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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS- GRADUAÇÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E
BIOLOGIA MOLECULAR
ANÁLISES CITOGENÉTICAS EM ACESSOS DE Cucumis melo
L. E HÍBRIDOS TRIPLOS DE Passiflora L.
RITA DE CÁSSIA VITAL SANTOS SANCHÊS
ILHÉUS – BAHIA - BRASIL
Abril de 2018
RITA DE CÁSSIA VITAL SANTOS SANCHÊS
ANÁLISES CITOGENÉTICAS EM ACESSOS DE Cucumis melo L. E HÍBRIDOS
TRIPLOS DE Passiflora L.
ILHÉUS – BAHIA - BRASIL
Abril de 2018
Tese apresentada à Universidade Estadual de
Santa Cruz, como parte das exigências para a
obtenção do título de Doutora em Genética e
Biologia Molecular
Área de concentração: Genética e Biologia
Molecular.
S211 Sanchês, Rita de Cássia Vital Santos Análises citogenéticas em acessos de Cucumis melo L. e híbridos triplos de Passiflora L. / Rita de Cássia Vital Santos Sanchês. – Ilhéus, BA: UESC, 2018. xii, 107f. : il. Orientadora: Margarete Magalhães de Souza Tese (Doutorado) – Universidade Estadual de Santa Cruz. Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular. Inclui referências.
1. Citogenética. 2. Citogenética molecular. 3.
Melão 4. Hibridação vegetal 5. Marcadores gené- ticos 6. Hibridização in situ por fluorescência (FISH). I. Título.
CDD 572.8
RITA DE CÁSSIA VITAL SANTOS SANCHÊS
ANÁLISES CITOGENÉTICAS EM ACESSOS DE Cucumis melo L. E HÍBRIDOS
TRIPLOS DE Passiflora L.
APROVADA: Ilhéus, BA, 30 de Abril de 2018.
Profa. Dr
a. Sônia Cristina Oliveira Melo Prof
a. Dr
a. Francisca Feitosa Jucá Santos
(UESC-BA) (Convênio Mondelez/UESC-BA)
Dra. Alayne M. T. D. Yamada Prof
a. Dr
a. Patrícia Nayara C. S. Rocha
(Instituto do Câncer-SP) (Prefeitura Municipal de Itabuna-BA)
Profa. Dr
a. Margarete Magalhães de Souza
(UESC- Orientadora)
Tese apresentada à Universidade Estadual
de Santa Cruz como parte das exigências
para a obtenção do título de doutora em
Genética e Biologia Molecular.
Área de concentração: Genética e Biologia
Molecular.
ii
DEDICATÓRIA
Ao homem da minha vida Charles pelo apoio incondicional em todos os
momentos, principalmente nos de incerteza. Sem você nenhuma conquista valeria a pena.
Ao meu filho Pedro Leonel, pelo tempo
que lhe era devido e, que o presente trabalho
absorveu.
A Osvaldo e Mary, meus pais, e irmãos pelo apoio na
minha formação pessoal e profissional, sempre que
eram chamados.
iii
AGRADECIMENTOS
Esta tese não é resultado apenas de um esforço individual. Ela nasceu de significativas
contribuições que recolhi durante minha trajetória profissional, acadêmica e como cidadã, ao
lidar com pessoas (infelizmente algumas não estão mais entre nós) e, instituições que foram
fundamentais a essa construção.
Ao meu Amado Jesus, que me amou, salvou, libertou, me chamou e capacitou para
realizar esta obra. Toda visão, todo dom e todo talento pertencem a Ti! Porque dEle e por Ele
e para Ele são TODAS as coisas.
A minha família, pelo esforço, ajuda, atenção e tudo mais. Meu muito obrigada!
Ao meu esposo Charles Leonel, pela renúncia, amor, estímulo e ajuda. Produzir
uma tese ao lado de um companheiro deste quilate, é um presente! Essa vitória é nossa! Te
amo!
Ao meu filho Pedro Leonel, pelo amor, cumplicidade, compreensão e pela própria
existência que há oito anos me dá força e sentido. Agora a tese chegou ao fim! Prometo ser
mais sua. Vamos andar de bike juntos. Vamos nadar juntos. Vamos vê tv juntos. Que tal?
À Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC), à Fundação de Amparo à Pesquisa
do Estado da Bahia (FAPESB), à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior (CAPES) e, ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(CNPq), pelo apoio financeiro para realização deste trabalho.
À Dra. Margarete Magalhães de Souza, pela orientação, pela transmissão de
conhecimentos, experiências e paciência dispensada durante a realização deste trabalho.
Ao Dr. Cláusio Antônio Ferreira de Melo, pela coorientação, pelas valiosas
contribuições, disponibilidade, acolhimento e incentivos recebidos. Não sei o queria sem
você!
Ao Dr. Ronan pela parceria e colaboração.
Ao Dr. Glauber Henrique de Sousa Nunes, pela colaboração cedendo às sementes
dos acessos de melão estudados na realização deste trabalho.
À Dra. Mônica Rosa Bertão, a qual não posso deixar de agradecer também pelo
incentivo, que mesmo a partir de outra instituição, marcou importante presença em vida
acadêmica e pessoal.
À colega e amiga Analu Cruz Souza que me ajudou com seu “jeitinho” de ser, com
os cruzamentos dos híbridos triplos, pelas horas que ouviu muuuuito de mim! Tudo para seu
bem...podes crê! Nunca irei te esquecer Flor...sucesso na sua caminhada.
À colega e amiga Viviane Souza de Oliveira que cedeu gentilmente seus híbridos -
HD25 para formação dos meus híbridos triplos complementando os trabalhos, além do apoio
prático todas as vezes que precisei e, ainda, pela amizade que se fortaleceu nos últimos meses
desse trabalho. Valeu e sucesso pra nós !!!!
iv
Aos professores do Curso da Pós Graduação em Genética e Biologia Molecular,
pela colaboração na minha formação profissional.
Às secretárias do PPGGBM...uma palavra as resume: EFICIÊNCIA!
Aos abençoados Roberto e Paulo pelo apoio na casa de vegetação.
Aos colegas do Laboratório de Melhoramento de Plantas – LAMEP (Aline, Analu,
Artur, Gonçalo, Jonathan, Manuela, Matusalem, Ohana, Pedro, Rita Moreira, Vanessa,
Viviane) pelos conselhos, pelas brigas, pelos choros, pelas risadas, pelas coletas de dados
(prática e teórica), pelas trocas de informações, pelo excelente convívio e amizades e, ainda,
principalmente, pelo crescimento científico. Deus abençoe cada um vocês grandemente!
Especialmente a Aline, Pedro, Ritão e Gonçalo (os últimos lamepianos) que,
gentilmente, estavam a postos no LAMEP ou não, mas a toda hora que precisava, estando eu
longe...bem longe. Muito obrigada pelos socorros!!!
Ao Pós-doc Gonçalo Santos da Silva e à Profa. Dra. Vanessa de Carvalho Caires
Pamponét meus respeitosos agradecimentos pela contribuição na banca de pré-defesa. Foram
contribuições valiosíssimas!!
Às Dras. Sônia Melo, Francisca Jucá, Alayne Yamada e Patrícia Rocha, pelos
aceites, participações na banca de defesa e contribuições que certamente serão aceitas.
Obrigada!!
A “todos os meus amigos e irmãos”, pois o homem de muitos amigos deve mostrar-
se amigável, mas há um amigo mais chegado do que um irmão. Provérbios 18:24. Obrigada
por TUDO!
A todos cujos nomes não estão aqui, mas que direta ou indiretamente me ajudaram,
torceram, oraram e estiveram comigo neste trabalho.
