UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE …€¦ · O peixe voador é um dos recursos disponíveis de importância econômica e social para países como a Filipinas, Indonésia,

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NUTRIÇÃO

SAMÁRIA SILVA DE ARAÚJO GARCIA

DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO DO ÍNDICE DE QUALIDADE DO PEIXE

VOADOR (Hirundichthys affinis, Günther, 1866) INTEIRO ARMAZENADO EM

GELO

NATAL/ RN

2017

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VOADOR (Hirundichthys affinis, Günther, 1866) INTEIRO ARMAZENADO EM GELO

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Nutrição, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Nutrição. Orientadora: Profª Drª Karla Suzanne Florentino da Silva Chaves Damasceno. Coorientador: Prof. Dr. Rodrigo Antônio Ponce de Leon Ferreira de Carvalho.

NATAL/ RN

2017

Garcia, Samária Silva de Araújo. Desenvolvimento do método do índice de qualidade do peixevoador (Hirundichthys affinis, GÜNTHER, 1866) inteiro armazenadoem gelo / Samária Silva de Araújo Garcia. - 2017. 113f.: il.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grandedo Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduaçãoem Nutrição. Natal, RN, 2017. Orientador: Profa. Dra. Karla Suzanne Florentino da SilvaChaves Damasceno. Coorientador: Prof. Dr. Rodrigo Antônio Ponce de LeonFerreira de Carvalho.

1. Peixe-voador - Dissertação. 2. MIQ - Dissertação. 3.Qualidade - Dissertação. 4. Frescor - Dissertação. 5.Armazenamento em gelo - Dissertação. I. Damasceno, Karla SuzanneFlorentino da Silva Chaves. II. Carvalho, Rodrigo Antônio Poncede Leon Ferreira de. III. Título.

RN/UF/BSCCS CDU 597.523

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRNSistema de Bibliotecas - SISBI

Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS

2



VOADOR (Hirundichthys affinis, Günther, 1866) INTEIRO ARMAZENADO EM GELO

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Nutrição,

da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito parcial à obtenção

do título de Mestre em Nutrição.

Aprovada em 08 de dezembro de 2017.

Profª. Drª. Lucia de Fátima Campos Pedrosa

Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Nutrição da Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN

BANCA EXAMINADORA

Profª Drª Karla Suzanne Florentino da Silva Chaves Damasceno Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN

Orientadora

Prof. Dr. Alex Augusto Gonçalves

Universidade Federal Rural do Semi-Árido - UFERSA Membro Externo

Profª. Drª. Elisabete Maria Macedo Viegas Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos da Universidade de São Paulo -

USP Membro Externo

https://www.escavador.com/sobre/24539826/universidade-federal-rural-do-semi-arido

3

AGRADECIMENTOS

À Deus, por Ele ser minha esperança.

À minha mãe Francisca pelo acolhimento materno diário.

Ao meu esposo Flávio pela dedicação, companheirismo, compreensão e cuidado

diário.

À minha orientadora Karla Suzanne pela louvável paciência, auxílio, conforto, por ser

tão amiga, mãe. Obrigada por me acolher e ao meu co-orientador Rodrigo Carvalho

pela ajuda no conhecimento e intermédio com os pescadores de Caiçara do Norte.

A minha turma de mestrado pelo acolhimento das alegrias e desafios da pesquisa e

da minha vida.

Às alunas de Iniciação Científica do Projeto Voador (Amanda, Julianna e Bruna) pelo

imensurável auxílio e por serem a alegria no dia a dia da pesquisa.

Aos monitores do Laboratório de Microbiologia.

Aos julgadores sensoriais pela efetiva participação desde o início da pesquisa, pelo

empenho e dedicação.

A Isailton Tavares que pacientemente atendeu às nossas necessidades na

pesquisa, fornecendo o peixe voador.

À Dona Graça, Rogério e Jéssica pelo auxílio e paciência diante da demanda das

análises nos Laboratórios.

Aos os servidores que fazem parte do programa de Pós-Graduação em Nutrição da

UFRN.

Ao auxílio financeiro de incentivo decorrente do EDITAL FAPERN/CAPES 006/2014

- que dispõe sobre o "APOIO AOS PROGRAMAS DE PÓS-GRADUAÇÃO DAS

INSTITUIÇÕES DE ENSINO SUPERIOR (IES) DO ESTADO DO RIO GRANDE DO

NORTE", assim como o de bolsa, EDITAL FAPERN/CAPES 013/2014 - que trata

sobre o "PROGRAMA DE BOLSAS DE FORMAÇÃO ACADÊMICA - MODALIDADE:

MESTRADO.

4

RESUMO

O peixe voador é um dos recursos disponíveis de importância econômica

e social para países como a Filipinas, Indonésia, Peru, Barbados, Trindade e

Tobago e Brasil, contudo os processos relacionados à sua perda de frescor são

pouco conhecidos. Uma ferramenta para avaliar as propriedades sensoriais do grau

de frescor do pescado, considerando aspectos específicos para cada espécie, é o

Método do Índice de Qualidade (MIQ), o qual fornece pontuações de demérito para

os atributos sensoriais do pescado em função do grau de deterioração. Neste

estudo, objetivou-se desenvolver o MIQ para avaliação do frescor do peixe voador

(Hirundichthys affinis, Günther, 1866) inteiro e armazenado em gelo, correlacionando

com análises físico-químicas e microbiológicas ao longo do período de

armazenamento. Para isso foram recrutados candidatos e selecionado julgadores

sensoriais pelos Teste de Reconhecimento de Aromas e Teste de 100 matizes de

Farnsworth Munsell. O desenvolvimento do MIQ se deu por meio de 3 ensaios de

armazenamento e foram utilizados exemplares de peixe voador capturados em

Caiçara do Norte, RN, Brasil. Foram realizadas análises microbiológicas (contagem

de Coliformes a 45ºC/g, pesquisa de Salmonella sp/25g, análise de Estafilococos

coagulase positiva/g e contagem total de microrganismos aeróbios mesófilos e

psicrotróficos) e físico-químicas (mensuração do pH e a determinação de nitrogênio

das Bases Voláteis Totais, Trimetilamina e Substâncias Reativas ao Ácido

Tiobarbitúrico). Assim, foi desenvolvido um esquema MIQ com 11 parâmetros,

agrupados em 3 atributos principais (aspecto geral, olhos e guelras) e o Índice de

Qualidade apresentou alta correlação linear (r = 0,956) com o tempo de

armazenamento indicando perda de frescor durante os dias. A contagem total de

bactérias aeróbias mesófilas e psicrotróficas revelaram forte e significante correlação

com o tempo de armazenamento (r = 0,705, p < 0,001 e r = 0,934 e p < 0,001,

respectivamente), variando de 3,20 log UFC/g (1º dia) a 5,61 log UFC/g (19º dia de

armazenamento) e de 2,0 log UFC/g (1º dia) a 8,18 log UFC/g (19º dia de

armazenamento), respectivamente. Salmonella não foi detectada em nenhuma

amostra. Foi encontrado Estafilococos coagulase positivo (4,0x102 UFC/g) e

coliformes a 45ºC (3,6 NMP/g) em uma amostra no 9º dia de armazenamento. Os

valores médios de pH tiveram aumento linear e contínuo (p < 0,001), variando de

5

6,23 (1º dia) a 6,88 (19º dia). Os valores médios de N-BVT e N-TMA variaram,

respectivamente, de 25,19 (1º dia) a 39,42 mg N-BVT/100g (19º dia) e 6,58 (1º dia) a

12,17 mg TMA/100g (19º dia), apresentando um aumento linear, contínuo e

significativo (p < 0,001 e p < 0,001) com forte e significativa correlação linear (r =

0,923, p < 0,001 e r = 0,747, p < 0,001) com o tempo de armazenamento. As médias

das Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (SRATB) variaram de 0,08 (1º dia)

a 2,52 MA/kg (22º dia). A Análise de Componentes Principais sugere que o peixe

voador permaneça com grau de frescor aceitável por até 9 dias, considerando as

análises realizadas e condições de armazenagem em gelo utilizadas neste estudo.

Palavras-chave: peixe voador, MIQ, qualidade, frescor, armazenamento em gelo.

6

ABSTRACT

The flying fish is one of the resources of economic and social importance

available to countries such as the Philippines, Indonesia, Peru, Barbados, Trinidad

and Tobago and Brazil, but the processes related to their loss of freshness unknown.

A tool to evaluate the sensory properties of fish freshness, considering specific

aspects for each species, is the Quality Index Method (QIM), which provides demerit

scores for the attributes of the fish as a function of the deterioration stage. The

objective of this study was to develop the QIM to evaluate the freshness of the fish

(Hirundichthys affinis, Günther, Günther, 1866), correlating with physical-chemical

and microbiological analyzes throughout the storage period. For this purpose

candidates were recruited and selected sensory judges by the Farnsworth Munsell

Aroma Test and Test of 100 shades. The development of the QIM was done by

means of 3 storage tests and were used flying fish specimens captured in Caiçara do

Norte, RN, Brazil. Microbiological analyzes (Coliform counts at 45ºC/g, Salmonella

sp/25g analysis, Coagulase positive Staphylococcus and total counts of aerobic

mesophilic and psychrotrophic) and physicochemical analyzes were performed (pH

measurement and determination of Total Volatile Bases and Trimethylamine). Then,

a QIM scheme was developed with 11 parameters, grouped into 3 main attributes

(appearance, eyes and gills) and a Quality Index that presented high linear

correlation (r = 0.956) with storage time indicating loss of freshness during the days.

The total count of aerobic mesophilic bacteria showed a significant increase (p =

0.009), ranging from 3.20 log CFU/g (1st day) to 5.61 log CFU/g (19th day of storage).

The total count of mesophilic and psychrotrophic aerobic bacteria showed a strong

and significant correlation with storage time (r = 0.705, p < 0.001 and r = 0.934 p

<0.001, respectively), ranging from 3.20 log CFU/g (1st day) 5.61 log UFC / g (19th

day storage) and 2.0 log UFC/g (1st day) at 8.18 log UFC/g (19th day storage),

respectively. Salmonella was not detected. Coagulase positive Staphylococcus

(4.0x102 CFU/g) and coliforms at 45ºC (3.6 NMP/g) were found in a 9th day storage

sample. The mean values of pH with a linear and continuous increase (p < 0.001),

ranging from 6.23 (1st day) to 6.88 (19th day). The mean values of TVB-N and TMA-N

ranged respectively from 25.19 (1st day) to 39.42 mg TVB-N/100 g (19th day) and

6.58 (1st day) to 12.17 mg (p <0.001 and p < 0.001) with a strong and significant

7

linear correlation (r = 0.923, p < 0.001 and r = 0.747, p < 0.001) with storage time. As

averages of Thiobarbituric Acid Reactive Substances (TBARS) ranged from 0.08 (1st

day) to 2.52 MA / Kg (22nd day). The Principal Component Analysis suggests that the

flying fish remain with an acceptable degree of freshness for up to 9 days,

considering the analyzes and ice storage conditions used in this study.

Key words: flying fish, MIQ, quality, freshness, ice storage.

8

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 – Hirundichthys affinis (A), Jerere(B)...........................................................17

Figura 2 – Fluxograma do desenho experimental.....................................................26

Figura 3 – Soluções estoque para o Teste de Reconhecimento de Aromas.............28

Figura 4 – Kit de apresentação para familiarização dos julgadores com os aromas

do Teste de Reconhecimento de Aromas...........................................................29

Figura 5 – Erlenmeyers codificados com números aleatórios das amostras

compondo o kit de análise referente ao Teste de Reconhecimento de Aromas........29

Figura 6 – Etapa de familiarização dos candidatos com os aromas do Teste de

Reconhecimento de Aromas......................................................................................30

Figura 7 – Série dos materiais codificados com três dígitos aleatórios e a ficha de

resposta apresentados ao candidato na cabine individual do Laboratório de Análise

Sensorial para o Teste de Reconhecimento de Aromas............................................30

Figura 8 – Soluções-teste do teste de 100 matizes de Farnsworth Munsell..............32

Figura 9 – Teste de 100 matizes de Farnsworth Munsell. Séries de tubos codificados

e aleatórios apresentados ao candidato em cabines individuais do Laboratório de

Análise Sensorial........................................................................................................32

Figura 10 – Etapas de desenvolvimento do esquema MIQ.......................................34

Figura 11 – Amostras de peixe voador H. affinis armazenadas em caixas isotérmicas

com gelo e temperatura monitorada...........................................................................35

Figura 12 – Julgadores avaliando os atributos sensoriais do peixe voador do primeiro

ensaio de armazenamento no Laboratório de Tecnologia de Alimentos...................36

Figura 13 – Julgadores avaliando sensorialmente as amostras de peixe voador no

segundo ensaio de armazenamento para desenvolvimento do MIQ.........................37

Figura 14 - Julgador avaliando sensorialmente as amostras de peixe voador no

terceiro ensaio de armazenamento para desenvolvimento do MIQ...........................38

9

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ACP Análise de Componentes Principais

AN Ágar Nutriente

ANOVA Análise de Variância

ATP Adenosina Trifosfato

Cad Cadaverina

CVT Contagem de microrganismos Viáveis Total

DMA Dimetilamina

EC E. Coli

EDTA Ethylenediamine Tetraacetic Acid

IQ Índice de Qualidade

KOH Hidróxido de potássio

MDA Malonaldeído

MIQ Método do Índice de Qualidade

MKTTn Tetrationato Muller Kauffmann Novobiocina

NMP Número Mais Provável

N-BVT Nitrogênio das Bases Voláteis Totais

NH3 Amônia

OTMA Óxido de Trimetilamina

Put Putrescina

PLS Partial Least Squares

RVS Rappaport Vassiliadis Soja

TBA Ácido Tiobarbitúrico

TBARS Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico

TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

TCA Ácido tricloroacético

TMA Trimetilamina

UFC Unidade Formadora de Colônia

VB Verde Brilhante

VIP Variável de Importância na Projeção

VP Voges-Proskauer

XLD Xilose Lisina Desoxicolato

10

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 12

2 CARACTERIZAÇÃO DO PROBLEMA ................................................................. 14

3 OBJETIVOS ......................................................................................................... 15

3.1 OBJETIVO GERAL ............................................................................................ 15

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .............................................................................. 15

4 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................. 16

4.1 PEIXE VOADOR, Hirundichthys affinis (Günther, 1866)..................................... 16

4.2 QUALIDADE DO PESCADO FRESCO .............................................................. 17

4.2.1. ASPECTOS MICROBIOLÓGICOS ................................................................. 18

4.2.2 ASPECTOS FÍSICO-QUÍMICOS ..................................................................... 19

4.2.3 ASPECTOS SENSORIAIS .............................................................................. 22

5 METODOLOGIA ................................................................................................... 26

5.1 ASPECTOS ÉTICOS ......................................................................................... 26

5.2 DESENHO DA PESQUISA ................................................................................ 26

5.3 RECRUTAMENTO, SELEÇÃO E TREINAMENTO DE AVALIADORES

SENSORIAIS PARA DESENVOLVIMENTO DO ESQUEMA MIQ............................ 27

5.3.1 RECRUTAMENTO .......................................................................................... 27

5.3.2 SELEÇÃO DOS AVALIADORES..................................................................... 27

5.3.3 TREINAMENTO .............................................................................................. 33

5.4 DESENVOLVIMENTO DO ESQUEMA MIQ ....................................................... 33

5.4.1 MATÉRIA-PRIMA ............................................................................................ 34

5.4.2 ESQUEMA MIQ PRELIMINAR ........................................................................ 35

5.4.3 TESTE DO ESQUEMA MIQ ............................................................................ 36

5.4.4 CURVA DE CALIBRAÇÃO .............................................................................. 37

5.5 ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS ....................................................................... 38

5.5.1 PREPARO DA AMOSTRA .............................................................................. 38

5.5.2. PREPARO DAS DILUIÇÕES ......................................................................... 39

5.5.3 CONTAGEM DE COLIFORMES A 45ºC/g ...................................................... 39

5.5.4 CONTAGEM DE ESTAFILOCOCOS COAGULASE POSITIVA/g ................... 40

5.5.5 CONTAGEM TOTAL DE MICRORGANISMOS AERÓBIOS MESÓFILOS EM

PLACAS ................................................................................................................... 40

11

5.5.6 CONTAGEM TOTAL DE MICRORGANISMOS AERÓBIOS

PSICROTRÓFICOS EM PLACAS ............................................................................ 41

5.5.7 PESQUISA DE SALMONELLA sp/25g ............................................................ 41

5.6 ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS .......................................................................... 44

5.6.1 DETERMINAÇÃO DE PH ............................................................................... 44

5.6.2 DETERMINAÇÃO DE BASES VOLÁTEIS TOTAIS (N-BVT) E TRIMETILAMINA

(TMA) ....................................................................................................................... 44

5.6.3 AVALIAÇÃO DAS SUBSTÂNCIAS REATIVAS AO ÁCIDO TIOBARBITÚRICO

(TBARS) .................................................................................................................. 45

5.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA .................................................................................... 46

6 ARTIGO PRODUZIDO .......................................................................................... 47

7 CONSIDERAÇÕES FINAIS .................................................................................. 80

REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 81

APÊNDICES ............................................................................................................ 93

ANEXOS ................................................................................................................ 106

12

1 INTRODUÇÃO

Os peixes voadores (família Exocoetidae) são comuns no mundo em

águas subtropicais e tropicais1,2 e considerados espécies comerciais e

ecologicamente importantes, um componente significativo da cadeia alimentar

epipelágica, independentemente da sua distribuição geográfica3, 4, 5.

