UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE INSTITUTO … · 1.1 NEUROGÊNESE NO CÓRTEX CEREBRAL Em mamíferos, a disposição funcional do córtex com suas seis camadas de discreta

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

INSTITUTO DO CÉREBRO

PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROCIÊNCIAS

EFEITOS DA SINALIZAÇÃO VIA CREB SOBRE A SOBREVIVÊNCIA E

DIFERENCIAÇÃO NEURONAL

THEMIS TAYNAH DA SILVA SANTANA

NATAL/RN

2012




Dissertação de mestrado apresentada

ao Programa de Pós-graduação em

Neurociências da Universidade Federal

do Rio Grande do Norte como requisito

para obtenção do título de Mestre em

Neurociências.

ORIENTADOR: PROF. DR. MARCOS ROMUALDO COSTA

NATAL/RN

2012

Catalogação da Publicação na Fonte Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN

Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Instituto do Cérebro

S231e Santana, Themis Taynah da Silva.

. Efeitos da sinalização Via Creb sobre a

sobrevivência e diferenciação neuronal / Themis Taynah da Silva Santana. - Natal, 2012. 91f: il.

Dissertação (Mestrado em Ciências, Área de concentração: Neurociências). Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Orientador: Profº. Dr. Marcos R. Costa.

.

1. Neurociências - Dissertação. 2. Córtex cerebral. 3. CREB. 4. Diferenciação dentrítica. I. Título

RN/UF/BSET/ICe CDU

612.8 RN/UF/BSET/ICE

CDU 612.8




Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em

Neurociências da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para

obtenção do título de Mestre em Neurociências.

Aprovada em: 21/09/2012.

À Aline, por todo apoio, paciência

e companheirismo durante esses dois

anos, suportando os altos e baixos e os

acontecimentos inesperados.

À minha família, minha bússola,

meu Norte; onde sempre posso ancorar

e buscar suporte, compreensão.

Em especial, meu agradecimento

ao meu Professor Orientador, Marcos

Costa, pela confiança, imensa simpatia e

paciência que tornaram a execução

desse trabalho muito mais agradável.

AGRADECIMENTOS

Primeiramente, a Deus, com o salmo que minha avó me ensinou - “O Senhor é o

meu pastor e nada me faltará.” (Salmo 23).

À minha mãe, pelo esforço contínuo em me proporcionar o melhor, incluindo a

melhor educação, que me ajudou a chegar até aqui.

Ao meu avô Doca que sempre sonhou me ver formada. Aqui estou eu, já no

mestrado!

As minhas companheiras de laboratório, em especial Jéssica Alves e Bruna

Landeira, pela ajuda nos experimentos e pelo apoio nos momentos mais complexos!

E à Sylvia Pinheiro pela enorme ajuda nas análises da vídeo-microscopia.

À professora Magdalena Götz, por abrir as portas de seu laboratório na

Alemanha.

À professora Luciana da Matta, por ter aceitado participar da minha banca de

defesa e pelos mais tantos conhecimentos compartilhados enquanto minha

orientadora na iniciação científica.

Ao professor João Menezes, também por aceitar fazer parte da minha banca.

Obrigada pela disponibilidade.

8

Pensar sobre o cérebro já é uma espécie de

enigma, porque você só pode pensar sobre

seu cérebro usando o seu cérebro. (...)

Parece, então, que estamos presos em um

paradoxo lógico de um sistema de auto-

referência, e nesse caso, de um sistema

obsecado por si mesmo. Talvez a única

conclusão confiável desse experimento de

pensamento seja de que o cérebro é muito

cheio de si.

Michael O’Shea

9

RESUMO

O desenvolvimento cortical requer um minucioso processo de

proliferação, migração, sobrevivência e diferenciação celular para que se

possa alcançar a elaboração de uma rede neuronal funcional. Diferentes

kinases, tais quais a PKA, CaMKII, MAPK e PI3K, fosforilam o fator de

transcrição CREB, ativando-o, e induzindo em ultima instância a expressão

de genes CREB-dependentes. A fim de identificar o envolvimento de tais vias

de sinalização mediadas por CREB sobre a diferenciação e sobrevivência

neuronal, experimentos in vitro de cultura celular foram conduzidos fazendo-

se uso de fármacos bloqueadores das kinases e de técnicas genéticas para

expressar diferentes formas do CREB (A-CREB e CREB-FY) em neurônios

corticais. A inibição da PKA e da CAMKII diminuiu o comprimento dos

neuritos; enquanto a inibição da MAPK não afetou o comprimento, mas

aumentou o numero de neuritos. O bloqueio da PI3K não pareceu alterar a

morfologia neuronal, nem o tamanho do soma foi afetado pelo bloqueio

dessas kinases. A ativação de CREB (CREB-FY) na presença de

bloqueadores da MAPK e PI3K teve um efeito negativo sobre o crescimento

neurítico e a expressão do A-CREB provocou uma redução significativa da

sobrevivência neuronal a partir de 60h in vitro e revelou similaridades quanto

à morfologia neuronal observadas com o bloqueio da PKA e CaMKII. Em

suma, a sinalização mediada por CREB influi na morfologia de neurônios

corticais, principalmente quando fosforilado pela PKA, e o bloqueio da

sinalização via CREB interfere na sobrevivência neuronal mesmo antes do

aparecimento de atividade sináptica. Nossos resultados contribuem para o

entendimento da sinalização por CREB, ativado por diferentes vias, sobre a

sobrevivência e diferenciação neuronal, podendo ser de grande valia na

elaboração de estratégias regenerativas em diferentes doenças neurológicas.

Palavras chave: Córtex, CREB, vias de sinalização, diferenciação dendrítica, sobrevivência

neuronal.

10

ABSTRACT

The cortical development requires a precise process of proliferation, migration,

survival and differentiation of newly formed neurons to finally achieve the

development of a functional network. Different kinases, such as PKA, CaMKII, MAPK

and PI3K, phosphorylate the transcription factors CREB, and thus activate it,

inducing CREB-dependent gene expression. In order to identify the involvement of

such signaling pathways mediated by CREB over neuronal differentiation and

survival, in vitro experiments of cell culture were conducted using pharmacological

kinase inhibitors and genetic techniques to express different forms of CREB (A-

CREB and CREB-FY) in cortical neurons. Inhibition of PKA and CaMKII decreased

the length of neuronal processes (neurites); whereas inhibition of MAPK did not

affect the length, but increased the number of neurites. Blockade of PI3K do not

appear to alter neuronal morphology, nor the soma size changed with the kinase

blockades. CREB activation (CREB-FY) along with MAPK and PI3K blockades

presented a negative side effect over neuritic growth and the expression of A-CREB

leaded to a significant decrease in neuronal survival after 60h in vitro and mimicked

some of the effects on neuronal morphology observed with PKA and CaMKII

blockade. In summary the signaling through CREB influences the morphology of

cortical neurons, particularly when phosphorylated by PKA, and CREB signaling is

also important for survival of immature neurons prior to the establishment of fully

functional synaptic contacts. Our data contribute to understanding the role of CREB

signaling, activated by different routes, on survival and neuronal differentiation and

may be valuable in the development of regenerative strategies in different

neurological diseases. Keywords: Cortex, CREB, signaling pathways, dendrite differentiation,

neuronal survival.

11

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 Histogênese no córtex cerebral .................................................... 17 Figura 2 Estudos de Birthdating demonstram o padrão “de dentro para

fora” da histogênese do córtex cerebral ....................................... 18

Figura 3 CREB ativa a proteína anti-apoptótica Bcl-2 ................................ 27 Figura 4 Organização anatômica do córtex embrionário de camundongo 35

Figura 5 Traçado dos neuritos ................................................................... 42 Figura 6 Neurônio expressando a proteína fluorescente verde (GFP) ...... 43 Figura 7 Análise morfológica de neurônios tratados farmacologicamente

com os inibidores da PKA (H-89) e da CaMKII (KN-62) .............. 46 Figura 8 Análise morfológica de neurônios tratados farmacologicamente

com os inibidores da MAPK (U0126) e da PI3K (Wort) ................ 47 Figura 9 Tamanho do soma de neurônios corticais tratados

farmacologicamente com os bloqueadores de kinases ................ 48 Figura 10 Neurônios GFP-positivos .............................................................. 49 Figura 11 Comprimento médio de cada neurito (µm) ................................... 50 Figura 12 Soma dos comprimentos dos neuritos (µm).................................. 51 Figura 13 Comprimento do neurito mais longo (µm) .................................... 53 Figura 14 Número total de neuritos por neurônio: Primários e Ramos ....... 55 Figura 15 Número de bifurcações por neurônio ........................................... 56 Figura 16 Número de bifurcações por neurito .............................................. 57 Figura 17 Taxa de sobrevivência neuronal (%) ............................................ 58 Figura 18 Densidade de neurônios em cultura ............................................. 59

12

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Exemplo de tabela gerada pelo programa ImageJ a partir do traçado dos neuritos .................................................................

42

13

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

Bcl-2 B-cell lymphoma 2

BDNF Brain Derived Growth Factor

BrdU 5‟-Bromo-2‟-deoxiuridina

BZIP Basic leucine zíper

CaMKs Proteína Kinase Cálcio/Calmodulina-dependente

CBP CREB-Binding Protein

Cm Centímetros

CP Placa Cortical

CRE cAMP response element

CREB cAMP Responsive Element Binding Protein

DEMEN Dulbecco's Modified Eagle Medium

DIV Dias in vitro

DMSO Dimetilsulfóxido

EGF Epidermal Growth Factor

ERK Extracellular signal-Regulated Kinase

FGF Fibroblast Growth Factor

G Grama

GFP Green Fluorescent Protein

HBSS Hank’s Balanced Salt Solution

HDACs Histone deacetilases

IEGs Immediate-Early-Response Genes

IRES Internal Ribossomal Entry Site

KCl Cloreto de Potássio

Km Constante de Michaelis

MAP2 Microtubule-Associated Protein 2

MAPK Mitogen-Activated Protein Kinase

Min Minuto

Ml Mililitro

mM Milimolar

MTs Microtúbulos

14

MZ Zona Marginal

NGF Nerve Growth Factor

NT-4 Neurotrofina-4

PBS Phosphate Buffered Saline

PC Placa cortical

pCMV Packaging plasmid

PDL Poli-D-lisina

PSD Densidade pós-sináptica

PVE Epitélio pseudoestratificado

pVSVG Pseudotyping plasmid

RSK-6 Ribosomal s6 kinase

Ser133 Serina 133

VGCC Voltage Gated Calcium Channel

Wort Wortmannin

ZSV Zona subventricular

ZV Zona ventricular

l Microlitro

15

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ........................................................................................ 16 1.1 NEUROGÊNESE NO CÓRTEX CEREBRAL .......................................... 16 1.2 SOBREVIVÊNCIA E DIFERENCIAÇÃO NEURONAL ............................ 19 1.3 PAPEL DO CREB NA SOBREVIVÊNCIA E DIFERENCIAÇÃO

NEURONAL ............................................................................................ 24 1.4 CREB, PLASTICIDADE E DOENÇAS NEUROLÓGICAS .................... 28

2 OBJETIVOS ............................................................................................ 32 2.1 GERAL .................................................................................................... 32 2.2 ESPECÍFICOS ........................................................................................ 32 3 METODOLOGIA ..................................................................................... 33 3.1 ANIMAIS ................................................................................................. 33 3.2 PLASMÍDEOS E VETORES RETROVIRAIS .......................................... 33 3.2.1 Dominante negativo do CREB .............................................................. 34 3.2.2 Forma constitutivamente ativa do CREB ............................................ 34 3.3 CULTURA DE CÉLULAS ........................................................................ 34 3.4 ENSAIOS FARMACOLÓGICOS ............................................................. 36 3.5 INFECÇÃO VIRAL ................................................................................... 36 3.6 IMUNOCITOQUÍMICA ............................................................................. 37 3.7 ANÁLISE MORFOLÓGICA ..................................................................... 37 3.8 ANÁLISE DA SOBREVIVÊNCIA - VÍDEO-MICROSCOPIA .................... 38 3.9 DENSIDADE DE CÉLULAS NEURONAIS .............................................. 40 3.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA ......................................................................... 40 4 RESULTADOS ....................................................................................... 41 4.1 CULTURAS CELULARES 41 4.1.1 Cultura de neurônios corticais diferenciados a partir de

neurosferas 41 4.1.2 Cultura primária de neurônios corticais 43 4.2 ANÁLISE MORFOLÓGICA 44 4.2.1 Manipulações farmacológicas – Cultura de neurônios corticais

diferenciados a partir de neurosferas 44 4.2.1.1 Tamanho do Soma Neuronal 47 4.2.2 Manipulações farmacológicas e genéticas – Culturas primárias de

neurônios corticais 48 4.2.2.1 Comprimento dos neuritos 50 4.2.2.2 Soma dos comprimentos dos neuritos 51 4.2.2.3 Neurito mais longo 52 4.2.2.4 Número total de neuritos (Primários x Ramos) 53 4.2.2.5 Número de bifurcações por neurônio 56 4.2.2.6 Número de bifurcações por neurito 57 4.3 ANÁLISE DA SOBREVIVÊNCIA, VÍDEO-MICROSCOPIA 58 4.4 DENSIDADE DE CÉLULAS NEURONAIS 59 5 DISCUSSÃO 60 6 CONCLUSÕES ....................................................................................... 67 REFERÊNCIAS ................................................................................................... 69

Introdução 16

1 INTRODUÇÃO

1.1 NEUROGÊNESE NO CÓRTEX CEREBRAL

Em mamíferos, a disposição funcional do córtex com suas seis camadas de

discreta compartimentalização e áreas especializadas por conectividades e

composição celular particulares constitui o quadro no qual uma elaborada

computação é implementada. Entender o desenvolvimento cortical continua a ser um

desafio essencial para a compreensão do sistema nervoso. Além disso, a disfunção

do córtex é a raiz de inúmeros distúrbios neurológicos, enfatizando a importância da

pesquisa nesta área.

A formação do córtex cerebral depende da geração e diferenciação

adequadas de diferentes tipos de neurônios, além das células macrogliais (astrócitos

e oligodendrócitos). Durante o desenvolvimento embrionário, as células

neuroepiteliais do epitélio pseudoestratificado (PVE), que formam a parede do tubo

neural, apresentam uma intensa atividade proliferativa, responsável pelo

crescimento longitudinal e transversal deste tubo. Estas células também são

responsáveis pela geração dos progenitores que compõem a zona ventricular

(BOULDER COMMITTEE, 1970) e, subsequentemente, a zona subventricular

telencefálicas (BOULDER COMMITTEE, 1970; SMART, 1973; TAKAHASHI et al.,

1995; NOCTOR et al., 2004). A zona ventricular e subventricular do telencéfalo

dorsal de roedores são consideradas as principais fontes de neurônios de projeção

corticais (PARNAVELAS, 2000), enquanto os neurônios não-piramidais

GABAérgicos parecem ser gerados quase exclusivamente no telencéfalo ventral

(MARIN; RUBENSTEIN, 2001).