Meu muitíssimo obrigada!!
v
NÃO É TARDE
Não é tarde para se sonhar
O céu ainda é azul, há esperança
Só olhar no olhar de uma criança
No sorriso de uma mãe que deu à luz
Ouvirei os testemunhos de bravos homens que venceram
Ouvirei dos cegos que ainda esperam a visão
Ouvirei canções que marcam toda uma geração
Não é tarde para sonhar
Não é não
Minha força vem de um Deus que faz milagres
Minha fé está além do impossível
Minha esperança viva está
Meu coração não quer parar
Pois nunca é tarde pra sonhar
Sempre há uma esperança
Para aqueles que esperam
Firmes nas promessas do Senhor
O Deus do impossível
Haja o que houver
Eu sonharei
Seus lindos sonhos viverei
Não desistirei
Não é não
Minha força vem de um Deus que faz milagres
Minha fé está além do impossível
Minha esperança viva está
Meu coração não quer parar
Pois nunca é tarde pra sonhar
Não é tarde – Fernanda Brum
vi
EXTRATO
SANTOS-SANCHÊS, Rita de Cássia Vital. Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus,
Março de 2018. Análises citogenéticas em acessos de Cucumis melo L. e híbridos triplos
de Passiflora L. Orientadora: Margarete Magalhães de Souza. Co-orientador: Cláusio
Antônio Ferreira de Melo.
Os gêneros Cucumis e Passiflora são dois grupos com grande diversidade e importância
econômica no Brasil. O primeiro foi introduzido no país durante a colonização e, hoje é
representado por um conjunto de variedades e cultivares, já o segundo tem o Brasil como um
importante centro de diversidade de germoplasma. Apesar da importância econômica mundial
da espécie Cucumis melo (meloeiro) a mesma tem sido pouco analisada em relação à
variabilidade cariotípica intra-específica em acessos e variedades brasileiras, indicando a
necessidade de ampliar as ações em análise citogenética desta espécie. Os híbridos de
passifloras possuem diversas aplicações, contudo em sua maioria são obtidos e caracterizados
híbridos F1, carecendo de informações genéticas acerca de híbridos com mais de dois genomas
em sua constituição, caracterização cariotípica de germoplasma de dois gêneros distintos,
Cucumis e Passiflora, ambas utilizadas comercialmente, através de métodos citogenéticos
clássicos e moleculares. A presente tese tem como objetivo geral a análise da variabilidade
cariotípica intraespecífica em acessos da espécie C. melo (meloeiro) e a obtenção e
caracterização cariotípica entre híbridos triplos do gênero Passiflora, envolvendo o genoma das
espécies P. thollozanii, P. mucronata e P. cincinnata. Como objetivos específicos: (i) revisar
estudos existentes sobre a citogenética clássica e molecular de Cucumis melo L.; (ii) realizar a
investigação da diversidade cariotípica intraespecífica do meloeiro (C. melo), ampliando os
conhecimentos acerca deste importante táxon; (iii) realizar a obtenção de híbridos triplos de
Passiflora e (iv) caracterizar citogeneticamente os híbridos triplos de Passiflora, com o intuito
de verificar o comportamento cromossômico deste germoplasma. No capítulo 1: a revisão dos
principais trabalhos e abordagens sobre os estudos citogenéticos convencionais e moleculares
realizadas em C. melo foram feitas compilando nos artigos através das palavras chaves
“cytogenetic” + “Cucumis” em portais de busca, revistas e livros com abertura para trabalhos
de citogenética. Foram encontrados poucos trabalhos relacionados apenas ao C. melo, e mais
trabalhos relacionados a C. melo comparados a outras espécies do gênero, por exemplo, C.
sativus L., C. angurus L. e C. metuliferus E. Mey. ex Naudim. A análise cariotípica do melão
foi determinada com base nos artigos relacionados a estudos cariológicos em Cucumis; técnicas
vii
de preparação de lâminas e coloração de cromossomos mitóticos de determinação cariotípica de
C. melo; estudo do número cromossômico; análise cariotípica do melão através da FISH e
fosmídeos; mapeamento citogenético molecular das espécies C. sativus e C. melo usando
sequências de DNA repetitivo; estudo cromossômico de algumas espécies de Cucumis; estudos
citológicos em Cucumis e Citrullus. Há proporcionalmente menos artigos falando apenas do C.
melo do que relacionados com outras espécies de Cucumis. No capítulo 2: a caracterização
cariotípica de acessos de meloeiro distribuídos por regiões brasileiras foi feita através da
aplicação de algumas técnicas citogenéticas. Para o preparo de lâminas, ápices de raízes das
espécies foram coletados e pré-tratados com 8-Hidroxiquinolina (8-HQ) e as lâminas foram
preparadas pela técnica de esmagamento e mantidas a -20 ºC até a aplicação dos fluorocromos
CMA3 e DAPI, Giemsa 3%, FISH. Os resultados indicam que o meloeiro possui estabilidade
cariotípica em termos quantitativos, contudo o tamanho cromossômico, a assimetria e o
comprimento do complemento cromossômico são variáveis entre as cultivares. Apesar da
estabilidade também em número de sítios de DNAr 45S e 5S, variações na posição destes sítios
foram observadas. Apesar do uso de técnicas citogenéticas clássicas e moleculares serem
informativas sobre a estabilidade e variação cariotípica em C. melo, a inclusão de outros
marcadores cromossômicos são necessários para melhor visualização da cromatina na espécie.
No capítulo 3: Foram cruzados três genótipos híbridos HD25 (Passiflora coccinea x P.
hatschbachii) com três espécies distintas: P. cincinnata, P. tholozani e P. mucronata, obtendo-
se três híbridos triplos (HD28, HD29 e HD30). Os híbridos foram confirmados por hibridação
genômica in situ (GISH), permintindo também a observação de um cromossomo com
recombinação entre P. coccinea e P. hatschbachii. A descrição morfológica dos híbridos indica
o uso do germoplasma, exceto o híbrido HD28, que não apresentou flor durante a condução do
experimento. A localização da heterocromatina rica em GC e de outros marcadores
cromossômicos sugere estabilidade cromossômica em estrutura e em número de cromossomos
homeólogos. A observação e a localização dos elementos repetitivos dispersos CL15 e CL86
não permitiu a análise da herança destas regiões cromossômicas. Por outro lado, esses
elementos e suas variações na distribuição em relação à espécie P. edulis sugere retração ou
expansão genômica.
Palavras-chave: Citogenômica, Citogenética Clássica, Citogenética Molecular, FISH, GISH,
Híbridos Artificiais.
viii
ABSTRACT
SANTOS-SANCHÊS, Rita de Cássia Vital. Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus,
Março de 2018. Cytogenetic analyzes in accessions of Cucumis melo L. and triple
Passiflora L. hybrids. Advisor: Margarete Magalhães de Souza. Co-Advisor: Cláusio
Antônio Ferreira de Melo.
The genera Cucumis and Passiflora are two groups with great reach and economic relevance in
Brazil. The first was introduced in the country during the colonization and today is represented
by a set of varieties and cultivars, while the second has as main center of genetics resource
diversity. The Cucumis melo (melon) has been few analyzed in the karyotypic variability, in
contrast with the large cultivar diversity. The hybrids of passifloras have several applications.
However, F1 hybrids are mostly obtained and characterized, lacking genetic information about
hybrids with more than two genomes in their constitution, karyotype characterization of
germplasm of two different genera, Cucumis and Passiflora, both used commercially via
classical and molecular cytogenetic methods. The present thesis aims at the analysis of
intraspecific karyotype variability in accessions of the C. melo (melon) species and the
obtaining and karyotype characterization among triple Passiflora hybrids, involving the
genome of the species P. thollozanii, P. mucronata and P cincinnata. As specific objectives: (i)
to review existing studies on the classical and molecular cytogenetics of Cucumis melo L .; (ii)
to carry out the investigation of the intraspecific karyotype diversity of melon (C. melo),
increasing the knowledge about this important taxon; (iii) to obtain triple Passiflora hybrids
and (iv) to characterize cytogenetically the triple Passiflora hybrids, in order to verify the
chromosomal behavior of this germplasm. In chapter 1: the review of the main works and
approaches on the conventional and molecular cytogenetic studies carried out in C. melo were
done by compiling in the articles through the key words "cytogenetic" + "Cucumis" in search
portals, magazines and books with opening for cytogenetic work. There were few studies
related to C. melo, and more work related to C. melo compared to other species of the genus,
for example C. sativus L., C. angurus L. and C. metuliferus E. Mey. ex Naudim. The karyotype
analysis of the melon was determined based on the articles related to cariological studies in
Cucumis; techniques for preparation of slides and staining of mitotic chromosomes of
karyotypic determination of C. melo; chromosome number study; karyotype analysis of melon
through FISH and phosmids; cytogenetic mapping of C. sativus and C. melo species using
repetitive DNA sequences; chromosome study of some species of Cucumis; cytological studies
ix
in Cucumis and Citrus. There are proportionately fewer articles speaking only of C. melo than
related to other species of Cucumis. In chapter 2: the karyotype characterization of melon
accessions distributed in Brazilian regions was made through the application of some
cytogenetic techniques. To prepare slides, root apices of the species were collected and
pretreated with 8-Hydroxyquinoline (8-HQ) and the slides were prepared by the crushing
technique and maintained at -20 ° C until the application of the fluorochromes CMA3 and
DAPI, Giemsa 3%, FISH. The results indicate that the melon has karyotype stability in
quantitative terms, however the chromosome size, the asymmetry and the length of the
chromosomal complement are variable among the cultivars. Despite the stability also in
number of 45S and 5S rDNA sites, variations in the position of these sites were observed.
