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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA – UFBA
INSTITUTO MULTIDISCIPLINAR EM SAUDE - IMS
PROGRAMA MULTICÊNTRICO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FISIOLÓGICAS - SBFIS
EVERALDO NERY DE ANDRADE
PEPTÍDEO NATRIURÉTICO ATRIAL EM UM MODELO DE
OBESIDADE E HIPERTENSÃO INDUZIDAS POR DIETA EM RATAS
OVARIECTOMIZADAS
Vitória da Conquista – BA
2010
EVERALDO NERY DE ANDRADE
PEPTÍDEO NATRIURÉTICO ATRIAL EM UM MODELO DE
OBESIDADE E HIPERTENSÃO INDUZIDAS POR DIETA EM RATAS
OVARIECTOMIZADAS
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa Multicêntrico de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas da Sociedade Brasileira de Fisiologia na Universidade Federal da Bahia, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciências Fisiológicas.
Orientadora: Profa. Dra. Najara de Oliveira Belo
Universidade Federal da Bahia - UFBA
Co-Orientadora: Profa. Dra. Adelina Martha dos Reis
Universidade Federal de Minas Gerais - UFMG
Vitória da Conquista – BA
2010
Biblioteca Universitária Campus Anísio Teixeira - UFBA
Andrade, Everaldo Nery de Peptídeo natriurético atrial em um modelo de obesidade e hipertensão induzidas por dieta em ratas ovariectomizadas / Everaldo Nery de Andrade. - 2010. 100 f. : il. Orientadora: Profa. Dra. Najara de Oliveira Belo, Profa. Co-orientadora Dr.ª Adelina Martha dos Reis. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal da Bahia, Programa Multicêntrico de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas, 2010
1. Obesidade - Fator Natriurético Atrial. 2. Hipertensão - Fator Natriurético Atrial. 3. Estrógenos. I. Universidade Federal da Bahia. Programa Multicêntrico de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas. II. Título. CDU – 616-056.52
AGRADECIMENTOS
AGRADECIMENTOS
A Deus.
À minha mãe, irmã, irmãos, sobrinhos e cunhados pelo carinho e dedicação.
A minha noiva Loreta pela compreensão, carinho e auxílio.
Aos meus cunhados Lorena e Cacau pelo apoio e compreensão no período do
mestrado.
A Profa. Najara de Oliveira Belo pela amizade e por ter acreditado em mim
profissionalmente, orientando e amparando-me nos momentos de dificuldades,
compartilhando suas habilidades e ensinando a superar as barreiras durante este
trabalho.
As Professoras Telma de Jesus Soares e Amélia Cristina Mendes de Magalhães
pela simpatia de ambas e apoio neste projeto nas áreas de função renal e na dieta,
respectivamente.
As colegas Liliany, Ana Carolina, Kelly e Daniela pelo convívio harmonioso,
constante apoio, troca de informações e companheirismo.
À Profa. Adelina Martha dos Reis pela oportunidade de estar ao seu lado durante
todo o período em que estive na UFMG, auxiliando-me nas dificuldades, nos
experimentos, assim como pela sua constante preocupação sobre minha logística
em Belo Horizonte.
Ao Prof. José Rodrigues Antunes pela iniciativa em propagar o conhecimento da
Fisiologia por meio do Programa Multicêntrico em Ciências Fisiológicas e constantes
diálogos incentivadores.
Aos Professores e colegas de turma das Universidades Nucleadoras da USP de
Ribeirão Preto e UFMG pelo acolhimento.
A Janine Costa Ivo por sua assistência no experimento de radioimunoensaio do
ANP.
A Luciana Firmes pelo constante apoio na realização dos experimentos de RT-PCR
e radioimunoensaio na UFMG.
Aos colegas de iniciação científica Gleisy, Thiago Henrique, Thiago Moreira,
Jussara, Luciano, Carol, Clarisse, Grazielle, Roberta, Alfredo, Jucimara, Welber por
auxílio em algumas partes desse trabalho.
A bibliotecária, Flávia Bulhões de Sousa, pelo auxílio nas normas técnicas da ABNT.
A UESB pela liberação para qualificação docente.
Ao CNPQ, CAPES e FAPESB pelo suporte financeiro.
A todos que direta ou indiretamente colaboraram na realização deste trabalho.
RESUMO
RESUMO
Introdução e objetivos: A obesidade é uma doença complexa, multifatorial, de
proporções epidêmicas e é o principal fator de risco para o desenvolvimento da
hipertensão arterial. Na pós-menopausa ocorre um aumento da incidência de
obesidade central e hipertensão. Todavia, os mecanismos envolvidos nesta
associação não estão esclarecidos. Os peptídeos natriuréticos podem participar da
gênese desta fisiopatologia, pois permitem a redução da pressão arterial e evitam a
hipertrofia cardíaca. Desta forma, indivíduos obesos apresentam baixos níveis
plasmáticos de peptídeo natriurético atrial (ANP) e alta quantidade de receptores
natriuréticos de clearance (NPR-C) que favorecem o desenvolvimento de
hipertensão arterial e hipertrofia cardíaca. Assim, o objetivo deste projeto foi estudar
o papel do sistema de peptídeos natriuréticos na patogênese da hipertensão e da
obesidade induzidas por dieta hipercalórica utilizando ratas ovariectomizadas.
Metodologia: Foram utilizadas 30 ratas Wistar pesando entre 150-200g. As ratas
foram ovariectomizadas ou sham-operadas. Os animais receberam as seguintes
dietas: dieta de alto teor de carboidrato ou dieta com alto teor de lipídeos ou dieta
controle. Foram mensuradas a massa corporal, a pressão arterial durante 24
semanas. Em seguida, as ratas foram sacrificadas e o sangue e os tecidos foram
removidos para análises posteriores. Foram realizadas: dosagem de ANP por
radioimunoensaio, mensuração do diâmetro dos cardiomiócitos por análise
morfológica e histológica de ventrículos e, reação em cadeia da polimerase para
determinação da expressão de ANP e seus receptores em rins, tecido adiposo e
coração.
Resultados: As ratas ovariectomizadas sob dieta hiperlipídica mostraram aumento
do peso corporal, da soma total de gorduras, da gordura visceral mesentérica e
parametrial, pressão sanguínea sistólica e média. A pressão arterial sistólica e
média foi correlacionada positivamente com o aumento do peso corporal nas ratas
sob dieta hiperlipídica. Além disso, estas ratas mostraram menor expressão gênica
de ANP cardíaco e plasmático e maior expressão gênica de NPR-C no tecido
adiposo e renal do que o grupo controle. Observou-se ainda uma correlação inversa
entre a expressão gênica de ANP ventricular e o peso cardíaco e correlação positiva
entre o aumento da expressão gênica de NPR-C e a elevação da pressão arterial
nas ratas ovariectomizadas sob dieta hiperlípidica. A maior razão da massa
cardíaca/corporal, a diminuição do lúmen das câmeras cardíacas, o aumento da
espessura do miocárdio e do diâmetro dos cardiomiócitos ventriculares sugerem
hipertrofia cardíaca concêntrica nas ratas ovariectomizadas sob dieta hiperlipídica.
Conclusão: Estes dados mostram que a combinação da ovariectomia com a dieta
hiperlipídica favorece o desenvolvimento da obesidade, aumento da pressão arterial
e hipertrofia cardíaca. Estes resultados sugerem que a redução da atividade do
sistema de peptídeos natriuréticos pode ser um dos mecanismos envolvidos não
somente no aumento da pressão arterial, mas também na hipertrofia cardíaca
associada com a obesidade em ratas ovariectomizadas.
Palavras-chaves: Hipertensão. Obesidade. Estrógenos. Fator natriurético atrial.
ABSTRACT
ABSTRACT
Introduction and aims: Obesity is a major challenge for basic science and clinical
research, since it represents an important risk for serious diet-related chronic
diseases including cardiovascular disease. Among other factors, obesity is an
important contributor to hypertension in humans and it is associated with salt
retention, especially in postmenopausal women. The mechanisms that link obesity
with high blood pressure, cardiac hypertrophy and postmenopausal status have not
been fully elucidated. It has been suggested that the natriuretic peptide system may
contribute to the development of hypertension in obese subjects, once they promotes
blood pressure reduction. Some authors hypothesized that obese individuals may
have an impaired natriuretic response. The present study was designed to study the
involvement of natriuretic peptide system in the mechanisms of obesity hypertension.
Methods: We used female Wistar rats weighting 150-200g. The animals were
ovariectomized or sham-operated and they were divided into six groups:
ovariectomized or sham-operated with high-fat diet, ovariectomized or sham-
operated with control diet, ovariectomized or sham-operated with high-carbohydrate
diet. At the end of every week in the entire study period, body weight and blood
pressure were measured. After 24 weeks of diet, rats were killed and tissues were
removed. Cardiac atrial natriuretic peptide (ANP), clearance receptor (NPr-C) gene
expression was determined by PCR. ANP concentrations were measured in plasma.
Transverse sections of the ventricles were stained with hematoxylin and eosin stain
for measurement of cardiomyocyte diameter and fibrosis.
Results: Ovariectomized fat-fed rats (OF) showed increased body weight, visceral
fat depot and blood pressure compared to others groups. A direct correlation was
observed between body weight and mean blood pressure in ovariectomized rats.
Also, these rats showed higher heart-to-body weight and cell diameters of ventricular
cardiomyocytes and lower cardiac ANP mRNA and plasma ANP than control group.
The adipocyte and renal NPr-C mRNA of OF rats are higher than control. An inverse
correlation was observed between ventricular ANP gene expression and heart weight
in ovariectomized rats. Also, a correlation was observed between adipocyte NPr-C
gene expression and blood pressure in ovariectomized rats. The cardiac
enlargement in the ovariectomized high-fat diet rats was associated with reduced
chamber lumen and increased wall thickness, indicative of concentric hypertrophy.
Conclusions: Our findings show that a high-fat diet plus ovariectomy promote
decreased synthesis and increased depuration of ANP what can generated obesity,
increase of the blood pressure and cardiac hypertrophy in female animals. These
results suggest that the impairment of natriuretic peptide system may be one of the
mechanisms involved not only in the increase of the blood pressure, but also in
cardiac hypertrophy associated with obesity in ovariectomized rats.
key-words: Hypertension; obesity; estrogen; atrial natriuretic factor.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ADH Hormônio anti-diurético
AGP Ácidos graxos poliinsaturados
AGS Ácidos graxos saturados
AIN American Institute of Nutrition (Instituto de Nutrição Americano)
AMPc Adenosina monofosfato cíclico
ANP Atrial Natriuretic Peptide (peptídeo natriurético atrial)
AT Angiotensina
AT1 Receptor de angiotensina do tipo 1
AVC Acidente vascular cerebral
BNP Brain Natriuretic Peptide (peptídeo natriurético cerebral)
cDNA DNA complementar
CNP C-type natriuretic peptide (peptídeo natriurético do tipo C)
DC Dieta controle
DCO Rata ovariectomizadas alimentada com dieta controle
DCS Rata sham alimentada com dieta controle
DEPC Dietilpirocarbonato
DL Dieta com alto teor de lipídios ou dieta hiperlipídica
DLO Rata ovariectomizadas alimentada com dieta hiperlipídica
DLS Rata sham alimentada com dieta hiperlipídica
DNP Dendroaspis natriuretic peptide (peptídeo natriurético dendoraspis)
DNTP Desoxiribonucleotídeo trifosfatado
DS Dieta com alto teor de carboidrato refinado ou dieta hipersacarídica
DSO Rata ovariectomizadas alimentada com dieta hipersacarídica
DSS Rata sham alimentada com dieta hipersacarídica
EDTA ácido etilenodiamino tetra-acético
eNOS Óxido nítrico sintase endotelial
EPN Endopeptidase neutra
ER Receptor de estrógeno
ERα Receptor de estrógeno tipo α
ERαKO Camundongo sem receptor de estrógeno tipo α
ERβ Receptor de estrógeno tipo β
ERβKO Camundongo sem receptor de estrógeno tipo β
ET-1 Endotelina-1
FENA+ Fração de excreção de sódio
FES Fração de excreção de sódio
FORKO Camundongos nocautes para o receptor de FSH
FSH Hormônio folículo estimulante
GCA Guanilil ciclase A
GMPc Guanosina monofosfato cíclico
GMT Ganho de massa total
GPCR Receptores acoplados a proteína G
GTP Guanosina trifosfato
HPLC Cromatografia líquida de alta pressão
HSL Lipase hormônio sensível
IMC Índice de massa corporal
IMS Instituto Multidisciplinar de Saúde
KATP Canais iônicos de potássio sensíveis a ATP
MAPK Proteína quinase ativada por mitógeno
MCF Massa corporal final
MCI Massa corporal inicial
MMLV Enzima do Moloney Murine Leukemia Vírus
N-ANP N-peptídeo natriurético pré-atrial terminal
NFAT Fator nuclear ativado pela célula T
NO Óxido nítrico
NOS Óxido nítrico sintase
NPR Receptor de peptídeo natriurético
NPR-A Receptor natriurético do tipo A
NPR-B Receptor natriurético do tipo B
NPR-C Receptor natriurético do tipo C
OMS Organização Mundial da Saúde
OVX Ovariectomizadas
PAM Pressão arterial média
PAS Pressão arterial sistólica
PCR Reação em cadeia da polimerase
PDE2 Fosfatidilesterase 2
PG Prostaglandinas
PGC Proteína guanilil ciclase
PGF2α Prostaglandinas F2α
PGH2 Prostaglandinas H2
PI3-KINASE Fosfatidilinositol-3-OH-inuase
PKA Proteína quinase A
PKC Proteína quinase C
PKG Proteína quinase G
PKGI Proteína quinase GI
PKGII Proteína quinase GII
PMSF Fenilmetilsulfonilfluorido
PN Peptídeos natriuréticos
PREPRO Pré-hormônio
ProANP Pro-peptídeo natriurético atrial
RGS Reguladores da sinalização da proteína G
RIE Radioimunoensaio
RNAm Ácido ribonucléico mensageiro
RT Transcrição reversa
RT-PCR Transcrição reversa-reação em cadeia da polimerase
s2 Variação do erro
SG Soma das gorduras
SRAA Sistema renina-angiotensina-aldosterona
TFG Taxa de filtração glomerular
TG Triglicerídeos
UFBA Universidade Federal da Bahia
UFMG Universidade Federal de Minas Gerais
SUMÁRIO
SUMARIO
01. INTRODUÇÃO.....................................................................................................18
03. REVISÃO DE LITERATURA................................................................................22
02. OBJETIVOS .......................................................................................................42
04. MATERIAL E MÉTODOS.....................................................................................44
05. RESULTADOS.....................................................................................................54
06. DISCUSSÃO........................................................................................................73
07. CONSIDERAÇÕES FINAIS.................................................................................82
08. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.....................................................................84
09. ANEXOS...............................................................................................................99
18
INTRODUÇÃO
19
01. INTRODUÇÃO
A obesidade, definida como aumento do depósito de triglicérides nas células
adiposas determinado por um desequilíbrio entre consumo e gasto de energia,
(MUST et al., 1999) é considerada uma doença complexa e multifatorial, de
prevalência crescente, que já atingiu proporções epidêmicas na sociedade ocidental.