Tem importância econômica em muitos países atuando como um recurso

pesqueiro na Indonésia6, nas Ilhas do Pacífico7, Coréia, China e no Mar do Japão6, 8,

sul da Califórnia, EUA9, Sul da Índia10, Antilhas Holandesas11, Caribe Oriental12 e

Nordeste do Brasil13.

O peixe voador (Hirundichthys affinis, Günther, 1866) é a espécie mais

importante e explorada pela indústria pesqueira de Barbados14, e também é um dos

recursos disponíveis e de baixo valor comercial, explorado por países como a

Coréia, Japão, Trindade e Tobago e Brasil15.

Na região Nordeste do Brasil, o Rio Grande do Norte é o estado que

representa, em âmbito nacional, a única área de pesca do peixe voador. Dentre os

municípios litorâneos do estado, Caiçara do Norte se destaca entre as principais

áreas, com produção pesqueira relativa de H. affinis de 38% durante o período de

1993 a 201016.

A qualidade do peixe é tema de pesquisa importante visto que o peixe é

alimento altamente perecível, e se deteriora rapidamente se não for manipulado,

processado e armazenado adequadamente17. Dessa forma, o frescor é o fator de

qualidade mais importante para a pesca porque é o primeiro critério para aceitação

ou rejeição do peixe18.

Imediatamente depois da captura, uma série de processos autolíticos

começam a ocorrer19. Em seguida, ocorrem alterações químicas e físicas

provocadas pela ação dos microrganismos20. Devido à importância desses

processos vários pesquisadores e institutos do setor da pesca desenvolveram

métodos para avaliar o frescor do peixe, com base nas alterações post-mortem

associadas às mudanças sensoriais, físico-químicas e microbiológicas21, 22.

Uma ferramenta para avaliar as propriedades sensoriais do grau de

frescor do pescado, considerando aspectos específicos para cada espécie, é o

Método do Índice de Qualidade (MIQ), o qual fornece pontuações de demérito para

os atributos do pescado, que no caso do peixe inteiro, incluem superfície do corpo,

13

olhos, brânquias, textura e abdômen, em função do estágio de deterioração e perda

de frescor23, 24, 25.

O MIQ é um método sensorial descritivo bastante utilizado na Europa,

desenvolvido na década de 1980 pela Tasmanian Food Research Unit26. Seu

princípio baseia-se na proposição de que os avaliadores não podem julgar graus de

perfeição, mas podem facilmente detectar desvios ou mudanças dele e, assim, os

defeitos no produto são atribuídos a pontos de demérito que são somados para

fornecer uma avaliação geral 27.

O MIQ fornece resultados confiáveis, rápidos e apresenta uma relação

linear entre a pontuação e o frescor e o tempo de armazenamento em gelo. Este

método apresenta como vantagem o fato de não destruir a amostra, ser simples,

preciso, objetivo, fácil de aplicar, de baixo custo e requerer pouco treinamento em

relação aos outros métodos28, 29, 30.

Diante disso, é relevante o desenvolvimento de uma metodologia eficiente

que contribua para o controle de qualidade da espécie peixe voador (Hirundichthys

affinis) e assim favorecer o consumo deste pescado e de seus produtos com padrão

de qualidade que assegure a sua qualidade sensorial e microbiológica.

14

2 CARACTERIZAÇÃO DO PROBLEMA

A perda de frescor do pescado implica em aumento da deterioração, e por

isso, a utilização de métodos adequados para a avaliação da qualidade dos produtos

da pesca está relacionada com a capacidade de definir padrões quantitativos sobre

esses processos de deterioração, permitindo assim avaliação correta do frescor30, 31.

Considerando que as legislações brasileiras (Decreto nº 9.013/2017 que

dispõe sobre o Regulamento da Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de

Origem Animal32 e o Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade de Peixe

Fresco pela Portaria nº185/199733) apresentam falta de especificidade quanto as

características organolépticas para as espécies de pescado, intensifica-se a

necessidade de ferramentas que auxiliem no controle de qualidade para as distintas

espécies. Nesse contexto, torna-se imprescindível o estabelecimento de uma

ferramenta sensorial que viabilize o controle de qualidade do peixe voador

(Hirundichthys affinis), conhecendo seu processo de deterioração e a sua vida útil,

visto que não existe na literatura nenhum regulamento técnico que identifique a

qualidade desta espécie de pescado, bem como nenhum MIQ desenvolvido para

esta espécie.

Estudos recentes apontaram que o peixe voador pode servir de matéria-

prima para diversos tipos de produtos34 e diante do seu potencial na alimentação

humana, pode ser considerado como um recurso abundante contribuindo para

geração de empregos e renda em um município com um dos menores índices de

desenvolvimento humano do Rio Grande do Norte que é Caiçara do Norte.

O MIQ poderá ser útil para dar condição aos pescadores a respeito do

frescor do peixe, resultando na influência positiva da manipulação a bordo das

embarcações pesqueiras35, além de permitir aos produtores manter os peixes em

gelo por tempo determinado, evitando perdas e aumentando a disponibilidade

comercial das espécies36. Espera-se também que, no futuro próximo, o MIQ seja o

método padrão de referência sensorial, sendo utilizado não só para fins de pesquisa,

mas também em mercados de peixe30.

Além da análise sensorial, as análises microbiológicas e físico-químicas

nos diferentes tempos de armazenamento em gelo determinam o limite satisfatório

do pescado quanto ao padrão de qualidade exigido.

15

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Desenvolver o Método do Índice de Qualidade (MIQ) para avaliação do

frescor do peixe voador (Hirundichthys affinis) inteiro armazenado em gelo.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Selecionar e treinar uma equipe de avaliadores para avaliação sensorial

do frescor do peixe voador;

Avaliar as alterações sensoriais, físico-químicas e microbiológicas do

peixe voador armazenado em gelo ao longo do tempo;

Correlacionar o MIQ com análises físico-químicas e microbiológicas ao

longo do período de armazenamento;

Determinar a vida útil do peixe voador armazenado em gelo.

16

4 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

4.1 PEIXE VOADOR, Hirundichthys affinis (Günther, 1866)

Da família Exocoetidae são encontradas no oceano atlântico 12 espécies

de peixe voador: Cypselurus cyanopterus Valenciennes, 1846; Cypselurus comatus

Mitchill, 1818; Cypselurus melanurus Rafinesque, 1810; Cypselurus heterurus

Rafinesque, 1810; Cypselurus exiliens Linné, 1771; Prognichthys gibbifrons Cuvier e

Valenciennes, 1864; Oxyporhamphus micropterus similis Bruun, 1935; Exocoetus

volitans Linnaeus, 1758; Parexocoetus brachypterus Richardson, 1846;

Hirundichthys speculiger Valenciennes, 1846 e Hirundichthys affinis, Günther,

186637, 2.

Esses peixes têm importância comercial em muitos países, atuando como

recurso pesqueiro na Indonésia6, Ilhas do Pacífico7, Coréia, China e no Mar do

Japão6, 8, Sul da Índia10, Antilhas Holandesas11, Caribe Oriental12 e Nordeste do

Brasil onde é conhecido como peixe voador de quatro asas13. Filipinas é o maior

produtor mundial e a pesca se dá na província de Batanes34. Barbados é

considerado o 5° produtor mundial de peixe voador e tem na espécie um patrimônio

nacional que simboliza o orgulho e a indústria do país, estando estampado na

moeda de um dólar e no logotipo da autoridade de turismo do país38.

O peixe voador (Hirundichthys affinis) é distribuído por todo o Atlântico

oeste tropical e é relatado próximo da costa ocidental da África39. No Atlântico

Ocidental é mais abundante ao longo da costa norte da América do Sul,

principalmente no nordeste do Brasil, no sul das Antilhas Menores e ao redor de

Curaçau39, 40, 41. No Brasil as espécies Cypselurus cyanopterus e Hirundichthys

affinis merecem destaque42. Na região de Caiçara do Norte predomina a espécie

Hirundichthys affinis (Günther, 1866) que pertence à classe Osteichthyes, ordem

Beloniformes, família Exocoetidae, gênero Hirundichthys43.

Esta espécie apresenta o corpo alongado, grosso e um pouco achatado

ventralmente, focinho mais curto que o olho, sem corte e dentes palatinos

geralmente ausentes. As nadadeiras peitorais, longas, perfazem 60 a 70% do

comprimento padrão. As nadadeiras dorsais e anais são bem atrás no corpo e suas

bases são curtas. As pélvicas são grandes, alcançando além da origem da

nadadeira anal12. Dorsalmente, a cor é azul iridescente e o corpo apresenta

17

coloração prateada. A nadadeira dorsal é incolor ou apenas ligeiramente pigmentada

e as peitorais são escuras44, Figura 1.

O corpo fusiforme facilita o hidrodinamismo e a presença da nadadeira

peitoral bem desenvolvida são adaptações para viver nas águas superficiais do mar

aberto44. O comprimento total e o peso corporal dos machos apresenta valores

médios de 26,5 cm e 150,24g e nas fêmeas, 27 cm e 154,75 g, respectivamente45. A

idade média do peixe voador Hirundichthys affinis adulto é cerca de 1 ano46.

A carne dos peixes voadores, utilizadas como isca para pesca de

espécies maiores34, tem qualidade para ser comercializada na forma de filé e suas

ovas utilizadas para produção sucedâneo de caviar47.

No Brasil, apresenta importância econômica e social, por constituir-se

alimento para populações de baixo poder aquisitivo, sendo comercializado na forma

salgada e seca45. Em Caiçara do Norte, nordeste do Brasil, a pesca do peixe voador

é realizada em barcos a motor e a vela que navegam para áreas oceânicas, em

profundidades superiores a 800 metros. O barco é deixado à deriva e é lançado na

água óleo de tubarão ou mamona para que os peixes voadores sejam atraídos e

então capturados com a utilização do jereré (armadilha de formato triangular de

madeira preenchida por uma rede de nylon)16, Figura 1.

(A) (B)

Fonte: Arquivo pessoal.

Figura 1. Hirundichthys affinis (A), Jerere (B).

4.2 QUALIDADE DO PESCADO FRESCO

No peixe após a captura e, consequentemente sua morte, uma série de

processos autolíticos começam a ocorrer, hidrolizando as proteínas e gorduras. Em

18

seguida, ocorrem alterações químicas e físicas provocadas pela ação dos

microrganismos20.

O rigor mortis é o primeiro estágio de alteração após a morte do pescado

e é considerado como uma alteração muscular irreversível, onde a formação do

complexo miosina com actina não pode ser desfeita, pois não existe energia

suficiente na forma de adenosina trifosfato (ATP)20.

Durante a deterioração, detecção de aromas e sabores desagradáveis,

produção de gás, formação de muco, coloração anormal e alterações na textura são

sinais de alterações do peixe que ocorrem devido à autólise, oxidação, atividade

bacteriana ou ainda pela combinação desses processos, interferindo diretamente no

prazo de validade48.

4.2.1. ASPECTOS MICROBIOLÓGICOS

O grau de deterioração do peixe é determinado, principalmente, pela

temperatura do músculo do peixe, carga bacteriana inicial, tempo decorrido após a

sua morte e pelas práticas sanitárias adotadas49 e, além disso, o crescimento

microbiano em combinação com a autólise enzimática e a oxidação são as principais

causas de deterioração dos peixes50.

Nas superfícies externas (pele e brânquias) e nos intestinos dos peixes

vivos e recém capturados, os microrganismos podem variar bastante em relação a

sua quantidade e natureza48

. Dessa forma, a microbiota existente sobre os peixes

recém-capturados depende dos seus hábitos alimentares e principalmente do

ambiente e modo de captura51.

A carne do peixe recém-capturado é estéril devido ao seu sistema

imunológico impedir que bactérias cresçam na carne. Após a morte do peixe há um

colapso do sistema imunológico, permitindo que as bactérias se proliferem48 e se

espalhe por vários tecidos52.

Essas espécies bacterianas produzem sabor, odor, textura e/ou cores

inaceitáveis, reduzindo assim a qualidade do pescado50. A microbiota natural dos

peixes são Shewanella, Pseudomonas, Photobacterium, Aeromonas e/ou

Enterobacteriaceae53 e dependem da carga bacteriana inicial, do tipo de

processamento, dos métodos de preservação e das condições de armazenamento50.

19

Em geral, bactérias gram-negativas predominam, mas os

microrganismos gram-positivos como Bacillus, Micrococcus, Clostridium,

Lactobacillus e Coryneforms também podem ser encontrados em proporções

variáveis48. Além disso, a baixa quantidade de carboidratos, pH relativamente alto

(6,2 a 6,5), alta atividade da água (aw ≈ 0,99) e altas quantidades de nitrogênio não

proteico como por exemplo, Óxido de Trimetilamina (OTMA) presentes no músculo

dos peixes servem como substrato para o crescimento de algumas bactérias

psicrotróficas54, 55.

Como o crescimento dos microrganismos é a principal causa da

degradação da qualidades dos peixes, a Contagem de microrganismos Viáveis Total

(CVT) é considerada como um índice de monitoramento da deterioração destes52.

Um nível de CVT superior a 107 UFC/g em peixe fresco é considerado inaceitável56.

No entanto, está bem documentado que nem toda a carga bacteriana enumerada

usando CVT é responsável pela deterioração, sendo observado que alguns peixes

com níveis de CVT acima de 107 UFC/g ainda são aceitáveis por avaliação

sensorial50.

As espécies psicrotróficas são dominantes durante o armazenamento dos

peixes em gelo57 e as mesófilas indica se a limpeza, a desinfecção e o controle da

temperatura durante os processos de tratamento industrial, transporte e

armazenamento foram realizados de forma adequada56.

Algumas bactérias são relacionadas a enfermidades por meio do

consumo de pescado e por isso precisam ser evitadas58. O Regulamento Técnico

sobre os Padrões Microbiológicos para Alimentos da Agência Nacional de Vigilância

Sanitária59 estabelece para pescado "in natura", resfriados ou congelados não

consumido cru, tolerância para Estafilococus coagulase positiva igual a 103 UFC/g e

ausência de Salmonella sp em 25g de amostra. Não há limite estabelecido para

Coliformes em peixe fresco, entretanto há limite que varia de 5 a 103 NMP/g para

produtos derivados de pescado.

4.2.2 ASPECTOS FÍSICO-QUÍMICOS

Após a morte do peixe o processo de respiração cessa e inicia o processo

de formação de ácido lático por via anaeróbica devido a degradação do glicogênio,

resultando na redução do pH48, 60.

20

As condições criadas pela diminuição do pH podem ocasionar o

rompimento das paredes dos lisossomos das células do tecido muscular e,

consequentemente, liberar enzimas dando início ao processo de autólise, que leva a

alterações estruturais no músculo do pescado, tornando-o amolecido pela quebra

dos tecidos conjuntivos61. Além disso, ocorre uma desnaturação parcial das

proteínas, as quais perdem a capacidade de reter da água, afetando a textura do

músculo48. Essa alteração no tecido muscular viabiliza a penetração de

microrganismos, e ainda, os produtos decorrentes das reações de autólise formam

substrato ideal para desenvolvimento de bactérias61.

O odor decorrente da deterioração do pescado é atribuído ao aumento

das aminas, por exemplo, dimetilamina (DMA), trimetilamina (TMA), amônia (NH3),

histamina, putrescina (Put), cadaverina (Cad), bem como outros compostos como

ácidos, carbonilos de cadeia curta, compostos de enxofre, compostos N-cíclicos e

aldeídos insaturados, que podem ser utilizados para monitorar a deterioração dos

peixes62.

À medida que o peixe se deteriora, o aumento do Nitrogênio das Bases

Voláteis Totais (N-BVT), composto principalmente por amônia, TMA e DMA

(produtos conhecidos como bases voláteis) e também o grau de oxidação lipídica

secundária indicada pelo nível de Ácido Tiobarbitúrico (TBA), como resultado da

degradação microbiana, são amplamente utilizados para avaliar o grau de frescor do

pescado63,

64

, além da determinação de produtos de degradação de ATP e formação

de aminas biogênicas65. Dessa forma, durante todas essas modificações post-

mortem o pH se mantém constante ou aumenta ligeiramente devido à formação de

compostos básicos e aminas voláteis por ação de enzimas tissulares e degradação

por microrganismos48. Quanto mais elevado o pH, maior atividade bacteriana60.