De forma geral e resumida, a histogênese no córtex cerebral ocorre em 3

estágios. No primeiro, a parede do córtex cerebral é constituída apenas por células

progenitoras que ocupam a zona ventricular (VZ). No próximo estágio, os primeiros

neurônios a saírem do ciclo celular, se acumulam na pré-placa, adjacente à

superfície pial. Os neurônios da pré-placa podem ser divididos em células Cajal-

Retzius, mais superficiais, e nas células da subplaca. No próximo estágio da

histogênese cortical, os neurônios recém- gerados (Figura 1, vermelho) migram

através das fibras da glia radial para formar uma camada entre as células Cajal-

Introdução 17

Retzius e a subplaca. Essa camada é chamada de placa cortical, e a maioria dos

neurônios no córtex cerebral se acumulam nessa camada (MARIN-PADILLA, 1978,

1998).

Figura 1. Histogênese no córtex cerebral. Nas fases mais precoces do desenvolvimento cortical, os

neuritos das células progenitoras abrangem toda a espessura do córtex (VZ, Zona Ventricular). Os

neurônios recém-gerados (vermelho) migram ao longo das fibras de glia radial para formar uma

camada entre as células de Cajal-Retzius e a subplaca. Essa camada é chamada de placa cortical, e

a maioria dos neurônios do córtex cerebral se acumula nessa camada, o que resulta no aumento

significativo na espessura cortical. (Modificada de SANES; REH; HARRIS, 2006).

Nos roedores, a neurogênese cortical dura cerca de uma semana: do dia

embrionário 11.5 (sendo E0 o dia embrionário zero) ao 17.5, no caso dos

camundongos (BAYER; ALTMAN, 1991; CAVINESS et al.,1995; TAKAHASHI et al.,

1995, MIYAMA et al., 1997; NOWAKOWSKI et al., 2002). As diferentes classes

neuronais das lâminas corticais surgem pela sobreposição das camadas VI a II "de

dentro para fora" (Inside-out) (Figura 2). Assim, a histogênese cortical é

caracterizada pelo aparecimento gradual dessas camadas dentro da placa cortical, à

medida que um número crescente de neurônios recém-gerados migra da zona

Introdução 18

ventricular para dentro da placa cortical, povoando zonas progressivamente mais

periféricas, ao mesmo tempo em que os neurônios gerados anteriormente estão

diferenciando.

Figura 2: Estudos de Birthdating demonstram o padrão “de dentro para fora” da histogênese

do córtex cerebral. Ratas grávidas recebem injeções de 3H-timidina em estágios progressivamente

tardios da gestação. Quando os filhotes nascem, sobrevivem até a maturidade e depois têm seus

cérebros processados a fim de revelar as células marcadas. Neurônios que se tornaram pós-mitóticos

no dia embrionário 11 encontram-se primariamente na subplaca (agora na substância branca

subcortical), enquanto neurônios “nascidos” em E13 encontram-se em camadas corticais mais

profundas, isto é, V e VI; e neurônios gerados em E15 são encontrados em camadas corticais mais

superficiais, ou seja, IV, III e II. A camada mais superficial, camada I, contém apenas remanescentes

de neurônios da pré-placa (não mostrados). (Modificada de ANGEVINE; SIDMAN, 1961).

Introdução 19

Portanto, neurônios gerados mais tardiamente migram através daqueles gerados

mais cedo, se instalando em camadas mais superficiais. Esse é o resultado do

desenvolvimento “de dentro para fora” das camadas corticais (ANGEVINE; SIDMAN,

1961).

1.2 SOBREVIVÊNCIA E DIFERENCIAÇÃO NEURONAL

A diferenciação do sistema nervoso é acompanhada por um crescimento

notório: o corpo celular e os dendritos neuronais expandem, células gliais e mielina

surgem, os vasos sanguíneos arborizam e matriz extracelular é secretada. Mesmo

após o término do período de neurogênese, o cérebro humano continua a aumentar

de tamanho, de 400 gramas ao nascimento para 1400 gramas quando adulto

(DEKABAN; SADOWSKY, 1978). Surpreendentemente, esse período de

neurogênese e crescimento coincide com uma enorme perda de neurônios e glia,

ambos morrendo de “causas naturais”. Dependendo da região cerebral, 20 a 80%

das células diferenciadas degeneram durante o desenvolvimento (OPPENHEIM,

1991; OPPENHEIM; JOHNSON, 2003). Enquanto que, por um lado, a morte celular

integra um mecanismo valioso que faz parte do desenvolvimento, em outros casos

ela não acontece como um processo natural; é o caso quando ela ocorre em

decorrência de danos ou insultos, a exemplo do Acidente Vascular isquêmico.

A sobrevivência ou não de um neurônio depende de muitos fatores. Fatores

tróficos solúveis na matriz extracelular podem ser fornecidos por alvos pós-

sinápticos, por nervos vizinhos e células gliais ou pelo sistema circulatório. Os

neurônios também são dependentes de contatos sinápticos e a deaferentação leva à

atrofia ou morte. Esses sinais diversos são referidos como „fatores tróficos‟. Embora

seja impraticável contar o número total de neurônios em qualquer área de córtex

cerebral, estima-se que 20 a 50% dos neurônios pós-migratórios são eliminados,

dependendo da região do córtex (FINLAY; SLATTERY, 1983; MILLER, 1995).

Sabe-se que a sobrevivência neuronal depende claramente da presença de

tecidos alvos. A simples hipótese é que as células alvo secretam substâncias

químicas que os neurônios pré-sinápticos necessitam para sua sobrevivência

(HAMBURGER, 1934). Embora o NGF (Nerve Growth Factor) seja apenas a ponta

de um enorme iceberg de fatores de crescimento e de sobrevivência, tem sido

apontado como um dos principais exercendo tal papel. Um anticorpo anti-NGF,

Introdução 20

injetado em roedores neonatais, leva à perda de praticamente todos os neurônios

simpáticos (LEVI-MONTALCINI; BOOKER, 1960). Desde que sua sequência de

aminoácidos foi determinada como similar a do NGF (TURNER et al., 1982;

LEIBROCK et al., 1989), o BDNF (Brain Derived Growth Factor), juntamente com

outras neurotrofinas (também chamadas factores neurotróficos, as neurotrofinas são

uma família de proteínas que favorecem a sobrevivência dos neurônios), também

tem demonstrado agir sobre a sobrevivência de populações específicas de

neurônios, até mesmo antes do axônio alcançar seu alvo (FARINAS et al, 1996).

Uma função crítica dos axônios durante o desenvolvimento é a detecção de sinais

no meio extracelular e sua transdução em mudanças na expressão gênica (HAASE

et al., 2002; PATEL et al., 2003; ZWEIFEL; KURUVILLA; GINTY, 2005; HODGE et

al., 2007). Durante o desenvolvimento, os cones de crescimento detectam NGF

sintetizado por células alvo, resultando na geração de um sinal retrógrado que é

convertido para o soma e que, em retorno, promove a sobrevivência neuronal

(HOWE; MOBLEY, 2005).

A via da PI3K-Akt (phosphatidylinositol 3-kinase/Akt) proporciona um sinal

intracelular crucial para manter os neurônios dependentes de NGF vivos (XIA et al.,

1995). O bloqueio específico tanto da PI3K quanto de Akt mata culturas primárias de

neurônios simpáticos mesmo na presença de NGF, enquanto que a ativação

constitutiva de qualquer uma das duas kinases mantém os neurônios vivos mesmo

na ausência de NGF (CROWDER; FREEMAN, 1998). Além disso, o NGF promove

a sobrevivência de células PC12, o que é acompanhado pela ativação de diversas

MAPKs (Mitogen-Activated Protein Kinases). Dentro de 6 horas da retirada de NGF,

as células PC12 começam a morrer em grande quantidade (XIA et al., 1995). Outra

kinase, a RSK (Ribosomal S6 Kinase), fosforila e inativa uma das proteínas

regulatórias pro-apoptóticas da família da Bcl-2 (B-cell lymphoma 2) (KURADA;

WHITE. 1998), também influindo na sobrevivência neuronal.

Além da sobrevivência neuronal, um dos aspectos mais importantes no

estudo da formação do sistema nervoso central (SNC) é o desenvolvimento da

microarquitetura neuronal. Desde as primeiras observações no início do século XIX,

por Camillo Golgi, os neurônios têm sido morfologicamente definidos por três

compartimentos: I. Soma ou corpo celular; II. Axônio, um prolongamento único e,

geralmente, longo partindo do soma; e III. Dendrito, um prolongamento que também

http://www.anotacoes.org/como-criar-um-blog/

Introdução 21

parte do corpo celular e se ramifica gerando uma estrutura altamente complexa em

forma de árvore (GOLGI, 1873). A partir do método de coloração desenvolvido por

Golgi foi possível refinar o estudo da arquitetura neuronal a um nível de

detalhamento surpreendente, descrevendo os dendritos como estruturas de

recepção sináptica, que coletam informações de outros neurônios e as transmitem

em direção ao corpo celular, e o axônio como a estrutura de saída do neurônio que

faz contatos sinápticos com neurônios vizinhos (RAMÓN Y CAJAL, 1897).

A diversidade de morfologias dendríticas confere diferentes propriedades

biofísicas aos neurônios (RALL et al., 1992; KOCH; SEGEV, 2000) e dessa maneira

é crucial para a integridade da sinalização neuronal e padrões de disparo (MAINEN;

SEJNOWSKI, 1996). Consequentemente, as propriedades neuronais subjacentes à

função cerebral são fortemente dependentes de fatores que controlam a forma

dendrítica. A formação da sinapse também é uma peça importante para a

diferenciação neuronal e para a plasticidade sináptica. O crescimento dendrítico e a

maturação sináptica são dois processos essenciais e interdependentes para o

desenvolvimento dendrítico; e sabe-se que os dendritos neuronais são participantes

ativos na formação das sinapses (CLINE, 2001). Portanto, os mecanismos

moleculares que regulam o desenvolvimento dendrítico são a base para o

estabelecimento e funcionamento dos circuitos neuronais, uma vez que a maturação

da arquitetura dendrítica desempenha um papel crucial na determinação dos

padrões de conectividade no cérebro adulto.

A função cerebral está diretamente relacionada com a composição celular,

assim como à arquitetura da circuitaria, cujos padrões são estabelecidos durante o

desenvolvimento. A árvore dendrítica cresce pela adição e elongação de ramos:

dendritos primários emergem do corpo neuronal, e ramificam para formar dendritos

secundários e terciários. Os dendritos permitem que os neurônios integrem

informação de um conjunto de inputs sinápticos, e o padrão específico da

arborização dendrítica limita o número e o tipo dos inputs que um neurônio pode

receber (WONG; GOSH, 2002). A morfologia dendrítica também influencia o

decaimento do sinal sináptico enquanto ele se propaga em direção ao soma.

Consequentemente, existe uma relação bem definida entre a morfologia dendrítica

de um neurônio e sua função (YUSTE; TANK, 1996; CONNORS; REGEHR, 1996).

Porque o padrão especial da arborização dendrítica influi na função neuronal, é

Introdução 22

importante determinar como os dendritos adquirem seu tamanho característico e sua

morfologia durante o desenvolvimento.

A fase mais ativa do crescimento dendrítico no córtex cerebral de roedores

ocorre entre a primeira e a terceira semana pós-natal, o que se aproxima bastante

do início da entrada de aferentes sensoriais talâmicos no córtex (MILLER, 1981). De

fato, diversos experimentos utilizando bloqueio de atividade neuronal sugerem que a

perda desta atividade durante o desenvolvimento leva a alterações permanentes no

desenvolvimento dendrítico (para revisão, HAAS, 2001). Enquanto essas

observações indicam que a atividade aferente exerce um papel crítico na regulação

do crescimento dendrítico durante o desenvolvimento, os mecanismos moleculares

envolvidos ainda não foram completamente elucidados (REDMOND; KASHANI;

GHOSH, 2002). Como as alterações na arborização dendrítica e na morfologia estão

presentes em muitas doenças neurodegenerativas, essas variações corrompem a

transmissão pós-sináptica e afetam a comunicação neuronal. Deste modo, é

importante entender os mecanismos moleculares que regulam a dendritogênese a

fim de possibilitar uma futura aplicabilidade de técnicas genéticas no ramo de

terapias celulares.

A arborização dendrítica se expande rapidamente quando a árvore dendrítica

ainda é relativamente simples, e o ritmo de crescimento diminui à medida que a

árvore dendrítica se torna cada vez mais complexa e quando a sinaptogênese chega

ao fim (CLINE, 2001). As vias de sinalização intracelulares que medeiam os efeitos

das atividades aferentes sobre o crescimento dendrítico e sua padronização não são

completamente compreendidas, mas o cálcio parece ser um componente chave.

Vias que envolvem variações no cálcio intracelular têm sido conhecidas por

influenciar a diferenciação neuronal, assim como crescimento axonal e seu

direcionamento (SPITZER, 2002). Estudos indicam um importante papel da

sinalização por cálcio no crescimento e padronização dendrítica. O influxo de cálcio

através dos VGCCs (Voltage Gated Calcium Channels) ativa um programa

transcricional que regula o crescimento dendrítico de forma geral (REDMOND;

KASHANI; GHOSH, 2002), afetando o crescimento dendrítico em culturas de fatias

do córtex cerebral (MCALLISTER; KATZ; LO, 1996). Redmond; Kashani; Ghosh

(2002) examinaram mecanismos do crescimento dendrítico induzido por cálcio em

neurônios corticais e observaram que a despolarização induzida pelo influxo de

cálcio através dos canais VGCCs era suficiente para induzir um programa de

Introdução 23

crescimento dendrítico. O efeito da ativação desses canais sobre o crescimento

dendrítico foi suprimido por inibidores farmacológicos das CaMKs (Proteína Kinase

Cálcio/Calmodulina-dependente) e foi reestabelecido ao nível dos controles após a

transfecção de uma forma ativa da CaM Kinase IV (CaMKIV), mas não da CaMKII.

Tais achados indicam que os efeitos da ativação de VGCC sobre os dendritos pode

ser mediado pela CaMKIV. Sabe-se que a expressão da CaMKIV atinge seus níveis

máximos durante a segunda e terceira semana pós-natal, o que coincide com o

período de maior crescimento dendrítico (MILLER; PETERS, 1981), e que seu alvo

nuclear mais bem caracterizado é o fator transcricional CREB.