Although the use of classical and molecular cytogenetic techniques are informative about the
stability and karyotype variation in C. melo, the inclusion of other chromosomal markers is
necessary for a better visualization of the chromatin in the species. In Chapter 3, three hybrid
genotypes HD25 (Passiflora coccinea x P. hatschbachii) were crossed with three distinct
species: P. cincinnata, P. tholozani and P. mucronata, yielding three triple hybrids (HD28,
HD29 and HD30). Hybrids were confirmed by genomic in situ hybridization (GISH), and also
the observation of a chromosome with recombination between P. coccinea and P. hatschbachii.
The morphological description of the hybrids indicates the use of the germplasm, except the
hybrid HD28, which did not show flower during the conduction of the experiment. The
localization of heterochromatin rich in GC and other chromosomal markers suggests
chromosomal stability in structure and number of homeopathic chromosomes. The observation
and location of the dispersed repetitive elements CL15 and CL86 did not allow the analysis of
the inheritance of these chromosomal regions. On the other hand, these elements and their
variations in the distribution in relation to the species P. edulis suggests retraction or genomic
expansion.
Palavras-chave: Cytogenomics, Classical Cytogenetics, Molecular Cytogenetics, FISH, GISH,
Artificial Hybrids.
x
ÍNDICE
EXTRATO ............................................................................................................................. vi
ABSTRACT .......................................................................................................................... viii
INTRODUÇÃO...................................................................................................................... 01
REVISÃO DE LITERATURA............................................................................................... 03
1. Família Cucurbitaceae e o gênero Cucumis…………………………………………......... 03
2. Aspectos econômicos de Cucumis melo L........................................................................... 04
3. Citogenética de Cucumis melo L........................................................................................ 06
4. Família Passifloraceae Juss e gênero Passiflora L.............................................................. 08
5. Importância econômica do gênero Passiflora L.................................................................. 09
6. Citogenética do gênero Passiflora L...............……...............…………………….……..... 10
7. Obtenção de híbridos de Passiflora L...................................................................................13
CAPÍTULO 1: Análises Cariotípicas Em Meloeiro (Cucumis melo L.).................................. 17
Resumo.................................................................….......................……………………...….. 17
Abstract.................................................................................................................................... 18
1. Introdução............................................................................................................................ 19
1.1. Análise citogenética convencional e bandamento cromossômico em Cucumis melo...20
1.2. Análise citogenética molecular em Cucumis melo L................................................... 22
2.Metodologia..........................................................................................................................26
2.1. Caracterização Geral e Organização da Revisão Bibliográfica....................................26
2.2. Seleção de Artigos: Critérios de Inclusão e Exclusão Adotados.................................26
3. Considerações Finais.............................................................................................................28
4. Agradecimentos................................................................................................................... 28
5. Referências Bibliográficas................................................................................................... 29
CAPÍTULO 2: Caracterização Cariotípica de Acessos De Meloeiro (Cucumis melo L.).33
Resumo..................................................................................................................................... 33
Abstract.................................................................................................................................... 34
1. Introdução ........................................................................................................................... 35
2. Material e Métodos ............................................................................................................. 36
2.1. Material vegetal ........................................................................................................... 36
2.2. Preparação cromossômica............................................................................................ 37
2.3. Análise cariomorfológica............................................................................................. 37
xi
2.3.1. Morfometria cromossômica............................................................................... 37
2.3.2. Análise estatística............................................................................................... 37
2.4. Bandamento CMA3/DAPI ........................................................................................... 38
2.5. Preparo de sondas para Hibridação in situ Fluorescente (FISH).................................. 38
2.6. Tratamento de lâminas para FISH................................................................................ 39
2.7. Aplicação da FISH....................................................................................................... 39
2.8. Fotodocumentação........................................................................................................ 40
3. Resultados............................................................................................................................ 40
4. Discussão............................................................................................................................. 48
5. Conclusões........................................................................................................................... 51
6. Agradecimentos................................................................................................................... 51
7. Referências Bibliográficas................................................................................................... 53
CAPÍTULO 3: Organização e Evolução Cariotípica Em Híbridos Triplos Interespecíficos de
Passiflora L.............................................................................................................................. 58
Resumo .................................................................................................................................... 58
Abstract.................................................................................................................................... 59
1.Introdução............................................................................................................................. 60
2. Material e Métodos ............................................................................................................. 62
2.1. Material vegetal e hibridações interespecíficas............................................................ 62
2.2. Germinação das sementes e condições de cultivo........................................................ 64
2.3. Descrição morfológica dos híbridos............................................................................. 64
2.4. Preparação cromossômica............................................................................................ 65
2.5. Coloração com fluorocromos CMA3/DAPI................................................................. 65
2.6. Extração do DNA e produção de sondas para GISH e FISH....................................... 66
2.7. Aplicação de FISH e GISH.......................................................................................... 69
3. Resultados............................................................................................................................ 70
3.1. Obtenção e descrição dos híbridos triplos.................................................................... 70
3.2. Identificação genômica e confirmação do genoma em híbridos.................................. 73
3.3. Localização da região heterocromática rica em GC.................................................... 74
3.4. Localização de sequências genômicas repetidas.......................................................... 76
4. Discussão............................................................................................................................. 81
5. Conclusões........................................................................................................................... 85
6. Agradecimentos................................................................................................................... 85
7. Referências Bibliográficas................................................................................................... 86
xii
8. Considerações Finais........................................................................................................... 92
9. Referências Bibliográficas Complementares....................................................................... 93
1
INTRODUÇÃO
O gênero Cucumis L. está incluso na subtribo Cucumerinae, tribo Melothrieae,
subfamília Cucurbitoideae, sendo um dos maiores gêneros da família Curcubitaceae, com 34
espécies (ALMEIDA, 2006), como os meloeiros (Cucumis melo L.), os pepinos (C. sativus
L.), as melancias (Citrullus lanatus Thunb.) e as abóboras (Curcubita maxima L.). O meloeiro
(Cucumis melo L.) é uma espécie representativa do gênero, pois se destaca pela sua
importância econômica no Brasil e, em diversos países do mundo como, Espanha e Índia
(LOPES et al., 1999). Em 2012, o melão foi a oitava fruta mais produzida no mundo em
toneladas (FAO, 2016), sendo uma das três principais frutas exportadas para Europa,
alcançando mais de 1,8 milhões de toneladas por ano (SOUZA et al., 2012).
A família Passifloraceae pertence à ordem Malphigiales, e compreende 18 gêneros e
mais de 700 espécies (BERNACCI et al., 2013), distribuídas nas regiões tropicais e
subtropicais do mundo. O gênero Passiflora é o mais importante da família, por possuir
espécies que tem valor econômico e, por apresentar maior diversidade de espécies, chegando
a 525 espécies atualmente relatadas (BERNACCI et al., 2013). Dentre as principais espécies,
com características comerciais, destaca-se a Passiflora edulis Sims (maracujazeiro azedo), o
qual ocupa 95% da área plantada no Brasil, destinada ao mercado de frutas in natura e à
indústria de sucos (MELETTI, 2011). Por outro lado, o recurso genético silvestre tem sido
amplamente utilizado para ornamentação de áreas ao ar livre e de interiores, para produção de
híbridos interespecíficos únicos, ainda pouco explorados comercialmente (ABREU et al,
2009) e também, para introgressão de características de interesse ao melhoramento de plantas
(VANDERPLANK, 2000; ABREU et al., 2009). Na Bahia, o gênero Passiflora é
representado por 31 espécies com uma ampla distribuição geográfica (NUNES; QUEIROZ,
2006), sendo considerado recurso genético a ser explorado para ornamentação.