Dados recentes da Organização Mundial de Saúde mostram que a incidência de
obesidade cresce em crianças e adultos no Brasil. Foi estimado que 60,3% das
mulheres brasileiras com mais de 15 anos possuem um índice de massa corporal
(IMC)≥ 25 Kg/m2 (excesso de peso), 24,5% nessa mesma faixa etária possuem
IMC≥ 30 kg/m² (obesas) e para as mulheres na faixa etária acima de 30 anos a
prevalência de obesas aumenta para 32,1%, enquanto em 2002 apenas 20,5% das
mulheres acima de 30 anos eram consideradas obesas e 58,3% estavam com
excesso de peso (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2010).
Esse aumento também foi apontado pelo Ministério da Saúde do Brasil (2009), o
qual afirma que em 2010 a obesidade aumentou entre os brasileiros, principalmente,
entre mulheres (13,6%), comparado a 1975 em que apenas 2,8% dos homens e
7,8% das mulheres eram obesas e 2002 em que a obesidade atingia 8,8% dos
homens e 12,7% das mulheres. É importante salientar que a obesidade entre
mulheres aumenta mais de três vezes na comparação das faixas etárias de 18 e 24
anos e de 55 a 64 anos: de 6,2% para 21,3%. Já o índice de excesso de peso mais
que dobra na faixa etária dos 45 aos 54 anos (52,9%) em relação a 18-24 anos
(24,9%). (MINISTÉRIO DA SAÚDE DO BRASIL, 2010).
A World Health Organization (2010) relaciona o aumento da prevalência de
sobrepeso e obesidade com muitas doenças crônicas relacionadas com dieta,
incluindo diabetes mellitus, doença cardiovascular, acidente vascular cerebral (AVC),
hipertensão e determinados tipos de câncer. Dentre estas associações, destaca-se a
relação entre obesidade e pressão arterial, sendo o risco de se desenvolver
hipertensão cerca de 3,8 vezes maior em obesos e de 2,4 vezes entre indivíduos
com excesso de peso (JOINT NATIONAL COMMITTEE, 2004). A idade, o IMC e a
circunferência abdominal aumentados são positivamente associados com uma maior
prevalência de hipertensão (CIPULLO et al., 2010). Dessa forma, a obesidade é
20
atualmente considerada um importante e independente fator de risco para
morbidade cardiovascular e mortalidade, especialmente quando do tipo visceral
(KISSEBAH, KRAKOWER, 1994).
No Brasil, as doenças cardiovasculares, destacando-se a hipertensão, são
responsáveis por cerca de 30% da mortalidade geral e por 1,2 milhões de
hospitalizações, com um custo aproximado de 650 milhões de dólares/ano
(MINISTÉRIO DA SAÚDE DO BRASIL, 2010). A hipertensão é a causa de diversos
danos corporais, entre esses, a hipertrofia cardíaca concêntrica, caracterizada pelo
aumento da espessura ventricular esquerda, presença ou ausência de redução da
contratilidade e do tamanho da câmera cardíaca no final da diástole (JOINT
NATIONAL COMMITTEE, 2004).
Em mulheres no período pós-menopausal há uma tendência de acúmulo de gordura
abdominal (LOVEJOY, 2003), sendo observada em 73,8% das 157 mulheres em
pós-menopausa avaliadas em ambulatórios públicos da cidade de São Paulo
(FRANÇA, ALDRIGHI, MARUCCI, 2008). Apesar dos mecanismos que ligam a
obesidade com a hipertensão e o estado pós-menopausal não estarem
completamente elucidados, mudanças na composição corporal na menopausa pode
ser causada pela diminuição dos níveis de estrógenos (LOVEJOV, 2003, FERRARA
et al., 2002), já que esse hormônio é o principal fator regulador do tecido adiposo no
desenvolvimento e fase adulta do indivíduo. O estrógeno possui efeito direto na
inibição da lipogênese e na regulação do consumo e gasto energético, o que
contribui para a diminuição da deposição adiposa, além de estar relacionado com o
número de adipócitos (COOKE, NAAZ, 2004).
Associada à alteração dos níveis de estradiol, a hipertensão está relacionada ainda
às mudanças no balanço do sódio (CIPULLO et al., 2010), resultantes de várias
alterações, entre as quais da atividade do sistema nervoso simpático (GUYENET,
2006; XAVIER, VILELA, FONTES, 2008), do sistema renina-angiotensina-
aldosterona (BOUSTANY, 2004) e da sensibilidade insulínica (SARZANI et al.,
2008).
Mais recentemente, a participação do sistema de peptídeos natriuréticos (PN) na
fisiopatologia da hipertensão e obesidade tem sido aventada (WANG et al., 2004;
21
DESSÌ-FULGHERI, SARZANI, RAPRELLI, 1998). Entretanto, os dados até agora
apresentados são preliminares e muito estudo ainda se faz necessário para se
determinar as alterações e a importância destes peptídeos e seus receptores na
gênese da hipertensão e obesidade, sobretudo no período pós-menopausal.
22
REVISÃO DE LITERATURA
23
02. REVISÃO DE LITERATURA
02.1 Peptídeos natriuréticos
A homeostase da pressão sanguínea é mantida em parte por um balanço entre as
ações vasoconstrictoras/antinatriuréticas do Sistema Renina Angiotensina
Aldosterona (SRAA) e as ações vasodilatadoras e natriuréticas dos peptídeos
natriuréticos (SHAH et al., 2010). Entretanto, pouca atenção tem sido dada ao
possível papel dos peptídeos natriuréticos e seus receptores na fisiopatologia da
hipertensão arterial. A família dos peptídeos natriuréticos é composta por três
peptídeos homólogos: peptídeo natriurético atrial (ANP), peptídeo natriurético tipo B
(BNP) e peptídeo natriurético tipo C (CNP) (RICHARDS, 2007; POTTER, ABBEY-
HOSCH, DICKEY, 2006). Além desses, há o peptídeo natriurético tipo D (DNP) e a
urodilatina (GAMA, SOUZA, 2006).
Assim como os demais peptídeos natriuréticos, o ANP é sintetizado como pré-
prohormônio (PREPRO) de 151 aminoácidos de comprimento, cuja clivagem da
sequência terminal resulta em uma estrutura de 126 aminoácidos conhecida como
proANP. O ProANP é a forma de armazenamento predominante nos grânulos atriais
e é clivado durante a sua secreção pela Corina, protease serina cardíaca
transmembrana, para formar a substância biologicamente ativa, o ANP com 28
aminoácidos (POTTER, ABBEY-HOSCH, DICKEY, 2006; CLERICO et al., 2006).
A secreção de ANP aumenta em resposta a expansão do volume e ao aumento da
pressão arterial (De BOLD et al., 2001; DIETZ, 2005; ANEJA et al., 2004). Além
disso, a liberação do ANP pode ser influenciada pela endotelina-1 (SHAH, 2010),
angiotensina (AT) II (AT II), agentes adrenérgicos, citocinas (IL-1, IL-6, TNF), fatores
de coagulação e crescimento, insulina, hormônio do crescimento, tireoidianos,
estrógenos (CLERICO et al., 2006), prostaglandinas (MELO, SONNENBERG, 1995)
e pelos corticosteróides (LAUAND et al., 2007). Segundo Ruskoaho et al. (1997) os
fatores endógenos liberados em resposta ao estiramento dos miócitos atriais são
mais importantes na ativação da secreção do ANP do que o próprio estiramento
muscular por sobrecarga de volume, apesar dos mecanismos dessa interação ainda
não estarem totalmente estabelecidos.
24
Em um estudo realizado com 15 pacientes submetidos à circulação extracorpórea,
os níveis plasmáticos de ANP se alteraram negativa e positivamente de acordo com
a diminuição e aumento, respectivamente, da pressão atrial esquerda e direita, o
que favorece o conceito do ANP plasmático como um fator relacionado com as
pressões atriais (FRANÇOIS et al., 2002)
A obesidade é caracterizada pelo aumento da retenção de sódio devido a: ativação
do SRAA por diminuição da perfusão renal em resposta à queda da pressão renal,
contração no volume plasmático e diminuição da chegada de sódio para a mácula
densa (KUROSKI DE BOLD, 1999); aumento da produção de aldosterona pela
ativação simpática, estímulo do hormônio adreno-corticotrópico, aumento da
angiotensina ou mesmo pela ausência da inibição gerada pelos níveis de ANP
(PIECHOTA et al., 2007) que se encontram baixos na obesidade (RICHARDS,
2007); alteração das forças de starling (EDWARDS et al., 1986).
Os peptídeos natriuréticos antagonizam a ação de angiotensina II sobre o tônus
vascular, inibem a secreção de renina e aldosterona, a reabsorção do sódio no
túbulo renal e o crescimento celular vascular (SARZANI et al., 2008; WILKINS,
REDONDO, BROWN, 1997; YOSHIBAYASHI, SAITO, NAKAO, 1996).
Nos rins, o ANP aumenta a taxa de filtração glomerular pela elevação da pressão
nos capilares glomerulares, simultaneamente realizada por meio da dilatação da
arteríola aferente e constricção da arteríola eferente (MARIN-GREZ, FLEMING,
STEINHAUSEN, 1986). Além disso, o ANP inibe a reabsorção de água e sódio no
túbulo proximal pela inibição do estímulo da angiotensina II e nos ductos coletores
pela inibição dos canais de sódio epiteliais sensíveis a amilorida (CLERICO et al.,
2006) que reduz o efluxo de sódio nessa região. No hipotálamo, o ANP suprime o
apetite por sal e a liberação de hormônio anti-diurético (ADH) (SAMSON et al.,
1987), a atividade simpática no tronco cerebral pela sensibilização das fibras vagais
(YUSOF et al., 2009) e atenua a resposta baroreceptora (SCHULTZ et al., 1988).
Assim, o aumento do ANP plasmático está correlacionado com o aumento da
diurese e natriurese (FRANÇOIS et al., 2002).
O efeito inibitório do ANP sobre a renina requer a presença da proteína quinase GII
(PKGII) a qual também permite a redução dos níveis de aldosterona, mas este
25
também é influenciado diretamente pelo ANP na zona glomerulosa da glândula
adrenal por mecanismos ainda controversos (CLERICO et al., 2006). Sabe-se que
estes mecanismos podem envolver a formação de guanosina monofosfato cíclico
(GMPc) aumentando a expressão da fosfatidilesterase 2 (PDE2) que degrada
adenosina monofosfato cíclico (AMPc), substrato para a formação da aldosterona na
glomerulosa (MACFARLAND, ZELUS, BEAVO, 1991).
No coração, os peptídeos natriuréticos inibem a hipertrofia e a fibrose (RICHARDS,
2007; LI et al., 2008; MIAO et al., 2010) de maneira autócrina (KNOWLES, 2001),
sendo que a diminuição da expressão gênica do ANP resulta em hipertrofia cardíaca
(FRANCO et al., 2004).
O ANP modula a hipertrofia cardíaca induzida por sobrecarga de volume (MORO,
BERLAN, 2006) por inibição da proliferação de células de músculo liso no vaso e de
secreção de matriz extracelular pelos fibroblastos cardíacos (ROSENKRANZ et al.,
2003), porém os mecanismos ainda não estão completamente esclarecidos. Uma
possível explicação para o efeito anti-hipertrófico do ANP pode ser devido a sua
ação depressora sobre os canais de Ca++, via ativação da proteína guanilil ciclase
(pGC), produção de GMPc e ativação de PDE2 por GMPc com subsequente
depressão da proteína quinase A (PKA) dependente de AMPc no desenvolvimento
inicial dos cardiomiócitos (MIAO et al., 2010).
A inibição da hipertrofia cardíaca pelo ANP pode sofrer a influência da leptina, já que
esta modula a atividade transcricional do gene promotor do ANP por meio da
ativação da NFATc4, um tipo de fator nuclear ativado pela célula T (NFAT). Esse
fator é Ca++-calmodulina dependente e está envolvido na hipertrofia patológica.
Dessa forma, a diminuição da leptina reduz a NFATc4, assim como o ANP cardíaco
(MASCARENO et al., 2009). O ANP ao ser acoplado na guanilil cilclase A (GCA)
ativa a proteína quinase G (PKG), a qual se liga, fosforila e ativa os reguladores da
sinalização da proteína G (RGS) que interage, negativamente, com a sinalização
dos agonistas dos receptores acoplados a proteína G (GPCR), impedindo a ativação
da calcineurina que gera hipertrofia cardíaca. Entretanto, os efeitos da interação do
ANP com a GCA em modular a hipertrofia cardíaca é independente da regulação da
pressão arterial (TOKUDAME et al., 2008).
26
Os efeitos do ANP sobre a pressão arterial se devem a combinação dos efeitos
sobre o volume intravascular, natriurese, diurese e relaxamento vascular.
Camundongos transgênicos com maior expressão do gene ANP têm menor pressão
sanguínea, enquanto animais com o gene para ANP inativado são propensos a
desenvolver hipertensão (MELO et al., 1998; MELO et al., 2000). Da mesma forma,
sugere-se que o ANP pode ser importante na hipertensão relacionada com a
obesidade onde os níveis de ANP são menores (DESSÌ-FULGHERI et al., 1997). A
administração exógena de ANP promove uma forte resposta na redução da pressão
arterial, no aumento da natriurese e na excreção urinária de GMPc em indivíduos
obesos (DESSÌ-FULGHERI et al., 1999).
A manutenção dos altos níveis de pressão sanguínea pode estar relacionada a
alterações da resposta do sistema de óxido nítrico ao ANP e aos seus receptores no
coração e aorta de animais hipertensos. Em átrios, ventrículo e aorta, o ANP
interage com receptores NPR-C ativando a óxido nítrico sintase (NOS) endotelial
(eNOS) através da proteína G inibitória. Em ventrículo e aorta, a ativação da NOS
também envolve NPR-A/NPR-B(COSTA et al., 2010).
O relaxamento vascular promovido pelo ANP ocorre por uma via dependente da
proteína quinase GI (PKGI) que permite a diminuição dos níveis de cálcio intracelular
e da sensibilidade ao cálcio pelo sistema de contração muscular (POTTER, ABBEY-
HOSCH, DICKEY, 2006). Essa proteína age diretamente na fosforilação e ativação
dos canais de potássio ativados pelo cálcio (ALIOUA et al., 1998) que aumenta o
efluxo de potássio, causa hiperpolarização da membrana e inibição do influxo de
cálcio pelos canais de cálcio voltagem dependentes.
Desta forma, os peptídeos natriuréticos defendem o organismo contra a retenção de
sódio e água, inibem a produção e ação de peptídeos vasoconstrictores como a
angiotensina II, promovem relaxamento vascular e ainda inibem o sistema nervoso
simpático. Estas ações levam à redução da pressão arterial, principalmente em
situações com elevada volemia (LEVIN, GARDINER, SAMSON, 1998). A
capacidade anti-hipertensiva do ANP pode ser devido à combinação das suas ações
natriuréticas, vasodilatadoras e inibitórias sobre o sistema nervoso simpático e
SRAA.
27
Os níveis circulantes de ANP podem ser regulados ou modificados por vários fatores
fisiológicos, entre eles podem-se citar a idade, hábitos alimentares, condições
clínicas e particularmente, o gênero (CLERICO et al., 2006, CLERICO et al., 2009).
Existem duas possíveis vias pelas quais a produção dos peptídeos natriuréticos
pode ser influenciada pelo estrógeno, uma das vias está relacionada ao efeito direto
dos hormônios ovarianos sobre a expressão gênica e liberação cardíaca dos
peptídeos natriuréticos, enquanto a outra se deve a um ou mais mecanismos
mediadores como o SRAA (KUROSKI DE BOLD, 1999; XU et al., 2008). Hong et al.