Então, quais seriam os mecanismos celulares que fazem com que os

dendritos adquiram uma morfologia única? Um grande conjunto de evidências indica

que o crescimento e a padronização dos dendritos são fortemente influenciados por

sinais ambientais, incluindo sinais de feedback vindos de alvos distantes (PURVES;

SNIDER; VOYVODIC, 1988; VOYVODIC, 1987; 1989; WINGATE; THOMPSON,

1994; LOM; COHEN-CORY, 1999), interações com células vizinhas do mesmo tipo

(KIRBY; CHALUPA, 1986; Gao et al., 1999), e através do contato com células pré-

sinápticas (ZIV; SMITH, 1996; JONTES, SMITH, 2000). A identidade de vários sinais

moleculares que medeiam esses efeitos tem sido amplamente investigada. Foi

encontrado, por exemplo, que semaforina 3A (Sema3A), Slit1, Notch e BDNF (Brain-

Derived Neurotrophic Factor) atuam como reguladores do crescimento e da

arborização dendrítica dos neurônios piramidais corticais (POLLEUX; MORROW,

GHOSH, 2000; WHITFORD et al., 2000; SESTAN; ARTAVANIS-TSAKONAS;

RAKIC, 1999; REDMOND et al., 2000; MCALLISTER; LO; KATZ, 1995).

O controle genético parece contribuir significativamente para a especificação

da arquitetura dendrítica já que neurônios do mesmo tipo, até mesmo de espécies

diferentes, apresentam morfologias semelhantes e, mesmo isolados em cultura,

desenvolvem aspectos característicos da sua morfologia, sugerindo um controle

intrínseco do crescimento dendrítico. Por exemplo, neurônios piramidais e estrelados

podem ser identificados em culturas corticais baseando-se em suas morfologias

distintas (THREADGILL; BOBB; GHOSH, 1997). Em conjunto, pode-se propor que

programas intrínsecos controlam certos aspectos do crescimento e organização da

morfologia dendrítica, ao passo que a compleição da estrutura dendrítica requer

também a atividade de neurônios vizinhos conectados (METZGER, 2010).

Introdução 24

1.3 PAPEL DO CREB NA SOBREVIVÊNCIA E DIFERENCIAÇÃO NEURONAL

Em estágios precoces do desenvolvimento, programas de crescimento

intrínsecos, geneticamente controlados, lideram a especificação do tipo neuronal e

polarização, coordenando a expansão dendrítica muito provavelmente através de

fatores de crescimento para construir uma complexa e volumosa árvore dendrítica

(McALLISTER, 2000; SCOTT; LUO, 2001; MILLER; KAPLAN, 2003; JAN; JAN,

2003). Estímulos extracelulares promovem, ao nível transcricional, a expressão de

uma variedade de genes IEGs (immediate-early-response genes), os quais

codificam fatores de transcrição que influenciam a expressão de genes de resposta

secundária (SHENG; GREENBERG, 1990), cujos produtos contribuem para a

resposta fenotípica da célula a tais estímulos externos. O fator de transcrição CREB

(cAMP response element binding protein ou CRE-binding protein) pertence à família

CREB, uma subcategoria da superfamília de fatores de transcrição denominada

BZIP (basic leucine zipper). O CREB se liga a elementos regulatórios denominados

CRE (cAMP response element) que encontram-se dentro dos promotores dos genes

CREB-dependentes, o que serve para facilitar interações futuras entre componentes

da maquinaria transcricional que, em ultima análise, executará a síntese do RNA do

gene em questão (LONZE; GINTY, 2002). A atividade do CREB é regulada por

fosforilação, e a Ser133 (Serina 133) tem sido apontada como principal sítio de

fosforilação (GONZALEZ; MONTMINY, 1989). A fosforilação do CREB aumenta sua

ligação aos coativadores CBP (CREB-binding protein) e p300 (VO; GOODMAN,

2001). CBP/p300, por sua atividade histona acetiltransferase, promovem

remodelamento da histona-cromatina e o recrutamento da maquinaria basal de

transcrição até os promotores contendo sítios CRE (GOODMAN; SMOLIK, 2000).

Sabe-se que a expressão gênica mediada por CREB é necessária para a

sobrevivência de múltiplos subtipos neuronais (BONNI et al., 1999; RICCIO et al.,

1999; WALTON et al., 1999; SHALIZI et al., 2003; MOURET et al., 2008), além de

estar envolvida tanto na diferenciação, quanto na plasticidade sináptica e memória

(LONZE; GINTY, 2002). Redmond e colaboradores (2002) demonstraram que o

crescimento induzido pelos canais VGCC e pela ativação da CaMKIV é suprimida

por um dominante negativo de CREB (K-CREB). Assim, o crescimento dendrítico

induzido por cálcio em neurônios corticais parece ser mediado pela CaMKIV e pela

transcrição dependente de CREB. Os mecanismos pelos quais a transcrição

Introdução 25

mediada por CREB regula o crescimento dendrítico não são bem compreendidos,

mas é interessante notar que um dos alvos do CREB é a neurotrofina BDNF (SHIEH

et al., 1998; Tao et al., 1998). BDNF é conhecidamente um regulador do crescimento

dendrítico em neurônios corticais e cerebelares (MCALLISTER; LO; KATZ, 1995;

MCALLISTER; KATZ; LO, 1996; SCHWARTZ et al., 1997; HORCH et al., 1999;

MERTZ; KOSCHECK; SCHILING, 2000) e é tentador especular que os efeitos do

CREB sobre o crescimento dendrítico seja mediado, ao menos em parte, via BDNF.

Embora o estudo de Redmond enfatize a via CaMKIV-CREB, outros mecanismos de

sinalização também são suscetíveis a contribuir no crescimento dendrítico

dependente de cálcio. Por exemplo, Vaillant et al. (2002) reportaram que o influxo de

cálcio induz a formação de dendritos em neurônios simpáticos através da CaMKII e

da MAPK, que atuariam no citoesqueleto estabilizando os dendritos (WU; CLINE,

1998).

Várias moléculas sinalizadoras, incluindo a proteína kinase dependente de

Ca2+/Calmodulina (CaMKII) e sinais extracelulares relacionados à kinase 1 e 2

(ERK1/2) também tem sido apontadas como reguladoras do crescimento neurítico

(PREKERIS et al., 1996; MENEGON et al., 2002; VAILLANT et al., 2002; LEE et al.,

2004; KOLKOVA et al., 2005). A CaMKII concentra-se na densidade pós-sináptica

(PSD), com ampla gama de substratos incluindo proteínas do citoesqueleto e

proteínas dos canais de glutamato (WU; CLINE, 1998; CHENG et al., 2006;

COLBRAN; BROWN, 2004). A CaMKII controla o crescimento dendrítico neuronal

atividade-dependente tanto in vitro quanto in vivo (VAILLANT et al., 2002; WU;

CLINE, 1998). Além disso, VAILLANT et al. 2002 também apontaram a CaMKII como

promotora do crescimento neurítico em neurônios através da ativação de ERK, a

qual pertence a família da MAPK. A fosforilação da ERK1/2 é mediada via MAPK

(MEK) e a sinalização via MEK/ERK tem sido implicada como sendo importante

reguladora das mudanças estruturais atividade-dependentes em neurônios

hipocampais (GOLDIN; SEGAL, 2003). A CaMKIV também é considerada elemento

chave na sobrevivência neuronal dependente de CREB, uma vez que o tratamento

com o inibidor da CaMK torna os neurônios vulneráveis à isquemia concomitante a

redução na fosforilação de CREB (Ser133) (MABUCHI et al., 2001). No geral,

experimentos indicam que o crescimento dendrítico induzido por cálcio é regulado

pela ativação de um programa transcricional que envolve CaMK IV e sinalização

mediada por CREB para o núcleo (REDMOND; GHOSH; 2005).

Introdução 26

A fosforilação da Ser133 pela proteína kinase A (PKA), RSK2 (Ribosomal S6

Kinase) ou outras kinases, recruta CBP (CREB binding protein) para o complexo de

iniciação e, desse modo, promove a transcrição. Muitos genes são ativados por

CREB, incluindo outros fatores de transcrição como o c-fos, através do qual a

sinalização por CREB pode indiretamente ativar uma grande variedades de genes

(ROBERSON, 2001). A sinalização por CREB também estimula a expressão de

BDNF (TAO et al., 1998; SHIEH et al., 1998), um fator de crescimento envolvido em

diferentes aspectos do desenvolvimento do SNC. Camundongos knock-out para

BDNF apresentam uma redução da sobrevivência neuronal, na arborização

dendrítica e na formação de memória (ALCÁNTARA et al., 1997; XU et al., 2000;

GORSKI et al., 2003a,b).

A expressão de BDNF parece gerar uma retroalimentação positiva no sistema,

uma vez que a sinalização por este fator pode levar a mais ativação de CREB. De

acordo com esta interpretação, TOJIMA; KOBAYASHI; ITO (2003) demonstraram

que a cascata de sinalização da MAPK pode ser ativada pelo BDNF, promovendo

neurogênese e crescimento de neuritos via expressão de genes CREB-

dependentes. A MAPK fosforila as ERKs (extracellular signal-regulated kinases) que

ativam o CREB (BONNI et al., 1999). Embora a Ser133 do CREB não seja um

substrato para a ERK, o efeito desta é indireto através da ativação do RSK2

(TRIVIER et al. 1996). Recentemente, um importante dado experimental destacou a

importância da sinalização via MAPK/ERK na regulação transcricional em neurônios

(BOZON et al., 2003) e dentre os fatores de transcrição ativados via MAPK, o CREB

desempenha um papel central nas respostas mediadas por neurotrofinas

(FINKBEINER, et al. 1997). Há indicativos de que a MAPK/ERK deve ser um ponto

de convergência integrando sinalizações via PKC, PKA e CaMK (IMPEY et al. 1998;

ROBERSON et al. 1999; VANHOUTTE et al. 1999).

A integridade da via de sinalização da PI3K durante o desenvolvimento

também é necessária para preservar a integridade do sistema nervoso (BACKMAN

et al., 2001; KWON et al., 2001; PIMENTEL et al., 2002; PENG et al., 2004;

EASTON et al., 2005). É também uma via central para a dendrítogênese e essencial

para a manutenção da complexidade da arborização dendrítica (JAWORSKI et al.,

2005; KUMAR et al., 2005). Assim sendo, qualquer defeito em moléculas mediando

a ativação da PI3K/Akt poderia resultar em redução na expansão dendrítica.

As vias de sinalização da PKA, CaMK, MAPK e PI3K não só ativam a

Introdução 27

sinalização por CREB como também medeiam a tolerância isquêmica, uma vez que

os genes alvos do CREB, como o Bcl-2, desempenham função crucial através de

mecanismos anti-apoptóticos (TERASAKI et al., 2010) (Figura 3). Embora a

diferença básica entre os efeitos dessas vias de ainda não esteja clara, uma

possibilidade é que tal diferença possa estar relacionada a habilidade de cada uma

em induzir a transcrição mediada por CREB.

Figura 3: CREB ativa a proteína anti-apoptótica Bcl-2. Tanto a PI3K/AKT quanto a MAPK/RSK podem fosforilar o fator de transcrição CREB. O P-CREB entra no núcleo e aumenta a expressão de proteínas anti-apoptóticas, como a Bcl-2. (SANES; REH; HARRIS, 2006).

A ativação de CREB em neurônios granulares do cerebelo durante o

desenvolvimento ou em neurônios granulares do giro denteado adulto têm sido

relacionada com sobrevivência destas células (WALTON et al., 1996; MONTI et al.,

2002; JAGASIA et al., 2009), sugerindo que a sinalização por CREB poderia ter um

efeito importante sobre a sobrevivência neuronal. Vale ressaltar também que os

ramos dendríticos são altamente dinâmicos no início do desenvolvimento e a

Introdução 28

arquitetura dendrítica é alterada em resposta a mudanças ambientais (VOLKMAR;

GREENOUGH, 1972), como lesões periféricas (VAN DER LOOS; WOOLSEY, 1973),

que impulsionam plasticidade dendrítica até mesmo em adultos (HICKMOTT;

STEEN, 2005). Assim sendo, a criação de medidas que possam atuar sobre tais

fenômenos, como o remodelamento dendrítico induzido por lesões ou o aumento da

sobrevivência celular, pode constituir-se em uma poderosa ferramenta para

possibilitar o surgimento de técnicas de engenharia genética que intervenham no

curso de certas doenças.

1.4 CREB, PLASTICIDADE E DOENÇAS NEUROLÓGICAS

Uma vasta gama de processos biológicos e patofisiológicos são influenciados

pelo CREB (SASAKI et al., 2011), assim, não é nada surpreendente que as

consequências do rompimento das funções desta molécula sejam bastante severas

in vivo. Enquanto a completa interrupção do CREB é letal em camundongos

(RUDOLPH et al., 1998), em humanos diversas condições patológicas existem nas

quais a função do CREB parece ter sido interrompida súbita ou parcialmente.

Algumas são desordens genéticas onde moléculas que interagem com o CREB são

defeituosas, como no caso da síndrome Coffin-Lowry, caracterizada por múltiplas

anormalidades físicas e retardamento mental, onde o gene da RSK-2, uma das

kinases que atua sobre o CREB, está mutada (TRIVIER et al., 1996).

O CBP (Creb Binding Protein) é um coativador transcricional não específico

para o CREB apenas. O CBP se liga através do seu domínio KIX à Ser133

fosforilada no domínio KID do CREB (PARKER et al., 1996; RADHAKRISHNAN et

al., 1997), e é o estímulo-dependente entre esses dois domínios que induz à

expressão gênica. A síndrome de Rubenstein-Taybi é similarmente caracterizada e

causada por uma mutação heterozigota no gene CBP (PETRIJ et al., 1995). O CBP

tem atividade de lisina acetiltransferase e é capaz de acetilar lisinas nas porções N-

terminais de histonas. Apontando a importância desses mecanismos via CREB para

a cognição humana, sabe-se que a perda da função de CBP nessa síndrome

(RUBINSTEIN; TAYBI, 1963; PETRIJ et al., 1995) provoca um distúrbio neurológico

congênito definido por deficiências características de crescimento pós-natal,

dismorfologia e deficiência intelectual. A identificação de desregulações na

acetilação de histonas devido a perda de CBP em pacientes com a Síndrome

Introdução 29

Rubinsteine-Taybi (MURATA et al., 2001) e em modelos animais correspondentes

(ALARCÓN et al., 2004; KORZUS et al., 2004; Wood et al., 2005) serve como um

dos primeiros exemplos de uma lista crescente de doenças em humanos com

déficits cognitivos que podem ser consideradas como cromatinopatias devido a

mutações casuais em reguladores da estrutura/ função da cromatina e,

consequentemente, da expressão gênica (LEVENSON; SWEATT, 2005; VAN

BOKHOVEN, 2011; HAGGARTY; TSAI, 2011). Tanto que pequenas moléculas

inibidoras de histona deacetilases (HDACs) agem como ativadoras da transcrição

regulada por CREB e moduladoras da neuroplasticidade mediada por cromatina

(FASS ET AL 2012).