Deve-se considerar que a variação do pH depende de múltiplos fatores,

dentre eles a espécie do peixe, o método de captura e a alimentação, o que torna a

determinação do pH um índice de frescor questionável em algumas situações48 e,

dessa forma, o pH é um parâmetro que isoladamente não é um bom indicador do

estado de frescor66.

A determinação do Nitrogênio das Bases Voláteis Totais (N-BVT) é um

dos testes mais utilizados para determinar o grau de frescor dos peixes e inclui a

avaliação de TMA (produzida por bactérias de deterioração), DMA (produzida por

21

enzimas autolíticas durante o armazenamento congelado), NH3 (formada pela

degradação/desaminação bacteriana de proteínas, péptidos e aminoácidos, e na

degradação autolítica de adenosina monofosfato)48, 67 e são amplamente utilizados

como indicadores de vida útil, especificamente para medir estágios avançados de

deterioração do pescado68. Porém, algumas vezes são consideradas não confiáveis

para a avaliação da deterioração durante os primeiros dez dias de armazenamento

refrigerado de bacalhau, bem como várias outras espécies69.

Além disso, deve-se considerar que os valores de N-BVT dependem, em

grande parte, do método de análise e também não refletem o modo de deterioração,

se bacteriano ou autolítico48.

A TMA é outro indicador comumente utilizado para avaliar a deterioração

no pescado68. A formação de TMA a partir da redução de Óxido de Trimetilamina

(OTMA) é causada por degradação bacteriana70. Entretanto, não é uma medida

direta de deterioração bacteriana pois não são todas as bactérias presentes no

peixe deteriorado que reduzem OTMA em TMA71. E também não refletem os

estágios iniciais da deterioração e são apenas confiáveis para certas espécies de

peixes48.

Muitos dos produtos de oxidação secundária (aldeídos, cetonas, ácidos

graxos de cadeia curta e outros) possuem odores e sabores desagradáveis e estão

geralmente presentes em fases posteriores de oxidação e, portanto, são

considerados indicativos de processos de autoxidação48

. Dentre os produtos de

oxidação, alguns aldeídos reagem com o ácido tiobarbitúrico, o que possibilita obter

uma medida de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS)48. Quantidades

dessas substâncias maiores que 10μmol de equivalência de malonaldeído (MDA)

por 1 kg de peixe provavelmente terá sabores rançosos48.

De acordo com o Decreto nº 9.013/2017 que dispõe sobre o Regulamento

da Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal, nos casos em que

a avaliação sensorial revele dúvidas acerca do frescor do pescado, deve-se recorrer

a exames físico-químicos complementares32.

Dessa forma, o peixe fresco é aquele que atende aos seguintes

parâmetros físico-químicos, sem prejuízo da avaliação das características

sensoriais: o pH da carne deve ser inferior a 7,00 (sete inteiros) e as bases voláteis

22

totais devem ser inferiores a 30 mg (trinta miligramas) de nitrogênio/100g (cem

gramas) de tecido muscular32.

Poderão ser estabelecidos valores distintos para determinadas espécies,

a serem definidas em normas complementares, quando houver evidências

científicas de que os valores naturais dessas espécies diferem destes fixados para

pH e bases voláteis totais32.

O Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade de Peixe Fresco

(inteiro e eviscerado) editado pela Portaria nº185/1997 fixa parâmetros físico-

químicos do peixe fresco inteiro ou peixe eviscerado fresco, apto para consumo

humano, devendo as bases voláteis totais apresentar valor inferior a 30mg de

Nitrogênio/100g de carne, e o nível máximo de histamina deve ser 100ppm no

músculo, nas espécies pertencentes às famílias Scombridae, Scombresocidae,

Clupeidae, Coryyphaenidae33.

A Comissão Europeia, através do Regulamento (CE) 2074/200572

estabeleceu que são considerados impróprios para o consumo humano o pescado

cuja inspeção sensorial do pescado tenha suscitado dúvidas quanto ao seu frescor e

o seu controle químico mostre que estão ultrapassados os seguintes limites de

bases voláteis totais: 25 mg de nitrogênio/100 g de tecido muscular para as espécies

Sebastes spp., Helicolenus dactylopterus, Sebastichthys capensis; 30 mg de

nitrogênio /100 g de tecido muscular para as espécies que pertencem à família

Pleuronectidae (à exceção do Hippoglossus spp.) e 35 mg de nitrogênio /100 g de

tecido muscular para as espécies Salmo salar, espécies que pertencem à família

Merluccidae, espécies que pertencem à família Gadidae.

Dessa forma, esse valor ainda é muito discutido pelos pesquisadores, e

por isso a necessidade de estudos em diferentes espécies73.

4.2.3 ASPECTOS SENSORIAIS

Os atributos sensoriais do pescado fresco devem apresentar na avaliação

sensorial, algumas características sensoriais a serem consideradas adequadas ao

consumo e são estabelecidas por legislações brasileiras, como o Decreto nº

9.013/201732 e a Portaria nº185/199733 fixando requisitos para as características

organolépticas do peixe fresco inteiro ou peixe eviscerado fresco, apto para

consumo humano. No entanto, esses critérios exigidos não levam em conta a

23

diferença entre as espécies, bem como não definem parâmetros de qualidade

sensoriais para o frescor de espécies de peixes distintos74.

Nos últimos 50 anos pode-se destacar 3 esquemas para análise sensorial

do pescado fresco, a escala “Torry” (método pioneiro, desenvolvido em 1950, na

“Torry Research Station”, na Escócia), o esquema da União Europeia (Regulamento

Comunitário 103/76, de janeiro de 1976, estabeleceu critérios para comercialização

de peixes) e o Método do Índice de Qualidade75.

A escala Torry é um esquema utilizado para avaliar o odor e sabor dos

filés de peixe cozidos. Esta escala contém 10 pontos categóricos para odor e sabor

e na categoria 10 apresenta-se o odor e o sabor de muito fresco e na categoria 3, o

produto é considerado como deteriorado. Dessa forma, frequentemente uma

pontuação de 5,5 tem sido utilizada com limite para estabelecer a vida útil76.

O esquema da União Europeia é um regulamento próprio para pescado

que pode ser utilizado tanto por especialistas como autoridades sanitárias para

avaliar graus de frescor do pescado por meio de parâmetros gerais. O regulamento

apresenta esquemas distintos para peixes azuis, brancos, esqualos, cefalópodes e

crustáceos, mas não considerando as diferenças das características sensoriais entre

as espécies76.

O Método do Índice de Qualidade (MIQ) baseia-se na proposição de que

os avaliadores não podem julgar graus de perfeição, mas podem facilmente detectar

desvios ou mudanças e, assim, os defeitos no produto são atribuídos a pontos de

demérito que são somados para fornecer uma avaliação geral. Essa abordagem foi

derivada do entendimento de que, durante o armazenamento de peixes, ocorrem

mudanças que são facilmente detectáveis e geralmente mensuráveis. Isso também

está de acordo com o fato de que a grande maioria dos testes químicos, bioquímicos

e microbiológicos em produtos à base de pescado começam de zero ou baixo valor

e aumentam com a temperatura e o período de armazenamento27.

Nesse método se utiliza um sistema prático de qualificação específico

para cada espécie, avaliando a qualidade dos atributos sensoriais do pescado fresco

(aparência, textura, odor, olhos, brânquias e abdômen) e classificando-os por pontos

de demérito. A cada atributo é dado um escore, que varia de 0 a 3, sendo

considerado zero como o melhor escore. O resultado da soma dessa pontuação

24

resulta no Índice de Qualidade (IQ), o qual quanto mais próximo de zero, mais fresco

se apresenta o pescado77, 23, 48.

A diferença entre o MIQ e outros métodos sensoriais é o fato dele

apresentar os descritores para cada espécie de pescado, o que otimiza o

desenvolvimento de um esquema para cada espécie em condições específicas de

armazenamento, apresentando também as vantagens da correlação linear entre o

IQ e o tempo de estocagem, menor necessidade de preparo da amostra e menor

exigência de treinamento dos avaliadores78.

O MIQ tem sido utilizado para a qualidade do frescor de várias espécies

de pescado30

tais como: Macrobrachium amazonicum79

, Salvelinus alpinus80

,

Hippoglossus hippoglossus L.81, Salmo salar77 23, Sardinops sagax82, Cetengraulis

edentulus83, Aphanopus carbo24, Pagellus bogaraveo28, Boops boops, L84.,

Sardinella brasiliensis83, Megalobrama amblycephala85, Rhombus laevis78, Illex

coindetii86, Gadus morhua78, 87, Octopus vulgaris88, Sepia officinalis86, 31, Anguilla

anguilla89, Merluccius merluccius24, Dicentrarchus labrax24, Paralichthys patagoius90,

Pandalus borealis78, Sparus aurata91, 92, 93, Upeneus moluccensis65, Melanogrammus

aeglefius78, Merluccius capensis and M. paradoxus94, Clupea harengus78, Trachurus

trachurus24, Morone saxalis x Morone chrysops95, Panulirus Argus96, Clupea

harengus97, Sardina pilchardus98, Neoepisesarma mederi99, Engraulis

encrasicholus100, Merluccius merluccius var. mediterraneus101, Pleuroectes

platessa78

, Pollachius virens78

, Onchorhynchus mykiss102

, Mullus barbatus65

,

Sebastes mentella/marinus78, Dicentrarchus labrax103, Solea senegalensis104,

Litopenaeus vannamei105, Lepidopus caudatus24, Solea vulgaris78, Oreochromis

niloticus106, Chelidonichthys lucernus107, Scophtalmus maximus78, Micropogonias

furnieri108, Oreochromis ssp109, Colossoma macropomum x Piaractus

mesopotamicus110, Cynoscion acoupa111, Lutjanus cyanopterus112,

Pseudoplatystoma fasciatum x Leiarius marmoratus113.

Para o desenvolvimento do esquema MIQ para uma determinada espécie

é necessário ter conhecimento específico sobre a espécie a ser estudada, um painel

sensorial treinado e desenvolvido em três ensaios de armazenamento: esquema

preliminar, teste do esquema preliminar e curva de calibração. Além disso, para o

desenvolvimento completo do novo esquema MIQ, o experimento deve iniciar no

momento da captura do peixe e continuar até depois do fim da vida de prateleira.

25

Com relação à matéria prima, deve-se detalhar a data de captura, o tipo de pesca,

as condições de armazenamento e ser armazenado em caixas com gelo suficiente,

devendo o gelo ser reposto durante todo o período de armazenamento27.

Para o esquema MIQ preliminar é necessário o primeiro ensaio de

armazenamento dos peixes em gelo, bem como um painel sensorial selecionado

composto por no máximo 5 julgadores (incluindo o líder). Nessa etapa, é descrito em

detalhes todas as características do peixe até o fim da vida útil, listando todos os

atributos, bem como cada avaliação do atributo foi realizada. Em seguida, o líder

seleciona todos os atributos e descrições são agrupadas junto aos atributos e as

maiores mudanças nas características são pontuadas com pontos de demérito de 0

a 3. Isso é feito em fixos intervalos de tempo de 12 a 48 horas, a depender da

expectativa de vida útil da espécie.

O teste do esquema MIQ preliminar é feito durante o segundo ensaio de

armazenamento. Para isso, um painel sensorial com no mínimo 10 julgadores,

incluindo os que participaram do desenvolvimento do esquema MIQ preliminar são

incluídos. Neste ensaio, os intervalos fixos são menos frequentes que no primeiro

ensaio e 5 peixes são avaliados individualmente usando o esquema MIQ preliminar.

Cada pontuação de todos os atributos e comentários são escritos e depois de cada

sessão, os escores, comentários e questões de como avaliar os atributos são

discutidos entre os julgadores. Durante o desenvolvimento do MIQ, registros

fotográficos são necessários de todas as mudanças dos atributos27

.

No terceiro ensaio, curva de calibração, é realizada a análise de

regressão linear e é considerado como o mais complexo. Novos lotes de peixe, que

são armazenados por diferentes dias em gelo, ou seja, com diferentes IQ, são

avaliados em uma sessão por no máximo 5 julgadores. Amostras são codificadas

em ordem aleatória, não permitindo que os julgadores conheçam o tempo em dias

que o peixe está armazenado27.

Esse método de análise sensorial do pescado fresco poderá ser útil para

dar condição aos pescadores a respeito do frescor do peixe, resultando na influência

positiva da manipulação a bordo das embarcações pesqueiras35.

26

5 METODOLOGIA

5.1 ASPECTOS ÉTICOS

Esta pesquisa foi submetida à apreciação do Comitê de Ética do Hospital

Universitário Onofre Lopes da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN)

para julgamento, de acordo com a Resolução CNS/MS 466/12114 e foi aprovado sob

o número CAAE: 55299516.3.0000.5292 (Anexo 1).

5.2 DESENHO DA PESQUISA

Primeiramente foi realizado o recrutamento de candidatos a julgadores

sensoriais por meio de um questionário. Os julgadores recrutados passaram por

testes de seleção, para em seguida participar do treinamento sobre terminologias

sensoriais, uso de descritores, princípio do MIQ e estágios de deterioração do

pescado. O desenvolvimento do MIQ ocorreu em 3 ensaios de armazenamento,

denominados de Esquema MIQ preliminar, Teste do esquema MIQ e Curva de

Calibração. Para isso foram utilizados exemplares de peixe voador capturados em

Caiçara do Norte, RN, Brasil.

Além das análises sensoriais, os peixes foram avaliados quanto as

características físico-químicas e microbiológicas durante o teste do esquema MIQ e

curva de calibração (Figura 2).

Figura 2. Fluxograma do desenho experimental.

27

5.3 RECRUTAMENTO, SELEÇÃO E TREINAMENTO DE AVALIADORES

SENSORIAIS PARA DESENVOLVIMENTO DO ESQUEMA MIQ

5.3.1 RECRUTAMENTO

O recrutamento foi realizado entre funcionários, professores e

acadêmicos do Departamento de Nutrição (DNUT) da UFRN, com idade superior a

18 anos e de ambos os sexos. Os candidatos que aceitaram participar da pesquisa

preencheram um Questionário de Recrutamento (Apêndice 1) para obter

informações sobre afinidade com pescado, disponibilidade de tempo e condições de

saúde. Além disso, assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

(TCLE), no qual consta o objetivo da pesquisa, procedimentos metodológicos, riscos

e benefícios.

Por meio desse questionário foram excluídos os candidatos que não

gostariam de participar de um treinamento de avaliação sensorial de peixe,

possuíam alergia ao mesmo ou alguma doença que prejudicasse sua acuidade

visual, percepção de cores e/ ou capacidade de perceber odores e/ ou capacidade

tátil, ou apresentasse com frequência sintomas ou problemas relacionados à

resfriados e/ou congestão nasal.

5.3.2 SELEÇÃO DOS AVALIADORES

5.3.2.1 TESTE DE RECONHECIMENTO DE AROMAS

Os avaliadores recrutados foram selecionados por meio do Teste de

Reconhecimento de Aromas. Foram apresentadas aos avaliadores amostras para

identificação dos estímulos de olfato preparadas com o odor de limão, baunilha,

floral (lírio), canela, manjericão, menta (hortelã), cravo, morango, alecrim, alho,

cebola, orégano, vinagre, maracujá e tempero de peixe, a fim de detectar casos de

anosmia ou possível perda de sensibilidade.

Os procedimentos deste teste foram realizados de acordo com a ISO

8586115 com algumas modificações e os materiais utilizados para o preparo das

soluções estoque estão apresentados no Anexo 2.

Os materiais foram pesados em Erlenmeyer de 250mL com o auxílio de

balança analítica e em seguida foi adicionado os respectivos diluentes e fechados

com algodão (Figura 3).

28


Figura 3. Soluções estoque para o Teste de Reconhecimento de Aromas.

Em seguida, foram preparadas as diluições das soluções de análise

utilizando a proporção de 94% de água destilada e 6% de solução estoque. Com

essas soluções diluídas, foram preparados dois kits, o de apresentação (utilizados

para familiarização dos julgadores com os aromas) e o de análise (utilizados para as

análises individuais). Para compor o kit de apresentação foi adicionado 100 mL da

diluição de cada aroma aos Erlenmeyer de 250 mL e para o kit de análise foi

utilizado 50 mL de cada diluição e adicionado em Erlenmeyer de 100mL.

Logo em seguida os erlenmeyers foram envolvidos e vedada a entrada

com papel alumínio. Foi feita uma outra camada de papel alumínio semelhante a

uma tampa para que no momento do teste essa tampa fosse retirada e furos fossem

feitos na primeira camada de papel alumínio para que o aroma pudesse evaporar.

Os erlemeyers do kit de apresentação foram codificados com o nome do

aroma e o kit de análise com números aleatórios de três dígitos (Figura 4 e 5).

29


Figura 4. Kit de apresentação para familiarização dos julgadores com os aromas do

Teste de Reconhecimento de Aromas.


Figura 5. Erlenmeyers codificados com números aleatórios das amostras compondo

o kit de análise referente ao Teste de Reconhecimento de Aromas.