(1992) demonstraram que a ovariectomia diminuiu o ácido ribonucléico mensageiro
(RNAm) de ANP transcrito no átrio, e após um tratamento por 7 dias, ratas Wistar
recebendo estradiol e progesterona, aumentaram a expressão gênica atrial de ANP.
Os diversos efeitos biológicos dos peptídeos natriuréticos são mediados pela ligação
destes hormônios a receptores específicos associados à membrana, os quais têm
sido encontrados em todos os tecidos em que os peptídeos natriuréticos agem,
incluindo adrenais, coração, tecido adiposo, cérebro, pulmões, rins, músculo liso
vascular, útero, condrócitos (POTTER, ABBEY-HOSCH, DICKEY, 2006). Existem
três subtipos diferentes de receptores de peptídeos natriuréticos (NPR). O receptor
de peptídeo natriurético do tipo A (NPR-A) e o receptor de peptídeo natriurético do
tipo B (NPR-B) são os únicos que contém um domínio catalítico intracelular guanilato
ciclase, o qual media a ação dos peptídeos natriuréticos pela produção do segundo
mensageiro GMPc (RICHARDS, 2007). O terceiro receptor, NPR-C, não está
associado com qualquer mediador intracelular específico e funciona principalmente
na captação, internalização e degradação intracelular (lisossomal) do hormônio
(POTTER, ABBEY-HOSCH, DICKEY, 2006; LEVIN, GARDINER, SAMSON, 1998).
Alguns estudos, usando técnicas de afinidade de ligação, mostraram que o NPR-B
é seletivo para CNP, sendo que este tem baixa afinidade de ligação para NPR-A. O
NPR-A é seletivo para ANP e BNP (SENGENÈS et al., 2002) e tem sua produção
aumentada em estados hipertensivos (YOSHIMOTO et al., 1995). Em contraste, o
NPR-C tem ampla especificidade, ligando-se a todos os três peptídeos natriuréticos,
apesar de ter uma maior afinidade para o ANP (ESPINER et al., 1995).
Os receptores NPR-A e NPR-B possuem um domínio extracelular ligante com
subdomínios aminas e íons cloreto em seu interior, uma região transmembrana
28
hidrofóbica, um domínio homólogo quinase intracelular, um domínio de dimerização
e um domínio guanilato ciclase carboxil-terminal com duas proteínas (HSP 70 e 90).
Acredita-se que o domínio catalítico forma um dímero em um arranjo que contém
dois sítios ativos que transforma guanosina trifosfato (GTP) em GMPc. Além disso,
há uma ligação dissulfeto no domínio extracelular. Já o NPR-C possui uma estrutura
que é apenas 30% similar ao domínio extracelular do NPR-A e NPR-B (POTTER,
ABBEY-HOSCH, DICKEY, 2006).
No estado basal, o receptor NPR-A é fosforilado em serinas ou treoninas com seis
sítios fosfatos dentro do domínio homólogo quinase afim de que o mesmo seja
sensível a ativação hormonal. Contudo, a fosforilação em alanina diminui a atividade
guanilato ciclase e consequentemente a sensibilidade do receptor. A ligação do ANP
no NPR-A induz uma mudança na conformação nas regiões do domínio extracelular
que expõe as regiões justamembranas do domínio, sendo que esse sinal é
propagado pela membrana até o domínio guanilato ciclase que permite a sua
dimerização em dois sítios ativos (POTTER, ABBEY-HOSCH, DICKEY, 2006).
Entretanto, em algumas situações patológicas, a exposição prolongada ao ANP
estimula a diminuição da sensibilidade do receptor (CLERICO et al., 2006), pois há a
desfosforilação deste que resulta em diminuição da sua atividade, processo
denominado de desensibilização e inibe o processo de fosforilação necessário para
o acoplamento do ANP no NPR-A. Porém, a liberação do ligante e refosforilação
retorna o receptor ao seu estado basal para novos acoplamentos (POTTER,
ABBEY-HOSCH, DICKEY, 2006), permitindo que o ANP promova os seus efeitos
fisiológicos em um novo acoplamento.
A expressão do NPR-C está aumentada em tecido adiposo humano (SARZANI,
2004), o que aumenta o clearence de ANP e consequentemente, diminui os seus
níveis plasmáticos. A expressão de ANP em tecido adiposo e pré-adipócitos sugeriu
a existência de um sistema autócrino/parácrino de ANP nesse tecido, cujas
implicações na lipólise e na função cardiovascular ainda não foram completamente
estudadas (GARRUTI et al., 2007).
Segundo Wang et al. (2004) o índice de massa corporal foi inversamente associado
com os níveis de peptídeos natriuréticos. O sobrepeso foi associado com níveis
29
plasmáticos de peptídeos natriuréticos de 1,4 a 3,5 vezes menores, assim como na
obesidade em que os níveis foram de 1,8 a 4,8 vezes mais baixos. Os níveis
plasmáticos de peptídeos natriuréticos eram 6-27% maiores em indivíduos
hipertensos comparados com não hipertensos. No entanto, indivíduos com
sobrepeso e obesidade e ainda hipertensão, tinham baixos níveis de BNP e N-
peptídeo natriurético pré-atrial terminal (N-ANP) comparados com indivíduos não
hipertensos com IMC normal. Os mesmos autores citam que a redução da atividade
dos peptídeos natriuréticos é uma manifestação da síndrome metabólica que pode
ter importantes implicações clinicas e fisiopatofisiológicas. Porém, os mecanismos
responsáveis pela relação inversa entre os peptídeos natriuréticos e a massa
corporal não foram totalmente esclarecidos (RICHARDS, 2007).
Um possível mecanismo para a redução dos peptídeos natriuréticos em obesos
pode ser devida aos receptores do tipo C, NPR-C, abundantes no tecido adiposo, e
que participam na remoção dos peptídeos natriuréticos da circulação (LAFONTAN et
al., 2005; MORO et al., 2004). A secreção reduzida de peptídeos natriuréticos pela
menor liberação (LICATA et al., 1994) ou pela diminuição de sua síntese
(MORABITO, VALLOTTON, LANG, 2001) pode também ser uma explicação
importante para os baixos níveis de peptídeos natriuréticos no plasma de indivíduos
obesos. Além disso, também é hipotetizado que a endopeptidase neutra (EPN), que
realiza proteólise de peptídeos natriuréticos e está presente na membrana de
adipócitos e pré-adipócitos (SCHLING, SCHA¨FER, 2002), pode está elevada na
obesidade e contribuir para a depuração dos peptídeos natriuréticos circulantes
(MORO et al., 2007).
Foi demonstrado que a ligação de ANP ao receptor NPR-A em adipócitos, induz
mobilização e oxidação lipídica em primatas (SENGENÈS et al., 2000; LAFONTAN
et al., 2005; BIRKENFELD et al., 2005). Em outras espécies como em ratos, a menor
responsividade do tecido adiposo ao ANP pode estar relacionada com a maior
expressão de NPR-C. Além disso, a estimulação da pequena quantidade de NPR-A
existente não é suficiente para promover o aumento do GMPc necessário para a
fosforilação da lipase hormônio sensível (HSL) (LAFONTAN et al., 2005).
Dessa forma, baixos níveis de peptídeos natriuréticos podem reduzir a lipólise e
consequentemente perpetuar o estado obeso (WANG et al., 2004). Nesse caso,
30
além da ausência ou diminuição dos efeitos cardioprotetores dos peptídeos
natriuréticos, o quadro da obesidade também se agrava devido à diminuição da
lipólise, constituindo um ciclo vicioso. Os peptídeos natriuréticos também regulam a
proliferação de adipócitos e a expansão do tecido adiposo visceral (SARZANI et al.,
2008).
O efeito lipolítico do ANP envolve uma via dependente de GMPc que não está
relacionada com a PKA, com a inibição da fosfodiesterase PDE-3B ou ainda pela
alteração na produção de AMPc. Esse efeito está relacionado com a ativação da
PKG, a qual promove a fosforilação da perilipina e da HSL (LAFONTAN et al., 2005).
Estes achados, de um novo controle da lipólise pelos peptídeos natriuréticos,
levantam a questão da função fisiológica desta nova via lipolítica e seu possível
envolvimento com o desenvolvimento e a patogênese da obesidade (SENGENÈS et
al., 2000).
Mais recentemente foi demonstrado que o ANP inibe a produção de adipocinas e
citocinas ligadas ao desenvolvimento da resistência à insulina (MORO, BERLAN,
2006) e aumenta a produção de adiponectina, proteína anti-inflamatória nos
adipócitos humanos, com possível efeito benéfico sobre o sistema cardiovascular
(TSUKAMOTO et al., 2009). Também foi verificada associação entre os níveis
plasmáticos de BNP com o desenvolvimento da resistência à insulina na hipertensão
associada à obesidade (TEKES, CIKIM, 2007), assim como com a hipertrofia
cardíaca (RITTER, NEYSES, 2003).
Em um estudo realizado com 3333 indivíduos com insuficiência cardíaca, observou-
se que os níveis plasmáticos de peptídeo natriurético foram inversamente
associados com todos os componentes da síndrome metabólica, exceto com a
pressão sanguínea elevada, o que sugere que a redução da atividade dos peptídeos
natriuréticos é uma manifestação da síndrome metabólica que pode ter importantes
implicações clínicas e fisiopatológicas (WANG et al., 2007).
Sarzani et al (1999) mostraram que variações na região promotora do gene Npr3
que codifica o receptor depurador de peptídeos natriuréticos NPR-C, foi associada
com baixos níveis de ANP e alta pressão sanguínea em pacientes obesos
hipertensivos que tinham uma reduzida taxa de expressão NPR-A/NPR-C no tecido
31
adiposo. Em um de seus estudos, Sarzani et al. (2004) mostraram uma possível
associação entre polimorfismo NPR-C C(55)A com índice de massa corporal,
distribuição de gordura corporal e pressão sanguínea em homens. Não houve
diferença significativa nos índices antropométricos, pressão sanguínea e variáveis
bioquímicas relevantes entre os genótipos. Há especulações que a variação
genética Npr3 poderia estar associada com uma alteração funcional no metabolismo
do tecido adiposo, levando a diferenças quantitativas na deposição da gordura
corporal.
Dessì-Fulgheri, Sarzani, Raprelli (1998) buscando elucidar o papel fisiopatológico
dos peptídeos natriuréticos e sua relação com o tecido adiposo, compararam a
expressão gênica de ANP e dos receptores NPR-A e NPR-C nos tecidos adiposos
de humanos e ratos. O ANP plasmático encontrado foi menor em obesos
hipertensivos do que nos normotensivos, entretanto, em sujeitos não-obesos o ANP
plasmático foi maior em hipertensos do que em normotensos. A razão dos níveis de
RNAm NPR-A/NPR-C foi significantemente menor em obesos hipertensos, o que
sugere uma diminuição da atividade biológica e aumento da depuração de peptídeos
natriuréticos no tecido adiposo. Esses dados suportam a hipótese de uma possível
participação do sistema de peptídeos natriuréticos na obesidade relacionada à
hipertensão.
Existem evidências de que a dieta tem um efeito regulador na pressão sanguínea,
bem como na atividade renal (DESSÌ-FULGHERI, SARZANI, RAPRELLI, 1998). Em
um estudo, oito pacientes obesos e hipertensos receberam uma dieta com baixo teor
calórico e em seguida, injeção em bólus de ANP exógeno. A injeção de ANP depois
da dieta foi acompanhada de um aumento nos níveis de ANP similares ao
observado antes da dieta. Uma significante diminuição da pressão sanguínea
sistólica e diastólica foi observada depois de quatro dias de dieta com baixo teor
calórico e o início da fase de perda de peso foi acompanhada por um considerável
aumento na diurese e natriurese. Houve uma significante redução da aldosterona
plasmática observada com a administração de ANP depois da dieta com restrição de
calorias (DESSÌ-FULGHERI et al., 1999). Sengenès et al. (2002) observaram que o
consumo de dieta hipocalórica promoveu a melhora da lipólise. Estes achados
confirmam a importância da captação calórica na modulação da atividade biológica
32
de ANP, sugerindo que o sistema de peptídeos natriuréticos pode ter participação
nas mudanças agudas da natriurese e diurese associada com a restrição calórica.
Percebe-se, portanto, a existência de evidências de que o sistema de peptídeos
natriuréticos esteja envolvido no desenvolvimento tanto da hipertensão quanto da
obesidade. O esclarecimento da participação do sistema de peptídeos natriuréticos
na hipertensão e na obesidade, especialmente no quadro da pós-menopausa, trará
contribuições para a prevenção e tratamento das mesmas.
02.2 Hipertensão, menopausa e obesidade
Além dos peptídeos natriuréticos, outras hipóteses a respeito da hipertensão
associada à obesidade na pós-menopausa têm sido estudadas. O estudo da
transição à menopausa e da terapia de reposição hormonal pós-menopausa tem
fornecido evidências de que os esteróides sexuais desempenham função importante
como reguladores da distribuição de gordura e na redução dos fatores de risco para
doenças cardiovasculares. De fato, a menor incidência de doenças cardiovasculares
tanto em mulheres antes da menopausa quanto em ratas e camundongas tem
levantado à hipótese de que os hormônios sexuais, particularmente o estrógeno,
sejam responsáveis por uma proteção cardiovascular (MENDELSOHN, KARAS,
1999; JANKOWSKI et al., 2001; TOSTES et al., 2003) contribuindo para redução
tanto do peso do tecido adiposo (BELO et al., 2008; COOKE, NAAZ, 2004) quanto
da pressão arterial (BELO et al., 2004; WEST et al., 2001).
Vários mecanismos têm sido propostos para tentar elucidar os efeitos diretos e
indiretos do estrógeno no sistema cardiovascular, como por exemplo, redução da
pressão arterial e atividade oxidante, alterações no metabolismo lipídico e de
depósito do tecido adiposo (TOSTES et al., 2003). A administração de estradiol
diminuiu a pressão arterial de mulheres normotensas após dois meses de
tratamento (CAGNACCI et al., 1999). Estradiol administrado oralmente ou por via
transdérmica diminuiu a resistência vascular periférica e consequentemente a
pressão arterial de mulheres na pós-menopausa (WEST et al., 2001).
Os mecanismos pelos quais o estrógeno realiza essas alterações no sistema
cardiovascular ainda são incertos, sendo alvo de inúmeros estudos. Existem
33
evidências sugerindo que o estrógeno pode afetar a função cardiovascular, por
reduzi a pressão arterial, via ação direta nos vasos sanguíneos (MURPHY, KHALIL,
2000), ação central no sistema nervoso autônomo (SALEH, CONNELL, SALEH,
2000), formação de substâncias vasodilatadoras, como oxido nítrico (TOSTES et al.,
2003), ou inibição da formação e/ou ação de substâncias vasoconstritoras, como as
prostaglandinas (PG) H2 (PGH2) e F2a (PGF2a) (DANTAS et al., 1999) e angiotensina
II (TAKEDA-MATSUBARA et al., 2002).
Nas células endoteliais, o estradiol altera ou modula o fluxo de íons e de receptores
da musculatura lisa. O estradiol aumenta a biodisponibilidade de óxido nítrico (NO)
(TOSTES et al., 2003), diminui a expressão de receptores de angiotensina do tipo 1
(AT1), de angiotensina II pelo NO (NICKENIG et al., 2000) e diminui a endotelina-1
(ET-1) e seus receptores (TOSTES et al., 2003). Também inibi o crescimento da
musculatura lisa vascular promovida pelos receptores AT1 (TAKEDA-MATSUBARA
et al., 2002). Nas células da musculatura lisa vascular, o 17-ß-estradiol pode
desempenhar uma função seletiva na regulação do tônus da musculatura lisa
vascular por modular a permeabilidade dos canais iônicos de K+ sensíveis a ATP
(KATP) (MARTINEZ et al., 2001), assim como dos canais de Ca++ (TOSTES et al.,
2003).