A perda de neurônios está associada às principais doenças do sistema

nervoso central (SNC), as quais têm representado um elevado e crescente custo

para saúde pública nas últimas décadas, (MALTA et al., 2006). Principalmente

devido ao envelhecimento da população, acidentes vasculares (hemorrágicos ou

isquêmicos), por exemplo, provocam morte neuronal aguda e são a principal causa

de óbitos no Brasil desde 1980, assim como seu risco tem aumentado na região

Nordeste segundo dados do MINISTÉRIO DA SAÚDE, Sistema de Informação sobre

mortalidade, 2004. Diante de tal fato, estudos recentes têm procurado meios de

reduzir a lesão isquêmica, através de medidas neuroprotetoras com ação

especificamente na área de penumbra, onde a disfunção e o sofrimento ainda são

potencialmente reversíveis. As ações neuroprotetoras atuariam em diferentes sítios

da cascata de eventos da isquemia e embora haja evidências experimentais do

benefício destas medidas, até o momento, não existe droga neuroprotetora a ser

recomendada para uso no tratamento do AVC (ARQ. NEUROPSIQUIATRIA, 2001).

O rt-PA (recombinant tissue-type plasminogen activator) ainda é a única terapia

aprovada contra o AVC isquêmico (NINDS, 1995), pois dentre mais de 700 drogas

que tem sido estudadas e demonstradas como eficazes em modelos animais de

isquemia, nenhuma tem provado ser eficaz para aplicabilidade em humanos

(KASTE, 2005; LEES et al., 2006).

Alternativamente, diversos grupos de pesquisa têm buscado maneiras de

substituir grupos de neurônios perdidos no curso destas doenças. De maneira

simplificada, as estratégias utilizadas baseiam-se em dois principais paradigmas: 1)

Transplante de células capazes de diferenciar em tipos neuronais específicos ou 2)

Estímulo à produção de neurônios por células residentes no SNC. Independente da

Introdução 30

estratégia utilizada para a obtenção de novos neurônios no SNC adulto, esta é

apenas a primeira parte do desafio. Uma vez situados no tecido, estes novos

neurônios precisam sobreviver, crescer neuritos (axônios e dendritos) e estabelecer

conexões funcionais (sinapses) com os neurônios pré-existentes. Portanto, é

fundamental entender os mecanismos moleculares controlando estes fenômenos, a

fim de sermos capazes de usar estas terapias celulares para recuperar lesões do

SNC de forma eficaz.

É sabido que, no cérebro adulto, novos neurônios são constitutivamente

gerados na Zona Subventricular (SVZ) e na Zona Subgranular (SGZ) no giro

denteado e que insultos que causam morte neuronal, como é o caso da isquemia,

são acompanhados por um aumento neurogênico nessas áreas (SVZ: LOIS;

ALVAREZ-BUYLLA, 1993; LUSKIN, 1993; JIN et al., 2001; ZHANG et al., 2001.

SGZ: BENGZON et al., 1997; PARENT et al., 1997; LIU et al., 1998; ARVIDSSON et

al., 2001). Existe um grande número de dados indicando que esses novos neurônios

gerados na ZSV podem migrar para áreas atingidas por um insulto isquêmico

(ARVIDSSON et al., 2002; PARENT et al., 2002; JIN et al., 2003; GOINGS et al.,

2004; KOBAYASHI et al., 2006), porém, há evidências de que tanto a diferenciação

quanto a sobrevivência destas células na área lesada podem estar comprometidas

(DEIERBORG et al., 2009), o que poderia limitar o uso desta abordagem para

terapias celulares. Dados de Herold et al. (2011) demonstram um papel essencial da

sinalização por CREB sobre a maturação de neurônios recém formados e na

sobrevivência e manutenção da expressão gênica neuronal durante os estágios

iniciais da neurogênese. Em particular, a ativação da cascata CREB-PGC-1 contribui

para a sobrevivência neuronal em varias doenças neurológicas, incluindo AVC,

doença de Huntington e Parkinson (OKAMOTO et al., 2009; ST-PIERRE et al.,

2006).

Ramón y Cajal uma vez destacou que o córtex é um tecido extremamente

complexo, onde qualquer tipo de abordagem simplista está fadada ao fracasso

(RAMÓN Y CAJAL, 1893). Algumas das abordagens mais promissoras estão na

combinação de novas técnicas genéticas, ópticas e fisiológicas. Melhorias recentes

nos métodos de transferência gênica permitiram a transfecção e a alteração

genética de células em cérebros intactos (DITTGEN et al., 2004; HAAS et al., 2001).

A tremenda especificidade temporal e espacial de tais manipulações ajudará na

determinação de como os genes ou a atividade de células individuais contribuem

Introdução 31

para propriedades sistêmicas, como no caso da plasticidade. Desta forma, a

habilidade em manipular a morfologia dendrítica a partir de perturbações

moleculares propiciam uma oportunidade ímpar para tratar questões de longa data

sobre a relação entre forma e função (WHITFORD et al., 2002) e a caracterização de

propriedades das células progenitoras neurais do telencéfalo.

Em suma, o grande desafio na área de neuroterapia celular tem sido

identificar maneiras de melhorar a sobrevivência, crescimento e integração sináptica

de neurônios transplantados à circuitaria local. Por este motivo, acreditamos que a

análise sistemática dos mecanismos moleculares envolvidos na sobrevivência e

diferenciação neuronal durante o desenvolvimento é fundamental para a elaboração

de estratégias eficazes ao reparo celular no sistema nervoso adulto lesado. Desta

forma, neste trabalho, pretendemos avaliar a função do fator transcricional CREB,

importante mediador na neuroproteção (SUGIURA et al., 2004; MELLER et al., 2005;

TERASAKI et al., 2010). Focar no entendimento das vias de sinalização por CREB e

seu papel sobre a sobrevivência neuronal permitirá o direcionamento de promissoras

abordagens terapêuticas como, por exemplo, contra o dano isquêmico do Acidente

Vascular Cerebral.

Objetivos 32

2 OBJETIVOS

2.1 GERAIS

Avaliar os efeitos da atividade de CREB fosforilado (pCREB) por diferentes

vias de sinalização sobre o crescimento neurítico e sobrevivência neuronal.

2.2 ESPECÍFICOS

Estabelecer modelos de cultura de células que possam ser utilizados para

avaliar sinalizações via CREB sobre a diferenciação e sobrevivência

neuronal;

Discriminar efeitos da sinalização por CREB induzido por diferentes kinases

em neurônios corticais in vitro, através de manipulações farmacológicas;

Avaliar os efeitos de diferentes formas do CREB (dominante negativo A-CREB

e a forma constitutivamente ativa CREB-FY) em neurônios corticais in vitro

com o uso de técnicas genéticas;

Identificar os efeitos farmacológicos que podem ser revertidos com a

expressão forçada do CREB ativado;

Avaliar o efeito da sinalização mediada por CREB sobre a sobrevivência de

neurônios corticais.

Metodologia 33

3 METODOLOGIA

3.1 ANIMAIS

Utilizamos, nesse estudo, camundongos fêmea da linhagem C57/Bl6 (n=9)

em período gestacional E14 (o dia da detecção do plug vaginal foi considerado como

o dia embrionário zero, E0) e foram utilizados uma média de 7 embriões por

experimento. As fêmeas estavam com idade entre 2 a 9 meses e foram mantidas em

ciclos claro/escuro de 12h (07:00 to 19:00 h) com alimentação ad libitum. Todos os

procedimentos realizados foram previamente aprovados pelo comitê de ética das

instituições envolvidas (CEUA/UFRN e Helmholtz Zentrun München).

3.2 PLASMÍDEOS E VETORES RETROVIRAIS

Retrovírus “defectivos” ou incompetentes para replicação são produzidos a

partir de uma linhagem celular estável (293T) transfectada transitoriamente com o

plasmídeo de expressão, o pCMV (packaging plasmid) e o pVSVG (pseudotyping

plasmid). As partículas virais são removidas do sobrenadante e ressuspendidas em

DMEM ou PBS (Phosphate Buffered Saline), aliquotadas e armazenadas a -80 °C

até o uso (COSTA et al., 2009b).

Os plasmídeos de expressão contendo o promotor CAG, uma região de

ligação a ribossomos IRES (Internal Ribossomal Entry Site) e o gene da proteína

fluorescente verde (GFP) foram utilizados para a produção de retrovírus. O vetor

usado como controle possui apenas o gene para a proteína fluorescente e foi

denominado CAG-IRES-GFP. Os plasmídeos contêm sítios de restrição para as

enzimas SfiI e PmeI entre o promotor CAG e o IRES, permitindo a inserção da

sequência codificadora das diferentes formas de CREB, descritas a seguir.

Os vetores resultantes da clonagem destas diferentes formas de CREB foram

denominados CAG-ACREB-IRES-GFP (A-CREB) e CAG-CREBFY-IRES-GFP

(CREB-FY). Todos os vetores retrovirais contendo os plasmídeos foram gentilmente

cedidos pelo Dr. Chichung Lie, Helmholtz Zentrum, Alemanha.

Metodologia 34

3.2.1 Dominante negativo do CREB

O dominante negativo A-CREB possui uma região acídica-anfipática que se

liga com grande afinidade ao CREB endógeno e bloqueia sua ligação ao DNA (AHN

et al., 1998). O vetor resultante da clonagem desta forma de CREB denomina-se

CAG-ACREB-IRES-GFP.

3.2.2 Forma constitutivamente ativa do CREB

O CREB-FY, forma de CREB constitutivamente ativa, contém uma alteração

do aminoácido tirosina (Y) 134 pela fenilalanina (F), tornando o CREB mais

suscetível a fosforilação por PKA e é suficiente para estimular a transcrição gênica

em células não estimuladas, devido a fosforilação constitutiva na Ser133 (DU et al.,

2000). Seus experimentos indicam que a mutação na tirosina 134 para fenilalanina

diminui o km do CREB pela PKA; pois estudos com o inibidor farmacológico da PKA

(o H-89) implica o envolvimento da atividade basal de PKA nesse processo. O vetor

resultante da clonagem desta forma de CREB denomina-se CAG-CREB-FY-IRES-

GFP.

Desta maneira, comparamos os efeitos de duas formas do CREB descritas

previamente na literatura, o dominante negativo A-CREB e a forma

constitutivamente ativa CREB-FY, para nos ajudar a entender o papel da sinalização

por vias ativadoras de CREB.

3.3 CULTURA DE CÉLULAS

Neste trabalho, fizemos uso de células embrionárias do telencéfalo dorsal em

E14 e E18 (Figura 4) para cultivo primário e de neurosferas, respectivamente.

Embriões de camundongos foram removidos após sacrifício materno por

deslocamento cervical, imersos em solução PBS e mantidos em gelo. Em ambiente

estéril, com o auxílio de um microscópio, os cérebros foram extraídos da caixa

craniana e a pia-máter foi cuidadosamente removida. Em seguida, a porção lateral

do telencéfalo dorsal foi cuidadosamente separada das eminências ganglionares e

Metodologia 35

primórdio hipocampal e as células foram dissociadas como já descrito (HEINS et al.,

2001).

Figura 4: Organização anatômica do córtex embrionário de camundongo. O período de gestação do camundongo dura 19 dias e a neurogênese cortical 8 dias, do 11º dia embrionário (E11) ao E19. Zona Ventricular (VZ), Subplaca (SP), placa cortical (CP), zona marginal (MZ), camada de fibras (FL). Em nossos experimentos utilizamos células embrionárias do córtex (telencéfalo dorsal) em E14 e E18 (similar a E17). (Modificada de SMART et al., 2002)

Para os cultivos de neurosferas, após dissociação química e mecânica, as

células foram plaqueadas em DMEM / 1% penicilina e estreptomicina suplementado

com B27, 10 ng/mL de FGF (Fibroblast Growth Factor) e 10 ng/mL de EGF

(Epidermal Growth Factor) como descrito previamente (REYNOLDS; WEISS, 1996;

CHOJNACKI; WEISS, 2004). FGF e EGF na concentração de 10 ng/mL deve ser

adicionado a cada 3 dias. Passados 7 dias in vitro (DIV) a 37oC em 5%CO2 / 95%O2,

as neurosferas foram plaqueadas para diferenciação (1-2 x 105 células) sobre

lamínulas pré-tradadas com poli-D-lisina (PDL) em DMEM / B27. 24 horas após o

plaqueamento, as células foram tratadas com as diferentes drogas bloqueadoras de

kinase (acima citadas). A fim de acessar a capacidade de auto-renovação de tais

células, as neurosferas primárias foram novamente dissociadas e plaqueadas (cerca

de 3 x 103 células) em 500 μL de DMEM suplementado com B27 (COSTA et al.,

2007); esse procedimento foi repetido 3 vezes, até a terceira passagem. Os dados

são provenientes de pelo menos 2 experimentos diferentes com dez lamínulas

analisadas por experimento (cada variável em duplicata). Os dados foram plotados e

mostrados como média ± sem.

Metodologia 36

No caso dos cultivos primários, logo após a dissociação, as células foram

plaqueadas em DMEM FCS 10%, cuja concentração é diminuída para 5% 24h

depois, quando da adição de DMEM suplementado com B27 (1:50). Após 2 horas,

as culturas foram infectadas com os vetores retrovirais (A-CREB ou CREB-FY) em

baixa concentração (<30 partículas) e 24 horas após o plaqueamento, foram

tratadas com as diferentes drogas bloqueadoras de kinase. Os dados são

provenientes de clones contendo, no máximo, 3 neurônios e de 7 experimentos

diferentes (cada variável em duplicata); sendo os grupos: GFP / GFP + DMSO / A-

CREB / CREB-FY / GFP + H-89 / CREB-FY + H-89 / GFP + KN-62 / CREB-FY + KN-

62 / GFP + U0126 / CREB-FY + U0126 / GFP + Wort / CREB-FY + Wort. Os dados

foram plotados e mostrados como média ± sem.

