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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ
CAMILA PASQUINI DE SOUZA
Efeito do tratamento prolongado com Insulina e Vitamina E no comportamento
relacionado ao medo em animais diabéticos
CURITIBA
2014
CAMILA PASQUINI DE SOUZA
Efeito do tratamento prolongado com Insulina e Vitamina E no comportamento
relacionado ao medo em animais diabéticos
Orientador: Janaína Menezes Zanoveli
CURITIBA
2014
Trabalho de Conclusão de Curso
apresentado ao Curso de Biomedicina
da Universidade Federal do Paraná
como requisito parcial à obtenção do
título de Biomédico.
RESUMO:
O diabetes é uma desordem metabólica crônica caracterizada pela hiperglicemia
resultante de uma debilitação no mecanismo regulatório de insulina. Sua
prevalência atualmente corresponde a 8% da população mundial, afetando em torno
de 382 milhões de pessoas (International Diabetes Federation, 2013). Estudos
apontam uma correlação positiva entre o diabetes e transtornos psiquiátricos, como
transtornos de humor, ansiedade e outros relacionados ao estresse. Muitos estudos
vêm sendo conduzidos com o intuito de compreender melhor os mecanismos
fisiopatológicos que relacionam o diabetes a estes transtornos psiquiátricos. As
causas dessas comorbidades permanecem ainda para serem elucidadas, embora
estudos apontem essas complicações psiquiátricas como consequência direta da
hiperglicemia crônica ou alterações bioquímicas decorrentes do diabetes, como o
aumento do estresse oxidativo. Tendo em vista o exposto acima, esse trabalho teve
como objetivo avaliar respostas comportamentais relacionadas a transtornos de
ansiedade e transtornos do estresse em animais com diabetes induzido por
estreptozotocina. Para avaliar os comportamentos relacionados a ansiedade, mais
especificamente o Transtorno de Ansiedade Generalizada (TAG), foi utilizado o
teste do labirinto em T elevado (LTE; avalia respostas de esquiva inibitória e fuga
que são relacionados a comportamentos de medo) e o teste de medo condicionado
contextual (MCC, sessão 1). Já para avaliar comportamentos relacionados a
transtornos de estresse, mais especificamente a extinção de memória condicionada
aversiva, foi utilizado o teste de MCC (avalia a resposta de congelamento associada
ao medo condicionado e também a extinção de memória condicionada aversiva). A
fim de entender uma possível relação da disrregulação da glicemia e de parâmetros
relacionados ao estresse oxidativo sobre os comportamentos avaliados no LTE e
MCC em animais diabéticos e normoglicêmicos, os animais foram tratados por 4
semanas com o hipoglicemiante insulina ou o antioxidante vitamina E. Animais
diabéticos tiveram um prejuízo na extinção da memória aversiva, o que não foi
revertido pelo tratamento com insulina. O tratamento com insulina e vitamina E
foram capazes de atenuar respostas associadas a ansiedade em ambos animais
normoglicêmicos e diabéticos. A vitamina E foi capaz, também, de melhorar a
extinção de memória aversiva em animais normoglicêmicos. Estudos mostram que
insulina é capaz de alterar os níveis serotoninérgicos, o que pode correlacionar com
seus efeitos ansiolíticos.
ABSTRACT:
Diabetes is a chronic metabolic disorder characterized by hyperglycemia resulting
from an impairment in the regulatory mechanism of insulin. Its prevalence currently
accounts for 8% of world population, affecting around 382 million people
(International Diabetes Federation, 2013). Studies have shown a positive correlation
between diabetes and psychiatric disorders such as mood disorders, anxiety and
other stress-related ones. Many studies have been conducted with the intention of
better understanding the pathophysiological mechanisms linking diabetes to these
psychiatric disorders. The causes of these comorbidities still remain to be elucidated,
although studies have indicated these psychiatric complications as a direct
consequence of chronic hyperglycemia or biochemical changes resulting from
diabetes, such as increased oxidative stress. In this regard, this study aimed to
evaluate behavioral responses related to anxiety disorders and stress disorders in
animals with streptozotocin-induced diabetes. To assess such behaviors related to
anxiety, specifically Generalized Anxiety Disorder (GAD), we used the elevated T
maze test (LTE, which evaluates inhibitory avoidance and escape responses that are
related to fear behavior) and the contextual fear conditioning test (MCC, session 1).
As to evaluate behaviors related to stress disorders, specifically the extinction of
conditioned aversive memory, MCC test was used (which assesses the freezing
response associated with fear conditioning and also the extinction of aversive
conditioned memory). In order to understand a possible relationship between blood
glucose dysregulation and parameters related to oxidative stress on the behaviors
evaluated in LTE and MCC in diabetic and normoglycemic animals, these animals
were treated for 4 weeks with the hypoglycemic insulin or the antioxidant vitamin E.