A implicação da ação benéfica e protetora do estrógeno na circulação cardiovascular
necessita ser completamente elucidada para o esclarecimento das condições
fisiopatofisiológicas observadas na pós-menopausa, como por exemplo, a
hipertensão arterial, e para sua aplicação na prática clínica. Como a obesidade é
fator de risco para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares, em especial
hipertensão arterial, a ação do estrógeno no tecido adiposo também merece
destaque.
O estrógeno tem sido descrito como o principal regulador do tecido adiposo em
fêmeas adultas (COOKE, NAAZ, 2004) regulando a sua deposição de maneira
dependente da localização do depósito. As mulheres têm mais tecido adiposo
subcutâneo do que os homens, com uma média de percentual de gordura corporal
em mulheres jovens de 25% contra 15% em homens (CHUMLEA et al., 1981). O
aumento da gordura abdominal nas mulheres na pré-menopausa parece ser inibido
34
pelo estrógeno, quando são comparadas com os homens que tendem a ter um
depósito de gordura no abdômen.
Todavia, a gordura abdominal pode aumentar nas mulheres no período pós-
menopausa (LEY, LESS, STEVENSON, 1992), o que está correlacionado com um
aumento no risco de desenvolvimento de várias doenças. No Brasil, a prevalência de
obesidade cresce nas mulheres na pós-menopausa. Na faixa etária de 18 a 24 anos
é de 6,2% e, na faixa etária de 55 a 64 anos é de 21,3%. O mesmo ocorre com o
excesso de peso que aumenta de 24,9% para 52,9% nas mulheres nas mesmas
faixas etárias (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2010).
A ovariectomia em roedores ou a menopausa em mulheres resulta em aumento do
depósito de tecido adiposo (COOKE, NAAZ, 2004) que está correlacionado com
baixos níveis de estradiol (FERRARA et al., 2002). Já o tratamento com estradiol
diminui o tecido adiposo visceral em mulheres na pós-menopausa (MUNOZ,
DERSTINE, GOWER, 2002). Animais manipulados geneticamente fornecem fortes
evidências que o estrógeno modula a quantidade de tecido adiposo. Tanto
camundongas que não expressam o receptor para estrógeno do tipo α, (HEINE et
al., 2000), quanto as que não expressam a enzima aromatase (JONES et al., 2000),
apresentam uma grande quantidade de tecido adiposo. Este efeito do estrógeno
pode acontecer através da diminuição da lipogênese (HOMMA et al., 2000),
aumento da lipólise por meio da ativação da HSL (PALIN et al., 2003), aumento dos
efeitos lipolíticos da epinefrina (SHERWOOD et al., 2010) e da oxidação dos ácidos
graxos (MISSO et al., 2003). Assim, percebe-se que o estrógeno desempenha
também importante função na regulação do tecido adiposo.
Existem dois tipos de receptores de estrógeno (ERs) intracelulares: tipo α (ERα) e
tipo β (ERβ) e seus variantes (MARINO, GALLUZZO, 2008), não totalmente
homólogos e consequentemente, passivos de não possuírem efeitos semelhantes
na interação com o estrógeno (TOSTES et al., 2003). As diferenças fisiológicas na
interação do ERβ em relação ao ERα com o estrógeno ou elementos responsivos a
este se deve a falta de habilidade e capacidade da terminação amina do ERβ
interagir com o domínio carboxil-terminal de ativação dependente de hormônio (LI et
al., 2008).
35
A função do receptor de estrógeno tipo α (ERα) no tecido adiposo foi verificada ao
comparar os tecidos adiposos de camundongos selvagens com os que não
expressam ERα (ERαKO). Observou-se que a ausência de ERα causa um aumento
de 100% da massa de tecido adiposo decorrente de hiperplasia e hipertrofia
adipocitárias, além de resistência à insulina e intolerância à glicose (HEINE et al.,
2000). Isso indica que ERα regula a deposição de tecido adiposo (DIEUDONNÉ et
al., 2004).
Para avaliar a participação da sinalização E2/ERβ no tecido adiposo, camundongos
que não expressam ERβ (ERβKO) foram ovariectomizados e observou-se que
nesses animais houve diminuição do tecido adiposo e da massa corporal
comparados aos apenas operados (sham-operados). Isso indica que ERβKO deve
ter um efeito inibitório na deposição do tecido adiposo que é o oposto ao efeito
mediado pelo ERα (NAAZ et al., 2002). Dessa forma, apesar do ERα ser o
modulador predominante dos efeitos do estrógeno no tecido adiposo, ERβ parece
também possuir um papel nos efeitos do estrógeno sobre os adipócitos.
No metabolismo lipídico, a reposição de estrógenos em mulheres na pós-
menopausa demonstrou impacto na diminuição dos níveis séricos de colesterol total
(HAARBO, MARSLEW, 1991) e de lipoproteína de baixa densidade (STAMPFER et
al., 1991). Além disso, o estrógeno é o maior supressor da lipase lipoprotéica
(HOMMA et al., 2000) no tecido adiposo em mulheres, o que contribui para a
prevenção de lesão cardiovascular.
Contrariamente aos seus efeitos gerais anti-lipogênicos e lipolíticos, os estrógenos
em locais específicos, atenuam os efeitos dos receptores adrenérgicos α2A no
tecido adiposo subcutâneo e diminui a lipólise, o que favorece o aumento da
deposição desse tipo de tecido em mulheres comparadas aos homens (PEDERSEN
et al., 2004).
Os mecanismos pelos quais o estrógeno influencia esses efeitos anti-lipogênicos,
lipolíticos, cardioprotetores não são totalmente conhecidos, porém podem ser devido
aos efeitos tardios e de duração prolongada, denominados de efeitos “genômicos”, e
os efeitos de início rápido e curta duração, chamados de efeitos “não-genômicos”.
Os efeitos rápidos levam minutos para ocorrerem, como as mudanças no tônus
36
vasomotor, sendo mediados por sinalizações celulares rápidas, enquanto os tardios
incluem, por exemplo, remodelamento e alterações lipídicas que requerem horas ou
dias para ocorrerem e eventos de transcrição de RNA mensageiro e expressão
protéica são necessários. Apesar desses efeitos serem facilmente diferenciados um
dos outros, existem ações rápidas do estradiol que ainda não se sabe se são
oriundas de mecanismos genômicos ou não-genômicos (TOSTES et al., 2003;
MARINO, GALLUZZO, 2008).
Assim como os receptores de outros hormônios esteroidais e tireoidianos, os
receptores de estrógenos pertencem a uma classe de receptores intracelulares que
têm fatores de transcrição relacionados ao núcleo. Dessa forma, a ativação desses
receptores deflagra a ação de uma sequência específica nos genes alvos que
modula a transcrição do RNAm (BEATO, SANCHEZ-PACHECO, 1996). Entretanto,
os efeitos do estrógeno de início rápido (não-genômicos) são mediados por
receptores localizados na superfície da membrana celular que levam a ativação da
proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK), produção de GMPc e liberação de
NO. Mais recentemente, observou-se que a sinalização envolve caminhos não
totalmente esclarecidos tais como PKG e segundos mensageiros (RUSSEL et al.,
2000) ou mesmo a mobilização Ca++, proteína quinase C (PKC) e fosfatidilinositol-3-
OH inuase (PI3-kinase) (KELLY, LEVIN, 2001; SIMONCINI et al., 2000).
HODGES et al. (2000) sugerem que os efeitos do estrógeno nas células vasculares
e, possivelmente no miocárdio, dependem da expressão relativa de ERα e ERβ.
Contudo, as funções desses receptores nas funções cardíacas não são conhecidas.
ERα e ERβ distribuem-se diferentemente no organismo. ERα tem alta expressão
identificada na hipófise, rins, epidídimo e glândulas adrenais, enquanto ERβ tem alta
expressão na próstata, pulmões, cérebro e bexiga. Em alguns locais há alta
expressão simultânea desses dois receptores de estrógeno, incluindo ovários,
testículos e útero. Na vasculatura, esses dois receptores têm sido identificados no
endotélio, íntima, adventícia e terminações nervosas adrenérgicas das artérias
(TOSTES et al., 2003). No tecido adiposo, ERs são expressos nos pré-adipócitos
(DIEUDONNÉ et al., 2004) e o estrógeno pode potencialmente regular o
desenvolvimento do pré-adipócito bem como atuar diretamente no adipócito
(COOKE, NAAZ, 2004).
37
Os estrógenos são capazes de produzir efeitos nos outros tecidos que regulam o
apetite, o gasto energético ou o metabolismo. ERs são amplamente distribuídos no
hipotálamo, o local primário da regulação do balanço energético ou mesmo no
fígado, onde os efeitos dos estrógenos podem produzir mudanças metabólicas que
afetam a deposição adiposa (COOKE, NAAZ, 2004).
Jankowski et al. (2001) observaram que o RNAm do ERβ foi expresso em alto nível
no átrio esquerdo de ratos e foi 3 a 4 vezes menor nas outras câmeras cardíacas de
ratos jovens. Porém em ratos adultos, o ERβ diminuiu 20 vezes no átrio esquerdo e
em menor extensão nas outras câmeras cardíacas. Com a ovariectomia, observou-
se a diminuição do ERα, da razão átrio/massa corporal e expressão gênica e
protéica de ANP, mas nenhuma alteração na pressão sanguínea sistólica e após a
reposição hormonal, essas mudanças foram revertidas, junto com a diminuição da
frequência cardíaca. Percebe-se que o aumento da expressão e secreção de ANP
em resposta a ativação do ERα pode ser um mecanismo de proteção no coração por
diminuição do consumo de oxigênio secundário à bradicardia.
Existem evidências que camundongos que não expressam o gene para ANP ou
NPR-A apresentam hipertrofia mais evidente nos átrios do que nos ventrículos,
sendo o espessamento cardíaco mais pronunciado em machos do que em fêmeas
(JOHN et al., 1995; OLIVER et al., 1998), o que sugere uma interação dos
estrógenos e ANP na prevenção da hipertrofia cardíaca. A co-localização dos ERs e
ANP nos miócitos cardíacos (BACK, FORSSMANN, STUMPF, 1989) e a
estimulação da secreção de ANP em átrio direito isolado de ratos por 17-β-estradiol
(DENG, KAUFMAN, 1993) sugere que o ANP age como um mediador da ação do
estrógeno. Além disso, muitos dos efeitos cardiovasculares do estrógeno são
semelhantes aos do ANP.
02.3 Modelo experimental de hipertensão e obesidade na pós-menopausa
Vários modelos experimentais são utilizados para estudar a patogênese da
obesidade e de condições associadas como resistência a insulina, diabetes mellitus
tipo 2 e dislipidemia, chamadas em conjunto de síndrome metabólica. Existem
38
alguns modelos animais de obesidade, como obesidade induzida por lesão do
núcleo hipotalâmico ventromedial (SHIMIZU et al., 2003), por dietas hipercalóricas e
através de mutações genéticas (ROBINSON, DINULESCO, CONE, 2000). Dentre
estes, o modelo mais simples e o que mais se assemelha a obesidade humana é o
modelo de obesidade exógena, onde é oferecido ao animal um maior aporte
calórico, através de uma sobrecarga de carboidratos ou de gordura, isoladamente ou
em associação (VON DIEMEN, TRINDADE, TRINDADE, 2006). A primeira descrição
de dieta com alto teor de gordura data de 1959 (MASEK, FABRY, 1959). Nestes
modelos experimentais, acrescenta-se ou associa-se, à ração padrão substâncias
altamente calóricas.
Como ressaltado neste estudo, atualmente, uma das doenças de maior relevância,
devido aos altos índices de mortalidade na população mundial, é a hipertensão
associada à obesidade. Diante disto, ressalta-se a importância do uso de modelos
animais apropriados para o estudo dos mecanismos envolvidos entre obesidade e o
desenvolvimento de hipertensão arterial.
Os modelos experimentais de obesidade em roedores como o ob/ob, os ratos
Zucher e os ratos espontaneamente hipertensos e obesos têm sido utilizados na
pesquisa cardiovascular. Entretanto, estes modelos podem não apresentar as
mesmas características que os humanos obesos, como hipertensão, hiperglicemia,
hiperinsulinemia e hipertrofia cardíaca (AMERICAN HEART ASSOCIATION, 2005;
CONTI et al., 2004). Ao contrário, os modelos de obesidade induzidos por dieta
mostram-se promissores para o estudo dos mecanismos renais (Hall et al., 1998) e
cardiovasculares (CARROLL, TYAGI, 2005; CARROLL et al., 1996) envolvidos em
doenças relacionadas com a obesidade.
Estudos subsequentes têm revelado que a dieta com alto teor de gordura promove
hiperglicemia e resistência à insulina. Assim, é geralmente aceito que as dietas com
alto teor de gordura podem ser utilizadas como modelo de hipertensão associada à
obesidade (OAKES et al., 1997, AHREN et al., 1999; LINGOHR, BUETTNER,
RHODES, 2002). A maioria dos modelos de hipertensão associada à obesidade
utilizam ratos (LANDA et al., 2007; CARROLL et al., 1996; BARNARD et al. 1998;
COATMELLEC-TAGLIONI et al., 2002; DOBRIAN et al., 2000; DOBRIAN et al.,
2001). A utilização de dietas hipercalóricas com elevada concentração de lipídios,
39
em estudos de obesidade em animais de laboratório, baseia-se na correlação
positiva previamente observada entre o consumo de gordura dietética e a incidência
de obesidade e as complicações clínico-metabólicas a ela associadas (WOODS et
al., 2003) como hipertensão, hipertrofia cardíaca e distúrbios renais (DOBRIAN et
al., 2000). Jakobsen et al. (2004) verificaram que o aumento de apenas 5% dos
níveis energéticos de ingestão de gordura saturada foi associado com um aumento
de 36% no risco de doença cardíaca coronariana entre mulheres.
Em um estudo de revisão, Buettner et al. (2007) observaram que gorduras animais e
ômega-6 e 9 contido em óleos de plantas podem ser usados para gerar fenótipos de
obesidade e resistência insulínica em roedores, enquanto animais alimentados com
óleos de peixe não desenvolvem essas desordens. Segundo Jakobsen et al. (2009)
a diminuição de 5% na ingestão de ácidos graxos saturados (AGS) e concomitante
aumento na ingestão de ácidos graxos poliinsaturados (AGP) promoveram a
redução no risco de eventos e mortes por causas coronarianas, mas a mesma
diminuição na ingestão de AGS e a substituição por carboidratos gerou uma
modesta associação entre a introdução de carboidratos e o surgimento de eventos
coronarianos. Entretanto, nesse estudo o tipo de carboidrato utilizado não foi
apresentado, o que dificulta comparações em relação aos efeitos deletérios
proporcionados, por exemplo, por uma dieta hipersacarídica.
Os carboidratos utilizados nas dietas de animais de laboratório consistem
principalmente de açucares mais reduzidos (sacarose, frutose, glicose), amido e
fibras. Dietas contendo elevados teores de sacarose ou frutose têm sido associadas
a distúrbios metabólicos, como hipertrigliceridemia (KEENAN et al., 1999), aumento
dos teores plasmáticos de ácidos graxos não esterificados, aumento do acúmulo de
triacilgliceróis no fígado e coração e hipersinsulinemia acompanhada por resistência
à insulina (LUO et al., 1995).
