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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
INSTITUTO DE SAÚDE DE NOVA FRIBURGO
CURSO DE GRADUÇÃO EM BIOMEDICINA
STÉPHANIE CHRISTINE SINDER MELLO
AVALIAÇÃO BIOQUÍMICA DO PERFIL LIPÍDICO E MARCADORES
DE LESÃO HEPÁTICA EM RESPOSTA A UMA DIETA
ATEROGÊNICA
NOVA FRIBURGO
2016
i
STÉPHANIE CHRISTINE SINDER MELLO
AVALIAÇÃO BIOQUÍMICA DO PERFIL LIPÍDICO E
MARCADORES DE LESÃO HEPÁTICA EM RESPOSTA A UMA
DIETA ATEROGÊNICA
ORIENTADORA:
PROFa. DRª. CAROLINE FERNANDES DOS SANTOS BOTTINO
NOVA FRIBURGO
2016
Monografia apresentada à Universidade
Federal Fluminense/ Instituto de Saúde de
Nova Friburgo, como Trabalho de
Conclusão do Curso de graduação em
Biomedicina.
M527a Mello, Stéphanie Christine Sinder
Avaliação bioquímica do perfil lipídico e marcadores de lesão hepática em
resposta a uma dieta aterogênica. / Stéphanie Christine Sinder Mello ; Profᵃ.
Drᵃ. Caroline Fernandes dos Santos Bottino, orientadora. -- Nova Friburgo, RJ:
[s.n.], 2016.
79f.
Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Biomedicina) –
Universidade Federal Fluminense, Instituto de Saúde de Nova Friburgo,
2016.
1. Bioquímica. 2. Lipoproteínas. 3. Enzimas hepáticas. 4. Aterosclerose. I.
Bottino, Caroline Fernandes dos Santos, Orientadora. II. Título.
CDD M574.192
ii
STÉPHANIE CHRISTINE SINDER MELLO
AVALIAÇÃO BIOQUÍMICA DO PERFIL LIPÍDICO E
MARCADORES DE LESÃO HEPÁTICA EM RESPOSTA A UMA
DIETA ATEROGÊNICA
Apresentado em: 29 de Novembro de 2016.
Banca Examinadora
_____________________________________ Profa. Dra. Fernanda Amorim de Morais Nascimento Braga (Titular)
Universidade Federal do Rio de Janeiro – Campus Macaé
_____________________________________
Prof. Dr. Leonardo de Souza Mendonça (Titular) Universidade Federal Fluminense – Instituto de Saúde de Nova Friburgo
_____________________________________ Profa. Dra. Caroline Fernandes dos Santos Bottino (Titular/Orientador)
Universidade Federal Fluminense – Instituto de Saúde de Nova Friburgo
_____________________________________ Profa. Dra. Fabiana Nunes Germano (Suplente)
Universidade Federal Fluminense – Instituto de Saúde de Nova Friburgo
NOVA FRIBURGO
2016
Monografia apresentada à Universidade
Federal Fluminense/ Instituto de Saúde de
Nova Friburgo, como Trabalho de
Conclusão do Curso de graduação em
Biomedicina.
iii
Todo aquele que se dedica ao estudo da ciência chega a convencer-se de que
nas leis do Universo se manifesta um Espírito sumamente superior ao do
homem, e perante o qual nós, com os nossos poderes limitados, devemos
humilhar-nos.
Albert Einstein
iv
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço a Deus, por me acompanhar, me
proteger e me dar forças durante toda a minha trajetória.
A minha família, por estar sempre comigo, acreditar em mim e me
ajudar em tudo que eu necessito. Principalmente aos meus pais que não
mediram esforços para meu crescimento moral e acadêmico.
A meus amigos por terem me dado todo o apoio necessário e por
fazerem com que esta caminhada tenha sido mais fácil de percorrer.
A meus professores, por, apesar das dificuldades, terem feito o
seu melhor em ensinar tudo que sabem. Principalmente a minha
orientadora, Caroline Fernandes, por fazer este trabalho ser possível e
por me acolher no mundo acadêmico em mais da metade da graduação.
v
RESUMO
A aterosclerose é uma doença inflamatória crônica que acomete os
vasos sanguíneos e possui origem multifatorial. A obesidade e o perfil lipídico
alterado são fatores de risco conhecidos para o desenvolvimento da
aterosclerose. O objetivo do presente estudo é caracterizar o perfil bioquímico
lipídico e hepático de camundongos C57Bl/6 alimentados com uma dieta
aterogênica. Para esse fim, camundongos C57BL/6 machos com três meses
de idade foram submetidos à dieta controle ou dieta aterogênica contendo
excesso de lipídios saturados, colesterol e ácido cólico durante 2, 4 ou 8
semanas (n=12/grupo). A massa corporal foi aferida semanalmente e a
ingestão de ração diariamente. No momento da eutanásia, sangue foi coletado
para análise bioquímica. A análise estatística foi realizada no software
GraphPad Prisma 6.0 sendo considerado significativo um P<0,05. Não houve
ganho de MC pela ingestão da dieta aterogênica. A ingestão de ração foi
menor nos grupos que ingeriram a dieta aterogênica (-19%). A ingestão de
energia foi maior no grupo submetido à dieta aterogênica por 2 semanas (A2)
em +11,6% e no grupo submetido à dieta aterogênica por 4 semanas (A4) em
+12,2%, porém menor no grupo que recebeu dieta aterogênica por 8 semanas
(A8) em -5,1%, quando comparados aos seus respectivos controles. Não
houve diferença significativa de triglicerídeo sérico entre os grupos. A ingestão
da dieta aterogênica aumentou o colesterol total (A2: +62,6%; A4: +35,4% e;
A8: +40%, P<0,05). Foi observado um aumento do colesterol de alta densidade
(HDL) nos grupos com dieta aterogênica (A2: +99%; A4: +369,1%; A8:
+111,2%, P<0,05). Os valores de colesterol de baixa densidade (LDL), por sua
vez, também se mostraram aumentados nos grupos submetidos à dieta
aterogênica (A2: +162,8%; A4: +128,8% e; A8: +108,9%, P<0,05). Em relação
ao perfil de marcadores séricos hepático, não houve diferença estatística nos
níveis de fosfatase alcalina entre os grupos. Porém, em relação ao grupo
controle, os níveis da enzima transaminase glutâmico-pirúvica (TGP) foram
aumentados (A2: +806,4%; A4: +194,4% e; A8: +107,6%, P<0,05). E, por fim,
os níveis de transaminase glutâmico-oxalacética (TGO) estavam aumentados
somente nos grupos A2 e A4 (+89,8% e +39,7%, respectivamente, P<0,05).
Dessa forma, concluímos que uma dieta hiperlipídica rica em colesterol e ácido
cólico é capaz de alterar o metabolismo lipídico e hepático, mesmo sem o
ganho de massa corporal e sem ser necessário um tempo prolongado de
exposição à dieta, em camundongos C57Bl/6.
Palavras chave: lipoproteínas, enzimas hepáticas, aterosclerose
vi
ABSTRACT
Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease that affects blood
vessels and has multifactorial origin. Obesity and altered lipid profile are known
risk factors for the development of atherosclerosis. The present study aimed to
characterize the lipid and hepatic biochemical profile of male C57Bl/6 mice fed
with an atherogenic diet. Therefore, three-months old C57Bl/6 mice were fed
with a control diet or an atherogenic diet rich in saturated fat, cholesterol and
colic acid for 2, 4 or 8 weeks (n=12/group). Body mass (BM) was measured
weekly and food intake daily. At euthanasia, blood was collected for
biochemical assays. Statistical analysis was performed using GraphPad Prisma
software 6.0 and a P< 0.05 was considered statistically significant. There was
no BM gain by the ingestion of the atherogenic diet. Food intake was decreased
in mice fed with the atherogenic diet (-19%). Energy intake of A2 and A4 groups
increased (+11.6% and +12.2%, respectively), but decreased in A8 group (-
5.1%), when they were compared to their respective controls. There was no
significant change in serum triglyceride, but the atherogenic diet increased total
cholesterol levels (A2: +62.6%; A4: +35.4% and; A8: +40%, P<0.05). An
increase in high-density lipoprotein (HDL) fraction was observed in the
atherogenic groups (A2: +99%; A4: +369.1% and; A8: +111.2%, P<0.05). The
low-density lipoprotein (LDL) fraction was also increased mice fed with the
atherogenic diet (A2: +162.8%; A4: +128.8% and; A8: +108.9%, P<0.05).
Regarding hepatic markers, there was no difference in alkaline phosphatase
among groups. However, in the control group, the level of the glutamic pyruvic
transaminase enzyme (SGPT) was increased (A2: + 806.4%; A4: + 194.4%
and; A8: +107.6%, P<0,05). Finally, the glutamic-oxaloacetic transaminase
(SGOT) was increased only in A2 and A4 groups (+89.8% and +39.7%,
respectively, P<0.05). Thus, we conclude that a high-fat diet rich in cholesterol
and colic acid can modulate lipid and hepatic metabolism, even if body weight
gain did not take place, without the need of a long-term induction time, in
C57Bl/6 mice.