Diabetic animals had an impairment in the extinction of aversive memory, which
was not reversed by insulin treatment. Insulin and vitamin E were able to attenuate
responses associated with anxiety in both normoglycemic and diabetic animals.
Vitamin E was also capable of improving the extinction of aversive memory in
normoglycemic animals. Studies have shown that insulin is capable of altering the
levels of serotonin, which can be correlated with its anxiolytic effects.
SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA..........................................................................1 2. OBJETIVOS.............................................................................................................4 2.1. Objetivo Geral.................................................................................................4 2.2. Objetivos Específicos.....................................................................................4 3. MATERIAIS E MÉTODOS.......................................................................................5
3.1. Animais...........................................................................................................5 3.2. Indução do Diabetes por Estreptozotocina.....................................................5 3.3. Teste do Labirinto em T Elevado....................................................................5 3.4. Teste do Campo Aberto..................................................................................6 3.5. Teste do Medo Condicionado Contextual.......................................................6 4. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS...................................................................8 4.1. Experimento 1- Insulina.................................................................................8 4.2. Experimento 2- Vitamina E............................................................................8 4.3. Análise Estatística.........................................................................................9 5. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL.....................................................................10 6. RESULTADOS......................................................................................................11 6.1. Insulina........................................................................................................11 6.2. Vitamina E...................................................................................................13 7. DISCUSSÃO.........................................................................................................15 8. CONCLUSÕES.....................................................................................................20 9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................21
1
1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA
O diabetes melittus é uma doença metabólica crônica e sua prevalência
atualmente corresponde a 8% da população mundial, afetando em torno de 382
milhões de pessoas. Em nosso país, estima-se que sejam 11.9 milhões de casos, o
que coloca o Brasil na quarta posição dentre os dez países com maior prevalência
mundial (International Diabetes Federation, 2013).
Transtornos de ansiedade são alguns dos transtornos psiquiátricos mais
presentes dentre a população geral de pacientes com diabetes mellitus. Estima-se
que 40% dos pacientes diabéticos tenham um aumento de sintomas relacionados à
ansiedade e que a prevalência em geral de desordens de ansiedade nesses
pacientes seja aproxidamente 14% (Grigsby et al., 2002, Kessler et al., 2005;
Wittchen, 2001; Leray et al., 2011). As principais desordens de ansiedade
associadas a doenças metabólicas são o transtorno de ansiedade generalizada
(TAG) e o transtorno de pânico (Fava et al, 2010). Sabe-se que pacientes diabéticos
geram altos custos hospitalares, seu tratamento chegando a custar, nos Estados
Unidos por exemplo, 263 bilhões de dólares anualmente (International Diabetes
Federation, 2013). Além disso, esses pacientes sofrem de baixa produtividade,
incapacidade de realização de atividades cotidianas e aumento de mortalidade (Lin
et al., 2008). Comparados à população em geral, estudos mostram que pacientes
diabéticos possuem maior probabilidade de desenvolver transtornos de ansiedade e
transtornos relacionados ao estresse como o transtorno de estresse pós-traumático
(TEPT) (Simon et al., 1995; Lloyd et al., 2000; de Groot et al., 2001; Anderson et al.,
2002; Von Korff et al., 2005; Lin et al., 2004, 2008). Esses transtornos de ansiedade
são um fator de risco crucial para induzir uma piora no controle da glicemia
(Lernmark et al., 1999) e eles podem ainda contribuir para o desenvolvimento de
subsequentes complicacões diabéticas (de Groot et al., 2001) através do descuido
do controle glicêmico e da alimentação em geral, levando então a um aumento da
glicemia, gerando um ciclo de causa e consequência entre diabetes e esses
trantornos. As causas dessas comorbidades permanecem ainda por serem
elucidadas, embora estudos apontem essas complicações como conseqüência
direta da hiperglicemia crônica ou alterações bioquímicas decorrentes da mesma,
como o aumento do estresse oxidativo (Revsin et al., 2008).
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Sabe-se que células neuronais são especialmente sensíveis ao estresse oxidativo
pelo seu alto consumo de oxigênio, sua relativamente baixa resistência antioxidante
e sua constituição rica em lipídios (Bouayed, 2009). Espécies reativas de oxigênio
podem levar a dano tecidual e destruição de componentes celulares (lipídios,
proteínas e DNA), o que pode acarretar em morte celular. Em ratos diabéticos,
muitos desses danos tem sido observados. Assim, foi observado um aumento de
parâmetros indiretos de estresse oxidativo em regiões límbicas relacionadas à
memória e comportamento emocional, como no hipocampo e córtex pré-frontal de
animais com diabetes induzido pela administração de estreptozotocina (Saravia et
al., 2002; Revsin et al., 2005, 2009; de Morais et al., 2014). Aliado ao aumento do
estresse oxidativo em áreas encefálicas, estudos indicam que animais diabéticos
apresentam uma resposta comportamental do tipo depressiva e ansiogênica mais
pronunciada quando submetidos a modelos animais de depressão e ansiedade,
respectivamente (Ramanathan et al.,1998; Wayhs et al., 2010; Ho et al., 2012; de
Morais et al., 2014).
