648:269-77.
28. El-Beshbishy HA, Tork OM, El-Bab MF,Autifi MA. Antioxidant and antiapoptoticeffect of green tea polyphenols againstazathioprine-induced liver injury in rats.Pathophysiology. 2011;18:125-35.
29. Cong M, Iwaisako K, Jiang C, Kisseleva T.Cell signals influencing hepatic fibros. Int JHepatol. 2012;2012:1-18.
30. Galicia-Moreno M, Rodríguez-Rivera A,Reyes-Gordillo K, Segovia J, Shibayama M,Tsutsumi V, et al. N-acetylcysteine preventscarbon tetrachloride induced livercirrhosis: role of liver transforming growthfactor beta and oxidative stress. Eur JGastroenterol Hepatol. 2009;21:908-14.
108
Biodata Penulis
Nama lengkap : Nanik Sundari
NPM : 1206330495
NIP : 19801004 200501 2 001
Tanggal Lahir : 4 Oktober 1980
Tempat Lahir : Jakarta
Jenis Kelamin : Perempuan
Agama : Islam
Status Pernikahan : Belum Menikah
Alamat Rumah : JL. Cempaka Putih Utara RT010/02. No. 18
Jakarta Pusat – DKI Jakarta
Kode Pos : 10640
No. Telepon : 021-4244677
No. HP : 08128167056
E-mail : [email protected]
Riwayat Pendidikan :
- 1987 – 1993, Sekolah Dasar Negeri 013 Pagi, Jakarta
- 1993 – 1996, Sekolah Menengah Pertama Negeri 77, Jakarta
- 1996 – 1999, Sekolah Menengah Atas Negeri 68, Jakarta
- 1999 – 2003, Sarjana di Bidang Farmasi, Jurusan Farmasi, Fakultas Matematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Indonesia
- 2003 – 2004, Program Apoteker, Jurusan Farmasi, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Universitas Indonesia
Pengalaman Penelitian :
- Peneliti dalam rangka Skripsi: Uji keamanan sediaan jadi ekstrak kering daun Jati
Blanda (Guazuma ulmifolia Lamk) terhadap fungsi hati ditinjau dari aktivitas
GPT plasma, alkali fosfatase dan jaringan hati tikus (2003).