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UNIVERSIDADE PRESBITERIANA MACKENZIE
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
CAROLINE RICCE ESPADA
ESTUDO DA SUSCETIBILIDADE À MILTEFOSINA EM ISOLADOS DE
Leishmania (Viannia) braziliensis
São Paulo
2014
UNIVERSIDADE PRESBITERIANA MACKENZIE
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
CAROLINE RICCE ESPADA
ESTUDO DA SUSCETIBLIDIDADE À MILTEFOSINA EM ISOLADOS DE
Leishmania (Viannia) braziliensis
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Centro de Ciências Biológicas e da Saúde da Universidade Presbiteriana Mackenzie como requisito para a obtenção do grau de Bacharel em Ciências Biológicas.
Orientador de TCC: Prof. Dr. Jan Carlo Morais O. B. Delorenzi
Orientador de Iniciação Científica: Dr. Adriano C. Coelho
São Paulo
2014
CAROLINE RICCE ESPADA
ESTUDO DA SUSCETIBLIDIDADE À MILTEFOSINA EM ISOLADOS DE
Leishmania (Viannia) braziliensis
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao
Centro de Ciências Biológicas e da Saúde da
Universidade Presbiteriana Mackenzie como
requisito para a obtenção do grau de Bacharel em
Ciências Biológicas.
Aprovada em ___/___/____
BANCA EXAMINADORA
___________________________________________________________________
Prof. Dr. Jan Carlo Morais O. B. Delorenzi – Orientador de TCC
Universidade Presbiteriana Mackenzie
__________________________________________________________________
Dr. Adriano Cappellazzo Coelho – Orientador de Iniciação Científica
Universidade de São Paulo
_________________________________________________________________
Profa. Dra. Camila Sacchelli Ramos
Universidade Presbiteriana Mackenzie
AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer à Universidade Presbiteriana Mackenzie e ao Centro
de Ciências Biológicas e da Saúde (CCBS) por me proporcionar um ensino de
qualidade, pela preocupação com a formação social de seus alunos e pelas
vivências que muito me ensinaram. A todos os professores do curso de Ciências
Biológicas e em especial para o meu orientador do Trabalho de Conclusão de Curso
(TCC), Prof. Dr. Jan Carlo Morais O. B. Delorenzi por todo o suporte.
Ao Instituto de Ciências Biomédicas (ICB) da Universidade de São Paulo,
mais precisamente ao Departamento de Parasitologia, pelo espaço cedido para a
realização desse trabalho e por todo o suporte que me foi dado.
Ao meu orientador de iniciação científica, Dr. Adriano Cappellazzo Coelho por
todos os ensinamentos, pela paciência infinita, pelo carinho e preocupação com a
minha formação e futuro, além da enorme ajuda para a confecção desse trabalho.
À Profa. Dra. Silvia Reni Bortolin Uliana, por abrir as portas de seu laboratório
para mim e acreditar no meu trabalho. Pela paciência, pelos conselhos e pelo seu
enorme coração.
À Jenicer por ser minha mãe do laboratório, sempre se preocupando comigo
e me ensinando a dar meus primeiros passos. Agradeço também a todos os
membros da nossa equipe: Jordana, agradeço por quebrar meu galho em vários
experimentos, pelas noites de pizza e filme, pelas conversas e conselhos. Cris,
agradeço pelo apoio, por me acalmar dizendo que as coisas dariam “ceeeerrrrrto”.
Ju, obrigada pelas dicas nos experimentos, pelas caronas e pelo carinho.
À FAPESP pelo apoio financeiro.
Aos membros da banca Dr. Adriano Cappellazzo Coelho, Prof. Dr. Jan Carlo
Morais B. O. Delorenzi e Profa. Dra. Camila Sacchelli Ramos por terem aceitado o
convite.
À minha amada mãe, por todo o apoio dado, todos os ensinamentos que me
passou, toda a ajuda que me deu e por em momento algum me deixar desistir dos
meus sonhos.
Ao meu pai, por me ensinar a seguir sempre pelo caminho certo, por me
lembrar sempre a importância de buscar minha independência e correr atrás dos
meus sonhos.
Agradeço a ambos por me apoiarem sempre e nunca desistirem de mim, por
me guiarem pelo caminho certo me incentivando a ser uma mulher independente e
ao mesmo tempo me dando todo o amor mais sincero deste mundo.
À minha tia Maria Luisa por todo o apoio na minha formação desde pequena e
por me encorajar a seguir os meus sonhos.
Ao meu namorado e melhor amigo Victor Amorim pela paciência e cuidado.
Por ser meu psicólogo, me ajudar sempre e me encorajar frente às complicações.
Ao meu querido e muito amado pipoca que infelizmente nos deixou. Obrigada
por sempre me colocar um sorriso no rosto e por ser a criatura mais amável desse
mundo, que você fique em paz no paraíso dos porquinhos da índia e saiba que eu
jamais vou te esquecer.
Aos meus amigos da graduação, por sempre me fazerem sorrir, por me
ensinarem que é possível conviver com pessoas tão diferentes de maneira
harmônica, respeitando a todos. Pelos conselhos e por toda a ajuda, não sei mesmo
como agradecer, muito obrigada seus lindos. Agradeço em especial à Maísa
Assano, à Mayra Gaspar e à Amanda Alves, pelos conselhos, sobretudo, pelas
risadas, pelo carinho e por estarem sempre por perto quando eu precisei.
Por fim, gostaria de agradecer a todos meus amigos de infância, da faculdade
e do Departamento de Parasitologia do ICB-USP pela ajuda e a toda a minha família
que sempre acreditou em mim, muito obrigada.
“I am among those who think that science
has great beauty. A scientist in his laboratory
is not only a technician: he is also a child
placed before natural phenomena which
impress him like a fairy tale”.
(Marie Curie)
RESUMO
Leishmania (Viannia) braziliensis é a principal espécie causadora da
leishmaniose cutânea no Brasil, com cerca de 22 mil novos casos por ano. O
principal fármaco utilizado para a quimioterapia da leishmaniose é o antimoniato de
meglumina que exige administração parenteral e possui alta toxicidade. A miltefosina
é uma alquilfosfocolina de uso oral já utilizada para o tratamento de leishmaniose
visceral na Ásia e na Europa, mas ainda não aprovada para o uso no Brasil. Neste
estudo, foi avaliada a suscetibilidade à miltefosina de 10 isolados clínicos de L. (V.)
braziliensis e de uma cepa referência in vitro. Primeiramente, as espécies dos
isolados clínicos foram identificadas por meio da amplificação da região do
espaçador transcrito interno do DNA ribossomal (ITS) e do gene da Heat Shock
Protein 70 (hsp70) seguida de digestão com a enzima de restrição HaeIII permitindo
deste modo confirmar que se tratavam de isolados de L. (V.) braziliensis.
Posteriormente, foram determinadas as concentrações inibitórias de miltefosina para
as formas promastigotas e amastigotas dos parasitas. Observou-se diferença
significativa na CI50 das formas promastigotas que variaram entre 22,93 e 144,2 µM
de miltefosina. Em amastigotas, as concentrações inibitórias para a miltefosina
variaram entre 0,85 e 4,3 µM. Foi observado ainda que as formas amastigotas são
mais sensíveis que as promastigotas. Estes resultados contribuirão para avaliar o
potencial da miltefosina no tratamento da leishmaniose no Brasil.
Palavras-chave: leishmaniose, Leishmania braziliensis, miltefosina, suscetibilidade
a drogas.
ABSTRACT
Leishmania (Viannia) braziliensis is the main causative specie of leishmaniasis
in Brazil with about 22,000 new cases per year. First line drug used for leishmaniasis
chemotherapy is meglumine antimoniate, which requires parenteral administration
and is toxic. Miltefosine, an alkylphosphocholine, is an oral drug already in use for
the treatment of visceral leishmaniasis in Asia and Europe, but still not approved for
use in Brazil. In this study, we evaluated the susceptibility to miltefosine of 10 clinical
isolates of L. (V.) braziliensis and of a reference strain in vitro. First, the clinical
isolates species were identified by amplification of internal transcribed spacer of
ribosomal DNA (ITS) and the Heat Shock Protein 70 (hsp70) gene, followed by
digestion with the restriction enzyme HaeIII. It was confirmed that all the isolates
species were L. (V.) braziliensis. Subsequently, we determined the inhibitory
concentrations of miltefosine for promastigotes and amastigotes. A significant
difference between the CI50 in promastigotes form of these isolates was found, which
ranged between 22,93 and 144,2μM for miltefosine. In amastigotes the inhibitory
concentrations for miltefosine ranged between 0,85 and 4,3mM. It was found that the
amastigotes are more susceptible than promastigotes. These findings will contribute
to evaluate miltefosine’s potential for leishmaniasis treatment in Brazil.
Keywords: leishmaniasis, Leishmania braziliensis, miltefosine, drug suceptiblity.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Ciclo biológico da Leishmania sp. Fonte: CDC
http://www.dpd.cdc.gov/dpdx. .................................................................................... 16
Figura 2 - Distribuição geográfica do local de isolamento dos 10 isolados clínicos de
L. (V.) braziliensis obtidos de pacientes com leishmaniose cutânea e da cepa
referência 1975/M2903.............................................................................................. 27
Figura 3 - (A) Representação esquemática da organização genômica das unidades
de repetição do DNAr e a localização dos iniciadores utilizados para a amplificação
do ITS (setas em cinza). SSU e LSU são respectivamente as regiões que codificam
as subunidades maior e menor do ribossomo. (B) Eletroforese em gel de agarose
0,8% do produto amplificado do ITS com os iniciadores IR1 e IR2. Foi utilizado como
marcador de peso molecular o fago λ digerido com HindIII. 1- L. (L.) infantum
chagasi, 2- L. (V.) naifii, 3- L. (V.) lainsoni, 4- L. (L.) amazonensis, 5- L. (V.) shawi, 6-
L. (V.) guyanensis, 7- L. (V.) braziliensis M2903. (C) Eletroforese em gel de agarose
0,8% da digestão do produto amplificado com a enzima de restrição HaeIII. Foi
utilizado como marcador de peso molecular o 100 pb Ladder. 1- L. (L.) infantum
chagasi, 2- L. (L.) amazonensis 2269, 3- L. (V.) braziliensis M2903, 4- L. (V.) shawi,
5- L. (V.) naiffi, 6- L. (V.) lainsoni, 7- L. (V.) guyanensis. ........................................... 35
Figura 4 - (A) Representação esquemática da organização genômica do gene hsp70
e a respectiva localização dos iniciadores utilizados para sua amplificação (setas em
cinza). (B) Eletroforese em gel de agarose 0,8% do produto amplificado do gene
hsp70 com os iniciadores F25 e R1310. Foi utilizado como marcador de peso
molecular o fago λ digerido com HindIII. 1- L. (V.) naiffi, 2- L. (V.) shawi, 3- L. (V.)
guyanensis, 4- L. (V.) braziliensis M2903, 5- L. (L.) infantum chagasi, 6- L. (V.)
lainsoni, 7- L. (L.) amazonensis 2269. A seta laranja indica o fragmento de
aproximadamente 1,2 kb. (C) Eletroforese em gel de agarose 3% da digestão do
produto amplificado do gene hsp70 com a enzima de restrição HaeIII. Foi utilizado
como marcador de peso molecular o 100 pb Ladder. 1- L. (L.) infantum chagasi, 2- L.