Estudos apontam que a insulina e sua sinalização são críticos para a
regulação de mecanismos de memória, regulação de outros neurotransmissores e
para a neuroproteção contra doenças neurodegenerativas (Hoyer and Lannert
2007). A sinalização intracelular regulada de insulina tem um papel putativo em
diversos aspectos da fisiologia do cérebro (Plum et al. 2005) e alterações nessas
vias tem sido consistentemente implicadas na etiologia de desordens psiquiátricas e
doenças neurodegenerativas (Hoyer and Lannert 2007).
A ausência do controle da hiperglicemia em pacientes diabéticos tem
consequências deletérias para o cérebro, como a potencialização da toxicidade
induzida por espécies reativas de oxigênio/nitrogênio e danos neurais (Dasgupta et
al., 2013). Em ratos foi observado que o consumo de dietas com altos níveis de
carboidratos levando a hiperglicemia aumenta a peroxidação lipídica no córtex
frontal e induz comportamento do tipo ansioso no teste do claro/escuro, sem alterar
a locomoção dos animais no campo aberto (Souza et al., 2007). Interessante que
Desrumaux e cols (2005) mostraram que a deficiência do antioxidante vitamina E no
cérebro de camundongos aumentou significativamente os níveis de marcadores
centrais de estresse oxidativo, tais como os níveis de peroxidação lipídica,
resultando também em comportamento do tipo ansiogênico.
3
O mecanismo de defesa antioxidante protege as células através da remoção
de espécies reativas de oxigênio. Estudos anteriores sugerem uma importante
correlação entre a atividade dessas espécies reativas e antioxidantes na
patofisiologia de várias desordens neuropsiquiátricas. A vitamina E é considerada a
primeira linha de defesa contra peroxidação lipídica, protegendo as membranas das
células do dano causado por espécies reativas de oxigênio. (Dragsted, 2008).
A insulina, como um hipoglicemiante e a vitamina E como um antioxidante
são, portanto, de grande importância para a manutenção de funções neuronais.
Com base no exposto e tendo em vista as alterações decorrentes da
hiperglicemia como o aumento de estresse oxidativo observados em animais com
diabetes, este estudo teve como objetivo investigar como o comportamento
relacionado ao medo do animal diabético difere do comportamento de animais
normoglicêmicos. Para tal, os animais tiveram o diabetes induzido pela
administração intraperitoneal de estreptozotocina e foram observados em modelos
animais capazes de avaliar respostas defensivas relacionadas com o Transtorno de
Ansiedade Generalizada (TAG), Transtorno do Pânico (TP) e Transtorno do
Estresse Pós-Traumático (TEPT). Os modelos utilizados para este fim foram o
labirinto em T elevado (LTE), um modelo animal que permite avaliar duas respostas
comportamentais, a esquiva inibitória e a fuga, relacionadas respectivamente com o
TAG e o TP (Zanoveli et al., 2003). Além disso, o teste de medo condicionado
contextual (MCC) foi realizado a fim de avaliar o comportamento desses animais
diabéticos em relação a aquisição do medo condicionado, bem como a extinção de
memórias aversivas, um modelo relacionado ao TEPT (Ninomiya et al., 2010).
A fim de entender uma possível relação da desrregulação da glicemia e de
parâmetros relacionados ao estresse oxidativo nos comportamentos defensivos
emitidos pelos animais diabéticos, foi estudado o efeito do tratamento prolongado
com drogas que atuam no controle da hiperglicemia, bem como no aumento do
estresse oxidativo.
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2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar o efeito do tratamento prolongado com o hipoglicemiante insulina, o
antioxidante vitamina sobre as respostas comportamentais emitidas após a
exposição em modelos animais que permitem avaliar respostas relacionadas com
TAG (esquiva inibitória e medo condicionado contextual), TP (resposta de fuga) e
TEPT (extinção de memória aversiva contextual) E em animais diabéticos
(hiperglicêmicos-DBT) e animais não diabéticos (normoglicêmicos-NGL).
2.2 Objetivos específicos
- Avaliar o comportamento de animais com diabetes induzido sobre as respostas
de esquiva inibitória, medo condicionado, fuga e extinção de memória condicionada
aversiva.
-Avaliar o tratamento prolongado com o hipoglicemiante insulina em animais
com hiperglicêmicos pelo diabetes sobre as respostas de esquiva inibitória, medo
condicionado, fuga e extinção de memória condicionada aversiva.
- Avaliar a influência do estresse oxidativo decorrente da indução do diabetes
através do tratamento prolongado com o antioxidante vitamina E sobre as respostas
comportamentais supracitadas.
- Avaliar a atividade locomotora de todos os animais após os diferentes
tratamentos no teste do campo aberto.