Keywords: lipoproteins, liver enzymes, atherosclerosis
vii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Desenvolvimento da placa aterogênica..............................................6
Figura 2 – Sumário do metabolismo lipoproteico.................................................9
Figura 3 – Esteatose hepática...........................................................................14
Figura 4 – Esteatohepatite e estresse oxidativo................................................15
Figura 5 – Evolução da Massa Corporal (MC)...................................................41
Figura 6 – Massa corporal final..........................................................................42
Figura 7 – Ingestão de ração.............................................................................43
Figura 8 – Consumo de energia........................................................................43
Figura 9 – Triglicerídeos séricos........................................................................45
Figura 10 – Níveis séricos de Colesterol total...................................................45
Figura 11 – Níveis séricos de Colesterol de alta densidade (HDL)...................46
Figura 12 – Níveis séricos de Colesterol de baixa densidade (LDL).................46
Figura 13 – Níveis séricos de Fosfatase Alcalina..............................................48
Figura 14 – Níveis séricos de transaminase glutâmico-pirúvica (TGP).............48
Figura 15 – Níveis séricos de transaminase glutâmico-oxalacética (TGO) ......49
viii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Composição nutricional das dietas experimentais...........................21
Tabela 2 – Ensaio para dosagem do colesterol total sérico..............................24
Tabela 3 – Ensaio para dosagem do HDL colesterol sérico..............................26
Tabela 4 – Ensaio para dosagem do LDL colesterol sérico..............................28
Tabela 5 – Ensaio para dosagem do triglicerídeo sérico...................................30
Tabela 6 – Curva padrão do ensaio para a dosagem de transaminase
glutâmico-oxalacética (TGO/AST) sérica...........................................................32
Tabela 7 – Ensaio para a dosagem de transaminase glutâmico-oxalacética
(TGO/AST) sérica..............................................................................................33
Tabela 8 – Curva padrão do ensaio para a dosagem de transaminase
glutâmico-pirúvica (TGP/ALT) sérica.................................................................35
Tabela 9 – Ensaio para a dosagem de transaminase glutâmico-pirúvica
(TGP/ALT) sérica...............................................................................................36
Tabela 10 – Ensaio para a dosagem de fosfatase alcalina sérica.....................38
Tabela 11 – Concentração esperada dos diferentes analitos presentes no
controle normal e controle patológico utilizados nos ensaios bioquímicos........39
Tabela 12 – Valor do r da correlação entre a absorbância e a concentração de
cada analito........................................................................................................50
Tabela 13 – Concentração observada dos diferentes analitos presentes no
controle normal e controle patológico utilizados nos ensaios bioquímicos........51
ix
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ALT Alanina aminotransferase
ApoE-/- Modelo animal knockout para a apolipoproteína E
AST Aspartato aminotransferase
CETP Proteína de transferência do éster de colesterol
CT Colesterol total
eNOS Enzina óxido nítrico sintase endotelial
EPM Média ± erro padrão da média
FA Fosfatase Alcalina
HDL Lipoproteína de alta densidade
ICAM1 Molécula de adesão intracelular
IDL Lipoproteína de densidade intermediária
IL-1 Interleucina 1
IL-8 Interleucina 8
LDL Lipoproteína de baixa densidade
LDL-ox LDL oxidado
LDLR-/- Modelo animal knockout para o receptor LDL
MC Massa corporal
PAD Padrão do ensaio
PAI-1 Inibidor do ativador do plasminogênio 1
PLTP Proteínas de transferência de fosfolípides
Qm Quilomícrons
RNS Espécies reativas de nitrogênio
x
ROS Espécies reativas de oxigênio
RT Reagente de trabalho
TG Triglicerídeo
TGO Enzima transaminase glutâmico oxalacética
TGP Enzima transaminase glutâmico pirúvica
VCAM1 Molécula de adesão vascular
VLDL Lipoproteínas de muito baixa densidade
xi
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO...............................................................................1
2 REVISÂO DE LITERATURA..........................................................3
2.1 ATEROSCLEROSE.....................................................................3
2.2 FISIOPATOLOGIA DA ATEROSCLEROSE................................4
2.3 METABOLISMO LIPÍDICO..........................................................7
2.4 PERFIL LIPÍDICO E RISCO DE ATEROSCLEROSE...............10
2.4.1 Papel do HDL na aterosclerose..............................................10
2.4.2 Papel do LDL na aterosclerose..............................................11
2.2.3 Papel do triglicerídeo na aterosclerose..................................12
2.5 PROCESSO INFLAMATÓRIO HEPÁTICO...............................13
2.6 MARCADORES HEPÁTICOS NA ATEROSCLEROSE............16
2.7 MODELOS ANIMAIS DE ATEROSCLEROSE..........................17
3 OBJETIVOS.................................................................................19
3.1 OBJETIVOS GERAIS................................................................19
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.....................................................19
4 MATERIAIS E MÉTODOS...........................................................20
4.1 ANIMAIS E GRUPOS EXPERIMENTAIS..................................20
4.2 EUTANÁSIA E COLETA DE AMOSTRAS................................22
4.3 BIOQUÍMICA SANGUÍNEA.......................................................22
4.3.1 Colesterol Total.......................................................................23
4.3.2 HDL Colesterol.......................................................................25
xii
4.3.3 LDL Colesterol........................................................................27
4.3.4 Triglicerídeos..........................................................................29
4.3.5 Transaminase Glutâmico-Oxalacética....................................31
4.3.6 Transaminase Glutâmico Pirúvica..........................................34
4.3.7 Fosfatase Alcalina..................................................................37
4.4 CONTROLE DE QUALIDADE NORMAL E PATOLÓGICO......39
4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA...........................................................40
5 RESULTADOS.............................................................................41
5.1 MASSA CORPORAL.................................................................41
5.2 INGESTÃO ALIMENTAR E ENERGÉTICA...............................42
5.3 LIPIDOGRAMA..........................................................................44
5.4 MARCADORES DE FUNÇÃO HEPÁTICA................................47
5.5 CONTROLE DE QUALIDADE DOS ENSAIOS
BIOQUÍMICOS................................................................................50
5.5.1 Curva Padrão..........................................................................50
5.5.2 Controles de Qualidade..........................................................51
6 DISCUSSÃO................................................................................52
7 CONCLUSÕES............................................................................56
8 REFERÊNCIAS............................................................................57
ANEXO 1 – Aprovação pelo Comitê de Ética no Uso de
Animais
1
1. INTRODUÇÃO
A aterosclerose é uma doença inflamatória multifatorial que acomete a
camada intima das artérias (Sposito et al., 2007). Juntamente com as demais
doenças cardiovasculares, esta é uma importante causa de óbitos ao redor do
mundo (Re et al., 1994; Laurenti et al., 2000; Reis et al., 2006). Além de fatores
genéticos predisponentes, os fatores de risco para tal doença estão
relacionados com os hábitos de vida e hábitos alimentares do indivíduo. Dessa
forma, diversos fatores como a hiperglicemia, a lipoproteína de baixa
densidade (LDL) aumentada, a lipoproteína de alta densidade (HDL) diminuída,
a resistência a insulina, a intolerância a glicose e a hipertensão arterial, que
são componentes da chamada Síndrome Metabólica, podem aumentar
consideravelmente o risco para o desenvolvimento da doença (Sinaiko, 2007;
Bonomini et al., 2015).
O aparecimento de placas (ateroma) resultantes do acúmulo de lipídeos,
macrófagos, restos celulares e diversas outras substâncias envoltos por uma
capa fibrótica rica em colágeno é a principal característica da doença (Sposito
et al., 2007). Tal formação se dá a partir da lesão endotelial que leva a uma
maior permeabilidade a lipoproteínas, principalmente ao LDL que se acumulam
na camada íntima arterial e se tornam imunogênicas (Weber e Noels, 2011;
Tavafi, 2013). A partir daí, a resposta imune se torna predominante na
patogênese e macrófagos fagocitam cristais de colesterol, se tornando células
esponjosas que estão presentes já nas lesões ateroscleróticas iniciais (Olivares
et al., 2016). Essas lesões progridem com o recrutamento de mais células
inflamatórias, proliferação das células inflamatória na lesão, apoptose celular e
aparecimento de um tecido necrótico (Lhotak et al., 2016). Com o avanço da
lesão pode haver a ruptura dessa placa resultando numa complicação
denominada aterotrombose que pode acarretar diversas consequências ao
paciente (Libby, 2002; Xavier et al., 2013).
O estudo do metabolismo lipídico é muito importante para se
compreender a aterosclerose. Os lipídeos são carreados pelo corpo humano
2
por partículas denominadas lipoproteínas (Wilkins, 2002) e, principalmente as
partículas do tipo LDL e as do tipo HDL são muito relacionadas a doença
aterosclerótica de modo que a partícula LDL apresenta um efeito pró
aterosclerótico enquanto partículas HDL apresentam um efeito protetor a
doença (Forti e Diament, 2006). Além disso, o monitoramento do processo
inflamatório hepático a partir de marcadores de lesão hepática como as
enzimas transaminase glutâmico oxalacética (TGO), transaminase glutâmico
pirúvica (TGP) e fosfatase alcalina (FA) é importante na aterosclerose à medida
que a doença hepática gordurosa não alcoólica é considerada uma
manifestação hepática da síndrome metabólica (Soler et al., 2008; Chaves et
al., 2012; Schild et al., 2013; Efe et al., 2014).
A utilização de animais de laboratório para o estudo de patologias
humanas é muito comum e com a aterosclerose não é diferente. Porem, nesse
caso, esse é um grande desafio visto que nenhum animal representa com
precisão todas as etapas da aterosclerose humana (Xiangdong et al., 2011).
Apesar de o camundongo ser naturalmente resistente a aterosclerose, esse
modelo é amplamente utilizado já que algumas espécies são capazes de
desenvolver lesões inicias a partir da utilização de uma dieta específica rica em
colesterol e gordura suplementada com ácido cólico (Nishina et al., 1990), além
de existirem modelos de camundongos geneticamente modificados para esse
fim (Plump et al., 1992; Zhang et al., 1992; Breslow, 1996; Leong et al., 2015).
3
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1 ATEROSCLEROSE
As doenças cardiovasculares são uma importante causa de morte em
todo o mundo, tanto em países desenvolvidos quanto em países ainda em
desenvolvimento (Laurenti et al., 2000). Alguns estudos mostram que eventos
cardiovasculares, dentre eles a aterosclerose, são responsáveis por grande
parte das ocorrências de morte súbita (Re et al., 1994; Reis et al., 2006). Nos
últimos anos houve um declínio da mortalidade por tais doenças em países
desenvolvidos, enquanto em países em desenvolvimento essa ocorrência vem
aumentando, o que ocorre no Brasil (Sposito et al., 2007). Diante disso, é
considerado muito importante estudar os fatores de risco para o
desenvolvimento da aterosclerose, suas características iniciais,
desenvolvimento e patogênese.
A Síndrome Metabólica é um transtorno caracterizado por diversos
fatores que levam a uma maior predisposição para as doenças
cardiovasculares e para o diabetes (Sinaiko e University of Minnesota, 2007).
Dentre esses fatores, pode-se destacar a hiperglicemia, LDL aumentado, HDL
diminuído, a resistência à insulina, a intolerância à glicose e a hipertensão
arterial. Quando esses fatores estão combinados com a predisposição genética
e com a obesidade, eles se tornam os principais fatores de risco para diversas
doenças, incluindo a aterosclerose (Bonomini et al., 2015). Além disso, o
consumo de alimentos ricos em gordura saturada aumenta o potencial de
monócitos se tornarem células esponjosas, ou seja, macrófagos repletos de
cristais de colesterol que estão presentes já nas fases iniciais da lesão
aterosclerótica (Henning et al., 2016).
Dessa forma, nota-se que os hábitos de vida e principalmente os hábitos
alimentares do indivíduo tem um importante papel no desenvolvimento e
estabelecimento da doença.
4
2.2 FISIOPATOLOGIA DA ATEROSCLEROSE
A aterosclerose é uma doença inflamatória que acomete a camada
intima das artérias e é caracterizada pelo aparecimento de placas de gordura
(ateroma). Tais placas são resultado de um acúmulo de lipídeos, macrófagos,
restos celulares, cálcio e outras substâncias, além de uma capa fibrosa rica em
colágeno (Sposito et al., 2007). Apesar do diagnóstico clínico dessa doença e
suas consequências normalmente ocorrerem após a meia-idade, seus sinais e
o início de seu desenvolvimento podem ocorrer ainda na infância e
adolescência (Santos et al., 2008).
A formação da placa característica da aterosclerose se dá a partir da
lesão endotelial causada por fatores de risco para a doença, como a
hipertensão arterial e o diabetes. A partir dessa lesão, ocorre o remodelamento
endotelial que leva a uma maior permeabilidade a lipoproteína, principalmente
as de baixa densidade (por sua capacidade de penetrar na célula endotelial por
endocitose). Há então o acumulo de lipoproteínas aterogênicas, como o LDL na
camada íntima arterial, mais especificamente no local da lesão (Weber e Noels,
2011; Tavafi, 2013).
Ao serem retidas no espaço subendotelial, as partículas de LDL sofrem
oxidação e se tornam imunogênicas, ou seja, há exposição de neoantígenos, o
que faz com que células do sistema imune sejam atraídas para o local onde
estes se encontram (Sposito et al., 2007; Rafieian-Kopaei et al., 2014). Além
disso, a presença de LDL oxidada (LDL-ox) estimula a expressão de moléculas
de adesão leucocitárias na superfície endotelial, promovendo a adesão de
leucócitos no local de acúmulo dessas moléculas (Kume et al., 1992; Boisvert
et al., 1998).
A partir de seu recrutamento, os macrófagos fagocitam esses cristais de
colesterol formando as chamadas células esponjosas, que são o principal
componente das lesões iniciais da aterosclerose, chamadas de estrias
gordurosas (Olivares et al., 2016). O crescimento da lesão aterosclerótica se
5
dá, então, a partir da proliferação de macrófagos. Quando a proliferação de
macrófagos diminui, mais monócitos são recrutados juntamente com linfócitos,
fazendo com que a resposta imune seja um importante fator para que a lesão
se mantenha. Com o avanço da lesão, macrófagos entram em apoptose e no
ultimo estágio da lesão pode-se notar um estágio necrótico em que se
observam restos celulares e cristais de colesterol a nível celular, como pode
ser observado na Figura 1 (Lhotak et al., 2016).