(L.) amazonensis 2269, 3- L. (V.) braziliensis M2903, 4- L. (V.) shawi, 5- L. (V.) naiffi,
6- L. (V.) lainsoni, 7- L. (V.) guyanensis. ................................................................... 36
Figura 5 – (A) Eletroforese em gel de agarose 0,8% do produto amplificado do ITS
do DNA ribossomal dos isolados com os iniciadores IR1 e IR2. Foi utilizado como
marcador de peso molecular o fago ʎ digerido com HindIII. A seta verde indica o
fragmento de 1 kb esperado. (B) Representação esquemática do produto
amplificado contendo os sítios para a enzima de restrição HaeIII. Os produtos
oriundos da digestão estão indicados. (C) Eletroforese em gel de agarose 3% da
digestão do produto amplificado do gene hsp70 dos isolados com a enzima de
restrição HaeIII. Foi utilizado como marcador de peso molecular o 100 pb Ladder.
Legenda: 1- 1975/M2903, 2- LTCP 19446, 3- LTCP 19512, 4- LTCP 16907, 5- LTCP
16012, 6- 2006/PPS, 7- 2006/BES, 8- 2003/IMG, 9- 2006/EFSF, 10- 2005/WSS e 11-
2006/HPV. ................................................................................................................. 37
Figura 6 – (A) Eletroforese em gel de agarose 0,8% do produto amplificado do gene
hsp70 dos isolados com os iniciadores F25 e R1310. Foi utilizado como marcador de
peso molecular o fago λ digerido com HindIII. A seta laranja indica o fragmento de
aproximadamente 1,2 kb esperado. (B) Representação esquemática do produto
amplificado contendo os sítios para a enzima de restrição HaeIII. Os produtos
oriundos da digestão estão indicados. (C) Eletroforese em gel de agarose 3% da
digestão do produto amplificado do gene da hsp70 dos isolados com a enzima de
restrição HaeIII. Foi utilizado como marcador de peso molecular o 100pb Ladder.
Legenda: 1- 1975/M2903, 2- LTCP 19446, 3- LTCP 19512, 4- LTCP 16907, 5- LTCP
16012, 6- 2006/PPS, 7- 2006/BES, 8- 2003/IMG, 9- 2006/EFSF, 10- 2005/WSS e 11-
2006/HPV. ................................................................................................................. 38
Figura 7 – Suscetibilidade à miltefosina de formas promastigotas dos 10 isolados
clínicos e da cepa referência 1975/M2903 utilizados neste estudo. (A) Média dos
valores de CI50. (B) Média dos valores de CI90 determinados pelo teste de MTT. ..... 41
Figura 8 – Suscetibilidade à miltefosina das formas promastigotas dos 10 isolados
clínicos de L. (V.) braziliensis. Os isolados foram agrupados de acordo com a
suscetibilidade ao fármaco (Azul: 20-45 µM), (Verde: 50-99 µM), (Bege: 100-200µM).
O ponto em vermelho representa a cepa referência 1975/M2903 Os grupos são
estatisticamente diferentes quando comparados entre si. *p<0.0001 ANOVA e
Tukey’s “multiple comparison test”. ........................................................................... 42
Figura 9 – Suscetibilidade de macrófagos medulares à miltefosina. Porcentagem de
sobrevivência dos macrófagos medulares em diferentes concentrações de
miltefosina (A). Curva sigmoidal refletindo o decaimento da viabilidade celular
quando há aumento da exposição à miltefosina (B). Média de 3 experimentos
independentes realizados em triplicata. .................................................................... 43
Figura 10 - Porcentagens de infecção obtidas para os isolados clínicos de L. (V.)
braziliensis. Estão representados a taxa de infecção obtida em dois ou mais
experimentos realizados em duplicata. ..................................................................... 44
Figura 11 – Suscetibilidade à miltefosina de amastigotas intracelulares de
macrófagos tratados com miltefosina. Os macrófagos foram infectados com a cepa
referência 1975/M2903 utilizando uma proporção de 30:1 por 4 horas e então
incubados por 72 horas na presença de concentrações crescentes de miltefosina (A)
0µM; (B) 3µM; (C) 5µM; (D) 10µM; (E) 15µM; (F) 25µM (aumento de 400X). ........... 45
Figura 12 – Suscetibilidade à miltefosina das formas amastigotas intracelulares dos
sete isolados clínicos e da cepa referência 1975/M2903 de L. (V.) braziliensis. (A)
Média dos valores de CI50. (B) Média dos valores de CI90. ....................................... 47
Figura 13 – Suscetibilidade à miltefosina dos isolados clínicos e da cepa referência
de L. (V.) braziliensis. Os valores de CI50 para as formas promastigotas e
amastigotas estão indicados. O ponto em vermelho refere-se ao valor para a cepa
referência. * p<0,0001 Teste t não pareado. ............................................................. 48
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Suscetibilidade à miltefosina in vitro de diferentes espécies de Leishmania
sp. ............................................................................................................................. 22
Tabela 2 - Porcentagem de cura para isolados clínicos de diferentes espécies de
Leishmania causadores de leishmaniose cutânea após tratamento com a miltefosina.
.................................................................................................................................. 23
Tabela 3 – Dados clínicos dos pacientes infectados com os respectivos isolados de
L. (V.) braziliensis utilizados neste estudo................................................................. 28
Tabela 4- Atividade in vitro da miltefosina contra as formas promastigotas dos
isolados clínicos de L. (V.) braziliensis. ..................................................................... 40
Tabela 5 - Atividade in vitro da miltefosina contra as formas amastigotas
intracelulares dos isolados clínicos de L. (V.) braziliensis. ........................................ 46
LISTA DE ABREVIATURAS
CC50 Concentração de miltefosina citotóxica 50%
CI50 Concentração de miltefosina que inibe o crescimento em 50%
CI90 Concentração de miltefosina que inibe o crescimento em 90%
CO2 Gás carbônico
DNA Ácido desoxirribonucleico
D.O. Densidade óptica
g Grama
hsp70 Heat Shock Protein 70
IR Índice de resistência
ITS Espaçador transcrito interno
kDNA DNA do cinetoplasto
Kg Kilograma
LM Leishmaniose cutânea
ʎ Lambda
MC Leishmaniose mucocutânea
µM Micromolar
µL Microlitro
mg Miligrama
mL Mililitro
mM Milimolar
M Molar
MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina
ng Nanograma
ND Não determinado
nm Nanômetro
PBS Solução salina tamponada com fosfato
PCR Reação em cadeia da polimerase
pH Potencial hidrogeniônico
RFLP Fragmento de restrição de comprimento
RNA Ácido ribonucleico
RPM Rotações por minuto
SDS Dodecil sulfato de sódio
U Unidades
UV Ultravioleta
v Volume
21G 21 gauge
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 15
1.1 GÊNERO Leishmania sp. E LEISHMANIOSES ................................................ 15
1.2 DIAGNÓSTICO ................................................................................................ 18
1.3 TRATAMENTO ................................................................................................ 19
2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 24
3 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 25
3.1 FÁRMACO ....................................................................................................... 25
3.2 CULTIVO DOS PARASITAS ........................................................................... 25
3.3 IDENTIFICAÇÃO DOS ISOLADOS DE L. (V.) braziliensis ........................... 25
3.3.1 Extração de DNA genômico .................................................................... 25
3.3.2 Reação em cadeia da polimerase (PCR) e digestão com a enzima de
restrição HaeIII .................................................................................................. 28
3.4 ATIVIDADE DA MILTEFOSINA CONTRA FORMAS PROMASTIGOTAS DE
L. (V.) braziliensis IN VITRO ................................................................................ 30
3.5 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DA MILTEFOSINA CONTRA AMASTIGOTAS
INTRACELULARES DE L. (V.) braziliensis ......................................................... 30
3.5.1 Obtenção de macrófagos de medula óssea .......................................... 30
3.5.2 Citotoxicidade da miltefosina para macrófagos medulares................. 31
3.5.3 Atividade da miltefosina contra amastigotas intracelulares de L. (V.)
braziliensis ........................................................................................................ 31
3.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................................. 32
4 RESULTADOS ....................................................................................................... 33
4.1 IDENTIFICAÇÃO DOS ISOLADOS DE L. (V.) braziliensis ........................... 33
4.2 ATIVIDADE DA MILTEFOSINA CONTRA PROMASTIGOTAS DE L. (V.)
braziliensis IN VITRO ........................................................................................... 39
4.3 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DA MILTEFOSINA CONTRA AMASTIGOTAS
INTRACELULARES DOS ISOLADOS CLÍNICOS DE L. (V.) braziliensis .......... 42
4.3.1. Citotoxicidade da miltefosina para macrófagos medulares................ 42
4.3.2. Atividade da miltefosina contra amastigotas intracelulares de L. (V.)
braziliensis ........................................................................................................ 43
5 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 49
6 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 54
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 55
15
1 INTRODUÇÃO
1.1 GÊNERO Leishmania sp. E LEISHMANIOSES
Os parasitos do gênero Leishmania sp. são protozoários flagelados da ordem
Kinetoplastida, família Trypanosomatidae. Essa ordem agrupa organismos que
apresentam cinetoplasto, uma organela característica que contém DNAs circulares
(os maxicírculos e minicírculos) correspondentes ao DNA mitocondrial, também
conhecido como kDNA (NEUBER, 2008; REY, 2008)
As leishmânias são parasitas dimórficos, ou seja, possuem duas formas ao
longo do seu ciclo de vida, promastigota e amastigota (Figura 1). Existem cerca de
20 espécies responsáveis por causar a leishmaniose, subdivididas em dois
subgêneros: Leishmania e Viannia. Os parasitas do subgênero Leishmania
desenvolvem-se dentro do intestino médio e do intestino anterior dos flebotomíneos.
Já os pertencentes ao subgênero Viannia passam por uma fase de desenvolvimento
adicional dentro do intestino grosso (LAINSON; SHAW, 1987; RANGEL; LAINSON,
2009). O protozoário atinge o hospedeiro mamífero por intermédio de um inseto
hematófago, dípteros flebolotomíneos do gênero Phlebotomus sp. na África, Europa
e Ásia e do gênero Lutzomyia sp., nas Américas. Cerca de 70 espécies de
flebotomíneos são vetores da Leishmania (MURRAY et al., 2005). Estes possuem
atividade noturna, são silenciosos e relativamente pequenos (de dois a três
milímetros) o que possibilita que atravessem as telas anti-mosquito colocadas nas
janelas das casas (HEPBURN, 2000).
O ciclo de vida do parasita se inicia quando o inseto fêmea realiza o repasto
sanguíneo em uma pessoa ou animal infectado (Figura 1). A forma amastigota, sem
flagelo externalizado, é ingerida juntamente com o sangue. No intestino do inseto a
forma amastigota se transforma em promastigota, forma com flagelo, adere ao
epitélio e nesse local ocorre uma intensa atividade multiplicadora. O aumento da
população se dá por fissão binária (ASHFORD, 2000; ROBERTS; JANOVY, 2009),
embora, estudos recentes utilizando marcadores de resistência a drogas
evidenciaram a ocorrência de troca de material genético em L. (L.) major e
consequentemente a formação de parasitas híbridos (AKOPYANTS et al., 2009).