3.4 ENSAIOS FARMACOLÓGICOS

2h após a adição do meio de diferenciação nos cultivos de neurosferas, e 24h

após o plaqueamento no caso dos cultivos primários, as culturas foram tratadas com

10 mM do H-89 (Sigma), inibidor da ativação de PKA, 10 mM do KN-62 (Sigma),

inibidor da CaM kinase II - para bloquear a fosforilação de CREB por vias

dependentes de AMPc e cálcio, respectivamente, 10 mM de U0126 (Sigma), inibidor

de MAPK e 10 nM de Wortmannin (Sigma), inibidor da PI3K. As drogas foram

diluídas em DMSO (Dimetilsulfóxido), que foi usado como controle.

3.5 INFECÇÃO VIRAL

Após 2 horas, as culturas foram infectadas com vírus em baixa titulação (<30

partículas) contendo os plasmídeos de interesse contendo o gene de interesse (A-

CRE ou CREB-FY) e a proteína repórter verde (GFP), como descrito acima, e

fixadas após 7 dias in vitro como previamente descrito (HEINS et al., 2001). Ao

utilizar um número reduzido de partículas virais para transduzir as células, nós

pudemos submeter as culturas a experimentos de vídeo-microscopia de tempo

intervalado e, após imunocitoquímica, identificar células bem separadas com um

aumento de 20x no microscópio de fluorescência (Zeiss).

Em experimentos subsequentes, essas manipulações foram combinadas com

as manipulações farmacológicas (inibidores das kinases: PKA, MAPK, CaMKII e

Metodologia 37

PI3K) e os efeitos comparados ao grupo controle (GFP + DMSO) a fim de observar

se os efeitos do bloqueio das kinases seriam anulados ou não.

3.6 IMUNOCITOQUÍMICA

As culturas celulares derivadas de neurosferas foram submetidas a reações

imunocitoquímicas com os anticorpos anti-GFP (Chicken, Aves Lab Inc., 1:500), para

visualização de células transfectadas com os diferentes vetores, TUJ1 (mouse

IgG2b, Sigma, 1:1000), que marca uma proteína específica do citoesqueleto

neuronal, a βIII-tubulina; já no caso dos cultivos primários, utilizamos o anticorpo

anti-MAP2 (mouse IgG1, Sigma, 1:1000) ao invés do TUJ1. O objetivo era analisar a

morfologia dos neurônios transfectados (através do programa IMAGE J) e a

densidade de células (proporção de células MAP2+ em relação ao total de células

DAPI) entre os diferentes grupos experimentais, quantificando e comparando

estatisticamente com o uso de ANOVA.

Os anticorpos primários (anti-GFP, anti-βIII tubulina e anti-MAP2) foram

diluídos em tampão fosfato (PBS) 0,1 M, triton a 0,5% e soro normal de cabra (NGS)

a 10%. Após 24h a 4 ºC, as culturas foram lavadas (3 vezes) por 5 minutos com PBS

0,1 M e incubadas com uma solução (PBS 0,1 M, 0,5% de triton) contendo os

anticorpos secundários, conjugados a diferentes fluoróforos (Alexa 488, verde e

Alexa 546, vermelho. Em experimentos subsequentes, essas manipulações foram

combinadas com a superexpressão do CREB ativo (CREB-FY) e os efeitos

comparados ao grupo controle (GFP + DMSO) a fim de observar se os efeitos do

bloqueio das kinases seriam anulados ou não), por 2h em temperatura ambiente.

Findo este período, mais três lavagens com PBS foram feitas e os núcleos celulares,

corados com DAPI antes da montagem das células em Acqua Polymount.

3.7 ANÁLISE MORFOLÓGICA

Para a análise morfológica fizemos uso do programa ImageJ (v. 1.46e) e do

plugin NeuronJ (v. 1.4.2). Após 7 DIV, as culturas celulares foram fixadas e os

neurônios que se encontravam mais isolados (neurônios TUJ1-positivos, no caso

das culturas derivadas de neurosferas e neurônios GFP-positivos, no caso dos

cultivos primários) foram fotografados em microscópio de fluorescência da Zeiss,

Metodologia 38

afim de que seu soma e seus neuritos pudessem ser desenhados com o auxílio do

programa acima citado para análise morfológica. Todos os testes foram realizados

com o auxílio do software GraphPad Prism 5.

Além da medição do tamanho do corpo celular (área do soma em duas

dimensões), foram definidos como critério de medida para a análise morfológica dos

neuritos os seguintes parâmetros:

Número total de neuritos: a quantidade total de neuritos de cada neurônio,

considerando os neuritos primários mais suas ramificações (ramos);

Número de neuritos primários: quantidade de neuritos que partem do soma;

Comprimento dos neuritos: considera a média do tamanho de todos os

neuritos, levando em conta os valores de cada um deles;

Soma dos comprimentos dos neuritos: considera a soma dos

comprimentos de todos os neuritos.

Comprimento do neurito mais longo: medida do tamanho do neurito mais

longo, desde o soma até a extremidade mais distal;

Número de bifurcações por neurônio: quantidade de pontos onde os

neuritos se ramificam ou se separam em dois.

Número de bifurcações por neurito: quantidade de vezes que o neurito se

ramifica ou bifurca; relação entre o número de bifurcações por neurônio e o

número total de neuritos.

3.8 ANÁLISE DA SOBREVIVÊNCIA - VÍDEO-MICROSCOPIA

O estudo de linhagens celulares no córtex de roedores in situ depende do uso

de um marcador que possa ser incorporado por uma célula progenitora e,

subsequentemente, transmitido para a sua progênie. O uso de vetores retrovirais

preenche os requisitos acima, pois os seus materiais genéticos, devido à ausência

da proteína transportase, só podem ser incorporados aos núcleos de células

mitóticas. Em geral, são utilizados como repórteres, genes que codificam proteínas

identificáveis por métodos de imunologia.

A definição de clone baseia-se na relação espacial entre as células que

incorporaram um gene repórter. Basicamente, os autores consideram como

pertencentes a um mesmo clone, células que estavam separadas por uma curta

distância ou se apresentavam radialmente dispostas. Através da morfologia das

Metodologia 39

células encontradas, os autores concluíram que, em sua maioria, os clones eram

formados por um único tipo celular (LUSKIN et al., 1988) A fim de observamos

diretamente a geração de células neurais a partir de um precursor individual, as

culturas foram continuamente monitoradas através de vídeo microscopia de tempo

intervalado. Esta técnica permite a quantificação de uma série de parâmetros não

mensuráveis através de outras técnicas, tais como número de neurônios por clone e

tipo de divisão (COSTA et al., 2008). Além disso, podemos observar diretamente a

ocorrência de morte celular, diferenciando o efeito desta do de uma diminuição na

capacidade proliferativa das células, ambas capazes de gerar clones menores.

Outros fenômenos, tais como migração e diferenciação celular (COSTA et al., 2007;

BERNINGER et al., 2007) também podem ser visualizados através deste método,

oferecendo uma poderosa ferramenta para o estudo de fenômenos celulares.

Utilizamos um paradigma experimental baseado na incorporação do material

genético de vetores retrovirais por células em divisão mitótica. Desta forma, a

linhagem de uma célula pode ser reconstruída através da análise da expressão de

um gene repórter contido nos retrovírus (PRICE et al., 1988). Os cultivos foram

mantidos a 37 °C, ventilados com 5%CO2 e 24 após o plaqueamento foram

posicionados para captura de vídeo em um microscópio Cell Observer (Zeiss)

equipado com uma incubadora e sistema de ventilação (COSTA et al., 2007, 2008;

BERNINGER et al., 2007; EILKEN et al., 2009). Com o auxílio de uma câmera digital

(AxioCam HR3) controlada pelo software AxioVision Rel 4.8.2.0 (Zeiss) com a macro

Timm’s Acquisition Tool; TAT (RIEGER et al., 2010). As culturas foram fotografadas

a cada 2 minutos em contraste de fase e imagens fluorescentes a cada 3 horas por

3 ½ dias (84h). As imagens obtidas (1388 x 1040 pixels) foram montadas como

vídeo e analisadas com o auxílio do software Timm’s Tracking Too; TTT (RIEGER et

al., 2009). Células transduzidas foram reconhecidas pela presença da proteína

fluorescente verde (GFP) e rastreadas em contraste de fase, permitindo a

identificação da linhagem de uma célula individual. Para mensurar a taxa de

sobrevivência acumulada, consideramos a porcentagem de células que sobreviviam

a cada ciclo de 12h. Por exemplo, se em 12h a célula se dividiu 2 vezes e, das 4

células geradas apenas 3 sobreviveram, tem-se que a taxa de sobrevivência foi de

75%. No total, foram analisadas 262 árvores: 124 (Controle), 64 (A-CREB) e 74

(CREB-FY).

Metodologia 40

3.9 DENSIDADE DE CÉLULAS NEURONAIS

A fim de determinar a densidade de células neuronais nos cultivos primários

submetidos aos ensaios farmacológicos com as drogas inibidoras de kinases (H-89,

KN-62, U0126 e Wort), foram feitas contagens do número de células MAP2 positivas

em relação ao número total de células através da contagem de núcleos celulares

corados com DAPI (MAP2/DAPI). As contagens foram feitas no programa ImageJ a

partir das imagens (1388 x 1040 pixels) adquiridas no microscópio de fluorescência

da Zeiss (aumento de 20x) após 7 dias de cultivo in vitro. Foi contado um total de 10

imagens por variável.

3.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os dados provenientes das análises morfológicas em neurônios dos cultivos

de neurosferas, como “número total de neuritos”, por exemplo, foram comparados

estatisticamente com o uso do teste de Mann-Whitney (teste-t, não-pareado, não-

paramétrico), com o auxílio do programa GraphPad Prism 5.0.

Todos os dados provenientes das análises morfológicas e de sobrevivências

dos cultivos primários foram comparados estatisticamente com o auxílio do mesmo

progama acima citado, porém com o teste One-way ANOVA (não-paramétrico) e pós

teste de Dunnett.

Resultados 41

4 RESULTADOS

4.1 CULTURAS CELULARES

4.1.1 Cultura de neurônios corticais diferenciados a partir de neurosferas

Células do telencéfalo dorsal de camundongos no período embrionário E18

foram isoladas e mantidas durante 7 dias em condições apropriadas para formar

neurosferas. Ao fim deste período, as células compondo as neurosferas foram

dissociadas e plaqueadas para diferenciação e, 2 horas depois, receberam

tratamento farmacologógico com os inibidores de kinase já citados anteriormente.

Passados 7 dias in vitro (7DIV), as culturas celulares, já diferenciadas, foram fixadas

e submetidas a reações imunocistoquímicas com o anticorpo anti-βIII tubulina

(TUJ1). Imagens dos neurônios que se encontravam mais isolados em cultura

puderam ser utilizadas para a análise morfológica através do programa ImageJ. A

Figura 5 mostra um neurônio marcado com TUJ1 (vermelho) e os traçados dos

neuritos (ciano). A Tabela 1 foi gerada pelo programa e mostra, dentre outras coisas,

a quantidade de traçados (tracing) e seus respectivos comprimentos (lenght), em

micrômetros.

Resultados 42

Figura 5: Traçado dos neuritos. A) Neurônio TUJ1 positivo do grupo controle (DMSO); aumento de 40x. B) Em cor ciano, traçado dos neuritos feitos com auxílio do programa ImageJ.

Tabela 1: Exemplo de tabela gerada pelo programa ImageJ a partir do traçado dos neuritos.

Image Tracing Cluster Type Label Length [µm]

Mean Val [a.u.]

SD Val [a.u.]

Min Val [a.u.]

Max Val [a.u.]

4_BIII N1 DMSO Neurite n1 81.093 81.817 27.546 18 124







4_BIII N8 DMSO Neurite n1 21.142 57 22.836 30 107





4_BIII N13 DMSO Neurite n1 11.066 108 24.957 86 158



A

TUJ1 TUJ1

B

Resultados 43

4.1.2 Cultura primária de neurônios corticais


foram dissociadas e plaqueadas para diferenciação. Após 2 horas, células foram

infectadas com retrovirus carregando plasmídeo com o gene para a proteína

fluorescente verde (GFP) e o gene A-CREB ou CREB-FY (o grupo controle continha

apenas a proteína fluorescente verde - GFP). Passadas 24 horas, as culturas

receberam tratamento farmacologógico com os inibidores de kinase H-89 (inibidor da

PKA), KN-62 (inibidor da CaMKII), U0126 (inibidor da MAPK) e Wort (inibidor da

PI3K). Após 7 dias in vitro (7DIV), as culturas celulares foram fixadas e submetidas a

reações imunocitoquímicas com os anticorpos anti-GFP e anti-MAP2, permitindo a

identificação de neurônios transfectados com os plasmídeos supracitados. Imagens

dos neurônios que se encontravam mais isolados em cultura puderam ser utilizadas

para a análise morfológica através do programa ImageJ. Neurônios GFP-positivos

(verde) e MAP2-positivos (vermelho) (Figura 6) tiveram seus neuritos traçados para

posterior análise morfológica.

Figura 6: Neurônio expressando a proteína fluorescente verde (GFP). Neurônio gerado em cultura primária infectada com o vírus contendo o plasmídeo CAG-IRES-GFP (controle). Imunocitoquímica para MAP2 e GFP após 7 dias in vitro, mostrando um neurônio expressando MAP2 (vermelho) e a proteína fluorescente verde (GFP). Aumento de 40x.

MAP2 GFP

Resultados 44

4.2 ANÁLISE MORFOLÓGICA

Por serem os principais sítios onde os neurônios recebem e integram

informação de um vasto número de contatos sinápticos, os dendritos e seu padrão

específico de arborização determinam não só o número, mas também o tipo das

sinapses recebidas por um neurônio (WHITFORD et al., 2002). Vê-se, então, que o

desenvolvimento dendrítico é essencial para a formação do circuito neuronal; e

porque o padrão especial da arborização dendrítica influencia na função neuronal,

faz-se importante determinar como os neuritos adquirem seu tamanho característico

e sua morfologia durante o desenvolvimento. Para tanto, analisamos diversos

parâmetros morfológicos cujas alterações podem corromper a transmissão sináptica

afetando por fim a comunicação neuronal. São eles: comprimento médio e total dos

neuritos, comprimento do neurito mais longo, número de neuritos por neurônio,

número de bifurcações por neurônio e por neurito.

Para as culturas diferenciadas a partir de neurosferas, analizamos as células

TUJ1 positivas. Para as culturas primárias, onde foram utilizados retrovírus

carreando o plasmídeo contendo a proteína fluorescente verde (GFP), identificamos

e analisamos as células que incorporaram o plasmídeo, indicando que elas

expressavam o gene A-CREB e GFP, CREB-FY e GFP, ou apenas GFP (controles).