A ingestão de carboidratos, particularmente, de frutose, pode ter um papel
importante nas doenças cardiorenais que pode ser mediado, em parte, pela
habilidade da frutose aumentar o ácido úrico (JOHNSON et al., 2007). Este caminho
explica também por que roedores são relativamente resistentes à frutose, pois esses
animais têm menores concentrações de ácido úrico devido à presença de uma
enzima (uricase) que degrada ácido úrico à alantoína. Além disso, quando uricase é
40
inibida no rato, a frutose causa um aumento de cinco vezes nas concentrações de
ácido úrico (STAVRIC et al., 1976).
A frutose é captada nos hepatócitos e em outras células, inlcuindo células tubulares,
adipócitos, células epiteliais intestinais, onde é completamente metabolizada pela
frutoquinase com o consumo de ATP, ao contrário do metabolismo da glicose que
possui mecanismo regulatório negativo para prevenir a depleção de ATP
(PERHEENTUPA, RAIVIO, 1967). Como consequência, o ácido lático e o ácido úrico
são gerados no processo de metabolização da frutose e suas concentrações se
elevam, promovendo efeitos hipertensivos no organismo devido a alterações como a
inibição da NOS na mácula densa, a estimulação da renina e a redução da
biodisponibilidade do óxido nítrico endotelial (MAZZALI et al., 2001; NAKAGAWA et
al., 2006).
Além disso, alguns dos resíduos metabólicos de três carbonos da frutose podem ser
convertidos à glicose através de gliconeogênese ou podem, eventualmente, ser
usados para a síntese de glicerol e ácidos graxos que através da esterificação pode
formar triglicerídeos (TG), ao contrário do metabolismo da glicose, em que há vários
processos que inibem a formação dos TG a partir própria glicose (HAVEL, 2005).
Portanto, alta ingestão de carboidrato refinado pode resultar em alta de síntese de
TG devido à falta de regulação desse caminho.
Dessa forma, indiretamente, a dieta com alto teor de frutose (também a sacarose,
constituída por aproximadamente 50% de frutose) pode constituir um fator de risco
independente para doenças (JOHNSON et al., 2007), por participar do
desenvolvimento da síndrome metabólica e obesidade (NAKAGAWA et al., 2006) e
esta pode estar relacionada à inabilidade da frutose em estimular a insulina e leptina
e inibir a grelina, fatores que são conhecidos por afetar o centro da saciedade no
sistema nervoso central (MAZZALI et al., 2001).
A grande maioria dos modelos animais de dieta disponíveis utiliza ratos machos e os
poucos estudos com fêmeas ou não encontraram aumento de pressão arterial
relacionada com a obesidade induzida por dieta (UEMURA, MORI, 2006;
COATMELLEC-TAGLIONI et al., 2002) ou não mensuraram a pressão arterial
(BARTNESS et al., 1992). Em coelhas foi observado aumento da massa corporal e
41
da pressão arterial após 12 semanas com uma dieta contendo 15% de gordura
(CARROLL et al., 1996). Uemura, Mori (2006) relatam que após 3 meses de
consumo de dieta com 50% de gordura na composição, as ratas não apresentaram
qualquer alteração na pressão arterial. Também Coatmellec-Taglioni et al. (2002)
não observaram aumento de pressão arterial em ratas após 10 semanas com uso da
dieta da cafeteria, apesar do aumento significativo da massa corporal.
Por outro lado, modelos animais que foram utilizados para o estudo da hipertensão
semelhantes à pós-menopausa como, por exemplo, ratas espontaneamente
hipertensas ovariectomizadas (BELO et al., 2004), ganham pouco peso e não
podem ser utilizados para estudar a associação entre obesidade e hipertensão.
Assim, um dos objetivos deste trabalho foi padronizar um modelo de hipertensão
associada à obesidade em ratas Wistar através de castração e utilização de dietas
hipercalóricas e verificar a participação do sistema de peptídeos natriuréticos na
hipertensão associada à obesidade induzidas por dieta hipercalórica neste modelo.
42
OBJETIVOS
43
03. OBJETIVOS
03.1 Objetivo Geral
Determinar a participação do sistema de peptídeos natriuréticos na patogênese da
hipertensão associada à obesidade em ratas Wistar ovariectomizadas alimentadas
com dieta hipercalórica.
03.2 Objetivos Específicos
1. Comparar os efeitos das dietas com alto teor de lipídeos (DL) ou alto teor de
carboidrato refinado (DS) com a dieta controle (DC) na pressão arterial sistólica e
média, massa corporal, na massa de diferentes depósitos de tecido adiposo em
ratas Wistar ovariectomizadas ou sham operadas.
2. Avaliar os níveis de ANP no plasma de ratas Wistar submetidas às dietas de alto
índice calórico.
3. Verificar alterações na síntese de ANP a partir da determinação da expressão
gênica de ANP em átrio direito e esquerdo de ratas Wistar alimentadas com dieta
hipercalórica por transcrição reversa - reação em cadeia polimerase (RT-PCR).
4. Avaliar a expressão gênica de receptores natriuréticos, NPR-A no rim e NPR-C
em tecido adiposo e rim de ratas Wistar alimentadas com dieta hipercalórica por RT-
PCR.
5. Determinar o diâmetro dos cardiomiócitos e verificar a presença de fibrose por
análise morfológica e histológica de ventrículos de ratas Wistar alimentadas com
dieta hipercalórica.
44
MATERIAL E MÉTODOS
45
04. MATERIAL E MÉTODOS
04.1 Animais
Foram utilizadas 30 ratas Wistar provenientes do Centro de Criação de Animais do
Instituto de Ciências da Saúde da Universidade Federal da Bahia (UFBA), e
mantidas no biotério do Instituto Multidisciplinar em Saúde/UFBA em ambiente com
controle de luz (12 horas de luz, das 7 às 19h) e temperatura (23±3°C) e livre acesso
à água e ração. O transporte ocorreu de acordo com as recomendações do Instituto
Nacional de Saúde para os cuidados e uso de animais de laboratório e esse estudo
foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade
Estadual de Feira de Santana, conforme Anexo 1.
Os animais consumiram ração padronizada do Instituto de Nutrição Americana (AIN)
93 (Pragsoluções, São Paulo, SP) descrita por Reeves, Nielsen, Fahey (1993) até o
dia da ovariectomia. As ratas foram ovariectomizadas ou sham-operadas com dez
semanas de idade e a partir desse momento, aleatoriamente, os animais foram
divididos nos seguintes grupos, conforme a dieta recebida:
· Dieta com alto teor de sacarose (52,9%) (dieta hipersacarídica – DS;
Pragsoluções Biociências, SP).
· Dieta contendo 54,4% do total de calorias oriundas de gordura (dieta
hiperlipídica - DL; Pragsoluções Biociências, SP).
· Dieta controle (DC) (ração padronizada AIN 93; Pragsoluções Biociências,
SP).
Após a ovariectomia as ratas foram colocadas em gaiolas metabólicas durante
quatro dias para determinação da ingestão alimentar. O mesmo procedimento foi
realizado na sexta, décima segunda e vigésima quarta semana de dieta. Nos demais
dias, os animais foram acomodados em caixas com cinco animais em cada uma
delas de acordo com a dieta recebida.
46
04.2 Dietas experimentais
As dietas experimentais foram calculadas utilizando-se como base a recomendação
para dietas de roedores de laboratórios elaborada pelo American Institute of Nutrition
e reportada por Reeves, Nielsen, Fahey (1993).
As proporções dos ingredientes nas dietas experimentais, expressas na matéria
seca e a composição bromatológica das dietas encontram-se descritas na Tabela 1.
Tabela 1 – Proporções dos ingredientes nas dietas experimentais
Ingredientes DC DL DS -------------------% MS--------------------- Amido de milho 37,38 13,88 2,50 Soja 30,50 30,50 - Caseína - - 14,20 Amido de milho dextrinizado 10,00 10,00 2,90 Sacarose 6,00 6,00 57,00 Óleo de soja 7,50 7,50 14,50 Sebo bovino 0,50 24,00 - Fibra (pó de celulose) 3,17 3,17 4,00 Mistura mineral (AIN-93M-MX) 1 3,50 3,50 3,50 Mistura Vitamínica (AIN-93-VX)2 1,00 1,00 1,00 L-cistina 0,30 0,30 0,18 Bitartarato Colina 0,15 0,15 0,22 Tert-butil-hidroquinona 0,0014 0,0028 0,0030 Total 100,00 100,00 100,00 1Mistura mineral AIN-93G-MX: 35,7% de carbonato de cálcio; 25% de fosfato monobásico de potássio; 7,4% de cloreto de sódio; 4,66% de sulfato de potássio; 2,8% de citrato de potássio; 2,4% de óxido de magnésio; 0,606% de citrato férrico; 0,165% de carbonato de zinco; 0,063% carbonato de manganês; 0,03% de carbonato de cobre; 0,001% de iodato de potássio; 0,001% de selenito de sódio; 0,0008% de paramobdato de amônia; 0,145% de metasilicato de sódio; 0,0275% de sulfato de potássio e cromo; 0,0082% de ácido bórico; 0,00635% de fluoreto de sódio; 0,00318% de carbonato de níquel; 0,00174% de cloreto de lítio; 0,00066% vanadato de amônio; 20,98% de sacarose em pó. 2Mistura vitamínica AIN-93-VX- Composição de vitaminas por kg de dieta: 30mg de ácido nicotínico; 15mg de ácido pantotênico; 6mg de piridoxina; 5mg de tiamina; 6mg de riboflavina; 2mg de ácido fólico; 750ug de vitamina K; 200ug de D-biotina; 25ug de vitamina B-12; 4000UI de vitamina A; 1000UI de vitamina D3; 75UI vitamina E.
As contribuições das frações de proteínas, carboidratos e gorduras no total de
energia metabolizável das dietas experimentais encontram-se descritas na tabela 2.
47
Tabela 2 – Contribuição das frações de proteínas, carboidratos e gorduras no total
da energia metabolizável nas dietas experimentais.
Item Dietas experimentais DC DL DS
Energia Metabolizável (Mcal/kg-1) 3,77 4,94 4,31 % de contribuição das frações dietéticas Proteína 20,8 14,4 16,8 Carboidratos 68,6 31,2 52,9 Gorduras 10,6 54,4 30,3
As frações de carboidratos das dietas experimentais foram calculadas de forma que
a dieta DS apresentasse maior contribuição da sacarose, em detrimento da fração
de amido, no fornecimento da energia metabolizável, como se pode constatar na
tabela 3.
Tabela 3 – Contribuição das frações de amido e sacarose no total da energia
metabolizável nas dietas experimentais.
Item Dietas experimentais DC DL DS
Energia Metabolizável dos
carboidratos (Mcal/kg-1)
2,34 1,54 2,28
% de contribuição das frações dietéticas
Amido 84,26 75,96 7,3
Sacarose 15,74 24,04 92,7
04.3 Procedimento experimental
As trinta ratas Wistar com dez semanas (150 a 200g de massa corporal) foram
ovariectomizadas e divididas, aleatoriamente, nos seguintes grupos com cinco
animais cada:
· Ratas ovariectomizadas alimentadas com dieta controle (DCO)
· Ratas ovariectomizadas alimentadas com dieta hiperlipídica (DLO)
· Ratas ovariectomizadas alimentadas com dieta hipersacarídica (DSO)
· Ratas sham alimentadas com dieta controle (DCS)
· Ratas sham alimentadas com dieta hiperlipídica (DLS)
48
· Ratas sham alimentadas com dieta hipersacarídica (DSS)
Foram realizadas as medidas da pressão arterial sistólica e média e da frequência
cardíaca pelo método de pletismografia de cauda utilizando-se o medidor LE5001®
(Panlab, Espanha). A massa corporal e a pressão arterial foram mensuradas,
semanalmente, por 24 semanas.
No final das 24 semanas de experimento, as ratas foram sacrificadas por
decapitação e o coração, rins e tecido adiposo dos depósitos mesentérico,
retroperitoneal e parametrial foram removidos, pesados, congelados em nitrogênio
liquido e armazenados em freezer -20°C e, posteriormente, utilizados para análises
de expressão gênica. O sangue do tronco foi coletado em tubos resfriados e
heparinizados contendo inibidores de proteases (fenilmetilsulfonilfluorido - PMSF a
10-5 mol/L; ácido etilenodiamino tetra-acético - EDTA a 10-5 mol/L e 0,5x10-5 mol/L de
pepstatina A, adquiridos na Sigma Chemical Co. St. Louis, MO, USA). Após a
centrifugação (3000 rpm a 4°C por 20 minutos), o plasma foi separado e
armazenado em freezer -20°C até a realização da dosagem de ANP. Foi realizada a
extração do RNA e PCR para determinar a expressão gênica de ANP nos átrios e
seus receptores em tecido adiposo e rim.
04.4 Ovariectomia
Após anestesia com cloridrato de cetamina (Fort Dodge, SP), dose de 50 mg/Kg
(intramuscular) de massa corporal e cloridrato de xilasina (Agener União, SP), dose
de 5mg/Kg (intramuscular) de massa corporal, foram feitas incisões em ambos os
flancos, os ovários foram removidos e em seguida, a pele foi suturada, de acordo
com técnica corrente em endocrinologia. Os animais receberam uma injeção
profilática de antibiótico (pentabiótico, Wyeth Fontoura) na dose de 0,4 ml/animal
(intramuscular).
49
04.5 Dosagem de ANP
As dosagens de ANP foram feitas por radioimunoensaio (RIE) de duplo anticorpo
como descrito por Gutkowska et al. (1987). O plasma foi submetido à extração
usando-se colunas Sep-Pak C18 (Waters Associates, Milford, MA). As colunas de
Sep-Pak foram ativadas com 8ml de acetonitrila e lavadas com 8ml de acetato de
amônio a 0,2%, pH 4. A seguir, o plasma foi aplicado à coluna. Após lavagem com
5ml de acetato de amônio, o ANP adsorvido foi eluído com 3 ml de acetonitrila 60%
em acetato de amônio 0,2%. Após a evaporação em Speed-Vac, as amostras foram
reconstituídas com tampão (fosfato de sódio 0,1 M, NaCl 0,14M, albumina bovina
0,1 %, azida sódica 0,01 %, triton X-100 0,1%- pH 7.4) e dosadas por RIE.
04.5.1 Iodação de ANP
A iodação de ANP de rato (Ser99-Tyr126) (Peninsula Laboratories Inc, Belmont,
CA,USA) foi feita pelo método de Lactoperoxidase com 125I-sódico como descrito
por Gutkowska et al (1987). A purificação da fração monoiodinada foi realizada por
cromatografia líquida de alta pressão (HPLC).
04.5.2 Radioimunoensaio para ANP
O ANP extraído do plasma por Sep-Pak foi reconstituído em 0,5 ml de tampão
(fosfato de sódio 0,1 M, NaCl 0,14M, albumina bovina 0,1 %, azida sódica 0,01%,
triton X-100 0,1% - pH 7.4). As amostras de 100µl, em duplicata, foram incubadas
“overnight” com 100µl de anticorpo anti-ANP a 4°C. Adicionou-se 100µl (8000cpm)
de 125I-ANP e em seguida, incubou-se por mais 24 horas. A separação do
imunocomplexo foi feita por precipitação com segundo anticorpo (soro de cabra
antigama-globulina de coelho). Após duas horas à temperatura ambiente adicionou-
se 0,5ml de polietilenoglicol 6,25% em água. Os tubos foram centrifugados por 20
minutos a 3000 g, 4°C, e a radioatividade do imunocomplexo foi determinada por
contador gama (LKB Wallac 1214 RCKBeta®).