Atualmente, a análise citogenética, associada às informações genômicas e ferramentas
de bioinformática, tem contribuído para ampliar o poder de visualização da cromatina.
Diversos estudos foram realizados, no sentido do conhecimento da diversidade cariotípica e
genética de espécies silvestres e cultivadas de C. melo, revelando as principais características
citológicas dessa espécie (TRIVEDI; ROY, 1970; SINGH; ROY, 1974; DANE; TSUCHIYA,
1976; RAMACHANDRAN; SASHADRI, 1986), incluindo as características quantitativas
dos loci de DNAr (HAN et al., 2009; LIU et al., 2010), a composição do DNA centromérico
e, a rota citoevolutiva por reposicionamento do centrômero (HAN et al., 2009). Contudo, as
2
relações intraespecíficas sobre a variabilidade e distribuição dos marcadores cromossômicos
são pouco conhecidas em C. melo.
No gênero Passiflora, a caracterização cariotípica molecular, pelo uso das técnicas de
hibridação in situ florescente (FISH) e hibridação in situ genômica (GISH), tem fornecido
informações importantes sobre a evolução e estabelecimento de híbridos interespecíficos,
principalmente entre espécies do subgênero Passiflora. Modificações cariotípicas como
aneuploidias, variações em sítios de DNAr, translocações e, poliploidização, têm sido
relacionadas a processos de hibridação e retrocruzamentos (SILVA et al., 2014; MELO et al.,
2017). Essas alterações são impactantes na biologia vegetal, principalmente em aspectos
reprodutivos disfuncionais, influenciando consideravelmente o estabelecimento e a indicação
de uso do recurso genético (SILVA et al., 2014; MELO et al., 2017).
Em Passiflora, o cruzamento interespecífico para a obtenção de híbridos
interespecíficos tem sido considerado uma ferramenta para obtenção de germoplasma voltado
a ornamentação (SANTOS et al., 2012; MELO et al., 2016). Esse fato ocorre por ampliar a
oferta e variabilidade em flores, bem como, ampliar o tempo de abertura da flor (SANTOS et
al., 2012; MELO et al., 2016). De modo geral, a obtenção de híbridos interespecíficos F1 tem
envolvido duas espécies, sendo mais raros os híbridos triplos ou, com mais espécies genitoras
(ULMER; MACDOUGAL, 2004) ou ainda, envolvendo retrocruzamentos (MELO et al.,
2016).
A presente pesquisa científica objetivou a caracterização cariotípica de germoplasma
de dois gêneros distintos, Cucumis e Passiflora, ambas utilizadas comercialmente, através de
métodos citogenéticos clássicos e moleculares. Para isso, foi realizada a análise da
variabilidade cariotípica intraespecífica em acessos da espécie C. melo (meloeiro). A obtenção
e caracterização cariotípica também foi realizada em híbridos triplos do gênero Passiflora,
envolvendo o genoma das espécies P. thollozanii, P. mucronata e P. cincinnata.
3
REVISÃO DE LITERATURA
1. Família Cucurbitaceae e o gênero Cucumis
Pertencente à ordem Cucurbitales, a família Cucurbitaceae é composta por 975
espécies, as quais estão distribuídas em 118 gêneros, fazendo com que essa família seja
considerada uma das mais numerosas e heterogêneas existentes adicionalmente.
Cucurbitaceae está dividida em duas grandes subfamílias: Zanonioideae e Cucurbitoideae
(JUDD et al., 2009; SCHAEFER; RENNER, 2011). O gênero Cucumis pertence à subfamília
Cucurbitoideae e à tribo Benincaseae (JEFFREY, 2005). É um dos gêneros mais importantes
dessa família em termos econômicos, em que se destacam Cucumis melo L. (meloeiro),
Cucumis sativus L. (pepino), Citrullus lanatus (Thumb.) Matsun & Nakai (melancia) e,
Cucumis anguria L (maxixe) (LOPES et al., 1999). O melão está entre os mais cultivados do
mundo (PITRAT et al., 1999). As espécies da família Cucurbitaceae são predominantemente
cultivadas pelo valor agronômico, com aproximadamente 26 espécies de Cucurbitáceas
cultivadas como hortícolas, em diversas regiões do mundo, utilizadas na alimentação e
também, como planta ornamental (PITRAT et al., 1999).
Os centros de origem, diversificação e diversidade de Cucurbitaceae tem sido
largamente discutido na literatura (ROBINSON; DECKER-WALTERS, 1999; NEE, 2007;
SCHAEFER; RENNER, 2011; GOMES-KLEIN et al., 2013). Os gêneros Cucurbita, Sechium
e Cyclanthera são originários do continente Americano. Contudo, os outros gêneros são
originários da África, como por exemplo, o Cucumis, com centro de diversidade na Ásia
tropical (ROBINSON; DECKER-WALTER, 1997; BRANDÃO FILHO; VASCONCELOS,
1998; ROBINSON; DECKER-WALTERS, 1999). A África e a Índia peninsular podem ter
sido o centro de diversidade, do Cucumis melo (meloeiro), mas o mesmo se diversificou na
Índia, Arábia e Irã (MALLICK; MASSUI, 1986). A região tropical da América é o centro de
distribuição de 53 gêneros, que são nativos desta região, com aproximadamente 325 espécies
descritas (NEE, 2007; SCHAEFER; RENNER, 2011). No Brasil, encontram-se distribuídos
29 gêneros, no qual estão inseridas 155 espécies (GOMES-KLEIN et al., 2013), e somente na
região Nordeste é possível encontrar 22 gêneros e 52 espécies (GOMES-KLEIN, 2006).
De maneira geral, os membros da família Cucurbitaceae são ervas anuais ou perenes,
nativas de áreas temperadas e tropicais, incluem pepinos, cabaças, melões e abóboras. A
maioria das espécies é extremamente sensível a temperaturas baixas, um fator que limita sua
4
distribuição geográfica e área de cultivo tropical. São predominantemente herbáceas
escandentes ou prostradas, monoicas ou dioicas, apresentam folhas simples, palmatilobadas
ou compostas; com inflorescências, geralmente, racemosas ou, de flor única, a maioria das
espécies tem flores unissexuais nas axilas das folhas e têm cinco pétalas brancas ou amarelas.
Há cinco sépalas em cada flor; flores masculinas têm até cinco anteras, muitas vezes fundidas
ou unidas de forma complexa e flores femininas, geralmente com três carpelos
(WUNDERLIN, 1978; JEFFREY; TRUJILLO, 1992; NEE, 2007). O fruto é geralmente um
pepônio, podendo ser capsular (Luffa), bacoide ou apresentar cápsula carnosa, e as sementes
apresentam forma achatada. Alguns frutos são utilizados na indústria farmacêutica como
fitoquímicos medicinais pela presença de compostos bioativos, outros são usados secos no
comércio, como utensílios, componentes para instrumentos musicais, esponjas, etc.
(PECKOLT, 1941; BEZERRA et al., 2002; PEREIRA et al., 2010).
2. Aspectos econômicos de Cucumis melo L.
O meloeiro (Cucumis melo) é uma espécie anual, herbácea, andromonoica, de
crescimento rasteiro, com ramificações sarmentosas, apresentando folhas membranáceas,
variavelmente lobadas, de 10-18 cm de comprimento. O meloeiro apresenta flores amarelas,
constituídas com 5 pétalas, podendo se apresentar de forma perfeita e imperfeita, ou ainda,
serem hermafroditas em pontos diferentes da planta (KIRKBRIDE JUNIOR, 1993;
LORENZI et al., 2006).
Possui frutos do tipo baga, de formato oblongo até elipsóide, com casca lisa ou
levemente enrrugada longitudinalmente, sem odor, de cor variável, de polpa espessa, com
textura fina e doce. Possui maturidade tardia e maior conservação pós-colheita (LORENZI et
al., 2006). Cada fruto produz de 200 a 600 sementes, dispostas simetricamente na parte
interna da polpa, tendo em média de 20 a 30 sementes por grama (MCCREIGHT et al., 1993).