A fim de avaliar parâmetros morfológicos neuronais, após 7DIV, as culturas

foram fixadas e submetidas a reações imunocitoquímicas com o anticorpo anti-βIII

tubulina ou anti-GFP (culturas derivadas de neurosferas e culturas primárias,

respectivamente). Imagens dos neurônios que se encontravam mais isolados em

cultura foram feitas com microscópio de fluorescência da Zeiss e foram utilizadas

para a análise morfológica através do programa ImageJ.

4.2.1 Manipulações farmacológicas – Cultura de neurônios corticais

diferenciados a partir de neurosferas

Ensaios farmacológicos com inibidores de vias de sinalização específicas

(PKA, CaMK, MAPK e PI3K) foram realizados com o intuito de avaliar a importância

dessas vias sobre a diferenciação neuronal, em termos de crescimento dos neuritos,

arborização dendrítica e tamanho do soma.

Resultados 45

Para avaliar os efeitos da inibição das vias de sinalização mediados pela

Proteína Kinase A (PKA) e Proteína Kinase Ca2+/Calmodulina-dependente II

(CaMKII) sobre o crescimento de neuritos, neurônios derivados de neurosferas

foram tratados com dois diferentes agentes farmacológicos (Figura 7A, B). O

bloqueio da PKA com o H-89 causou uma redução tanto no comprimento do neurito

mais longo quanto na soma dos comprimentos dos neuritos (Figura 7B, teste de

Mann-Whitney *p < 0,05). Vale ressaltar que, em culturas tratadas com H-89, o

número de neurônios observados foi extremamente reduzido (cerca de 100x menos

do que os controles). Tal resultado implica uma forte influência da via da PKA sobre

a complexidade da arborização dendrítica (bifurcação dos neuritos) e sugere uma

redução na geração de neurônios e/ou um aumento na taxa de morte celular uma

vez que os neurônios analisados (n = 10) correspondiam ao total de neurônios em

cultura, aproximadamente 1% da quantidade de neurônios observada no controle.

O bloqueio da CaMKII com o KN-62 diminuiu significativamente o tamanho

dos neuritos individuais, embora o número total de neuritos e o número de neuritos

primários pareçam estar normais em relação ao controle (DMSO) (Figura 7B).

Para medir os efeitos da inibição das vias de sinalização mediadas por

(MAPK) e a (PI3K) sobre o crescimento de neuritos, neurônios derivados de

neurosferas foram tratados com inibidores farmacológicos correspondentes (U0126

e Wortmannin). Nossos experimentos revelaram que, em condições basais, o

inibidor da PI3K não parece afetar o crescimento neuronal, ao passo que o inibidor

da MAPK, U0126, aumenta o número de neuritos (Figura 8).

Resultados 46

A

B

Figura 7: Análise morfológica de neurônios tratados farmacologicamente com os inibidores da PKA (H-89) e da CaMKII (KN-62). A. Neurônios após 7 DIV marcados com TUJ1 e tratados farmacologicamente com DMSO (controle), H-89 (inibidor da PKA ) ou KN-62 (inibidor da CAMKII). B. Avaliação da complexidade dendrítica dos neurônios tratados com H-89 e KN-62. O bloqueio da PKA pelo H-89 diminuiu significativamente o tamanho dos neuritos mais longos e também diminuiu a soma do cumprimento dos neuritos; enquanto a inibição da CaMKII pelo KN-62 influenciou o comprimento dos neuritos. (DMSO, n = 18 / H-89, n = 10 / KN-62, n = 25). * p<0,05, comparado ao tratamento controle (DMSO) usando Mann-Whitney test.

Resultados 47

A

B

Figura 8: Análise morfológica de neurônios tratados farmacologicamente com os inibidores da MAPK (U0126) e da PI3K (Wort). A. Neurônios marcados com TUJ1 após 7 dias de diferenciação em cultura e tratados farmacologicamente com DMSO (controle), U0126 (inibidor da MAPK) ou Wortmannin (inibidor da PI3K). B. Neurônios tratados com U0126 apresentaram um aumento no número de neuritos, enquanto os tratados com Wortmannin (Wort) não apresentaram diferenças significativas sobre parâmetros de crescimento neuronal avaliados. (DMSO, n = 18 / U0126, n = 12 / Wort, n = 35). * p<0,05, comparado ao tratamento controle (DMSO) usando Mann-Whitney test.

4.2.1.1 Tamanho do Soma Neuronal

Para mensurar o tamanho médio do soma de neurônios corticais gerados a

partir de neurosferas e tratados farmacologicamente com inibidores da PKA,

Resultados 48

CaMKII, MAPK e PI3K, usamos o programa ImageJ para desenhar o contorno do

corpo celular e calcular a área. Não foram encontradas mudanças significativas de

tamanho no soma entre os grupos testados (Figura 9).

A B

Figura 9: Tamanho do soma de neurônios corticais tratados farmacologicamente com os bloqueadores de kinases. O tamanho do soma de neurônios corticais não apresentou diferença significativa em comparação ao controle (DMSO) quando tratados com H-89 (inibidor de PKA), KN-62 (inibidor da CaMKII), U0126 (inibidor da MAPK) e Wortmannin (inibidor da PI3K). A. Visão geral do soma de neurônios corticais após 7 DIV. B. Tamanho do soma em µm

2. (DMSO, n = 22 / H-89, n = 12

/ KN-62, n = 44 / U0126, n = 29 / Wort, n = 37). Quantificação através de ANOVA.

4.2.2 Manipulações farmacológicas e genéticas - Culturas primárias de

neurônios corticais


foram dissociadas e plaqueadas para diferenciação. Após 2 horas, células foram

infectadas com retrovirus carregando plasmídeo com o gene para a proteína

fluorescente verde (GFP) e o gene A-CREB ou CREB-FY (o grupo controle continha

apenas a proteína fluorescente verde - GFP) (Figura 10). Passadas 24 horas, as

culturas receberam tratamento farmacologógico com os inibidores de kinase já

cidados anteriormente, Imagens dos neurônios expressando GFP foram capturadas

em microscópio de fluorescência, aumento de 20x, e seus neuritos foram

desenhados no programa Image J. No total foram desenhados e analizados 302

neurônios (GFP: n = 22; GFP + DMSO, n = 22; A-CREB: n = 36; CREB-FY, n = 19;

GFP + H-89: n = 33; CREB-FY + H-89: n = 30; GFP + KN-62, n = 34; CREB-FY: +

KN-62: n = 31; GFP + U0126, n = 24; CREB-FY + U0126, n = 24; GFP + Wort, n =

25; CREB-FY + Wort, n = 12).

Resultados 49

Figura 10: Neurônios GFP-positivos. Neurônios corticais após 7 DIV expressando a proteína fluorescente verde (GFP). Aumento de 20x. Barra de calibração: 25 µm.

Resultados 50

4.2.2.1 Comprimento dos neuritos

Em condições basais, o fator de transcrição CREB, não parece exercer função

sobre o comprimento médio dos neuritos, uma vez que não houve diferença

significativa entre o grupo controle, o A-CREB e o CREB-FY (Figura 11).

Embora a inibição da PKA pelo H-89 e a inibição da CaMKII pelo KN-62

tenham reduzido significativamente o comprimento médio dos neuritos (Figura 11), o

CREB-FY conseguiu recuperar a nível do controle o tamanho médio dos neuritos em

neurônios tratados com H-89 (CREB-FY + H-89), indicando a participação da via de

sinalização da PKA na ativação do CREB sobre o crescimento neurítico.

Contr

ole

A-C

REB

CREB-F

Y

GFP

+ H

-89

CREB-F

Y + H

-89

GFP

+ K

N-6

2

CREB-F

Y + K

N-6

2

GFP

+ U

0126

CREB-F

Y + U

0126

GFP

+ W

ort

CREB-F

Y + W

ort

0

20

40

60

***

*

Co

mprim

ento

do

s n

eurito

s (m

)

Figura 11: Comprimento médio de cada neurito (µm). Para a avaliação desse parâmetro morfológico, consideramos a média do comprimento de todos os neuritos, do total de neurônios analisados. O A-CREB não teve ação sobre o comprimento neurítico médio. A inibição da PKA (GFP + H-89) e da CaMK (GFP + KN-62) reduziu em aproximadamente 60% e 50%, respectivamente, o comprimento médio dos neuritos. A expressão do CREB-FY conjuntamente à inibição da PKA (CREB-FY + H-89) foi suficiente para recuperar os valores para níveis normais (similares ao controle). Os valores são médias + sem * p<0,05 e ** p<0,01; ANOVA pós-teste de Dunnett.

As vias de sinalização da MAPK e da PI3K não agem sobre o comprimento

médio dos neuritos e os valores obtidos nos grupos CREB-FY + U0126 e CREB-FY

+ Wort indicam que a ativação do CREB através dessas duas vias de sinalização

Resultados 51

não está exercendo influência sobre a variável avaliada, ou seja, o comprimento

médio dos neuritos neuronais.

4.2.2.2 Soma dos comprimentos dos neuritos

A avaliação desse parâmetro morfológico indicou que a atividade do CREB

altera o comprimento total dos neuritos, ou seja, a soma dos comprimentos de todos

os neuritos de um neurônio. Com a inibição do CREB endógeno (grupo A-CREB)

houve uma diminuição significativa (41%) no comprimento total dos neuritos (Figura

12).

Con

trole

A-C

REB

CREB-F

Y

GFP

+ H

-89

CREB-F

Y + H

-89

GFP

+ K

N-6

2

CREB-F

Y + K

N-6

2

GFP

+ U

0126

CREB-F

Y + U

0126

GFP

+ W

ort

CREB-F

Y + W

ort

0

300

600

900

1200

1500

**

*** ******

So

ma d

os c

om

pri

men

tos

do

s n

eu

rito

s (

m)

Figura 12: Soma dos comprimentos dos neuritos (µm). Essa variável foi analisada levando-se em consideração o valor da soma dos comprimentos dos neuritos de cada neurônio. O H-89 e o KN-62 reduziu significativamente a soma dos comprimentos dos neuritos. O CREB-FY, expresso concomitante ao bloqueio farmacológico, não recuperou os valores para níveis similares ao controle. ** p<0,01 e ***p<0,001; quantificação através de ANOVA.

Quando a PKA (GFP + H-89) e a CaMKII (GFP + KN-62) foram inibidas,

observamos uma redução significativa (*** p < 0,001) na soma dos comprimentos

dos neuritos (94% e 80%, respectivamente), ao passo que a inibição das vias da

MAPK e da PI3K não causaram alterações de comprimento. Apenas o efeito do

bloqueio da PKA pôde ser parcialmente revertido com a expressão de CREB-FY,

Resultados 52

porém não para o nível dos controles. O efeito do bloqueio da CaMKII não pode ser

revertido, nem mesmo parcialmente, com o CREB-FY. Contra-intuitivamente, a

expressão de CREB-FY em neurônios tratados com U0126 e Wortmannin reduziu a

soma dos comprimentos dos neuritos (Figura 12).

4.2.2.3 Neurito mais longo

Mensuramos o comprimento dos neuritos que partiam do soma, ou seja, os

neuritos primários; a fim de avaliar o maior tamanho que podiam atingir (em

micrômetros). De acordo com o gráfico (Figura 13), pode-se notar que o fator de

transcrição CREB exerce um importante papel no crescimento do maior neurito

primário. Quando comparado ao controle, a expressão do A-CREB reduziu em 55%

o comprimento do neurito mais longo.

Todos os fármacos reduziram significativamente o comprimento do neurito

mais longo (H-89: 92%; KN-62: 85%; U0126: 37% e Wort: 47%), sendo mais

acentuada a redução gerada pelo bloqueio da PKA (H-89), CaMKII (KN-62), PI3K

(Wort) e MAPK (U0126), nessa ordem.

Em nenhum dos casos onde o CREB-FY foi expresso concomitante ao

bloqueio farmacológico (CREB-FY + H-89; CREB-FY + KN-62; CREB-FY + U0126 e

CREB-FY + Wort), houve recuperação para comprimentos próximos aos do controle.

Porém, a expressão de CREB-FY recuperou parcialmente o efeito do bloqueio da

PKA. Mais uma vez de forma contra-intuitiva, a expressão de CREB-FY em

neurônios tratados com U0126 e Wortmannin afetou de maneira mais intensa o

crescimento do neurito mais longo do que o tratamento com as drogas apenas.

Resultados 53

Con

trole

A-C

REB

CREB-F

Y

GFP

+ H

-89

CREB-F

Y + H

-89

GFP

+ K

N-6

2

CREB-F

Y + K

N-6

2

GFP

+ U

0126

CREB-F

Y + U

0126

GFP

+ W

ort

CREB-F

Y + W

ort

0

150

300

450

600

750

****

*** ***

**

Neu

rito

mais

lo

ng

o (

m)

Figura 13: Comprimento do neurito mais longo (µm). O A-CREB, assim como o bloqueio das quatro vias (PKA, CaMKII, MAPK e PI3K) pelos fármacos correspondentes (H-89, KN-62, U0126 e Wort) reduziu significativamente o comprimento do neurito mais longo. Em nenhum dos grupos, o CREB-FY recuperou o comprimento do neurito mais longo. * p<0,05; ** p<0,01 e ***p<0,001; quantificação através de ANOVA.

4.2.2.4 Número total de neuritos (Primários x Ramos)

A árvore dendrítica cresce pela adição e elongação de ramos: dendritos

primários emergem do corpo neuronal, e ramificam para formar dendritos

secundários e terciários.

A padronização precisa dos dendritos é importante na determinação de como

a informação é processada pelo neurônio (VETTERET al., 2001; SCHAEFER et al.,

2003). Quando há um decréscimo anormal no número de ramos dendríticos no

neurônio, este não consegue receber informação apropriadamente, e

consequentemente resulta na ruptura da rede de sinalização adequada (CHEN et

al., 2005). Assim, existe um grande interesse em entender como o número de

dendritos de um neurônio é determinado

Foi possível observar que o fator de transcrição CREB exerce influência sobre

o número total de neuritos do neurônio, uma vez que a expressão do dominante

Resultados 54

negativo A-CREB reduziu significativamente (p < 0,01) a quantidade total de

neuritos, embora a expressão da sua forma ativa, o CREB-FY, não tenha

aumentado essa quantidade quando comparado ao grupo controle. Pelo gráfico

(Figura 14) pode-se perceber que essa redução no número total de neuritos deve-se

à diminuição significativa do número de ramos, uma vez que o número de neuritos

primários manteve-se praticamente similar entre os três grupos (Controle: 6,18; A-

CREB: 5,06; CREB-FY: 6,16).