Aos candidatos foi apresentada uma amostra de cada aroma para se

familiarizarem com os 15 aromas identificados no frasco utilizando o kit de

apresentação de aromas (Figura 6). Em seguida, eles foram conduzidos a cabines

individuais e apresentados a outra série dos mesmos materiais codificados com três

dígitos aleatórios e foram solicitados a fazer a correspondência de cada amostra

com a aquela do conjunto original, utilizando apenas a memória olfativa (Figura 7). A

cada candidato foi entregue a ficha de resposta (Apêndice 2) para preenchimento.

30


Figura 6. Etapa de familiarização dos candidatos com os aromas do Teste de

Reconhecimento de Aromas.


Figura 7. Série dos materiais codificados com três dígitos aleatórios e a ficha de

resposta apresentados ao candidato na cabine individual do Laboratório de Análise

Sensorial para o Teste de Reconhecimento de Aromas.

Foram selecionados neste teste os candidatos que acertaram no mínimo

80% das respostas em 80% dos testes. O Teste de Reconhecimento de Aromas foi

31

realizado três vezes e conduzidos no Laboratório de Tecnologia de Alimentos e em

cabines individuais no Laboratório de Análise Sensorial do DNUT da UFRN.

5.3.2.2 TESTE DE 100 MATIZES DE FARNSWORTH MUNSELL

O teste de discriminação de cores foi realizado com os candidatos que

atingiram a pontuação mínima de acerto nos testes de Reconhecimento de Aromas.

O teste de 100 matizes de Farnsworth Munsell foi realizado de acordo com a ISO

8586115.

Os reagentes e materiais utilizados foram 32 tubos de ensaio, balança

analítica, água destilada, amido de milho em pó, grafite em pó, corantes amarelo

damasco líquido, azul anis pó e vermelho morango pó.

Com estes materiais foram preparadas três soluções estoque (amarela,

azul e vermelha) e uma mistura estoque (amido com grafite).

Para a série de testes a partir da cor amarela para verde e azul, foi

pesado 0,2 g de amarelo em um balão volumétrico de 100mL e 0,2 g de azul em um

balão volumétrico de 200 mL e ambos diluídos com água destilada.

Para a série de testes a partir da cor vermelha para violeta e azul, foi

pesado 0,2 g de vermelho em um balão volumétrico de 100mL e 0,2 g de azul em

um balão volumétrico de 200 mL e ambos diluídos com água destilada.

Para o teste com a cor cinza do claro para o escuro, foi preparada uma

mistura homogênea com 90% da fração em massa de amido de milho (nativo e

baixo teor de umidade) e 10% da fração em massa de grafite em pó.

Em seguida foi preparado três séries de testes (do amarelo passando

pelo verde até azul, do vermelho passando pelo violeta até o azul e do cinza claro

para o cinza escuro) a partir das soluções estoque.

A preparação das soluções-teste se deu da seguinte forma: para cada

uma das amostras 1 até 11 (série de tubos) foi adicionado a um tubo de ensaio e

diluído com 10 mL de água destilada o(s) volume(s) da(s) solução(ões)-estoque, em

mililitros, listado(s) no Anexo 3. Em seguida os tubos foram fechados (Figura 8).

32


Figura 8. Soluções-teste do teste de 100 matizes de Farnsworth Munsell.

Para cada amostra de 1 a 10 da variação de cinza, foi adicionado em

tubos de ensaio as quantidades de amido de milho e grafite listados no Anexo 3.

No momento da realização do teste os tubos foram apresentados ao

julgador em ordem aleatória em cabines individuais (Figura 9) e foi solicitado que a

série de tubos fosse organizada a partir do amarelo, passando pelo verde até azul, a

partir do vermelho, passando pelo violeta até o azul e a partir do cinza claro para o

escuro. Foi entregue ao julgador a ficha para resposta (Apêndice 3) e o TCLE.


Figura 9. Teste de 100 matizes de Farnsworth Munsell. Séries de tubos codificados

e aleatórios apresentados ao candidato em cabines individuais do Laboratório de

Análise Sensorial.

33

Os requisitos mínimos da seleção de julgadores nesse teste foi que para

cada série de 10 a 11 amostras, foram permitidos até dois erros envolvendo duas

amostras adjacentes.

Esse teste foi realizado com os julgadores por três vezes e foram

selecionados aqueles que atenderam os requisitos mínimos em pelo menos um dos

testes. Os testes foram conduzidos em cabines individuais no Laboratório de Análise

Sensorial do DNUT da UFRN.

5.3.3 TREINAMENTO

Os avaliadores (n=20) foram treinados de acordo com as normas

internacionais, perpassando pela terminologia geral, terminologia relativa aos

sentidos, terminologia relativa aos atributos organolépticos, terminologia relativo aos

métodos116 e também no desenvolvimento e uso de descritores115. Esse treinamento

ocorreu durante 3 sessões.

Em um primeiro momento, os avaliadores foram orientados quanto os

princípios do MIQ, os atributos analisados por meio deste método, as vantagens e

resultados que este método pode oferecer. Foi exposto para quais espécies de

pescado já existem o MIQ desenvolvido e a participação do peixe voador

Hirundichthys affinis nos países que possuem maior produção do peixe voador.

Na segunda e terceira sessão foi explicado e ilustrado por meio de

imagens os estágios de deterioração do pescado e suas consequências no aspecto

sensorial do mesmo e imagens ilustrando os diferentes graus de frescor com as

alterações nos atributos de qualidade de diferentes espécies de pescado. Além

disso, foi explicado o vocabulário específico dos atributos organolépticos para esta

espécie e suas medidas morfométricas. Por meio de infográfico, (Apêndice 4) os

avaliadores foram informados sobre descrição geral dos parâmetros sensoriais que

devem ser avaliados por cada julgador sensorial no momento do desenvolvimento

do MIQ.

5.4 DESENVOLVIMENTO DO ESQUEMA MIQ

As etapas de desenvolvimento do esquema MIQ pode ser visualizado na

Figura 10.

34

Figura 10. Etapas de desenvolvimento do esquema MIQ.

5.4.1 MATÉRIA-PRIMA

Foram utilizados exemplares do peixe voador (Hirundichthys affinis)

provenientes do seu habitat natural (Caiçara do Norte, RN, Brasil) capturados com

jerere no início da manhã nos meses de fevereiro a julho de 2017. Após a captura os

peixes foram armazenados em caixas isotérmicas com gelo e transportados ao

Laboratório de Microbiologia de Alimentos do Departamento de Nutrição da UFRN,

acomodando-os a uma temperatura de ±2ºC em camadas de gelo em escama

(proporção 1:1, peixe:gelo) para que as amostras mantivessem a temperatura

superficial próxima a 0ºC. A temperatura era monitorada com termômetro digital

diariamente (Figura 11). O gelo derretido de cada caixa foi reposto diariamente e a

água proveniente do degelo era drenada. Para assegurar que a qualidade das

amostras não fosse comprometida foi estabelecido um tempo limite de 30h entre a

captura e o início dos testes.

Um primeiro lote (n = 50 peixes) capturado em fevereiro foi utilizado para

a etapa do Esquema MIQ preliminar, considerado como o primeiro ensaio de

armazenamento em gelo. Um segundo lote de 280 peixes foi utilizado, capturados

em maio, dos quais 80 peixes foram destinados para as análises microbiológicas e o

restante (n= 200) foi utilizado para a etapa do Teste do esquema MIQ (segundo

ensaio de armazenamento) e análises físico-químicas. Para a Curva de Calibração

do esquema MIQ, análises microbiológicas e físico-químicas foram utilizados 110

peixes capturados em tempos distintos durante os meses de junho e julho, sendo

este o terceiro ensaio de estocagem.

35


Figura 11. Amostras de peixe voador H. affinis armazenadas em caixas isotérmicas

com gelo e temperatura monitorada.

5.4.2 ESQUEMA MIQ PRELIMINAR

Este foi considerado o primeiro ensaio de armazenamento, consistindo na

análise sensorial, a cada 48h, de um único lote de peixe voador estocado em gelo,

um total de 10 sessões de análise. Cada amostra foi previamente mantida em

condições ambientais por 30 minutos antes da análise30, apresentadas à equipe de

julgadores (1 homem e 4 mulheres) previamente selecionada, sobre bandeja com

fundo branco e analisadas sob condições laboratoriais. As amostras foram

descartadas após cada sessão de análise.

Aos cinco julgadores foi solicitado avaliar os atributos sensoriais de uma

amostra: aspecto externo (pele, muco, odor, textura/firmeza, abdômen), olhos

(córnea, forma e cor), brânquias/guelras (cor, odor, muco)78 bem como descrever

como a avaliação de cada atributo foi realizada utilizando uma Ficha de Avaliação

(Apêndice 5) . As sessões de análise foram conduzidas de forma a obter o máximo

de descritores possíveis que pudesse assinalar todas as modificações ocorridas no

peixe voador com o decorrer do tempo de armazenamento até o fim da vida útil e

uma lista de termos descritivos relativo aos atributos do pescado foi levantada.

36

A partir das alterações dos atributos sensoriais perceptíveis pela equipe

de avaliadores durante 19 dias de armazenamento, o líder produziu um protocolo

preliminar, selecionando os descritores, agrupando-os junto aos atributos de

qualidade e atribuído uma pontuação de 0-1, 0-2, 0-3 pontos de demérito para as

alterações que ocorreram no decorrer do tempo de armazenamento. O número de

pontos atribuídos para cada atributo foi somado, resultando no Índice de Qualidade

(IQ) igual a 29, o qual é a pontuação sensorial total (Apêndice 6).

Todas as sessões de análise sensorial foram realizadas no Laboratório de

Tecnologia dos Alimentos do DNUT da UFRN (Figura 12).


Figura 12. Julgadores avaliando os atributos sensoriais do peixe voador do primeiro

ensaio de armazenamento no Laboratório de Tecnologia de Alimentos.

5.4.3 TESTE DO ESQUEMA MIQ

O segundo ensaio de armazenamento do peixe voador em gelo foi

utilizado para testar o esquema MIQ preliminar resultante das primeiras

observações, realizar possíveis alterações e também para treinar a equipe de

julgadores sensoriais no uso do protocolo. O protocolo MIQ preliminar foi explicado

aos julgadores e indicado como realizar a correta avaliação utilizando o mesmo. Foi

solicitado aos julgadores que destacasse os descritores que os fizeram determinar

cada ponto de demérito (score).

Dessa forma, durante 19 dias, a cada 48h os julgadores (entre 11 e 20)

analisaram amostras de peixe voador armazenadas em gelo (Figura 13) e foi

realizado registro fotográfico dos atributos sensoriais do peixe voador para cada

tempo de armazenamento, sendo então analisado os peixes armazenados a 1, 3, 5,

7, 9, 11, 13, 15, 17 e 19 dias em gelo.

37


Figura 13. Julgadores avaliando sensorialmente as amostras de peixe voador no

segundo ensaio de armazenamento para desenvolvimento do MIQ.

A versão final do esquema MIQ foi preparada pelo líder considerando as

sugestões de melhorias dadas pelos julgadores e de acordo com a o número de

repetição de cada descritor por dia de análise, permanecendo no esquema MIQ

apenas os descritores que foram mais repetidos. A versão MIQ final apresentou um

IQ total igual a 22 pontos (Apêndice 7).

5.4.4 CURVA DE CALIBRAÇÃO

A partir da definição final do esquema MIQ para a espécie Hirundichthys

affinis, três julgadores treinados quanto ao uso do protocolo MIQ analisaram 10

peixes aleatoriamente escolhidos para cada tempo de armazenamento.

Para esse terceiro ensaio, novos lotes (n = 5) foram estocados por

diferentes dias em gelo. Em cada sessão de análise, 5 peixes com tempos de

armazenamento distintos foram apresentados sob bandejas com fundo branco,

previamente codificados com números aleatórios de três dígitos, sem a indicação de

tempo de armazenamento e avaliados pelos julgadores (Figura 14). No total de 2

sessões de análise foram avaliados peixes armazenados em gelo a 1, 4, 5, 8, 10,

14, 16, 17 e 22 dias.

38


Figura 14. Julgador avaliando sensorialmente as amostras de peixe voador no

terceiro ensaio de armazenamento para desenvolvimento do MIQ.

5.5 ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS

As análises foram realizadas com duas amostras de peixe voador

armazenadas em gelo, sendo cada uma composta por 4 exemplares de peixe

voador (H.affinis).

Foram realizadas a contagem de Coliformes a 45ºC/g pela técnica dos

tubos múltiplos117, pesquisa de Salmonella sp/25g118, análise de Estafilococos

coagulase positiva/g pelo método de contagem direta em placas119 e contagem total

de microrganismos aeróbios mesófilos120 e psicrotróficos121 em placas.

As análises foram realizadas durante o desenvolvimento do esquema MIQ

preliminar nos dias 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 e 19 e na etapa da curva e calibração

nos dias1, 4, 5, 8, 9, 10, 14, 16, 17 e 22 de armazenamento.

Essas análises foram conduzidas no Laboratório de Microbiologia de

Alimentos do DNUT da UFRN.

5.5.1 PREPARO DA AMOSTRA

Com auxílio de utensílios adequados (pinça e tesoura estéreis) foram

retirados a musculatura de quatro peixes inteiros para compor uma amostra que foi

utilizada para a contagem de Coliformes a 45ºC/g, Estafilococos coagulase

positiva/g, contagem total de microrganismos aeróbios mesófilos e psicrotróficos e

para a pesquisa de Salmonella sp/25g.

39

5.5.2. PREPARO DAS DILUIÇÕES

Foram pesados 25g da amostra e transferida para um erlenmeyer estéril

de 500 mL, contendo 225 mL de água peptonada 0,1% e homogeneizado por 2

minutos. Essa solução caracterizou-se como a diluição 10–1. A partir dela foram

realizadas as diluições subsequentes (10–2, 10–3 e 10–4) retirando-se 1 mL da diluição

anterior e adicionando a um tubo contendo 9 mL de água peptonada a 0,1% estéril.

5.5.3 CONTAGEM DE COLIFORMES A 45ºC/g

Realizou-se o teste presuntivo, em que três alíquotas de 1 mL foram

inoculadas em uma série de três tubos contendo 10 mL de Caldo Lauril Sulfato

Triptose (LST) por diluição. Em seguida foram incubados em estufa a 35±0,5º por

24±2h. Após esse período, foi observado se houve produção de gás nos tubos de

Durhan e crescimento, passando então para a prova confirmatória. Caso negativo,

foi reincubado até completar 48±2h e repetida a leitura, passando para prova

confirmatória subsequente em caso de crescimento com produção de gás.

Para a confirmação dos coliformes termotolerantes, uma alçada de cada

tubo positivo do teste presuntivo foi transferida para tubos contendo tubos de Durhan

e 10 mL Caldo E. coli (EC). A observação de crescimento com produção de gás nos

tubos de EC, após 24±2h de incubação a 44,5±0,2ºC no banho-maria foi

considerada confirmativa da presença de coliformes termotolerantes e o resultado foi

determinado pelo Número Mais Provável (NMP)/g utilizando a técnica dos tubos

múltiplos (série de três tubos).

Os tubos de EC positivos para coliformes termotolerantes são suspeitos

da presença de E. coli. Para a confirmação, uma alçada de cada tubo foi estriada em

placas contendo Ágar Levine Eosina Azul de Metileno e incubadas em estufa a 35

±1ºC por 24±2 horas e, transcorrido esse tempo, observado o desenvolvimento de

colônias típicas de E. coli (nucleadas, com centro preto, com ou sem brilho metálico).

Em caso positivo, colônias típicas foram transferidas para tubos inclinados de Ágar

Padrão para Contagem (PCA) e incuba-los a 35 ±1ºC por 24±2 horas. A partir das

culturas puras em PCA, foi realizada a coloração de Gram e também submetidas às

provas bioquímicas: indol, VM, VP e citrato (IMViC). Foram consideradas como E.

coli todas as culturas da seguinte forma: bastonetes Gram negativas, indol (+) ou (-),

VM (+), VP (-) e citrato (-).

40

5.5.4 CONTAGEM DE ESTAFILOCOCOS COAGULASE POSITIVA/g

A contagem deste microrganismo foi realizada transferindo 0,1mL (100µL)

de cada diluição para placas de Petri contendo Ágar Baird-Parker. Este

procedimento foi realizado em duplicata por diluição. O inóculo, com auxílio alça de

Drigalski, foi espalhado e então, as placas foram incubadas em estufa a 35-37ºC por

45-48 horas.

Transcorrido esse tempo a contagem das colônias presuntivas que

apresentam características circulares, pretas ou cinza escuras, lisas, convexas, com

bordas perfeitas, massa de células esbranquiçada nas bordas, rodeada por uma

zona opaca e/ou um halo transparente se estendendo para além da zona opaca,

foram contabilizadas nas placas que apresentaram entre 20 e 200 colônias típicas

e/ou atípicas.

Em seguida, foram selecionadas 6 colônias típicas e/ou atípicas,

semeadas com o auxílio de uma alça de platina estéril em 6 tubos contendo Caldo

Infusão Cérebro Coração e estes foram incubados em estufa a 35-37ºC por 18-24

horas.