A cultura do melão é bastante antiga, onde há evidências de que seu cultivo na Europa
e no Oriente Médio tenha ocorrido por volta de 2000 a 1500 antes Cristo, e sua exploração
resultou na formação de vários centros, de origem secundários, como a Índia, Irã, Turquia,
China e, as Repúblicas Asiáticas (KARCHI, 2000). Atualmente, as cultivares de melão estão
distribuídas no mundo em relação a sua demanda produtiva e de consumo.
As cultivares podem ser divididas em seis grupos básicos, de acordo com a origem e
características básicas dos frutos: amarelo (valenciano), cantaloupe, honeydew, gália (caipira),
pele de sapo e charentais. Os principais tipos produzidos comercialmente no Brasil pertencem
5
a dois grupos: inodoros ou aromáticos. No grupo dos inodoros destacam-se dois tipos, que são
produzidos em escala comercial, denominados amarelo e pele de sapo. O tipo amarelo foi
introduzido da Espanha e, por isso, é conhecido como Melão Amarelo Espanhol, com seu
formato redondo ovalado e sua casca amarela com polpa entre branco a creme; é o tipo mais
cultivado, principalmente, pelo fato de apresentar boa conservação pós-colheita (SENAR,
2014). O tipo pele de sapo apresenta tamanho relativamente grande quando comparado com
os demais tipos comerciais e sua nomenclatura se deve ao fato do mesmo possuir casca verde-
clara com manchas verde-escuras, levemente enrugada e dura; sua polpa possui a cor creme
esverdeada de consistência firme e os aromáticos apresentam quatro tipos: cantaloupe, orange,
gália e charentais (SENAR, 2014).
O cantaloupe é de origem americana e é o mais produzido no mundo, apresenta a
casca rendilhada com formato esférico e polpa salmão (ARAGÃO, 2010). O charentais de
origem francesa; apresenta polpa salmão, casca lisa, verde-clara ou ligeiramente cinza e
reticulada (costelada), forma arredondada ou semi-ovalado e às vezes achatada (WHITAKER
et al, 1986). O tipo gália é de origem israelense; tem formato arredondado, casca verde e
amarela quando o fruto está maduro; a coloração da polpa varia de branco a branco
esverdeado (ARAGÃO, 2010). E o tipo Orange que apresenta frutos com formato redondo e
casca lisa de cor creme, polpa laranja-escura ou creme-esverdeada (SENAR, 2014).
O melão obteve o nono lugar no ranking de fruta mais produzida no mundo no ano de
2013, evidenciando a grande importância dessa cultura. Está entre as três principais frutas
exportadas, alcançando mais de 1,8 milhão de toneladas por ano (FAO, 2016). A cultura
atingiu área colhida de quase 1,34 milhão de hectares e produção (≈ 32 milhões de toneladas)
(FAO, 2016). China, Irã, Turquia, Egito e Índia são considerados os maiores produtores de
melão do mundo, com mais de 71% do total produzido em 2013 (FAO, 2016). Segundo dados
do IBGE (2016), a produção brasileira chegou a alcançar 589.9 mil toneladas de frutos, no
ano de 2014, oriunda de uma área cultivada de 21.99 mil hectares. O Brasil vem apresentando
um aumento crescente no volume de exportação de melão, saltando de 98,7 mil toneladas em
2002 para mais de 223,8 mil toneladas em 2015 (BRASIL, 2016). De 2012 até 2015, o melão
tem sido a fruta fresca com maior volume de exportação, exceto em 2013, quando foi também
a primeira em valor de exportação (ANUÁRIO BRASILEIRO DA FRUTICULTURA, 2015).
O fruto do meloeiro (C. melo) é apreciado no mundo todo e, embora a planta seja
botanicamente uma hortaliça, é comercializado como fruta. No Brasil, grande parte da
produção concentra-se na região Nordeste, no Vale do São Francisco (Bahia e Pernambuco) e,
principalmente, no Polo Jaguaribe-Açu (Ceará e Rio Grande do Norte), responsáveis por pelo
6
menos 97% das exportações brasileiras, na última década (CELIN et al., 2014). O meloeiro é
uma das mais importantes culturas para a região nordeste no Brasil. A expansão da área
cultivada no nordeste brasileiro tem sido responsável por 95,0% da produção nacional de
melão, destacando-se Jaguaribe – Açu (≈ 467 mil toneladas por ano), envolvendo a região de
Mossoró, localizada na divisa dos estados Ceará e Rio Grande do Norte, e o Submédio do
Vale São Francisco (≈ 64 mil toneladas por ano), localizado na divisa dos Estados da Bahia e
Pernambuco (FIGUEIRÊDO et al., 2017). A produção de melão, na região Nordeste, é
considerada competitiva pela qualidade dos frutos e, por seu ciclo ser reduzido (≈ 60 dias), se
comparada com a Espanha e França (≈ 120 dias), chegando até três safras por ano.
O Brasil exportou com a cultura do melão em 2015, um valor que superou 154
milhões de dólares (BRASIL, 2016), onde o Ceará representa mais de 60%, seguido do Rio
Grande do Norte, que representa um pouco menos de 40% restantes. Aproximadamente,
metade da produção brasileira de melão é exportada, principalmente, para países da Europa,
responsável por ≈ 97 % das exportações brasileiras, na última década e a outra metade é
utilizada para atender ao mercado doméstico (CELIN et al., 2014). No Brasil a produção de
melão vem apresentando crescimento contínuo ao longo das últimas décadas, sendo este
fenômeno resultante de incrementos sucessivos na área cultivada e na produtividade obtida
(BRASIL, 2016).
3. Citogenética de Cucumis melo L.
A caracterização cariotípica pela aplicação da coloração convencional em C. melo tem
revelado o número cromossômico constante de 2n = 2x = 24, com cromossomos pequenos
(cerca de 2 µm), com dados limitados de morfologia cromossômica obtidos pela visualização
e análise de centrômeros e constrições secundárias (TRIVEDY; ROY, 1970; SINGH; ROY,
1974; RAMACHANDRAN; SASHADRI, 1986; HOSHI et al., 2013).
A localização da heterocromatina base-específica realizada através da coloração
diferencial com fluorocromos Cromomicina A3 (CMA3) e 4´-6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)
tem sido pouco relatada em C. melo, contudo o DNA repetitivo CentM, restrito a regiões
centroméricas e pericentromérica, tem revelado a riqueza em GC (HAN et al., 2009). O
estudo entre as espécies de C. melo e C. metuliferus revelou alta similaridade cariotípica em
bandas heterocromáticas, sendo os centrômeros e satélites ricos em GC (CMA3+
/DAPI-)
(HOSHI et al., 2013). Essa cromatina rica em GC e pobre em AT têm sido utilizadas como
7
um exelente marcador cromossômico amplamente empregado na análise citogenética
comparativa vegetal (GUERRA, 2002).
Estudos citogenéticos criaram a base para a integração de mapas moleculares,
genéticos e citológicos em estudos de algumas espécies do gênero Cucumis (ROY; SINGH,
1974; HOSHI et al., 1999; KOO et al., 2002; HAN et al., 2009; KOO et al., 2010). O
mapeamento usando a hibridação fluorescente in situ (FISH), com clones de DNA ancorados
com marcadores de DNA geneticamente mapeados em cromossomos paquitênicos, é uma
abordagem muito eficiente para integrar mapas genéticos com mapas cromossômicos
(JIANG; GILL, 2006). Técnicas citogenéticas têm sido utilizadas para avaliar o
reposicionamento do centrômero de um cromossomo que pode mover-se durante a evolução
e, o seu impacto no genoma de algumas espécies pertencentes ao gênero Cucumis, pode
resultar numa grande alteração da morfologia dos cromossomos e cariótipos (HAN et al.,
2009).
