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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DE ALIMENTOS
JAQUELINE FRONZA WALKER
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO ÓLEO ESSENCIAL DE
MANJERONA (Origanum majorana) CONTRA Salmonella
enterica sorovar Schwarzengrund MULTIRRESISTENTE
EM HORTALIÇAS
SALVADOR – BA
2014
2
JAQUELINE FRONZA WALKER
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO ÓLEO ESSENCIAL DE
MANJERONA (Origanum majorana) CONTRA Salmonella
enterica sorovar Schwarzengrund MULTIRRESISTENTE
EM HORTALIÇAS
Orientador (a): Profa. Dra. Alaíse Gil Guimarães
Coorientador: Prof. Dr. Cleber Alberto Schmidt
Dissertação apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade Federal da Bahia, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos, para obtenção do título de Mestre.
Salvador – BA 2014
3
Sistema de Bibliotecas - UFBA
Walker, Jaqueline Fronza.
Atividade antimicrobiana do óleo essencial de manjerona (Origanum majorana) contra
Salmonella enterica sorovar Schwarzengrund multirresistente em hortaliças / Jaqueline Fronza
Walker. - 2014. 60 f.: il.
Inclui anexos e apêndices. Orientadora: Profª. Drª. Alaise Gil Guimarães.
Coorientador: Prof. Dr. Cleber Alberto Schmidt. Dissertação (mestrado) - Universidade Federal da Bahia, Faculdade de Farmácia, Salvador, 2014.
1. Óleos vegetais. 2. Origanum majorana. 3. Alimentos. 4. Salmonela. I. Guimarães, Alaise Gil. II. Schmidt, Cleber Alberto. III. Universidade Federal da Bahia. Faculdade de Farmácia.
IV. Título. CDD - 665.3
CDU - 665.3
4
5
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho aos meus pais, irmã e noivo pelo amor e
compreensão durante toda a minha trajetória acadêmica.
E em especial à minha amiga Jaqueline Fontes Moreau Cruz (in memoriam
e no coração) pelo incentivo em fazer esse mestrado. Nunca esquecerei da
pessoa carinhosa, que dizia todo dia: “Jaque, o edital, Jaque... Já abriu!”. Meu
eterno agradecimento.
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AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, por ouvir meus pedidos e me conceder bênçãos. Aos meus pais Airton e Beatriz, por não medirem esforços para continuar me apoiando com amor. À minha irmã Priscila, acolhedora de todas as horas, sejam tristes ou felizes. Ela é sensacional! Ao meu noivo Thiago, que sempre me incentivou a continuar minha carreira acadêmica. Obrigada “princhipe”! À minha orientadora Alaíse, pelos ensinamentos, compreensão e disposição SEMPRE prestados. Ao meu co-orientador Cléber, que foi fundamental, com suas ideias, sugestões e mudanças, sempre prestativo. À minha amiga Andréia, estava sempre à disposição para tirar minhas dúvidas, pelas conversas e que me ajudou muito em todas as etapas do estudo. À minha amiga Adriana, que desde a primeira vez que a vi, já gostei! Obrigada pela ajuda com tudo! Às estagiárias Palloma, Marcelle e Edilaine, pelo auxílio no laboratório.
Aos meus colegas do mestrado, que sofreram junto, mas os momentos de felicidade superaram as dificuldades! Às minhas amigas “Meninas”, estamos juntas pra sempre!
Aos meus tios, tias e primos.
À família do noivo, sempre presente na minha vida!
Às amigas Tainah, Neima e Verena pelo ótimo convívio e amizade!
Aos professores do PGALI.
A todos os funcionários da UFBA, em especial àqueles que ajudaram nas constantes mudanças de laboratório. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB), pela concessão de auxílio dissertação. E a todos que de alguma forma contribuíram para a concretização deste trabalho.
7
SUMÁRIO
RESUMO ................................................................................................................ 9
ABSTRACT .......................................................................................................... 10
INTRODUÇÃO GERAL ........................................................................................ 11
OBJETIVOS ......................................................................................................... 13
Objetivo geral ....................................................................................................... 13
Objetivos específicos............................................................................................ 13
CAPÍTULO 1 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ........................................................ 14
1. Salmonella spp. .............................................................................................. 14
2. Cultivo orgânico de alimentos ......................................................................... 17
3. Antimicrobianos naturais ................................................................................ 18
3.1. Óleos essenciais ........................................................................................... 20
3.1.1. Óleo essencial de alecrim .......................................................................... 23
3.1.2. Óleo essencial de manjericão .................................................................... 24
3.1.3. Óleo essencial de manjerona ..................................................................... 24
4. Microbiologia de vegetais folhosos ................................................................. 25
REFERÊNCIAS .................................................................................................... 29
CAPÍTULO 2 - ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO ÓLEO ESSENCIAL DE
MANJERONA (Origanum majorana) CONTRA Salmonella enterica sorovar
Schwarzengrund MULTIRRESISTENTE EM HORTALIÇAS DE CULTIVO
ORGÂNICO .......................................................................................................... 37
RESUMO .............................................................................................................. 38
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................... 38
2. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................... 39
2.1. Preparação da cultura bacteriana ................................................................. 39
2.2. Hortaliças e óleos essenciais ........................................................................ 40
2.3. Triagem da atividade antimicrobiana dos óleos essenciais ........................... 40
2.4. Soluções do OE para tratamento antimicrobiano .......................................... 41
2.5. Atividade antimicrobiana do óleo essencial contra Salmonella
Schwarzengrund em hortaliças ............................................................................ 41
2.6. Análise sensorial ........................................................................................... 42
8
2.7. Análise estatística.......................................................................................... 42
3. RESULTADOS ............................................................................................... 43
3.1. Triagem da atividade antimicrobiana dos óleos essenciais ........................... 43
3.2. Atividade antimicrobiana do óleo essencial de manjerona contra S.
Schwarzengrund em vegetais orgânicos .............................................................. 43
3.2.1. Atividade do óleo essencial de manjerona comparado com o controle de
hipoclorito de sódio 250 ppm em amostras inoculadas com S. Schwarzengrund 44
3.2.2. Atividade do óleo essencial de manjerona comparado com o controle de
tampão fosfato salino em amostras inoculadas com S. Schwarzengrund ............ 46
3.3. Análise sensorial ........................................................................................... 47
4. DISCUSSÃO .................................................................................................. 48
5. CONCLUSÃO ................................................................................................. 52
6. REFERÊNCIAS .............................................................................................. 52
ANEXOS .............................................................................................................. 57
APÊNDICES ......................................................................................................... 59
9
RESUMO
Os óleos essenciais são produtos extraídos de plantas e exibem importantes propriedades antimicrobianas, antitoxigênicas e antiparasitárias. A garantia da segurança em se ter alimentos livre de patógenos, com características nutricionais e organolépticas conservadas e o fato de que os consumidores estão cada vez mais dando preferência a alimentos mais saudáveis e livres de conservantes sintéticos é o que tem motivado o estudo de óleos essenciais para aplicação em alimentos. O objetivo do trabalho foi avaliar a eficácia do óleo essencial de manjerona quando aplicado em hortaliças orgânicas inoculadas artificialmente com Salmonella enterica sorovar Schwarzengrund. Foi avaliada, primeiramente a atividade antimicrobiana dos óleos essenciais de alecrim, manjericão e manjerona, para saber qual apresentava maior efetividade contra a Salmonella enterica sorovar Schwarzengrund. Esse teste foi realizado pela técnica de difusão em discos de papel filtro estéreis. As amostras de alface lisa, couve e rúcula foram lavadas e deixadas imersas em solução com hipoclorito de sódio 250 ppm por 20 minutos. Após pesagem em porções de 10g, as amostras foram inoculadas por imersão em solução salina a 0,85% contendo 4 log UFC.g-1 de Salmonella enterica sorovar Schwarzengrund, posteriormente imersas separadamente em cada uma das três soluções do óleo essencial a 0,1%, 0,3% e 0,5%, no controle de tampão fosfato-salino e no controle de hipoclorito de sódio 250 ppm, por 1 e 2 minutos. A enumeração de Salmonella foi realizada em três dias consecutivos, por meio de plaqueamento nos meios HE (ágar Entérico de Hecktoen) e XLD (ágar Xilose Lisina Desoxicolato). A concentração de 0,5% do óleo essencial de manjerona proporcionou as maiores reduções na carga microbiana, com diferenças estatisticamente significativas (p<0,05), quando comparada ao controle de hipoclorito de sódio 250 ppm nas folhas de couve e rúcula. Houve uma boa aceitação sensorial das amostras de alface tratadas com o óleo essencial de manjerona incorporado ao azeite de oliva. Além da boa aceitação sensorial, observou-se que nas condições em que os testes foram realizados, os dados obtidos demonstraram que o óleo essencial de manjerona a 0,5% foi mais eficaz que o hipoclorito de sódio na redução da contaminação microbiana em todas as amostras, o que permite propor sua utilização como um complemento na desinfecção de hortaliças, aumentando a segurança na utilização destes alimentos. Palavras-chave: Antimicrobianos naturais. Origanum majorana. Desinfecção. Salmonella.
10
ABSTRACT
The essential oils are products extracted from plants that exhibit significant antimicrobial, antiparasitic and antitoxigenic properties. The use of essential oils in the foods or foodstuff area has been motivated by the need to ensure microbiological safety and the maintenance of nutritional and organoleptic characteristics, as well as the fact that consumers are increasingly preferring healthier foods, which are free of synthetic preservatives. The aim of the study was to evaluate the efficacy of the marjoram essential oil when applied to organic vegetables artificially inoculated with Salmonella enterica serovar Schwarzengrund. First, was evaluated the antimicrobial activity of rosemary, sage and majorana essential oils to know which has the greatest effectivity against the Salmonella enterica sorovar Schwarzengrund. This test was conducted by the test of disk diffusion in sterile filter papers. The samples of smooth lettuce, kale and arugula were washed and immersed in solution with 250 ppm sodium hypochlorite for 20 minutes. After weighing in portions of 10g, the samples were inoculated by immersion in 0.85% saline solution containing 4 log CFU.g-1 of Salmonella enterica serovar Schwarzengrund, later immersed separately in three solutions (0.1%, 0.3% and 0.5% concentration) and in the control solutions of sterile phosphate-buffered saline and sodium hypochlorite (250 ppm) during 1 and 2 minutes. The enumeration of Salmonella through plating in HE (Hecktoen Enteric) and XLD (Xylose Lysine Deoxycholate) agar was carried out during 3 consecutive days. In kale and arugula leaves, the marjoram essential oil at 0.5% concentration showed higher antimicrobial activity compared to the control of sodium hypochlorite 250 ppm. There was a good acceptability of lettuce samples treated with the essential oil of marjoram incorporated into the olive oil. Besides the good acceptability, it was observed that under the conditions which the tests were performed, the results showed that 0.5% marjoram essential oil was more effective than the 250 ppm sodium hypochlorite solution in reducing microbial contamination in all samples, allowing us to propose it as a complement to disinfect vegetables, increasing the safety use of these foods.
