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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR, EMBRIOLOGIA E GENÉTICA
2019-1
Profª Drª Ilíada Rainha de Souza
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR, EMBRIOLOGIA E GENÉTICA
2019-1
Profª Drª Ilíada Rainha de Souza
Griffiths et al., 2009: (biblioteca Universitária, Xerox)
Cap. 8 – Transcrição e processamento
Cap. 9 -- Proteínas e sua síntese (Tradução)
Klug et al., 2009, cap.11, 14 e 15
Alberts et al., 2008, cap.6
Complementares:
Principal (indicada):
Anthony Griffiths; Susan Wessler; Richard Lewontin; Sean Carroll.
Menks Ribeiro, 2009
(Moodle).
Roteiro das Aulas 05 e 06 (cap. 8 e 9)
• O que são genes? E o genoma?
• Estrutura de gene
• Região promotora
• Região transcrita (Íntrons e Éxons)
• Regiões reguladoras
• Transcrição
• Processamento do RNA [quepe (cap), cauda poli-
A e encadeamento (splicing)]
Processamento alternativo do RNA (íntron →
éxon)
• Tradução (→ teórico-prática)
• Regulação da tradução
GENOMAS E SUAS
CARACTERÍSTICAS
Como estão Organizados os
Genomas de diferentes espécies?
...e como é a Estrutura dos Genes ?
Hipótese:
Relação do tamanho do Genoma e
a complexidade do organismo
Constatação....
Mus musculus
TAMANHO
DO
GENOMA
(pb)
Escherichia coli Amoeba dubia
2.500.000.000 pb 2.900.000.000 pb
4.639.221 pb 670.000.000.000 pb
Frittilaria assyriaca
120.000.000.000 pb
Homo sapiens
12/ 1.000.000 pb 9,3/ 1.000.000 pb
950/ 1.000.000 pb > 90/ 1.000.000 pbnd
DENSIDADE
DO
GENOMA
(genes/Mb)
Mus musculus
Escherichia coli Amoeba dubiaFrittilaria assyriaca
Homo sapiens
Genomas
• Grande variedade de tamanho eorganização
• O tamanho do genoma é medido pelasua quantidade de DNA: C (haplóide)
• O tamanho do genoma não se correlaciona com complexidade
→ paradoxo do valor de C
• Região de 65 kilobases (65.000 pares de bases) de DNA é ilustrada para
cada organismo. A região que codifica para a maior subunidade da RNA
polimerase (RNA pol II para as células eucariontes) está indicada em
vermelho.
• Notar como o no de genes codificados dentro do mesmo comprimento
de DNA diminui a medida que a complexidade do organismo aumenta.
Comparação da densidade gênica nos cromossomos para
diferentes organismos:
Tamanhos aproximados (em quilobases),
espaçamento de genes e o número total de genes
em vários organismos representativos
Número total de genes ~ 3.200
Número total de genes ~ 6.300
Número total de genes ~ 13.600
Número total de genes ~ 25.000
O que
são os
genes?
Dogma
central
da
Biologia
Molecular
O que é um gene?
Dogma
central
da
Biologia
Molecular
O que é um gene?
EUCARIOTOS X PROCARIOTOS
Semelhanças
e diferenças
Procariotos
Região codificadora: contém a informação para o produto
do gene (geralmente uma proteína).