Além disso, mediadores de inflamação estimulam a migração e
proliferação de células musculares lisas da camada média próxima a intima e
estas, por sua vez, produzem mais citocinas, fatores de crescimento e a matriz
extracelular que vai ser fundamental para a constituição da camada fibrosa
externa da lesão (Sposito et al., 2007).
A ruptura da capa fibrótica da placa aterosclerótica expõe material
lipídico altamente trombogênico, causando a chamada aterotrombose (Xavier
et al., 2013). Nesse caso, essa é uma das complicações da aterosclerose que
pode levar ao infarto agudo do miocárdio, além de acidente vascular encefálico,
que pode levar o paciente a graves complicações ou até mesmo a morte
(Libby, 2002).
6
Figura 1 – Desenvolvimento da placa aterogênica. Na fase inicial da aterosclerose
(1), há infiltração de monócitos na camada endotelial, a diferenciação destes em
macrófagos e a proliferação celular induzindo o crescimento da lesão. Em 2, a
proliferação de macrófagos aumenta e, além disso, mais monócitos são recrutados. A
infiltração de células inflamatórias (3), compostas pela proliferação de linfócitos ocorre
simultaneamente com a apoptose de macrófagos, sendo esta a transição entre as
lesões iniciais e intermediárias. No estágio intermediário (4), além de células
inflamatórias, já se pode observar a formação de um tecido necrótico. Em lesões
avançadas (5), a proliferação celular se torna mais lenta e a lesão avança a um estado
necrótico com a presença de restos celulares e cristais de colesterol. Adaptado de
(Lhotak et al., 2016).
7
2.3 METABOLISMO LIPÍDICO
Os lipídeos de maior relevância clínica são os fosfolipídios, o colesterol,
os triglicerídeos e os ácidos graxos (Grundy, 1998; Sposito et al., 2007). Esses
lipídeos viajam pelo sangue em diferentes partículas chamadas lipoproteínas
(Wilkins, 2002). As lipoproteínas, como sugere o nome, são compostas de
lipídeos e proteínas, sendo classificadas em quilomícrons (Qm), lipoproteínas
de muito baixa densidade (VLDL), lipoproteínas de densidade intermediária
(IDL), LDL e HDL.
O colesterol é precursor de hormônios esteroidais, ácidos biliares e da
vitamina D. Por outro lado, os triglicerídeos têm em sua conformação três
ácidos graxos ligados a uma molécula de glicerol e possuem um papel
importante no armazenamento energético (Wilkins, 2002; Sposito et al., 2007).
O metabolismo lipídico pode ser dividido em duas vias, a via exógena
que se inicia com a absorção e se estende até o transporte dos lipídeos
ingeridos ao fígado e aos tecidos e a via endógena que compreende o
transporte e metabolismo das lipoproteínas produzidas no fígado (Silva, 2015).
Os triglicerídeos (TGs) representam a maior parte das gorduras que os
indivíduos ingerem. Ao serem ingeridos, os TGs são quebrados em ácidos
graxos livres no intestino pelas lipases pancreáticas presentes no suco
pancreático. Os demais lipídeos ingeridos são emulsificados por componentes
da bile e transformados em micelas, o que facilita a sua absorção. Após
absorvidos pelas células intestinais, tais partículas lipídicas, em especial os
ácidos graxos, são utilizados para a produção de Qms (Xavier et al., 2013).
Os Qms, por sua vez, entram na circulação linfática e alcançam assim a
circulação sanguínea. Nesta, a enzima lipase lipoproteica faz a hidrólise dessa
lipoproteína, o que permite a entrega de ácidos graxos para células musculares
e adipócitos. São então formadas partículas de Qm remanescentes, que são
captadas pelo fígado (Cooper, 1997).
8
No fígado, a partir dos TGs e outras moléculas como as apolipoproteínas
B-100, E e C, são formadas as partículas de VLDL. Estas são liberadas para a
circulação onde, assim como ocorre com o Qm, são hidrolisadas pela lipase
lipoproteica e, com isso, são formadas partículas remanescentes de VLDL e
IDL. Essas partículas, ao chegarem no fígado, podem ser degradadas ou sofrer
a ação da lipase hepática, o que resulta na formação de partículas de LDL. A
LDL é a principal lipoproteína carreadora de colesterol para tecidos periféricos
(Santos et al., 1999).
O HDL, por sua vez, é uma lipoproteína heterogênea que pode ser
secretada pelo fígado, sintetizada diretamente pelo intestino e, ainda, resultar
de restos do catabolismo de lipoproteínas ricas em triglicerídeos. Estas são
importantes por fazerem o transporte do colesterol proveniente de tecidos
periféricos para o fígado para que este seja, então, removido do organismo
(Silva, 2015).
Por fim, vale salientar que durante a hidrólise de lipoproteínas ricas em
TGs, essas lipoproteínas estão sujeitas a trocas lipídicas com HDL e LDL
através da ação da proteína de transferência do éster de colesterol (CETP)
(Tall, 1993; Santos et al., 1999; Forti e Diament, 2006). Na Figura 2 é ilustrado
resumidamente o metabolismo esse metabolismo lipídico.
9
Figura 2 – Sumário do metabolismo lipoproteico. O esquema ilustra o metabolismo
lipoproteico a partir da absorção intestinal e o movimento das partículas lipídicas a
partir das diversas lipoproteínas, incluindo seu metabolismo hepático. Dessa forma, se
pode observar tanto o metabolismo lipídico exógeno (partindo do intestino) como
endógeno (partindo do fígado) e as diversas moléculas que formam as lipoproteínas.
Adaptado de (Silva, 2015).
10
2.4 PERFIL LIPÍDICO E RISCO DE ATEROSCLEROSE
Em relação a aterosclerose, as principais lipoproteínas a serem
estudadas são o HDL e o LDL, já que se sabe que concentrações sanguíneas
elevadas de LDL e concentrações baixas de HDL são importantes fatores de
risco para as doenças cardiovasculares e para a formação da placa
aterosclerótica (Forti e Diament, 2006).
Valores desejáveis de colesterol total (CT) devem se limitar a 200 mg/dL.
Os valores de HDL devem estar acima de 45 mg/dL para mulheres e acima de
35 mg/dL para homens e os valores de LDL devem ser até 100 mg/dL para ser
considerado desejável. O valor de TG desejável deve se limitar a 200 mg/dL
(Wilkins, 2002).
2.4.1 Papel do HDL na aterosclerose
O colesterol HDL tem um efeito protetor contra a aterosclerose por
diversos fatores (Acton et al., 1996; Assmann e Gotto, 2004; Linsel-Nitschke e
Tall, 2005). Em primeiro lugar, tal lipoproteína faz o transporte reverso do
colesterol, ou seja, transporta o colesterol até o fígado para que o mesmo seja
eliminado. Esse transporte pode ser feito diretamente já que as CETPs e as
proteínas de transferência de fosfolípides (PLTP) transferem triglicerídeos e
fosfolípides de outras lipoproteínas para o HDL e esse HDL rico em TGs é mais
sensível a ação das lipases hepáticas. Além disso, ocorre o transporte reverso
indireto de colesterol à medida que partículas de LDL e VLDL são enriquecidas
com colesterol esterificado proveniente do HDL por intermédio da CETP, o que
as torna mais sensíveis às lipases hepática e a captação destes por receptores
presentes no fígado (Forti e Diament, 2006; Leança et al., 2010; Ferreira e
Sposito, 2014).
11
O HDL também exerce um efeito protetor em relação à aterosclerose de
outras formas. Ele apresenta efeito antitrombótico ao inibir a agregação
plaquetária, diminuir a viscosidade sanguínea, diminuir a atividade do fator
tecidual e inibidor do ativador do plasminogênio 1 (PAI-1) e diminuir os níveis
de antígenos (Rosenson et al., 1998). Além disso, o HDL é capaz de promover
a proteção do endotélio ao inibir as moléculas de adesão leucocitária na
superfície endotelial, como a molécula de adesão vascular (VCAM1), molécula
de adesão intracelular (ICAM1) e a E-selectina (Cybulsky e Gimbrone, 1991;
Cockerill et al., 1995). O HDL interfere no diâmetro do vaso ao aumentar a
concentração da proteína óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) (Rämet et al.,
2003) e modula a produção do peptídeo natriurético C (Sugiyama et al., 1995)
causando vasodilatação, e ao provocar o relaxamento vascular ao estimular a
síntese de prostaciclina (Fleisher et al., 1982).
Por fim, o HDL apresenta uma função anti-inflamatória ao inibir
moléculas fundamentais no processo inflamatório como a interleucina 1(IL-1) e
a interleucina 8 (IL-8) (Cockerill et al., 1995). Além disso, o HDL inibe alguns
produtos da oxidação do LDL, revertendo os efeitos do LDL-ox (Matsuda et al.,
1993) e diminuindo a peroxidação lipídica do LDL (Mackness et al., 2016).
2.4.2 Papel do LDL na aterosclerose
Sabe-se que existe uma estreita relação entre o colesterol LDL e a
aterosclerose, sendo essa lipoproteína considerada elemento importante na
formação da placa aterosclerótica (Boisvert et al., 1998; Ramos, 1998; Wilkins,
2002).
O LDL apresenta maior capacidade de penetração no endotélio
lesionado onde sofre oxidação, tornando-se LDL-ox (Weber e Noels, 2011). A
presença de LDL-ox foi observada em placas ateroscleróticas tanto em
humanos quanto em animais (Ylä-Herttuala et al., 1989). Tal modificação de
LDL para LDL-ox pode ser induzida tanto por células musculares lisas, quanto
por células endoteliais ou até mesmo por macrófagos e monócitos (Henriksen
12
et al., 1981; Henriksen et al., 1983; Parthasarathy et al., 1986). Esse processo
é decorrente da ação de espécies reativas de oxigênio (ROS) e espécies
reativas de nitrogênio (RNS) liberadas pelas células, desencadeando a
peroxidação lipídica (Steinberg et al., 1989).
O LDL-ox apresenta citotoxidade aumentada em relação ao LDL não
oxidado, atividade quimiotática para monócitos circulantes e inibitória para
migração de macrófagos da parede arterial para os tecidos, fatores que
contribuem para a resposta inflamatória que culmina na aterosclerose. Além
disso, apresenta menor taxa de captação pelos receptores de LDL presente
nas células hepáticas e periféricas e maior afinidade pelos receptores
scavenger dos macrófagos contribuindo, assim, para a formação das células
esponjosas (Siqueira et al., 2006).
2.4.3 Papel do triglicerídeo na aterosclerose
O metabolismo lipídico está intimamente relacionado a
hipertrigliceridemia e costuma ocorrer juntamente com outros fatores de risco
para a aterosclerose como o aumento do LDL, diminuição do HDL, resistência
a insulina, hipertensão arterial, obesidade, entre outros fatores (Grundy, 1998;
Wilkins, 2002). Além disso, estudos mostram que a elevação dos níveis de TGs
é, também, um fator independente para o desenvolvimento da placa (Nakaya,
2002) já que lipoproteínas ricas em TGs, principalmente o VLDL, apresentam
efeito aterogênico (Schiavo et al., 2003).
Estudos mostram, também, que a hipertrigliceridemia acelera a
aterosclerose ao estar associado com a diminuição do HDL, aumento de
lipoproteínas remanescentes, pequena elevação do LDL e aumento de
condições trombogênicas (Nakaya, 2002).
