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UNIVERSITA’ DI MILANO-BICOCCAUNIVERSITA’ DI MILANO-BICOCCALAUREA MAGISTRALE IN LAUREA MAGISTRALE IN
BIOINFORMATICABIOINFORMATICA
Corso di
BIOINFORMATICA: TECNICHE DI BASE
Prof. Giancarlo Mauri
Lezione 9
Pattern discovery
2
Il problema
Abbiamo un insieme di sequenze (DNA o proteine) non allineate e funzionalmente correlate
Sappiamo che: tutte le sequenze (o la maggior parte di esse) contengono regioni “simili” tra loro
le regioni comuni potrebbero essere responsabili della funzione delle sequenze
Problema: esiste un metodo efficiente e affidabile per trovare tali regioni?
3
Obiettivo: individuare regioni simili all’interno di due o più sequenze per scoprire
origine evolutiva comune funzioni comuni Per le biosequenze (DNA, RNA e proteine), una forte similarità di solito implica una significativa similarità funzionale o strutturale
Esempi: Similarità tra l’oncogene n-sys del virus del sarcoma delle scimmie e il gene del fattore di crescita PDGF (Doolittle 83, Waterfield, 83).
Similarità tra i geni delle globine nell’uomo e nello scimpanzè
Un problema più generale: confronto di sequenze
4
Quanto simili?
Identiche
Con nucleotidi diversi permessi in alcune posizioni
Con mutazioni (in generale)
Con inserzioni e/o delezioni
Con alcune parti conservate separate da regioni casuali
All of the above(??)
5
ttatcACAAAccaatggcgattccgaactttaccgtacaactatcttAGAAAagcaaggattacttatgggtgagtaATAAAtagtcgctaactactgaatcgaccctggcaccccaacaAAAAAagaggaataca
Regione: AXAAA
Mutazioni in posizione fissa
ttatcACAAAccaatggcgattccgagtacaactatcttAGAAAagcaaggattacttat
gggtgagtaATAAAtagtcgctaactactgaatcccccaacaAAAAAagaggaataca
6
atattACAAAacctttgctctggtagaggttacgccccctggagcttaAAGAAcgtgatcggttccttggggacccctgAAAATattatggcaagattgtgaaaacctgGAAAAagaccataaatggagccgttaagcccgactttccgttttcAAACAaggagttccct
Regione: AAAAA
Mutazioni
atattACAAAacctttccccctggagcttaAAGAAcgtgatcggttcctt
ggggacccctgAAAATattatggcaagaaaacctgGAAAAagaccata
ttccgttttcAAACAaggagttccct
7
ccaaacAAAgcgAAAggtatcaaacacccggcttagagcagcagtagtAAAtgAAAacgtcaggcaacaacAAAggactAAActccgcatatgctctactaccgaaatttctgagcttcctgAAAcAAAcctttat
Regione: AAAX(1,5)AAA
Gap
caaacAAA---gcAAAggtgagcagcagtagtAAA---tgAAAacgtcaggcaa
aacAAAggactAAActtaatcctgAAAc----AAAcctttat
8
Pattern Discovery
Obiettivo: dato un insieme di sequenze (nucleotidi o proteine) trovare tutti i pattern (anche detti segnali o motivi) che occorrono in forma esatta o approssimata (con mutazioni, inserzioni o delezioni) in tutte o in un numero significativo di esse
Ricercare un singolo pattern esatto è facile (O(n)):
ACGAGCGAGCACGAAGCGXXGXGXGAGCXXGAXGXG
9
Pattern Discovery approssimato
Obiettivo: dato un insieme di sequenze (nucleotidi o proteine) trovare tutti i pattern (anche detti segnali o motivi) che:
occorrano, con un numero di mutazioni, inserzioni o delezioni non superiore a un massimo assegnato, in ogni sequenza del set; oppure:
occorrano come sopra in forme non più distanti di un massimo assegnato, secondo una assegnata misura di distanza; oppure:
occorrano come sopra in un numero di sequenze “sorprendentemente” elevato
ma...