A partir dos tubos com Caldo Infusão Cérebro Coração, após o período de

incubação, foi realizado o teste da coagulase e semeado 0,25mL (250µL) da cultura

para um tubo estéril contendo 0,5mL (500µL) de plasma de coelho com EDTA

(Coagulase Plasma - EDTA), incubado em estufa a 35-37ºC, observando

periodicamente durante 6 horas, verificando se havia a formação de coágulo. A

coagulação total ou parcial do plasma foi considerada positiva.

5.5.5 CONTAGEM TOTAL DE MICRORGANISMOS AERÓBIOS MESÓFILOS EM

PLACAS

Foi realizado o plaqueamento em profundidade transferindo 1mL

(1000µL) de cada uma das diluições para placas petri estéreis e vazias, vertendo em

cada uma 15mL de Ágar Padrão para Contagem, previamente fundido e resfriado a

44-46ºC. O inóculo foi misturando com o meio de cultura nas placas por meio de

movimentos suaves em forma de oito no sentido horário e anti-horário, repetindo de

oito a dez vezes, sob uma superfície plana. As placas foram distribuídas numa

bancada fria, sem empilhar, para solidificação do meio e em seguida foram

41

incubadas em estufa a 35±1ºC por 48±2 horas. Esse procedimento foi realizado em

duplicata para cada diluição.

Foram selecionadas as placas com as diluições que apresentaram melhor

visualização e com 25 a 250 colônias. Realizou-se a contagem das colônias com o

auxílio de um contador de colônias. O número de unidades formadoras de colônias

(UFC) por gramas da amostra foi calculado multiplicando o número de colônias (a

média aritmética da contagem obtida em cada uma das placas duplicatas) pelo

inverso da diluição inoculada.

5.5.6 CONTAGEM TOTAL DE MICRORGANISMOS AERÓBIOS

PSICROTRÓFICOS EM PLACAS

Por meio da técnica de semeadura em superfície foi transferido 0,1mL

(100µl) de cada uma das diluições para placas de Petri com Ágar Padrão para

Contagem previamente preparadas. O inóculo, com auxílio alça de Drigalski, foi

espalhado até que todo o excesso de líquido fosse absorvido. As placas foram

incubadas de 7±1ºC por 10 dias. Este procedimento foi realizado em duplicata.

A contagem seguiu as mesmas orientações descritas para o

plaqueamento em profundidade, porém, foi multiplicado o resultado por dez, para

levar em conta o volume dez vezes menor inoculado.

5.5.7 PESQUISA DE SALMONELLA sp/25g

Para o pré-enriquecimento foi homogeneizado uma porção de 25g da

amostra em erlenmeyer com 225mL de Água Peptonada Tamponada e incubado a

37±1ºC/18±2h.

Após esse período o erlenmeyer do pré-enriquecimento foi

cuidadosamente agitado e realizado o enriquecimento seletivo, transferindo uma

alíquota de 0,1mL em um tubo contendo 10 mL de caldo Rappaport Vassiliadis Soja

(RVS) e 1mL em um tubo contendo 10 mL de Caldo Tetrationato Muller Kauffmann

Novobiocina (MKTTn). O caldo RVS foi colocado a 41,5±1°C/24±3h em banho-maria

e o caldo MKTTn a 37±1°C/24±3h na estufa.

O plaqueamento diferencial foi a etapa seguinte, na qual estrias por

esgotamento foram feitas em placas contendo ágar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD)

e ágar Verde Brilhante (VB) a partir de uma alçada nas culturas do tubo com RVS. O

42

mesmo procedimento foi realizado com o caldo MKTTn. As placas foram incubadas

a 37±1°C/24±3h.

Após o período de incubação foi verificado desenvolvimento de colônias

típicas de Salmonella nos meios de plaqueamento diferencial. No ágar XLD as

colônias típicas são cor de rosa escuro, com centro preto e uma zona avermelhada

levemente transparente ao redor. Cepas de Salmonella ácido sulfídrico fortemente

positivas podem produzir colônias com centro preto grande e brilhante, ou mesmo

inteiramente pretas. Cepas de Salmonella ácido sulfídrico fortemente negativas

produzem colônias cor de rosa com centro rosa mais escuro, mas não preto. Cepas

de Salmonella lactose positivas produzem colônias amarelas com ou sem centro

preto. No ágar VB colônias típicas são de cor vermelha.

De cada placa inoculada, cinco colônias típicas e/ou atípicas foram

submetidas à confirmação. Por estrias de esgotamento foi inoculada cada colônia

selecionada em placa com Ágar Nutriente (AN), para purificação e incubadas a

37±1°C/24±3h. Após a incubação foi selecionada uma colônia bem isolada de cada

placa de AN para os testes de confirmação bioquímica e sorológicos.

Para o teste de crescimento em Ágar Tríplice Açúcar Ferro foi inoculado,

com uma agulha de inoculação, cada cultura em um tubo inclinado de Ágar Tríplice

Açúcar Ferro, por picada e estrias na rampa e incubado a 37±1ºC/24±3h, com as

tampas ligeiramente frouxas, para manter condições aeróbias e prevenir produção

excessiva de H2S. Após esse período foi observada a ocorrência de reação típica de

Salmonella: rampa alcalina (vermelha), fundo ácido (amarelo) com produção de gás

(bolhas ou rachaduras no meio de cultura), com ou sem produção de H2S

(escurecimento ou não do meio no fundo). Eventualmente pode crescer uma cepa

lactose positiva de Salmonella, provocando uma reação ácida (amarela) atípica na

rampa. Essas cepas não foram descartadas sem levar em conta os resultados dos

demais testes a seguir.

No teste de urease cada cultura foi inoculada por estrias na rampa em um

tubo com Ágar Uréia de Christensen inclinado e incubado a 37 ± 1ºC/24±3h. A

ocorrência de viragem alcalina do indicador com alteração da cor do meio de

pêssego para cor rosa escuro indicou teste positivo e a permanência do meio na cor

original, teste negativo. A maioria das cepas de Salmonella são urease negativa.

43

O teste de lisina descarboxilase foi conduzido inoculando, logo abaixo da

superfície do líquido, a cultura, em um tubo com Caldo Descarboxilase 0,5% L-lisina.

Incubou-se a 37 ± 1ºC/24±3h e em seguida observou se ocorreu turvação com

viragem alcalina do indicador, alterando a cor do meio para roxo azulado (teste

positivo) ou viragem ácida para amarelo (teste negativo). A maioria das salmonelas

são lisina-positivas, mas as cepas do sorotipo Paratyphi são negativas.

No teste de Voges-Proskauer (VP) cada cultura foi inoculada em um tubo

com 3mL de caldo VM-VP e incubados a 37±1ºC/24±3h. Após a incubação, foram

adicionados aos tubos duas gotas de solução aquosa 0,5% de creatina monohidrato,

três gotas da solução α-naftol 5% e duas gotas de solução KOH 40%, nesta

sequência, agitando os tubos entre um reagente e outro. O desenvolvimento de uma

cor rosa escuro ou vermelho no meio de cultura, no intervalo de 15 min, indicou teste

positivo. O não desenvolvimento da cor rosa ou vermelha indicou negativo. As

salmonelas são VP negativas.

Para o teste de Indol cada cultura foi inoculada em um tubo com 5 mL de

Caldo Triptona 1% suplementado com 1g/L de DL-Triptofano e incubado a

37±1ºC/24±3h. Após esse período foi adicionado 1 mL do Reagente de Kovacs,

para cada 5 ml de cultura, e observado o desenvolvimento de um anel vermelho-

violeta na superfície do meio de cultura (teste positivo) ou se o anel permaneceu

amarelado, cor do reagente de Kovacs (teste negativo). Desenvolvimento de vários

tons entre vermelho e rosa indicou teste indeterminado. A maioria das cepas de

Salmonella são indol-negativas.

Para a confirmação sorológica, a detecção dos antígenos somáticos (poli

O) e flagelares (poli H) foram realizados. Para isso, foram marcados dois quadrados

de aproximadamente 2cm2 em uma lâmina de vidro, usando um lápis de marcar

vidro de material hidrofóbico. Colocada uma gota de solução salina 0,85% estéril em

um dos quadrados e uma gota de anti-soro somático polivalente anti-Salmonella no

outro. Emulsionada uma parte da colônia suspeita na gota de solução salina e outra

parte na gota de anti-soro. Segurando a lâmina contra um fundo preto bem

iluminado, realizou-se delicados movimentos de inclinação e rotação da lâmina, para

movimentar a emulsão, observando a ocorrência de aglutinação no quadrado com o

anti-soro. Foi comparada com a aparência da emulsão no quadrado com salina

(controle negativo), para não confundir a aparência turva da emulsão com reação de

44

aglutinação. Eventualmente a aglutinação em ambos os quadrados, indicou que a

cepa é auto-aglutinante. O mesmo procedimento foi realizado substituindo o anti-

soro somático pelo anti-soro flagelar polivalente anti- Salmonella.

5.6 ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS

A mensuração do pH122 e a determinação de nitrogênio das Bases

Voláteis Totais e de Trimetilamina por arraste de vapor123 foram realizadas nas

amostras de peixe voador (H.affinis) armazenado em gelo, durante os ensaios do

teste do esquema MIQ e da curva de calibração. As substâncias reativas ao ácido

tiobarbitúrico (TBARS) foram determinadas por espectrofotometria124 durante o

ensaio da curva de calibração.

As análises foram conduzidas no Laboratório de Análise de Alimentos do

DNUT da UFRN e realizadas em triplicata para cada dia de amostragem durante

todos os pontos amostrais do experimento.

5.6.1 DETERMINAÇÃO DE pH

Uma amostra de 3g foi homogeneizada com 30 mL de água destilada até

que todas as partículas ficassem uniformemente suspensas. O pH foi mensurado

utilizando um aparelho medidor digital de pH (pH 21 HANNA, Brasil).

5.6.2 DETERMINAÇÃO DE BASES VOLÁTEIS TOTAIS (N-BVT) E TRIMETILAMINA

(TMA)

Para a determinação de N-BVT uma amostra de 25g foi homogeneizada

com 75mL de solução de ácido tricloroacético a 5% durante 1 minuto em mixer

(Mixer 700 PHILCO, China) para obter uma massa homogênea. O homogeneizado

foi filtrado utilizando papel filtro qualitativo até obtenção de um extrato límpido. Uma

alíquota de 5 mL do extrato foi transferida para aparelho de destilação por arraste de

vapor e adicionado 5mL de solução de hidróxido de sódio 2 M. O filtrado foi destilado

em equipamento destilador e o destilado foi recebido em Erlenmeyer contendo 5 mL

de solução de ácido clorídrico 0,01N e indicador (solução de ácido rosólico)

coletando cerca de 15 mL do destilado. Foi titulado o excesso de ácido com solução

de hidróxido de sódio 0,01N até coloração rósea pálido.

45

Para a determinação de TMA, foi adicionado 1mL de formaldeído a 16%

para cada 10mL de líquido no Erlenmeyer proveniente da análise de N-BVT e

titulado o ácido liberado com solução de hidróxido de sódio 0,01N até o mesmo

ponto final.

Os resultados da análise de N-BVT e TMA foram expressos em mg de

N/100g de amostra. As equações a seguir foram utilizadas para calcular esses

resultados:

Equação 1:

Equação 2:

Onde:

75 = solução de ácido tricloroacético a 5% em mL utilizado para homogeneizar a

amostra.

A = conteúdo de água na amostra expressa como mg/ 100g.

V = volume de ácido consumido em mL na titulação com solução de hidróxido de

sódio 0,01N

V’ = volume de ácido liberado em mL na titulação com solução de hidróxido de sódio

0,01N

F = fator de correção da solução de hidróxido de sódio 0,01N

N = normalidade da solução de hidróxido de sódio 0,01N

P = peso da amostra em gramas

Va = volume da alíquota em mL.

Na maioria dos casos pode-se afirmar que o conteúdo de água no

músculo do peixe é de 80%.

5.6.3 AVALIAÇÃO DAS SUBSTÂNCIAS REATIVAS AO ÁCIDO TIOBARBITÚRICO

(TBARS)

Foram pesados 10g de amostra em balança analítica e homogeneizados

com 50 mL de ácido tricloroacético (TCA) a 7,5 % com EDTA a 0,1% durante 1

minuto em um mixer. O homogeneizado foi filtrado através de papel de filtro

46

qualitativo e recolhido em um béquer. Foi transferido 5 mL do filtrado para um tubo

de cultura com tampa (este procedimento foi realizado em triplicata) e adicionado 5

mL de ácido tiobarbitúrico (0,02 M de solução de ácido 2-tiobarbitúrico). Foi feito um

branco com 5 mL de TBA e 5 mL de TCA a 7,5% com EDTA a 0,1% para calibrar o

espectro. Os tubos foram agitados mecanicamente e aquecidos em banho-maria por

40 minutos a 100ºC e em seguida, resfriados em gelo por 10 minutos. A absorbância

foi mensurada em espectrofotômetro a 538 nm.

Os resultados da análise de TBA foram expressos como mg de

malonaldeído/kg de amostra.

5.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA

As médias dos dados das análises microbiológicas e físico-químicas

foram comparadas por meio de uma análise de variância (ANOVA) e os efeitos

foram considerados significativos, de acordo com teste de Tukey, quando p-valor <

0,05. Os dados bacteriológicos foram expressos em log UFC/g.

Foi realizada a correlação linear dos dados das análises microbiológicas,

físico-químicas e sensoriais com o período de armazenamento, obtendo-se o

coeficiente de correlação (r), sendo considerado significativo quando p-valor < 0,05.

A Análise de Componentes Principais (ACP) foi utilizada para

correlacionar os dados das análises sensoriais, microbiológicas e físico-químicas

tanto do segundo como do terceiro ensaio de armazenamento, teste do esquema

MIQ e curva de calibração, respectivamente.

Os dados obtidos no esquema MIQ foram submetidos à análise de

regressão linear simples. A equação da regressão linear simples e o coeficiente de

determinação (R2) entre o IQ (Índice de Qualidade) e o tempo de armazenamento

em gelo foram calculados.

A regressão dos mínimos quadrados parciais (Partial Least Squares –

PLS) foi usada para determinar a incerteza da predição de dias no gelo a partir do

IQ. Os atributos do MIQ que mais positivamente ou negativamente influenciaram no

IQ foram identificados através da Variável de Importância na Projeção (VIP).

Todas as análises estatísticas foram realizadas pelo programa XLSTAT

para Windows (Adinsoft, Paris, France) e Microsoft Excel.

47

6 ARTIGO PRODUZIDO

O artigo intitulado “Desenvolvimento do Método do Índice de Qualidade

do peixe voador (Hirundichthys affinis. Günther, 1866) armazenado em gelo” foi

submetido para publicação no periódico “Food Control”, que possui fator de impacto

3,496 e Qualis A1 da CAPES para área de Nutrição.

48

DEVELOPMENT OF THE QUALITY INDEX METHOD FOR THE WHOLE FLYING

FISH (Hirundichthys affinis, Günther, 1866) STORED ON ICE

Samária Silva de Araújo Garciaa

Bruna Nayara Nogueira Filgueiraa

Amanda Gracielle Carlos Dantasa

Julianna Domingos Campos de Souzaa

Rodrigo Antônio Ponce de Leon Ferreira de Carvalhob

Karla Suzanne Florentino da Silva Chaves Damascenoa

aDepartment of Nutrition (DNUT), Federal University of Rio Grande do Norte (UFRN),

Avenida Senador Salgado Filho, 3000, Campus Universitário. Lagoa Nova, 59078-

970 Natal, RN, Brazil.

bAgricultural School of Jundiaí (EAJ), Federal University of Rio Grande do Norte

(UFRN), RN 106, Km 03, Distrito de Jundiaí, 59280-000 Macaíba, RN, Brazil.

Corresponding author: [email protected]

Abstract

This study aims to develop the Quality Index Method (QIM) for the whole flying fish

(Hirundichthys affinis) stored on ice and to estimate the shelf life according to the

physicochemical, microbiological and sensorial characteristics. The QIM scheme for

the flying fish stored on the ice was developed during three storage trials. The final

QIM scheme included 11 parameters, grouped into 3 quality attributes (general

appearance, eyes, and gills), with demerit scores ranging from 0 to 3 for each

parameter. A Quality index maximum score of the was 22 points and displayed a

strong (r = 0.956) and significant (p <0.0001) linear correlation with storage time.

Variables importance in the projection values (VIP) most relevant to this QIM were

recorded for superficial mucus, the color of the pupil and cornea. The total count of

aerobic mesophilic and psychotropic bacteria showed a significant increase with a

strong and significant correlation with storage time. The initial values of pH, TVB-N,

and TMA-N (6.23, 25.19 and 6.58 mg 100g-¹, respectively) increased linearly and

were strongly and significantly correlated with the ice storage period until the

maximum values of 6.88, 39.49 and 12.00 mg 100g-¹ respectively on the 19th.