04.6 PCR
50
04.6.1 Extração de RNAm
O RNA dos átrios direito e esquerdo, dos rins e do tecido adiposo dos depósitos
mesentérico e parametrial dos animais foi isolado de acordo com o método de
thiocionato-fenol-clorofórmio (CHOMCZYNSKI, SACCHI, 1987). Após decapitação
dos animais, os tecidos foram rapidamente removidos e congelados em nitrogênio
liquido. Os tecidos foram armazenados a -20oC. No dia da extração, os tecidos
foram colocados em tubos plásticos estéreis contendo solução de fenol e
isotiocianato de guanidina (Brazolâ), 1mL/100mg de tecido. As amostras foram
trituradas por um homogeneizador elétrico. A adição de clorofórmio (0,2 mL/100mg
de tecido) seguida de centrifugação (10000g, 4 oC, 15 minutos) separou a solução
em três fases, uma fase orgânica no fundo do tubo plástico, uma fase constituída
principalmente por DNA que se localizava na parte média e uma fase aquosa
contendo RNA total, que se situava no sobrenadante, conforme figura 1 abaixo.
Figura 1. Separação das fases da amostra após a adição de clorofórmio
A fase aquosa foi transferida cuidadosamente para novos tubos plásticos estéreis e
identificados. Álcool isopropílico (0,5ml) foi adicionado ao RNA total para promover a
sua precipitação e após 10 minutos de repouso, seguiu-se uma nova centrifugação
(12000 g, 4oC, 20 minutos). O precipitado de RNA foi, então, lavado com 1ml de
etanol a 75% e após, uso lento de vórtex, seguiu-se por centrifugação curta (9500g,
4oC, 5 minutos).
O precipitado de RNA foi ressuspendido em 50µl de água tratada com
dietilpirocarbonato (DEPC) e homogeneizado em vórtex levemente. Em seguida,
51
colocou-se em banho maria por 10 minutos a 50 graus para desnaturação da cadeia
e armazenou-se em -20 graus para uso na próxima etapa.
04.6.2 Dosagem de RNA
Foi realizada a leitura do RNA com 100% de tramitância em espectrofotômetro SP-
2000UV-VIS® (Spectrum, Shanghai) com comprimento de onda específico: 260nm
(RNA) e 280nm (Proteína). Para tanto, usou-se a amostra diluída numa proporção
de 1:200 em água DEPC em novos eppendorfs. Então, utilizou-se 10µL de RNA e
1,990ml de tampão Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM (TE) (diluição de 1:200) e
no branco usou-se 2 ml de tampão TE. Antes da leitura, fez-se rapidamente vórtex
para facilitar a homogeneização. A leitura da proteína serve para se estimar a
quantidade de contaminantes na solução e, portanto, determinar a eficácia da
extração. Uma solução ideal deve apresentar uma relação A260/A280 entre 1,5 e
2,5.
Após a leitura em 260 e 280nm, calculou-se a concentração de RNA (µg/µL)
mediante a fórmula (A260*40*200)/1000.
04.6.3 Síntese do DNA complementar (cDNA) - Transcrição reversa
Após o RNA dos átrios, rins e do tecido adiposo serem extraídos utilizando-se Brazol
como descrito anteriormente, a obtenção do cDNA foi feita através de uma
transcrição reversa (RT) a partir do RNAm, utilizando-se oligonucleotídeos
complementares a cauda poli-A do RNAm.
Em eppendorfs foram pipetados um volume de RNA correspondente à 1µg mais
volume de água suficiente para completar 4µL e 1,0 µL de oligo DT (controle +, no
negativo, a amostra não foi colocada). Dessa forma, foi obtido um volume final de 5
µL. Em seguida, aqueceu-se a 70°C por 5 minutos no termociclador e depois,
colocou-se, imediatamente, em gelo por 5 minutos para interromper a reação.
Para a transcrição reversa foi adicionado ao volume de 5ml da reação anterior, 4ml de
tampão específico (10x) ImProm®, 1mL de desorribonucleotídeo trifosfatado (DNTP)
52
(10mM), 1,6mL de MgCl2, 6,4µL de nuclease free water, 1µL de inibidor e 1mL de
enzima transcriptase reversa Moloney Murine Leukemia Vírus (MMLV). A solução
final de 20µL foi então mantida a 40°C por 60 minutos para a síntese de c-DNA. Em
seguida, colocou-se no termociclador a 25 graus por 5 minutos, 42 graus por 1 hora
para finalizar a reação.
04.6.4 Reação em cadeia da polimerase (PCR)
Após a síntese do cDNA foi realizada a reação PCR para amplificação do cDNA
para ANP, NPR-A e NPR-C com pares de “primers” baseados em sequências
previamente publicadas. Para amplificar o ANP (425 bp, sequência 90-515) os
seguintes “primers” foram utilizados: 5´-GCCGGTAGAAGATGAGGTCA e 5´-
GGGCTCCAATCCTGTCAATC (SUZUKI et al., 1998); para amplificar o NPR-A
(554bp, sequência 966-1598) 5´-GCAAAGGCAAGGTTGGGACCTATTGGC e 5´-
TGTCCTCTTCGTTCCATTGGCCGTCGA (NUGLOZEH et al., 1997) e para
amplificar o NPR-C (492bp, sequência 279-771), os “primers” foram: 5´-
GCGAAGCCTGAGTTTGAGAA-3’ e 5’-ATACCGATCCCCATTAGCAT-3’ (SUZUKI et
al., 1998). As condições dos PCR foram padronizadas e definidas após realização
de testes.
O PCR foi realizado em triplicata, utilizando-se 0,2µL de primer senso, 0,2µL de
primer anti-senso, 1µL cDNA, 25µL de mistura pré-formada para PCR, 23,6 µL de
água DEPEC. Dessa forma, obtinha-se um volume total de 50µL. As condições do
PCR foram 95°C por 10 minutos, seguidos de 35 ciclos de 94°C por 30 segundos,
60°C por 30 segundos, 72°C por 30 segundos e uma terceira etapa a 72°C por 10
minutos para amplificar o ANP. As condições para a B-actina foram 95°C por 1
minuto, seguidos por 25 ciclos de 95°C por 30 segundos, 59°C por 30 segundos e
72°C por 30 segundos. A amplificação de NPR-A consistiu de 94°C por 1 minuto,
seguidos por 30 ciclos de 94°C por 30 segundos, 59°C por 30 segundos e 72 graus
por 30 segundos e a amplificação do NPR-C foi realizado a 94°C por 2 minutos,
seguido por 40 ciclos a 94°C por 15 segundos, 58°C por 30 segundos, 72°C por 30
segundos e uma terceira etapa a 72°C por 5 minutos.
53
Os produtos da reação foram analisados por eletroforese em gel de agarose a 1%.
O gel foi revelado com brometo de etídio (1µg/ml), visualizado em luz ultravioleta e
digitalizado. As bandas foram quantificadas através do programa ImageQuant 5®. ß-
Actina foi amplificada como um controle interno de cada PCR usando-se primers
específicos anteriormente descritos (BELO et al., 2008). Os resultados são
referentes a três PCR para cada amostra.
04.7 Mensuração do diâmetro dos cardiomiócitos e fibrose
Os ventrículos foram colocados em formaldeído e embebidos em parafina. Secções
transversas (4µm de espessura) dos ventrículos foram corados com hematoxilina e
eosina ou tricromo de Masson. A imagem foi capturada usando o Software Adobe
Photoshop 4.0® seguida por análises por meio do Software Pro Plus 4.1® (Media
Cybernetics, Silver Spring). Aproximadamente 50 cardiomiócitos foram selecionados
das 5 a 7 imagens capturadas em diferentes lugares do ventrículo, e um valor médio
do diâmetro da secção transversa do coração foi calculado para cada animal. Além
disso, em cada animal, um valor médio da fibrose do coração foi calculado.
04.8 Análise dos dados
O delineamento utilizado nos experimentos foi o inteiramente casualizado. Os
animais de mesmo peso e idade foram distribuídos de maneira aleatória. Foram
mantidos em ambiente com condições ambientais controladas e uniformes, e
submetidos aos mesmos procedimentos (cirurgia e dieta). Existiu, portanto, três
fontes de variação: a individual, a devida à castração e a devida à dieta.
Para comparar as médias entre os grupos estudados foi determinada a variação
individual ou variação do erro (s2), através de análise de variância ANOVA one way.
Foi empregado um teste estatístico mais rigoroso para a comparação de média dos
seis grupos estudados. O teste escolhido foi o teste Newman-Keuls, para controlar a
ocorrência de erro tipo I (atribuir uma significância quando ela realmente não existir)
comum para variável pouco instável. Correlações foram calculadas usando o
coeficiente de correlação de Pearson two-tailed. Os resultados foram expressos
como média mais ou menos o erro padrão da média usando o Software GraphPad
Prism® e como critério para significância, foi considerado p menor que 0,05.
54
RESULTADOS
55
05. RESULTADOS
05.1 Massa corporal e dos órgãos e ingestão calórica
A massa corporal dos grupos de ratas alimentadas com a dieta controle, hiperlipídica
e hipersacarídica não ovariectomizadas ou ovariectomizadas foram mensurados
semanalmente. As médias da massa corporal inicial dos seis grupos não diferiram
significantemente. Em termos de ganho de massa corporal, os resultados mostraram
uma diferença entre a massa final das ratas sob dieta hiperlipídica comparada com
as ratas DCS (Tabela 4). Houve um aumento da massa corporal das ratas DLO em
relação às DLS, porém não houve alteração na massa corporal das ratas sob dieta
hipersacarídica após 24 semanas de dieta (Tabela 4). A ovariectomia ou a dieta
hiperlipídica induziram um aumento de três vezes no ganho de massa corporal
comparado às ratas controle. A combinação de ambas, ovariectomia e dieta
hiperlipídica, induziram aumento do ganho de massa corporal quase seis vezes
maior que o das ratas controle (Tabela 4).
A partir da oitava semana de dieta, as ratas do grupo DLO tiveram maior massa
corporal do que as ratas controle, permanecendo maior até o final do experimento
(Figura 2). Na vigésima semana de dieta, a massa corporal das ratas do grupo DLS
foi maior do que o das ratas DCS (Figura 2). Na figura 2, observa-se que os animais
alimentados com dieta hipersacarídica não apresentaram aumento de massa
corporal quando comparados ao grupo controle durante todo o período experimental.
A soma da massa das gorduras foi maior nos grupos DLO, DLS e DCO, quando
comparados com o grupo controle depois de 24 semanas de dieta (Tabela 4). Não
existiu diferença no consumo de ração entre os grupos de dieta controle e
hiperlípídica (Figura 3A), mas devido à maior quantidade energética da dieta
hiperlipídica, a ingestão calórica foi maior nos grupos de dieta hiperlipídica do que
nos grupos de dieta controle (Figura 3B). O grupo sob dieta hipersacarídica
apresentou menor consumo alimentar na 24ª semana de dieta (Figura 3A), fato que
refletiu em uma menor ingestão calórica quando comparado com os demais grupos
(Figura 3B).
56
As massas de gordura visceral parametrial se elevaram em todos os grupos
experimentais (DLO, DLS, DSO, DSS, DCO) em comparação com as ratas controle
(DCS) (Figura 4C), assim como houve aumento nas massas de gordura visceral
mesentérica nos grupos DLS, DLO e DSO (Figura 4B). Entretanto, a gordura visceral
retroperitoneal (Figura 4A) não foi responsiva à alteração da dieta ou mesmo à
ovariectomia (Figura 4C). É interessante notar que as ratas ovariectomizadas sob
dieta hipersacarídica tiveram maior massa de gordura visceral parametrial do que as
ratas DCO, DLS, DLO e DSS (Figura 4C).
Como esperado, a massa uterina diminuiu nos grupos DCO, DLO e DSO devido à
falta de hormônios ovarianos (0,48±0,25, 0,30±0,05 e 0,96±0,06 versus 2,28±0,33
mg/g massa corporal do grupo DCS, p<0,05). Não se observou diferença na massa
dos rins entre os seis grupos experimentais estudados (dados não mostrados).
57
Tabela 4 – Comparação do ganho de massa total e de gordura visceral em ratas
Wistar alimentadas com dieta controle, hiperlipídica e hipersacarídica.
Variável DC DL DS
Sham OVX Sham OVX Sham OVX
MCI (g) 220 ±16 239±10 221±3 235±2 212±20 238±10
MCF (g) 270±6 398±25* 420±9* 520±14*† 275±21 317±29
GMT (g) 50±10 159±13* 199±6* 290±11*† 63±3 79±19
SG (g) 14,2±3,7 33,6±3,2* 36,3±6,8* 47,3±3,3*† 16±3 24±10
Dieta controle (DC); Dieta hiperlipídica (DL); Dieta hipersacarídica (DS); Massa corporal inicial (MCI); Massa corporal final (MCF); Ganho de massa total (GMT); Soma das gorduras (SG); Ovariectomizadas (OVX); * p<0.05 vs ratas controle (ratas DCS); † p<0,05 vs ratas DLS.
58
Figura 2 - Massa corporal de ratas alimentadas com dieta controle sham (DCS) e
ovariectomizadas (DCO), dieta hiperlipídica sham (DLS) e ovariectomizadas (DLO),
dieta hipersacarídica sham (DSS) e ovariectomizadas (DSO) durante 24 semanas de
dieta. *p< 0,05 vs DCS.
4 8 12 16 20 24
100
200
300
400
500
600
DCS
DCODLS
DLO
** *
**
* *
DSSDSO
Semanas de dieta
Ma
ssa
co
rpo
ral
(g)
59
0 6 12 18 240
50
100
150
DCODCS
DLSDLODSSDSO
*
B
Semanas de dieta
Ing
est
ão c
aló
rica
(K
cal/d
ia) *
**
*
Figura 3 - A, Consumo alimentar de ratas sham alimentadas com dieta controle
(DCS), dieta hiperlipídica (DLS), dieta hipersacarídica (DSS) e ratas
ovariectomizadas alimentadas com dieta controle (DCO), dieta hiperlipídica (DLO),
dieta hipersacarídica (DSO) durante 24 semanas de dieta. B, Ingestão calórica de
ratas DCS, DLS, DSS, DCO, DLO ou DSO durante 24 semanas de dieta. *p< 0,05 vs
DCS.
0 6 12 18 240
25
50
75
100
125
150
175C
on
su
mo
alim
en
tar(
g)
/s
em
an
a)
*
A
Semanas de dieta
60
Figura 4 - A, Representação gráfica dos depósitos de gordura visceral
retroperitoneal nas ratas sham alimentadas com dieta controle (DCS) ou dieta
hiperlipídica (DLS) ou dieta hipersacarídica (DSS) e ratas ovariectomizadas
alimentadas com dieta controle (DCO) ou dieta hiperlipídica (DLO) ou dieta
hipersacarídica (DSO) após 24 semanas de dieta. B, Representação gráfica dos
depósitos de gordura visceral mesentérica nas ratas DCS, DLS, DSS, DCO, DLO e
DSO após 24 semanas de dieta. C, Representação gráfica dos depósitos de gordura
visceral parametrial nas ratas DCS, DLS, DSS, DCO, DLO e DSO após 24 semanas
de dieta. (*p< 0,05 vs DCS, # p<0,05 vs DCO, DSS, DSO (*p< 0,05 vs DCS, #
p<0,05 vs DCO, DSS, DLS, DLO).