Depois de quatro ou cinco dias, os protozoários promastigotas procíclicos (que
possuem capacidade de divisão) migram para o esôfago e se transformam em
16
promastigotas metacíclicos, forma infectiva para o hospedeiro vertebrado e que
apresenta uma maior motilidade. Ao sugar o sangue, o inseto realiza grande esforço
e após a sucção, a musculatura relaxa causando regurgitação do material aspirado.
Desse modo, o inseto vetor inocula os parasitas na corrente sanguínea do
hospedeiro vertebrado. Os promastigotas metacíclicos são então fagocitados por
células do sistema fagocítico mononuclear, principalmente macrófagos, e dentro dos
vacúolos parasitóforos, onde encontram as condições ideais de pH e temperatura,
se transformam na forma amastigota. Os parasitas dentro do macrófago se dividem
e rompem a célula, liberando novamente os amastigotas na corrente sanguínea.
Estes são novamente fagocitados pelos macrófagos ou ainda podem ser ingeridos
durante o repasto sanguíneo pelo inseto flebotomíneo, recomeçando o ciclo
(BATES, 1994; REY, 2008; ROBERTS; JANOVY, 2009).
Figura 1 - Ciclo biológico da Leishmania sp. Fonte: CDC http://www.dpd.cdc.gov/dpdx.
17
Há quatro tipos de manifestações clínicas da doença, que estão relacionadas,
dentre outros fatores, com a respectiva espécie causadora (ASHFORD, 2000; REY,
2008):
A forma cutânea caracteriza-se por lesões tegumentares localizadas
que podem vir a ser ulcerosas e são naturalmente curadas, sendo que após a
picada do vetor a doença pode se desenvolver ou não após um período de
incubação de uma a doze semanas (HEPBURN, 2000). No Brasil, 7 espécies são
responsáveis por causar a leishmaniose cutânea sendo as principais espécies: L.
(V.) braziliensis, L. (L.) amazonensis e L. (V.) guyanensis (MURRAY et al., 2005).
A forma mucocutânea consiste em lesões destrutivas nas mucosas
oral, nasal e/ou faríngea. Esta forma de manifestação clínica está principalmente
relacionada com a espécie L. (V.) braziliensis (HEPBURN, 2000).
A forma cutânea difusa aparece normalmente em indivíduos anérgicos
ou cujo sistema imune está muito debilitado e se caracteriza por lesões
disseminadas pelo corpo. Estas lesões são de difícil cura, uma vez que não
cicatrizam sem o auxílio de fármacos e podem reincidir após o tratamento. No Brasil,
esta forma de manifestação clínica está relacionada com L. (L.) amazonensis
(HEPBURN, 2000).
A forma visceral (ou calazar) é a mais severa e é caracterizada pelo
aumento do baço e do fígado devido a um tropismo do parasita para esses órgãos e
para medula óssea podendo levar ao óbito se não tratada (ASHFORD, 2000;
HEPBURN, 2000; DESJEUX, 2004; REY, 2008). No Brasil, a espécie causadora da
leishmaniose visceral é L. (L.) infantum chagasi (MURRAY et al., 2005).
A co-infecção com o vírus HIV pode agravar os quadros da doença
dificultando a cura, uma vez que prejudica a resposta imune do indivíduo, sendo
extremamente preocupante principalmente quando associada à forma visceral da
doença (ASHFORD, 2000; HEPBURN, 2000; DESJEUX, 2004; REY, 2008).
As leishmanioses mostram uma tendência crescente preocupante, com
aproximadamente 1,3 milhões de novos casos e 20 a 30 mil mortes por ano. A
doença é endêmica em 98 países e afeta principalmente regiões mais pobres uma
vez que nesses locais há privação de uma alimentação adequada e alta incidência
18
de doenças imunossupressoras, o que pode favorecer a baixa imunidade e resultar
consequentemente na manifestação clínica da doença (HEPBURN, 2000;
DESJEUX, 2004; WHO, 2014). Com base em estimativas, aproximadamente 0,7 a
1,2 milhões de casos de leishmaniose cutânea ocorrem a cada ano. Dez países
englobam 70 a 75% desses casos, sendo eles Afeganistão, Argélia, Colômbia,
Brasil, Irã, Síria, Etiópia, Sudão, Costa Rica e Peru. No Brasil, L. (V.) braziliensis é a
principal espécie causadora de leishmaniose cutânea podendo também causar a
forma mucocutânea. Entre os anos de 2003 a 2007, 26 mil casos de leishmaniose
cutânea por ano foram reportados no país (ALVAR et al., 2012; WHO, 2014).
1.2 DIAGNÓSTICO
O diagnóstico da leishmaniose pode ser feito por exames parasitológicos,
imunológicos e moleculares.
Os exames parasitológicos podem ser feitos de forma direta e indireta:
Direta: busca do parasito em material obtido por escarificação, biópsia ou
por aspirados de lesão, medula óssea e baço. Esse método é rápido e de baixo
custo, porém a sua sensibilidade varia com o tempo de evolução da doença
(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2007).
Indireta: isolamento e cultivo do parasito em meios de cultura. Após o
quinto dia pode-se encontrar promastigotas na cultura (MINISTÉRIO DA SAÚDE,
2007).
Os principais exames imunológicos utilizados são:
Teste intradérmico (Intradermoreação de Montenegro): injeção
intradérmica de antígeno de Leishmania sp. Trata-se de um teste de
hipersensibilidade tardia. O resultado é avaliado após 48 horas fazendo-se a
medição do tamanho da reação no local que foi injetado o antígeno. Essa reação
geralmente persiste positiva mesmo após o tratamento ou a cura espontânea da
lesão, desse modo, os resultados devem ser interpretados com cuidado
(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2007).
19
Testes sorológicos: detecção de anticorpos anti-Leishmania no soro dos
pacientes por meio de ensaio Imunoenzimático e de imunofluorescência indireta.
Devido à reação cruzada com outras doenças, estes testes não devem ser
realizados isoladamente (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2007).
Os métodos moleculares consistem, em geral, no uso da reação em cadeia
da polimerase (PCR) tendo como alvos tanto o DNA genômico como o kDNA
(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2007). A PCR é utilizada majoritariamente para fins de
pesquisa e raramente no diagnóstico, porém, se utilizada juntamente com os demais
testes parasitológicos pode aumentar sua sensibilidade. Por este método, pode-se
identificar inclusive a espécie causadora da doença no paciente, o que auxilia nos
estudos de monitoramento epidemiológico (PEREZ et al., 2007), no entendimento da
manifestação clínica da doença e em possíveis previsões do sucesso ou falha no
tratamento clínico já estes podem estar relacionados com a espécie causadora.
Diferentes alvos de amplificação são utilizados pela técnica de PCR, dentre eles, os
minicírculos do kDNA (SPITHILL; GRUMONT, 1984) o espaçador transcrito interno
do DNA ribossomal (ITS) (CUPOLILLO et al., 1995), o gene META2 (ZAULI-
NASCIMENTO et al., 2010), o gene da glucose 6-fosfato desidrogenase (CASTILHO
et al., 2003), o gene da Heat Shock Protein 70 (hsp70) (MONTALVO et al., 2012),
gene mini-exon (MARFURT et al., 2003), dentre outros.
Estes marcadores têm como característica conter regiões conservadas entre
as espécies, o que possibilita o reconhecimento pelo mesmo iniciador em todas elas,
e regiões polimórficas que irão resultar em um padrão de bandas diferenciado após
a digestão com enzimas de restrição (RFLPs) ou ainda através do sequenciamento
direto do produto amplificado, possibilitando assim a discriminação das diferentes
espécies do parasito.
1.3 TRATAMENTO
Como não há formas de prevenção efetiva para a leishmaniose, o controle é
baseado no tratamento da doença. Os fármacos de primeira escolha para a
leishmaniose cutânea e visceral no Brasil são os antimoniais pentavalentes
20
(Pentostam® e Glucantime®) introduzidos para o uso em 1945. Sua larga utilização
muitas vezes interrompida, devido as dificuldades oriundas de sua manipulação
parenteral, favorece o aparecimento de casos de resistência adquirida pelo parasita,
devido principalmente ao abandono do tratamento decorrente dos efeitos colaterais
(CROFT et al., 2003a; SUNDAR, 2001). Além disso, diversos efeitos colaterais são
descritos como anorexia, hepatotoxicidade, nefrotoxicidade, mialgias e arritmia
cardíaca (CROFT et al., 2003b). A anfotericina B, fármaco de segunda escolha, é
utilizada caso os antimoniais se mostrem ineficientes. A droga é tóxica podendo
levar a falência renal, e sua administração é parenteral. O desenvolvimento da
composição associada a lipídios diminuiu muito a toxicidade devido à redução da
dose, porém sua formulação é muito cara o que inviabiliza a utilização em áreas
endêmicas, onde há um grande número de pessoas com a doença (HEPBURN,
2000; CROFT et al., 2003b). A pentamidina demonstrou efeito no tratamento da
leishmaniose cutânea, cutânea difusa e visceral, mas sua toxicidade é muito alta,
sendo seu uso indicado apenas para casos refratários ao tratamento com os
antimoniais e a anfotericina B (CROFT et al., 2003b; MURRAY et al., 2005).
A miltefosina, ou hexadecilfosfocolina é uma alquilfosfocolina inicialmente
sintetizada para o tratamento do câncer de mama (DORLO et al., 2012). O fármaco
demonstrou atividade contra tripanossomatídeos (CROFT; ENGEL, 2006) sendo
posteriormente aprovado para o tratamento da leishmaniose visceral na Índia (JHA
et al., 1999). É o único medicamento administrado por via oral para o tratamento das
leishmanioses e é considerado o medicamento de escolha na Índia com elevada
incidência de casos de resistência aos antimoniais para o tratamento da
leishmaniose visceral (JHA et al., 1999; SUNDAR et al., 2002). Em 2004, o fármaco
foi aprovado para uso no tratamento da leishmaniose cutânea na Colômbia após
demostrar eficácia similar quando comparada aos antimoniais pentavalentes (SOTO
et al., 2004). Testes clínicos realizados no Brasil mostraram uma eficácia maior da
miltefosina quando comparada aos antimoniais (MACHADO et al., 2010). A
comprovação da eficácia associada ao uso oral (DORLO et al., 2012) faz da
miltefosina um fármaco potencial, uma vez que não é necessária hospitalização para
sua administração, diminuindo assim os riscos de infecções e possibilitando o
tratamento em regiões mais afastadas dos grandes centros urbanos.