non si sa quale pattern si deve cercare
10
Pattern Discovery approssimato
Problema 1Problema 1
INPUT:
una sequenza S sull’alfabeto , due valori e,q N
OUTPUT:
tutti i pattern che occorrono in S
almeno q volte con
al più e mismatches
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Pattern Discovery approssimato
Problema 2Problema 2
INPUT:
un insieme S = {S1, …, Sk} di sequenze sull’alfabeto , due valori e, q N
OUTPUT:
tutti i pattern che occorrono in
almeno q elementi di S con al più e mismatches
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Problema 3Problema 3
INPUT:
una sequenza S definita sull’alfabeto , due valori e, q N ed una misura di distanza d
OUTPUT:
tutti i pattern P che occorrono in S almeno q volte con un forma P’ tale che d(P,P’) e
Misure di distanza:
- numero di mismatches (mutazioni)- distanza di edit- weight matrices (PAM,BLOSUM)
Misure di distanza:
- numero di mismatches (mutazioni)- distanza di edit- weight matrices (PAM,BLOSUM)
Pattern Discovery approssimato
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Metodi Pattern Driven
La soluzione più semplice: Generare tutti i pattern fino ad una lunghezza massima m
Cercare separatamente ogni pattern nelle sequenze Riportare il pattern più significativo sulla base di qualche misura statistica
La ricerca è più efficiente con l’aiuto di una struttura di indicizzazione dei testi adatta
Limite: ci sono 4m o 20m pattern candidati per ogni lunghezza m:
m = 5 : 1024 pattern m = 10 : 1.048.576 pattern m = 15 : 1.073.741.824 pattern
14
Metodi Pattern Driven
L’enumerazione di tutti i pattern possibili funziona solo per lunghezze limitate e per DNA (l’alfabeto è più piccolo)
Soluzioni possibili per accelerare la ricerca sono:
Ridurre a priori il numero di pattern candidati (limitando la ricerca a quelli che occorrono almeno una volta senza errori)
Imporre restrizioni alle posizioni in cui possono verificarsi mutazioni (ossia permettere errori solo in specifiche posizioni)
Se il pattern è contenuto nel set di candidati, questi metodi garantiscono di trovarlo
15
Metodi Pattern Driven
Funzionano bene nella pratica: con pattern corti (fino a 8-10 residui)
se il pattern occorre esatto in almeno una sequenza
se sono solo permesse mutazioni in posizione fissa (ad esempio: ATXGGGXTCAXXG)
Limite: deve essere predefinito un valore di errore massimo (dipendente dalla dimensione del pattern)
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Metodi Sequence Driven
La maggior parte dei software usati si basano su metodi sequence driven che: prendono tutti i pattern che occorrono nelle sequenze, e cercano similarità tra di essi
non necessitano di un limite superiore della lunghezza del motivo e/o del numero di mutazioni
non necessitano di una soglia di distanza: semplicemente cercano il gruppo (o i gruppi) dei pattern più simili (uno per ogni sequenza)
Limite: il problema diventa anche più difficile di prima
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Grafo in cui:- i nodi sono i pattern
- gli archi connettono pattern entro una distanza 2d (possono essere istanze dello stesso pattern)
GGATAGGATA
GAAAAGAAAA
AAAATAAAAT
ACAAAACAAA
GAAAAGAAAA
Metodi Sequence Driven
Esempio: pattern di lunghezza m con al più d mutazioni
18
…è NP-difficile!!!
Metodi Sequence Driven
Equivalente a trovare una cricca massimale nel grafo...