O fármaco H-89, inibidor da PKA, reduziu drasticamente o número total de

neuritos, diminuindo significativamente não só o número de neuritos primários

(Figura 14, barras brancas) quanto também, de forma bem mais acentuada, o

número de ramos por célula (Figura 14, barras pretas). Essa ampla redução no

número total de neuritos ocasionada pela droga H-89 (cerca de 74% em relação ao

controle) não foi amenizada pela expressão concomitante do CREB-FY, que não

recuperou, nem mesmo para valores próximos aos do controle, a quantidade total de

neuritos. Semelhantemente, o KN-62, inibidor da CaMK, reduziu o número total de

neuritos por célula, embora em menor porcentagem (61%). Esse efeito, como no

caso do H-89, também se deu pela redução significativa do número de neuritos

primários (25%) e foi, principalmente, influenciado pela redução do número de ramos

(75%).

O U0126, inibidor da MAPK, não causou diminuição nem no número total de

neuritos nem no número de neuritos primários, embora tenha havido uma redução

(54%) do numero total de neuritos quando da manipulação conjunta do fármaco com

o CREB-FY. Exatamente o mesmo ocorreu com o Wortmannin, inibidor da PI3K;

embora a redução do número total de neuritos quando foi feita a manipulação

farmacológica e genética juntas tenha sido inferior (30%) à redução causada pelo

U0126 (54%).

Resultados 55

Figura 14: Número total de neuritos por neurônio: Primários e Ramos. O número total de neuritos está diminuído quando o CREB endógeno é bloqueado com seu dominante negativo A-CREB. O bloqueio da via da PKA (GFP + H-89), além de reduzir significativamente o número total de neuritos, também reduziu o número de neuritos primários. O bloqueio da CaMKII (GFP + KN-62) diminuiu apenas o número total de neuritos, mas não o número de neuritos primários. O CREB-FY, não foi capaz de recuperar as alterações causadas pelos bloqueios farmacológicos; enquanto que juntamente com o U0126 e o Wort acabou por provocar a redução do número total de neuritos. * p<0,05; ** p<0,01 e *** p<0,001; quantificação através de ANOVA.

Resultados 56

4.2.2.5 Número de bifurcações por neurônio

Consideramos como bifurcação o local onde o neurito se ramifica ou se

separa em dois e quantificamos o número de vezes que os neuritos de um neurônio

bifurcam ou ramificam. O A-CREB reduziu o número de bifurcações em 36% (A-

CREB: 10,86 + 6,76) quando comparado ao grupo controle (controle: 17,27 + 7,74;),

embora o CREB-FY não tenha aumentado esse número, mantendo os valores

praticamente iguais aos do grupo controle (Figura 15).

A inibição das vias da PKA (GFP + H-89) e da CaMKII (GFP + KN-62)

diminuiu enormemente o número de bifurcações de cada célula neuronal. Já a

inibição das outras duas vias, MAPK e PI3K (GFP + U0126 e GFP + Wort,

respectivamente) não provocou alteração alguma. Por outro lado, o número de

bifurcações totais por neurônio decaiu para todos os grupos onde as manipulações

farmacológicas foram realizadas em conjunto a expressão genética do CREB-FY

(CREB-FY + H-89; CREB-FY + KN-62; CREB-FY + U0126; CREB-FY + Wort)

(Figura 15).

Figura 15: Número de bifurcações por neurônio. A expressão do dominante negativo A-CREB, assim como o bloqueio da PKA (H-89) e da CaMKII (KN-62) reduziram significativamente o número de bifurcações por neurônio, ou seja, os neuritos ramificaram menos que o normal. Por algum motivo desconhecido, a expressão do CREB-FY juntamente com o bloqueio farmacológico (CREB-FY + H-89, KN-62, U0126 ou Wort) provocou uma diminuição do número de bifurcações neuronais; talvez por aumentar estabilidade dos neuritos. * p<0,05; ** p<0,01 e ***p<0,001; quantificação através de ANOVA.

Resultados 57

4.2.2.6 Número de bifurcações por neurito

Uma relação entre o número total de neuritos e o número de bifurcações por

neurônio foi feita a fim de se obter o número médio de bifurcações por neurito

(bifurcações por neurito = n° total de neuritos / n° de bifurcações por neurônio). A

partir do gráfico (Figura 16) pôde-se observar que esse parâmetro morfológico não

sofreu influência do fator de transcrição CREB, uma vez que a inibição da sua

atividade a partir do seu dominante negativo A-CREB não reduziu nem aumentou o

número de bifurcações por neurito.

Com exceção do bloqueio da CaMKII (GFP + KN62) que aumentou o número

de bifurcações por neurito em cerca de 39% (Controle: 1,44 + 0,26; GFP + KN-62:

2,34 + 1,40), efeito este que foi abolido pela expressão concomitante do CREB-FY

(Figura 16), as demais drogas (H-89, U0126 e Wort) inibidoras das vias de

sinalização da PKA, MAPK e PI3K, respectivamente, não causaram alterações no

número de bifurcações por neurito, da mesma forma que a expressão de A-CREB e

CREB-FY não o fizeram.

Con

trole

A-C

REB

CREB-F

Y

GFP

+ H

-89

CREB-F

Y + H

-89

GFP

+ K

N-6

2

CREB-F

Y + K

N-6

2

GFP

+ U

0126

CREB-F

Y + U

0126

GFP

+ W

ort

CREB-F

Y + W

ort

0

1

2

3

*

Nd

e b

ifu

rcaçõ

es p

or

neu

rito

Figura 16: Número de bifurcações por neurito. O número de vezes que um neurito bifurca ou ramifica não sofreu alteração em nenhum dos grupos, exceto para o KN-62, onde houve um aumento. * p<0,05; quantificação através de ANOVA.

Resultados 58

4.3 ANÁLISE DA SOBREVIVÊNCIA - VÍDEO-MICROSCOPIA

Para acompanharmos, por vídeo-microscopia, a progênie dos progenitores do

telencéfalo dorsal, as células em cultivo foram infectadas com retrovírus carregando

o gene para GFP apenas (controle), A-CREB + GFP ou CREB-FY + GFP após duas

horas de cultivo. Estes vírus são caracterizados pela sua incapacidade de

reprodução e pela incompetência de transportar seu material genético para o núcleo

de células não mitóticas. Desta forma, apenas as células em mitose durante o

período de atividade viral incorporam o seu material genético contendo o gene da

proteína GFP, a qual é transmitida para as células filhas, que a expressam

permitindo a análise dos clones gerados a partir de um progenitor.

Células GFP-positivas nos diferentes grupos foram acompanhadas por um

período de 84h, permitindo a quantificação da taxa de morte celular nos diferentes

grupos (ver metodologia). Nossos dados demonstraram que o fator de transcrição

CREB exerce um papel importante para a sobrevivência de neurônios corticais em

cultura, uma vez que a inibição dessa molécula feita pelo dominante negativo A-

CREB reduziu significativamente a taxa de neurônios (%) que sobrevivem a partir de

60h in vitro (Figura 17).

12 24 36 48 60 72 84

50

60

70

80

90

100Controle

A-CREB

CREB-FY***

*** *

Tempo (h)

So

bre

viv

ên

cia

acu

mu

lad

a (

%)

Figura 17: Taxa de sobrevivência neuronal (%). As células em cultura foram infectadas com o retrovírus carreando os plasmídeos com o gene GFP (Controle), A-CREB (dominante negativo) e CREB-FY (forma constitutivamente ativa). As culturas foram submetidas à vídeo-microscopia por 84h. Pôde-se observar que a inibição do CREB endógeno, feita pelo A-CREB, reduziu 12,53% (*** p<0,001) a sobrevivência em 60h, 13,45% (*** p<0,001) em d3 e 7,94% em 84h (* p<0,05).

Resultados 59

4.4 DENSIDADE DE CÉLULAS NEURONAIS

Durante as análises morfológicas dos neurônios corticais em cultura na

presença de bloqueadores de kinases, observamos que em algumas condições o

número de neurônios parecia menor do que nos controles. Tendo em vista o efeito

de tais kinases sobre a fosforilação do CREB e a importância deste evento para a

sobrevivência neuronal, é possível que nos experimentos com drogas estivéssemos

afetando a geração e/ou sobrevivência neuronal.

Com a finalidade de avaliar a taxa de neurogênese (geração + sobrevivência)

em culturas expostas a diferentes tratamentos com bloqueadores de kinases, foram

quantificadas as densidades de neurônios após 7 dias in vitro. Um total de 50

imagens (10 por variável: DMSO, H-89, KN-62, U0126 e Wort), adquiridas no

microscópio de fluorescência da Zeiss (aumento de 20x), foram analisadas.

Contagens do número de células MAP2-positivas e do número de núcleos celulares

corados com DAPI (MAP2/DAPI) foram feitas a fim de determinarmos a densidade

de células neuronais nos cultivos primários que foram submetidos aos ensaios

farmacológicos. Os cultivos primários tratados com os inibidores da PKA (H-89),

CaMKII (KN-62) e Wort (PI3K) tiveram uma redução significativa da densidade

celular, sugerindo que, quando bloqueadas essas vias de sinalização interferem na

quantidade de neurônios existentes em cultura após 7 dias in vitro. Enquanto que o

bloqueio da PKA e da CaMKII reduziu em cerca de 52% a densidade neuronal em

cultura, o bloqueio da PI3K reduziu esses valores em 61% (Figura 18).

DM

SOH-8

9

KN-6

2

U01

26

Wort

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

****

***

MA

P2 /

DA

PI

Figura 18: Densidade de neurônios em cultura. A proporção de neurônios (células MAP2-positivas) em relação ao número de células totais (DAPI) decaiu significativamente em culturas tratadas farmacologicamente com o H-89, KN-62 e Wort (inibidores da PKA, CaMK II e PI3K, respectivamente).** p<0,01; *** p<0,001, quantificação através de ANOVA.

Discussão 60

5 DISCUSSÃO

Assim como em nosso trabalho, cultivos primários de células corticais têm

sido usados extensivamente no estudo da diferenciação e sobrevivência celular

(veja, por exemplo: COSTA et al., 2007, 2009a; BARTKOWSKA et al., 2007).

Nossos cultivos celulares foram feitos a partir de progenitores do telencéfalo dorsal

embrionário (E14 e E18). Além da importância desses progenitores para o

desenvolvimento do córtex cerebral, que potencialmente contribuiriam para a

geração de diferentes tipos de neurônios glutamatérgicos encontrados nesta

estrutura, estas células apresentam um elevado potencial terapêutico.

Em nenhum lugar, o ditado ''a forma segue a função'' é mais apropriado do

que no campo da neurobiologia. O desenvolvimento da arborização dendrítica é

especialmente importante, já que este é o local primário em que o input sináptico é

integrado na célula. Fatores que influenciam a morfologia dendrítica incluem pistas

genéticas intrínsecas, pistas extrínsecas, tais como fatores de crescimento e

neurotrofinas, e input sináptico vindo de outros neurônios. A árvore dendrítica é

esculpida de maneira altamente dinâmica por meio da adição e eliminação de

dendritos, assim como elongação e ramificação. A ostentação incrivelmente diversa

de estruturas dendríticas vistas dentre as várias classes de neurônios é uma das

indicações do quão fortemente ligada à função é a forma de um neurônio (ALVANIA;

CHEN; GINTY, 2006). Experimentos clássicos onde o estímulo sensório é

bloqueado demonstram que a atividade neuronal é necessária para a apropriada

arborização dendrítica (RAJAN; CLINE, 1998; REDMOND; KASHANI; GHOSH,

2002; LOHMANN; MYHR; WONG, 2002). Nosso trabalho tem o objetivo de avaliar

os efeitos da arborização dendrítica em estados basais, ou seja, sem aplicação

alguma de estímulos, diferentemente da maioria dos trabalhos já descritos na

literatura, que aplicam algum tipo de estímulo externo, como despolarização

neuronal com o uso de KCl (REDMOND; KASHANI; GHOSH, 2002), por exemplo.

A partir de nossos experimentos, observamos que tanto o H-89, quanto o KN-

62, inibidores da Proteína Kinase A (PKA) e da Proteína Kinase Ca2+/Calmodulina-

dependente II (CaMKII), respectivamente, exercem grande influência sobre

crescimento neurítico, tanto em nosso modelo de cultivo de neurônios derivados de

neurosfera quanto em culturas primárias de neurônios corticais. Estes efeitos foram

recuperados, total ou parcialmente, pela expressão do CREB-FY, indicando que os

Discussão 61

efeitos da PKA e CaMKII sobre o crescimento de neuritos em condições basais é

dependente de CREB. De acordo com esta interpretação, o tratamento com o

inibidor H-89 provoca uma redução de 53% na transcrição dependente de CRE,

enquanto a superexpressão da subunidade catalítica da PKA aumenta de 3 vezes

na ativação da transcrição CRE-dependente (LIANG et al., 2008). Da mesma forma,

a regulação transcricional positiva de genes CRE-dependentes induzidos por PKA é

completamente bloqueada pela inativação endógena do CREB com dominantes

negativos (dn-CREB133: mutado no site de fosforilação especifica da PKA, a Serina

133, evitando assim a transcrição; e dn-KCREB: mutado no domínio de ligação ao

DNA, bloqueando assim a habilidade do CREB em ligar-se à CRE) (LIANG et al.,

2008). Em conjunto, nossos resultados e os de Liang e colaboradores demonstram a

competência da sinalização via PKA em ativar genes CRE-dependentes via CREB

em neurônios.

Por outro lado, nem todos os efeitos observados sobre o crescimento

neurítico após o bloqueio da PKA e CaMKII foram recuperados pela expressão de

CREB-FY. De maneira similar, nem todos os efeitos foram mimetizados com a

expressão de A-CREB, indicando que CREB não seria o único alvo da PKA e

CaMKII envolvidas no crescimento neurítico. Por exemplo, a redução no número de

neuritos totais do neurônio ocasionada pela droga H-89 é tão acentuada (diminuição

de 90% em relação ao controle) que a expressão do CREB-FY não consegue

recuperar para valores próximos aos do controle a quantidade de neuritos,

possivelmente devido a participação de outras vias de sinalização por PKA

independentes de CREB.