Keywords: Natural antimicrobials. Origanum majorana. Disinfection. Salmonella.
11
INTRODUÇÃO GERAL
A Organização Mundial da Saúde (OMS) recomenda o consumo diário
de 400g de frutas e hortaliças, o que equivale a cinco porções desses alimentos.
As frutas e hortaliças desempenham papel importante na alimentação humana e
são fonte de vitaminas e minerais, sendo importantes componentes de uma dieta
saudável. Investigações revelam o seu efeito protetor na redução do risco de
doenças cardiovasculares, alguns tipos de câncer e também na manutenção do
peso corporal (JAIME et al., 2009; RAMALHO et al., 2012). Segundo o Instituto
Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE, 2010) o consumo anual de hortaliças
per capita, entre os anos de 2008/2009 foi de 27,075kg.
Como as hortaliças são consumidas normalmente cruas, se o processo
de higienização não for realizado corretamente, podem conter micro-organismos
veiculadores de doenças. Dessa forma, esses alimentos estão cada vez mais
relacionados a surtos de gastroenterites, com um aumento progressivo de casos,
passando de sete casos no ano de 2000 para 109 no ano de 2012 (CASTRO-
ROSAS et al., 2012; BRASIL, 2013).
Esse fato pode ser potencializado com o aumento do consumo de
hortaliças orgânicas. Estes produtos são mais suscetíveis a contaminação
microbiológica, uma vez que em seu cultivo não são utilizados produtos químicos
para eliminar os organismos vivos presentes. Então, esses alimentos necessitam
de maior cuidado na etapa de higienização (NGUZ et al., 2005).
A preocupação com a segurança na adição de aditivos químicos em
alimentos tem surgido nos últimos anos, pois os consumidores exigem cada vez
mais o uso de produtos naturais como conservantes alternativos. Particular
interesse tem sido focado no uso de óleos essenciais de plantas como aditivos
alimentares, devido ao seu potencial como ingredientes preservativos ou
tratamentos descontaminantes, e por serem amplamente aceitos pelos
consumidores (GOVARIS et al., 2010; GUTIERREZ et al., 2009).
A garantia da segurança em se obter alimentos com características
nutricionais e organolépticas conservadas é o que tem motivado a busca por
esses conservantes naturais com potencial aplicação em alimentos. Porém, a
12
escolha de antimicrobianos naturais está vinculada à compatibilidade destes com
o alimento alvo, assim como sua efetividade contra micro-organismos
indesejáveis, segurança, entre outras características (HYLDGAARD et al., 2012).
Os óleos essenciais de plantas são um exemplo de potenciais
antimicrobianos naturais bastante estudados para aplicação em alimentos e sua
grande maioria é classificada como GRAS, do termo inglês “generally recognized
as safe” (geralmente reconhecido como seguro). São produtos obtidos de
materiais vegetais, em que seus componentes e óleo extraído exibem
propriedades antimicrobianas, antioxidante, antitoxigênicas e antiparasitárias
(BURT, 2004; CAROVIC-STANKO et al., 2010).
13
OBJETIVOS
Objetivo geral
Determinar qual óleo essencial (alecrim, manjericão e manjerona) possui a melhor
atividade antimicrobiana contra Salmonella enterica sorovar Schwarzengrund
multirresistente, para posterior aplicação em três tipos de hortaliças.
Objetivos específicos
- Realizar testes de triagem da atividade antimicrobiana dos óleos essenciais de
alecrim, manjericão e manjerona contra Salmonella enterica sorovar
Schwarzengrund em ensaios de disco difusão no ágar;
- Estudar a eficácia antimicrobiana do óleo essencial que apresentar melhor
atividade antimicrobiana em diferentes concentrações e tempos de aplicação;
- Comparar a atividade antimicrobiana do óleo essencial que apresentar melhor
atividade antimicrobiana à da solução de hipoclorito de sódio (250 ppm) nos
mesmos tempos de aplicação;
- Avaliar, por meio de teste sensorial, a aceitação e intenção de compra de alface
com óleo essencial misturado ao azeite de oliva.
14
CAPÍTULO 1 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1. Salmonella spp.
O gênero Salmonella pertence à família Enterobacteriaceae, são
bastonetes Gram-negativos, fermentadores, não esporulados, na maioria móveis,
de metabolismo aeróbio ou facultativamente anaeróbio. Estão amplamente
distribuídos na natureza e têm o trato intestinal do homem e animais como seu
hábitat primário. Sua temperatura ideal de desenvolvimento situa-se na faixa de
35 a 37ºC, sendo a mínima de 5ºC e a máxima de 47ºC. O pH ótimo para seu
desenvolvimento fica próximo de 7,0 e valores superiores a 9,0 e inferiores a 4,0
são bactericidas e, não toleram concentrações superiores a 9% de NaCl (JAY,
2005).
Em todo o mundo, Salmonella spp. é um dos principais micro-
organismos responsáveis por gastroenterites em humanos, podendo afetar
qualquer pessoa, principalmente aqueles com sistema imune debilitado. Sua
dinâmica de infecção é variável e pode também ser afetada pelo estilo de vida e
comportamento humano, tecnologia, comércio e turismo. Como as salmonelas
apresentam a habilidade de persistirem no intestino de animais e de invadirem
tecidos, muitos alimentos podem servir como veículos para sua transmissão, o
que representa um desafio maior à segurança alimentar (HUMPHREY, 2004;
WIGLEY et al., 2005; BAJPAI et al., 2012; CARRASCO et al., 2012).
A infecção geralmente decorre da ingestão de água e alimentos
contaminados, tais como temperos e principalmente alimentos de origem animal.
Porém, nos últimos anos, infecções desse tipo têm sido cada vez mais
associadas a alimentos crus, como frutas e hortaliças minimamente processadas,
onde a contaminação ocorre principalmente pela água de irrigação e adubo
orgânico utilizados na produção primária. Com relação às etapas do
processamento dos alimentos, vários fatores como a temperatura de
armazenagem inadequada, cocção insuficiente ou contaminação cruzada
favorecem a multiplicação de micro-organismos (OLIVEIRA et al., 2011;
MUKHOPADHYAY e RAMASWAMY, 2012; ZWEIFEL e STEPHAN, 2012).
15
A carga bacteriana para iniciar uma infecção varia de acordo com a
cepa, o alimento consumido e o estado geral do hospedeiro, estimando-se que
seja necessário de 105 a 1010 UFC (unidades formadoras de colônias) para iniciar
uma infecção. Grande quantidade de inóculo é necessária para superar a barreira
da acidez do estômago e competir com a microbiota do intestino. Porém, a dose
infecciosa é reduzida quando os alimentos contaminados com Salmonella
atravessam o estômago mais rapidamente, como líquidos, ou alimentos que
neutralizam a acidez estomacal. Com isso, indivíduos com pH gástrico mais
elevado são mais suscetíveis à infecção (DARWIN e MILLER, 1999).
As espécies Salmonella enterica e Salmonella bongori são as únicas
que compreendem o gênero Salmonella. Salmonella enterica é subdividida em
seis subespécies, que apresentam diferenças bioquímicas e genômicas entre si e
são designadas por nomes ou números romanos, com um total de 2610 sorotipos
(Tabela 1) (GUIBOURDENCHE et al., 2010).
Tabela 1. Espécie, subespécie e número de sorotipos de Salmonella spp.
Espécie Subespécie N° de sorotipos por
subespécie
S. enterica enterica 1547
S. enterica salamae 513
S. enterica arizonae 100
S. enterica diarizonae 341
S. enterica houtenae 73
S. enterica indica 13
S. bongori 23
Total: 2610
Fonte: Guibourdenche et al., 2010.
Quando são excretadas nas fezes, podem ser transmitidas por insetos
e outros organismos vivos para outras localidades, sendo a água uma delas. Essa
água, quando usada no processamento de alimentos, pode torna-los veículos de
doenças transmitidas por alimentos, caracterizando uma contaminação cruzada
(JAY, 2005).
16
As salmonelas podem ser destruídas pelos desinfetantes mais
utilizados nas indústrias, tais como fenóis, clorados e iodados, além de que são
sensíveis à luz solar e também quando submetidas a altas temperaturas (60°C
por 5 minutos). Porém, o uso inadequado de agentes químicos para limpeza das
linhas de produção nas indústrias de alimentos favorece a manutenção de
patógenos em toda cadeia produtiva, dificultando a eliminação do micro-
organismo e permitindo a ocorrência de surtos de infecções alimentares causadas
pelo consumo de produtos contaminados (CERF et al., 2010).
Historicamente, os sorotipos de Salmonella Enteritidis e Typhimurium
têm sido os maiores causadores de salmonelose não-tifoidal, que geralmente é
uma doença auto limitada, os pacientes se recuperam sem a necessidade de
atenção médica, sendo a administração de antimicrobianos no tratamento de
gastroenterites não recomendado. Já uma pequena parcela de infecções por
Salmonella resulta em salmonelose invasiva, que requer hospitalização e
antibioticoterapia. O que tem agravado esses casos são as salmonelas
multirresistentes, ou seja, cepas que são resistentes a antimicrobianos de
diferentes classes, dificultando o controle e tratamento dessas doenças
(BANGTRAKULNONTH et al., 2004; CERF et al., 2010; BRICHTA-HARHAY et al.,
2011).
Cloete (2003) define a resistência de bactérias aos antimicrobianos
como a capacidade temporária ou permanente de um micro-organismo e sua
descendência de permanecer viável e/ou se multiplicar sob condições que
poderiam destruir ou inibir outros membros da cepa.