Regiões regulatórias: contém sequências reconhecidas e
ligadas por proteínas que determinam a transcrição e
influenciam a quantidade de RNA transcrito.© 1999 by W. H. Freeman and Company
Esquema de um gene procarioto
Promotor: Sítio de ligação da RNA Polimerase (transcrição)
+1 = início de transcrição
RBS = sítio ligador ao ribossomo;
ATG = códon de iniciação da síntese protéica;
Cds ou ORF = seq. codificadora da proteína ou quadro aberto
de leitura (open reading frame);
STOP = qualquer um dos três códons de finalização
da síntese proteica (tradução);
terminador = região terminadora da transcrição
Estrutura típica de um gene procarioto
DNA
+1
mRNA transcrito do gene
Estrutura típica de um gene procarioto
mRNA transcrito do gene
UTR = untranslated
region
(região não traduzida)
Estrutura típica de um gene procarioto
mRNA transcrito do gene
5'-UTR
contém
o RBS
UTR = untranslated
region
(região não traduzida)
3'-UTR
grampo de
terminação
Estrutura típica de um gene procarioto
mRNA transcrito do gene
5'-UTR
contém
o RBS
3'-UTRgrampo de
terminação
Estrutura típica de um gene procarioto
amino-terminal (N) (C)
carboxi-
terminal
Região codificante
mRNA transcrito do gene
5'-UTR
contém
o RBS
3'-UTR
grampo de
terminação
UTR = untranslated
region
(região não traduzida)
Estrutura típica de um gene procarioto
amino-
terminal (N)carboxi-
terminal (C)
Região codificante
In:http://departments.oxy.edu/biology/Franck/Bio130S_2002
Um promotor regula a transcrição de vários genes ao
mesmo tempo
Um promotor regula a transcrição de um único gene
Alberts et al. 2010, Fig 6-3
Os genes podem ser expressos sob diferentes
taxas.
PROPRIEDADES DO RNA
Geralmente unifilamentar (+ flexível)
Tem ribose
Tem uracila (U)
Pode catalisar reações (ribozimas)
5’
3’
• Cadeia de polirribonucleotídeos.
• Ligação fosfodiéster é a mesma que ocorre no DNA.
• Moléculas de DNA em torno de milhões de pb e de
RNA apenas milhares de pb ( ≠ ).
RNA-polimerase catalisa ligações fosfodiéster formando uma cadeia linear 5’-3’
Substratos trifosfatos de ribonucleosídeo
Alberts et al. 2010, Fig 6-8
Enzimas polimerases apareceram duas vezes na evolução
INICIAÇÃO
Ponto chave da regulação gênica!
PROCARIOTOS
A RNA-polimerase (uma única) é composta de várias subunidades, alfa, beta e
ômega (2α, β, β’, ω) e o fator sigma (σ)
Apoenzima (enzima base) + fator sigma = holoenzima RNA-polimerase
PROMOTOR: sequência especial no DNA que
indica o ponto de início de transcrição onde o
fator sigma se liga firmemente. Há uma ampla
gama de promotores + fortes ou + fracos.
TTGACAT TATAAT
Sequências de
consenso para todas as
sequências promotoras
de E.coli
Fortes sequências promotoras de E.coli
Sequências promotoras de diferentes
genes bacterianos
Alberts et al. 2010, Fig 6-11
TRANSCRIÇÃO
Alberts et al. 2010, Fig 6-11
Funções da RNA
polimerase ?
TRANSCRIÇÃO
Alberts et al. 2010, Fig 6-11
TRANSCRIÇÃO
1. Reconhecer a região promotora
2. Desnaturar o DNA expondo a
seqüência a ser copiada
3. Manter as fitas de DNA
separadas na região da síntese
Alberts et al. 2010, Fig 6-11
4. Separação do fator σ da RNA
polimerase
5. Manter o híbrido DNA:RNA
estável
6. Renaturar o DNA na região
imediatamente posterior à
síntese
TRANSCRIÇÃO
Alberts et al. 2010, Fig 6-11
TRANSCRIÇÃO
7. Terminar a síntese do RNA
• Reconhecer a região promotora
• Desnaturar o DNA expondo a sequência a
ser copiada
• Manter as fitas de DNA separadas na região
da síntese
• Manter o híbrido DNA:RNA estável
• Renaturar o DNA na região imediatamente
posterior à síntese
• Terminar a síntese do RNA
Funções da RNA polimerase:
TÉRMINO
As sequências de TERMINADORES são muito mais heterogêneas do que as de
PROMOTORES ➔ potencial de formar estruturas em grampo (ex: 5’CCCG...CGGG 3’)
Lewin. Genes IX, Fig 11.45-46
Lewin. Genes IX, Fig 7.13
Transcrição e tradução altamente
relacionadas nas bactérias (quase
simultâneos)
Alberts et al. 2010, Fig 6-14
Sentidos de transcrição de uma pequena porção de genes bacterianos
Se uma molécula de DNA for transcrita e uma das fitas seja
5’- CAATTTGGTTATGCCC - 3’ ... (não molde para o RNA), qual será a
sequência 5’-3’ do RNAm transcrito?