Os efeitos do bloqueio da PKA observados em nossos estudo poderiam estar

associados com a estabilidade de microtúbulos. De fato, MAP2 (Microtubule-

associated protein 2), a MAP mais abundante no cérebro, está principalmente

localizada em compartimentos somatodendríticos dos neurônios e está envolvida na

associação dos microtúbulos e estabilização dos dendritos (GOEDERT et al., 1991;

MATUS, 1994). A MAP2 é também componente principal de pontes cruzadas

(ligações cruzadas) entre microtúbulos (MTs) ou entre MTs e outros componentes do

citoesqueleto nos dendritos, como já revelado por métodos de microscopia

(SHIOMURA; HIROKAWA, 1987; HIROKAWA et al., 1988). A superexpressão de

MAP2 resulta na agregação intracelular de MTs e formação de neuritos em células

não-neuronais (LEWIS et al., 1989; CHEN et al., 1992; TAKEMURA et al.,1992;

Discussão 62

HIROKAWA, 1994). Esses resultados indicam que MAP2 é essencial para o

crescimento dos dendritos por estabilizar os MTs. Sabe-se também que MAP2

possui um domínio de ligação à subunidade regulatória II da proteína kinase

dependente de cAMP (PKA) (VALLEE; DIBARTOLOMEIS; THEURKAUF, 1981;

THEURKAUF; VALLEE, 1982). Como a MAP2 é altamente concentrada no

citoesqueleto dendrítico, assume-se que é uma das principais proteínas de

ancoragem da PKA nos dendritos, e assim acredita-se que ela desempenha um

papel na transdução de sinal via PKA (HARADA et al., 2002). Esses mesmos

autores reportaram que MAP2 é importante como proteína estrutural e como

pronteína de ancoramento para a PKA em dendritos, cuja perda conduz a redução

de PKA nos dendritos e de PKA total, assim como provoca redução na ativação de

CREB. Por tudo isso, é tentador especular que os efeitos sobre o crescimento

dendrítico encontrados em nossas avaliações quando do bloqueio farmacológico da

PKA, sejam devido à intrínseca relação dessa via com MAP2 e a estabilização dos

microtúbulos dendríticos.

As proteínas kinase Cálcio/Calmodulina dependentes (CaMKs) também tem

sido implicadas no desenvolvimento dendrítico, no entanto quais das muitas

isoformas da CaMK estão envolvidas na arborização dendrítica é um ponto que tem

sido difícil de discernir. WAYMAN et al. (2006) fornece evidências da importância da

atividade da CaMKI (uma via de sinalização por cálcio ainda não descrita até então)

sobre a arborização dendrítica induzida por estímulo e sugere que a CaMKIV

desempenha um papel menos importante. Por outro lado, Redmond; Kashani;

Ghosh (2002) demonstram que a CaMKIV exerce sim influência sobre a morfologia

dendrítica atividade dependente. No entanto, as variações no modo de entrada de

cálcio poderiam explicar porque diferentes grupos observam requisitos distintos para

as várias vias de sinalização da CaMK (ALVANIA; CHEN; GINTY, 2006). Além de

revelar crosstalk entre as vias de sinalizações CaMK e Erk afetando a extensão do

prolongamento axonal em resposta a despolarização da membranda, SCHMITT et

al., 2004 também demonstraram que a CaMKI ativa a transcrição mediada por

CREB e que essa ativação é necessária para o crescimento dendrítico induzido pela

atividade. Tomados conjuntamente, esses achados sugerem que tanto a CaMKI

quanto a CaMKIV estão envolvidas no processo de ativação do CREB dependente

de atividade e no crescimento dendrítico, embora suas relativas contribuições devem

depender do tipo neuronal e da natureza do estímulo (ALVANIA; CHEN; GINTY,

Discussão 63

2006). De forma geral, a atividade da CaM Kinase IV (CaMKIV), mas não da CaMKII

(REDMOND; KASHANI; GHOSH, 2002) e a atividade da CaMKI (WAYMAN et al.,

2006) têm sido apontadas quando se fala em crescimento dendrítico dependente de

atividade.

Nossos resultados sugerem que em estados basais, sem aplicação de

estímulo externo, outra isoforma da CaMK, a CaMKII, exerce papel sobre a

morfologia dendrítica. Vários parâmetros da morfologia neuronal foram alterados

pelo tratamento com KN-62 e apenas algumas destas alterações puderam ser

parcialmente revertidos com a expressão de CREB-FY, indicando que a sinalização

por CamKII é importante para o crescimento de neuritos em neurônios imaturos. O

fato de não conseguirmos reverter os efeitos com CREB-FY podem indicar que a

CaMKII está agindo por outras vias ou que a maior tendência de fosforilação do

CREB-FY pela PKA não permita a recuperação (DU et al., 2000).

As outras duas vias de sinalização inibidas em nossos experimentos, MAPK e

PI3K, não parecem exercer grande influência sobre o crescimento neurítico em nível

basal (exceto em relação ao neurito mais longo, cujo comprimento mostrou-se

diminuído). No entanto, outros trabalhos na literatura tem sugerido um papel da

MAPK e PI3K sobre o crescimento neurítico (GHOSH; GREENBERG, 1995;

POSERN et al., 2000; WU; DEISSEROTH; TSIEN, 2001), principalmente em

condições de despolarização forçada dos neurônios em cultura. Por exemplo, o

aumento do crescimento dendrítico induzido por KCl é suprimido tanto por KN62

quanto por U0126, indicando que tanto a CaM kinase quanto a MAPK contribuem

para o crescimento dendrítico dependente de atividade/cálcio (GHOSH;

GREENBERG, 1995). As diferenças entre estes trabalhos e os nossos resultados

podem ser explicadas pelo fato de não utilizarmos quaisquer estímulos que

induzissem a despolarização neuronal.

Existem consideráveis evidências de que o BDNF regula o crescimento

dendrítico durante o desenvolvimento, mas os mecanismos permanecem incertos. A

fim de identificar vias de sinalização mediando os efeitos por BDNF sobre o

crescimento dendrítico, Finsterwald et al. (2010) estimularam neurônios corticais

com BDNF na presença ou ausência de inibidores farmacológicos específicos da

MAPK e PI3K e a morfologia dos dendritos foi subsequentemente analisada. Em

comparação a culturas que não foram estimuladas, os neurônios expostos a BDNF

exibiram um número aumentado de pontos de ramificação e comprimento total dos

Discussão 64

dendritos, um efeito que foi totalmente abolido pelo inibidor da MAPK, o U0126.

Contrariamente, o bloqueio da PI3K apenas atenuou, mas não preveniu os efeitos

do BDNF sobre a morfologia dendrítica. Em adição, a exposição de neurônios

corticais ao BDNF induziram fosforilação sustentada do CREB, que foi suprimido

pelo U0126. A expressão de A-CREB suprimiu o aumento no comprimento

dendrítico induzido por BDNF, sugerindo que a regulação do desenvolvimento

dendrítico por BDNF requer a transcrição de genes CREB-dependentes

(FINSTERWALD et al. 2010). A expressão de uma forma constitutivamente ativa de

MAPK foi suficiente para aumentar o comprimento total e o número de bifurcações

em neurônios corticais, embora a transfecção de neurônios corticais com a forma

constitutivamente ativa da PI3K não tenha aumentado a extensão nem a

complexidade dos prolongamentos dendríticos (FINSTERWALD et al., 2010). Esses

dados indicam que a ativação da cascada de sinalização da MAPK, mas não da

PI3K, é suficiente para aumentar o comprimento dendrítico e a arborização de

neurônios corticais.

Chan et al. (2011) também observaram que em camundongos knockout para

PIKE (Phosphoinositide 3-kinase enhancer), um ativador da PI3K, havia reduzida

dendritogênese. A fim de averiguar se a diminuição na atividade da PI3K era a

causa de tal fenômeno, neurônios corticais knockouts para PIKE foram infectados

com adenovírus superexpressando a forma selvagem PIKE-L; o dominante negativo

PIKE-L KS (PIKE-L K413A-S414N), o qual previne a estimulação da PI3K (RONG et

al., 2003) e as formas constitutivamente ativas da PI3K (PI3K-CA) e da Akt (Akt-CA).

Três dias após a infecção, a superexpressão, exceto do PIKE-L KS, aumentou

proeminentemente a complexidade dendrítica e, também, da morfologia das

espinhas dendríticas. A análise quantitativa revelou que o número de terminais e o

comprimento total dendrítico estavam marcantemente elevados em neurônios PIKE

-/- infectados com PIKE-L, PI3K-CA, e Akt-CA, fato esse que demonstra a influência

da PI3K sobre a morfologia dendrítica. O resultado contraditório dos nossos

experimentos pode ser devido à diferença no modo de bloqueio da via, pois

enquanto fizemos o bloqueio direto da PI3K com o Wort, os autores do artigo

utilizaram camundongos knockout para PIKE.

Conforme citado acima, o U0126, fármaco inibidor da MAPK, não causou

diminuição nem no número total de neuritos nem no número de neuritos primários,

embora tenha havido uma redução (54%) do numero total de neuritos quando da

Discussão 65

manipulação conjunta do fármaco com o CREB-FY, talvez por um aumento na

estabilização dos neuritos via CREB ativado (pCREB). Curiosamente, no entanto, a

expressão de CREB-FY na presença de bloqueadores da MAPK (e também da

PI3K) provocou uma diminuição do crescimento neurítico, especialmente no número

de neuritos e suas bifurcações. Esses resultados poderiam indicar que tanto a

MAPK quanto a PI3K agem através de vias CREB dependentes e independentes, de

modo que o balanço de ativação entre estas vias seria determinante do crescimento

neuronal.

Quanto ao tamanho do soma, nossos resultados revelaram não haver

alteração significativa do mesmo quando do bloqueio das vias da PKA, CaMKII,

MAPK e PI3K, indicando que os efeitos das nossas manipulações farmacológicas

eram específicas para os neuritos e não uma alteração generalizada do crescimento

celular. Em contraste, Chan et al. (2011) detectaram que a inibição da via da PI3K

reduz em 76.9% o corpo celular de neurônios corticais (E18) de camundongos

knockout para PIKE, potencialmente ligado à atividade reduzida da PI3K/Akt, uma

vez que PIKE normalmente se liga à PI3K/Akt elevando sua atividade. Essa redução

dos neuritos e do soma de neurônios em animais PIKE -/- pode ser um efeito

generalizado da mutação sobre o crescimento neuronal, ao invés de indicar um

efeito específico da PI3K sobre a arborização dendrítica.

A proporção de neurônios (células MAP2-positivas) em relação ao número de

células totais (DAPI) decaiu significativamente em culturas tratadas

farmacologicamente com o H-89, KN-62, e Wortmannin (Wort), o que sugere que o

bloqueio dessas vias (PKA, CaMKII e PI3K, respectivamente) interfere no número de

neurônios existentes ao final dos 7 dias de cultura. Essa observação nos inclina a

supor que tais vias estariam relacionadas à sobrevivência neuronal, embora esse

efeito de redução da densidade neuronal também possa ser devido a uma

diminuição na proliferação. De uma forma ou de outra, é fato que ao inibir qualquer

uma dessas vias, a redução na proporção MAP2/DAPI é significativamente elevada,

diminuindo a densidade neuronal para valores inferiores a 50%, o que pode ser

devido a uma menor sobrevivência dessas células quando tratadas com drogas que

inibem a PKA, CaMKII e PI3K. Além disso, as análises de vídeo-microscopia

revelaram que a expressão do A-CREB (inibição da atividade de CREB) ocasionou

uma redução significativa da sobrevivência neuronal a partir de 60h (2,5 dias) in

vitro, enquanto que a taxa de sobrevivência em células transfectadas com o CREB-

Discussão 66

FY permaneceu similar ao grupo controle. Conjuntamente, nossos dados indicam

que o bloqueio da sinalização mediada por CREB prejudica a sobrevivência

neuronal.

É possível que a expressão do CREB-FY não tenha sido suficiente para

recuperar os valores dos parâmetros morfológicos analisados quando comparado ao

grupo controle e aumentar a sobrevivência devido ao fato de o CREB-FY ser uma

forma mutada do CREB que é apenas mais facilmente fosforilada pela PKA (DU et

al., 2000). Talvez, repetir os experimentos fazendo uso de outra forma

constitutivamente ativa do CREB, como o CREB-s142l (RAVNSKJAER et al., 2007),

que contém uma alteração do aminoácido serina 142 por leucina e é suficiente para

estimular a transcrição gênica independentemente do aumento de AMPc intracelular

e consequentemente ativação de PKA. Essa abordagem talvez possa nos ajudar a

esclarecer e/ou confirmar nossos dados sobre a influências das vias de sinalização

da PKA, CaMKII, MAPK e PI3K sobre a diferenciação neuronal através da ativação

de CREB.

É razoável sugerir que o entendimento das vias moleculares envolvidas na

geração e sobrevivência de novos neurônios durante o desenvolvimento poderá

fornecer importantes informações para a elaboração de terapias celulares para o

tratamento de doenças neurodegenerativas e lesões isquêmicas ou traumáticas do

sistema nervoso central. De fato, um grande desafio na área de neuroterapia celular

tem sido identificar maneiras de melhorar a sobrevivência e a incorporação de

células transplantadas à circuitaria local. Por este motivo, acreditamos que a análise

sistemática dos mecanismos moleculares envolvidos na sobrevivência e

diferenciação neuronal (crescimento dendrítico/axonal) durante o desenvolvimento é

fundamental para a elaboração de estratégias eficazes ao reparo celular no sistema

nervoso adulto lesado.

Conclusões 67

6 CONCLUSÕES

I. Gerais

A sinalização por CREB afeta diferentes aspectos da diferenciação

neuronal, tais como sobrevivência e crescimento de neuritos,

independentemente de atividade sináptica;

Os efeitos da fosforilação de CREB por diferentes kinases sobre a

diferenciação neuronal são distintos, indicando a participação de

outras moléculas.

II. Cultura de neurônios corticais diferenciados a partir de neurosferas

A inibição da PKA e da CaMKII diminui o comprimento dos

neuritos;

A inibição da MAPK não afeta o comprimento, mas aumenta o

numero de neuritos;

O bloqueio da PI3K não altera a morfologia neuronal;

O tamanho do soma neuronal não parece estar sob influência das

proteínas kinase inibidas aqui (PKA, CaMKII, MAPK e PI3K).

III. Cultura primária de neurônios corticais

A ativação do CREB via PKA e CaMKII exerce influência sobre o

comprimento neurítico;

Alguns efeitos do bloqueio de kinases não podem ser explicados

apenas através da mediação por CREB;

A ativação de CREB na presença de bloqueadores da MAPK e

PI3K tem um efeito negativo sobre o crescimento neurítico.

IV. Densidade e Sobrevivência neuronal

A densidade neuronal em cultura estava significativamente

reduzida quando do bloqueio farmacológico das vias da PKA,

CaMKII e PI3K, mas não da MAPK;

A expressão do A-CREB diminuiu significativamente a

sobrevivência de neurônios corticais in vitro a partir de 60h;

Conclusões 68

Os neurônios expressando CREB-FY mantiveram uma taxa de

sobrevivência similar àquela observada no grupo controle.

Referências 69

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