Segundo Aarestrup e colaboradores (2007) a Salmonella
Schwarzengrund recentemente se tornou um dos principais sorovares isolados de
humanos, animais e alimentos, inclusive multirresistentes a medicamentos. A
preocupação com a existência de Salmonella resistente a medicamentos se deve
ao fato de que pessoas infectadas com esse micro-organismo ficam
hospitalizadas por períodos mais longos do que os pacientes com infecções
causadas por cepas sensíveis, tendo uma maior incidência de óbitos (LEE et al.,
1994; HELMS et al., 2004).
17
2. Cultivo orgânico de alimentos
Para a maioria dos consumidores, a segurança tem se tornado um dos
atributos mais importantes nos alimentos e essa preocupação tem influenciado o
seu padrão de compra. Um desses aspectos tem sido o aumento da demanda por
alimentos cultivados organicamente, onde essa preferência está associada à
crença de que alimentos orgânicos são mais saudáveis (CHASSY et al., 2006;
MAGKOS et al., 2006).
A agricultura orgânica utiliza condições que evitam produtos químicos,
hormônios, antibióticos, engenharia genética e irradiação. Por estar baseada
numa visão holística, esta forma de cultivo promove o desenvolvimento
sustentável dos agroecossistemas, obedecendo a biodiversidade, os ciclos
biogeoquímicos e a atividade biológica do solo utilizando fertilizantes de origem
orgânica e fontes renováveis de energia (CHEN, 2005; CASADO e MOLINA,
2009; FORMAN e SILVERSTEIN, 2012). Segundo o Ministério da Agricultura,
Pecuária e Abastecimento, o objetivo do cultivo orgânico é promover qualidade de
vida com proteção ao meio ambiente (MAPA, 2013).
Os consumidores estão cada vez mais optando por esses alimentos
devido à percepção de que são mais saudáveis e seguros do que aqueles
cultivados em sistema convencional, por não conterem resíduos de pesticidas e
nitratos/nitritos (LV et al., 2012). Frente a este cenário, Andrade e Bertoldi (2012)
caracterizaram, por meio de entrevistas, o mercado consumidor de alimentos
orgânicos na cidade de Belo Horizonte-MG. Quando indagados sobre o conceito
de “alimento orgânico”, 69,7% dos consumidores definiu como isento de
agrotóxicos ou pesticidas e 14,5% de produtos químicos.
Por acreditarem que os alimentos orgânicos tenham um valor
nutricional mais elevado e um maior teor de compostos biologicamente ativos, os
consumidores estão dispostos a pagar maior valor para obtê-los (MAGKOS et al.,
2006; HALLMANN e REMBIALKOWSKA, 2012). Porém, Winter e Davis (2006)
concluíram que esse melhor valor nutricional depende do nutriente avaliado. Entre
estudos que comparam a quantidade de componentes alimentares, os que
tiveram destaque foram os ácidos orgânicos e compostos polifenólicos.
18
Apesar de ter um apelo saudável, autores relatam que os alimentos de
cultivo orgânico têm sido considerados um risco à saúde do consumidor, por
serem mais suscetíveis a contaminação microbiológica devido ao método de
cultivo e processamento, onde fertilizantes naturais como esterco animal são
utilizados em substituição aos fertilizantes químicos (McMAHON e WILSON,
2001; NGUZ et al., 2005).
Em contrapartida, existem no Brasil selos de regulamentação para a
produção de orgânicos. Dentre as normas exigidas, uma delas é a de que a
compostagem do esterco seja realizada de acordo com procedimentos
específicos como, por exemplo, que esse processo seja feito a 55-77°C, e
aplicado com mais de 90 dias antes da colheita. Já no uso em cultivo
convencional, não são exigidos tais procedimentos (CHEN, 2005; WINTER e
DAVIS, 2006).
3. Antimicrobianos naturais
Diversos sistemas de conservação de alimentos utilizam tratamento
térmico e/ou adição de conservantes químicos para controlar o desenvolvimento
de micro-organismos deteriorantes e patogênicos, porém esses sistemas podem
ter efeitos indesejáveis. Dentre os compostos antimicrobianos, antioxidantes e
prebióticos utilizados, as indústrias estão começando a dar preferência àqueles
naturais, evitando dessa forma, a utilização extensiva de aditivos químicos, onde
estudos comprovam a toxicidade de alguns desses compostos, bem como pelo
fato de que os consumidores estão dando maior preferência a alimentos naturais,
livres de aditivos sintéticos (OLASUPO et al., 2003; BURT, 2004; KECHICHIAN et
al., 2010).
Segundo o Codex Alimentarius (2008), antimicrobiano ou agente
antimicrobiano é qualquer substância de origem natural, semissintética ou
sintética que em concentrações adequadas elimina ou inibe o crescimento de
micro-organismos devido à interação com um alvo específico. Os antimicrobianos
podem ser classificados como bactericidas, que eliminam micro-organismos, ou
bacteriostáticos, que inibem o seu desenvolvimento.
19
Existe uma demanda crescente por alimentos minimamente
processados, frescos prontos para o consumo e de preparo rápido. Esses novos
tipos de comércio de alimentos representam grandes desafios para a qualidade e
segurança alimentar. Com isso, os antimicrobianos naturais são utilizados em
alimentos para controlar sua deterioração natural e também como prevenção e/ou
controle do desenvolvimento de micro-organismos, inclusive os patógenos
(TAJKARIMI et al., 2010; LUCERA et al., 2012).
Os antimicrobianos podem agir sobre os micro-organismos de quatro
formas diferentes: inibição da síntese da parede celular; alteração da
permeabilidade da membrana celular ou do transporte ativo através da membrana
celular; inibição da síntese de proteínas e inibição da síntese de ácido nucleico
(ANVISA, 2014; SILVA, 2007). A Figura 1 mostra os efeitos dessa ação, no caso
dos óleos essenciais, com a degradação da parede celular, os danos para a
membrana citoplasmática, danos às proteínas de membrana, coagulação do
citoplasma e esgotamento da força motriz dos prótons (BURT, 2004).
Figura 1. Sítios do mecanismo de ação dos óleos essenciais frente à célula bacteriana (Adaptado de Burt, 2004).
Existem mais de 1340 plantas com compostos antimicrobianos naturais
definidos e mais de 30000 componentes têm sido isolados dos seus óleos
vegetais e que são utilizados na indústria de alimentos. No entanto,
características comerciais úteis estão disponíveis somente em alguns óleos
essenciais (TAJKARIMI et al., 2010).
20
3.1. Óleos essenciais
Óleos essenciais (OE) são também considerados como
antimicrobianos naturais, sendo líquidos aromáticos e voláteis extraídos de alguns
órgãos das plantas como: flores, raízes, sementes, cascas, folhas, frutas ou
madeira e da planta como um todo. Têm sido utilizados durante séculos na
medicina, perfumaria e cosmético, tendo adquirido relevância como agentes
flavorizantes no século XIX (HYLDGAARD et al., 2012).
São metabólitos secundários biossintetizados em estruturas
glandulares de uma célula vegetal. Seus constituintes são uma família diversa de
compostos orgânicos de baixo peso molecular, com grandes diferenças na
atividade antimicrobiana. Os óleos essenciais empregados comercialmente
podem ser isolados ou extraídos utilizando metodologias como extração com
solvente e expressão, porém o mais utilizado é o método de destilação a vapor. E
para determinar a composição detalhada desses produtos são utilizados
normalmente cromatografia e espectrometria de massa, sendo que os
componentes em maior quantidade podem constituir até 85% do óleo essencial
(BURT, 2004; BAJPAI et al., 2012; HYLDGAARD et al., 2012).
Cada óleo essencial exibe uma atividade antimicrobiana, e que
depende do tipo de condimento ou erva, da composição química e teor de
extratos. A composição química é variada, complexa e depende da variedade,
parte da planta utilizada, origem, processamento e condições de armazenamento.
Os componentes dos óleos essenciais são divididos em dois grupos: os de origem
terpênica e os compostos aromáticos. Os compostos fenólicos são os principais
componentes responsáveis pelas propriedades antibacterianas desses produtos,
são capazes de romper a membrana celular, bem como inibir as propriedades
funcionais da célula e eventualmente, saída dos materiais do interior da célula. Na
Tabela 2 estão discriminados os principais componentes de alguns óleos
essenciais que exibem propriedades antimicrobianas (BURT, 2004; BAJPAI et al.,
2012; ALBOOFETILEH et al., 2014).
21
Tabela 2. Principais componentes de óleos essenciais que exibem propriedades antimicrobianas
Nome comum do
OEa
Nome científico da
planta fonte
Principais
componentes
Composição aproximada
b
(%)
Referências
Coentro
Coriandrum sativum
(sementes)
Linalol
E-2-decanal
70%
-
(Delaquis et al., 2002)
Canela
Cinnamomum
zeylandicum
Trans-2-
cinamaldeído
65%
(Lens-Lisbonne et al., 1987)
Orégano
Origanum vulgare
Carvacrol
Timol Γ-Terpineno p-Cimeno
Traço-80%
Traço-64% 2-52%
Traço-52%
(Lawrence, 1984; Prudent et al.,
1995; Charai et al., 1996; Sivropoulou et al., 1996; Kokkini et al., 1997; Russo et al., 1998;
Daferera et al., 2000; Demetzos e Perdetzoglou, 2001; Marino et
al., 2001)
Alecrim
Rosmarinus officinalis
α-pineno acetato Bomyl
Cânfora
1,8-cineol
2-25% 0-17& 2-14%
3-89%
(Daferera et al., 2000, 2003;
Pintore et al., 2002)
Sálvia
Salvia officinalis L.
Cânfora
α-pineno β-pineno 1,8-cineol
α-tujone
6-15%
4-5% 2-10% 6-14%
20-42%
(Marino et al., 2001)
Cravo
Syzygium aromaticum
Eugenol
Acetato eugenilo
75-85%
8-15%
(Bauer et al., 2001)
aÓleos Essenciais que tem demonstrado propriedades antibacterianas in vitro ou em modelos de alimentos e para o
qual a composição pode ser encontrada na literatura. bPorcentagens dos voláteis totais arredondados para o número inteiro mais próximo.
Fonte: Adaptado de Burt (2004).