13
2.5 PROCESSO INFLAMATÓRIO HEPÁTICO
A doença hepática gordurosa não alcoólica abrange um aspecto de
alterações que vão desde a esteatose hepática assintomática, com a dosagem
de aminotransferases (TGO e TGP) de normais a um pouco elevadas, até a
esteatohepatite, que consiste em esteatose com inflamação, fibrose e cirrose
(Neuschwander-Tetri e Caldwell, 2003; Damiani et al., 2011). Estudos mostram
que uma dieta com alto teor de lipídeos pode levar a inflamação hepática
independe da presença ou não de esteatose. Além disso, camundongos
modificados geneticamente para apresentam hiperlipidemia se mostram
susceptíveis ao desenvolvimento da esteatohepatite não alcoólica (Wouters et
al., 2008). Daí a importância da dieta nos processos inflamatórios hepáticos e
na consequente lesão hepática.
Day e colaboradores propuseram um modelo para explicar a patogênese
da esteatohepatite, o qual consiste em dois eventos: 1) esteatohepatite
relacionada a resistência à insulina e a obesidade e; 2) esteatohepatite
relacionada ao estresse oxidativo (Day e James, 1998).
No primeiro evento, depósitos lipídicos e a lipólise estão comprometidos
em tecidos mais sensíveis à insulina, o que aumenta a concentração de ácidos
graxos no plasma e, consequentemente, aumenta o fluxo de ácidos graxos
livres para o fígado, gerando um acúmulo de triglicerídeos no hepatócito (Day e
James, 1998; Browning e Horton, 2004; Damiani et al., 2011), como pode ser
observado na Figura 3.
14
Figura 3 – Esteatose hepática. Alterações metabólicas que resultam no acúmulo
de triglicerídeos no fígado em casos de resistência à insulina. Adaptado de (Browning
e Horton, 2004).
15
O segundo evento, caracterizado pelo estresse oxidativo (Figura 4), é
resultante do desequilíbrio entre espécies químicas pró-oxidantes e
antioxidantes (Robertson et al., 2001). A oxidação de ácidos graxos é uma
importante fonte de espécies químicas pró-oxidantes como, por exemplo,
radicais hidroxil e ânions superóxido que, juntamente com outras espécies
químicas, são chamadas de ROS. O aumento de ROS causa depleção de ATP
e do dinucleotídeo nicotinamida, altera a estabilidade proteica, destrói
membranas via peroxidação lipídica e aumenta citocinas pró-inflamatórias. Tais
eventos levam a lesão celular (Bergamini et al., 2004; Browning e Horton, 2004;
Damiani et al., 2011).
Figura 4 – Esteatohepatite e estresse oxidativo. Mecanismo de lesão celular
induzido por lipídios na doença hepática não alcoólica (Browning e Horton, 2004).
16
2.6 MARCADORES HEPÁTICOS NA ATEROSCLEROSE
A avaliação da função hepática se torna importante quando se trata da
aterosclerose, à medida que os estudos mostram uma estreita correlação entre
a doença hepática gordurosa não alcoólica e a síndrome metabólica, podendo
a primeira ser considerada uma manifestação hepática da segunda. A
síndrome metabólica, por sua vez, é um fator de risco conhecido para doenças
cardiovasculares (Soler et al., 2008; Chaves et al., 2012; Schild et al., 2013; Efe
et al., 2014). Além disso, a avaliação hepática deve ser feita rotineiramente em
pacientes de todas as idades que apresentem fatores de risco para doença
hepática, como a obesidade, o diabetes e a hiperlipidemia (Minuk, 1998).
A enzima TGP é encontrada no citosol do hepatócito em maior
quantidade do que em outros tecidos, o que a torna a enzima mais específica
para a caracterização de doença hepática. A enzima TGO, por sua vez, é
localiza-se tanto no citosol quanto na mitocôndria e está distribuída por
diversos tecidos como o fígado, o coração, o musculo esquelético, os rins, o
cérebro, o pâncreas, os pulmões, os leucócitos e os eritrócitos sendo, dessa
forma, menos específica para lesões hepáticas. A relação entre os valores
séricos de ambas é importante na avaliação da gravidade da lesão hepática
(Minuk, 1998; Ozer et al., 2008; Al-Busafi et al., 2013). Além disso, a doença
hepática não gordurosa é um importante fator para o aumento discreto dessas
transaminases (Al-Busafi et al., 2013).
A FA é uma enzima localizada na membrana celular e está presente
principalmente no fígado e nos ossos (Ozer et al., 2008). Dessa forma, o
aumento sérico dessa enzima se relaciona principalmente a distúrbios nesses
dois órgãos. Quando há indícios de que tal aumento possui origem hepática,
deve-se pesquisar tanto por colestase (obstrução parcial dos dutos biliares,
cirrose biliar primária, colangite esclerosante primária ou colestase por drogas)
ou por doença hepática infiltrativa (Mincis e Micis, 2016).
17
2.7 MODELOS ANIMAIS DE ATEROSCLEROSE
Muitos animais já foram utilizados como modelo para o estudo da
aterosclerose, dentre eles coelhos, ratos, camundongos, hamster, suínos, aves
e primatas. Todavia, não há nenhum modelo animal que demonstre com
precisão todos os estágios da aterosclerose humana (Xiangdong et al., 2011).
Os camundongos costumam ser utilizados em experimentos que
investigam a aterosclerose por apresentarem pequeno porte, tempo de vida
relativamente curto, serem de fácil manutenção e domesticação e
desenvolverem diversas patologias humanas (Animais de laboratório: o
camundongo, 2016). Entretanto, os camundongos costumam ser resistentes ao
desenvolvimento da placa aterosclerótica induzida por dieta, visto que
aproximadamente 70% do seu colesterol total sérico é representado por
partículas de HDL (Xiangdong et al., 2011).
Mesmo em face a essa limitação do modelo, estudos mostram que
camundongos C57Bl/6J alimentados com uma dieta rica em colesterol e
gordura suplementada com ácido cólico, apresentam células esponjosas no
espaço subendotelial após alguns meses de ingestão da dieta, o que indica
que tais animais são capazes de desenvolver a placa aterosclerótica (Nishina
et al., 1990; Breslow, 1996).
Além da linhagem C57Bl/6J, as linhagens AKR/J, DBA/2J e C57L/J
também são capazes de desenvolver aterogênese induzida por dieta, apesar
de serem menos susceptíveis (Paigen et al., 1985). A principal desvantagem
destes modelos é que a lesão observada a partir da utilização de tal dieta é
pequena, chegando apenas aos estágios iniciais da aterosclerose humana
(estrias gordurosas), após um tempo de ingestão de dieta entre 12 semanas a
9 meses, apesar deste tempo ser variável (Paigen et al., 1985; Jawien et al.,
2004).
Além dos modelos de aterogênese em camundongos induzidos por
dieta, existem os modelos modificados geneticamente (Xiangdong et al., 2011).
Entre estes, pode-se destacar o modelo knockout para a apolipoproteína E
18
(ApoE-/-) e o modelo (LDLR-/-), que são bem estudados, caracterizados e
desenvolvem placas ateroscleróticas expressivas.
A apolipoproteína é responsável pelo empacotamento do colesterol e
outras gorduras. No modelo ApoE-/- os camundongos apresentam a
apolipoproteína E inativada pela técnica de targeting e, por esse motivo, os
animais apresentam concentrações plasmáticas de colesterol
aproximadamente cinco vezes maiores e desenvolvem depósitos de células
esponjosas na aorta a partir dos três meses de idade (Plump et al., 1992;
Zhang et al., 1992).
Já o modelo LDLR-/- apresenta inativação do receptor de LDL. Esse
receptor está presente nos hepatócitos e faz a mediação da endocitose de
ApoE para captar as partículas de LDL da circulação sanguínea. Por esse
motivo, os níveis de colesterol aumentam duas vezes nos camundongos LDLR-
/- em relação ao animal que não apresenta tal modificação genética (Breslow,
1996; Leong et al., 2015).
19
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVOS GERAIS
Avaliar bioquimicamente o perfil lipídico e marcadores de lesão hepática
no soro de camundongos submetidos a uma dieta aterogênica.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Avaliar curto período de administração de dieta rica em lipídios
saturados, colesterol e ácido cólico desencadeia alterações
bioquímicas anteriores a formação das lesões ateroscleróticas
propriamente ditas;
• Avaliar a progressão do perfil lipídico em resposta a uma dieta
aterogênica ao dosar o TG, CT, HDL colesterol e LDL colesterol
séricos;
• Avaliar a progressão de marcadores de lesão hepática em resposta a
uma dieta aterogênica através da dosagem de FA, TGP e TGO.
20
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 ANIMAIS E GRUPOS EXPERIMENTAIS
Os protocolos para a experimentação animal foram aprovados pelo
Comitê de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal Fluminense
(CEUA/UFF n°647/2015). Foram utilizados camundongos C57Bl/6 machos
obtidos do Biotério Central da UFF localizado no Campus Valonguinhos e
mantidos, durante todo o experimento, no Biotério do Instituto de Saúde de
Nova Friburgo da UFF. Os animais foram mantidos em gaiolas com no máximo
cinco animais e, aos três meses de idade começaram a ser alimentados com
dieta controle ou dieta aterogênica por um tempo de dois, quatro ou oito
semanas. Os grupos experimentais foram classificados de acordo com o
número de semanas de alimentação com a respectiva dieta conforme descrito
a seguir com um número de 12 animais por grupo experimental:
o Grupo C2: Dieta controle por 2 semanas
o Grupo C4: Dieta controle por 4 semanas
o Grupo C8: Dieta controle por 8 semanas
o Grupo A2: Dieta aterogênica por 2 semanas
o Grupo A4: Dieta aterogênica por 4 semanas
o Grupo A8: Dieta aterogênica por 8 semanas
As dietas utilizadas no experimento foram elaboradas pela empresa
PragSoluções (Jaú-SP, www.pragsolucoes.com.br), com base nas
recomendações do Instituto Americano de Nutrição (AIN-93M) (Reeves et al.,
1993). A composição das dietas controle e aterogênicas está descrita na tabela
a seguir (Tabela1).
21
Tabela 1 – Composição nutricional das dietas experimentais
DIETA
CONTROLE
DIETA
ATEROGÊNICA
INGREDIENTES (g/kg)
Amido de Milho 466,0 193,0
Amido de Milho dextrinizado 155,0 155,0
Sacarose 100,0 100,0
Caseína 140,0 175,0
Óleo de soja 40,0 40,0
Banha (colesterol total) --- 238,0*
Fibras (celulose) 50,0 50,0
L-cistina 1,8 1,8
Colina 2,5 2,5
BHT 0,008 0,04
Mix de Minerais 35,0 35,0
Mix de Vitaminas 10,0 10,0
Ácido cólico --- 5,0
TOTAL 1.000,0 1.005,3
ENERGIA DA DIETA
Kcal/g 3.804 5.000
Proteína (%) 14,0 14,0
Carboidratos (%) 76,0 36,0
Lipídios (%) 10,0 50,0
*A banha consiste em gordura saturada. Cada 100g contém 243,0 mg de colesterol
A principal diferença entre as dietas utilizadas está na adição de gordura
saturada (banha) e ácido cólico na composição da dieta aterogênica. A banha
adicionada apresenta altos níveis de colesterol em sua composição e o ácido
cólico tem a função de potencializar o efeito desse colesterol. Além disso, tais
adições fizeram com que a dieta aterogênica apresentasse uma maior
quantidade de energia (5.000 Kcal/g).
Durante o experimento, a massa corporal foi aferida semanalmente a fim
de avaliar o ganho de peso dos animais. Para se avaliar a quantidade de
alimento e de energia ingerida pelos camundongos, a ingestão alimentar foi
aferida diariamente durante todo o experimento.
22
4.2 EUTANÁSIA E COLETA DE AMOSTRAS
Para a eutanásia, os animais foram colocados em jejum (sem privação
de água) por seis horas a fim de se medir a glicemia de jejum. A glicemia foi
aferida a partir de uma gota de sangue coletada a partir de uma pequena
incisão na cauda de cada animal com a utilização de um glicômetro (Glicômetro
One Touch Ultra) porém não foi observada diferença significativa em relação a
glicemia entre os grupos estudados.