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Metodi Sequence Driven
Miglioramenti: introdurre euristiche per ottenere una buona (possibilmente la migliore) soluzione in un tempo accettabile, senza verificare tutti i profili possibili
La soluzione ottima non è più garantita
I programmi più ampiamente utilizzati:
CONSENSUS (greedy)
Gibbs Sampler (probabilistico)
MEME (machine learning)
sono sequence driven. Ognuno è basato su un’euristica diversa
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Metodi Sequence Driven
Pregi: Non si deve imporre nessun limite alla lunghezza della regione comune
Non si deve definire esplicitamente un limite superiore all’errore
Una soluzione viene sempre trovata
Difetti: Non garantiscono di trovare la soluzione migliore
La dimensione della regione deve sempre essere “suggerita” all’algoritmo
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Metodi Sequence Driven
La sequenza può essere vista come generata da due diverse sorgenti: una che genera nucleotidi appartenenti a rumore di fondo casuale (random background noise)
una che genera il motivo
Soluzione: provare a stimare i parametri della sorgente che genera il motivo
Più il motivo differisce dal rumore di fondo, più ci si aspetta che sia significativo
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Metodi Sequence Driven
Computano la frequenza di ogni nucleotide nelle sequenze (pi)
Tentano di costruire un profilo della sorgente del pattern con una matrice di frequenze
Trovano la matrice le cui frequenze differiscono maggiormente dalle frequenze di background
Più il segnale è vicino alla distribuzione del rumore di fondo, più è arduo rilevarlo con metodi sequence driven
23
1 2 3 4 5 -------------------A | 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8C | 0.0 0.2 0.0 0.2 0.0G | 0.2 0.0 0.2 0.0 0.0 T | 0.0 0.0 0.0 0.0 0.2
atattACAAAacctttccccctggagcttaAAGAAcgtgatcggttcctt
ggggacccctgAAAATattatggcaagaaaacctgGAAAAagaccata
ttccgttttcAAACAaggagttccct
Profili
1 2 3 4 5 -----------------A | 4 4 4 4 4C | 0 1 0 1 0G | 1 0 1 0 0 T | 0 0 0 0 1
24
Scoring Patterns (SD)
Il solo conteggio del numero di occorrenze di un pattern può non essere sufficiente
Obiettivo: associare ad ogni pattern (o profilo) un punteggio statistico, tentando di riflettere il più possibile la sua rilevanza biologica
Riporta dunque i pattern con score più elevato
Pattern driven: computa il numero di occorrenze di un pattern e lo compara con qualche valore atteso:
S(p) = Obs(p)/Exp(p)
25
i
jim
j i ji
ffI
Prlog ,
1
4
1 ,∑ ∑= ==
Minimo quando fi,j = Pri
Massimo quando il nucleotide meno probabile occorre esclusivamente
Scoring Patterns (SD)
I metodi SD classificano la matrice di frequenza secondo il suo contenuto di informazione (o entropia relativa):
26
1 2 3 4 5A 2 1 1 2 2C 0 1 0 0 0
G 0 0 1 0 0 T 0 0 0 0 0
Consensus (1990)
Prende un pattern dalla prima sequenza, uno dalla seconda e costruisce la matrice delle frequenze
Ripete per ogni coppia di pattern
Salva la matrice migliore
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Consensus (1990)
Ripete per k volte, aggiungendo ad ogni passo i pattern di una nuova sequenza e salvando le più elevate matrici di scoring
Alla fine, stampa in output le matrici “migliori”, che corrisponderanno alle occorrenze del motivo (uno per ogni sequenza)
L’algoritmo è greedy: nessuna garanzia che le matrici finali siano le migliori possibili
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Gibbs Sampler (1993)
Sceglie a caso un pattern da ogni sequenza
Costruisce la matrice delle frequenze
Scarta il pattern appartenente ad una sequenza (S’)
Per ogni pattern di S’ calcola la verosimiglianza (likelihood) che venga generato dalla sorgente del motivo rispetto alla sorgente di background:
L(Pi) = M(Pi)/B(Pi)
Assegna ad ogni posizione i di S’ una probabilità proporzionale a L(Pi) e sceglie uno nuovo pattern da S’