A maioria dos óleos essenciais é classificada como GRAS e sua
efetividade não é definida por um mecanismo específico e nem pelo grande
número de diferentes compostos químicos presentes, mas sim por vários alvos na
célula que podem contribuir para suas propriedades antimicrobianas (BURT,
2004).
Com relação ao mecanismo de ação dos óleos essenciais, já é
reconhecido que a ação antimicrobiana depende de suas características
hidrofílicas ou lipofílicas, sendo que o mecanismo é relatado com o ataque aos
fosfolipídios presentes na membrana celular, o que resulta em um aumento da
permeabilidade e extravasamento do citoplasma, ou também em interações com
enzimas localizadas na parede celular. O modo de ação desses antimicrobianos
depende também do tipo de micro-organismo (KALEMBA e KUNICKA, 2003;
GÓMEZ-ESTACA et al., 2010).
Embora haja exceções na literatura, geralmente as bactérias Gram-
positivas são mais suscetíveis do que as Gram-negativas aos compostos
22
lipofílicos dos óleos essenciais. Uma possível explicação para esta atividade pode
estar relacionada à dificuldade dos óleos essenciais em se difundirem através da
membrana externa da parede celular, pois existe uma barreira hidrofílica que
impede a passagem de macromoléculas e combinações hidrofóbicas, embora não
seja totalmente impermeável (Figura 2) (KALEMBA e KUNICKA, 2003; BUSATTA
et al., 2008).
Figura 2. Diagrama simplificado da parede celular de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. Fonte: FOX (2010).
O efeito antimicrobiano de um óleo essencial é avaliado inicialmente in
vitro, podendo utilizar o método de difusão em ágar, onde discos de papel filtro
estéril são impregnados com o agente antimicrobiano, colocados sobre a
superfície de placas com ágar previamente inoculadas com o micro-organismo e o
seu halo de inibição é observado. Já a avaliação dos óleos essenciais em
modelos alimentares é necessária para determinar se eles serão agentes
antimicrobianos eficazes dentro da matriz alimentar (FISHER e PHILLIPS, 2008).
Em alimentos de origem vegetal, por exemplo, a eficácia biológica dos
óleos essenciais é atribuída às propriedades intrínsecas e extrínsecas das
amostras, sendo que o conteúdo de gordura de um alimento pode ser um
adversário direto sobre a eficácia dos óleos essenciais quando testados contra os
patógenos, já que a mesma serve de barreira para esses micro-organismos
(BAJPAI et al., 2012).
Koutsoumanis e colaboradores (1999) estudando salada inoculada com
patógeno alimentar, constataram que o óleo essencial de orégano pode suprimir o
número de Salmonella Enteritidis imediatamente após a inoculação e também
proporcionar aumento na taxa de mortalidade desse micro-organismo.
Óleos essenciais podem ser utilizados como antibacterianos, porém o
impacto organoléptico deve ser considerado quando de seu uso como
23
conservantes naturais, uma vez que podem alterar o sabor dos alimentos ou
exceder limiares aceitáveis de sabor (GUTIERREZ et al., 2008). Porém Burt
(2004) afirma que, em se tratando de propriedades organolépticas, os óleos
essenciais podem ser facilmente incorporados em produtos alimentares.
Os óleos essenciais têm sido utilizados pela indústria de alimentos
como conservantes naturais para prevenir a deterioração, aumentar a vida de
prateleira de produtos e controlar o desenvolvimento de patógenos, visto que um
grande problema de saúde pública são as doenças transmitidas por alimentos
(SOLÓRZANO-SANTOS e MIRANDA-NOVALES, 2012).
3.1.1. Óleo essencial de alecrim
Nos países mediterrâneos, o alecrim (Rosmarinus officinalis) nasce
como uma planta selvagem, chegando a 1,5 m de altura pertencendo à família
Lamiaceae. A sua classificação botânica é bastante complexa, pois há várias
espécies dentro do gênero Rosmarinus, com uma gama de variedade e formas.
Devido às propriedades antioxidantes de suas folhas, Rosmarinus officinalis tem
sido amplamente aceito como uma das especiarias com maior atividade
antioxidante (ATTI-SANTOS et al., 2005; WANG et al., 2008).
A Tabela 3 apresenta os micro-organismos que têm sido estudados
frente à ação antimicrobiana do óleo essencial de alecrim, sendo eficiente para
todos.
Tabela 3. Atividade antimicrobiana do óleo essencial de Rosmarinus officinalis
MICRO-ORGANISMOS ESTUDADOS
REFERÊNCIAS
Staphylococcus aureus
OJEDA-SANA et al., 2013; JIANG et al., 2011;
OKOH et al., 2010; BOZIN et al., 2007
Enterococcus faecalis
OJEDA-SANA et al., 2013 Escherichia coli OJEDA-SANA et al., 2013; RIBEIRO et al., 2013
Klebsiella pneumoniae
OJEDA-SANA et al., 2013; OKOH et al., 2010
Bacillus subtilis
JIANG et al., 2011; OKOH et al., 2010; BOZIN et
al., 2007
Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Aspergillus niger
JIANG et al., 2011
Salmonella Typhi, Salmonella Enteritidis, Shigella sonei, Micrococcus flavus, Sarcina lutea,
Staphylococcus epidermidis
BOZIN et al., 2007
24
O óleo essencial de alecrim é considerado uma das fontes mais
importantes de compostos voláteis e não-voláteis e a variação da sua composição
foi reportada à sua origem geográfica (OJEDA-SANA et al., 2013).
Estudos realizados com a finalidade de identificar os principais
constituintes do óleo essencial de alecrim, que seriam os responsáveis pela
atividade antioxidante e antimicrobiana desse óleo, constataram que o 1,8-cineol
e α-pineno foram encontrados em maior quantidade (WANG et al., 2008;
BERETTA et al., 2011; JIANG et al., 2011; OJEDA-SANA et al., 2013).
3.1.2. Óleo essencial de manjericão
O manjericão (Ocimum basilicum L.) é membro da família Lamiaceae, e
entre as 150 espécies do gênero Ocimum, é a principal espécie cultivada
comercialmente em muitos países. Pode ser utilizada como uma planta medicinal,
tempero ou condimento e seu óleo essencial pode ser empregado em alimentos e
fragrâncias (HUSSAIN et al., 2008; BLANK et al., 2012).
De acordo com a literatura, os principais componentes do óleo
essencial de manjericão são o linalol e estragol (BAGAMBOULA et al., 2004;
HUSSAIN et al., 2008; BLANK et al., 2012; SIENKIEWICZ et al., 2013). Estudos
comprovam que esse óleo foi mais efetivo que o óleo essencial de alecrim na
inativação de Escherichia coli resistente (SIENKIEWICZ et al., 2013). Foi testado
contra Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Pasteurella multocida, Escherichia
coli, Aspergillus niger, Mucor mucedo, Fusarium solani, Botryodiplodia
theobromae, Rhizoctonia solani, Escherichia coli O157:H7 e Salmonella
Typhimurium, mostrando efetividade em todos os casos (HUSSAIN et al., 2008;
KARAGÖZLÜ et al., 2011).
3.1.3. Óleo essencial de manjerona
Manjerona (Origanum majorana) é uma planta aromática perene,
herbácea pertencente à família Lamiaceae, nativa da região mediterrânea. Na
indústria de alimentos é utilizada como condimento de salsichas, e em menores
25
relatos nos produtos de panificação, legumes processados, sopas, salgadinhos e
molhos (KOMAITIS, 1999; NOVAK et al., 2002; LEEJA e THOPPIL, 2007).
Além de ser utilizado na perfumaria e cosméticos, devido ao seu odor
picante, o óleo essencial de manjerona é empregado também na manufatura de
fungicidas e em vários produtos farmacêuticos, podendo ter o maior potencial
para uso em aplicações industriais (BUSATTA et al., 2008; BAÂTOUR et al.,
2012). Ainda que pouco estudado, seu principal constituinte é o terpinen-4-ol
(VERA e CHANE-MING, 1999; VÁGI et al., 2005; BUSATTA et al., 2008).
O óleo essencial de manjerona tem sido estudado desde o século XIX,
quando Biltz afirmou que esse óleo continha cerca de 40% de hidrocarbonetos
monoterpênicos, principalmente terpineno. Já em 1906, Wallach demonstrou que
a manjerona doce continha terpineol-4 e α-terpineol. E a partir daí, somente nos
anos sessenta é que prosseguiram as investigações em torno desse óleo
(TASKINEN, 1974).
4. Microbiologia de vegetais folhosos
Recentes surtos de origem alimentar têm levado ao reconhecimento
de produtos frescos como veículos emergentes de doenças transmitidas por
alimentos. O Centro de Controle e Prevenção de Doenças (CDC) dos Estados
Unidos reportou um aumento no número de surtos de doenças transmitidas por
alimentos por produtos frescos entre 1995 e 2005 em todo o mundo (SEOW et al.,
2012). No Brasil, segundo a Secretaria de Vigilância em Saúde (SVS-MS) entre
os anos de 2000 e 2013, foram reportados 110 casos de surtos envolvendo
hortaliças como agente de doenças veiculadas por alimentos (BRASIL, 2013).
A contaminação e potencial desenvolvimento de micro-organismos
patógenos em hortaliças, principalmente em saladas prontas para o consumo tem
sido objeto de estudo. A contaminação de hortaliças por coliformes fecais,
Escherichia coli e seus patotipos, aeróbios mesófilos, aeróbios psicrotróficos,
leveduras, Listeria monocytogenes e Salmonella spp. já foi comprovada
(CASTRO-ROSAS et al., 2012; SANT'ANA et al., 2012; SEOW et al., 2012).
Salmonella é a causa mais frequente relatada em casos de
gastroenterites e tem sido implicada em surtos causados pelo consumo de
26
vegetais contaminados. Em toda a cadeia de produção, os vegetais folhosos
podem ser contaminados com Salmonella. A contaminação por água de irrigação
(excrementos, solo e outros insumos como esgoto podem introduzir
enteropatógenos diretamente para os cursos de água), solo ou esterco
compostado indevidamente durante a produção primária, são consideradas as
fontes mais prováveis (HEATON e JONES, 2008; GÜNDÜZ et al., 2009;
RAVISHANKAR et al., 2010; OLIVEIRA et al., 2011).
Na Tabela 4 estão relacionados surtos que aconteceram no mundo
entre os anos de 1997 e 2007, em que a Salmonella foi o agente etiológico e
frutas e hortaliças os alimentos-veículos.