O sequenciamento do genoma do meloeiro (C. melo), em 2012, promoveu um
crescimento nos estudos citogenéticos na espécie, impulsionando o mapeamento, a análise
sintênica e genômica desta cultura (GARCIA-MASA et al., 2012). No entanto, muitas
inferências citológicas e evolutivas sobre o táxon e a espécie próxima do C. sativus, já haviam
sido realizadas, quanto à composição e, distribuição da heterocromatina, principalmente, o
desenvolvimento e aplicação de marcadores cromossômicos, importantes para a análise da
cromatina em composição e distribuição (HAN et al., 2009; LIU et al., 2010).
A técnica de FISH tem sido utilizada para determinar o número e a localização
cromossômica de loci de DNAr 5S e 45S, em Cucumis diplóides (LI et al., 2016). Os
resultados fornecem evidências citogenéticas claras sobre a divergência entre, C. melo, e
espécies silvestres diploides africanas de Cucumis, tanto em número, como na posição destes
sítios de DNAr (LI et al., 2016). Esses resultados mostraram as inter-relações entre espécies
no gênero Cucumis, e também que os padrões de DNAr podem ser usados como marcadores
citológicos para a discriminação de espécies estreitamente relacionadas (LI et al., 2016).
Adicionalmente, a técnica de FISH quando combinada com informações genômicas,
através da utilização de fosmídeos ancorados por marcadores SSR específicos, tem se
mostrado como marcadores citológicos para o conhecimento da rota evolutiva e filogenética
dessas espécies (LIU et al., 2010). Estudos citogenéticos comparativos entre C. sativus e C.
melo, tem sido uma boa estratégia utilizada para inferências evolutivas entre ambos os táxons,
tendo em vista a especiação dos mesmos de um ancestral comum a aproximadamente nove
milhões de anos atrás (SCHAEFER et al., 2009).
8
4. Família Passifloraceae Juss e gênero Passiflora L.
A família Passifloraceae compreende 18 gêneros e mais de 700 espécies, distribuídas
nas regiões tropicais e subtropicais do mundo (BERNACCI et al., 2013), cuja maior
diversidade é encontrada na região neotropical, onde ocorre cerca de 500 espécies. O gênero
Passiflora é representado por espécies de ampla utilização direta, como por exemplo, P.
edulis f. edulis flavicarpa L. (maracujazeiro roxo), P. alata Curtis (maracujazeiro doce) e
Passiflora edulis f. flavicarpa O. Deg. (maracujazeiro azedo) (ULMER; MACDOUGAL,
2004). O número de espécies do gênero continua crescendo com a descoberta de novas
espécies, tais como Passiflora kikiana Cervi & Linsingen (CERVI; LINSINGEN, 2010), P.
cristalina Vanderpl. & Zappi (VANDERPLANK; ZAPPI, 2011), P. cacao Bernacci & M. M.
Souza (BERNACCI; SOUZA, 2012) e, P. pottiae Cervi & Imig (CERVI; IMIG, 2013),
ampliando o recurso genético conhecido do gênero.
O centro de origem de mais de 95% das espécies do gênero é a América do Sul. O
Brasil é considerado um dos principais centros de diversidade, com quatro gêneros relatados,
Passiflora, Ancistrothrysus Harms, Dilkea Mast. e Mitostemma Mast., em torno de 85
espécies endêmicas e mais de 137 espécies nativas (FERREIRA, 1994; BERNACCI et al.,
2013), atribuindo ao país uma posição privilegiada em termos de diversidade (FERREIRA,
1994; CERVI; SANTOS, 2000). Algumas espécies são cultivadas comercialmente por
características como sabor do fruto, propriedades nutricionais, farmacêuticas, cosméticas,
ambientais e ornamentais (CERVI, 1997; ABREU et al., 2009; PATIL et al., 2013).
O estado da Bahia é representado por 31 espécies do gênero Passiflora já descritas,
demonstrando ampla distribuição em praticamente todos os biomas do Estado, como por
exemplo, em fragmentos de floresta Atlântica no sul (NUNES; QUEIROZ, 2006). O risco de
extinção e perda do recurso genético, nos fragmentos de floresta Atlântica restantes e,
consequentemente, a redução da diversidade alélica têm sido considerados um problema
contemporâneo, que atinge vários grupos vegetais. As espécies P. campanulata Mast., P.
setulosa Killip, P. malacophylla Mast. e P. racemosa Brot., táxons endêmicos do estado do
Rio de Janeiro, têm sofrido em risco de extinção, indicando a necessidade de medidas de
proteção da diversidade (HERBÁRIO IAC).
O gênero Passiflora compreende plantas trepadeiras, herbáceas, arbustivas e lenhosas
com gavinhas axilares (CERVI, 1997). Possuem caules cilíndricos ou quadrangulares, muito
9
ramificados, angulosos, suberificados, glabros, que em algumas espécies, podem apresentar
pilosidade e atingir de 5 a 10 m de comprimento (KILLIP, 1938). As folhas são alternas,
simples e com morfologia bastante variável (ULMER; MACDOUGAL, 2004; FARINAZZO;
SALIMENA, 2007, ARAÚJO et al., 2008; JUDD et al., 2009). As flores são vistosas,
possuem características marcantes e diferem de outros gêneros da família Passefloraceae por
apresentarem cinco estames, cinco pétalas, cinco sépalas e androginóforo ereto com estames
de extremidades livres e três estigmas (CERVI, 1997). O fruto é do tipo baga e indeiscente,
com numerosas sementes e apresentam casca dura (FARINAZZO; SALIMENA, 2007).
O maracujazeiro tem polinização dependente de agentes polinizadores, principalmente
de grande porte, a exemplo das mamangavas, vespas, mariposas, borboletas e morcegos
(SAZIMA; SAZIMA, 1978; VARASSIN et al., 2001), uma vez que o maracujazeiro é uma
planta alógama com um sistema de autoincompatibilidade que favorece a polinização cruzada
(GANGA et al., 2004; BRUCKNER et al., 2005).
5. Importância econômica do gênero Passiflora L.
As espécies da família Passifloraceae, ou maracujazeiros, como são conhecidas
popularmente no Brasil, ou ainda como passion fruit nos países de língua inglesa, são
utilizadas para o consumo in natura e na indústria alimentícia. Apresentam grande
importância econômica na agricultura. As espécies de maior importância econômica no Brasil
são P. edulis e P. alata, sendo o país um dos maiores produtores e consumidores mundiais
(AGRIANUAL, 2017). A espécie P. edulis ocupa a primeira posição na produção de
maracujá no Brasil, sendo uma importante geradora de renda para o país. Em 2015 a produção
foi de 50.837 ha de área colhida e, 584.000 t (toneladas) de produção, com um rendimento de
14,5 t/ha, sendo que, a maior parte da produção de maracujá ocorre na região Nordeste (71%
da produção), principalmente no estado da Bahia (42.81% da produção) (IBGE - Produção
Agrícola Municipal, 2015) com isso, o Brasil, é considerado o maior produtor e consumidor
mundial de maracujá (FALEIRO; JUNQUEIRA, 2016).
A importância das passifloras na área dos cosméticos e farmácia também é bastante
representativa, as quais possuem flavonóides com atividade ansiolítica, hipnótica e sedativa
(SAKALEM et al., 2012). No ano de 2015, a produção anual brasileira foi estimada de
823.000 toneladas, mostrando o potencial e a importância socioeconômica do maracujazeiro
ao Brasil (IBGE, 2015). Um total de 90% do suco industrializado produzido no Brasil é
exportado para o mercado comercial Europeu (AGRIANUAL, 2017). O nordeste brasileiro é
10
a região do país de maior produção, liderada pela Bahia (410.078 t/ha), seguido pelos estados
da região sudeste: Espírito Santo, São Paulo e Rio de Janeiro (IBGE, 2015).