Parametrial
DC
S
DC
O
DL
S
DL
O
DS
S
DS
O
0.00
0.02
0.04
0.06
* * **
*#
Mas
sa(g
)/m
assa
co
rpo
ral (
g)
CMesentérico
DC
S
DC
O
DL
S
DL
O
DS
S
DS
O
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
** *
Mas
sa(g
)/m
assa
co
rpo
ral (
g)
B
Retroperitoneal
DC
S
DC
O
DL
S
DL
O
DS
S
DS
O
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
Mas
sa(g
)/m
assa
co
rpo
ral (
g)
A
61
05.2 Pressão arterial e frequência cardíaca
A média da pressão arterial média inicial foi de 91±3mmHg em todas as ratas
usadas no experimento. Depois de 24 semanas de dieta, a pressão arterial média
das ratas DLO foi de 112±3 mmHg, significativamente maior do que nos grupos de
ratas DCO (92±3 mmHg), DLS (94±3 mmHg) ou DCS (92±4 mmHg) (Figura 5A). A
pressão arterial sistólica medida depois de 24 semanas foi significativamente
elevada no grupo DLO (130±2 mmHg) comparada com a do grupo DCS (Figura 5B),
sendo que a diferença apareceu no quinto mês de dieta. A frequência cardíaca não
foi significativamente diferente entre os grupos (dados não mostrados). Uma
correlação direta foi observada entre a massa corporal e a pressão arterial sistólica
(p= 0,0028) ou a pressão arterial média (p= 0,0062) nas ratas sob dieta hiperlipídica
ovariectomizados ou não (Figura 5C). Como não houve alterações na pressão
arterial e massa corporal nas ratas sob dieta hipersacarídica, os demais parâmetros,
foram avaliados, apenas nas ratas sob dieta hiperlipídica e controle.
62
Figura 5 - A, Pressão arterial média (PAM) de ratas sham-operadas, alimentadas
por 24 semanas com dieta controle (DCS) ou dieta hiperlipídica (DLS) ou dieta
hipersacarídica (DSS), e de ratas ovariectomizadas, alimentadas com dieta controle
(DCO) ou dieta hiperlipídica (DLO) ou dieta hipersacarídica (DSO). B, Pressão
arterial sistólica (PAS) de DCS, DLS, DCO, DLO, DSS e DSO após 24 semanas de
dieta. C, Correlação entre pressão arterial sistólica e média com a massa corporal de
ratas Wistar ovariectomizadas ou sham operadas e alimentadas com dieta
hiperlípidica por 24 semanas (p<0,01 Pearson r=0, 924). * p<0,05 vs DCS.
DCS DLS DCO DLO DSS DSO0
25
50
75
100
125
150*
B
Pre
ssão
art
eria
l sis
tólic
a(m
mH
g)
200 250 300 350 400 450 500 550 60080
90
100
110
120
130
C
PSMPSS
Massa corporal (g)
Pre
ssão
san
gu
ínea
(m
mH
g)
DCS DLS DCO DLO DSS DSO0
50
100
150
*
A
Pre
ssão
art
eria
l méd
ia(m
mH
g)
63
05.3 Função renal e o sistema de peptídeos natriuréticos
Dados de nosso grupo de pesquisa mostraram que a excreção absoluta de sódio
diminuiu no grupo DLO comparada com os outros grupos, DCS, DLS e DCO (dados
não mostrados). Resultados similares do nosso grupo de pesquisa foram obtidos
quando a fração de excreção de sódio foi analisada (FENa+) nesses animais. A
FENa+ foi significativamente reduzida no grupo DLO (0,15±0,06%) comparada com
DCS (0,30±0,08%, p<0,05). Uma correlação inversa foi observada entre a pressão
sanguínea sistólica e a FENa+ em ratas ovariectomizadas (r=-0.689, p=0.003).
Para testar a hipótese de que o aumento do tecido adiposo pode levar a um
aumento da expressão de NPR-C, foi comparada a expressão desse gene por PCR.
Os grupos DLO e DCO apresentaram maior RNAm para NPR-C no depósito de
gordura visceral do que as ratas DCS (figura 6). Uma correlação inversa foi
observada entre a expressão do gene para NPR-C em tecido adiposo e a FENa+ em
ratas ovariectomizadas (r= -0,775, p=0,024), assim como uma correlação positiva
entre a expressão do gene NPR-C e o aumento da pressão arterial média (r=0,9540
p=0,002) de ratas ovariectomizadas. O grupo DLO apresentou maior expressão
renal do gene NPR-C do que o grupo controle. Nenhuma mudança foi observada na
expressão renal do gene NPR-C nos grupos DLS, DCO e DCS (figura 6). A
expressão gênica renal de NPR-A aumentou nas ratas DLO, DLS e DCO em
comparação com as ratas DCS (Figura 7).
O nível plasmático de ANP nas ratas DCO e DLO foi menor do que no grupo DCS e
as ratas DLO apresentaram níveis plasmáticos de ANP menores do que nas ratas
DCO (Figura 8). Ao analisar a expressão gênica do ANP em seus principais locais
de síntese, ou seja, os átrios direito e esquerdo, observamos uma menor expressão
do gene para o ANP em ambos os átrios dos animais ovariectomizados (DLO, DCO)
quando comparados ao grupo controle (figura 9).
64
65
Figura 6 - Expressão do gene NPR-C no tecido adiposo e rim. A expressão deste
gene foi examinada nos níveis de RNAm em tecido adiposo visceral mesentérico e o
tecido renal de ratas ovariectomizadas sob dieta hiperlipídica (DLO), dieta controle
(DCO) e sham-operadas sob dieta hiperlipídica (DLS) e controle (DCS). Painel do
topo: Representa a visualização de brometo de etídio dos produtos RT-PCR de um
dos experimentos. Painel de baixo: Intensidade do sinal NPR-C foram normalizados
para β-actina. * p<0.05 comparado às ratas DCS, (n=5).
Tecido adiposo Tecido renal0
5
10
15DCS
DLS
DCO
DLO*
*
*
Raz
ão N
Pr-
C/
B-a
ctin
a e
m u
nid
ades
arb
itrá
rias
Tecido adiposo Tecido renal
DCS DLS DCO DLO DCS DLS DCO DLO NPR-C
B-ACTINA
66
DCS DCO DLS DLO0.000
0.001
0.002
0.003
0.004
* **
Exp
ress
ão g
ênic
a re
nal
de
NP
r-A
(un
idad
es a
rbit
rári
as)
Figura 7 - Expressão do gene NPR-A no rim. A expressão deste gene foi examinada
nos níveis de RNAm em tecido renal de ratas ovariectomizadas sob dieta
hiperlipídica (DLO), dieta controle (DCO) e sham-operadas sob dieta hiperlipídica
(DLS) e controle (DCS). Painel do topo: Representa a visualização de brometo de
etídio dos produtos RT-PCR de um dos experimentos. Painel de baixo: Intensidade
do sinal NPR-C foram normalizados para β-actina. * p<0.05 comparado às ratas
DCS, (n=5).
NPR-A
B-ACTINA
67
Figura 8 - Concentração plasmática de ANP de ratas ovariectomizadas sob dieta
hiperlipídica (DLO), dieta controle (DCO) e sham-operadas sob dieta hiperlipídica
(DLS) e controle (DCS) após 24 semanas de dieta. * p<0.05 vs ratas DCS; ** p<0.05
vs ratas DCO.
DCS DCO DLS DLO0
50
100
150
*
*
**
AN
P p
lasm
átic
o (
pg
/ml)
68
Figura 9 - Expressão do gene de ANP nos átrios. A expressão deste gene foi
examinado nos níveis de RNAm em átrio direito e esquerdo de ratas
ovariectomizadas sob dieta hiperlipídica (DLO), dieta controle (DCO) e sham-
operadas sob dieta hiperlipídica (DLS) e controle (DCS). Painel do topo: Representa
a visualização de brometo de etídio dos produtos RT-PCR de um dos experimentos.
Painel de baixo: Intensidade do sinal NPR-C foram normalizados para β-actina. *
p<0.05 comparado às ratas DCS, (n=5).
Átrio direito Átrio esquerdo
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0DCS
DLSDCO
DLO
**
* *
Raz
ão A
NP
/ B
-act
ina
em u
nid
ades
arb
itrá
rias
Átrio direito Átrio esquerdo
DCS DLS DCO DLO DCS DLS DCO DLO
ANP
B- ACTINA
Átrio direito Átrio esquerdo
69
5.4 Morfologia cardíaca e do cardiomiócito
A massa cardíaca relativa das ratas sob dieta hiperlipídica e ovariectomizadas
aumentou em comparação com o grupo sob dieta controle e sham operadas (DCS)
(Figura 10). Análises morfológicas e histológicas do coração revelaram uma
hipertrofia ventricular concêntrica junto com o aumento do diâmetro do cardiomiócito
nas ratas ovariectomizadas sob dieta hiperlipícia (DLO) comparado aos outros
grupos (Figura 11B e 11C).
Na figura 11A, a representação das seções transversa mediana mostra que o
espessamento cardíaco nas ratas ovariectomizadas sob dieta hiperlipídica foi
associado com a redução do lúmen cardíaco e aumento do espessamento da
parede, indicativo de hipertrofia concêntrica. Além disso, a expressão ventricular de
RNAm para ANP diminuiu nas ratas ovariectomizadas sob dieta hiperlipídica (Figura
12).
Uma correlação inversa foi observada entre a expressão gênica ventricular de ANP
e a massa cardíaca nas ratas ovariectomizadas (r= -0,832, p=0,0042). O grau de
fibrose intersticial e perivascular, avaliado pela marcação do Tricrome de Masson
não foi diferente em ratas obesas e controles (Dados não mostrados).
70
Figura 10 – Massa cardíaca relativa de ratas ovariectomizadas sob dieta
hiperlipídica (DLO), dieta controle (DCO) e sham-operadas sob dieta hiperlipídica
(DLS) e controle (DCS) em pg/ml após 24 semanas de dieta. * p<0,05 vs ratas
controle (ratas DCS) , (n=5).
DCS DCO DLS DLO0.000
0.001
0.002
0.003 *
Mas
sa c
ard
íaca
(g
)/m
assa
co
rpo
ral (
g)
71
Figura 11 - Avaliação morfológica da hipertrofia cardíaca em ratas alimentadas com
dieta hiperlipídica. A, Representação de toda área de secção transversa mediana do
coração corada por hematoxilina e eosina em ratas ovariectomizadas sob dieta
hiperlipídica (DLO), dieta controle (DCO) e sham-operadas sob dieta hiperlipídica
(DLS) e controle (DCS). B, Diâmetro dos cardiomiócitos estimado por morfometria
quantitativa das secções ventriculares coradas com hematoxilina e eosina de DCS,
DLS, DCO e DLO. Linhas azuis indicam os diâmetros dos cardiomiócitos na região
dos núcleos das células que foi significativamente aumentado nos corações das
ratas DLO. C, Diâmetros dos cardiomiócitos dos grupos de ratas DCS, DLS, DCO e
DLO (n = 5 corações/grupo, *p < 0.05 vs. DCS).
C
A B
DCS DCO DLS DLO0
5
10
15
20
25*
Diâ
met
ro d
o c
ard
iom
ióci
to (
um
)
72
Figura 12 - Expressão do gene para ANP no ventrículo das ratas sob dieta
hiperlipídica (DLO), dieta controle (DCO) e sham-operadas sob dieta hiperlipídica
(DLS) e controle (DCS). Painel do topo: Representa a visualização de brometo de
etídio dos produtos RT-PCR de um dos experimentos. Painel de baixo: Intensidade
do sinal ANP foram normalizados para β-actina. * p<0.05 comparado às ratas DCS,
(n=5).
B-ACTINA
ANP
DCS DCO DLS DLO0.0
0.2
0.4
0.6
**
Raz
ão A
NP/
B-a
ctin
aem
uni
dade
s ar
bitr
ária
s
73
DISCUSSÃO
74
06. DISCUSSÃO
Ratas Wistar fêmeas, ovariectomizadas sob dieta hiperlipídica (DLO), foram usadas
como um modelo para se estudar possíveis mecanismos envolvidos na hipertensão
associada à obesidade observada frequentemente na menopausa. Nessas ratas,
foram examinados os efeitos da ovariectomia e/ou dieta hiperlipídica sobre o ganho
de massa de gordura e corporal, pressão sanguínea, função renal, massa cardíaca e
sistema de peptídeos natriuréticos. Encontrou-se que: (1) ou a dieta hiperlipídica ou
a ovariectomia induziram um aumento similar na massa de gordura visceral e
corporal, (2) a ovariectomia, mas não a dieta hiperlipídica diminuiu a síntese de ANP
e (3) a dieta hiperlipídica somada a ovariectomia induziu a hipertrofia cardíaca,
aumento da pressão sanguínea média, o maior aumento da massa de gordura
visceral, da expressão gênica de NPR-C e NPR-A e diminuição da excreção de
sódio (dados anteriores do nosso grupo de pesquisa), níveis plasmáticos de ANP e a
expressão gênica de ANP.
Os resultados deste estudo mostraram que a dieta hiperlipídica ou a ovariectomia
sozinhas não foram capazes de induzir as alterações que ocorrem na obesidade e
hipertensão. Por outro lado, estas duas condições juntas são capazes de promover
algumas mudanças cardiovasculares e renais similares às observadas em mulheres
obesas e hipertensas e mostram uma possível ligação entre a função cardíaca
endócrina e a massa de gordura como mecanismo para o desenvolvimento de
hipertensão e hipertrofia cardíaca em fêmeas.
A elucidação dos mecanismos responsáveis pela hipertensão pós-menopausal e a
obesidade tem sido dificultada devido à falta de um modelo animal. Ratas
espontaneamente hipertensas (SHR) velhas ou SHR ovariectomizadas ganham
pouco peso com a idade ou perda ovariana (RECKELHOFF, FORTEPIANI, 2004).
Camundongos nocautes para o receptor do hormônio folículo estimulante (FSH)
(FORKO) ganham massa corporal e possuem diminuição dos níveis plasmáticos de
estradiol, mas estes animais não exibem aumento do estresse oxidativo, disfunção
endotelial e hipertrofia cardíaca (JAVESHGHANI et al., 2003), fatores que são
comuns em mulheres na pós-menopausa.
75
Alguns estudos têm revelado que dietas hiperlipídicas promovem obesidade e
hipertensão em animais machos (CARROLL et al., 1996; BOUSTANY et al., 2004).
Contudo, muitos estudos usando animais fêmeas falharam em mostrar hipertensão e
obesidade induzida pela dieta hiperlipídica (AUBIN et al., 2008; UEMURA, MORI,
2006; TAMAYA-MORI, UEMURA, IGUCHI, 2002), provavelmente devido aos efeitos
de proteção do estrógeno no sistema cardiovascular (MENDELSOHN, KARAS,
1999).
Dietas com carboidratos também são associadas com o surgimento de eventos
coronarianos (JAKOBSEN et al., 2009) e distúrbios metabólicos, especialmente, nas
dietas com elevados teores de sacarose ou frutose (KEENAN et al., 1999). No
presente estudo, entretanto, a dieta hipersacarídica não proporcionou alterações na
pressão arterial sistólica e média nem na massa corporal, semelhantemente, ao
resultado encontrado por Sanchez-Lozada et al. (2007). Além disso, a dieta com alto
teor de carboidrato refinado não promoveu alterações na fração de excreção de
sódio e na massa total de gordura, mas, essa dieta proporcionou o aumento das
gorduras parametrial (grupo DSS e DSO) e mesentérica (DSO). A manutenção da
massa corporal e da soma das gorduras pode estar relacionada com a diminuição
do consumo alimentar nas ratas sob dieta hipersacarídica a partir do quinto mês de
experimento quando comparadas com o grupo controle (DCS), o que refletiu na
diminuição da ingestão calórica.