Tabela 4. Surtos alimentares reportados entre os anos de 1997 e 2007 no mundo com agente etiológico a Salmonella.
Ano Patógeno Veículo Referência
1997 Salmonella Enteritidis Couve-flor Anon (2005a)
1997 S. Enteritidis PT4 Pimenta Anon (2005a)
1997 S. Meleagridis Semente germinada (alfafa) Taormina et al. (1999)
1997 S. Infantis ⁄ S. Anatum Semente germinada (alfafa e feijão-da-china)
Taormina et al. (1999)
1997 S. Saphra Melão Sivaplasingham et al. (2004)
1997-8 S. Senftenberg Semente germinada (trevo e alfafa)
Taormina et al. (1999)
1998 S. Havana ⁄ S. Cubana ⁄ S. Tennessee
Semente germinada (alfafa) Taormina et al. (1999)
1998 S. Oranienburg Melão Anon (2001a,b)
1998-99 S. Baildon Tomates Anon (2001a,b)
1999 S. Muenchen Suco de laranja não pasteurizado
Anon (2001a,b)
1999 S. Thompson Coentro Sivaplasingham et al. (2004)
1999 S. paratyphi B var. java Sementes germinadas Stratton et al. (2001)
2000 S. Enteritidis Suco de frutas cítricas não pasteurizado
Anon (2001a,b)
2000 S. Poona Melão CDC (2002a)
2000 S. Typhimurium Alface Horby et al. (2003)
2000 S. Typhimurium DT104 Alface Anon (2005a)
2000 S. Typhimurium DT204B Alface Anon (2005a)
27
Tabela 4. Continuação.
2000 S. Enteritidis 11b Broto de feijão-da-china Harb et al.(2003)
2001 S. Kottbus Semente germinada (alfafa) CDC (2002b)
2001 S. Newport Salada misturada ensacada Anon (2005a)
2001 S. Virchow Salada Anon (2005a)
2001 S. Poona Melão CDC (2002a)
2001 S. Enteritidis Broto de feijão-da-china Honish and Nguyen (2001)
2002 S. Javiana Tomates CDC (2002c)
2002 S. Poona Melão CDC (2002a)
2003-4 S. Enteritidis Amêndoas CDC (2004)
2004 S. Newport Alface Gillespie (2004)
2004 S. Thompson Salada de rúcula Nygard et al. (2004)
2004 S. Braenderup Tomates CDC (2005)
2004 S. Javiana Tomates Anon (2005a)
2005 S. Typhimurium DT104 Alface Takkinen et al. 2005
2005 S. Typhimurium DT104 Alface Anon (2005a)
2005 S. Enteritidis Broto de feijão Anon (2005b)
2006 S. Newport Tomates Anon (2007)
2006 S. Typhimurium Tomates CDC (2006a)
2007 S. Senftenberg Manjericão Pezzoli et al. (2007)
Fonte: Adaptado de HEATON e JONES (2008).
Nas condições do campo, as populações de Salmonella aderidas à
superfície dos vegetais diminuem ao longo do tempo por não ser este um meio
propício, com isso, a proliferação não ocorre. Porém, após a colheita, os
patógenos entéricos têm oportunidades de crescimento, dependendo da
temperatura, disponibilidade de água, danos nos tecidos, nutrientes, microflora
nativa e composição atmosférica de embalagens (OLIVEIRA et al., 2011).
Outro risco de contaminação de vegetais folhosos se dá por meio da
contaminação cruzada, que é a transferência, direta ou indireta, de bactérias ou
vírus de um produto contaminado para um não contaminado. Essa forma de
transferência de contaminação pode ocorrer por meio de práticas deficientes de
28
higiene, equipamento contaminado, armazenamento inadequado e contaminação
por manipuladores de alimentos (CARRASCO et al., 2012).
Ravishankar e colaboradores (2010) avaliaram a ocorrência de
contaminação cruzada de Salmonella enterica de um frango contaminado para
alface. Os autores relatam que após a tábua de corte e faca usadas no
experimento serem lavadas com sabão e água quente não foram detectadas
salmonelas, diferentemente de quando os materiais não foram lavados ou quando
passados na água quente corrente.
Assim sendo, os produtos frescos podem ser contaminados durante a
produção, colheita, processamento, em níveis de varejo ou nas cozinhas das
residências. Seja qual for o ambiente, o método mais estudado para reduzir o
nível de contaminação é o procedimento de lavagem (CARRASCO et al., 2012).
A principal forma de desinfecção utilizada em vegetais folhosos é a
utilização de hipoclorito de sódio, porém tem apresentado algumas limitações e
desvantagens, como redução da eficácia antimicrobiana e formação de
compostos organoclorados cancerígenos, como os trihalometanos, especialmente
quando acontece hipercloração da água para uso em alimentos com elevada
carga orgânica, produzindo níveis inaceitáveis desses produtos carcinogênicos.
Além disso, a preocupação da indústria de alimentos com a redução da utilização
de conservantes químicos tem sido levantada, devido a possibilidade de liberação
de materiais tóxicos no interior de produtos alimentares embalados. Na União
Europeia, produtos clorados já são proibidos no manuseio pós-colheita de
produtos orgânicos (GÜNDÜZ et al., 2009; LÓPEZ-GÁLVEZ et al., 2010;
AZEREDO et al., 2011; BAJPAI et al., 2012).
Estima-se que de 40 a 60% dos casos notificados de doenças
transmitidas por alimentos são resultado de práticas inadequadas de manipulação
de alimentos nas residências (RAVISHANKAR et al., 2010; BRASIL, 2013).
Percebe-se que existem muitas formas de contaminação dos vegetais folhosos e
aliadas a falta de informação dos consumidores sobre higienização eficiente é que
são necessárias cada vez mais, novas técnicas de desinfecção desses alimentos.
Sendo assim, a probabilidade de ocorrer uma doença transmitida por alimentos é
diminuída.
29
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37
CAPÍTULO 2 - ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO ÓLEO ESSENCIAL DE
MANJERONA (Origanum majorana) CONTRA Salmonella enterica sorovar
Schwarzengrund MULTIRRESISTENTE EM HORTALIÇAS DE CULTIVO
ORGÂNICO
ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF MARJORAM (Origanum majorana) ESSENTIAL OIL AGAINST ANTIBIOTIC-RESISTANT Salmonella enterica serovar Schwarzengrund INOCULATED IN VEGETABLES FROM ORGANIC FARMING Jaqueline Fronza Walkera, Palloma de Souza Santosb, Cleber Alberto Schmidtc, Thereza Cristina Calmon de Bittencourtd, Alaíse Gil Guimarãesc. a Mestranda do Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos (PGALI), Faculdade de Farmácia, Universidade Federal da Bahia (UFBA). b Aluna de Iniciação Científica do Laboratório de Pesquisa em Microbiologia de Alimentos, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal da Bahia (UFBA). c Professor (a) do Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos (PGALI), Faculdade de Farmácia, Universidade Federal da Bahia (UFBA). d Professora do Departamento de Produção Animal, Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Federal da Bahia (UFBA).
38
RESUMO
A eficácia antimicrobiana do óleo essencial de manjerona (OEM) quando aplicado a vegetais orgânicos inoculados com 4 log.UFC -1 de Salmonella enterica sorovar Schwarzengrund foi avaliada. Amostras previamente inoculadas de alface lisa (Lactuva sativa), couve (Brassica oleracea) e rúcula (Eruca sativa) foram imersas separadamente em três soluções de óleo essencial de manjerona (0,1%, 0,3% e 0,5%) durante 1 e 2 minutos. Controles de solução salina tamponada e solução de hipoclorito de sódio (250 ppm) foram realizados em paralelo. A enumeração de Salmonella foi realizada durante 3 dias consecutivos. Considerando todas as amostras, o óleo essencial produziu uma redução média na carga microbiana, variando 2,12 - 3,31 log.UFC-1, contra 1,86 - 2,81 log.UFC-1 obtido com o método tradicional de desinfecção com solução de hipoclorito. Em amostras de alface, a concentração de OEM a 0,5% mostrou eficácia semelhante ao controle de hipoclorito. A mesma concentração de óleo essencial testado em couve e rúcula mostraram atividade antimicrobiana significativa quando comparado com o mesmo controle. Testes sensoriais e afetivos mostraram boa aceitação do sabor do óleo essencial de manjerona em folhas de alface. De acordo com este modelo experimental, este óleo tem atividade antimicrobiana promissora contra Salmonella enterica sorovar Schwarzengrund e pode ser utilizado na redução ou substituição do hipoclorito de sódio no processo de desinfecção de produtos hortícolas.
1. INTRODUÇÃO
Entre os anos de 2000 e 2013, o principal agente etiológico identificado
em doenças transmitidas por alimentos (DTAs) foi a Salmonella spp., responsável
por 39,39% dos surtos no Brasil. Em 3409 casos relatados, o principal local de
ocorrência desses surtos foram as residências, o que demonstra a falta de
informação e de cuidado da população na manipulação de alimentos [1].
Dentre os alimentos envolvidos em surtos que tiveram aumento
progressivo dos casos foram as hortaliças, passando de sete no ano de 2000
para 109 casos no ano de 2012 [1]. Esses alimentos desempenham papel
importante na alimentação humana, já que são fontes de vitaminas e minerais.
Porém, as hortaliças são consumidas normalmente cruas e se o processo de
higienização não for realizado corretamente, podem conter micro-organismos
veiculadores de doenças por alimentos. Dessa forma, encontram-se cada vez
mais relacionadas a surtos de gastroenterites [2].
39
A garantia da segurança em se obter alimentos com características
nutricionais e organolépticas conservadas é o que tem motivado a busca por
conservantes naturais com potencial aplicação em alimentos. Porém, a escolha
de antimicrobianos naturais está vinculada à compatibilidade destes com o
alimento alvo, a efetividade contra micro-organismos indesejáveis, segurança,
entre outras características [3].
Os óleos essenciais de plantas são um exemplo de potenciais
antimicrobianos naturais bastante estudados para aplicação em alimentos e sua
grande maioria é classificada como GRAS (geralmente reconhecido como
seguro). São produtos obtidos através de materiais vegetais, em que seus
componentes e óleo extraído exibem propriedades antimicrobianas,
antitoxigênicas e antiparasitárias [4,5].