21
A elevada meia-vida da miltefosina no corpo associada com a variedade na
suscetibilidade das espécies causadoras da leishmaniose (ESCOBAR et al., 2002;
YARDLEY et al., 2005) são questões problemáticas, uma vez que os parasitas não
são completamente eliminados após o tratamento o que pode levar ao surgimento
de parasitas resistentes. O que se observa é que além da diferença de
suscetibilidade in vitro entre as diferentes espécies de Leishmania (Tabela 1), há
uma variação na suscetibilidade em isolados de uma mesma espécie (FERNANDEZ
et al., 2014). Além disso, o sucesso no tratamento varia entre as espécies o que
pode dificultar o estabelecimento de uma droga eficaz em todas as regiões (CROFT;
OLLIARO, 2011). Ensaios envolvendo pacientes da Colômbia e da Guatemala
infectados com L. (V.) braziliensis mostraram que a suscetibilidade do parasita à
miltefosina varia nessas regiões dependendo da espécie e do isolado clínico (SOTO;
BERMAN, 2006). A taxa de cura para infecções por L. (V.) braziliensis mostrou-se
variável em diferentes regiões, sendo de 33% na Guatemala (SOTO; BERMAN,
2006) e 70% na Colômbia (VELEZ et al., 2010). No Brasil apenas dois estudos
foram realizados e mostraram uma eficácia de cerca de 70% para infecções por L.
(V.) braziliensis e L. (V.) guyanensis em pacientes com leishmaniose cutânea
(MACHADO et al., 2010; CHRUSCIAK-TALHARI et al., 2011). Esses dados mostram
uma eficácia menor no tratamento para os casos de leishmaniose tegumentar
quando comparada com a taxa de 95% observada para a leishmaniose visceral na
Índia (JHA et al., 1999). É importante ressaltar ainda que uma redução de eficácia
tem sido observada nos últimos anos para o tratamento da leishmaniose visceral
utilizando a miltefosina (SUNDAR et al., 2012; RIJAL et al., 2013).
A miltefosina ainda não é utilizada em larga escala no Brasil e existe grande
interesse e potencial para a sua aplicação, tanto por representar uma alternativa
para pacientes que não respondem mais ao tratamento com os antimoniais e a
anfotericina B, como pelo fato de ser um fármaco de administração oral. Porém, é
necessário inicialmente um estudo que avalie a suscetibilidade de isolados do Brasil
à miltefosina, permitindo assim avaliar a eficácia do medicamento em regiões
endêmicas no Brasil. Estudos prévios mostraram que L. (V.) braziliensis apresenta
baixa suscetibilidade à miltefosina quando comparada com outras espécies do
parasita (Tabela 1) e que a taxa de cura da leishmaniose cutânea tratada com
miltefosina varia entre diferentes espécies e isolados de diferentes regiões
22
endêmicas (Tabela 2). Considerando que não existem relatos na literatura sobre a
suscetibilidade à miltefosina de isolados clínicos brasileiros, foi proposto neste
estudo avaliar a suscetibilidade à miltefosina em isolados clínicos de L. (V.)
braziliensis, a principal espécie causadora da leishmaniose cutânea e mucocutânea
no Brasil.
Tabela 1- Suscetibilidade à miltefosina in vitro de diferentes espécies de Leishmania sp.
Espécie Promastigotas Amastigotas Referência
L. (L.) donovani 0,45 µM 4,56 µM (ESCOBAR et al., 2002)
L. (L.) aethiopica 2,76 µM 4,92 µM (ESCOBAR et al., 2002)
L. (L.) tropica 1,74 µM 5,82 µM (ESCOBAR et al., 2002)
L. (L.) mexicana 2,37 µM 6,83 µM (ESCOBAR et al., 2002)
L. (V.) panamensis 1,30 µM 10,63 µM (ESCOBAR et al., 2002)
L. (L.) major 13,10 µM 37,17 µM (ESCOBAR et al., 2002)
L. (V.) lainsoni ND 3,7 µM (YARDLEY et al., 2005)
L. (L.) amazonensis 7,9 µM 9 µM (SANTA-RITA et al., 2004)
L. (V.) braziliensis 109 µM 17 µM (SANCHEZ-CANETE et al., 2009)
L. (V.) guyanensis ND 4,02 µM (MORAIS-TEIXEIRA et al., 2011)
L. (L.) infantum chagasi ND 4,46 µM (MORAIS-TEIXEIRA et al., 2011)
* Suscetibilidade representada pela CI50 em µM – Concentração que inibe o crescimento em 50%. ND = Não
determinado
23
Tabela 2 - Porcentagem de cura para isolados clínicos de diferentes espécies de Leishmania causadores de leishmaniose cutânea após tratamento com a miltefosina.
País Cura (%) Espécie Referência
Brasil 75% L. (V.) braziliensis (MACHADO et al., 2010)
Guatemala 33% L. (V.) braziliensis (SOTO; BERMAN, 2006)
Colômbia 70% L. (V.) braziliensis (VELEZ et al., 2010)
Colômbia 91% L. (V.) panamensis (SOTO; BERMAN, 2006)
Colômbia 60% L. (V.) panamensis (VELEZ et al., 2010)
Colômbia 92% L. (V.) panamensis (RUBIANO et al., 2012)
Brasil 71,40% L. (V.) guyanensis (CHRUSCIAK-TALHARI et al., 2011)
Colômbia 68% L. (V.) guyanensis (RUBIANO et al., 2012)
24
2 OBJETIVOS
Considerando o potencial de utilização da miltefosina para o tratamento da
leishmaniose no Brasil e da necessidade de avaliar sua eficácia em isolados clínicos
brasileiros, o objetivo deste trabalho é avaliar a suscetibilidade à miltefosina in vitro
de isolados de pacientes brasileiros infectados por L. (V.) braziliensis, de modo a
investigar sua eficácia e auxiliar na avaliação do potencial desse fármaco para o
tratamento da leishmaniose tegumentar no Brasil. Para tal, os objetivos específicos
são:
- Identificar as espécies dos isolados recebidos no laboratório e selecionar
aqueles identificados como L. (V.) braziliensis.
- Determinar as concentrações inibitórias da miltefosina para promastigotas
dos isolados clínicos de L. (V.) braziliensis.
- Determinar à citotoxicidade de macrófagos medulares de camundongos
BALB/c à miltefosina.
- Determinar as concentrações inibitórias da miltefosina para amastigotas
intracelulares dos isolados clínicos de L. (V.) braziliensis por meio de culturas de
macrófagos infectados por estes mesmos isolados.
25
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 FÁRMACO
A Miltefosina foi adquirida da companhia Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA)
e as diluições foram feitas utilizando água estéril.
3.2 CULTIVO DOS PARASITAS
As culturas de promastigotas de Leishmania foram cultivadas em meio 199
estéril (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), que foi preparado diluindo-se o pó em
água destilada. Este foi complementado com 40 mM de HEPES, pH 7,4, 0,1 mM de
adenina, 0,005% de hemina, suplementado com 10% de soro fetal bovino (Gibco®)
inativado e estéril, 100 μg/mL de penicilina/estreptomicina e 2% de urina humana
masculina. As culturas foram mantidas em estufa a 25°C e os repiques foram feitos
semanalmente. Os parasitas utilizados foram: a cepa referência de L. (V.)
braziliensis MHOM/BR/1975/M2903; e isolados obtidos de pacientes diagnosticados
com leishmaniose cutânea, sem tratamento anterior com miltefosina, sendo eles:
MHOM/BR/2006/EFSF, MHOM/BR/2005/WSS, MHOM/BR/2003/IMG,
MHOM/BR/2006/BES, provenientes de Goiás; MHOM/BR/2006/HPV proveniente de
Tocantins; MHOM/BR/2006/PPS, LCTP 16012, LCTP 19512, LCTP 16907 e LCTP
19446 provenientes da Bahia. A localização de cada um desses isolados obtidos nos
respectivos Estados brasileiros está indicada no mapa da Figura 2 e as informações
sobre os isolados encontram-se disponíveis na Tabela 3.
3.3 IDENTIFICAÇÃO DOS ISOLADOS DE L. (V.) braziliensis
3.3.1 Extração de DNA genômico
O protocolo utilizado foi aquele descrito por Medina-Acosta e Cross (1993).
Cerca 108 promastigotas de fase logarítmica de crescimento foram transferidos para
tubos cônicos e centrifugados a 3.000 RPM durante dez minutos. O sobrenadante foi
descartado e o sedimento celular foi ressuspenso em 150 μL de TELT (50 mM de
Tris 50 pH 8,0; 62,5 mM de EDTA pH 9,0; 2,5 M de LiCl e 4% de TRITON X-100),
26
com o objetivo de lisar os parasitas. Após incubação de 5 minutos a temperatura
ambiente, o conteúdo foi transferido para um tubo eppendorff, acrescido de 150 μL
de fenol-clorofórmio (1:1), sendo mantido por 5 minutos a temperatura ambiente. Em
seguida, o lisado foi centrifugado por 10.800 RPM durante 10 minutos para separar
os ácidos nucléicos dos outros componentes celulares. O sobrenadante contendo os
ácidos nucléicos foi transferido para um tubo eppendorff contendo 300 μL de etanol
absoluto, homogeneizado e incubado por 5 minutos a temperatura ambiente. A
mistura foi novamente centrifugada a 10.800 RPM durante 10 minutos. O
sobrenadante foi descartado e o etanol residual foi deixado para evaporar a 42°C. O
DNA genômico foi ressuspenso em 50 μL de TE (10 mM de Tris pH 7,0, 1 mM de
EDTA pH 8,0) contendo RNase (0,2 mg/mL) sendo incubado a 37°C durante 1 hora.
As amostras de DNA genômico foram então mantidas a 4oC.
Alternativamente, foi utilizado a extração de DNA total com o reagente
DNAzol® (Life Technology). Aproximadamente 10 mL de cultura de promastigotas
em fase logarítmica foram transferidos para um tubo cônico e centrifugados a 3.000
RPM durante 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e o sedimento celular foi
ressuspenso em 10 mL de PBS 1X (solução salina tamponada com fosfato – 137
mM NaCl; 2,7mM de KCl; 8 mM de Na2HPO4; 1,46 mM de KH2PO4; pH 7,4) 1X e
centrifugado novamente a 3.000 RPM durante dez minutos. O sobrenadante foi
descartado e o sedimento celular ressuspenso em 400 µL de solução de DNAzol®
(Life Technology), homogeneizado e a seguir foi acrescido 400 µL de etanol
absoluto. O DNA foi recolhido do tubo com o auxílio de um aro plástico e lavado em
etanol 70% por duas vezes. O aro foi deixado em um eppendorff até que o etanol
evaporasse e o DNA foi diluído em cerca de 150µL de água Mili Q. A concentração
de DNA gênomico total obtido e sua integridade foram determinadas por
espectrofotometria de luz no aparelho Nanodrop™ (Thermo Scientific).
27
Figura 2 - Distribuição geográfica do local de isolamento dos 10 isolados clínicos de L. (V.) braziliensis obtidos de pacientes com leishmaniose cutânea e da cepa referência 1975/M2903.
28
Tabela 3 – Dados clínicos dos pacientes infectados com os respectivos isolados de L. (V.) braziliensis utilizados neste estudo.