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Gibbs Sampler (1993)
Si ferma dopo un dato numero di iterazioni, o quando gli score della matrice sono stabili
Riporta i profili migliori
Necessita di un elevato (>10) numero di sequenze in input
Una soluzione candidata (profilo) potrebbe essere rimpiazzata da una peggiore
Deve essere eseguito più di una volta
30
1-1 1 AATGCTCAGC cataccaata 2-1 2 c AATCGTCAGC cagagctgtg 3-1 3 aa AATCCCCAGC gaataacgcg 4-1 4 gtg AATGCTCAGC cagttaatgg 5-1 5 agcg ATTCCTCAGC tgtcgggtag 6-1 6 gttgg GATCCTCAGC ataaaaaaaa 7-1 7 ctcgac AATCCTCAGG agacgactta 8-1 8 tgctacg AATCCTCAGT atcttattca 9-1 9 tcaaaaga AATCCTCCGC aaatggttac 10-1 10 agacaaacc AATTCTCAGC agaatgaagt 11-1 11 atgacgaaat AATCCTCTGC agacctggtc 12-1 12 gaacaaaact AATCCTCACC tagcttgagg 13-1 13 aactacggct AATCCTCATC tcctgggaag 14-1 14 tacagacgat AATCCTTAGC agcccgctac 15-1 15 gttcaggcta AATCCCCAGC ggcacggtct sites: **********
Gibbs Sampler (1993)
31
Gibbs Sampler (1993)
Motif model (residue frequency x 100):
POS A C G T Info 1 87 . . . 1.2 2 87 . . . 1.2 3 . . . 93 1.5 4 . 75 . . 0.9 5 . 87 . . 1.3 6 . . . 81 1.1 7 . 87 . . 1.3 8 81 . . . 1.0 9 . . 81 . 1.0 10 . 81 . . 1.1
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Limiti di performance
Falliscono tutti sul seguente benchmark (Pevzner 2000):
Trovare un segnale lungo 15 nucleotidi che appare con esattamente 4 mutazioni in un campione di 20 sequenze, ognuna lunga 600
nucleotidi
In generale, Pevzner ha evidenziato i seguenti valori limite per lunghezza pattern/numero di mismatches per insiemi di venti sequenze di lunghezza 600 6 5 5 4 3 3 2 1
2019181615131210
33
AGGAAGCCGAGCGAT
gctgtcgcacAGGAATCCGACGGACaatggcagctggggttaaagcatgtcctgaaaagAGGAAGCCATATGATgggctttactacaccgagagaggtgtttcaggtgTGAAAGCCGGGGGATacggcagcggaattgaataacggtgagtgtcggtTGGATACCGATCGATtaaacgtcgcggtacaagtatcatactcacgggaAGGAAGCCACGAGCTcacacataccactacctaagtcaactccaagtatAATAAGCCGAGCGTCgcaagaggcttctatctacaatttaaacacaaacAGTTGGCCGAGCGACttatgtgacgtacactccttattgataggtcataAAGAATCCGAGACATgacctcaacgattggcacacaaggcgaggtcaccAAGAAGGCGAAAGATccaagggtataagtcaaggagttaggcaacggaaCGGATGCCGAGATATatgaacgccaggtgggaaggttccaggcctccggAGTAATTCTAGCGATctgtaacacctcggacgcaacgcctcttttattaAGTAAGCCCCGCGTTcgtggttacgtgggtgggcggacaatgccaagtaACTAAGCTGAGCGACcgaagagtagactgcggagactgtgactcgtcgcCCGAAGGTGAGCGATtatctgaattacacatctccatcgtcgtgtccgaACGAAGCCGAATTATgtcgaatggacgaatggtagggcaccctgtgcgcAGGAAGGCGACCGTCagggagtgccattagtttacgacgttatattccaAGGAAGTGGAACTATgcgtcacaagcggaggtaaaggcattgggaaggtATGAAGCAGCCCGATgggctccatggcacgtccttccgatacctcccctGGGAAGCTGAACGAGagctttaaccctataaccagagcaggggtcgatgTGGAAGCCCGTCGATgggtcgcgactcgggacgtgcgat
Segnale (15,4)
34
Le ricerche più recenti
La ricerca recente si è focalizzata sul problema del motivo (l,e) per il DNA: trovare tutti i pattern di lunghezza l che occorrono con al più e mutazioni in un insieme di sequenze
Il problema è stato “probabilmente” risolto in modo adeguato
Più alta è la probabilità di successo desiderata, più tempo richiede il programma
Alcuni programmi:
SP-Star
Projection
Weeder
35
),(,
jji
i ppd∑
Si raffinano i pattern trovati costruendo una stringa di consensus
SP-Star (2000)
Per tutti i pattern p che occorrono esattamente nelle sequenze, si trova la migliore istanza pi in ogni sequenza i
Si selezionano i pattern che minimizzano:
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A AG T G
Alcune occorrenze del motivo saranno proiettate nello stesso sub-pattern
Le posizioni da rimuovere sono scelte a caso ad ogni passo
Il raffinamento del pattern avviene con un profilo
Projection (2001)
Idea: proiettare un pattern di m caratteri in un sottospazio a k dimensioni, con k<l-d:
ACGAGGTCG
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Weeder (2001)