EXERCÍCIO:
Roteiro da Aula 5 (cap. 8 e 9)• O que são genes? E o genoma?
• Estrutura de gene
• Região promotora
• Região transcrita (Íntrons e Éxons)
• Regiões reguladoras
• Transcrição em Procariotos e
Transcrição em Eucariotos
• Processamento do RNA [quepe (cap), cauda poli-
A e encadeamento (splicing)]
Processamento alternativo do RNA (íntron →
éxon)
TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS
Alberts et al. 2010, Tab 6-2
-DNA nuclear de eucariotos é linear e empacotado através de histonas vs DNA
bacteriano que é circular e não associado a histonas;
✓Associação das duas fitas com proteínas - histonas
Estrutura Terciária do DNA
em EUCARIOTOS
( ) Cromossomos em
metáfase: Maior grau de
condensação (10.000x)
( ) Compactação em
intérfase (500x)
( ) Cada cromátide é uma
molécula de DNA
COMPACTANDO
O DNA –
complete as
lacunas:
( ) DNA descompactado
2
1
3
4
5
67
8
9
( ) Solenoide
( ) Histona H1
( ) Nucleossomo( ) cauda N-terminal de
histona
( ) Tetrâmero de
histonas H3-H4EXERCÍCIO
10
EUCARIOOS
-RNA-polimerase tem 3 formas (semelhantes à única polimerase bacteriana)
GTFs ajudam 1) a posicionar a RNA-polimerase sobre o promotor, 2) a separar
as 2 fitas de DNA e 3) a liberar a RNA-polimerase do promotor
TFII = fatores de transcrição da polimerase II (TFII B, TFII D, TFII E, TFII F
(mesma estrutura do fator sigma), TFII H, TFII I).Alberts et al. 2010, Tab 6-2
Forma Produto
RNA-polimerase I rRNA (ribossômico)
RNA-polimerase IImRNA (mensageiro),
snRNA (small nuclear)
RNA-polimerase IIIrRNA 5S, tRNA
(transportador)
RNA-polimerase em Eucariotos:
-RNA-polimerase precisa de vários Fatores Gerais de Transcrição (GTF) vs
único fator sigma (procariotos)
-DNA nuclear de eucariotos é linear e empacotado através de histonas vs DNA
bacteriano que é circular e não associado a histonas;
TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS
COMPLEXO DE INICIAÇÃO DE TRANSCRIÇÃO
(in vitro)
Alberts et al. 2010, Fig 6-16
• TFIID = Fator de Transcrição (TF) da RNA
polimerase II
• TBP = proteína de ligação à região TATA boxe
COMPLEXO DE INICIAÇÃO DE TRANSCRIÇÃO
(in vitro)
Alberts et al. 2010, Fig 6-16
TBP = TATA-binding protein
TATA box
(-25)
COMPLEXO DE INICIAÇÃO DE TRANSCRIÇÃO
(in vitro)
Alberts et al. 2010, Fig 6-16
TFIID = Fator de Transcrição da RNA polimerase II
TFIIB = segundo “ “ liga-se ao DNA
COMPLEXO DE INICIAÇÃO DE TRANSCRIÇÃO
(in vitro)
Alberts et al. 2010, Fig 6-16
TFIID = Fator de Transcrição da RNA polimerase II
TFIIB = segundo “ “ liga-se
TFIIE, TFIIH = próximos fatores a ligarem-se à
região. A seguir TFIIF e outros fatores ligam-se à
polimerase que se unem ao complexo de pré-
iniciação.