5
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Animais
Foram utilizados ratos Wistar machos, provenientes do biotério central da
Universidade Federal do Paraná (UFPR) - Curitiba, com peso entre 180-200g no
início do experimento. Os animais tiveram livre acesso a água e alimento e foram
mantidos sob ciclo de luz claro/escuro de 12 h (7:00 às 19:00 h) e temperatura
controlada em 22 ±1°C. Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com as
normas e legislações exigidas pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Animais da
UFPR (CEUA BIO/UFPR #668).
3.2 Indução do Diabetes por Estreptozotocina
Após a submissão de 12 horas de jejum, foi administrado via intraperitoneal
(ip) 60 mg/Kg/ml de estreptozotocina (STZ) (Sigma-Aldrich, EUA; grupo de animais
diabéticos-STZ). Três dias após, o diabetes foi confirmado. Para isso, amostras de
aproximadamente 5 µl de sangue da veia caudal foram adicionadas em fitas teste
impregnadas de glicose oxidase (Accu-Check ActiveTM, Roche) e foram
considerados ratos diabéticos (DBT) quando a glicemia foi igual ou superior a 250
mg/dL.
3.3 Teste do Labirinto em T Elevado
Habituação: Na quarta semana após a diabetização e após o tempo
determinado de cada tratamento, cada animal foi manipulado pelo experimentador
por 5 minutos. A seguir, este animal foi colocado por 5 minutos em uma gaiola de
acrílico (24 x 18 x 35 cm) com serragem no assoalho previamente à execução do
teste do LTE.
Pré-exposição: Logo após a habituação, cada animal foi exposto por 30
minutos a um dos braços abertos do labirinto em T elevado (LTE). Neste
procedimento, cada animal foi colocado individualmente em um dos braços abertos
do LTE isolado dos demais braços por uma parede de madeira, disposta na linha de
separação entre a área central do labirinto e porção proximal do braço aberto. A
pré-exposição tem por objetivo tornar a resposta de fuga potencializada,
favorecendo, dessa maneira a detecção do efeito de drogas. Esta potencialização
6
da resposta de fuga talvez ocorra por diminuir a atividade exploratória dos animais
quando recolocados em um dos braços abertos do LTE no dia do teste (Teixeira e
cols., 2000).
Teste: Vinte e quatro horas após a pré-exposição, 2 horas após a última
injeção de insulina ou 40 minutos após a última aplicação de vitamina E, os animais
foram testados no LTE. O teste foi iniciado pela tomada da esquiva inibitória. Para
tal, cada animal é colocado na extremidade distal do braço fechado e medido o
tempo gasto para a saída, com as quatro patas, deste braço (LATÊNCIA BASAL). A
mesma medida foi tomada por mais duas vezes com intervalos de 30 segundos
entre elas (ESQUIVA 1 e ESQUIVA 2). O tempo máximo de permanência do animal
neste braço, em cada uma das tomadas de esquivas, é de 5 minutos.
Trinta segundos após o término da tomada da ESQUIVA 2, foi avaliado o
comportamento de fuga. Para tal, cada animal foi colocado na extremidade do braço
aberto e medido o tempo gasto para a saída, com as quatro patas, deste braço
(FUGA 1). A latência de saída do braço aberto era medida por mais duas vezes
(FUGA 2 e FUGA 3) com intervalos de 30 segundos entre elas.
Trinta segundos após a tomada da FUGA 3, cada animal foi colocado
individualmente no campo aberto para observação da atividade locomotora.
3.4 Teste do Campo Aberto
O teste de campo aberto foi utilizado para avaliar a atividade locomotora dos
animais e foi efetuado imediatamente após o LTE. Para tal, os animais foram
colocados em uma arena retangular feita de madeira (50 cm de comprimento, 40 cm
de largura e 50 cm de altura), cujo assoalho é dividido em 6 seções. O número de
cruzamentos entre essas seções e a distância percorrida são avaliados como
parâmetros de atividade locomotora, durante 5 minutos. O campo aberto foi
cuidadosamente limpo após cada teste com uma solução de álcool etílico à 5% e
seco.
3.5 Teste do Medo Condicionado Contextual
O teste do medo condicionado contextual (MCC) consiste de 2 fases: a fase de
condicionamento e a fase teste. O condicionamento de medo contextual (sessão
treinamento) foi conduzido conforme descrito pelo nosso grupo de pesquisa
(Ninomiya et al., 2010) e conduzido nos mesmos animais com um intervalo de 48
7
horas após o teste no LTE e campo aberto. A câmara de condicionamento consiste
de uma caixa (26x31,5x21 cm; Insight, Ribeirão Preto, SP, Brasil). Três lados da
caixa são de aço e o quarto lado é de acrílico, o que permite a análise
comportamental do animal. O fundo da caixa consiste de espaços finos de metal
conectados a um estimulador elétrico que pode liberar choques elétricos nas patas
dos animais.