Em humanos, a dieta rica em carboidratos refinados favorece a produção de
catabólitos (ácido lático e ácido úrico) pela inibição da via glicolítica que promove
efeitos hipertensivos devido à alteração no sistema de óxido nítrico (MAZZALI et al.,
2001; NAKAGAWA et al., 2006) ou mesmo promovem síndrome metabólica
(NAKAGAWA et al., 2006). Nas ratas submetidas à dieta hipersacarídica deste
estudo, o não desenvolvimento de obesidade e a manutenção dos valores de
pressão arterial podem também estar relacionados à resistência dos roedores à
frutose pela presença da enzima uricase que não permite o aumento suficiente do
ácido úrico (STAVRIC et al., 1976). Sabe-se que o ácido úrico constitui um fator de
risco para o desenvolvimento de síndrome metabólica (JONHSON et al., 2007).
Todavia, o aumento da massa de gordura visceral parametrial nas ratas sob dieta
hipersacarídica, independente da presença ou não de estrógenos, corrobora com
76
Queiroz et al. (2009) ao demonstrar que a presença de sacarose pode estar
relacionada com a massa adiposa visceral, mas pouco com a massa corporal total.
Stanhope et al. (2009) observaram que humanos alimentados com carboidrato
refinado (25% do requerimento energético) ganharam em média 1,4Kg durante um
período de oito semanas, o qual foi associado com aumento da área de gordura
intra-abdominal e não de gordura subcutânea. Isto sugere que o consumo de
carboidrato refinado pode promover deposição lipídica no tecido adiposo visceral,
mas não no subcutâneo, de forma a não alterar significativamente, a massa de
gordura total, tal como foi observado em nosso estudo. Entretanto, os mecanismos
relacionados com a preferência de local de deposição adiposa são desconhecidos,
mas devem envolver os efeitos dos diferentes carboidratos (glicose e frutose) sobre
a exposição pós-prandial aos triglicerídeos e lipoproteínas (STANHOPE, HAVEL,
2009).
Está evidente em experimentos animais que a porcentagem de energia derivada de
gordura na dieta é positivamente correlacionada com o conteúdo de gordura
corporal. Interessantemente, as ratas ovariectomizadas sob dieta hiperlipídica (DLO)
mostraram maiores valores de soma das massas de gorduras e massa corporal
quando comparadas com os animais sham operados sob dieta hiperlipídica (DLS),
apesar do consumo similar de alimento entre estes dois grupos. Devido à maior
quantidade energética da dieta hiperlipídica, a ingestão calórica nos grupos com
essa alimentação foi maior do que nos demais grupos.
O aumento de gordura visceral nas ratas sob dieta hiperlipídica ocorreu,
especificamente, nas gorduras parametrial e mesentérica quando comparadas com
o grupo controle (DCS), independentemente da realização da ovariectomia, ao
contrário da dieta hipersacarídica em que não houve aumento da gordura visceral
mesentérica no grupo DSS. Isso demonstra um maior potencial da dieta hiperlipídica
sobre a deposição adiposa do que a dieta hipersacarídica ou controle e
principalmente, sobre a gordura visceral, considerada um fator de risco para o
desenvolvimento das doenças cardiovasculares. Diferentemente do grupo de ratas
sob dieta hipersacarídica, os animais alimentados com a dieta hiperlipídica (DLS e
DLO) apresentaram aumento simultâneo da quantidade de gordura total e das
gorduras parametrial e mesentérica, o que corrobora com Bergman et al. (2006) ao
77
afirmar que uma dieta hiperlipídica proporciona o aumento tanto da gordura
subcutânea quanto visceral.
A presença do sebo bovino (24%) na composição da dieta hiperlipídica utilizada em
nosso estudo (Tabela 1) favorece um maior aporte de gorduras saturadas, a qual
está relacionada com o desenvolvimento de obesidade (Buettner et al., 2007) e
doenças cardiovasculares (JAKOBSEN et al., 2009).
Alguns estudos mostraram que a transição para a menopausa, desconsiderando-se
a dieta, pode causar aumento de peso, mostrando que a falta de estrógeno modifica
a taxa metabólica corporal, o que reduz o gasto energético e causa o acúmulo de
gordura (LOVEJOY et al., 2008).
Apesar das ratas sob dieta hiperlipídica apresentarem ganho de massa adiposa,
somente as ratas ovariectomizadas sob dieta hiperlipídica apresentaram aumento da
pressão sanguínea sistólica e média comparada com os animais sham operados sob
dieta controle. Esta resposta é provavelmente devida à falta de estrógeno ao invés
de somente pelo ganho de massa de gordura. Heine et al. (2000) observaram que
camundongas nocautes para o receptor ERα apresentam hiperplasia e hipertrofia
adipocitária, porém no tecido subcutâneo o estrógeno possui efeitos contrários (anti-
lipolíticos e lipogênicos), o que demonstra o potencial dos estrógenos na regulação
do desenvolvimento do pré-adipócito, assim como diretamente no adipócito
(COOKE, NAAZ, 2004).
A perda do estrógeno associado com a menopausa pode aumentar a prevalência de
vários fatores de risco para doenças cardiovasculares, incluindo a elevação da
pressão sanguínea. Investigações anteriores têm indicado que mulheres em período
pós-menopausal são duas vezes mais propensas a serem hipertensas do que
mulheres no período pré-menopausal (TREMOLLIERES et al., 1999). Xu et al.
(2008) demonstraram que a pressão sanguínea e massa corporal em ratas
ovariectomizadas foram significativamente maiores do que em ratas sham. Contudo,
seu estudo falhou em mostrar hipertrofia cardíaca e hipertensão, uma vez que a
pressão sanguínea sistólica mensurada nas ratas ovariectomizadas foi dentro dos
limites normais.
78
Os efeitos do estrógeno sobre o sistema cardiovascular podem estar relacionados à
sua ação direta sobre os vasos sanguíneos (MURPHY, KHALIL, 2000), ação central
no sistema nervoso autônomo (SALEH, CONNELL, SALEH, 2000), formação de
substâncias vasodilatadoras (TOSTES et al., 2003) e inibição da formação de
substâncias vasoconstrictoras (DANTAS et al., 1999). Xu et al. (2008) mostraram
que a deficiência de estrógenos diminui o nível de ANP plasmático em ratas
ovariectomizadas, e o tratamento com estrógeno pode reverter esse efeito.
Em nosso estudo, os grupos ovariectomizados mostraram menor expressão gênica
de ANP cardíaco, tanto atrial quanto ventricular e, as ratas ovariectomizadas sob
dieta hiperlipídica tiveram níveis plasmáticos de ANP menores do que no grupo
controle, semelhantemente aos dados encontrados por Jankowshk et al. (2001) e
Hong et al. (1992). O estrógeno afeta o sistema de peptídeos natriuréticos cardíaco
por estimular a liberação de ANP (BELO et al., 2004) e aumentar a expressão
gênica e a produção de ANP atrial (BELO et al., 2004; JANKOWSKI et al., 2001). A
ação do estradiol sobre o ANP no coração parece estar relacionada com a maior
responsividade dos ERα nos átrios, principalmente no átrio direito do que nos
ventrículos. A diminuição dos níveis séricos de estradiol favorece a diminuição da
transcrição e tradução protéica de ERα e consequentemente, a produção de ANP
nos átrios (JANKOWSHK et al., 2001) e seus efeitos cardioprotetores (TOHSE et al.,
1995).
O ANP parece ser um mediador dos efeitos cardiovasculares do estradiol. Estudos
prévios mostraram uma maior correlação entre níveis de ANP plasmático e
diminuição na pressão sanguínea em SHR tratadas com estradiol (BELO et al.,
2004). O efeito do ANP sobre a regulação da pressão sanguínea é bem conhecido.
ANP defende organismo contra o excesso de sal e retenção de água, inibe a
produção e a ação de peptídeos vasoconstrictores e inibe o fluxo simpático
(LEWICKI, PROTTER, 1995). Estas ações levam a uma redução na pressão
sanguínea. Interessantemente, as ratas ovariectomizadas sob dieta hiperlipídica
mostraram menores níveis de ANP plasmático do que as ratas ovariectomizadas sob
dieta controle, o que demonstra um efeito adicional da dieta hiperlipídica nos níveis
de ANP.
79
As ratas ovariectomizadas alimentadas com dieta hiperlipídica apresentaram
maiores valores de massa corporal e de gorduras, assim como maior expressão
gênica de NPR-C no rim e no tecido adiposo do que o grupo controle (DCS). Além
disso, estes animais tiveram maior pressão sanguínea sistólica e média comparada
com o grupo controle. Estes resultados mostram que a dieta hipercalórica somada a
ovariectomia podem desencadear a hipertensão e obesidade em ratas fêmeas. Além
disso, o aumento da massa de gordura visceral e da pressão sanguínea foram
altamente correlacionadas com o aumento da expressão gênica de NPR-C.
Recentes achados apontam para a função potencial do tecido adiposo no
desenvolvimento da obesidade relacionada à hipertensão. Em indivíduos com
sobrepeso ou obesidade e ainda hipertensão, os níveis de ANP geralmente são
menores, o que demonstra a possível influência do tecido adiposo sobre o sistema
de peptídeos natriuréticos (RICHARDS, 2007).
Estudos de Sarzani et al. (1995) revelaram uma influência nutricional na expressão
dos receptores de peptídeo natriurético em ratos; o jejum inibiu o NPR-C do tecido
adiposo. Elevada expressão gênica de NPR-C no tecido adiposo de humanos com
obesidade e hipertensão tem sido documentada e alelos variantes deste gene têm
sido associados com menores níveis plasmáticos de ANP (SARZANI et al., 2008;
DESSÌ-FULGHERI et al., 1997). Aumento da expressão de NPR-C no tecido adiposo
pode, portanto, contrabalancear os efeitos vasodilatadores e natriuréticos dos
peptídeos natriuréticos e, consequentemente, promover o desenvolvimento da
hipertensão. Portanto, aumento do NPR-C não somente no tecido adiposo, mas
também nos rins durante o ganho de massa corporal e adiposa pode fornecer uma
explicação razoável para a antinatriurese observada em nosso estudo.
De fato, a obesidade é associada com o aumento da diurese e da reabsorção de
sódio renal (HALL, 2003). O ANP induz natriurese através de um efeito direto sobre
o túbulo proximal renal e inibição da reabsorção de sódio no túbulo distal através de
canais epiteliais de sódio (MORO, BERLAN, 2006) ou mesmo por meio da inibição
do sistema renina, angiotensina e aldosterona (CLERICO et al., 2006). É possível
que a retenção de sódio renal evidenciada pela diminuição na excreção de sódio em
ratas ovariectomizadas sob dieta hiperlipídica pode ser causada, em parte, pelo
impedimento da resposta do peptídeo natriurético nestes animais.
80
Os resultados de nosso estudo são consistentes com a hipótese que o aumento da
massa de tecido adiposo total dos animais obesos por meio do aumento da
expressão de NPR-C pode influenciar a atividade dos peptídeos natriuréticos, uma
vez que uma grande quantidade de NPR-C pode capturar mais moléculas de ANP
circulantes, dificultando que o ANP se ligue aos seus receptores biologicamente
ativos (NPR-A). Neste estudo, observou-se uma correlação inversa entre a
expressão gênica de NPR-C no adipócito e a excreção de sódio. Portanto, a redução
da atividade do sistema de peptídeos natriuréticos pode contribuir em parte para o
aumento da pressão arterial observada neste estudo.
Dada a possibilidade do envolvimento do ANP no remodelamento cardíaco,
objetivou-se neste estudo elucidar esta função usando a avaliação histológica. As
dimensões dos cardiomiócitos indicam que a hipertrofia celular em corações de ratas
ovariectomizadas alimentadas com dieta hiperlipídica é proeminente. A hipertrofia
cardíaca em ratas ovariectomizadas sob dieta hiperlipídica foi acompanhada por
diminuição da expressão gênica ventricular de ANP. A diminuição da expressão
gênica de ANP nos átrios também ocorreu nas ratas do grupo DLS, porém sem
alteração dos níveis plasmáticos de ANP e sem desenvolvimento de hipertrofia
cardíaca nessas ratas, o que sugere uma ação autócrina/parácrina do ANP no
coração (JOHN et al., 1995), assim como a interação entre a razão de NPR-A/NPR-
C e ANP nos efeitos cardioprotetores ou mesmo com outros tipos de peptídeos
natriuréticos como o BNP (D’SOUZA, DAVISB, BAXTERC, 2004).
Vários modelos de alterações genéticas do sistema de peptídeos natriuréticos
fornecem evidência para as ações anti-hipertróficas do ANP (FRANCO et al., 2004;
ZAHABI et al., 2003). A hipertrofia ventricular vista nos camundongos nocautes para
NPR-A parece refletir, em grande parte, a perda de um efeito antihipertrófico direto
do ANP no coração. O controle farmacológico da pressão sanguínea nestes animais
não foi capaz de reverter a hipertrofia ventricular (KNOWLES et al., 2001). Por outro
lado, a alta expressão de NPR-A cardíaco após a introdução de gene para NPR-A
nos corações dos camundongos nocautes para esse gene resultou em reduções no
tamanho do cardiomiócito (KISHIMOTO, ROSSI, GARBERS, 2001).
É possível que a redução da síntese e liberação de ANP nas ratas ovariectomizadas
sob dieta hiperlipídica não seja somente um mecanismo compensatório, mas que
81
contribua diretamente para o desenvolvimento da hipertrofia cardíaca. Nesse
sentido, propõe-se que, em ratas ovariectomizadas sob dieta hiperlipídica, a
diminuição da expressão de ANP ventricular pode estar envolvida não somente no
desenvolvimento da hipertensão, mas também da hipertrofia cardíaca.
82
CONSIDERAÇÕES FINAIS
83
07. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os achados deste estudo mostram que a dieta hiperlipídica somada a ovariectomia
promoveram a diminuição da síntese e aumento da depuração de ANP, o que pode
gerar obesidade e alteração pressórica em fêmeas. Além disso, este modelo
mostrou que a hipertrofia cardíaca está associada com a redução da expressão
gênica cardíaca e dos níveis plasmáticos de ANP.
Assim, sugere-se que a abundância de NPR-C no tecido adiposo e rins e a redução
da síntese de ANP podem desempenhar um papel significante em explicar, pelo
menos em parte, o desenvolvimento da hipertrofia cardíaca e aumento dos valores
da pressão sanguínea sistólica e média no modelo proposto.
Este trabalho abre caminho para estudos futuros com objetivos de determinar o
impacto do ganho de massa corporal e da perda do estrógeno não somente no
desenvolvimento da obesidade e hipertensão, mas também na hipertrofia cardíaca
em fêmeas. Este modelo pode também ser útil para o estudo de outras patologias e
condições associadas com a hipertensão e obesidade, tais como alterações na
estrutura e função renal, assim como o papel da reposição hormonal nestas
condições.
84
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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08. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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99
ANEXOS
100
ANEXO 1
Parecer do Comitê de Ética no uso de animais
101
ANEXO 2
Artigo publicado na Revista Regulatory Peptides
102
103
104
105
106
107
108