Isolado Local de moradia
Idade Forma Clínica
Tratamento Resposta
Terapêutica Tempo de Cura
Tempo de
Lesão
MHOM/BR/1975/2903
- - - - - - -
MHOM/BR/2006/BES
Goiás 41 LC Gluc/Anfo B Cura ND 8 meses
MHOM/BR/2006/ESF
Goiás 44 LC Gluc Cura ND 3 meses
MHOM/BR/2005/WSS
Goiás 22 LC Gluc Não
Retornou ND 8 meses
MHOM/BR/2006/HPV
Tocantins 46 LC Gluc Cura ND 3 meses
MHOM/BR/2006/PPS
Bahia 69 MC Não
Retornou Não
Retornou ND ND
MHOM/BR/2003/IMG
Goiás 43 LC Gluc Cura ND 45 dias
LCTP 16907 Bahia 27 LC Gluc Cura 3 meses ND
LCTP 19512 Bahia 58 LC Gluc Falha ND ND
LCTP 19446 Bahia 28 LC Gluc Cura 3 meses ND
LCTP 16012 Bahia 21 LC Gluc Cura 2 meses ND
*ND: não determinado. Gluc = Glucantime; Anfo B = Anfotericina B convencional. LC = Leishmaniose cutânea;
MC= Leishmaniose mucocutânea.
3.3.2 Reação em cadeia da polimerase (PCR) e digestão com a enzima de
restrição HaeIII
Para cada reação foi utilizado cerca de 100 ng de DNA genômico, 5 ng de
cada oligonucleotídeo (100 ng/mL), 1,5 mM de MgCl2 (25 mM), tampão Taq 1x
(Tampão 10x: 100 mM de Tris-HCl pH 8,8 a 25°C; 500 mM de KCl, 0,8% (v/v)
Nonidet P40), 0,2 mM de cada dNTP (dNTP 10 mM), 1,25 U da enzima Taq DNA
Polimerase (5 U/μL) e água Mili-Q para completar o volume final da reação. Para a
reação de PCR utilizou-se um ciclo inicial de 3 minutos a 95°C para a desnaturação,
seguido de 30 ciclos de amplificação e um ciclo de 15 minutos a 72°C para a
extensão final. As etapas de cada ciclo foram: 30 segundos a 95°C para
desnaturação, 30 segundos a 55°C para a associação do iniciador e um minuto a
29
72°C para a extensão. A região de amplificação escolhida foi o ITS (espaçador
transcrito interno) localizado entre os genes que codificam as subunidades maior e
menor do RNA ribossomal organizados em tandem, no cromossomo 27 de L. (V.)
braziliensis (Figura 3A). Os iniciadores utilizados foram: IR1: 5’ GTC GTA GGT GAA
CCT GCA GCA GCT GGA TCA TT 3’ e IR2: 5’ GCG GGT AGT CCT GCC AAA CAC
TCA GGT CTG 3’ previamente descritos (CUPOLILLO et al., 1995). Outra região
utilizada para amplificação foi a região codificadora do gene hsp70 (heat-shock
protein 70) localizado no cromossomo 28 de L. (V). braziliensis (Figura 4A), por meio
da utilização dos seguintes iniciadores: F25: 5’ GGA CGC CGG CAC GAT TKC T 3’
e R1310: 5’ CCT GGT TGT TGT TCA GCC ACT C 3’. Nesta segunda reação de
PCR, algumas condições foram modificadas. Foi utilizado um ciclo inicial de 5
minutos a 95°C para a desnaturação seguido de 35 ciclos de amplificação e um ciclo
de 10 minutos a 72°C para a extensão final. As etapas de cada ciclo foram: 40
segundos a 94°C para desnaturação, 1 minuto a 61°C para a associação do
iniciador e 1 minuto a 72°C para a extensão (MONTALVO et al., 2012).
Os produtos amplificados por PCR foram analisados por eletroforese em gel
de agarose 0,8% (UltraPure ™ Agarose - Invitrogen™) acrescido de 0,75 µg/mL de
brometo de etídio (EtBr) em tampão TBE 1x (89 mM de Tris-borato; 2mM de EDTA;
pH entre 8,2 e 8,4). Foi adicionado ao DNA o Loading buffer (0,25% Bromophenol
blue, 0,25% xylene cyanol e 15% ficol 400 diluídos em água). Os marcadores de
peso molecular utilizados foram 100bp DNA Ladder (New England Biolabs®) ou o
fago λ digerido com a enzima HindIII (Invitrogen®). O gel foi fotografado após
exposição a luz UV e analisado com o programa ImageQuant. Os produtos
amplificados por PCR da região do ITS e do gene hsp70 dos respectivos isolados
foram ainda digeridos com a enzima de restrição HaeIII (New England Biolabs®)
conforme as instruções do fabricante e analisados por eletroforese em gel de
agarose 3% (Agarose-1000 - GibcoBRL). Os fragmentos obtidos foram analisados
por meio da comparação com as respectivas sequências disponíveis no GenBank
utilizando o programa Clone Manager 9 que indica a localização dos sítios de HaeIII
nas respectivas sequências de DNA.
30
3.4 ATIVIDADE DA MILTEFOSINA CONTRA FORMAS PROMASTIGOTAS DE L.
(V.) braziliensis IN VITRO
A atividade da miltefosina contra formas promastigotas dos isolados de L. (V.)
braziliensis foi avaliada utilizando o teste do MTT (3-(4,5- dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil
brometo de tetrazolina). Esse composto, de coloração amarela, é um substrato que
quando na presença de uma enzima mitocondrial sofre reação de redução e forma o
produto formazan, de coloração roxa. A produção do formazan ocorre apenas
quando a célula encontra-se viva (PERES et al., 2008). O protocolo utilizado foi
aquele previamente descrito pelo grupo da Profa. Silvia R. B. Uliana (ZAULI-
NASCIMENTO et al., 2010). Inicialmente os parasitas foram contados em câmara de
Neubauer. Cerca 2x106 promastigotas foram incubados na presença de
concentrações crescentes de miltefosina por 24 horas em estufa a 25°C. Após esse
período adicionou-se 30μL de solução de MTT (5mg/mL) (Sigma-Aldrich, St. Louis,
MO, USA), e após 3 horas, a reação foi interrompida utilizando 50 μL de SDS
(dodecil sulfato de sódio) 20%. A leitura da densidade óptica (D.O.) foi feita por
espectrofotometria no leitor de microplaca POLARstar Omega, BMG Labtech,
medindo-se a absorbância a 595 nm, utilizando-se como referência 690 nm. Os
experimentos foram realizados em triplicada e repetidos independentemente pelo
menos três vezes. A linhagem referência MHOM/BR/1975/M2903 foi utilizada em
todos os experimentos como controle do ensaio. Os valores de CI50 e CI90
(concentração de miltefosina que inibe a viabilidade celular em 50% e 90%
respectivamente) foram determinados a partir de curvas de regressão sigmoide
utilizando o programa GraphPad Prism 6.
3.5 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DA MILTEFOSINA CONTRA AMASTIGOTAS
INTRACELULARES DE L. (V.) braziliensis
3.5.1 Obtenção de macrófagos de medula óssea
Para a obtenção de macrófagos de medula óssea foi utilizado o protocolo
previamente descrito por Zamboni e Rabinovitch (2003). Estes foram obtidos a partir
de fêmures de camundongos BALB/c previamente sacrificados em câmara de CO2
que foram removidos e as respectivas epífises cortadas. A seguir, com o auxílio de
31
uma agulha 21G acoplada a uma seringa foi introduzido na cavidade medular meio
R2020 (60% de Meio RPMI 1640 - Gibco®, 20% de Soro Fetal Bovino e 20% do
sobrenadante de cultura de fibroblastos L929) para remoção das células da medula
óssea. Macrófagos diferenciados foram obtidos a partir da incubação em estufa a
37°C e atmosfera de 5% de CO2 por 7 dias em meio R2020. Após esse período, o
meio R2020 foi removido para remoção dos macrófagos não aderidos e/ou não
diferenciados. Os macrófagos aderidos foram removidos da placa utilizando um “cell
scraper” em presença de PBS, transferidos para um tubo cônico de 15 ml,
centrifugados a 1.500 RPM durante 10 minutos e ressuspensos em meio RPMI. O
número de macrófagos obtido foi determinado utilizando uma câmara de Neubauer.
3.5.2 Citotoxicidade da miltefosina para macrófagos medulares
Os ensaios de citotoxicidade foram realizados em placas de 24 poços.
Utilizou-se 5x106 macrófagos por poço, cultivados em meio RPMI mantidos em
estufa a 37°C e 5% CO2 durante 24 horas (ZAULI-NASCIMENTO et al., 2010). A
seguir, retirou-se o meio RPMI dos poços e lavou-se duas vezes com PBS à 37°C
de modo a retirar os macrófagos que não haviam aderido. Adicionou-se 500 μL de
meio RPMI contendo concentrações crescentes de miltefosina (0, 20, 40, 50, 60, 70,
80 e 160 μM) por 72 horas à 37°C em uma atmosfera de 5% de CO2. Após esse
período, as células foram lavadas duas vezes com PBS a temperatura ambiente. A
cada poço, foi adicionado 200 μL de PBS e 40 μL de solução de MTT (5 mg/mL),
incubando-se novamente a placa por 5 horas à 37°C e 5% de CO2. A reação foi
então interrompida através da adição de 100 μL de SDS 20%. A leitura da densidade
óptica (D.O.) foi feita por espectrofotometria e a CC50 (concentração de miltefosina
citotóxica 50%) foi determinado a partir de curvas de regressão sigmoide utilizando o
programa GraphPad Prism 6.
3.5.3 Atividade da miltefosina contra amastigotas intracelulares de L. (V.)
braziliensis
Macrófagos de medula óssea foram cultivados em placas de 24 poços
contendo previamente lamínulas redondas de vidro de 13 mm de diâmetro estéreis.
32
Cerca de 3x105 células foram plaqueadas em presença de 300 μL de meio RPMI.
Após incubação por 24 horas em estufa a 37°C e 5% CO2, retirou-se o meio RPMI
dos poços e lavou-se duas vezes com PBS a 37°C de modo a retirar os macrófagos
que não haviam aderido. Os macrófagos foram infectados com formas
promastigotas de L. (V.) braziliensis em fase estacionaria de crescimento numa
proporção de 30:1 (parasitas:macrófago). As infecções foram realizadas por 3 horas
a 33°C em atmosfera contendo 5% de CO2. Após esse período, os poços foram
lavados duas vezes com PBS para a retirada dos parasitas não internalizados, e
então foi adicionado 500 μL de meio RPMI por poço, contendo concentrações
crescentes de miltefosina (0, 0,5, 1,5, 3, 5, 8, 15, 25, 40 μM de miltefosina). Os
macrófagos infectados foram incubados a 33°C contendo 5% de CO2 por 72 horas.
A seguir, os poços foram lavados com PBS, fixados com metanol e corados com o
kit Instant Prov (Newprov) segundo as orientações do fabricante. As lâminas foram
observadas ao microscópio óptico, avaliando 100 macrófagos por lâmina,
identificando os macrófagos infectados e o número de amastigotas por macrófago.
Calculou-se o índice de infecção (porcentagem de macrófagos infectados
multiplicado pela média de amastigotas por macrófago) e os valores de CI50 e CI90
(concentração de miltefosina que inibe a viabilidade celular em 50% e 90%
respectivamente) foram determinados a partir de curvas de regressão sigmoide
utilizando o programa GraphPad Prism 6.