Duas horas após a última injeção, para a insulina e quarenta minutos após,
para a vitamina E, os ratos foram colocados na câmara de condicionamento por 3
minutos e então receberam um choque elétrico nas patas (1,5 mA, com duração de
1s). Após, os animais permaneceram na caixa por mais 1 minuto, retornando em
seguida para suas respectivas caixas.
- Sessão teste: consistiu em 3 sessões realizadas em dias consecutivos (S1,
S2 e S3). Assim, por 3 dias consecutivos os animais foram re-expostos às câmaras
de condicionamento por 9 minutos, mas sem receber o choque elétrico nas patas
(Sessão teste 1-3).
O comportamento de congelamento condicionado observado na S1 estaria
relacionado não apenas com a memória, mas também com a TAG; já a avaliação de
congelamento nas sessões S2 e S3 foram utilizadas como um índice de memória
seguindo a reexposição ao contexto (Bitencourt, 2008). Um animal foi considerado
em congelamento quando este apresentou uma posição de agachamento
estereotipada com completa imobilidade, com exceção de movimentos de
respiração.
8
4. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
Todos os experimentos foram realizados a partir da quarta semana após a
indução do diabetes com STZ. Apesar de alguns estudos de comportamento serem
realizados após 21 dias de indução do diabetes (Gomez e Barros, 2000; Wayhs et
al., 2010), dados prévios e recentes do nosso grupo de pesquisa mostram que após
28 dias esses animais apresentam alterações notórias no comportamento defensivo,
em processos relacionados ao estresse oxidativo como níveis de produtos da
peroxidação lipídica e atividade da superóxido desmutase, bem como na resposta
nociceptiva (Schreiber et al., 2012; de Morais et al., 2014).
4.1 Experimento 1 – Insulina: Efeito do tratamento prolongado com Insulina
sobre as respostas relacionadas à ansiedade- esquiva inibitória, medo
condicionado contextual e fuga, bem como de extinção de memória
condicionada aversiva
Neste estudo foi avaliado, em animais NGL e DBT, o efeito do tratamento
prolongado (28 dias) com insulina (via subcutânea (sc), 2UI entre 08:00 e 09:00h e
4 UI entre 17:00 e 18:00h ) ou seu veículo salina em animais controle
normoglicêmicos (NGL) e animais diabéticos (STZ) sobre as respostas de esquiva
inibitória e fuga (LTE), atividade locomotora (campo aberto) e medo condicionado e
extinção de memória condicionada aversiva (MCC). A última injeção de insulina foi
aplicada 2 horas antes dos teste do MCC.
4.2 Experimento 2-Vitamina E: Efeito do tratamento prolongado com vitamina
E sobre as respostas relacionadas à ansiedade- esquiva inibitória, medo
condicionado contextual e fuga, bem como de extinção de memória
condicionada aversiva
Neste estudo foi avaliado, em animais NGL e DBT, o efeito do tratamento
prolongado (28 dias) com vitamina E (via oral, 300 mg/kg, 1 x ao dia das 08:00 as
09:00h) ou seu veículo óleo de milho em animais NGL e DBT sobre as respostas de
esquiva inibitória e fuga (LTE), atividade locomotora (campo aberto) e medo
condicionado e extinção de memória condicionada aversiva (MCC). A última
aplicação de vitamina E foi dada por gavagem 40 minutos antes do teste do MCC.
9
4.3 Análise Estatística
O teste de Levene e Kolmogorov foi inicialmente empregado para assegurar que
os dados satisfaziam os critérios necessários de normalidade para se aplicar testes
paramétricos. Dados paramétricos foram expressos como média ± erro padrão da
média (EPM).
Os dados obtidos após o teste do LTE foram avaliados pela análise de variância
(ANOVA de 2 vias) com medidas repetidas para analizar ambos os dados, esquiva
inibitória e fuga, sendo o a latência de esquiva e fuga (em segundos) a variável
dependente e o tratamento e condição (NGL e DBT) as variáveis independentes,
com as tentativas (3 medidas de esquiva ou 3 medidas de fuga) como medidas
repetidas.
Para a análise da atividade locomotora, os dados foram submetidos à ANOVA
de 2 vias.
A análise dos dados após o teste de condicionamento ao medo contextual foi
feita pela ANOVA de duas vias, tendo o tratamento como fator independente e o
número de sessões teste (S1-S3) como o fator dependente.
Quando houveram diferenças estatísticas significativas após todas as ANOVAs
realizadas para cada dado, essas diferenças entre os grupos foram investigadas
aplicando, quando apropriado, o teste de múltipla comparação de Duncan. Um valor
de p ≤ 0,05 foi considerado significativo.
10
5. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Figura 1: Linha do tempo geral dos experimentos. Após 4 semanas de tratamento crônico com o
hipoglicemiante insulina (2 doses diárias, 2UI manhã/4UI tarde) ou o antioxidante vitamina E (via oral,
300 mg/kg, 1 x ao dia das 08:00 as 09:00h) iniciaram-se os testes comportamentais. LTE= teste do
labirinto em T elevado; MCC= teste de medo condicionado contextual; S1= sessão 1 do teste de
medo condicionado contextual; S2 e S3= sessões de teste para avaliar a extinção de memória
aversiva ao contexto.