CTD = domínio C-terminal = 52 repetições de 7 aa,
que sofre fosforilação na cauda de carboxila.
COMPLEXO DE INICIAÇÃO DE TRANSCRIÇÃO
(in vitro)
Alberts et al. 2010, Fig 6-16
Alberts et al. 2010, Fig 6-19
• Há neste complexo de iniciação de transcrição proteico + de 100 subunidades
• A RNA-polimerase II precisa se liberar do complexo para polimerizar
• Depois ela se move “aos saltos” com ajuda de fatores de extensão que mantém
a associação polimerase-DNA
O processo é ainda + complexo in vivo!!!
Fatores de transcrição e RNA polimerase II
https://www.youtube.com/watch?feature=endscreen&NR=1&v=5MfSYnItYvg
Região promotora e transcrição
Sítio de início da
transcrição
início da transcrição
(+1)
[ https://www.youtube.com/watch?v=icZjgZozkB8 ]
COMPLEXO DE INICIAÇÃO DE TRANSCRIÇÃO
(in vitro)
Alberts et al. 2010, Fig 6-16
https://www.youtube.com/watch?v=WsofH466lqk
(North Dakota State University)
Griffiths et al. Figura 8.2
Promotores: Sequência da região 5’ antes do ponto de início da
transcrição, região codante do gene, onde fatores de
transcrição (proteínas e/ou RNAs) e a RNA
polimerase se ligam para dar início à transcrição.
TATA box: Sequência conservada, encontrada na promotora a
cerca de 25 a 30 pb anterior (5’) do sítio de iniciação da
transcrição, e onde se ligam complexos proteicos.
Enhancer: É uma sequência de DNA próxima a região promotora que
é capaz de aumentar a capacidade desta.
Regiões reguladoras da transcrição
Início da Transcrição: É determinado por duas sequências curtas
localizadas aproximadamente nos
nucleotídeos -35 (aproximadamente 20 pares
de bases da região TATA box) e -10, onde a
polimerase se liga. Ocorre antes do AUG de
início da Tradução. Estas sequências são
bastante conservadas, assim como o
espaçamento.
Regiões reguladoras da transcrição
Modificações
co- e pós-
transcrição
5’
5’ 3’
Quepe 5’ (Cap 5’): Estrutura de 7-metilguanosina adicionada aos mRNA
eucarióticos após a transcrição; auxilia na estabilidade
da molécula e na iniciação da síntese protéica,
podendo servir também de proteção.
Cauda Poli-A: Parece ter várias funções: (1) auxilia na exportação do
RNAm maduro para o citoplasma; (2) afeta a estabilidade
do mRNA; (3) parece servir como um sinal de
reconhecimento para o ribossomo. A cauda poli-A em
combinação com o quepe 5’ mantém a conformação
secundária circular da molécula de mRNA ativa e permite
ao ribossomo determinar se o mRNA está intacto.
Processamento do RNA co-transcricional
PROCESSAMENTO
DO RNA PÓS-
TRANSCRIÇÃO
(SPLICING)
Gene HBB - Hemoglobina
Íntron 1
Íntron 2
TCAAAAGGTAGGCA
AAATAAGGTGAGCC
AGCTCAGGTACAGA
CCTGCCAGTAAGTT
ACAAATGGTAAGGT
GACTGAGGTATATG
TGAGAGGTATGGC
GCTCTAGACAACT
ATTACAGGTTGTT
TATTCAGTGTGGC
TTTACAGGAATAC
CTTAAAGGAATTA
GCTCAAGCAAGAA
CTTGCAGCTTGAG
Íntron A
Íntron B
Íntron C
Íntron D
Íntron E
Íntron F
Íntron G
Éxon 2...
Éxon 3...
Éxon 4...
Éxon 5...
Éxon 6...