3.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA
As análises estatísticas foram realizadas através do programa GraphPad
Prism 6, CA, USA, utilizando os testes ANOVA de uma via e pós-teste de
comparações múltiplas de Tukey. Foi utilizado também, o teste t não pareado. O
valor de P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
33
4 RESULTADOS
4.1 IDENTIFICAÇÃO DOS ISOLADOS DE L. (V.) braziliensis
Os dez isolados clínicos utilizados neste estudo estavam disponíveis no
laboratório da Profa. Silvia R. B. Uliana. Estes isolados previamente identificados
como L. (V.) braziliensis, foram confirmados como pertencentes a esta espécie por
meio da amplificação do espaçador transcrito interno (ITS) localizado no
cromossomo 27 desta espécie e que possui aproximadamente 12 cópias por
genoma haploide organizadas em tandem (Figura 3A) (MARTINEZ-CALVILLO et al.,
2001) e do gene hsp70 que possui 6 cópias organizadas em tandem no
cromossomo 28 de L. (V.) braziliensis (Figura 4A) (RAMIREZ et al., 2011). Os
iniciadores utilizados para o ITS foram o IR1 e IR2 localizados entre o gene que
codifica a subunidade menor e o início do gene que codifica a subunidade maior do
RNAr respectivamente como esquematizado na Figura 3A. Uma vez que o ITS é
variável em tamanho para as diferentes espécies de Leishmania, o resultado obtido
do produto de PCR amplificado foram fragmentos de tamanhos variáveis porém
todos com cerca de 1kb (Figura 3B). O produto amplificado foi digerido com a
enzima de restrição HaeIII e analisado em uma eletroforese em gel de agarose
(Figura 3C). Devido a similaridade no padrão dos fragmentos de restrição do ITS das
espécies do subgênero Viannia (Figura 3C), optou-se por utilizar um segundo
método molecular para a discriminação destas espécies, baseado na amplificação
do gene hsp70 (MONTALVO et al., 2012). O gene hsp70 foi amplificado utilizando os
iniciadores F25 e R1310, localizados na fase aberta de leitura deste gene que possui
aproximadamente 1,9 Kb. Foi possível amplificar o respectivo gene em todas as
espécies de Leishmania analisadas e o resultado obtido foi um fragmento de
aproximadamente 1,2 kb (Figura 4B). A digestão do produto amplificado do gene
hsp70 com a enzima de restrição HaeIII permitiu discriminar as principais espécies
do subgênero Viannia (Figura 4C).
Deste modo, os isolados previamente identificados como L. (V.) braziliensis,
recebidos no laboratório da Profa. Silvia Uliana, provenientes de diferentes regiões
geográficas (Figura 2) foram identificados através da amplificação do ITS e do gene
hsp70 e posterior digestão dos produtos amplificados com a enzima de restrição
HaeIII. Os respectivos produtos amplificados foram analisados em uma eletroforese
em gel de agarose e o produto amplificado foi um fragmento de aproximadamente 1
34
Kb correspondente ao ITS de todos os isolados e para a cepa referência M2903
(Figura 5A). A digestão dos respectivos produtos amplificados com a enzima de
restrição HaeIII mostrou que todos os isolados apresentaram o mesmo padrão de
restrição (Figura 5C). Estes apresentavam fragmentos de restrição de 625, 159 e
201 pares de base conforme ilustrado na Figura 5B, na qual estão representados os
sítios para a enzima de restrição HaeIII no produto amplificado. Os tamanhos e a
localização dos sítios de restrição foram confirmados por meio da análise de uma
sequência de L. (V.) braziliensis correspondente à região do ITS (GenBank:
JQ061322.1).
A amplificação do gene hsp70 foi possível em todos os isolados e resultou em
um fragmento de aproximadamente 1,2 Kb, conforme representado na Figura 6A. A
digestão do produto de PCR do gene hsp70 com a enzima de restrição HaeIII,
revelou que todos os isolados apresentaram o mesmo padrão de fragmentos quando
comparados com a cepa referência M2903 (Figura 6C). O padrão de restrição do
produto amplificado apresenta os seguintes fragmentos de restrição: 21, 41, 13, 338,
286, 47, 307, 59, 40 e 134 pares de base, conforme análise da sequência de L. (V.)
braziliensis correspondente ao gene hsp70 (GenBank: AF291716.1) (Figura 6B), A
eletroforese em gel de agarose 3% mostrou que apenas os fragmentos maiores que
40 pb eram visíveis no gel (Figura 6C).
35
Figura 3 - (A) Representação esquemática da organização genômica das unidades de repetição do DNAr e a localização dos iniciadores utilizados para a amplificação do ITS (setas em cinza). SSU e LSU são respectivamente as regiões que codificam as subunidades maior e menor do ribossomo. (B) Eletroforese em gel de agarose 0,8% do produto amplificado do ITS com os iniciadores IR1 e IR2. Foi utilizado como marcador de peso molecular o fago λ digerido com HindIII. 1- L. (L.) infantum chagasi, 2- L. (V.) naifii, 3- L. (V.) lainsoni, 4- L. (L.) amazonensis, 5- L. (V.) shawi, 6- L. (V.) guyanensis, 7- L. (V.) braziliensis M2903. (C) Eletroforese em gel de agarose 0,8% da digestão do produto amplificado com a enzima de restrição HaeIII. Foi utilizado como marcador de peso molecular o 100 pb Ladder. 1- L. (L.) infantum chagasi, 2- L. (L.) amazonensis 2269, 3- L. (V.) braziliensis M2903, 4- L. (V.) shawi, 5- L. (V.) naiffi, 6- L. (V.) lainsoni, 7- L. (V.) guyanensis.
36
Figura 4 - (A) Representação esquemática da organização genômica do gene hsp70 e a respectiva localização dos iniciadores utilizados para sua amplificação (setas em cinza). (B) Eletroforese em gel de agarose 0,8% do produto amplificado do gene hsp70 com os iniciadores F25 e R1310. Foi utilizado como marcador de peso molecular o fago λ digerido com HindIII. 1- L. (V.) naiffi, 2- L. (V.) shawi, 3- L. (V.) guyanensis, 4- L. (V.) braziliensis M2903, 5- L. (L.) infantum chagasi, 6- L. (V.) lainsoni, 7- L. (L.) amazonensis 2269. A seta laranja indica o fragmento de aproximadamente 1,2 kb. (C) Eletroforese em gel de agarose 3% da digestão do produto amplificado do gene hsp70 com a enzima de restrição HaeIII. Foi utilizado como marcador de peso molecular o 100 pb Ladder. 1- L. (L.) infantum chagasi, 2- L. (L.) amazonensis 2269, 3- L. (V.) braziliensis M2903, 4- L. (V.) shawi, 5- L. (V.) naiffi, 6- L. (V.) lainsoni, 7- L. (V.) guyanensis.
37
Figura 5 – (A) Eletroforese em gel de agarose 0,8% do produto amplificado do ITS do DNA ribossomal dos isolados com os iniciadores IR1 e IR2. Foi utilizado como marcador de peso molecular o fago ʎ digerido com HindIII. A seta verde indica o fragmento de 1 kb esperado. (B) Representação esquemática do produto amplificado contendo os sítios para a enzima de restrição HaeIII. Os produtos oriundos da digestão estão indicados. (C) Eletroforese em gel de agarose 3% da digestão do produto amplificado do gene hsp70 dos isolados com a enzima de restrição HaeIII. Foi utilizado como marcador de peso molecular o 100 pb Ladder. Legenda: 1- 1975/M2903, 2- LTCP 19446, 3- LTCP 19512, 4- LTCP 16907, 5- LTCP 16012, 6- 2006/PPS, 7- 2006/BES, 8- 2003/IMG, 9- 2006/EFSF, 10- 2005/WSS e 11- 2006/HPV.
38
Figura 6 – (A) Eletroforese em gel de agarose 0,8% do produto amplificado do gene hsp70 dos isolados com os iniciadores F25 e R1310. Foi utilizado como marcador de peso molecular o fago λ digerido com HindIII. A seta laranja indica o fragmento de aproximadamente 1,2 kb esperado. (B) Representação esquemática do produto amplificado contendo os sítios para a enzima de restrição HaeIII. Os produtos oriundos da digestão estão indicados. (C) Eletroforese em gel de agarose 3% da digestão do produto amplificado do gene da hsp70 dos isolados com a enzima de restrição HaeIII. Foi utilizado como marcador de peso molecular o 100pb Ladder. Legenda: 1- 1975/M2903, 2- LTCP 19446, 3- LTCP 19512, 4- LTCP 16907, 5- LTCP 16012, 6- 2006/PPS, 7- 2006/BES, 8- 2003/IMG, 9- 2006/EFSF, 10- 2005/WSS e 11- 2006/HPV.
39
4.2 ATIVIDADE DA MILTEFOSINA CONTRA PROMASTIGOTAS DE L. (V.)
braziliensis IN VITRO
A suscetibilidade à miltefosina dos isolados de L. (V.) braziliensis foi
determinada utilizando o método do MTT conforme descrito em Material e Métodos.
Na Tabela 4 são apresentados os valores de CI50 (concentração de miltefosina que
inibe o crescimento dos parasitas em 50%) da cepa referência e dos 10 isolados
clínicos. Os valores de CI50 dos isolados variaram entre 22,93 ± 3,74 μM para o
isolado LCTP 16012 e 144,2 ± 16,08 μM para o isolado 2006/EFSF. A média dos
valores de CI50 dos isolados foi de 65,14 ± 36,21 e o valor de CI50 para a cepa
referência 1975/M2903 foi de 53,48 ± 6,63 μM. Dos 10 isolados avaliados, dois
deles, LCTP 16907 e 2006/EFSF, apresentaram valores de CI50 significativamente
maiores quando comparados com a cepa referência 1975/M2903 (p<0.0001 ANOVA
e Tukey’s “multiple comparison test”) (Figura 7A). Além disso, o isolado 2006/ESFS
também mostrou valor significativamente maior quando comparado com os demais
isolados (p<0.0001 ANOVA e Tukey’s “multiple comparison test”) (Figura 7A). Os
isolados, LCTP 16907 e 2006/EFSF, apresentaram valores de CI50 de 1,9 e 2,7
vezes maiores que a cepa referência 1975/M2903 respectivamente (Tabela 4). Por
outro lado, os isolados LTCP 16012 e LTCP 19512, apresentaram valores
significativamente menores de CI50 quando comparados com a cepa referência
(p<0.0001 ANOVA e Tukey’s “multiple comparison test”) (Figura 7A). Em relação aos
demais isolados, apenas 2006/HPV e 2003/IMG não apresentaram valores de CI50
significativamente diferentes da cepa referência (p<0.0001 ANOVA e Tukey’s
“multiple comparison test”). Baseando-se nesta análise, os isolados foram separados
em grupos de acordo com seu valor de CI50. Estes foram divididos em três grupos:
entre 20 e 49 µM, 50 e 99 µM e o último, entre 100 e 200 µM. Todos os grupos
foram estatisticamente diferentes quando comparados entre si (p<0.0001 ANOVA e
Tukey’s “multiple comparison test”) (Figura 8).