Com base na necessidade de desenvolver métodos naturais para
reduzir ou eliminar micro-organismos patogênicos em alimentos, é que a eficácia
do óleo essencial de manjerona (Origanum majorana) foi avaliada quando
aplicado em hortaliças provenientes da agricultura orgânica, inoculadas com
Salmonella enterica sorovar Schwarzengrund multirresistente.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Preparação da cultura bacteriana
A cepa de Salmonella enterica sorotipo Schwarzengrund, isolada de
frango in natura, resistente à ampicilina, cefalotina, cefotaxima, tetraciclina,
ceftriaxona, sulfametoxazol e ácido nalidíxico utilizada no estudo foi obtida da
coleção de culturas do Laboratório de Pesquisa em Microbiologia de Alimentos da
Faculdade de Farmácia-UFBA.
Para a reativação bacteriana, um inóculo da cepa mantida sob -8°C em
Caldo infusão de cérebro e coração (BHI; Himedia), acrescido de glicerol (10%),
foi retirado com o auxílio de alça bacteriológica e inoculado em Ágar triptona de
soja (TSA; Himedia). Em seguida, incubou-se a 37°C durante 24 horas.
40
A suspensão bacteriana foi preparada em solução salina estéril a
0,85% e ajustado com um densitômetro (Biosan®-DEN 1) ao padrão 0,5 da escala
Mac Farland (1,5 x 108 UFC.ml-1).
2.2. Hortaliças e óleos essenciais
Os óleos essenciais de alecrim (Rosmarinus officinalis), manjericão
(Ocimum basilicum) e manjerona (Origanum majorana) foram obtidos
comercialmente da empresa Laszlo Aromalândia (sob registro na ANVISA nº
2.04.758-2).
As hortaliças orgânicas (certificadas como orgânicas pelo Ministério da
Agricultura) utilizadas para este estudo foram adquiridas no comércio da cidade
de Salvador-BA. Foram avaliados três tipos diferentes de vegetais orgânicos:
alface lisa (Lactuva sativa), couve (Brassica oleracea) e rúcula (Eruca sativa).
2.3. Triagem da atividade antimicrobiana dos óleos essenciais
A avaliação da atividade antimicrobiana dos óleos essenciais foi
realizada utilizando a técnica de difusão em ágar com discos de papel de filtro
estéril (69 mg/cm2) [6] contra a cepa de Salmonella. Com o auxílio de um swab, a
suspensão obtida tal como descrito no item 2.1, foi espalhada uniformemente
sobre a superfície de uma placa com Ágar Müeller Hinton (Himedia) em três
direções. Em seguida, 15μL de cada óleo essencial puro (alecrim, manjericão e
manjerona) foram pipetados sobre os discos de papel de filtro estéreis (6 mm de
diâmetro) e dispostos em placas de Petri, as quais foram incubadas a 37°C ± 1°C
durante 24 h. Após a incubação, o diâmetro (mm) das zonas de inibição foram
medidos. Considerou-se como atividade antimicrobiana positiva quando
observada a zona de inibição do crescimento bacteriano de diâmetro superior a
10 mm [7]. Os ensaios foram realizados em duplicata, em três experimentos
independentes. Em paralelo, o mesmo ensaio foi realizado com dimetilsulfóxido
PA (DMSO; Synth), um dos solventes utilizado para a diluição dos óleos
essenciais [5].
41
2.4. Soluções do OE para tratamento antimicrobiano
As soluções do óleo essencial que apresentou melhor atividade
antimicrobiana foram preparadas em tampão fosfato-salino (PBS, pH 7,0), nas
concentrações de 0,1%, 0,3% e 0,5%, para imersão das hortaliças. Para a
incorporação do óleo no preparo destas soluções, foi utilizado dimetilsulfóxido PA
(DMSO) 10%. Após o preparo, as soluções foram utilizadas imediatamente.
2.5. Atividade antimicrobiana do óleo essencial contra Salmonella
Schwarzengrund em hortaliças
Os vegetais orgânicos depois de selecionados, foram lavados com
água potável e, em seguida, com água destilada, ficaram imersos em solução de
hipoclorito de sódio a 250 ppm por 20 minutos [8], para redução da microbiota
inicial. Para escoamento do excesso de hipoclorito de sódio, as folhas passaram
por centrifugação em equipamento manual devidamente esterilizado e
posteriormente foram divididas em pedaços menores e separadas em amostras
de 10g. Após este processo, as amostras foram inoculadas por imersão em
solução salina a 0,85% contendo 4 log UFC.mL-1 de S. Schwarzengrund durante
2 min, removidas da solução com o auxílio de uma pinça estéril, colocadas em
sacos individuais de polietileno estéreis e deixadas em câmara de fluxo laminar
durante 30 minutos para permitir a adesão dos micro-organismos nas folhas.
Cada amostra foi então submersa em uma das três soluções de tratamento do
antimicrobiano (200mL), durante um minuto (T1) e dois minutos (T2), com suave
agitação. Como controle, foram utilizadas amostras inoculadas como descrito
acima, imersas em solução tampão fosfato-salino (PBS, pH 7,0) e em solução de
hipoclorito de sódio a 250 ppm [8]. Imediatamente após o tratamento, as amostras
foram colocadas em sacos individuais de polietileno estéreis e armazenadas a
8°C.
Para determinar se havia contaminação inicial presente nas folhas,
foram analisadas amostras antes da inoculação e antes da secagem.
Para a enumeração de Salmonella, as amostras foram analisadas
imediatamente (dia 0) e também após armazenamento (nos dias 1 e 2). As 10g de
42
cada amostra foram diluídas em 90 mL de água peptonada tamponada e
homogeneizadas com o auxílio de um stomacher (Digital Blender® - MC 1204) por
1 minuto, seguido de plaqueamento nos meios HE (ágar Entérico de Hecktoen;
Himedia) e XLD (ágar Xilose Lisina Desoxicolato; Himedia).
As placas foram incubadas a 37°C durante 24 h. Os experimentos
foram realizados em duplicata em três ensaios independentes.
2.6. Análise sensorial
O projeto foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa da Escola de
Nutrição da UFBA (CEPNUT), sendo aprovado sob o número 661.025 no dia 20
de abril de 2014 (ANEXO A).
Para a análise sensorial, as folhas de alface (obtidas do mesmo
produtor certificado) foram lavadas e higienizadas por imersão em hipoclorito de
sódio a 250 ppm [8]. Foi utilizado o óleo essencial que apresentou melhor
atividade antimicrobiana, bem como a melhor concentração. O azeite de oliva foi
utilizado para diluição do óleo essencial. As folhas de alface foram oferecidas em
pratos descartáveis e com garfos, sendo uma amostra sem tratamento, outra
imersa em azeite de oliva e a última em azeite de oliva com o óleo essencial. A
aceitabilidade das três amostras foi avaliada por meio de testes sensoriais
afetivos. As amostras foram servidas para 50 consumidores não-treinados,
utilizando uma apresentação monádica e uma escala hedônica de nove pontos,
variando de “gostei muitíssimo” e “desgostei muitíssimo” [9]. Os julgadores
também registraram sua intenção de compra para cada amostra na mesma folha
de pontuação, usando uma escala de atitude de cinco pontos [10].
2.7. Análise estatística
Os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e a
diferença entre as amostras foi avaliada de acordo com o teste de Tukey a 5% de
significância, no software Statistical Package for the Social Sciences - SPSS,
versão 13.0.
43
3. RESULTADOS
3.1. Triagem da atividade antimicrobiana dos óleos essenciais
A atividade antimicrobiana dos óleos essenciais estudados (alecrim,
manjericão e manjerona) foi testada contra Salmonella enterica sorovar
Schwarzengrund multirresistente, pelo método de difusão em discos (Tabela 1). O
óleo essencial de manjerona mostrou a melhor atividade antimicrobiana. Os óleos
essenciais de alecrim e manjericão evidenciaram um espectro de ação similar
sobre o microrganismo testado. Observou-se em ordem decrescente de atividade
antimicrobiana: manjerona > manjericão > alecrim.
Devido ao seu melhor efeito sobre Salmonella enterica sorovar
Schwarzengrund multirresistente, o óleo essencial de manjerona foi escolhido
para a avaliação de sua atividade sobre três diferentes vegetais orgânicos (alface
lisa, couve e rúcula) artificialmente inoculados com o micro-organismo alvo.
Pela análise cromatográfica enviada pela empresa Laszlo (fornecedora
dos óleos essenciais), o principal componente encontrado no óleo essencial de
manjerona (Origanum majorana) foi o α-terpineol (ANEXO B).
Tabela 1. Atividade antimicrobiana dos três óleos essenciais contra Salmonella enterica sorovar
Schwarzengrund multirresistente determinado pelo método de difusão em discos
ÓLEO ESSENCIAL MÉDIA DO DIÂMETRO DA ZONA DE
INIBIÇÃO ± DP (mm)*
Alecrim 10 ± 1
Manjericão 11,3 ± 0,6
Manjerona 12,1 ± 0,9
(*) n=6
3.2. Atividade antimicrobiana do óleo essencial de manjerona contra
S. Schwarzengrund em vegetais orgânicos
Salmonella spp. não foram detectadas nas amostras tomadas antes da
inoculação, demonstrando que não houve influência da microbiota original sobre
44
as contagens posteriores. As amostras analisadas após a inoculação do micro-
organismo e secagem por 30 minutos, mostraram que os níveis de bactérias
permaneceram ao redor de 4 log UFC.g-1 em todos os vegetais testados.
De um modo geral, observou-se que todos os vegetais folhosos
tratados com as três concentrações do óleo essencial, nos dois tempos testados,
apresentaram redução da carga microbiana, como pode ser observado pela
Figura 1.
Figura 1. Redução da carga microbiana de Salmonella enterica sorovar Schwarzengrund
multirresistente nas folhas de alface, couve e rúcula tratadas com as concentrações de 0,1%,
0,3% e 0,5% do óleo essencial de manjerona nos tempos de contato de um minuto (T1) e dois
minutos (T2).
3.2.1. Atividade do óleo essencial de manjerona comparado com o
controle de hipoclorito de sódio 250 ppm em amostras inoculadas com S.