- Após os testes comportamentais, os animais foram anestesiados com tiopental e
lidocaína e eutanasiados por decaptação de forma rápida e eficiente, com o mínimo
de sofrimento possível para os mesmos.
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6. RESULTADOS
6.1 Insulina
Esquiva Inibitória
Fuga
Figura 2: Efeito (média± SEM) do tratamento com insulina (INS, 6UI, s.c.) na esquiva inibitória (s)
(painel A) e latência de fuga (s) (painel B) em animais normoglicêmicos (NGL) e diabéticos (DBT)
submetidos ao teste do labirinto em T elevado. n = 7-8. * p<0.05 comparado ao grupo NGL/VEH; #
p<0.05 comparado ao grupo DBT/VEH
12
MCC
Figura 3: Efeito (média± SEM) do tratamento com insulina (INS, 6UI, s.c.) no comportamento de
congelamento em animais normoglicêmicos (NGL) e diabéticos (DBT) submetidos ao MCC. n = 7-8.
* p<0.05 comparado ao grupo NGL/VEH; # p<0.05 comparado ao grupo DBT/VEH.
Campo Aberto
Figura 4: Efeito (média± SEM) do tratamento com insulina (INS, 6UI, s.c.) no número de cruzamentos
em animais normoglicêmicos (NGL) e diabéticos (DBT) submetidos ao teste do campo aberto. n = 7-
8. * p<0.05 comparado ao grupo NGL/VEH; # p<0.05 comparado ao grupo DBT/VEH.
6.2 Vitamina E
Esquiva Inibitória
13
Fuga
Figura 5: Efeito (média± SEM) do tratamento com vitamina E (via oral, 300 mg/kg) na esquiva
inibitória (s) (painel A) e latência de fuga (s) (painel B) em animais normoglicêmicos (NGL) e
diabéticos (DBT) submetidos ao teste do labirinto em T elevado. n = 7-8. * p<0.05 comparado ao
grupo NGLVEH; # p<0.05 comparado ao grupo DBT/VEH
14
MCC
Figura 6: Efeito (média± SEM) do tratamento com vitamina E (via oral, 300 mg/kg) no
comportamento de congelamento em animais normoglicêmicos (NGL) e diabéticos (DBT) submetidos
ao MCC. n = 7-8. * p<0.05 comparado ao grupo NGL/VEH; # p<0.05 comparado ao grupo DBT/VEH.
Campo Aberto
Figura 7: Efeito (média± SEM) do tratamento com vitamina E (via oral, 300 mg/kg) no número de
cruzamentos em animais normoglicêmicos (NGL) e diabéticos (DBT) submetidos ao teste do campo
aberto. n = 7-8. * p<0.05 comparado ao grupo NGL/VEH; # p<0.05 comparado ao grupo DBT/VEH.
7. RESULTADOS E DISCUSSÃO
15
Este estudo teve como objetivo investigar respostas relacionadas ao medo
em animais diabéticos, mais especificamente respostas de ansiedade como esquiva
inibitória, medo condicionado contextual e fuga e também extinção de memória
contextual aversiva. Teve como objetivo também aprofundar os estudos
investigando se o controle de parâmetros relacionados ao diabetes como
hiperglicemia e o estresse oxidativo poderiam não só afetar esses comportamentos
relacionados ao medo, mas também servir como potenciais novos alvos no
tratamento do diabetes associado à estes transtornos neuropsiquiátricos.
A partir dos resultados obtidos nesse trabalho, foi possível observar uma
resposta relacionada ao medo mais pronunciada em animais diabéticos quando
comparados a animais normoglicêmicos. Esses animais, em geral, exibiram
respostas relacionadas ao TAG e TP, como a esquiva inibitória, mais significativas.
Além disso observamos um prejuízo na extinção de memória aversiva de animais
diabéticos ao longo das sessões de extinção (S2 e S3), quando em comparação
com os animais normoglicêmicos.