Logo após a aferição da glicemia os camundongos foram anestesiados
com ketamina (100,0 mg/kg) e xilasina (10,0 mg/kg) intraperitoneal e a
eutanásia só foi realizada após esses animais não responderem mais a
estímulos. O sangue foi então coletado diretamente do átrio direito por punção
com a utilização de uma seringa de 1 mL.
O sangue coletado foi acondicionado em microtubos de 1,5 mL (um
microtubo por animal) e centrifugado por dez minutos a 3.200 rpm a 4°C, após
a retração sanguínea. Por fim, o soro foi separado após a centrifugação,
acondicionado em um segundo microtubo e congelado em congelador
convencional -20°C para a posterior bioquímica sanguínea. O restante do
sangue foi descartado.
4.3 BIOQUÍMICA SANGUÍNEA
Entre as 12 amostras coletadas por grupo, foram utilizadas
aleatoriamente seis amostras para a realização das dosagens bioquímicas. As
dosagens bioquímicas foram feitas através de ensaios colorimétricos (Bioclin,
Belo Horizonte, MG, Brasil) adaptados para serem realizados em microplaca de
96 poços. Foram dosados o CT, HDL colesterol, LDL colesterol, TG e enzimas
hepáticas (TGO, TGP e FA). Todas as dosagens foram realizadas com as
amostras em duplicata e os controles e padrões em triplicata.
23
Anterior à realização dos ensaios, o soro foi retirado do congelador
(descongelado) e acondicionado em gelo até o momento de ser utilizado. Antes
da pipetagem das amostras, as mesmas foram homogeneizadas em vortex.
Todos os ensaios bioquímicos colorimétricos foram lidos com a utilização do
espectrofotômetro de microplacas Epoch (LifeTechnologies), na configuração
area scan 5x5 a fim de, ao captar a absorbância de diversos pontos de cada
poço da microplaca, apresentar resultados mais fidedignos, ao evitar efeito do
menisco do líquido e presença de bolhas no líquido.
4.3.1 Colesterol Total
A dosagem do CT foi feita com a utilização do kit colorimétrico
COLESTEROL MONOREAGENTE K083 da empresa Bioclin. O ensaio foi
adaptado para a realização em microplaca de 96 poços, sendo a capacidade
total de cada poço de 300µL. Para tal adaptação, foi adicionado 200µL do
reagente de trabalho (RT) nº1 em todos os poços, incluindo padrões, controles
e amostras. Os padrões 1, 2 e 3 foram pipetados de acordo com o volume
indicado na tabela abaixo (Tabela 2) utilizando o RT nº 2, em triplicata. As
amostras e os controles foram adicionados em seus respectivos poços em
quantidade de 2 µL.
Após a adição de reagentes, padrões e amostras, a microplaca foi
agitada para homogeneização e colocada em banho-maria a 37°C para o
desenvolvimento da cor. Após, foi feita a leitura da absorbância de cada poço
da microplaca em espectrofotômetro de microplacas (Epoch, LifeTechnologies)
no modo area scan 5x5, no λ 500 nm (490-550 nm), acertando o zero com o
branco.
24
Tabela 2 – Ensaio para dosagem do colesterol total sérico
Quantidade de reagentes, controles e amostras que foram adicionados aos poços da microplaca correspondentes aos padrões, controles e
amostras para a obtenção do colesterol total sérico. Na coluna “explicação” se observa o valor do colesterol total em mg/dL contido em cada
padrão (PAD1, PAD2 e PAD3). *Concentração desconhecida.
RT (N° 1) RT (N° 2)
CN, CP ou
Amostra Explicação
BRC 200 µL --- --- Branco
PAD 1 200 µL 1,0 µL --- Padrão 1 (100 mg/dL)
PAD 2 200 µL 2,0 µL --- Padrão 2 (200 mg/dL)
PAD 3 200 µL 4,0 µL --- Padrão 3 (400 mg/dL)
CN 200 µL --- 2,0 µL Controle Normal
CP 200 µL --- 2,0 µL Controle Patológico
AMOSTRAS 200 µL --- 2,0 µL Amostras*
25
4.3.2 HDL Colesterol
A dosagem do colesterol HDL foi obtida a partir da utilização do kit
colorimétrico HDL DIRETO K071 da empresa Bioclin adaptado para ser feito
em microplaca de 96 poços.
Primeiramente foram adicionados 150 µL de reagente RT nº 1 em todos
os poços da microplaca, seguido dos padrões em quantidade determinada na
tabela a seguir (Tabela 3) e 1,5 µL dos controles e das amostras em suas
respectivas posições na microplaca. Feito isso, a microplaca foi
homogeneizada à mão e colocada em banho-maria a 37°C por 10 min e foi
feita a leitura da absorbância a 550 nm (Epoch, LifeTechnologies, area scan
5x5).
Após a leitura da primeira etapa do ensaio, iniciou-se a segunda etapa,
na qual foi adicionado 50 µL do RT nº 2 em todos os poços. Feito isso, a
microplaca foi novamente homogeneizada e colocada em banho-maria a 37ºC
por 10 min. Após a incubação foi feita uma nova leitura da absorbância a 550
nm (Epoch, LifeTechnologies, area scan 5x5).
Para o cálculo do valor do colesterol HDL das amostras, primeiramente
foi subtraído a absorbância do branco da absorbância de todos os poços. Após,
o valor da primeira leitura foi subtraído da segunda leitura. O valor resultante foi
utilizado para o cálculo da equação de regressão linear e correlação de
Pearson da curva padrão. A partir desta curva foi determinado o valor em
mg/dL do colesterol HDL de todas as amostras.
26
Tabela 3 – Ensaio para dosagem do HDL colesterol sérico
Quantidades de reagentes, padrão e amostras que devem ser pipetados nos poços da microplaca correspondentes aos padrões, controles e
amostras para a obtenção do colesterol HDL pelo método direto. Na coluna “explicação” se observa o valor em mg/dL do colesterol HDL
contido em cada padrão (PAD1, PAD2 e PAD3). * Concentração desconhecida.
ETAPA 1
Leitura 1
HOMOGENEIZAR
+
BANHO-MARIA
37ºC por 10 min
+
LER
ABSORBÂNCIA
550 nm
ETAPA 2
Leitura 2
HOMOGENEIZAR
+
BANHO-MARIA
37ºC por 10 min
+
LER
ABSORBÂNCIA
550 nm
Explicação
RT
(N° 1)
CN, CP ou
Amostra Calibrador
RT
(N° 2)
BRC 150 µL --- --- 50 µL Branco
PAD 1 150 µL --- 0,75 µL 50 µL Padrão 1 (27 mg/dL)
PAD 2 150 µL --- 1,50 µL 50 µL Padrão 2 (54 mg/dL)
PAD 3 150 µL --- 3,00 µL 50 µL Padrão 3 (108 mg/dL)
CN 150 µL 1,5 µL --- 50 µL Controle Normal
CP 150 µL 1,5 µL --- 50 µL Controle Patológico
AMOSTRAS 150 µL 1,5 µL --- 50 µL Amostras*
27
4.3.3 LDL Colesterol
Para a dosagem do colesterol LDL nas amostras de soro dos animais foi
utilizado o kit colorimétrico COLESTEROL LDL TOTAL K088 da empresa
Bioclin adaptado para ser feito em microplaca de 96 poços.
Foi adicionado 150 µL de RT em todos os poços, incluindo os poços
correspondentes a branco, controles, padrões e amostras. Foi adicionado água
destilada, calibrador, controles e amostras nas quantidades indicadas na tabela
a baixo (Tabela 4) em seus respectivos poços na microplaca. Após essa
adição, a microplaca foi homogeneizada a partir de agitação manual e colocada
em banho-maria a 37°C por 5 minutos. Após essa etapa, a absorbância foi lida
em 600 nm (Epoch, LifeTechnologies, area scan 5x5, 546 - 600 nm).
Após a primeira leitura, foi adicionado 50 µL de RT n°2 em todos os
poços, a microplaca foi novamente homogeneizada e colocada em incubação
por 5 minutos em banho-maria a 37°C. Uma nova leitura foi feita em 600 nm
(Epoch, LifeTechnologies, area scan 5x5, 546 - 600 nm).
Para a obtenção dos valores de colesterol LDL em mg/dL foi subtraída a
leitura da absorbância do poço branco da leitura de todos os demais poços em
ambas as leituras. Foi subtraída a primeira leitura da segunda leitura e, após
esse procedimento, foi feita uma curva padrão para a determinação dos valores
de colesterol LDL a partir dos valores dos padrões já conhecidos previamente.
28
Tabela 4 – Ensaio para dosagem do LDL colesterol sérico
ETAPA 1
Leitura 1
AGITAR
+
BANHO-MARIA
37ºC por 5 min
+
LER
ABSORBÂNCIA
600 nm
ETAPA 2
Leitura 2
AGITAR
+
BANHO-MARIA
37ºC por 5 min
+
LER
ABSORBÂNCIA
600 nm
Explicação RT
(N° 1)
Água
Destilada Calibrador
CN, CP ou
Amostra
RT
(Nº2)
BRC 150 µL 1,5 µL --- --- 50 µL Branco
PAD 1 150 µL --- 0,75 µL --- 50 µL Padrão 1 (32,5 mg/dL)
PAD 2 150 µL --- 1,50 µL --- 50 µL Padrão 2 (65,0 mg/dL)
PAD 3 150 µL --- 3,00 µL --- 50 µL Padrão 3 (130,0 mg/dL)
CN 150 µL --- --- 1,5 µL 50 µL Controle Normal
CP 150 µL --- --- 1,5 µL 50 µL Controle Patológico
AMOSTRAS 150 µL --- --- 1,5 µL 50 µL Amostras*
Quantidades de reagentes e amostra que devem ser pipetados nos poços da microplaca correspondentes aos padrões, controles e amostras
para a obtenção do colesterol LDL. Na coluna “explicação” se observa o valor em md/dL de colesterol LDL contido em cada padrão (PAD 1,
PAD 2 e PAD 3).*Concentração desconhecida.
29
4.3.4 Triglicerídeos
A dosagem de TGs séricos foi feita a partir do kit colorimétrico
TRIGLICERIDEOS K117 da empresa Bioclin adaptado para ser feito em
microplaca de 96 poços. Os padrões, controles e o branco foram aferidos em
triplicata e as amostras em duplicata.
Para o ensaio, foi adicionado 200 µL do RT nº 1 em todos os poções da
microplaca. Os padrões 1, 2 e 3 (RT nº 2) foram adicionados em triplicata de
acordo com a tabela abaixo (Tabela 5). Foi pipetado 2 µL dos controles normal
e patológico, assim como das amostras em seus respectivos poços.
Após serem adicionados todos os reagentes e amostras, a microplaca
foi incubada a 37°C por 10 minutos em banho-maria. Após a incubação, a
absorbância dos poços da microplaca foi lida com a utilização de um
espectrofotômetro para a leitura de microplacas (Epoch, LifeTechnologies, area
scan 5x5) com a utilização de um comprimento de onda de 500 nm.
Para o cálculo do TG sérico das amostras, a absorbância do branco foi
subtraída da absorbância de todos os demais poços (padrões, controles e
amostras). Após, foi criada uma curva padrão de calibração utilizando
absorbância e concentrações de TG dos padrões 1, 2 e 3. A absorbância das
amostras foi colocada nessa curva padrão para a obtenção da dosagem de TG
em mg/dL.