TBARS analysis ranged from 0.08 on the 1st day to 2.52 MA/kg on the 22nd day of ice

storage. Based on the PCA correlation of the studied variables, the shelf life of the

flying fish stored on the ice was 9 days.

Keywords: Flying fish; Hirundichthys affinis; Quality Index Method; shelf life

mailto:[email protected]

49

Highlights

••There is no published data about the flying fish post mortem changes and shelf life.

•This is the first Quality Index Method scheme developed for a species of flying fish.

• Quality Index showed a strong and significant correlation with storage time.

• The shelf life of the flying fish stored in ice was estimated in 9 days.

• It allows predicting how many days the fish is stored.

50

Introduction 1

Flying fish (Exocoetidae family) are small pelagic fishes with planktonic 2

feeding habits, commonly found globally in subtropical and tropical oceans 3

(Oxenford, Mahonl, & Hunte, 1995) and are considered commercially and 4

ecologically important. The flying fish is a significant component of the epipelagic 5

food chain as a forage species for pelagic fishes such as tuna, swordfish, and Mahi 6

mahi (Parin, 1968; Parin, 2002). 7

Flying fishes are a source of income for coastal communities in the Asian 8

countries of the Philippines, Indonesia, and India; in the Caribbean countries as 9

Barbados, Dominican Republic; in South America as Trinidad and Tobago, Peru and 10

Brazil; and in Africa as Benin, Sao Tome, Principe, and Nigeria; which altogether and 11

combined with other countries produced 55.000 t of flying fishes in 2015 (FAO, 12

2017). The economic importance of the flying fish was first described in the 1960s in 13

Indonesia (Parin, 1960), Dutch Antilles (Zeneveld, 1961), Barbados (Lewis, John B.; 14

Brundritt, J. K.; Fish, 1962), Korea, China and Japan (Parin, 1960; Shiokawa, 1969), 15

California (USA) (Herald, 1969) and later in northeastern Brazil (Ogawa & Alves, 16

1971) and Pacific islands (Gillet & Ianelli, 1991) and south of India (Pajot & 17

Prabhakaradu, 1993). 18

The flying fish has a low market value, but in Barbados filleting adds value 19

(CRFM, 2014). In northeastern Brazil, this fish is sold salted (Ogawa & Alves, 1971). 20

The flying fish roe, called Tobiko, holds value for Asian markets and is exported by 21

Peru, Indonesia, and Brazil, all of which exported about 2,000 tons of roe in 2015 22

from various species, including the flying fish (FAO, 2017). 23

Value-added strategies for ocean-caught flying fish are still in development, 24

which impedes improving the use of this important resource for socio-economic and 25

environmental purposes. Unpublished studies have demonstrated that the minced 26

meat of flying fish can produce different consumer food products such as nuggets 27

and meat patties with a high acceptance rate. An important necessity for value-28

addition of flying fish products is to understand the postmortem changes and 29

determine the shelf life of this species. Immediately after capture, a series of autolytic 30

processes begin to occur (García et al., 2017), followed by chemical and physical 31

changes caused by microorganisms (Liu, Liang, Xia, Regenstein, & Zhou, 2013). In 32

light of these processes, several methods have been developed to evaluate fish 33

51

freshness based on postmortem changes associated with sensorial, physicochemical 34

and microbiological changes (Ocaño-Higuera et al., 2011; Li, Li, & Hu, 2013). 35

A tool to evaluate the sensory properties of fish freshness, considering specific 36

aspects of each species is the Quality Index Method (QIM) (Martinsdóttir, 37

Sveinsdóttir, Luten, Schelvis-Smit, & Hyldig, 2001), which provides demerit scores for 38

fish attributes such as eyes, gills, and texture according to the stage of decay and 39

loss of freshness (Sveinsdottir, Hyldig, Martinsdottir, Jørgensen, & Kristbergsson, 40

2003; Nunes, Batista, & Cardoso, 2007; Hyldig, G., Martinsdottir, E., Sveinsdottir, K., 41

Schelvis, R., & Bremner, 2010). 42

The QIM provides reliable, fast results and presents a linear relationship 43

between punctuation and freshness and storage time on ice. This method has the 44

advantage of not manipulating the sample with chemicals, being simple, precise, 45

objective, easy to apply, low cost and requiring little training in relation to other 46

methods (Sant’ana, Soares, & Vaz-Pires, 2011; Šimat, Bogdanović, Krželj, Soldo, & 47

Maršić-Lučić, 2012; Borges, Conte-Junior, Franco, Mársico, & Freitas, 2014). 48

This study aims to develop the Quality Index Method for the flying fish 49

(Hirundichthys affinis) stored on ice and to estimate the shelf life according to the 50

physicochemical, microbiological and sensorial characteristics. 51

52

2. Material and methods 53

2.1. Ethical aspects 54

This study was approved by the Ethics Committee of the Onofre Lopes 55

University Hospital of the Federal University of Rio Grande do Norte (UFRN; CAAE 56

number: 55299516.3.0000.5292), in accordance with Resolution CNS/MS 466/12 57

(Brazil, 2012). 58

59

2.2. Collection and storage of samples 60

Samples of the whole flying fish (Hirundichthys affinis) were captured in the 61

early morning from February to July 2017, in the Atlantic Southwest, Major Fishing 62

Area 41, Subarea 41.1 and Division 41.1.2 (Natal) and landed in the county of 63

Caiçara do Norte, RN, Brazil. 64

Upon capture, the fish were packed in insulated boxes between layers of ice 65

for transport to the Food Microbiology Laboratory of the Department of Nutrition at 66

52

UFRN, and were then maintained at a temperature of ± 2ºC. The ice from each box 67

was replenished daily and the water from melting was drained. To ensure that the 68

quality of the samples was not compromised, a time limit of less than 30 h was 69

established between the capture and the start of the tests. 70

A first batch (n = 50 fish) was used for the preliminary QIM scheme step, 71

considered as the first ice storage assay. A second batch of 280 fish was used, of 72

which 80 fish were destined for the microbiological analyses and the remainder (n = 73

200) was used for the QIM scheme test stage (second storage test) and physico-74

chemical analyses. For the Calibration Curve of the QIM scheme, microbiological and 75

physico-chemical analyses were used 110 fish (third storage test). 76

77

2.3. Sensory analysis 78

2.3.1. Development of the Quality Index Method (QIM) 79

The QIM scheme for the flying fish (Hirundichthys affinis) was developed and 80

evaluated following guidelines for fish species described in Martinsdóttir, Sveinsdóttir, 81

Luten, Schelvis-Smit, & Hyldig (2001) and Hyldig, Bremner, Martinsdóttir, & Schelvis 82

(2012). The QIM scheme was developed using three storage trials for the flying fish. 83

A sensory panel of 20 individuals was recruited to undergo training for sensory 84

evaluation of fish products according to the International Standards Organization 85

(2012). The panelists were declared to be void of fish allergies and any impairment of 86

their visual acuity, color perception, ability to perceive odors and tactile ability. 87

Panelists were also declared void of symptoms or problems related to colds and 88

nasal congestion. The sensorial analyses were conducted in the laboratory at a 89

temperature of 20ºC and with adequate lighting. 90

To develop the preliminary QIM scheme, the first batch of flying fish stored on 91

ice was analyzed every 48 hours by 5 members of the sensory panel (1 man and 4 92

women), with the objective of establishing the sensorial descriptors through a total of 93

10 analytical sessions. Each sample was removed from ice storage and kept at room 94

temperature for 30 minutes before analyses, presented to the panel of judges on a 95

white tray and analyzed under laboratory conditions. Samples were discarded after 96

each analytical session. 97

From the sensory parameters described by the panelists, the panelist leader 98

produced a preliminary QIM scheme, assigning a score of zero to three demerit 99

53

points for each quality parameter. Scores close to zero represent better quality while 100

closer to three was lesser quality. 101

The QIM scheme test (second ice storage trial) was performed to confirm the 102

first observations, to perform revisions in the scheme and to train members of the 103

sensory panel to use the scheme. 104

For 19 days every 48 hours (days 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, and 19), the 105

sensory panel (n = 11 to 20 panelists) analyzed samples of flying fish stored on ice 106

using the preliminary QIM scheme, totaling 10 analytical sessions. Photographic 107

records of the sensory parameters of the flying fish were carried out during each time 108

of storage. 109

The final version of the QIM protocol was prepared by the leader with 110

consideration of the suggestions for improvements given by the panelists, and 111

according to the number of repetitions of each quality parameter description per day 112

of analysis. Only the descriptors that were used the most remained in the QIM 113

scheme. 114

For the QIM calibration curve, the fishs were stored on ice for different lengths 115

of time (days). In each analytical session, 5 fishs with distinct storage times were 116

presented under white-bottomed trays, previously coded with random three-digit 117

numbers, without indication of storage time, and evaluated individually by 3 panelists. 118

In a total of two analytical sessions, fish were stored on ice at 1, 4, 5, 8, 9, 10, 14, 16, 119

17 and 22 days. 120

121

2.3. Microbiological analyses 122

The Coliforms count at 45ºC/g was performed by the multiple tube technique 123

according to Kornacki & Johnson (2001), Salmonella sp/25g according to the 124

methodology described in the International Standards Organization (2002), analysis 125

of coagulase positive Staphylococcus/g by the direct counting method described in 126

Lancette & Bennett (2001), and total count of aerobic mesophilic and psychrotrophic 127

plaques as described in Morton (2001) and Cousin, Jay & Vasavada (2001), 128

respectively. 129

Microbiological analyses were carried out on 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 and 130

19 days of storage in the preliminary QIM test stage and on 1, 4, 5, 8, 9, 10, 14, 16, 131

54

17 and 22 days, during the calibration curve of the QIM scheme, using two samples, 132

each sample consisting of 4 specimens of flying fish (H.affinis) stored on ice. 133

134

2.4. Physicochemical analysis 135

During the ice storage of the flying fish, the ionic potential of the hydrogen (pH) 136

was measured using a digital pH meter (pH 21 HANNA, Brazil) equipped with a glass 137

electrode calibrated with buffer solutions 4 and 7 according to the methodology 138

described by the Adolfo Lutz Institute (2008). 139

Nitrogen from the Total Volatile Bases (TVB-N) and Trimethylamine (TMA-N) 140

were determined using steam drag method modified from Brazil (1981). Initially, 25g 141

of muscle from a flyingfish sample was homogenized with 75 mL of 5% trichloroacetic 142

acid solution for 1 minute in a mixer (Mixer 700 PHILCO, China) to obtain a 143

homogeneous mass. The homogenate was filtered through qualitative filter paper 144

until a clear extract was obtained. An aliquot of 5 mL of the extract was transferred to 145

a steam distillation apparatus and 5 mL of 2 M sodium hydroxide solution was added. 146

The filtrate was distilled and collected in an Erlenmeyer containing 5 mL of 0.01 N 147

hydrochloric acid solution and indicator (rosolic acid solution), to obtain about 15 mL 148

of the distillate. Excess acid was titrated with 0.01N sodium hydroxide solution until 149

pale pink coloration. 150

To determine the TMA-N, 1mL of 16% formaldehyde was added to each 10mL 151

of liquid in the Erlenmeyer from the TVB-N analysis, and titrated the released acid 152

with 0.01N sodium hydroxide solution to the same endpoint. 153

The results of the TVB-N and TMA-N analysis were expressed as mg N 100g-1 154

of the sample. The following equations were used to calculate these results. 155

156

157

158

159

At where: 160

75 = 5% solution of trichloroacetic acid in mL used to homogenize the sample. 161

A = water content in the sample expressed as mg / 100g. 162

V = volume of acid consumed in mL on titration with 0.01N sodium hydroxide solution 163

55

V' = volume of acid consumed in mL on titration with 0.01N sodium hydroxide 164

solution in the second titration 165

F = correction factor of 0.01N sodium hydroxide solution 166

N = normality of 0.01N sodium hydroxide solution 167

P = sample weight in grams 168

Va = volume of the aliquot in mL. 169

The water content of the fish muscle was approximately 80%. 170

These analyses were carried out in triplicate concomitant with the 171

microbiological analyses in the second and third storage trials, and two samples of 172

flying fish (as a pool of 4 fish per sample) were evaluated. 173

Thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) were determined in triplicate 174

by spectrophotometry as described by Vyncke (1970) on the days of the third ice 175

storage assay. 176

177

2.5. Statistical analysis 178

The means of the microbiological and physicochemical parameters were 179

compared using the analysis of variance (ANOVA). If significant differences were 180

found, means were compared using the Tukey test with p-value < 0.05. 181

Bacteriological data were expressed as log CFU / g. 182

The linear correlations of the microbiological, physicochemical and sensorial 183

data with the storage period were performed to obtain the correlation coefficient (r), 184

which was considered significant when p-value < 0.05. 185

Principal Component Analysis (PCA) was used to correlate data from the 186

sensory, microbiological and physicochemical analyses of both the second and third 187

storage tests, the QIM scheme test, and the calibration curve, respectively. 188

The data obtained in the QIM scheme were subjected to simple linear 189

regression analyses. The simple linear regression equation and the coefficient of 190

determination (R2) between the QI and the storage time on ice were calculated. 191

The Partial Least Squares (PLS) regression was used to determine the 192

uncertainty of predicting days on ice from the QI. The attributes of the QIM that most 193

positively or negatively influenced the QI were identified through the Importance of 194

Projection (VIP) variable. 195

56

All statistical analyses were performed by the XLSTAT program for Windows 196

(Adinsoft, Paris, France) and Microsoft Excel. 197

198

3. Results and discussion 199

3.1 Quality Score Method (QIM) 200

The final QIM scheme (Table 1) developed for whole flying fish (H. afinnis) 201

included 11 parameters, grouped into 3 quality attributes (general appearance, eyes, 202

and gills), with demerit scores ranging from 0 to 3 for each parameter. The total sum 203

of demerit points is called the Quality Index (QI) and the maximum score is 22 points. 204

The QI displayed a strong (r = 0.956), positive and significant (p <0.001) linear 205

correlation with storage time. This evolution can be expressed by the equation y = 206

0.9343x + 1.8968, whose determination coefficient was R2 = 0.9486 (Figure 1), 207

indicating this model as a strong and significant (p <0.001) predictor for IQ 208

assessment for any day of ice storage of the flying fish, within the range of days 209

studied (1 - 22 days). 210

The current scheme score lies between the maximum score of the schemes 211

reported previously for species such as the Mediterranean anchovy (Engraulis 212

encrasicholus), which recorded a maximum QI of 23 for 10 parameters grouped into 213

5 main attributes (Pons-Sánchez-Cascado, Vidal-Carou, Nunes, & Veciana-Nogués, 214

2006), carapeba (Eucinostomus gula) which recorded a maximum QI of 19, for 9 215

parameters grouped into 3 main attributes (Gonçalves & Soares, 2017) and turbot 216

(Scophthalmus maximus), which recorded a maximum QI of 20 for 9 parameters 217

grouped into 5 main attributes (Li et al., 2017). This reveals the sensorial differences 218

between species and reinforces the need for a specific sensory evaluation scheme 219

for each species. 220

The slope of the regression (0.934) was superior to those previously reported 221

for pelagic fish such as the herring (0.361 to 0.743) (Nielsen & Hyldig, 2004) and 222

inferior to the demersal acoupa weakfish (1.2284 to 1.5884) (Billar dos Santos, 223

Kushida, Viegas, & Lapa-Guimarães, 2014), with rejections estimated at 6.5 and 8 to 224

9 days, respectively. This affirms the general observation that small fish spoil faster 225

than large fish (Huss, 1995; Nielsen & Hyldig, 2004). 226

Changes occur during the storage of fish that are easily detectable and usually 227

measurable. This affirms that the vast majority of chemical, biochemical and 228

57

microbiological tests on fish products start at zero or a low value and increase with 229

temperature and storage period (Hyldig, Bremner, Martinsdóttir, & Schelvis, 2012). 230

Figure 2 shows the partial least squares (PLS) regression based on the mean 231

QI scores per storage day, which showed an error of approximately 1.4 days (MSE = 232

1.356) and a coefficient of determination (R² = 0.963) of the linear regression 233

between the QI and ice storage. The QI is suggested here to predict the storage time 234

to an accuracy of ± 1 day and a half, based on average scores of three samples 235

evaluated per day of storage. Figure 2 also shows that the opinion of the judges was 236

more dispersed on days 1, 5, and 16.These results are similar to the development of 237

the QIM for anchovy, Engraulis anchoita, which showed a margin of error of 1.044 238

days (Massa, Manca, & Yeannes, 2012), the bogue, Boops boops, with an error of 239

0.9535 days (Bogdanović, Šimat, Frka-Roić, & Marković, 2012) and for carapeba 240

(Eucinostomus gula) with an error of 1.8 days (Gonçalves and Soares, 2017). 241

The Variable Importance of Projection (VIP) values superior to 1.0 revealed 242

that the superficial mucus, the color of pupil and cornea (2.603, 1.164 and 1.057, 243

respectively) were the most relevant quality attributes to this QIM scheme for the 244