Idea: invece di ridurre il set di pattern candidati, ridurre il set di possibili match per ogni pattern, tentando di risparmiare un numero significativo di occorrenze valide
Invece di effettuare una ricerca esaustiva dei patterns che occorrono in ogni sequenza, si cercano pattern che occorrono in un loro sottoinsieme
L’algoritmo ha bisogno in input solo di un prefissato rapporto di errore
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Weeder (2001)
Input: un insieme di sequenze e un rapporto di errore
Output: tutti i pattern che occorrono in almeno q sequenze con al più m mutazioni
Le mutazioni non possono essere concentrate all’inizio del pattern
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Weeder (2001)
Dato un pattern P = p1p2....pm, l’algoritmo può trovare tutte le occorrenze valide di P (con al più |P| mutazioni), tale che al più i mutazioni occorrono nei primi i caratteri del pattern
Ma: alcune occorrenze del pattern possono venire dimenticate completamente
I segnali di DNA sono sempre così “puliti” da mostrarsi decomposti in blocchi? La risposta è no, ma si può usare Weeder con buon senso
40
Uso di Weeder
Esempio: pattern (15,4) che occorre in 20 sequenze i.i.d.
Possibili occorrenze valide (decomposte in blocchi): 829
Possibili occorrenze totali: 1365
Probabilità di “centrare” un’occorrenza possibile in una sequenza:
phit = .61
Probabilita di trovare il pattern in ogni sequenza: come tentare di vincere all’Enalotto!
Se si cercano pattern che occorrono in almeno 10 sequenze, la probabilità di vedere il pattern almeno 10 volte è:
Phit(20,10) = .89
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Uso di Weeder
Si può usare Weeder come setaccio, per filtrare il set di pattern candidati
Tutti i pattern trovati da Weeder in almeno q sequenze possono essere ricercati nuovamente nelle sequenze, questa volta senza restrizione sulla posizione dei mismatch
Ci si aspetta che il numero dei pattern (pattern casuali diversi dal segnale reale) passati alla seconda fase sia molto più piccolo di quello originale (e non più esponenziale)
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Uso di Weeder
La probabilità di trovare un pattern in una sequenza dipende dalla sua lunghezza e dal rapporto di errore
La probabilità di trovare un pattern in un insieme di sequenze (e in questo modo la scelta del quorum q per la prima fase) dipende dal numero di sequenze
Lo stesso approccio può essere applicato quando il segnale non compare in ogni sequenza
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Uso di Weeder
Quando ci si aspetta che il segnale da trovare sia corto, l’algoritmo può essere usato in exact mode
Per segnale più lungo, più è basso il quorum q, più sarà alta la probabilità di trovare il segnale
Ma: anche il numero di pattern che soddisfano i vincoli di input è più elevato, e il programma è più lento
L’utente può scegliere un opportuno trade-off tra tempo e accuratezza
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Complessità teorica in tempo
Approccio naïve O(4men)
Approccio con suffix tree (Sagot, 1998) O(4emekn) con n dimensione dell’input, m lunghezza del pattern ed e numero di mutazioni permesse
Weeder O((1/)e4ekn) con e numero di mutazioni che occorrono nel più lungo pattern trovato
45
Conclusioni
Metodi esaustivi Adatti per pattern corti e analisi di dati once-for-all (ad esempio per interi genomi)
Metodi Sequence Driven Danno risposte più veloci ma meno accurate
Per dati di dimensione limitata
E’ possibile scegliere un trade-off tra tempo e accuratezza
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Cosa troviamo sicuramente
Pattern corti
Pattern che occorrono esatti almeno una volta
Pattern composti da posizioni conservate e quelli wildcard (senza limiti di lunghezza, eccetto...)
DNA pattern con mutazioni (probabilmente! Ma si deve sapere quante mutazioni sono permesse)
Per il resto..... good luck!