Em programas de melhoramento genético para a introgressão de fatores de resistência
a estresses bióticos e abióticos em cultivares comerciais, espécies são utilizadas de modo
direto ou são introduzidas (JUNQUEIRA et al., 2005; MELETTI et al., 2005; SANTOS,
2013). Contudo, a utilização como planta ornamental tem sido foco principal do germoplasma
híbrido, obtidos pela hibridação interespecífica entre espécies silvestres, para a produção de
híbridos com características únicas ou intermédiárias aos genitores (BELO, 2010; SANTOS et
al., 2012; MELO et al., 2017). Em Passiflora, a obtenção de híbridos interespecíficos por
simples hibridação sexual é comum, pois, existem fracas barreiras reprodutivas entre as
espécies do mesmo subgênero (VANDERPLANK; ZAPPI, 2011). Por outro lado, as relações
citogenéticas e filogenéticas entre as espécies genitoras têm sido consideradas dois parâmetros
importantes para o sucesso da hibridação (ABREU et al., 2009; SANTOS et al., 2012; MELO
et al., 2017). Em Passiflora, os híbridos oriundos de mais de duas espécies são raramente
relatados, mas já foram obtidos para a ornamentação (JUNQUEIRA et al., 2008). Muito
embora as relações genômicas e o estabelecimento deste germoplasma não tem sido ponto de
investigação pela aplicação de técnicas moleculares ou citogenéticas (ABREU et al., 2009;
SANTOS et al., 2012; MELO et al., 2017).
Outras características comerciais e de importância ambiental têm sido atribuída a
compostos extraídos de espécies como, P. ligularis com a descoberta de um novo
polissacarídeo, o biopolímero xiloglucan, extraído da casca do fruto e que pode ser usado para
produção de plástico biodegradável (TOMMONARO et al., 2007). Em P. edulis foi verificada
alta eficiência biossortiva, também extraída da casca, na remoção de íons metálicos de cobre e
zinco, com 92,95% e 83,49%, respectivamente, de retenção dos íons pela biomassa (RAMOS
et al., 2016). Nas flores de Passiflora foram extraídas substâncias que podem ser usadas como
herbicidas naturais, importante para reduzir o uso de herbicidas sintéticos e de agrotóxicos
(KHANH et al., 2008).
6. Citogenética do gênero Passiflora L.
A expressiva variabilidade genética inter- e intraespecífica de Passiflora revelada por
análise citogenética tem permitido selecionar espécies com genótipos promissores ao
cruzamento interespecífico (OHRI, 1998; SANTOS et al., 2012; MELO et al., 2014; MELO
et al., 2017). Além disso, as análises citogenéticas podem trazer contribuições indispensáveis,
11
no sentido de aumentar a eficiência das estratégias de conservação e na condução de
programas de melhoramento com a espécie (SANTOS et al., 2012; MELO et al., 2014;
MELO et al., 2017). As técnicas citogenéticas clássicas e moleculares têm sido aplicadas para
a compreensão das relações entre as espécies, trazendo avanços significativos ao estudo
citotaxonômico no gênero Passiflora (MELO et al., 2001, MELO; GUERRA, 2003) e
também evolutivo (VIANA; SOUZA, 2012; MELO et al., 2014).
As espécies já analisadas de Passiflora demonstram ampla variação no número
cromossômico diploide, sendo uma característica relacionada a subgêneros, série e seção
botânica (MELO et al., 2014). Diferentes números cromossômicos básicos (x) já foram
propostos para o gênero, sugerindo que essa informação possa ser utilizada para agrupar os
táxons de acordo com o status taxonômico, como por exemplo, pertencente ao grupo de x = 6,
x = 9, x = 10 e x = 12 (MELO et al., 2001; MELO; GUERRA, 2003). Na literatura há vários
trabalhos usando dados citogenéticos e moleculares acerca do número básico primário e
secundário para Passiflora (STOREY, 1950; RAVEN, 1975; MORAWETZ, 1986; SNOW;
MACDOUGAL, 1993; MELO et al., 2001; MELO; GUERRA, 2003; HANSEN et al., 2006;
SOUZA et al., 2008). A nível cariotípico, além da descrição de passifloras consideradas
diploides com 2 n = 12, 2 n = 18, 2 n = 20 e 2 n = 22 (MELO et al., 2001; SOUZA et al.,
2008), também já foram descritos citótipos tetraploides (2 n = 4x = 24) sendo x = 6
(KNIGHT, 1991; BRUNER, 1998; MELO; GUERRA, 2003), hexaploides (2 n = 6x = 36)
também com x = 6 (MELO; GUERRA, 2003) ou, octaploides (2 n = 8x = 72) com x = 9
(SNOW; MACDOUGAL, 1993; MELO et al., 2001; MELO; GUERRA, 2003).
A utilização de técnicas convencionais tem revelado parâmetros cariotípicos comuns a
ocorrência de taxon com 2 n = 12 e 2 n = 18 em espécies do subgênero Decaloba e Passiflora,
respectivamente (MELO et al., 2014). Apesar da contribuição da citogenética clássica para
estudo do gênero Passiflora, o número cromossômico foi identificado em apenas 13% das
espécies já documentadas, de acordo com o IPCN chromosome number (GOLDBLATT;
JOHNSON, 2011). O número de espécies avaliadas está sendo ampliado com a inclusão de
novos dados obtidos pela aplicação de técnicas citogenéticas clássicas e moleculares
(VIANA; SOUZA, 2012; CERVI, 2013; KOCH, et al., 2015; MELO et al., 2017). Além do
número cromossômico obtido pela coloração citogenética convencional, a aplicação de outras
técnicas citogenéticas clássicas têm auxiliado o estudo genético do gênero, por exemplo, a
utilização do bandamento C para a localização da heterocromatina constitutiva e subsequente
identificação e delimitação entre as espécies P. edulis e P. cacao Bernacci & Souza (VIANA;
SOUZA, 2012).
12
A aplicação da coloração diferencial com nitrato de prata realizada nas espécies P.
alata, P. amethystina, P. coccinea, P. edulis, P.incarnata e P. maliformis, indicaram que
algumas espécies apresentam mais de um par cromossômico com Região Organizadora de
Nucléolo (RON) (MAYEDA, 1997). Já a utilização de fluorocromos base-específicos
CMA3/DAPI, realizada em oito espécies de Passiflora (P. amethystina, P. caerulea, P.
capsularis, P. edulis, P. foetida, P. racemosa, P. rubra e P. tricuspis), possibilitou a
visualização de um a três pares de blocos CMA3+/DAPI relacionados a constrições
secundárias (MELO; GUERRA, 2003).
A contribuição da citogenética molecular para a análise comparativa entre espécies do
gênero Passiflora tem sido realizada com sucesso através de trabalhos com a aplicação da
hibridação in situ fluorescente (FISH) (MELO; GUERRA, 2003; SOUZA et al., 2010;
COELHO et al., 2016; MELO et al., 2017; PAMPONÉT, 2017 ; SILVA et al., 2017) e
hibridação in situ genômica (GISH) (MELO et al., 2015; COELHO et al., 2016; MELO et al.,
2017; SILVA et al., 2017).
A técnica de FISH tem demonstrado variações, principalmente, em nível taxonômico,
no número de sítios de hibridação de DNAr 45S e 5S (MELO; GUERRA, 2003). O
mapeamento das regiões de DNAr 45S em P. edulis e em P. amethystina demonstraram a
presença de quatro sítios de DNAr 45S para P. edulis e seis sítios para P. amethystina (CUCO
et al., 2001). O número de sítios de DNAr 45S tem apresentado relação com o nível de ploidia
das espécies do gênero Passiflora (MELO; GUERRA, 2003).
Até o momento poucos trabalhos têm sido relatados sobre a construção de mapas
físicos em espécies de Passiflora. Um exemplo é o trabalho com oito genes, obtidos a partir
de uma biblioteca genômica inserida em BACs (Bacterial Artificial Chromossome) e
sequenciados pela técnica de BAC-ends resultando em padrões de hibridação dispersos,
encontrados nas regiões pericentroméricas e subteloméricas na maioria dos cromossomos,
indicando a presença de DNA repetitivo nesses BACs (SANTOS et al., 2014). Outro exemplo
é com P. edulis, que analisou 10.000 sequências inseridas em BACs (Bacterial Artificial
Chromossome), sendo observado cerca de 20% dessas sequências corresponde a DNA
repetitivo (SANTOS et al., 2014). Uma abordagem importante é a caracterização do DNA
repetitivo de espécies pertencentes ao gênero Passiflora, elucidando a origem evolutiva de P.
edulis f. flavicarpa e as relações genômicas entre as espécies dos subgêneros Decaloba e
Passiflora com P. edulis f. flavicarpa, bem como, identificar, caracterizar e mapear o DNA
repetitivo (DNA ribossomal, DNA satélite e elementos tranponíveis) em espécies de
Passiflora L. (SILVA, 2017).