Hirundichthys affinis (Figure 3). 245

The evolution of the QI for individual quality parameters of the flying fish stored 246

on ice revealed that for the general appearance attribute, the skin color ranged from 247

dark blue and matte until the fifth day to an inconsistent dark blue and matte with 248

loose scales on the 14th day (Figure 4A). The QI for mucus started as zero until the 249

tenth day and reached its maximum value as it became viscous and beige on the 17th 250

day. The odor worsened from day 5 onwards while the texture / firmness started in 251

the middle of its scale and oscillated reflecting confusing criteria for the evaluators as 252

also did the abdomen (Figure 4A). Both of these parameters were not considered 253

relevant according to the VIP scores. 254

For the quality attribute of the eyes, the individual QI revealed that the cornea 255

scored zero on the first day of analysis and increased almost progressively until 256

reaching its maximum score on the 17th day when it became opaque, orange and 257

gold colored and presented black spots. The shape was convex during most of the 258

period but the lineation changed from defined to weak after the fifth day of ice 259

storage. The pupil color changed almost linearly from bright dark blue to an opaque 260

and milky light gray until day 9 when it reached a plateau (Figure 4B) 261

58

Similar to the eye parameters, the evolution of the gills quality parameters 262

seemed more evident than those of the general appearance. The color of the gills 263

changed from bright red/wine to light wine to brown after 5 days and reached a faded 264

red /brown color in the 10th day possibly due to the presence of oxyhemoglobin, 265

which was transformed into metamyoglobin (Lanzarin et al., 2016). The odor evolved 266

in steps and reached the intermediate value after 8 days as a strong, persistent acid 267

and dried seaweed odor and its maximum at the 16th day as very strong, persistent 268

acid and ammonia odor. The mucus followed the color and odor patterns and 269

reached the intermediary score, reddish and viscous after 9 days and remained close 270

to its maximum until the end (Figure 4C), similar to other studies Lanzarin et al. 271

(2016) e Borges, Conte-Junior, Franco, Mársico, & Freitas (2014) 272

Images of the sensory attributes of H. affinis on the 1st and 19th day of 273

storage can be observed in Figure 5. 274

275

3.2 Microbiological analysis 276

The total count of mesophilic aerobic bacteria showed a significant increase (p 277

= 0.009) with a strong and significant correlation (r = 0.705 and p < 0.001) ranging 278

from 3.20 log CFU/g on the first day to 5.61 log UFC/g on the 19th day of storage, 279

which can be explained by the equation y = 0.11191x + 3.0475 (R2 = 0.597) (Figure 280

6). A mesophilic count level above 7.0 log CFU / g in fresh fish is considered 281

unacceptable (ICMSF, 1986). In this study, this value was not reached during the 19 282

days of storage. 283

The total count of aerobic psychrotrophic bacteria showed a significant linear 284

increase (p < 0.001) with a strong and significant correlation (r = 0.934 and p 285

<0.0001) with storage time, ranging from 2.0 log CFU/g on the first day at 8.18 log 286

CFU/g on the 19th day of storage, which can be explained by the equation y = 287

0.3585x + 2.1933 (R2= 0.875) (Figure 6). 288

Since the growth of microorganisms is the main cause of fish quality 289

degradation, the total viable microorganisms count is considered as a monitoring 290

index of fish deterioration (Morsy et al., 2016). 291

Psychrotrophic species are dominant during storage of fish on ice (Nychas & 292

Drosinos, 2010) and mesophilic bacteria indicate whether cleaning, disinfection and 293

59

temperature control during industrial treatment, transport and storage processes 294

have been adequately performed (ICMSF, 1986). 295

The flesh of the newly caught fish is sterile because its immune system 296

prevents bacteria from growing in the flesh. After fish death there is a collapse of the 297

immune system, allowing the bacteria to proliferate and during storage, a part of the 298

bacteria present in the skin invade the flesh (Huss, 1995). This explains the low total 299

counts reported at the beginning of the storage period and the increase over time 300

(Figure 6). 301

Salmonella sp. was absent in all samples in contrast to other studies with 302

yellow hake (Cynoscion acoupa) stored on ice (Billar dos Santos, Kushida, Viegas, & 303

Lapa-Guimarães, 2014). 304

Staphylococcus coagulase positive was found in a sample (4.0x102 CFU/g - 305

9th day of storage), however, this value was under the limit established by the 306

Brazilian legislation that corresponds to 103 CFU/g (Brazil, 2001). In acoupa weakfish 307

(Cynoscion acoupa) preserved on ice, no positive coagulase Staphylococcus was 308

detected in any sample (Billar dos Santos, Kushida, Viegas, & Lapa-Guimarães, 309

2014). 310

The mean number of thermotolerant coliforms at 45°C remained < 3.0 MPN/g 311

during the storage period, except on day 9 of storage where a value of 3.6 MPN/g 312

was found. There is no established limit for Coliforms in fresh fish, however, values 313

ranging from 5 to 103 MPN/g are acceptable for fish products (Brazil, 2001). 314

315

3.3 Physicochemical analysis 316

The initial pH value of 6.23 increased linearly and was strongly and 317

significantly correlated (r = 0.847 and p < 0.001) with the ice storage period until the 318

maximum value of 6.88 on the 19th day (Figure 7). Previous studies with the pelagic 319

horse mackerel and the benthic tub gunard reported initial pH values of 6.38 and 320

6.25 that increased to 7.65 and 7.17 after 22 and 21 days on the ice, respectively 321

(Rodríguez, Losada, Aubourg, & Barros-Velázquez, 2005; Bekaert, 2006). 322

The pH of live fish is typically about 7.3 and falls through rigor mortis as 323

glycogen is converted to lactic acid through anaerobic processes, resulting in pH 324

levels close to 6.0. After the resolution of rigor mortis, the glycogen is replaced by 325

alkaline substances, such as ammonia and other volatile compounds from protein 326

60

degradation expressed as TVB-N and TMA-N, which increase the pH as deterioration 327

progresses (Huss, 1995; Rodríguez et al., 2005; Howgate, 2009; Gonçalves, Lima & 328

Paula, 2015; Ritter et al., 2016) (Figure 8). 329

This trend was also evident in this study. The levels of TVB-N and TMA-N 330

followed the pH path and increased almost linearly and significantly (p < 0.001 and p 331

< 0.001, respectively) from 25.19 (1st day) to 39.42 (19th day) and 6.58 (1st day) to 332

12.00(19th day) mg 100g-¹, respectively, which were strongly e significantly correlated 333

with the 19 day period (r = 0.923, p < 0,001 e r = 0.747, p < 0,001, respectively). 334

The adoption of TVB-N as a spoilage indicator is very controversial as its 335

values are affected by species, capture method, and analytical procedure. It is 336

observed that since the first days of storage, the flying fish has already presented 337

high values of TVB-N. This may indicate a particular feature of the species that may 338

be associated with the capture mode. 339

According to Relibein & Oehlenschlager (1982), the determination of TVB-N 340

reflects only advanced stages of deterioration and are generally considered 341

unreliable to evaluate deterioration during the first ten days of refrigerated cod 342

storage. 343

Another factor that may be related to high initial values is the practice of 344

artisanal catching of flying fish. Capture methods for marine fish are more stressful 345

and lead to worse maltreatment with onboard accommodation. In addition, N-TVB 346

values should be considered to depend on the method of analysis and not reflect the 347

mode of deterioration, whether bacterial or autolytic (Huss, 1995). 348

Throughout the long history of spoilage studies on fish, the pH, and the TVB-N 349

are the most common measurements of the muscle tissue. However, the great 350

variability of intrinsic pH and TVB-N between species, effects of biological conditions 351

and harvesting procedures and between fish within a batch, impede the efficacy of 352

these measures for spoilage (Howgate, 2009). 353

The results of the thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) analysis 354

ranged from 0.08 on the 1st day to 2.52 MA/kg on the 22nd day of ice storage. A study 355

about the effects of ozonated ice on sardines stored on ice for 22 days demonstrated 356

linear correlations between 0.84 and 0.95 between TBARS and storage time. 357

Damage to lipids measured by TBARS under different ice storage conditions ranged 358

from 0.57 - 0.65 to 2.12 - 2.66 mg malonic aldehyde/kg of sample at 2 and 19 days 359

61

storage, respectively (Losada, Barros-Velázquez, Gallardo, & Aubourg, 2004). A 360

study on the quality of sardines marketed as wholesale and free-trade recorded 361

TBARS values between 0.02 - 2.73 and 1.07 - 15.66 mg malonic aldehyde/kg for 362

fresh and frozen sardines, respectively (Pereira & Tenuta-Filho, 2005). 363

364

3.4 Correlation between sensory, microbiological and physicochemical analysis 365

In the Principal Component Analysis (PCA), two vectors were used to explain 366

93.12% of the variance and the first main component (PC1) explained 86.22%, while 367

the second main component (PC2) explained 6.90% of the variances quality 368

parameters. 369

Figure 9 shows that all vector lengths are similar, which means that their 370

importance for differentiating the samples was also similar. Thus, the parameters in 371

the order of importance of the vectors are days of storage (0.997), mean scores 372

(0.992), TVB-N (0.960), psychrotrophic (0.940), pH (0.910), TMA-N (0.889) and 373

mesophilic (0.795). Vectors that are close indicate parameters that are likely to be 374

significantly correlated linearly (p <0.009). The growth of mesophiles did not show 375

significant correlation with pH (p = 0.073). 376

The counting parameters of mesophilic bacteria and TMA-N were observed to 377

have little influence on the differentiation of the samples during the storage period. 378

The formation of groups of samples and the correlation of samples for different 379

storage times. Samples stored for 1, 3, 5, 7 and 9 days (observations 1, 2, 3, 4 and 380

5) were similar in relation to freshness. Samples stored for 10 and 15 days 381

(observations 6 and 8) were located in the PC1 and PC2 positive quadrants, while 382

the samples stored for 13, 17 and 19 days (observations 7, 9 and 10) were in the 383

PC1 positive quadrant and in the negative quadrant PC2. 384

As previously reported, the microbiological, physicochemical and sensorial 385

variables evaluated showed an increase over the storage period and, consequently, 386

the decrease of freshness. 387

In the Principal Components Analysis (PCA), observations 6, 7, 8, 9 and 10, 388

for 10, 13, 15, 17 and 19 days of ice storage, respectively, of the flying fish samples 389

were better represented with the high scores (Figure 9) and that the position of the 390

samples stored at 1, 3, 5, 7 and 9 days showed that this group consisted of samples 391

suitable for human consumption. 392

62

In Figure 10, the PCA performed with the calibration curve data from the QIM 393

scheme indicates that the observations 6, 7, 8, 9 and 10 (ice storage days 10, 14, 16, 394

17, 22) also showed high values, confirming that the flying fish exhibited more 395

deterioration after 10 days of storage during the third storage test. 396

As shown by the PCA (Figures 9 and 10), the samples stored up to the 9 days 397

on the ice were similar in freshness. 398

399

4. Conclusions 400

The QIM scheme for flying fish (Hirundichthys affinis) was obtained in this study and 401

is a reliable and practical tool to evaluate the freshness of this fish when stored on 402

ice. The QIM scheme established a maximum Quality Score of 22 demerit points, 403

with a strong and significant linear correlation with the storage time, making it 404

possible to predict how many days the fish is stored. The sensory parameters mucus, 405

pupil color, and cornea were considered relevant to the scheme. Based on the PCA 406

correlation of the studied variables, the shelf life of the flying fish stored on ice was 9 407

days 408

409

Acknowledgements: financial incentive aid resulting from the FAPERN/CAPES 410

006/2014 Notice - which provides for "Support for postgraduate programs of Higher 411

Education Institutions (HEIs) in the state of Rio Grande do Norte / Brazil" and 412

FAPERN / CAPES 013/2014 - which deals with the "Scholarship program of 413

academic formation - modality: masters and doctorate" 414

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Table 1. Quality Index scheme for the flying fish (Hirundichthys affinis) stored on ice.

Quality attributes

Parameters Description Score

General aspect

Skin Bright, iridescent dark blue; well adhered scales. 0

Bright, dark blue matte; scales less adhered and more apparent.

1

Non-uniform, matte blue, loose scales. 2

Mucus Aqueous, transparent, absent 0

Slightly viscous, light beige. 1

Odor Fresh fish, seaweedy 0

Fish, cucumber. 1

Fish filth, moldy dirty cloth. 2

Texture/ firmness

Firm 0

Firm, elastic, muscle recovers quickly after finger pressure

1

Less firm and less elastic, finger pressure mark dissappears slowly or remains.

2

Abdomen Firm 0

Elastic to soft 1

Very soft 2

Eyes Cornea Bright, translucent 0

Bright, silvery white and / or yellowish 1

Bright, gray, yellowish 2

Opaque, golden, orange, black spots 3

Form Convex, defined delineation of the cornea and pupil

0

Convex, pupil without delineation 1

More convex or flat, pupil without delineation 2

Color of pupil

Dark blue, bright, slightly translucent 0

Dark gray, blurry 1

Light gray, opaque, milky 2

Gills Color Bright red, wine 0

Wine, brownish 1

Faded red, light wine, faded brown. 2

Odor Strong, sea air, seaweedy, fresh fish 0

Strong, persistant, mild acid, dried seaweed 1

Very strong, persistent, strong acid, ammonia. 2

Mucus Transparent, slightly viscous, absent. 0

Reddish, slimy. 1

Reddish, very viscous. 2

Quality index (0 - 22)

70

Figure 1. Regression analysis for the flying fish (Hirundichthys affinis) between mean

Quality Index storage on ice for 22 days.

71

Figure 2. Partial least-squares (PLS) model of measured vs. predicted 22 demerit

points of the QIM scheme for the flying fish (Hirundichthys affinis) stored on ice for 22

days. Continuous lines represent 95% confidence limits of the regression.

Observations: 30 R

2: 0.963

Standard deviation: 1.205

MSE: 1.356

72

Figure 3. Variable Importance in the Projection (VIP) values of the Quality Index

Method parameters for flying fish (Hirundichthys affinis) stored on ice with 95%

confidence level.

73

Figure 4. Mean scores of each quality attribute parameter assessed for the flying fish

(Hirundichthys affinis) stored on ice for 22 days.

General aspect

Eyes

Gills

74

1 day

stored on ice

19 days

stored on ice

Figure 5. Changes in the selected quality attribute parameters (abdomen, eye, gills)

evaluated with the QIM scheme for the flying fish (Hirundichthys affinis) for the 1st

and 19th day of ice storage.

75

Figure 6. Total Mesophilic bacteria count (TMC) and psychrotrophic (TPC) bacteria

counts of the flying fish (Hirundichthys affinis) stored on ice during 19 days.

76

Figure 7. Regression analysis for the flying fish (Hirundichthys affinis) between mean

pH and storage time on ice for 19 days.

77

Figure 8. Mean total volatile basic nitrogen (TVB-N) and trimethylamine Nitrogen

(TMA-N) with regression analysis for the flying fish (Hirundichthys affinis) stored on

ice during 19 days.

78

Figure 9. Correlation loadings plots of the principal component analysis (PCA) of the

quality parameters assessed for the flying fish (Hirundichthys affinis) stored on ice for

19 days in storage trial 1. TVB-N = Total volatile basic nitrogen, TMA-N =

Trimethylamine, pH = hydrogen potential, obs1 = day 1, obs2 = day 3, obs3 = day 5,

obs4 = day 7, obs5 = day 9, obs6 = day 10, obs7 = day 13, obs8 = day 15, obs9 =

day 17, obs10 = day 19.

79

Figure 10. Correlation loadings plots of the principal component analysis (PCA) of the

quality parameters assessed for the flying fish (Hirundichthys affinis) stored on ice for

22 days in storage trial 3. TVB-N = Total volatile basic nitrogen, TMA-N =

Trimethylamine, pH = hydrogen potential, TBARS = Thiobarbituric acid reactive

substances. P1 = skin, P2 = general aspect - mucus, P3 = general aspect - odor, P4

= texture/firmness, P5 = abdomen, P6 = eyes - cornea, P7 = eyes - form, P8 = eyes

– color of pupil, P9 = gills - color, P10 = gills - odor, P11 = gills - mucus, obs1 = day

1, obs2 = day 4, obs3 = day 5, obs4 = day 8, obs5 = day 9, obs6 = day 10, obs7 =

day 14, obs8 = day 16, obs9 = day 17, obs10 = day 22.

80

7 CONSIDERAÇÕES FINAIS

Esta pesquisa fez parte de um grande projeto em parceria com a Escola

Agrícola de Jundiaí/UFRN, intitulado "Projeto voador: agregação de valor e renda ao

pescado em Caiçara do Norte".

Para a realização das análises foram encontradas algumas limitações:

falta de recursos financeiros para compra de gelo para o armazenamento dos peixes

e de alguns reagentes, bem como o atraso do recebimento dos materiais

necessários após a compra; também a dificuldade de comunicação com o pescador

de Caiçara do Norte para a captura dos peixes, a dependência de fatores naturais

para que tudo estivesse favorável para a pesca.