Foi calculada também a CI90 (concentração de miltefosina que inibe o
crescimento dos parasitas em 90%) dos isolados clínicos e sua média foi de 99,14 ±
67,48. O valor para a cepa referência 1975/M2903 foi de 70,12 ± 7,67 (Tabela 4 e
Figura 7B). Os valores variaram entre 30,87 ± 6,39 para o isolado LTCP 16012 e
277,05 ± 16,28 para o isolado 2006/EFSF, sendo a diferença entre estes dois
valores significativa (p<0.0001 ANOVA e Tukey’s “multiple comparison test”).
40
Tabela 4- Atividade in vitro da miltefosina contra as formas promastigotas dos isolados clínicos de L. (V.) braziliensis.
Isolado CI50 ± S.D. (µM) CI90 ± S.D. (µM) IR CI50
MHOM/BR/1975/2903 53,48 ± 6,63 70,17 ± 7,67 1
MHOM/BR/2006/BES6 62,25 ± 13,54 92,9 ± 13,33 1,16
MHOM/BR/2006/ESF6 144,2 ± 16,08 277,05 ± 16,28 2,69
MHOM/BR/2005/WSS 39,93 ± 4,19 75,88 ±2,97 0,75
MHOM/BR/2006/HPV 65,17 ± 3,74
78,28 ± 2,12 1,22
MHOM/BR/2006/PPS 59,83 ± 4,72
73,64 ± 4,80 1,12
MHOM/BR/2003/IMG 50,99 ± 6,71
76,06 ± 2,85 0,95
LCTP 16907 101,24 ± 5,96
133,6 ± 12,02 1,89
LCTP 19512 26,12 ± 1,58
41,54 ± 2,99 0,45
LCTP 19446 90,43 ± 5,12 140,33 ± 16,42 1,69
LCTP 16012 22,93 ± 3,74 30,87 ± 6,39 0,42
Média de 3 experimentos independentes realizados em triplicata. * O índice de resistência foi calculado dividindo-se o valor médio de CI50 de cada isolado pelo valor médio de CI50 da cepa referência 2903.
41
19775/M
2903
2006/H
PV
2005/W
SS
2006/P
PS
LC
TP
16907
LC
TP
19512
LC
TP
19446
2003/IM
G
LC
TP
16012
2006/E
FS
F
2006/B
ES
0
5 0
1 0 0
1 5 0
CI 5
0 (
M)
1975/M
2903
2006/H
PV
2005/W
SS
2006/P
PS
LC
TP
16907
LC
TP
19512
LC
TP
19446
2003/IM
G
LC
TP
16012
2006/E
FS
F
2006/B
ES
0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
4 0 0
CI 9
0 (
M)
Figura 7 – Suscetibilidade à miltefosina de formas promastigotas dos 10 isolados clínicos e da cepa referência 1975/M2903 utilizados neste estudo. (A) Média dos valores de CI50. (B) Média dos valores de CI90 determinados pelo teste de MTT.
A
B
42
20-4
9 M
50-9
9 M
100-2
00
M
0
5 0
1 0 0
1 5 0C
I 50 (
M)
*
*
*
Figura 8 – Suscetibilidade à miltefosina das formas promastigotas dos 10 isolados clínicos de L. (V.) braziliensis. Os isolados foram agrupados de acordo com a suscetibilidade ao fármaco (Azul: 20-45 µM), (Verde: 50-99 µM), (Bege: 100-200µM). O ponto em vermelho representa a cepa referência 1975/M2903 Os grupos são estatisticamente diferentes quando comparados entre si. *p<0.0001 ANOVA e Tukey’s “multiple comparison test”.
4.3 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DA MILTEFOSINA CONTRA AMASTIGOTAS
INTRACELULARES DOS ISOLADOS CLÍNICOS DE L. (V.) braziliensis
4.3.1. Citotoxicidade da miltefosina para macrófagos medulares
Inicialmente, a citotoxicidade da miltefosina para os macrófagos medulares foi
avaliada de modo a determinar qual a maior concentração a ser utilizada nos testes
in vitro de infecção e tratamento dos macrófagos infectados. Macrófagos derivados
de medula óssea foram incubados em concentrações crescentes de miltefosina e
sua suscetibilidade foi avaliada utilizando o teste do MTT. Foi observado que em
concentrações acima de 40 μM a porcentagem de células viáveis diminui
drasticamente (Figura 9). Estas células apresentaram um CC50 de 46,55 ± 3,86.
Estes achados foram confirmados por microscopia de luz dos macrófagos tratados
43
com miltefosina e foi observada uma redução significativa na viabilidade e
sobrevivência dos macrófagos a partir de 40 µM (dados não mostrados).
0 510
20
40
80
120
160
0
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
M ilte fo s in a (µ M )
% s
ob
re
viv
ên
cia
A
-1 0 1 2 3
0
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
% s
ob
re
viv
ên
cia
B
L o g d a c o n c e n tra ç ã o d e m ilte fo s in a (µ M )
Figura 9 – Suscetibilidade de macrófagos medulares à miltefosina. Porcentagem de sobrevivência dos macrófagos medulares em diferentes concentrações de miltefosina (A). Curva sigmoidal refletindo o decaimento da viabilidade celular quando há aumento da exposição à miltefosina (B). Média de 3 experimentos independentes realizados em triplicata.
4.3.2. Atividade da miltefosina contra amastigotas intracelulares de L. (V.)
braziliensis
Para avaliar a atividade da miltefosina em amastigotas intracelulares,
macrófagos medulares foram infectados com formas promastigotas de fase
estacionária de crescimento, de 7 isolados e da cepa referência de L. (V.)
braziliensis e então incubados em concentrações crescentes de miltefosina. A
proporção escolhida para uso nas infecções foi de 30 parasitas por macrófago. Foi
observado que os isolados apresentaram variabilidade nas taxas de infecção que
variaram entre 33 e 77% (Figura 10).
44
M2903
WS
S-5
PP
S-6
LT
CP
16907
LT
CP
19446
LT
CP
16012
EF
SF
-6
BE
S-6
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
% i
nfe
cç
ão
Figura 10 - Porcentagens de infecção obtidas para os isolados clínicos de L. (V.) braziliensis. Estão representados a taxa de infecção obtida em dois ou mais experimentos realizados em duplicata.
A atividade da miltefosina contra as formas amastigotas foi determinada pelo
índice de infecção dos isolados clínicos. Na Figura 11, pode-se observar que os
macrófagos infectados tratados com miltefosina apresentaram redução na
porcentagem de infecção e no número de amastigotas por macrófago de maneira
dose dependente. Resultados similares foram observados para os isolados clínicos
avaliados. Pode-se observar ainda, na mesma figura, que na concentração de 25
µM, não haviam mais macrófagos infectados pela cepa referência 1975/M2903. Os
valores de CI50 dos isolados variaram entre 0,84 ± 0,09 e 4,25 ± 0,25 µM (Tabela 5),
sendo significativamente diferentes entre si (p<0.0001 ANOVA e Tukey’s “multiple
comparison test”). O valor de CI50 encontrado para a cepa referência foi de 2,68 ±
0,22 (Tabela 5). A média dos valores de CI50 para as formas amastigotas foi de 2,58
± 1,23. Os resultados obtidos mostraram que os valores de CI50 dos isolados são
significativamente diferentes do valor de CI50 da cepa referência, com exceção do
isolado 2005/WSS (p<0.0001 ANOVA e Tukey’s “multiple comparison test”) (Figura
12A). A média dos valores de CI90 para as formas amastigotas foi de 7,36 ± 3,37 e o
valor para a cepa referência 1975/M2903 foi de 5,13 ± 1,09 (Figura 12B e Tabela 5).
Os valores variam entre 2,02 ± 0,22 (LTCP 16012) e 11,94 ± 0,42 (2006/EFSF)
conforme indicado na Tabela 5.
45
Além disso, foi observado que os valores de CI50 para as formas amastigotas
da cepa referência e dos demais isolados foram significativamente menores quando
comparado com a CI50 das respectivas formas promastigotas (*p<0,0001Teste t não
pareado) (Figura 13).
Figura 11 – Suscetibilidade à miltefosina de amastigotas intracelulares de macrófagos tratados com miltefosina. Os macrófagos foram infectados com a cepa referência 1975/M2903 utilizando uma proporção de 30:1 por 4 horas e então incubados por 72 horas na presença de concentrações crescentes de miltefosina (A) 0µM; (B) 3µM; (C) 5µM; (D) 10µM; (E) 15µM; (F) 25µM (aumento de 400X).
46
Tabela 5 - Atividade in vitro da miltefosina contra as formas amastigotas intracelulares dos isolados clínicos de L. (V.) braziliensis.
Isolado Número de
experimentos CI50 ± S.D. (µM) CI90 ± S.D. (µM) IR CI50
A
MHOM/BR/75/2903 9 2,68 ± 022 5,13 ± 1,09 1,00
MHOM/BR/2005/WSS 5 2,75 ± 0,42 6,93 ± 0,27 1,03
MHOM/BR/2006/PPS 3 1,24 ± 0,45 8,16 ± 1,59 0,46
MHOM/BR/2006/BES 2 1,68 ± 0,53 4,80 ± 1,26 0,62
MHOM/BR/2006/EFSF 2 3,47 ± 0,56 11,94 ± 1,12 1,29
LTCP 19446 4 4,25 ± 0,25 8,43 ± 2,10 1,58
LTCP 16907 4 3,34 ± 0,45 11,48 ±0,42 1,24
LTCP 16012 3 0,84 ± 0,09 2,02 ± 0,22 0,32
Média de experimentos independentes realizados em duplicata. A O índice de resistência foi calculado
dividindo-se o valor médio de CI50 de cada isolado pelo valor médio de CI50 da cepa referência M2903.
47
1975/M
2903
2005/W
SS
2006/P
PS
LT
CP
16907
LT
CP
19446
LT
CP
16012
2006/E
FS
F
2006/B
ES
0
1
2
3
4
5
CI 5
0 (
M)
1975/M
2903
2005/W
SS
2006/P
PS
LT
CP
16907
LT
CP
19446
LT
CP
16012
2006/E
FS
F
2006/B
ES
0
5
1 0
1 5
CI 9
0 (
M)
Figura 12 – Suscetibilidade à miltefosina das formas amastigotas intracelulares dos sete isolados clínicos e da cepa referência 1975/M2903 de L. (V.) braziliensis. (A) Média dos valores de CI50. (B) Média dos valores de CI90.
B
A
48
P r o m a s t ig o ta s A m a s t ig o ta s
0
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0C
I 50
(
M)
*
Figura 13 – Suscetibilidade à miltefosina dos isolados clínicos e da cepa referência de L. (V.) braziliensis. Os valores de CI50 para as formas promastigotas e amastigotas estão indicados. O ponto em vermelho refere-se ao valor para a cepa referência. * p<0,0001 Teste t não pareado.