Schwarzengrund
Na amostra de alface tratada com hipoclorito de sódio, houve uma
redução média de 1,4 log UFC.g-1 no T1 e de 1,74 log UFC.g-1 no T2 (p < 0,05),
quando comparado ao controle com tampão fosfato-salino (Fig. 2). Para esta
amostra, não houve diferença estatística significativa entre as médias das
contagens microbianas entre o tratamento com hipoclorito de sódio e as três
concentrações do óleo essencial de manjerona (p > 0,05).
Nas amostras de couve tratadas com hipoclorito de sódio houve uma
redução média de 1,35 log UFC.g-1 para o tempo de contato T1 e 1,79 log UFC.g-1
0,5
0,9
1,3
1,7
2,1
2,5
2,9
3,3
3,7
4,1
4,5
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Log
UFC
/g
Concentração do OE manjerona (%)
ALFACE T1
ALFACE T2
COUVE T1
COUVE T2
RUCULA T1
RUCULA T2
45
para o tempo de contato T2 (p < 0,05) em comparação ao controle com solução
tampão fosfato-salino (Fig. 3). As folhas de rúcula tratadas com hipoclorito de
sódio quando comparadas ao mesmo controle, apresentaram uma redução média
de 1,76 log UFC.g-1 para T1 e 2,33 log UFC.g-1 para T2 (p < 0,05) (Fig. 4).
Nas folhas de alface, couve e rúcula tratadas com as concentrações de
0,1% e 0,3% do óleo essencial de manjerona não se observou diferença
estatística significativa na média das contagens quando comparadas ao controle
com hipoclorito de sódio (p>0,05). Porém, as amostras de couve tratadas com a
concentração de 0,5% do óleo essencial mostraram reduções significativas nas
contagens médias. Mesmo quando comparado ao hipoclorito de sódio, a
efetividade do óleo essencial a 0,5% foi significativa, apresentando diferença
média de 1 log UFC.g-1 e 0,85 log UFC.g-1 entre estes tratamentos nos tempos de
contato 1 e 2 minutos, respectivamente (p<0.05) (Fig. 3).
Assim como ocorreu com as folhas de couve, observou-se que nas
folhas de rúcula o tratamento com óleo essencial de manjerona na concentração
de 0,5% mostrou maior atividade antimicrobiana que o hipoclorito de sódio. A
diferença média nas contagens microbianas entre estes dois tratamentos foi de
0,69 log UFC.g-1 e 0,5 log UFC.g-1 para T1 e T2, respectivamente (p<0.05) (Fig.
4).
Figura 2. Sobrevivência de Salmonella enterica sorovar Schwarzengrund em alface lisa orgânica utilizando o controle tampão fosfato-salino , controle com hipoclorito de sódio 250 ppm e soluções do óleo essencial de manjerona nas concentrações de 0,1% , 0,3 % e 0,5% nos tempos de tratamento de 1 minuto (A) e 2 minutos (B). n=3. Barra erro=DP.
0,00
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Dia 0 Dia 1 Dia 2
Log
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Dia 0 Dia 1 Dia 2
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/g
B
46
Figura 3. Sobrevivência de Salmonella enterica sorovar Schwarzengrund em couve orgânica utilizando o controle tampão fosfato-salino , controle com hipoclorito de sódio 250 ppm e soluções do óleo essencial de manjerona nas concentrações de 0,1% , 0,3% e 0,5% nos tempos de tratamento de 1 minuto (A) e 2 minutos (B). n=3. Barra erro=DP.
Figura 4. Sobrevivência de Salmonella enterica sorovar Schwarzengrund em rúcula orgânica utilizando o controle tampão fosfato-salino , controle com hipoclorito de sódio 250 ppm e soluções do óleo essencial de manjerona nas concentrações de 0,1% , 0,3% e 0,5% nos tempos de tratamento de 1 minuto (A) e 2 minutos (B). n=3. Barra erro=DP.
3.2.2. Atividade do óleo essencial de manjerona comparado com o
controle de tampão fosfato salino em amostras inoculadas com S.
Schwarzengrund
Entre as amostras de alface lisa, a única que não mostrou diferença
estatística significativa na redução da carga microbiana inoculada em relação ao
controle de tampão fosfato-salino foi na concentração de 0,1% de óleo essencial
de manjerona no T1 (Fig. 2A). As amostras de alface tratadas com as
concentrações de 0,3% e 0,5% do óleo essencial no T2 (Fig. 2B), mostraram
0,00
1,00
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Dia 0 Dia 1 Dia 2
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Dia 0 Dia 1 Dia 2
Log
UFC
/g
B
47
reduções médias de 1,3 e 1,7 log UFC.g-1, respectivamente, quando comparadas
ao controle (p < 0,05).
Nas amostras de couve, a concentração de 0,5% do óleo essencial de
manjerona mostrou a maior redução média da S. Schwarzengrund, 2,36 log
UFC.g-1 no T1 (Fig. 3A) e 2,64 log UFC.g-1 no T2 (Fig. 3B) (p < 0,05).
As diferenças mais significativas nas médias das contagens da amostra
tratada com o óleo essencial e este controle foram observadas na amostra de
rúcula tratada com a concentração de 0,5% do óleo essencial no T2 (2,84 log
UFC.g-1; p<0,05) e no T1 (2,45 log UFC.g-1; p<0.05) (Fig. 4).
3.3. Análise sensorial
Dos 50 consumidores participantes da pesquisa, 82% eram do sexo
feminino e 18% do sexo masculino, com uma faixa etária de 19 a 43 anos. Os
resultados da análise sensorial podem ser observados na Tabela 2. Entre as
amostras tratadas somente com o azeite de oliva e as tratadas com o óleo
essencial de manjerona na concentração de 0,5% não houve diferença estatística
na aceitabilidade (p>0,05). Houve diferença estatística significativa (p<0,05) entre
as amostras de alface pura e aquelas tratadas com óleo essencial de manjerona e
com azeite de oliva.
Tabela 2. Teste de aceitação sensorial de alface com óleo essencial de manjerona, avaliado por
teste sensorial afetivo com 50 consumidores não treinados utilizando apresentação monádica e
escala hedônica de nove pontos.
Amostras Média da aceitabilidade
Alface 6,12b
Alface com azeite de oliva 6,90a
Alface com óleo essencial de manjerona na concentração de 0,5% incorporado ao azeite de oliva 6,84
a
Médias com a mesma letra não diferem significativamente, pelo teste de Tukey (p<0,05).
A intenção de compra está representada pela Figura 5 com a
porcentagem de consumidores em função de conceitos de compra. A amostra de
48
alface tratada com azeite de oliva apresentou a maior intenção de compra,
representada pelos conceitos “certamente compraria” (40%) e “provavelmente
compraria” (42%). Em seguida, vem a amostra tratada com o óleo essencial, com
36% e 40% de intenção para “certamente compraria” e “provavelmente
compraria”, respectivamente. A amostra de alface pura teve a menor
porcentagem de compra com relação ao conceito “certamente compraria”, com
16%.
Figura 5. Intenção de compra para as amostras de alface tratadas com óleo essencial de manjerona na concentração de 0,5% incorporado ao azeite, comparada ao azeite de oliva e a alface pura, utilizando uma escala de atitude de cinco pontos.
4. DISCUSSÃO
Entre os óleos essenciais testados (alecrim, manjericão e manjerona)
contra a Samonella enterica sorovar Schwarzengrund multirresistente, o que
apresentou melhor atividade antimicrobiana foi o óleo essencial de manjerona.
Alboofetileh e colaboradores [11] analisando a atividade antimicrobiana dos óleos
essenciais de alho, cominho, algaravia, canela, manjerona e coentro contra
Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus e Escherichia coli, concluíram
que o óleo essencial de manjerona também foi o mais efetivo.
A composição química dos óleos essenciais é variada, complexa e
depende da variedade, parte da planta utilizada, origem, processamento e
condições de armazenamento [11,5]. Estudos afirmam que o principal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
1 2 3 4 5
Co
nsu
mid
ore
s (%
)
1=Certamente compraria; 2= Provavelmente compraria; 3= Talvez compraria/Talvez
não compraria; 4= Provavelmente não compraria; 5= Certamente não compraria.
Alface pura
Alface tratada com óleo essencial demanjerona na concentração de 0,5%
incorporado ao azeite de oliva
Alface tratada com azeite de oliva
49
componente encontrado no óleo essencial de manjerona é o terpinen-4-ol
[12,13,14,15,16,17,18].
A empresa fornecedora dos óleos essenciais utilizados nesse estudo,
realiza periodicamente análises cromatográficas dos seus óleos essenciais
comercializados, para certificação da pureza e autenticidade dos seus produtos.
Na sua última análise, o principal componente encontrado no óleo essencial de
manjerona (Origanum majorana) foi o α-terpineol e segundo Maróstica e Pastore
[20] este é um dos compostos mais utilizados na perfumaria.
O mecanismo de ação dos óleos essenciais em micro-organismos é
complexo, porém já é reconhecido que sua ação antimicrobiana depende de suas
características hidrofílicas ou lipofílicas, sendo que o mecanismo é relatado com a
ruptura aos fosfolipídios presentes na membrana celular, o que resulta em um
aumento da permeabilidade e extravasamento do citoplasma, ou também em
interações com enzimas localizadas na parede celular, sendo que o modo de
ação desses antimicrobianos depende também do tipo de micro-organismo
[20,21].
Baseado no modo de ação, em geral as bactérias Gram-positivas são
mais suscetíveis do que as Gram-negativas aos compostos lipofílicos dos óleos
essenciais, porém o óleo essencial de manjerona desempenha alta atividade
antimicrobiana em especial contra as bactérias Gram-negativas, o fato está
relacionado com a presença de grupos hidroxil nos compostos dos óleos
essenciais [22].
A contaminação e potencial desenvolvimento de micro-organismos
patógenos em hortaliças, principalmente em saladas prontas para o consumo tem
sido objeto de estudo. Recentes surtos de origem alimentar têm levado ao
reconhecimento desses produtos frescos como veículos emergentes de doenças
transmitidas por alimentos e a Salmonella é o micro-organismo mais
frequentemente relatado como causador das gastroenterites [23,24].