Com esta pesquisa foi possível a colaboração em três planos de Iniciação

Científica que resultaram em Trabalhos de Conclusão de Curso e um trabalho

selecionado para apresentação oral no Congresso de Iniciação Científica e

Tecnológica da UFRN (CICT 2017) e participação como co-orientadora.

Participação como ministrante nas ações de extensão intitulado II

Minicurso de Microbiologia de Alimentos: Normas de laboratório, preparo de meios

de cultura e interpretação de resultados e na Semana de estudos sobre a

Salmonella: Implantação de metodologia no Departamento de Nutrição da UFRN.

O recrutamento e os testes de seleção de julgadores sensoriais desta

pesquisa gerou um resumo intitulado “Selection of assessors to compose a trained

team for development of the fish Quality Index Method (QIM)” aprovado para

apresentação no 12º Simpósio Latino Americano de Ciência de Alimentos (SLACA).

81

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enterotoxins. In: Downes F, Ito K, editors. Compendium of Methods for the

Microbiological Examination of Foods. 4th ed. Washington, D. C.: American

Public Health Association; 2001. p. 387–403.

120. Morton R. Aerobic plate count. In: Compendium of Methods for the

Microbiological Examination of Foods. 2001.

121. Cousin M, Jay J, Vasavada P. Psychrotrophic microrganisms. In: Downes F, Ito

K, editors. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of

Foods. 4th ed. Washington, D. C.: American Public Health Association; 2001.

p. 159–66.

122. Instituto Adolfo Lutz. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. In: Métodos

físico-químicos para análise de alimentos. 4th ed. São Paulo; 2008. p. 104–5.

123. Brasil. Métodos analíticos oficiais para controle de produtos de origem animal

e seus ingredientes: Métodos Físico-Químicos. (LANARA). M da AP e AN de

DALN de RA, editor. Portaria No 01, de 07 de outubro de 1981. Brasília (DF):

Diário Oficial da União de 13 de outubro de 1981; 1981.

124. Vyncke W. Direct Determination of the Thiobarbituric Acid Value in

Trichloracetic Acid Extracts of Fish as a Measure of Oxidative Rancidity. Fette,

Seifen, Anstrichm. 1970;72(12):1084–7.

93

APÊNDICES

94

APÊNDICE 1 – Questionário para recrutamento de avaliadores.

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE


QUESTIONÁRIO PARA RECRUTAMENTO DE AVALIADORES

Nome: ________________________________________________________

Data de nascimento: ___/___/_____ Sexo: ( )F ( ) M

Endereço:___________________________________________________________

_____________________________________________________

Telefones: _______________________________

E-mail:__________________________________

1. Gostaria de participar de um treinamento de análise sensorial?

[ ]Sim [ ]Não

2. Quais os seus horários livres para a participação do treinamento?

___________________________________________________________________

_____________________________________________________

3. Gosta de peixe? [ ]Sim [ ]Não

4. Cite aromas que você desgosta muito.

____________________________________________________________

____________________________________________________________

5. Você é capaz de citar um alimento que possua brilho na superfície?

____________________________________________________________

6. Você tem algum problema de saúde que contra indique o contato (com as mãos

ou aroma) com pescado?

___________________________________________________________________

_____________________________________________________

7. Você possui alguma doença que prejudique sua acuidade visual, percepção de

cores e/ ou capacidade de perceber odores e/ ou capacidade tátil?

___________________________________________________________________

_____________________________________________________

95

8. Está tomando alguma medicação que poderia interferir sua capacidade de

perceber odores? Em caso positivo, explique, por favor.

___________________________________________________________________

___________________________________________________________________

9. Apresenta com frequência sintomas ou problemas relacionados à:

- Resfriados frequentes: [ ]Sim

- Dor de cabeça: [ ]Sim

- Congestão nasal: [ ]Sim

- Uso de medicamentos: [ ]Sim

10. Já realizou ou realiza algum curso e/ou treinamento sobre análise sensorial?

[ ]Sim [ ]Não

96

APÊNDICE 2 – Teste de reconhecimento de aromas




TESTE DE RECONHECIMENTO DE AROMAS

Data: ___/___/___.

Provador: __________________________________________________ Nº: ______

Você está recebendo amostras com aromas distintos. Aspire a primeira amostra.

Identifique o odor/aroma e registre na ficha. Aguarde alguns segundos para aspirar a

próxima ou realize o branco aspirando o braço ou a mão inodoros. Proceda dessa

forma para as amostras restantes. Faça aspirações curtas e sequenciais e evite

inalações profundas e longas.

Amostra Identificação/descrição do odor/aroma

Observações:________________________________________________________

___________________________________________________________________

Muito Obrigada!

97

APÊNDICE 3 – Teste de 100 matizes de Farnsworth Munsell




TESTE DE 100 MATIZES DE FARNSWORTH MUNSELL

Data: ___/___/___.

Julgador: __________________________________________________

Você está recebendo tubos apresentados em ordem aleatorizada e tem que ser

organizados a partir do amarelo, passando pelo verde até azul, a partir do vermelho,

passando pelo violeta até o azul e a partir do cinza claro para o escuro.

Ordem dos tubos (do amarelo ao azul)

Amostras

Tubo 1

Tubo 2

Tubo 3

Tubo 4

Tubo 5

Tubo 6

Tubo 7

Tubo 8

Tubo 9

Tubo 10

Tubo 11

Códigos

Ordem dos tubos (do vermelho ao azul)

Amostras

Tubo 1

Tubo 2

Tubo 3

Tubo 4

Tubo 5

Tubo 6

Tubo 7

Tubo 8

Tubo 9

Tubo 10

Tubo 11

Códigos

Ordem dos tubos (do cinza claro ao cinza escuro)

Amostras

Tubo 1

Tubo 2

Tubo 3

Tubo 4

Tubo 5

Tubo 6

Tubo 7

Tubo 8

Tubo 9

Tubo 10

Códigos

Muito Obrigada!

98

APÊNDICE 4 – Infográfico.

99

APÊNDICE 5 – Ficha de avaliação

Desenvolvimento do Método do Índice de Qualidade do peixe voador

(Hirundichthys affinis. Günther, 1866)

Julgador: Data: ___/____/ _______.

PARÂMETROS DE QUALIDADE DESCREVA COMO A AVALIAÇÃO DO FOI FEITA

DESCRITORES

ASPECTO/ TEXTURA

PELE

MUCO

CHEIRO (cheirar a zona dorsal)

TEXTURA/FIRMEZA (pressionar com o dedo, não com demasiada força, a parte dorsal; observar se o músculo recupera e a rapidez com que tal acontece)

100

ABDOMEN (apertar entre os dedos ou palpando levemente com a ponta dos dedos)

OLHOS (não toque nos olhos; se um olho estiver danificado, observe o outro)

CÓRNEA (avaliar a cor e a transparência)

FORMA (avaliar olhando diretamente ou de lado para o olho)

COR DA PUPILA (observar a pupila perpendicurlarmente)

GUELRAS COR

ODOR (levante os opérculos e cheire o arco branquial)

MUCO (avaliar cor e aspecto)

101

APÊNDICE 6 – Protocolo QIM preliminar.



Julgador: Data: ___/____/ _______.

PARÂMETROS DE QUALIDADE Descritores SCORE

ASPECTO PELE (observar a cor da região dorsal, lateral e abdominal. Passar o dedo em todo o corpo no sentido cabeça cauda e obervar as escamas)

Dorso: brilhante, úmido, azul escuro iridiscente; lateral: branco iridiscente; ventre: branco; escamas aderidas.

0

Dorso: brilhante, azul escuro fosco; lateral: branco iridiscente; ventre: branco com risco amarelado; escamas menos aderidas e mais aparentes no dorso.

1

Dorso: menos brilhante, azul não uniforme e fosco; lateral: branco com menos iridiscência; ventre: bege claro com risco amarelo queimado; escamas menos aderidas e mais aparentes no dorso.

2

Dorso: azul arroxeado não uniforme e fosco; lateral: branco e desbotado com menos iridiscência; ventre: amarelo queimado, levemente dourado; escamas soltas.

3

MUCO (observar, passar o dedo levemente e levantá-lo em todo o corpo)

Aquoso, transparente, ausente. 0

Levemente viscoso, transparente. 1

Levemente viscoso, escorregadio, transparente ou bege claro, com espuma. 2

CHEIRO (cheirar a zona dorsal)

Peixe fresco, maresia, algas na praia. 0

Acentuado, forte, residual, sargaço desidratado/seco. 1

Neutro, sargaço, praia, peixaria, peixe. 2

Peixaria suja, peixe que não está fresco, seção de peixe no supermercado, insosso, 3

102

frio

TEXTURA/FIRMEZA (pressionar com o dedo, não com demasiada força, no meio e próximo à cabeça na região dorsal; observar se o músculo recupera e a rapidez com que tal acontece)

No centro: firme, rígido, marca do dedo desaparece imediatamente; próximo à cabeça: elástico, marca do dedo desaparece imediatamente.

0

No centro: firme, rígido, marca do dedo desaparece imediatamente; próximo à cabeça: menos elástico, marca do dedo desaparece lentamente

1

No centro: firme, rígido, marca do dedo desaparece lentamente; próximo à cabeça: menos elástico, marca do dedo desaparece mais lentamente ou marca do dedo permanece

2

ABDOMEM (apertar entre os dedos ou palpando levemente com a ponta dos dedos no centro e próximo à cabeça)

No centro: firme; próximo à cabeça: elástico 0

No centro: pouco elástico, levemente distendido; próximo à cabeça: menos elástico. 1

No centro: flácido; próximo à cabeça: muito mole. 2

OLHOS (não toque nos olhos; se um olho estiver danificado, observe o outro)

CÓRNEA (observar a cor e a transparência perpendicularmente)

Brilhante, cinza prateado, translúcida. 0

Brilhante, branco prateado e/ou levemente amarelado, traço de sangue. 1

Brilhante, cinza, amarelado, dourado, alaranjado, partes opacas. 2

Sem brilho, cinza, dourado, alaranjado, partes opacas, manchas pretas, enegrecido na parte inferior.

3

FORMA (observar a forma frontal e perpendicularmente)

Convexo, delineamento definido da córnea e pupila. 0

Convexo, delineamento definido da córnea, pupila com perda de delineamento, formato de gota

1

Mais convexo, abaulamento, delineamento definido da córnea, pupila com perda de delineamento, formato de gota

2

Mais convexo, abaulamento, delineamento definido da córnea, pupila com perda de delineamento, formato de gota e com descolamento.

3

COR DA PUPILA Azul escuro, levemente translúcido, brilhante. 0

103

(observar a pupila perpendicularmente)

Cinza escuro, azul escuro esbranquiçado, leitoso, embaçado 1

Cinza, azul esbranquiçado, mais opaco, bem leitoso. Olho cego. Faixa azul acinzentada, preto fumê, preto opaco ao redor da pupila. Esfera branca, mais claro no centro.

2

Cinza azulado, esbranquiçada, dourado. Faixa azul acinzentada ao redor. Fenda/ marca transparente no centro.

3

GUELRAS COR (levantar o opérculo e observar a cor)

Vermelho, vinho, brilhante 0

Vermelho, vinho, amarronzado, marrom desbotado, amarelado nas pontas. 1

Vermelho desbotado, rosa claro, vinho claro, marrom amarelado, amarronzado nas pontas, vermelho pálido no interior.

2

ODOR (levante os opérculos e cheire o arco branquial)

Forte, maresia, algas, sargaço, peixe fresco, ferro 0

Forte, persistente, leve ácido, sargaço desidratando, escamas ressecadas. 1

Forte, persistente, ácido, praia cheia de sargaço ressecado, de podre 2

Muito forte, persistente, muito ácido, amoníaco. 3

MUCO (observar a cor e aspecto)

Transparente, líquido, pouco aparente, ausente, nenhum. 0

Transparente, levemente viscoso. 1

Marrom claro, amarelado, avermelhado, viscoso, camada gelatinosa. 2

Rosa, muito viscoso, muito muco formando liga entre as brânquias, muco unindo as brânquias.

3

ÍNDICE DE QUALIDADE (0 - 29)

104

APÊNDICE 7 – Esquema QIM final.



CÓDIGO DA AMOSTRA: Data: ___/____/____. Atributos de qualidade

Parâmetros Descritores Score

Aspecto geral

Pele Brilhante, azul escuro iridescente; escamas aderidas.

0

Brilhante, azul escuro fosco; escamas menos aderidas e mais aparentes.

1

Azul não uniforme e fosco, escamas soltas. 2

Muco Aquoso, transparente, ausente 0

Levemente viscoso, bege claro. 1

Cheiro Peixe fresco, maresia. 0

Peixe, pepino. 1

Peixaria suja, pano sujo molhado. 2

Textura/ firmeza

Rígido 0

Firme, elástico, marca do dedo desaparece imediatamente.

1

Menos firme e menos elástico, marca do dedo desaparece lentamente ou permanece.

2

Abdômen Firme. 0

Não muito firme. 1

Mole. 2

Olhos Córnea Brilhante, translúcida. 0

Brilhante, branco prateado e/ou amarelado. 1

Brilhante, cinza, amarelado. 2

Opaco, dourado, alaranjado, manchas pretas. 3

Forma Convexo, delineamento definido da córnea e pupila.

0

Convexo, pupila com perda de delineamento. 1

Mais convexo ou plano, pupila com perda de delineamento.

2

Cor da pupila

Azul escuro, levemente translúcido, brilhante. 0

Cinza escuro, embaçado. 1

Cinza claro, opaco, leitoso. 2

Guelras Cor Vermelho, vinho, brilhante. 0

Vinho, amarronzado. 1

Vermelho desbotado, vinho claro, marrom desbotado.

2

Odor Forte, maresia, algas, sargaço, peixe fresco. 0

Forte, persistente, leve ácido, sargaço ressecado.. 1

Muito forte, persistente, muito ácido, amoníaco. 2

105

Muco Transparente, levemente viscoso, ausente. 0

Avermelhado, viscoso. 1

Avermelhado, muito viscoso. 2

Índice de Qualidade (0 - 22)

106

ANEXOS

107

ANEXO 1 – Parecer do Comitê de Ética.

108

109

110

111

112

ANEXO 2 – Material utilizado para preparo das soluções estoque para o Teste de

Reconhecimento de Aromas.

.

Odor Material Quantidade Diluente

(100ml)

Tempero de

Peixe

Tempero oriental (Hondashi) 1g Água

destilada

Canela Canela-da-china em casca (General

Mills Brasil Alimentos Ltda.)

1g Etanol 99,8%

Manjericão Folhas de manjericão fresco 1g Etanol 99,8%

Menta/Hortelã Essência de menta (Cod. 1640) 5 gotas Etanol 99,8%

Cravo Essência de cravo (Cod. 1640) 5 gotas Etanol 99,8%

Limão Essência de limão (Essência e Arte) 5 gotas Etanol 99,8%

Morango Cobertura para sorvete de Morango

(Sterbom)

1g Água

destilada

Alecrim Folhas de alecrim fresco 1g Etanol 99,8%

Alho Dentes de alho in natura triturado 1g Etanol 99,8%

Cebola Cebola in natura triturada 1g Etanol 99,8%

Baunilha Aroma artificial de baunilha

(água, álcool etílico, corante

caramelo, aroma artificial de

baunilha)

1g Etanol 99,8%

Orégano Orégano desidratado (Hikari) 1g Etanol 99,8%

Vinagre Vinagre 1g Etanol 99,8%

Maracujá Essência de Maracujá (Essência e

Arte - Propylane Glycol)

5 gotas Etanol 99,8%

Floral/Lírio Essência de floral (Essência e Arte) 5 gotas Etanol 99,8%

113

ANEXO 3 – Volumes da solução-estoque (solução colorida) diluída em 10 mL no primeiro quadro e Quantidade da mistura-estoque

a ser misturada com amido de milho branco no segundo quadro.

Valores em mililitros.

Volume da solução-estoque colorida

Amostra N°.

Tubo 1

Tubo 2

Tubo 3

Tubo 4

Tubo 5

Tubo 6

Tubo 7

Tubo 8

Tubo 9

Tubo 10

Tubo 11

Amarelo ou vermelho

2,5

2,35 2,15 1,9 1,65 1,25 0,7 0,35 0,15 0,05 0

Azul 0 0,15 0,35 0,6 0,85 1,25 1,8 2,15 2,35 2,45 2,5

NOTA: verde = amarelo + azul; violeta = vermelho + azul

Valores em grama.

Substância Amostra N°.

Tubo 1

Tubo 2

Tubo 3

Tubo 4

Tubo 5

Tubo 6

Tubo 7

Tubo 8

Tubo 9

Tubo 10

Amido de milho 1,99 1,97 1,95 1,93 1,91 1,89 1,87 1,85 1,83 1,81

Mistura-estoque grafite/ amido de milho

0,01 0,03 0,05 0,07 0,09 0,11 0,13 0,15 0,17 0,19

Documents

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE …€¦ · O peixe voador é um dos recursos disponíveis de importância econômica e social para países como a Filipinas, Indonésia,