30
Tabela 5 – Ensaio para dosagem do triglicerídeo sérico
RT* (N° 1) RT** (N° 2)
CN, CP ou
Amostra Explicação
BRC 200 µL --- --- Branco
PAD 1 200 µL 1,0 µL --- Padrão 1 (50 mg/dL)
PAD 2 200 µL 2,0 µL --- Padrão 2 (100 mg/dL)
PAD 3 200 µL 4,0 µL --- Padrão 3 (200 mg/dL)
CN 200 µL --- 2,0 µL Controle Normal
CP 200 µL --- 2,0 µL Controle Patológico
AMOSTRAS 200 µL --- 2,0 µL Amostras*
Quantidades de reagentes e amostras que foram pipetados nos poços da microplaca de 96 poços correspondentes a padrões (PAD 1,
PAD 2 e PAD 3), controle normal (CN) e patológico (CP) e amostras para a dosagem de triglicerídeos séricos. *Concentração
desconhecida.
31
4.3.5 Transaminase Glutâmico-Oxalacética
A dosagem da enzima TGO ou aspartato aminotransferase (AST) foi
feita através do kit TGO K034 da empresa Bioclin adaptado para a realização
em microplaca de 96 poços.
Para criação da curva de calibração do ensaio, foi realizada a mistura do
padrão e água destilada em diferentes quantidades com o substrato da TGO
nos poços, conforme indicado na Tabela 6, utilizando-se microtubos de 2 mL.
Logo após, foi adicionado 125 µL de RT n° 2 (reagente de cor) e 1.250 mL de
hidróxido de sódio 0,4 N em cada microtubo e a solução final obtida foi
homogeneizada em vortex.
Duzentos microlitros da mistura de cada microtubo foi então transferida
para os poços da microplaca, em triplicata, a fim de se obter a curva de
calibração dos padrões. A microplaca foi homogeneizada, deixada em repouso
por cinco minutos e então sua absorbância foi lida a 505 nm (Epoch,
LifeTechnologies, area scan 5x5, 490 - 540 nm), acertando o zero com água
destilada. A curva de calibração foi plotada colocando na ordenada os valores
de absorbância e na abcissa os valores de TGO em Unidades/mL.
Uma segunda placa foi preparada para o ensaio com as amostras de
valor desconhecido. Os reagentes e controles foram adicionados de acordo
com a Tabela 7 em seus respectivos poços, em duplicata. A microplaca foi
então homogeneizada deixada em repouso por cinco minutos a temperatura
ambiente. A absorbância de cada poço foi lida a 505 nm (Epoch,
LifeTechnologies, area scan 5x5), acertando o zero com água destilada. Os
valores de TGO foram obtidos a partir da curva de calibração confeccionada no
início deste ensaio (Tabela 6) e os resultados obtidos foram expressos em UI.
32
Tabela 6 – Curva padrão do ensaio para a dosagem de transaminase glutâmico-oxalacética (TGO/AST) sérica
Microtubos Padrão* Substrato de TGO Água destilada TGO
1 --- 125,0 µL 25,0 µL 0 U/mL
2 12,5 µL 112,5 µL 25,0 µL 24 U/mL
3 25,0 µL 100,0 µL 25,0 µL 61 U/mL
4 37,5 µL 87,5 µL 25,0 µL 114 U/mL
5 50,0 µL 75,0 µL 25,0 µL 190 U/mL
Quantidades de reagentes a serem adicionados para a confecção dos padrões de 1 a 5 e o valor de enzima TGO em U/ml correspondente a
cada padrão.
33
Tabela 7 – Ensaio para a dosagem de transaminase glutâmico-oxalacética (TGO/AST) sérica
RT
(N° 1)
INCUBAR
37ºC
por 3 min
CP, CN,
Amostra
HOMOGENEIZAR
+
BANHO-MARIA
37ºC por 30 min
RT
(N° 2) HOMOGENEIZAR
+
REPOUSO 20 min
(Temperatura
ambiente)
NaOH 0,4 N Explicação
AMOSTRAS 20 µL 8,0 µL 20 µL 200 µL Amostras*
CN 20 µL 8,0 µL 20 µL 200 µL Controle
Normal
CP 20 µL 8,0 µL 20 µL 200 µL Controle
Patológico
Quantidade de reagentes, amostras e controles que foram pipetados nos poços da microplaca de 96 poços correspondentes aos controles
normal (CN) e patológico (CP) e amostras em todas as etapas do ensaio para a quantificação de enzima TGO sérica. * Concentração
desconhecida.
34
4.3.6 Transaminase Glutâmico Pirúvica
A dosagem da enzima TGP ou alanina aminotransferase (ALT) foi
realizada com a utilização do Kit TGP K035 da empresa Bioclin adaptado para
ser feito em microplaca de 96 poços.
Para a obtenção da curva de calibração deste ensaio, seguiu-se o
mesmo protocolo utilizado para a obtenção da curva de calibração do TGO,
porém utilizando-se o substrato específico para TGP. A mistura de reagentes
com os padrões também foi realizada em microtubos de 2,0 mL. A esta mistura
cujas quantidades de reagentes são indicadas na Tabela 8, foi adicionado
posteriormente 125 µL do RT nº 2 (reagente de cor) e 1.250 mL de hidróxido de
sódio 0,4 N. Duzentos microlitros da mistura final foram transferidos para uma
microplaca, em triplicata. Foi utilizado o mesmo procedimento para a obtenção
dos valores da curva de calibração utilizado no protocolo anterior de dosagem
do TGO sérico.
Em uma segunda microplaca, as amostras, controles e reagentes foram
adicionados conforme é mostrado na Tabela 9 em seus respectivos poços, em
duplicata. A placa foi então homogeneizada e incubada por 3 minutos a
temperatura ambiente e lida a 505 nm (Epoch, LifeTechnologies, area scan
5x5), acertando o zero com água destilada. A dosagem de TGP foi obtida a
partir da curva de calibração e expressa então em UI.
35
Tabela 8 – Curva padrão do ensaio para a dosagem de transaminase glutâmico-pirúvica (TGP/ALT) sérica
Microtubos Padrão* Substrato de TGP Água destilada TGP
1 --- 125,0 µL 25 µL 0 U/mL
2 12,5 µL 112,5 µL 25 µL 28 U/mL
3 25,0 µL 100,0 µL 25 µL 57 U/mL
4 37,5 µL 87,5 µL 25 µL 97 U/mL
5 50,0 µL 75,0 µL 25 µL 150 U/mL
Quantidade de reagentes a serem adicionados para a confecção dos padrões 1, 2, 3, 4 e 5 e o valor de enzima TGP em U/ml correspondente
a cada padrão.
36
Tabela 9 – Ensaio para a dosagem de transaminase glutâmico-pirúvica (TGP/ALT) sérica
RT
(N° 1)
INCUBAR
37ºC
por 3 min
CP, CN,
Amostra
HOMOGENEIZAR
+
BANHO-MARIA
37ºC por 30 min
RT
(N° 2) HOMOGENEIZAR
+
REPOUSO 20 min
(Temperatura
ambiente)
NaOH 0,4 N Explicação
AMOSTRAS 20 µL 4,0 µL 20 µL 200 µL Amostras*
CN 20 µL 4,0 µL 20 µL 200 µL Controle
Normal
CP 20 µL 4,0 µL 20 µL 200 µL Controle
Patológico
Quantidade de reagentes e amostras que devem ser pipetados nos poços da microplaca de 96 poços correspondentes ao controle normal
(CN), controle patológico (CP) e amostras em todas as etapas do ensaio para a quantificação de enzima TGO sérica. * Concentração
desconhecida.
37
4.3.7 Fosfatase Alcalina
A dosagem da enzima FA alcalina foi feita com a utilização do kit
FOSFATASE ALCALINA K019 da empresa Bioclin adaptado para realização do
ensaio em microplaca de 96 poços.
O ensaio para a quantificação da enzima fosfatase alcalina foi feito em
três etapas. Na primeira etapa, foi adicionado 5 µL do RT n°1 em todos os
poços, seguido de 50 µL do RT nº2, também em todos os poços. Feito isso, foi
adicionado os padrões nas quantidades indicadas na Tabela 10 em seus
respectivos poços, em triplicata. A microplaca foi coberta, homogeneizada à
mão e colocada em banho-maria por dois minutos.
Na segunda etapa, foram adicionados os controles e as amostras em
seus respectivos poços, em duplicata. A placa foi então coberta,
homogeneizada novamente e incubada a 37°C em banho-maria por 10
minutos. Na terceira etapa, foi adicionado 200 µL de RT n°3 em todos os poços
e a microplaca foi novamente homogeneizada. Após essa adição, foi medida a
absorbância de cada poço da microplaca no λ 578 nm (Epoch,
LifeTechnologies, area scan 5x5).
Para a obtenção do resultado em UI, foi subtraída a absorbância do
poço correspondente ao branco de todas as absorbâncias dos controles e das
amostras. Foi criada uma curva padrão a partir dos padrões e a partir dessa,
fosse obtida a concentração de FA sérica ao se plotar as absorbâncias das
amostras nessa curva.
38
Tabela 10 – Ensaio para a dosagem de fosfatase alcalina sérica
ETAPA 1
HOMOGENEIZAR
+
BANHO-MARIA
37ºC por 2 min
ETAPA 2
HOMOGENEIZAR
+
BANHO-MARIA
37ºC por
EXATAMENTE
10 min
ETAPA 3
RT
(N°1)
RT
(N°2)
RT
(Nº4) SALINA
CN, CP e
Amostra
RT
(Nº3)
BRANCO 5,0 µL 50 µL --- --- --- 200 µL
PADRÃO 1 (40 UI) 5,0 µL 50 µL 5,00 µL --- --- 200 µL
PADRÃO 2 (20 UI) 5,0 µL 50 µL 2,50 µL 2,50 µL --- 200 µL
PADRÃO 3 (10 UI) 5,0 µL 50 µL 1,25 µL 3,75 µL --- 200 µL
CN 5,0 µL 50 µL --- --- 5,0 µL 200 µL
CP 5,0 µL 50 µL --- --- 5,0 µL 200 µL
AMOSTRAS* 5,0 µL 50 µL --- --- 5,0 µL 200 µL
Quantidade de reagentes e amostras que devem ser pipetados nos poços da microplaca de 96 poços correspondentes a padrões (P1, P2 e
P3), controle normal (CN) e patológico (CP) e amostras em todas as etapas do ensaio para a quantificação de enzima TGO sérica. *
Concentração desconhecida.
39
4.4 CONTROLE DE QUALIDADE NORMAL E PATOLÓGICO
Para avaliar os ensaios realizados, foram utilizados controle de
qualidade normal (BIOCONTROL N K073, Lote 0050, Bioclin) e patológico
(BIOCONTROL P K074, Lote 0038, Bioclin), onde a concentração dos diversos
analitos era conhecida. Após realizado o ensaio de interesse, verificou-se se a
absorbância obtida, após aplicada à curva padrão, retornaria o valor esperado
dos controles normal e patológico.
Tabela 11 – Concentração esperada dos diferentes analitos presentes no
controle normal e controle patológico utilizados nos ensaios bioquímicos
Analito Controle Normal Controle Patológico
Colesterol Total 107 – 131 mg/dL 263 – 323 mg/dL
HDL Colesterol 48 – 74 mg/dL 86 – 130 mg/dL
LDL Colesterol 20 – 30 mg/dL 57 – 87 mg/dL
Triglicerídeo 58 – 72 mg/dL 281 – 345 mg/dL
TGO 26 – 38 U/mL 93 – 139 U/mL
TGP 17 – 27 U/mL 88 – 132 U/mL
Fosfatase alcalina 24 – 36 U/L 53 – 79 U/L
40
4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados foram tabelados e organizados no software Excel for
Windows. Para o cálculo do valor sérico dos analitos estudados, a curva
padrão foi calculada através da curva de regressão linear, onde na ordenada
foi plotada a absorbância e na abscissa a concentração do analito em questão.