O tratamento crônico tanto com insulina quanto com vitamina E foi capaz de
atenuar algumas das respostas aversivas induzidas pela hiperglicemia e aumento
de estresse oxidativo que os animais diabéticos apresentaram. Os tratamentos
tiveram efeitos importantes sobre respostas relacionadas à ansiedade (Figuras 2 e
5), mas não sobre a extinção de memória contextual aversiva (Figuras 3 e 6) em
animais com diabetes induzido por estreptozotocina. Nossos resultados em relação
ao efeito ansiogênico observado em animais diabéticos corroboram com outros
estudos que relatam um aumento de respostas do tipo ansiogênicas em animais
com diabetes induzido por estreptozotocina (Gupta et al., 2014a, 2014b; Ates et al.,
2014)
O efeito observado em animais diabéticos nos testes realizados no labirinto em
T elevado sugere que esses animais apresentam em geral uma resposta do tipo
ansiogênica (Figuras 2 e 5). Um resultado interessante é a resposta avaliada dos
animais diabéticos no labirinto em T elevado, onde se observa um aumento na
latência de fuga desses animais (Figuras 2 e 5). Ao analisar esses resultados
através dos parâmetros do teste, essa resposta poderia ser considerada do tipo
panicolítica, o que não parece corroborar com as respostas altamente aversivas
observadas nesses animais. O diabetes traz diversas alterações no sistema
nervoso central associadas com hiperglicemia crônica, como hiperatividade do eixo
16
HPA, aumento dos níveis de glicocorticóides circulantes, aumento do estresse
oxidativo e desrregulação de neurotransmissores (Rowland and Bellush, 1989;
Kamei et al., 2003; Beauquis et al., 2008; de Morais et al., 2014). Esse aumento na
latência da fuga, observado em animais diabéticos expostos ao braço aberto do
labirinto em T elevado parece ser mais relacionado a uma maior susceptibilidade ao
estresse nesses animais do que de fato uma resposta panicolítica. Estudos
mostram que pré-tratamento numa dose sub-crônica de insulina (5 U/kg, s.c., 2
vezes ao dia) reverte o comportamento do tipo ansiogênico de camundongos
diabéticos expostos ao teste de estresse da plataforma aberta elevada (Myiata et
al., 2007). Esse comportamento do tipo ansiogênico foi correlacionado com uma
diminuição de secreção de serotonina no córtex pré-frontal e a melhora observada
no comportamento relacionado à ansiedade após o tratamento com insulina foi
também relacionada com a normalização dos níveis serotoninérgicos no cortéx pré-
frontal. Além disso, animais diabéticos que recebem uma estimulação elétrica na
área cinzenta periaquedutal dorsal (dPAG), um modelo de ataque de pânico,
também exibem um comportamento do tipo panicogênico mais intenso em
comparação com animais normoglicêmicos (Gambeta et al., dados ainda não
publicados). Esses animais que tem a dPAG estimulada eletricamente apresentam
um limiar bem menor de corrente elétrica necessária para evocar respostas de fuga,
o que sugere um efeito aversivo e panicogênico encontrado em animais diabéticos.
Esses estudos sugerem então que o aumento da latência de fuga observado em
animais diabéticos expostos ao braço aberto do labirinto seria na verdade
relacionado a um prejuízo nas respostas ativas de aversão e um aumento de
respostas passivas como o congelamento nesses animais, consequência essa do
alto nível de estresse em que eles se encontram.
O tratamento com vitamina E teve um efeito significativo do tipo ansiolítico em
animais diabéticos e normoglicêmicos (Figura 5). Vários estudos apontam que uma
sinalização redox desregulada pode ser crucial para a patogênese de várias
desordens neurológicas, incluindo as ligadas à ansiedade (Pascuan, 2014).
Espécies oxidativas são produzidas normalmente através de processos fisiológicos
e seu excesso é, geralmente, neutralizado por mecanismos antioxidantes. Mas, em
situações adversas, as defesas antioxidantes podem ser insuficientes, resultando
em mudanças estruturais e funcionais que podem levar a dano celular
(Ischiropoulos e Beckman 2003). Estudos mostram também uma correlação positiva
17
entre marcadores de estresse oxidativo, tanto periféricos quanto centrais, e
comportamentos ligados à ansiedade (Terada, 2011). A vitamina E parece então
exercer um efeito neuroprotetor, possivelmente em áreas cerebrais relacionadas ao
medo, através do seu potencial antioxidante. Não apenas isso, mas é relatado que a
vitamina E pode prevenir a morte de células neuronais através de uma diminuição
na atividade da ciclooxigenase-2 (Ezaki, 2005).
Além disso, durante o estresse, o eixo HPA é estimulado e a secreção de
glicocorticóides pela adrenal é elevada. Há estudos mostrando que o estresse
induzido por imobilização produz tanto estresse psicológico quanto físico. Essa
ativação do eixo HPA leva então à liberação de fator de liberação de corticotrofina
na região do locus coeruleus resultando, portanto, em uma resposta do tipo
ansiogênica. O resultado disso se manifesta através de alteração em respostas
comportamentais, secreção de hormônios de estresse como a corticosterona e
aumento de estresse oxidativo no cérebro. (Machawal et al., 2014). Essas respostas
parecem ser cruciais na regulagem de comportamentos relacionados à ansiedade e
ao estresse de condicionamentos aversivos. Estudos mostram que tratamento com
vitamina E diminui significativamente os níveis de corticosterona em animais
submetidos ao estresse do teste do labirinto em cruz elevado (Terada, 2011).