A desinfecção é uma das etapas mais críticas na produção de vegetais
frescos, afetando a qualidade, segurança e vida de prateleira do produto final,
visto que é responsável pela eliminação dos micro-organismos presentes. A
indústria de alimentos tem usado produtos do cloro como um dos sanificantes
mais eficazes para garantir a segurança de seus produtos. No entanto, existe uma
50
tendência em eliminar o cloro do processo de desinfecção de alimentos, já que há
uma preocupação sobre sua eficácia e sobre os riscos ambientais e de saúde
associados com a formação de subprodutos carcinogênicos, como os
trihalometanos, quando sua utilização não é feita da forma correta [25,26].
A avaliação da eficácia de diferentes tecnologias de desinfecção é
afetada por vários fatores, como propriedades físico-químicas da água de
lavagem e também do tipo de produto. Existe dificuldade também na comparação
de agentes descontaminantes pela diferença no método de inoculação, tempo de
secagem antes da lavagem e o método de detecção [27].
Nesse estudo foi realizada a análise da utilização do óleo essencial de
manjerona como método alternativo de desinfecção de vegetais folhosos, os
resultados obtidos mostraram que a concentração de 0,5% do óleo essencial de
manjerona foi mais efetiva do que o hipoclorito de sódio a 250 ppm (redução de
1,35 log UFC.g-1) nas folhas de couve no tempo de contato de 2 minutos (redução
de 2,64 log UFC.g-1). Kondo e colaboradores [28] avaliaram o tratamento de
alface inoculada com Escherichia coli, Samonella Typhimurium DT104 e
Staphylococcus aureus com hipoclorito de sódio a 200 ppm, sendo que a
contagem final ficou abaixo de 2 unidades logarítmicas. A imersão de tomates em
uma solução contendo 110 ppm de cloro por 2 minutos resultou na redução de
1,22 log no número de Salmonella Montevidéu [29]. Alface picada e tomate em
cubos foram inoculados com Salmonella Baildon em nível de 3,60 – 3,86 log
UFC.g-1 e tratadas com 120 ou 200 µg/ml de cloro, resultando em redução menor
que 1 log [30].
Nota-se claramente que a redução na contaminação microbiana, em
todas as amostras, ocorreu em função do tempo de exposição (T1 e T2) e da
concentração do OE, como pode ser observada na Figura 1.
As amostras de alface tratadas com o óleo essencial de manjerona nas
concentrações de 0,3 e 0,5% no tempo de contato de 2 minutos mostraram uma
redução média na carga microbiana inicial de 1,5 log UFC.g-1 quando comparadas
ao controle de tampão fosfato-salino. Moore-Neibel e colaboradores [31]
mostraram que amostras de alface Romana tratadas nas mesmas concentrações
e tempo de contato com o óleo essencial de capim santo tiveram a mesma média
na redução de Salmonella Newport.
51
Tanto para as folhas de couve como de rúcula, as maiores reduções na
contaminação foram observadas na concentração de 0,5% nos tempos de contato
de 1 e 2 minutos, assim como Moore-Neibel e colaboradores [32] mostraram que
essa concentração foi a mais efetiva na redução de Salmonella Newport em
amostras de alface Romana, alface Iceberg (americana) e espinafre orgânico
tratadas com óleo essencial de orégano. A análise de amostras de alface
Romana, alface Iceberg e espinafre tratadas na concentração de 0,5% do óleo
essencial de canela também mostrou maiores reduções da Salmonella Newport
[33].
Em frutas e hortaliças, a eficácia biológica dos óleos essenciais é
atribuída a propriedades intrínsecas (gordura, proteína, conteúdo de água,
antioxidantes, pH, sal) e extrínsecas (temperatura, embalagem, características
dos micro-organismos) desses produtos, sendo que o conteúdo de gordura de um
alimento pode ser um adversário direto sobre a eficácia dos óleos essenciais
quando testados contra os patógenos, já que a mesma serve de barreira para
esses micro-organismos [34,5,35].
O óleo essencial de manjerona mostrou diferenças na efetividade
antimicrobiana nas três hortaliças testadas, sendo mais efetivo nas folhas de
couve e rúcula. Isso se deve, possivelmente, às diferenças na morfologia da
superfície, rugosidade, hidrofobicidade e/ou hidrofilicidade, presença de
metabólitos secundários antimicrobianos nativos na superfície, à composição,
conteúdo de nutrientes e atividades metabólicas das hortaliças [36,37,32].
A menor eficácia do hipoclorito de sódio na eliminação de micro-
organismos em frutas e hortaliças também pode ser devido a fatores relacionados
às características dos vegetais folhosos, como: uma solução aquosa de
hipoclorito pode não molhar a superfície hidrofóbica da cutícula serosa desses
produtos, o contato com o tecido vegetal pode inativar o hipoclorito e a formação
de biofilmes pode proteger os micro-organismos contra os efeitos letais desse
composto [38].
Outro aspecto de fundamental importância para otimizar a aplicação de
óleos essenciais em alimentos é o impacto da aceitabilidade sensorial [22]. Neste
estudo, não houve diferença significativa na aceitação das amostras de alface
tratadas com azeite de oliva e aquelas contendo o óleo essencial de manjerona a
52
0,5% incorporado ao azeite de oliva, demonstrando que houve boa aceitação do
óleo essencial, além de uma intenção de compra de 36% no conceito “certamente
compraria”, seguido de 40% para “provavelmente compraria”.
Azeredo e colaboradores [38] analisaram a aceitabilidade dos óleos
essenciais de orégano e alecrim separadamente e também misturados. Quando
testados separadamente, apesar da eficácia em inibir o crescimento microbiano, a
concentração utilizada causou efeitos indesejáveis sobre os atributos sensoriais.
A maior aceitação sensorial foi dos vegetais tratados com os óleos misturados em
concentrações sub-inibitórias, ou seja, menores que as necessárias para
completa inibição dos micro-organismos.
5. CONCLUSÃO
Apesar da Salmonella utilizada no estudo ser resistente a sete
antimicrobianos, observou-se que os óleos essenciais testados foram efetivos na
redução desse micro-organismo, tanto na avaliação in vitro como nos testes
realizados nos vegetais folhosos. O óleo essencial de manjerona mostrou maior
atividade antimicrobiana contra o micro-organismo estudado. Os resultados
sugerem que esse óleo essencial, na concentração de 0,5% e tempo de contato
de dois minutos, pode desempenhar papel fundamental na substituição ou
redução da utilização de hipoclorito de sódio na desinfecção de hortaliças. Além
de que, suas características sensoriais mostraram boa aceitação por parte dos
consumidores que revelaram intenção de compra favorável para a hortaliça com
óleo essencial de manjerona.
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57
ANEXOS
Anexo A. Parecer consubstanciado do projeto “Atividade antimicrobiana do óleo essencial de
manjerona contra Salmonella Schwarzengrund multirresistente em hortaliças de cultivo orgânico”,
aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Escola de Nutrição da UFBA (CEPNUT).
58
Anexo B. Análise cromatográfica do óleo essencial de manjerona (Origanum majorana)
disponibilizada pela empresa Laszlo Aromalândia.
59
APÊNDICES
Apêndice A. Ficha para avaliação da aceitabilidade (utilizando uma apresentação monádica e
escala hedônica de nove pontos) e intenção de compra (utilizando uma escala de atitude de cinco
pontos) das amostras de alface pura, alface tratada com azeite de oliva e alface tratada com óleo
essencial de manjerona incorporado ao azeite de oliva.
60
Apêndice B. Contagens médias (três dias) de Salmonella enterica sorovar Schwarzengrund (log
UFC.g-1
) das amostras de alface lisa, couve e rúcula orgânicos tratadas com os controles de
tampão fosfato-salino e hipoclorito de sódio (250 ppm), e a solução do óleo essencial de
manjerona nas concentrações de 0,1%, 0,3% e 0,5%, nos tempos de contato de 1 e 2 minutos.
ALFACE
TRATAMENTO TEMPO DE CONTATO
(MIN) Log UFC.g
-1 ± DP
Controle com solução tampão fosfato salino 1 3,65 ± 0,29
Controle com hipoclorito de sódio (250 ppm) 1 2,25 ± 0,41
Concentração de 0,1% do OE de manjerona 1 2,76 ± 0,54
Concentração de 0,3% do OE de manjerona 1 2,50 ± 0,19
Concentração de 0,5% do OE de manjerona 1 2,17 ± 0,30
Controle com solução tampão fosfato salino 2 3,65 ± 0,29
Controle com hipoclorito de sódio (250 ppm) 2 1,91 ± 0,47
Concentração de 0,1% do OE de manjerona 2 2,62 ± 0,63
Concentração de 0,3% do OE de manjerona 2 2,35 ± 0,29
Concentração de 0,5% do OE de manjerona 2 1,95 ± 0,50
COUVE
TRATAMENTO TEMPO DE CONTATO
(MIN) Log UFC.g
-1 ± DP
Controle com solução tampão fosfato salino 1 3,80 ± 0,15
Controle com hipoclorito de sódio (250 ppm) 1 2,45 ± 0,33
Concentração de 0,1% do OE de manjerona 1 2,55 ± 0,13
Concentração de 0,3% do OE de manjerona 1 2,30 ± 0,07
Concentração de 0,5% do OE de manjerona 1 1,44 ± 0,16
Controle com solução tampão fosfato salino 2 3,80 ± 0,15
Controle com hipoclorito de sódio (250 ppm) 2 2,01 ± 0,49
Concentração de 0,1% do OE de manjerona 2 2,47 ± 0,17
Concentração de 0,3% do OE de manjerona 2 2,18 ± 0,10
Concentração de 0,5% do OE de manjerona 2 1,16 ± 0,15
RUCULA
TRATAMENTO TEMPO DE CONTATO
(MIN) Log UFC.g
-1 ± DP
Controle com solução tampão fosfato salino 1 3,85 ± 0,07
Controle com hipoclorito de sódio (250 ppm) 1 2,08 ± 0,23
Concentração de 0,1% do OE de manjerona 1 2,67 ± 0,12
Concentração de 0,3% do OE de manjerona 1 2,38 ± 0,25
Concentração de 0,5% do OE de manjerona 1 1,40 ± 0,26
Controle com solução tampão fosfato salino 2 3,85 ± 0,07
Controle com hipoclorito de sódio (250 ppm) 2 1,51 ± 0,49
Concentração de 0,1% do OE de manjerona 2 2,50 ± 0,11
Concentração de 0,3% do OE de manjerona 2 2,10 ± 0,22
Concentração de 0,5% do OE de manjerona 2 1,00 ± 0,31