Para avaliar a eficiência da curva padrão, foi calculado o r da correlação de
Pearson entre a absorbância e a concentração do analito dos padrões.
O valor sérico dos analitos estudados é apresentado na forma de média
± erro padrão da média (EPM). Os grupos dieta controle e dieta aterogênica,
que receberam a dieta pelo mesmo tempo, foram comparados através de teste
t de Student (dados paramétricos) ou teste de Mann-Whitney (dados não
paramétricos). Para comparar o efeito do tempo de dieta entre os anmais que
receberam o mesmo tipo de dieta, foi utilizando teste ANOVA One way com
pós-teste de Tukey e pós-teste para tendência linear (dados paramétricos) ou
teste ANOVA de Kruskal Wallis com pós-teste de Dunn (dados não
paramétricos). Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o
sotware GraphPad Prism versão 6.0.
41
5 RESULTADOS
5.1 MASSA CORPORAL
A massa corporal (MC) final dos camundongos alimentads com dieta
controle por 2, 4 e 8 semanas foi respectivamente de 27±0,4g, 30±0,6g e
30±0,8g. Já a MC final dos camundongos alimentados com dieta aterogenica
também por 2, 4 e 8 semanas foi de 28,2±0, 30,3±1g e 28,4±0,8g,
respectivamente. Dessa forma, não houve ganho de MC pela ingestão de dieta
aterogênica quando comparados os animais que receberam dieta controle
como é ilustrado nos gráficos abaixo (Figuras 5 e 6).
S e m a n a s
Ma
ss
a C
orp
ora
l (g
)
0 1 2 3 4 5 6 7 8
0
2 2
2 4
2 6
2 8
3 0
3 2
3 4D ie ta C o n tro le
D ie ta A te ro g e n ic a
Figura 5 - Evolução da Massa Corporal (MC). Camundongos C57BL/6 alimentados
com dieta controle e aterogênica por 2, 4 e 8 semanas.
42
Ma
ss
a C
orp
ora
l F
ina
l (g
)
2 4 8 2 4 8
0
1 0
2 0
3 0
4 0
D ie ta C o n tro le D ie ta A te ro g ê n ic a
Figura 6 – Massa corporal final. Camundongos C57BL/6 alimentados com dieta
controle e aterogênica por 2, 4 e 8 semanas.
5.2 INGESTÃO ALIMENTAR E ENERGÉTICA
Houve diferença estatística significativa na ingestão de ração quando
comparados os grupos experimentais alimentados com dieta controle e os
grupos alimentados com dieta aterogênica. A ingestão alimentar foi menor no
grupo que recebeu dieta aterogênica quando comparado ao grupo de seu
respectivo número de semanas alimentado com dieta controle (A2: -16%; A4: -
15% e A8: -28%; p<0,05).
43
Ra
çã
o g
/an
ima
l
2 4 8 2 4 8
0
1
2
3
4
5
D ie ta C o n tro le D ie ta A te ro g ê n ic a
[* ] v s . C o n t ro le (m e s m o te m p o )
* *
*
Figura 7 – Ingestão de ração. Camundongos C57BL/6 alimentados com dieta
controle e aterogênica por 2, 4 e 8 semanas. Quando indicado, p<0,05 [*] vs.
respectivo grupo controle.
Contudo, apesar da menor ingestão de ração dos grupos alimentados
com dieta aterogenica quando comparados aos grupos controle, hove um
aumento de ingestão energética nos grupos A2 (+11,6%) e A4 (+12,2%) e
diminuição da ingestão energética no grupo A8 (-5,1%) quando comparados
aos seus respectivos controles.
En
erg
ia m
éd
ia (
Kc
al/
dia
/an
ima
l)
2 4 8 2 4 8
0
5
1 0
1 5
2 0
D ie ta C o n tro le D ie ta A te ro g ê n ic a
* **
[* ] v s . C o n t ro le (m e s m o te m p o )
Figura 8 – Consumo de energia. Camundongos C57BL/6 alimentados com dieta
controle e aterogênica por 2, 4 e 8 semanas. Quando indicado, p<0,05 [*] vs.
respectivo grupo controle.
44
5.3 LIPIDOGRAMA
Na bioquímica sanguínia que avaliou o metabolismo lipídico, o TG foi de
C2: 51,3±8,5 mg/dL, C4: 36±6,2 mg/dL e C8: 52,7±10,5 mg/dL, A2: 35,5±6,0
mg/dL A4: 59,9±17,0 mg/dL A8: 46,7±5,8 mg/dL. Dessa forma, não houve
diferença estatística em relação ao TG dos animais alimentados com dieta
aterogênica em relação aos animais alimentados com dieta controle.
Já em relação ao CT foi observado um aumento estatístico significativo
de tais níveis nos animais alimentados com dieta aterogênica quando
comparados aos seus respectivos controles com o mesmo tempo de dieta. Nos
controles, os valores de CT foram de C2: 58,3±3,6 mg/dL C4: 68,9±5,6 mg/dL
C8: 57,6±5,0 mg/dL e houve um aumento percentual de CT em A2 de +62,6%,
em A4 de +35,4% e em A8 de A8: +40%.
Ao se analisar as frações de colesterol presentes no soro dos animais,
houve diferenças estatísticas em ambas (HDL e LDL). Os níveis de HDL foram
de C2: 63,5±2,5 mg/dL, C4: 72,7±3,7 mg/dL C8: 99,1±17,8 mg/dL, sendo
observado aumento nos grupos com dieta aterogênica (A2: +99%; A4:
+369,1%; A8: +111,2%, P<0,05). Os valores de LDL, por sua vez, foram de C2:
36,5±2,5 mg/dL, C4: 19,5±4,9 md/dL C8: 9,7±1,9 md/dL também aumentados
no grupos submetidos a dieta aterogênica (A2: +162,8%; A4: +128,8%; A8:
+108,9%, P<0.05).
45
Tri
gli
ce
rid
eo
s (
mg
/dL
)
2 4 8 2 4 8
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
1 2 0
D ie ta C o n tro le D ie ta A te ro g ê n ic a
Figura 9 – Triglicerídeos séricos. Camundongos C57BL/6 alimentados com dieta
controle e aterogênica por 2, 4 e 8 semanas.
Co
les
tero
l to
tal
(mg
/dL
)
2 4 8 2 4 8
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
1 2 0
D ie ta C o n tro le D ie ta A te ro g ê n ic a
*
*
*
[* ] v s . C o n t ro le (m e s m o te m p o )
Figura 10 – Níveis séricos de Colesterol total. Camundongos C57BL/6 alimentados
com dieta controle e aterogênica por 2, 4 e 8 semanas. Quando indicados, p<0,05 [*]
vs. respectivo grupo controle.
46
HD
L (
mg
/dL
)
2 4 8 2 4 8
0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
4 0 0
5 0 0
D ie ta C o n tro le D ie ta A te ro g ê n ic a
*
*
*
[* ] v s . C o n t ro le (m e s m o te m p o )
[a ] v s . 2 s e m a n a s (m e s m a d ie ta )
a
a
Figura 11 – Níveis séricos de Colesterol de alta densidade (HDL). Camundongos
C57BL/6 alimentados com dieta controle e aterogênica por 2, 4 e 8 semanas. Quando
indicados, p<0,05 [*] vs. respectivo grupo controle, [a] vs. grupo 2 semanas (mesma
dieta).
LD
L (
mg
/dL
)
2 4 8 2 4 8
0
5 0
1 0 0
1 5 0
D ie ta C o n tro le D ie ta A te ro g ê n ic a
*
*
*[* ] v s . C o n t ro le (m e s m o te m p o )
[a ] v s . 2 s e m a n a s (m e s m a d ie ta )
a
a
Figura 12 – Níveis séricos de Colesterol de baixa densidade (LDL). Camundongos
C57BL/6 alimentados com dieta controle e aterogênica por 2, 4 e 8 semanas. Quando
indicados, p<0,05 [*] vs. respectivo grupo controle, [a] vs. grupo 2 semanas (mesma
dieta).
47
5.4 MARCADORES DE FUNÇÃO HEPÁTICA
Na análise dos marcadores de lesão hepática, a dosagem sérica da
enzima FA não foi alterada com a ingestão de dieta aterogênica. Os valores da
dosagem de FA foram C2: 42,8±1 UI C4: 41,2±2,2 C8: 42,1±0,7 UI para os
camundongos alimentados com dieta controle e A2: 39,1±3 UI, A4: 37,6±2,3 UI
e A8: 40,9±0,8 para os animais alimentados com dieta aterogênica.
Os níveis de TGP se mostraram aumentados substancialmente com a
utilização da dieta aterogênica. A dosagem de tal enzima foi de C2: 15,3±2
U/mL C4: 36,9±7,5 U/mL C8: 42,1±12,3 U/mL no grupo controle e de A2:
138,5±20,5 U/mL, A4: 108,7±16,6 U/mL e A8: 87,4±22,6 U/mL no grupo
alimentado com dieta aterogênica. Dessa forma, foi observado um aumento
percentual de +806,4% em A2 em relação a C2, de +194,4% em A4 em relação
a C4 e de A8: +107,6% em A8 em relação a C8.
Por fim, os níveis de TGO mostraram-se aumentados estatisticamente
apenas em A2 e A4 em relação aos seus respectivos controles. Tal dosagem
foi de C2: 72,3±4,1 U/mL C4: 92±9,1 U/mL e C8: 115,4±14,4 U/mL nos grupos
controle e A2: 137,2±13 U/mL, A4: 128,5±12,1 U/mL e A8: 109,4±8,9 U/mL nos
grupos alimentados com dieta aterogênica. O aumento estatístico foi de
+89,8% em A2 em relação a C2 e de +39,7% em A4 em relação a C4.
48
Fo
sfa
tas
e A
lca
lin
a (
UI)
2 4 8 2 4 8
0
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
6 0
D ie ta C o n tro le D ie ta A te ro g ê n ic a
Figura 13 – Níveis séricos de Fosfatase Alcalina. Camundongos C57BL/6
alimentados com dieta controle e aterogênica por 2, 4 e 8 semanas.
TG
P (
U/m
L)
2 4 8 2 4 8
0
4 0
8 0
1 2 0
1 6 0
2 0 0
D ie ta C o n tro le D ie ta A te ro g ê n ic a
*
*
*
[* ] v s . C o n t ro le (m e s m o te m p o )
Figura 14 – Níveis séricos de transaminase glutâmico-pirúvica (TGP).
Camundongos C57BL/6 alimentados com dieta controle e aterogênica por 2, 4 e 8
semanas. Quando indicados, p<0,05 [*] vs. respectivo grupo controle.
49
TG
O (
U/m
L)
2 4 8 2 4 8
0
4 0
8 0
1 2 0
1 6 0
2 0 0
D ie ta C o n tro le D ie ta A te ro g ê n ic a
**
[* ] v s . C o n t ro le (m e s m o te m p o )
[a ] v s . 2 s e m a n a s (m e s m a d ie ta )
a
Figura 15 –– Níveis séricos de transaminase glutâmico-oxalacética (TGO).
Camundongos C57BL/6 alimentados com dieta controle e aterogênica por 2, 4 e 8
semanas. Quando indicados, p<0,05 [*] vs. respectivo grupo controle, [a] vs. grupo 2
semanas (mesma dieta).
50
5.5 CONTROLE DE QUALIDADE DOS ENSAIOS BIOQUÍMICOS
5.5.1 Curva Padrão
Para o cálculo da concentração dos analitos foi plotada uma curva de
regressão linear entre as concentrações conhecidas do analito em questão
(eixo X) e sua absorvancia após a realização do ensaio bioquímico (eixo Y). A
Tabela 12 mostra a curva de regressão linear obtida para cada analito. A curva
padrão de todos os analitos apresentou uma boa correlação (r), variando entre
0,94 e 0,99.