Éxon 7...
Éxon 8...
....Éxon 1
....Éxon 2
....Éxon 3
....Éxon 4
....Éxon 5
....Éxon 6
....Éxon 7
Transcrição5’ 3’
gGTaag
“gGUaag”
cAGgSequências permitidas:
Sítio doador Sítio aceptor
Comparação entre sequências nos limites éxon-íntron do gene da albumina
Processamento do RNA pós transcrição
Splicing ou processamento do RNA transcrito
primário
Sequência transcrita em RNA e é mantido na molécula
funcional (mRNA), após o processamento (splicing). A união
dos éxons monta a região codificadora, assim como a 5’UTR e
3’UTR (todas presentes no mRNA maduro).
Íntrons:
Exón:
Sequência transcrita, portanto presente no pré-mRNA, mas
removida durante o processamento, não estando presente na
molécula de mRNA madura. Para isto as regiões que flaqueiam
os íntrons (ou éxons) são ligadas, formando o RNAm maduro.
Um gene pode conter um grande número de íntrons e estes
podem ser bem maiores que a região contida nos éxons.
Processamento do RNA pós transcrição
Junção de splicing: Sequência de DNA que cerca o limite entre um éxon
e um íntron. Há um grau de conservação nestas
regiões, permitindo a identificação e remoção
correta dos íntrons.
Splicing: Processo que ocorre durante a maturação do mRNA
eucariótico, onde ocorre a remoção de íntrons e a união dos
éxons. É o mesmo que processamento do mRNA.
Processamento do RNA pós transcrição
Conceitos de Genética – William S. Klug, Michael R. Cummings, Charlotte A. Spencer & Michael A. Palladino
(a) Interação de guanosina , a
qual age como co-fator de reação
com o transcrito primário;
(b) Grupo 3’ OH da guanosina é
transferido para o nucleotídeo
adjacente à extremidade 5’ do
íntron;
(c) E à extremidade 3’ do íntron;
(d) O íntron é removido e as
regiões dos dois éxons são
ligadas , levando ao ribossomal
Pré- RNA
ribossomal
RNA ribossomal
maduro
transcrito
primário
Splicing
O splicing consiste na retirada dos íntrons de umRNA precursor (heterogêneo nuclear - hnRNA), deforma a produzir um mRNA maduro funcional.
Essa excisão dos íntrons do mRNA é um eventomuito importante e requer uma extrema precisãodas enzimas envolvidas no processo (smallnuclear RNAs - snRNAs).
A falta ou o acréscimo de um único nucleotídeo emum éxon pode levar a uma alteração da fase deleitura e a produção de uma proteínacompletamente diferente da original.
Processamento após Transcrição
Conceitos de Genética – William S. Klug, Michael R. Cummings, Charlotte A. Spencer & Michael A. Palladino
Modelo de remoção de
íntrons do pré-mRNA de
origem nuclear no
mecanismo de
encadeamento (splicing):
A excisão depende de
cinco pequenas
riboncleoproteínas
nucleares (snRNP- snurps)
que são complexos de
proteínas e um dos 5
snRNAs (U1,U2, U4, U5,U6),
as quais atuam como parte
integrante de uma grande
estrutura chamada
spliceossomo.
A estrutura em laço é típica
desse mecanismo.
mRNA
Pré- RNA
mensageiro
Do Transcrito Primário à Proteína
[ ~1800 nucleotídeos]
(5 +2)
A guaniltransferase adiciona 7-
metilguanosina (cap = quepe)
Cauda poli-A:
150 a 200 nc
PR
OC
ES
SA
ME
NT
O
Remoção do Íntron por
snRNA
PROCESSAMENTO
ALTERNATIVO
(SPLICING)
Figure 8-14 Padrão complexo de splicing de mRNA em eucariontes. O transcrito pre-
mRNA do gene α-tropomiosina é alternativamente processado em diferentes tipos de
células. As caixas verdes claras ( , entre os números) representam íntrons e as
outras cores de caixas representam éxons. Poliadenilações são indicadas por um A.