O tratamento com insulina foi capaz de induzir um efeito ansiolítico importante
tanto em animais diabéticos quanto normoglicêmicos (Figura 2- esquiva inibitória;
Figura 4- sessão 1 de MCC), sugerindo que o controle da glicemia induz efeitos
benéficos independente da condição desses animais. Esse mesmo efeito foi
observado por Gupta e cols (2014b) em camundongos diabéticos quando tratados
com insulina por 14 dias no teste do labirinto em cruz elevado e teste da caixa
claro/escuro.
Considerando que esse comportamento ansiogênico observado em animais
diabéticos seja, dentre outras razões, correlacionado a um desbalanço negativo nos
níveis serotoninérgicos no córtex pré-frontal desses animais (Myiata et al., 2007), a
melhora observada nesses animais através do tratamento crônico com insulina pode
ser relacionada com uma restauração desses níveis de serotonina. Outras
alterações benéficas induzidas pelo tratamento com insulina são associadas às
suas propriedades neuroprotetoras, pois a insulina é capaz de aumentar a
proliferação hipocampal e reduzir o estresse oxidativo no hipocampo e córtex pré-
frontal de animais diabéticos (Ho et al., 2012; de Morais et al., 2014). O tratamento
18
com insulina foi importante também para a atenuação do aumento de latência na
fuga de animais diabéticos no labirinto em T elevado, o que parece estar
relacionado com a diminuição do limiar de aversão desses animais frente à
situações estressantes.
Apesar desse efeito interessante, animais diabéticos tratados com insulina não
tiveram uma melhora da extinção de memória aversiva relacionada ao contexto,
quando avaliados nas sessões 2 e 3 do teste de MCC.
Dentre as implicações neurológicas causadas pelo diabetes, encontram-se
também distúrbios cognitivos de aprendizagem e memória (Reaven et al., 1990;
Ryan, 1988). Foi-se obervado também um aumento de retenção de memória
relacionada ao medo em animais com diabetes induzido por estreptozotocina,
quando avaliados no teste de medo condicionado contextual (Asato et al., 2012). Há
várias evidências provenientes de estudos com animais e humanos que indicam que
hormônios glicocorticóides (corticosterona em ratos, cortisol em humanos) que são
liberados durante estresse e experiências emocionalmente aversivas podem
influenciar funções cognitivas e retenção de memória (Roozendaal, 2000). Estudos
sobre o efeito da corticosterona, bem como agonistas e antagonistas sintéticos de
receptores de glicocorticóides, indicam que a consolidação de memória em vários
tipos diferentes de testes, incluindo esquiva inibitória, labirinto aquático de Morris e
MCC é ampliada por agonistas glicocorticóides e prejudicada por seus antagonistas
(McGaugh e Roozendaal, 2002; Roosendaal, 2002).
O tratamento com vitamina E levou a um efeito positivo na extinção de
memória aversiva em animais normoglicêmicos, efeito esse que não foi visto em
diabéticos (Figura 6). O prejuízo na extinção de memória aversiva em animais
diabéticos observado nos resultados deste trabalho, parece estar pelo menos em
parte relacionado com a natureza do estímulo desse teste e na intensidade da
aversão causada nesses animais que parecem ter um limiar para aversão
extremamente baixo. Animais diabéticos apresentam níveis basais de corticosterona
extremamente elevados e, portanto, não só a consolidação dessa memória aversiva
se faz mais intensa neles do que em animais normoglicêmicos, mas também o
tratamento com vitamina E parece não conseguir atuar sobre essa ativação intensa
do eixo HPA o suficiente para surtir efeito na extinção de memória condicionada
aversiva nesses animais.
19
Há, portanto, um grande indício que essas memórias condicionadas evocadas
por situações aversivas e estressantes em animais diabéticos são bem mais
importantes e de difícil extinção, quando em comparação com animais
normoglicêmicos (Bellush and Rowland, 1989; Bellush et al., 1991; Flood et al.,
1990).
20
8. CONCLUSÕES
Em conclusão, esse trabalho mostrou que animais com diabetes induzido por
estreptozotocina apresentaram respostas relacionadas ao medo mais pronunciadas,
quando comparados aos animais normoglicêmicos. Não só isso, mas foi observado
também um importante prejuízo na extinção da memória contextual aversiva nesses
animais. Tratamento com insulina e vitamina E foram capazes de atenuar respostas
associadas a ansiedade em ambos animais normoglicêmicos e diabéticos. Vitamina
E foi capaz, também, de melhorar a extinção de memória aversiva em animais
normoglicêmicos. O uso de antioxidantes pode levar a um possível efeito
neuroprotetor contra danos oxidativos e comportamento tipo ansioso em animais
submetidos a situações estressantes. Estudos mostram que a insulina, além de
controlar a hiperglicemia e suas consequências danosas, tende a aumentar os
níveis serotoninérgicos, o que pode correlacionar com seus efeitos do tipo
ansiolítico em ambos animais normoglicêmicos e diabéticos.
21
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