Tabela 12 – Valor do r da correlação entre a absorbância e a concentração de
cada analito
Analito r (P) Equação de regressão
Colesterol Total 0,999 (NS) ABS = 0,000785*[CT] + 0,0515
HDL Colesterol 0,972 (NS) ABS = 0,001098*[HDL] + 0,1570
LDL Colesterol 0,984 (NS) ABS = 0,002508*[LDL] - 0,1195
Triglicerídeo 0,997 (NS) ABS = 0,0004057*[TG] + 0,0160
TGO 0,943 (NS) ABS = 0,001135*[TGO] + 0,2065
TGP 0,970 (NS) ABS = 0,001489*[TGP] + 0,2083
Fosfatase alcalina 0,948 (NS) ABS = 0,05274*[FA] - 0,6340
Abreviaturas: NS, não significativo; ABS, absorbância da amostra; CT, colesterol total;
HDL, lipoproteína de alta densidade; LDL, lipoproteína de baixa densidade; TG,
triglicerídeos; TGO, transaminase glutâmico oxalacética; TGP, transaminase glutâmico
pirúvica; FA, fosfatase alcalina.
51
5.5.2 Controles de Qualidade
Na Tabela 13 são apresentados os valores observados dos diferentes
analitos sanguíneos, após a realização dos diferentes ensaios bioquímicos. Os
valores observados de CT, FA e TGO, tanto para o controle normal quanto
para o patológico se encontram foram do esperado segundo a bula dos
controles de qualidade. Os valores do controle normal de LDL e TG também se
encontram fora do esperado, assim como o valor do controle patológico de TG.
Porém, apesar de fora do esperado, os valores do controle normal de TGP e
FA são observados bem próximo ao esperado. Foram observados valores
dentro do que se espera segundo a bula para os controles normais de HDL e
TG e para os controles patológios de HDL, LDL, TG e TGP.
Tabela 13 – Concentração observada dos diferentes analitos presentes no
controle normal e controle patológico utilizados nos ensaios bioquímicos
Analito Controle Normal Controle Patológico
Colesterol Total 73,91 mg/dL 248,67 mg/dL
HDL Colesterol 49,8 mg/dL 91,1 mg/dL
LDL Colesterol 8,6 mg/dL 73,9 mg/dL
Triglicerídeo 49,4 mg/dL 377,6 mg/dL
TGO 79,6 U/mL 186,0 U/mL
TGP 15,7 U/mL 118,4 U/mL
Fosfatase alcalina 37,14 U/L 47,31 U/L
Abreviaturas: HDL, lipoproteína de alta densidade; LDL, lipoproteína de baixa
densidade; TGO, transaminase glutâmico oxalacética; TGP, transaminase glutâmico
pirúvica.
52
6 DISCUSSÃO
Dietas ricas em gordura saturada são um importante fator para o
desenvolvimento da aterosclerose, por causar distúrbios lipídicos,
principalmente o aumento do LDL (Steinberg et al., 1989; Sposito et al., 2007;
Henning et al., 2016). Apesar dessa informação ser amplamente difundida, o
consumo desse tipo de dieta, que juntamente com o consumo de sódio e
carboidratos simples é chamada de dieta ocidental, se faz muito presente na
sociedade moderna.
No presente estudo, para avaliar as consequências iniciais da ingestão
desse tipo de dieta, foi utilizada uma dieta rica em gordura (15%), colesterol
(1,25%) e ácido cólico (0,5%). Estudos mostram que esse tipo de dieta é capaz
de induzir, após em torno de 12 semanas de ingestão, estágios iniciais de
aterosclerose em algumas linhagens de camundongos como o C57BL/6,
apesar de camundongos serem relativamente resistentes ao desenvolvimento
da aterosclerose (Paigen et al., 1985; Nishina et al., 1990; Breslow, 1996). Tal
dieta se mostra eficiente para esse fim porque a ingestão de ácido cólico
aumenta a absorção intestinal de gordura e colesterol, assim como inibe a
conversão de colesterol em ácido biliar, diminuindo ao final a eliminação do
colesterol absorvido (Ando et al., 2005). Além disso, o tipo de gordura saturada
presente na dieta é oriunda da banha de porco, sendo o tipo de gordura mais
recomendada para induzir a obesidade e roedores (Buettner et al., 2006).
Diante disso, a dieta utilizada no presente estudo se mostrou eficaz em
modificar parâmetros lipídicos e marcadores de função hepática.
Observou-se, em nosso estudo, que os animais do grupo experimental
que receberam dieta aterogênica apresentaram uma ingestão alimentar menor
do que os animais alimentados com dieta controle. Apesar disso, o consumo de
energia do grupo alimentado com dieta aterogênica foi estatisticamente maior
nos grupos de 2 e 4 semanas. Este fato justifica-se pela densidade energética
da dieta aterogênica ser consideravelmente maior do que a da dieta controle
(5,000 kcal/g vs 3,804 kcal/g respectivamente). Tal dado é importante, já que o
aumento do consumo energético é indispensável para o aumento da
adiposidade (Townsend et al., 2008).
53
Apesar da maior ingesta calórica, não foi observado o aumento da MC
dos animais, quando comparados os grupos alimentados com dieta controle e
dieta aterogênica. Isso mostra que a ingestão da dieta aterogênica não foi
capaz de aumentar a MC de camundongos C57Bl/6 alimentados por oito
semanas. Esse dado pode ser considerado consistente com a literatura, à
medida que Nishina e colaboradores, em seu estudo, também não observaram
aumento de MC com a utilização de dieta semelhante (Nishina et al., 1990).
Sabe-se que as deslipidemias estão intimamente relacionadas com o
processo de aterogênese. A partir da utilização de uma dieta aterogênica, se
pode observar o aumento nos níveis de CT, o que mostra que a dieta em
questão foi eficaz em induzir uma deslipidemia nos camundongos. No estudo
de Srivastava e colaboradores, tal alteração também foi observada (Srivastava
et al., 2000). Diversos estudos mostram que uma dieta rica em gordura
saturada e rica em ácido cólico aumenta os níveis séricos de LDL e diminui os
níveis séricos de HDL (Nishina et al., 1990; Ishida et al., 1991; Srivastava et al.,
2000). Tal dado não foi consistente com o presente estudo já que foi observado
um aumento tanto de LDL, quanto do HDL, de forma bastante significativa.
Em relação aos triglicerídeos, não foram observadas alterações entre os
animais alimentados com dieta controle e aterogênica. Corroborando com esse
estudo, Ishida e colaboradores também não encontraram diferença na
concentração de tal analito em camundongos alimentados com dieta
aterogênica (Ishida et al., 1991). Já Srivastava e colaboradores observaram um
aumento significativo no triglicerídeo de camundongos alimentados com dieta
rica em lipídeos e ácido cólico quando comparado a uma dieta convencional
(controle), porém não encontraram tal diferença quando comparada a
alimentação com dieta aterogênica e alimentação com dieta rica em lipídeos
sem a adição de ácido cólico (Srivastava et al., 2000).
O monitoramento de enzimas hepáticas é fundamental com a utilização
desse tipo de dieta, já que a lesão hepática é uma das manifestações da
Sindrome Metabólica na qual esse tipo de dieta é um fator de risco conhecido
(Soler et al., 2008; Schild et al., 2013). Em nosso estudo, foi observado um
aumento significativo nos níveis da enzima TGP, considerada a enzima mais
54
específica para a caracterização de doença hepática, uma vez que ela está
presente em maior quantidade no citosol do hepatócito do que em outros
tecidos. Esse nível aumentado está de acordo com a literatura já que Nishida e
colaboradores também observaram em seu estudo um aumento considerável
dos níveis séricos desse marcador em camundongos C57BL/6 alimentados
com dieta aterogênica até a 14ª semana (Nishina et al., 1990).
Geralmente, os níveis das enzimas TGO e TGP aumentam em conjunto
e a relaçao entre ambos é importante na avaliação da gravidade da lesão
hepática (Ozer et al., 2008; Al-Busafi et al., 2013). No presente estudo, houve
aumento dos níveis séricos da enzima TGO na 2ª e na 4ª semana de estudo,
porém esse aumento não foi observado na 8ª semana. Todavia, numa análise
mais ampla, esse tipo de dieta foi capaz de alterar os níveis séricos dessas
enzimas, indicando que houve lesão hepática a nível de hepatócitos.
Além da lesão à nível celular, estudos mostram que a presença de ácido
cólico na dieta experimental é capaz de induzir a formação de cálculos biliares
até a 14ª semana (Nishina et al., 1990; Khanuja et al., 1995). Como a enzima
fosfatase alcalina está presente nas células de ductos biliares, seu aumento
normalmente se faz presente na presença de cálculos biliares já que, nesse
caso, há obstrução desses ductos. No presente estudo, não foi observado
aumento dos níveis séricos de fosfatase alcalina, mostrando que o tempo de
administração de dieta não foi suficiente para alterar tal parâmetro.
Por fim, a partir desse estudo, pode-se observar que a avaliação do
perfil lipídico e de marcadores de função hepática por método bioquímico
colorimétrico adaptado para a realização em microplaca de 96 poços foi
eficiente. Os ensaios forneceram uma boa curva padrão dos analitos com a
utilização de pequenas quantidades de reagentes e amostras, o que é
importante, visto a dificuldade na obtenção de grandes quantidades de soro em
estudos feitos em camundongos. Em média, consegue-se obter após punção
cardíaca e centrifugação do sangue, cerca de 300 a 400 µL de soro ou plasma,
dependendo da linhagem, gênero e idade do camundongo. Esse volume é
considerado pequeno, quando se quer realizar a dosagem de diversos analitos
55
em um soro ou plasma proveniente de um mesmo animal para estudos
metabólicos.
A curva de regressão linear plotada para o cálculo da concentração dos
analitos apresentou uma boa correlação, onde o r variou entre 0,94 e 0,99.
Entretanto, os controles normal e patológico utilizados nos diversos ensaios
não atingiram os valores esperados para diversos analitos. Acreditamos que os
controles utilizados no presente ensaio não são confiáveis para todos os
analitos, necessitando-se buscar dessa forma controles de novos fornecedores
que sejam de qualidade e confiabilidade para a realização de ensaios futuros.
56
7 CONCLUSÃO
Uma dieta hiperlipídica rica em colesterol e ácido cólico é capaz de
alterar o metabolismo lipídico e hepático, mesmo sem o ganho de massa
corporal e sem ser necessário um tempo prolongado de exposição à dieta, em
camundongos C57Bl/6. Entretanto, esta mesma dieta não é capaz de alterar os
níveis de fosfatase alcalina, indicando que até a oitava semana de exposição
não haveria o risco de colestase e doença hepática obstrutiva neste modelo
animal.
57
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Serviço Público Federal Universidade Federal Fluminense
Pró-Reitoria de Pesquisa, Pós-Graduação e Inovação Comissão de Ética no Uso de Animais
Certificamos que o projeto n° 647, intitulado “Efeito de dietas hiperenergéticas com
potencial obesogênico e/ou aterogênico sobre o sistema cardiovascular e renal de
camundongos”, sob a orientação da Profª. Caroline Fernandes dos Santos do Polo
Universitário de Nova Friburgo, está de acordo com os Princípios Éticos na
Experimentação Animal da SBCAL e obteve a aprovação da Comissão de Ética no
Uso de Animais em 26 de fevereiro de 2015. A quantidade total de animais
aprovada pela CEUA para este projeto foi de 240 (duzentos e quarenta)
camundongos, e este certificado é válido por três anos após sua aprovação.
Niterói, 26 de fevereiro de 2015.
_________________________________________
Prof. Dr. Fabio Otero Ascoli
Coordenador da CEUA