Linhas pontilhadas nos mRNAs maduros são indicações de regiões removidas por
splicing. TM = tropomiosina. ( J. P. Lees et al., Molecular and Cellular Biology 10, 1990,
1729 – 1742).
- o mecanismo que pode explicar a enorme diferença
entre o tamanho modesto do conjunto de genes
humano e a elevada complexidade do proteoma.
-Estima-se que mais de 50% dos genes humanos são
alternativamente processados
- Alguns genes podem gerar muitas isoformas de
proteínas por eventos complexos de splicing
alternativo.
-A análise do transcriptoma (conjunto de mRNAs do ser
vivo ou da célula em estudo) poderá ajudar a decifrar
splicing alternativo.
Splicing ou processamento alternativo
Mais correto dizer:
Éxons → sequências que permanecem no RNA após a
remoção dos íntrons
Splicing alternativo???
O que é éxon em um momento pode ser íntron em outro
momento e vice-versa
É preciso estar alerta sobre esta dificuldade conceitual,
que de fato não tem solução
Os Exons
(Donadi et al., 2011)
44 alelos14 variantes protéicas(Robinson et al., 2006)
Exemplo de processamento alternativo
HLA-G
MECANISMOS DE
RNA DE
INTERFERÊNCIA
RNAi (RNA interferente ou RNA deinterferência)
é um mecanismo exercido por moléculasde RNA complementares a RNAs mensageiros,as quais inibem a expressão gênica na fasede tradução ou dificulta a transcriçãode genes específicos...
TRANSCRIÇÃO X REPLICAÇÃO
(S = semelhança / D = diferença)
• complementariedade por pareamento de bases (S)
mas com U ao invés de T (D)
• síntese a partir de DNA (S)
• só uma fita do DNA de cada gene é molde,
dependendo do promotor (D)
• o RNA não fica ligado ao molde ➔ muitas cópias (+
1000 / h / gene) (D)
• 1 molécula de DNA = milhões pb; 1 molécula de
RNA ≤ milhares de bases (D)
• Síntese de RNA não há primer ➔ RNA polimerase
erra 1000 X mais que a DNA polimerase (D)
Depois da aula é
a hora de ver o
que vc
aprendeu...
Complete os
exercícios
que estão
no moodle !!
Faça os
exercícios para
comentários
na próxima
aula!!
Griffiths et al., 2009: (biblioteca
Universitária, Xerox)
Cap. 8 –Transcrição e processamento
Cap.9 - Proteínas e sua síntese (Tradução)
Klug et al., 2009,
cap.11, 14 e 15
Alberts et al., 2008,
cap.6
Complementares:
Literatura indicada:
Griffiths et al., 2009
Menks Ribeiro, 2009
Moodle.
TRANSCRIÇÃO
Animação:
• https://www.youtube.com/watch?v=SMtWvDbfHLo(AVANÇADO) - DNA Learning Center ... 22 de mar de 2010
• https://www.youtube.com/watch?v=XzVXhemtwmA (Oxford
University press).
• https://www.youtube.com/watch?v=so3G_kI1PVw
(by Canadian Museum of Nature)
• https://www.youtube.com/watch?v=gG7uCskUOrA
– transcrição e tradução (Oxford University, 2014).
• https://www.youtube.com/watch?v=vi-zWoobt_Q
- Regulação da Transcrição (North Dakota State University )
MATERIAL COMPLEMENTAR:
PROCESSAMENTO DO RNA
Animação (Jack Slater)
• https://www.youtube.com/watch?v=DoSRu15VtdM
(cap e cauda poli-A)
• https://www.youtube.com/watch?v=o0BQJbLNYSg
(splicing)
• https://www.youtube.com/watch?v=28mgfg8nRT4
• https://www.youtube.com/watch?v=gG7uCskUOrA
(Publicado em 7 de jan de 2015)