49
5 DISCUSSÃO
A ausência de vacinas para a leishmaniose faz com que o tratamento da
doença seja seu principal meio de controle. O arsenal terapêutico disponível para o
tratamento da leishmaniose baseia-se em fármacos caros, tóxicos e de aplicação
intravenosa ou intramuscular que inviabilizam o tratamento para o paciente, que
muitas vezes o abandona. Os antimoniais pentavelentes, por exemplo, são fármacos
que foram introduzidos em 1945 e ainda são os fármacos de primeira escolha em
muitas regiões, inclusive no Brasil (CROFT; COOMBS, 2003a). Na Índia, por
exemplo, os antimoniais já se mostram ineficazes para o tratamento da leishmaniose
visceral (SUNDAR, 2001). Desse modo, é essencial a busca por novos fármacos
que sejam mais eficazes e com menos efeitos colaterais para o tratamento da
leishmaniose, reduzindo assim a desistência do tratamento e consequentemente a
potencial geração de cepas resistentes. A miltefosina, um fármaco de uso oral,
poderia ser uma melhor opção para o tratamento no Brasil, já que possibilitaria o
tratamento dos pacientes em casa e de forma indolor. No entanto, não existem
estudos que avaliem a eficácia da miltefosina para isolados brasileiros de L. (V.)
braziliensis, o que levou ao desenvolvimento deste trabalho.
Foram selecionados 10 isolados clínicos de L. (V.) braziliensis de diferentes
regiões geográficas do Brasil que foram previamente identificados e confirmados
como pertencentes a esta espécie do parasito. O método de identificação dos
isolados foi baseado na amplificação por PCR de dois marcadores moleculares
previamente descritos na literatura como capazes de discriminar as principais
espécies do parasito, inclusive aquelas que são endêmicas no Brasil. O método
descrito por Cupolillo et al (1995), consiste na amplificação da região do ITS do DNA
ribossomal seguido da digestão com enzimas de restrição permitindo discriminar as
diferentes espécies de Leishmania devido a presença de polimorfismos nos
fragmentos de restrição. Este método mostrou-se eficaz para diferenciar L. (V.)
braziliensis e L. (L.) amazonensis, principais espécies causadoras da leishmaniose
cutânea no Brasil (LAINSON; SHAW, 1987). No entanto, os padrões de fragmentos
obtidos por este método não foram suficientes para distinguir as espécies
pertencentes ao subgênero Viannia que também são responsáveis por causar a
doença no Brasil. Os padrões de fragmentos foram semelhantes entre as espécies
do subgênero Viannia, necessitando um segundo método para a discriminação
50
destas espécies. Optou-se então por amplificar o gene hsp70 conforme descrito por
Montalvo et al (2012). Foi possível diferenciar as principais espécies do subgênero
Viannia com uma melhor precisão. Desta forma, estabeleceu-se no laboratório que
para a identificação dos isolados seria necessário o uso de ambos os marcadores
(ITS e hsp70) para a identificação das espécies de Leishmania. Os padrões de
fragmentos obtidos com a enzima de restrição HaeIII apresentaram foram os
mesmos para todos os isolados e para a cepa referência, indicando que os isolados
utilizados neste estudo eram L. (V.) braziliensis.
Estudos prévios já demonstraram que existe variação de suscetibilidade à
miltefosina entre as espécies de Leishmania (ESCOBAR et al., 2002; SANTA-RITA
et al., 2004; YARDLEY et al., 2005; SANCHEZ-CANETE et al., 2009; MORAIS-
TEIXEIRA et al., 2011), o que justifica a importância para que as espécies sejam
previamente identificadas e que garante uma maior chance de eficácia no
tratamento da doença. Uma vez identificados os isolados clínicos como L. (V.)
braziliensis, foi avaliada a suscetibilidade in vitro destes isolados à miltefosina.
Embora ainda não aprovada para o uso no tratamento da leishmaniose no Brasil,
este fármaco tem grande potencial de vir a ser utilizado no tratamento da doença
fazendo-se extremamente necessário avaliar a suscetibilidade de isolados
brasileiros à miltefosina. Inicialmente foi avaliada a suscetibilidade das formas
promastigotas do parasita. Foi observada uma grande variabilidade entre os
isolados, com valores de CI50 que variaram de 22,93 ± 3,74 a 144,2 ± 16,08 µM.
Estes dados mostram uma variação de suscetibilidade das formas promastigotas
maior quando comparados com isolados de L. (V.) braziliensis do Peru que
apresentaram valores de CI50 que variaram entre 54 e 73 µM (YARDLEY et al.,
2005). Obonaga et al (2014) avaliou a suscetibilidade de isolados de L. (V.)
braziliensis antes e depois do tratamento clínico com miltefosina e encontrou valores
de CI50 em promastigotas próximo à média dos isolados avaliados neste trabalho,
sendo o valor médio de CI50 de 56 µM para esses isolados de L.(V) braziliensis. As
formas promastigotas de L. (V.) braziliensis se mostraram pouco sensíveis à
miltefosina, como previamente observado por Yardley et al (2005) e Sanchez-
Canete (2009) quando comparados com outras espécies do subgênero Leishmania
(ESCOBAR et al, 2012; SANTA-RITA et al., 2004). Estudos clínicos mostram taxas
de cura diferentes para L. (V.) braziliensis, 83% na Bolívia e menos de 50% na
51
Guatemala (SOTO et al., 2007). Estes dados sugerem que isolados de L. (V.)
braziliensis podem apresentar diferenças de sucetibilidade in vitro. Desse modo, a
eficácia do fármaco em uma região não pode ser considerada em outra região
endêmica, mesmo se tratando da mesma espécie (SOTO et al., 2008) sendo
importante avaliar a suscetibilidade dos isolados da região antes da implementação
do fármaco. A separação dos isolados em grupos evidenciou que dentre os isolados
existem isolados mais sensíveis (20-49 µM), menos sensíveis (100-200 µM) e um
grupo intermediário de isolados (50-99 µM). Esta diversidade na suscetibilidade à
miltefosina nos isolados clínicos pode estar relacionada com a grande
heterogeneidade genética intraespecífica de L. (V.) braziliensis (CUPOLILLO et al.,
2003). É importante salientar que os isolados não foram previamente expostos à
miltefosina e que portanto, a baixa suscetibilidade encontrada é intrínseca a alguns
isolados avaliados neste estudo. Além disso, foi observado que os isolados
2006/HPV e LTCP 16012 possuem rápido decaimento da viabilidade celular em
concentrações maiores que a de CI50, atingindo a CI90 com um aumento pequeno da
concentração de miltefosina, enquanto que os isolados 1975/M2903, 2006/BES,
2006/EFSF, 2005/WSS, 2006/PPS, 2003/IMG, LTCP 16907, LTCP 19512 e LTCP
19446 apresentam queda apenas em concentrações mais elevadas. É provável que
essas características devam interferir nos aspectos de suscetibilidade à miltefosina
assim como na geração de parasitos resistentes.
De maneira similar, as formas amastigotas intracelulares dos isolados clínicos
também apresentaram variação na suscetibilidade. Observou-se ainda que a
porcentagem de infecção variou entre 33 e 77% para os isolados estudados. Devido
a este fato, optou-se por utilizar a proporção de infecção de 30:1. Esta proporção é
maior do que a utilizada, por exemplo, por Morais-Teixeira et al (2011), que infectou
macrófagos em uma proporção 10:1. Porém, neste estudo foram utilizados
macrófagos extraídos de peritônio, enquanto que neste trabalho foram utilizados
macrófagos derivados de medula. Sabe-se que existe diferença de infectividade
para diferentes linhagens celulares de macrófagos (ZAULI-NASCIMENTO et al.,
2010) e que podem portanto explicar essas diferenças de infectividade. As formas
amastigotas dos isolados de L. (V.) braziliensis se mostraram mais sensíveis à
miltefosina quando comparadas com as respectivas formas promastigotas. Esta
diferença foi observada por Santa-Rita et al (2000), Azzouz et al (2005) e Obonaga
52
et al (2014). Segundo Azzouz et al (2005), essa diferença pode ser explicada pelo
fato da miltefosina aumentar a citotoxicidade dos macrófagos contribuindo assim
para a morte do parasita no interior da célula infectada.
A média do valor de CI50 para as formas amastigotas dos isolados foi de 2,58
± 1,23, sendo menor do que o observado para outras espécies de Leishmania
(ESCOBAR et al., 2002; SANTA-RITA et al., 2004; YARDLEY et al., 2005; MORAIS-
TEIXEIRA et al., 2011) e para L. (V.) braziliensis (OBONAGA et al., 2014;
SANCHEZ-CANETE et al., 2009). Interessantemente, foi demonstrado por Obonaga
et al (2014) que apenas concentrações de 32 µM de miltefosina resultava em 100%
de tratamento para os isolados clínicos sensíveis à miltefosina. Por outro lado, os
amastigotas de isolados menos suscetíveis mostraram-se refratários a essa mesma
concentração de miltefosina utilizada (OBONAGA et al., 2014). Diferentemente,
neste estudo foi observado que o tratamento dos macrófagos medulares infectados
com a miltefosina levou a ausência de amastigotas na concentração a partir de 25
µM em todos os isolados clínicos, tanto os mais suscetíveis quanto os menos
suscetíveis. Os resultados obtidos aqui sugerem que existe uma correlação entre a
CI50 das formas promastigotas e das formas amastigotas, porém para se avaliar
corretamente se existe ou não correlação, um número maior de isolados devem ser
avaliados.
Devido aos diversos problemas dos fármacos atualmente utilizados para o
tratamento da leishmaniose, a pesquisa por alternativas mais eficazes é altamente
necessária. O uso parenteral dos fármacos de primeira e segunda escolha no Brasil,
pode resultar em abandono do tratamento pelo paciente. Desse modo, a
possibilidade de utilização de um fármaco oral reduziria esse problema resultando
em uma maior adesão ao tratamento e consequentemente na redução do
desenvolvimento de parasitas resistentes. Os resultados obtidos mostraram que
alguns isolados apresentaram uma resistência intrínseca à miltefosina, sugerindo a
importância de se investigar a suscetibilidade antes de iniciar o tratamento do
paciente com o fármaco. O trabalho pode contribuir desse modo, para a avaliação
da miltefosina como um possível fármaco para o tratamento da leishmaniose
cutânea no Brasil, que poderia ser utilizada como alternativa aos fármacos
53
atualmente utilizados. Faz-se necessário, no entanto, mais estudos que avaliem um
número maior de isolados clínicos brasileiros.
Por fim, este trabalho é um dos pioneiros a apresentar dados sobre a
suscetibilidade de isolados brasileiros de pacientes com leishmaniose cutânea
causada por L. (V.) braziliensis, levantando novos questionamentos para estudos
futuros, como por exemplo, as bases moleculares da resistência intrínseca à
miltefosina encontrada em isolados clínicos.
54
6 CONCLUSÕES
Os isolados clínicos foram identificados molecularmente através da
amplificação da região do ITS e do gene hsp70 seguido de digestão com a enzima
de restrição HaeIII. Todos eles foram tipados como L. (V.) braziliensis.
O padrão de restrição com HaeIII do gene hsp70 obtido permitiu diferenciar as
principais espécies do subgênero Viannia.
Os 10 isolados clínicos de L. (V.) braziliensis apresentaram variabilidade na
suscetibilidade à miltefosina.
As formas amastigotas intracelulares são mais suscetíveis à miltefosina que
as respectivas formas promastigotas.
55
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