13
E ainda, o trabalho para identificar, caracterizar e mapear o DNA repetitivo de P.
edulis e verificar a eficiência da hibridação heteróloga das sondas para caracterização do
DNA repetitivo em espécies relacionadas. Nesse sentido, esses estudos permitiram uma
melhor compreenção sobre a estrutura e organização do genoma em espécies do gênero
Passiflora possibilitando a obtenção de avanços nas pesquisas com Passiflora L. (SILVA,
2017).
A técnica de GISH é uma modificação da FISH, em que a diferença essencial está no
uso de sondas, que são elaboradas a partir do DNA genômico de espécies genitoras ou,
filogeneticamente próximas ao germoplasma analisado (CHESTER et al., 2010). Da mesma
forma, a GISH tem sido empregada para identificação de híbridos em muitas famílias de
plantas (SILVA; SOUZA, 2013). Ela utiliza o DNA genômico total de um genitor como
sonda e o DNA genômico total do outro genitor como DNA de bloqueio, identificando o
genoma de cada espécie formadora do híbrido (STACE; BAILEY, 1999; SILVA; SOUZA,
2013). Em híbridos de Passiflora, oriundos do cruzamento entre P. gardneri vs. P.gibertii a
técnica de GISH permitiu comprovar o caráter híbrido em todas as plantas F1 analisadas
(SILVA et al., 2017) e, ainda, em estudos de recombinação entre híbridos retrocruzados
(MELO et al., 2017).
7. Obtenção de híbridos de Passiflora L.
A diversidade das passifloras refletem-se na importância econômica do gênero, cujos
representantes são explorados para fins ornamentais (VANDERPLANK, 1996), medicinais
(TOMMONARO et al., 2007) e nas indústrias cosmética e alimentícia, podendo os frutos de
várias espécies ser processados para a fabricação de sucos, sorvetes, licores e doces
consumidos ou in natura, a exemplo do maracujá azedo (Passiflora edulis Sims). O Brasil
tem se destacado no cenário internacional com a cultura do maracujazeiro (IBGE, 2016),
representando mais de 95% dos pomares no país (MELETTI, 2011). No entanto, esta espécie
apresenta alta susceptibilidade a várias doenças, a exemplo de bacterioses, fusarioses e
viroses, o que ameaça a expansão e a produtividade dos cultivos. Consequentemente, esta
espécie tem sido alvo de hibridações em diversos programas de melhoramento genético
(MELETTI, 2011; CERQUEIRA-SILVA et al., 2014; SILVA, 2017), os quais utilizam
espécies silvestres do gênero como alternativas para ampliação da base genética para
resistência a diversas doenças, a qual pode ser combinada com características de
14
produtividade e qualidade de frutos (BELLON et al., 2007) e para ornamentação (MELO et
al., SILVA, 2017; SOUZA , 2018).
Uma das espécies silvestres de passifloras no Brasil, a P. cincinnata Mast., apresenta
potencial agronômico, por possuir frutos com sabor característico (ARAÚJO et al., 2008;
CERQUEIRA-SILVA et al., 2010), além de apresentar variabilidade de caracteres de
interesse agronômico (ARAÚJO et al., 2008) como tolerância a doenças (MELETTI et al.,
2005). Apresenta o número cromossômico 2 n = 18 e dois pares de sítios de DNAr 45S, sendo
considerada citologicamente semelhante a P. edulis (MELO; GUERRA, 2003), tornando-a
importante em hibridações para uso em programas de melhoramento genético (MELETTI et
al., 2005; CERQUEIRA-SILVA et al., 2012).
Apesar das barreiras reprodutivas, existem relatos de sucesso na obtenção de híbridos
mediante a utilização de técnicas de hibridação sexual e somática em Passiflora (BARBOSA;
VIEIRA, 1997; SOARES-SCOTT et al., 2003; CUCO et al., 2005; BARBOSA et al., 2007;
JUNQUEIRA et al., 2008), bem como a obtenção de híbridos interespecíficos para fins
ornamentais (ULMER; MACDOUGAL 2004; CONCEIÇÃO et al., 2011; SANTOS et al.,
2012).
O primeiro híbrido produzido envolvendo espécies do gênero Passiflora ocorreu em
1819, pelo inglês Thomas Milne, que cruzou P. caerulea com P. racemosa, dando origem ao
híbrido que denominou de P. ‘Violacea’, segundo a fórmula de hibridação descrita por Jean-
Louis-Auguste-Loiseleur-Destongchamps, em 1928 (VANDERPLANK, 2000). A finalidade
da obtenção de híbridos ainda permanece desconhecida, mas acredita-se que foi para fins
ornamentais (ABREU et al., 2009). A definição mais usada para o termo híbrido são
resultados de cruzamentos inter ou intraespecíficos utilizando-se genitores com genótipos
diferentes e originando espécies que comportam genes alelos de interesse (ALLARD,1971;
GRIFFITHS et al., 1998; VANDERPLANK, 2000). Até 2005, cerca de 400 híbridos de
passifloras com finalidade ornamental já havia sido reportado (PEIXOTO, 2005). Entre 2010
e 2011 foram registrados 21 novos híbridos (KING, 2011), e a maioria com flores de grande
exuberância.
Para os programas de melhoramento genético, é de fundamental importância entender
o potencial das espécies genitoras, bem como avaliar e caracterizar os híbridos
interespecíficos mediante parâmetros genéticos e fenotípicos que permitam estimar a
diversidade genética, as taxas de viabilidade e fertilidade, bem como reconhecer as barreiras
pré e pós-zigóticas. Nesse caso, a constituição, o comportamento cromossômico dos
genótipos promissores e dos híbridos podem ser avaliados pelas análises mitótica e meiótica
15
(SOARES-SCOTT et al., 2003; BARBOSA et al., 2007; SANTOS et al., 2012), aplicando
técnicas de bandeamento cromossômico (MORAES et al., 2013), Hibridização in situ
Fluorescente (Fluorescent In Situ Hybridization - FISH) (SOUZA et al., 2010; MORAES et
al., 2013) e a Hibridização Genômica in situ (Genomic In Situ Hybridization - GISH), a qual
utiliza sondas genômicas, tem possibilitado a identificação de cromossomos em híbridos
interespecíficos e em espécies alopoliploides (RAINA; RANI, 2001), como observado, por
exemplo, nos gêneros Epidendrum L. (MORAES et al., 2013), Spondias L. (ALMEIDA et al.,
2007) e Passiflora (MELO et al., 2015).
Neste sentido, existem relatos de sucesso na obtenção de híbridos de Passiflora,
através da utilização de técnicas de hibridação sexual e somática (JUNQUEIRA et al., 2008;
BARBOSA et al., 2007; CUCO et al., 2005; JUNQUEIRA et al., 2005; SOARES-SCOTT et
al., 2003; BARBOSA; VIEIRA, 1997), bem como, a obtenção de híbridos interespecíficos
para fins ornamentais (BELO et al., 2018; MELO et al., 2017; COELHO et al., 2016; MELO
et al., 2015; SANTOS et al., 2012; CONCEIÇÃO et al., 2011; BELO et al., 2010; ULMER;
MACDOUGAL, 2004).
As passifloras são alógmas por excelência. A sua autoincompatibilidade favorece a
hibridação cruzada, até mesmo entre espécies diferentes (BRUCKNER et al., 1995). Por isso,
a autoincompatibilidade é útil na produção de híbridos em Passiflora. Levando em
consideração as caracteristíticas florais e o florescimento em Passiflora, o emprego das
técnicas de hibridação é relativamente fácil, pois as espécies possuem na sua maioria flores
grandes e florecem o ano todo, além disso, a viabilidade do pólen e a receptividade do
estigma ocorrem no mesmo dia (BRUCKNER; OTONI, 1999).
Em Passiflora, devemos observar também a existência de híbridos naturais. Alguns
autores com base em estudos evolutivos questionam a origem de algumas espécies,
acreditando que nesse gênero novas espécies possam surgir por hibridação. Por exemplo, já
foi proposto que P. edulis f. flavicarpa resultou do cruzamento entre P. edulis e P. ligularis
Juss (POPE, 1935), no entanto, sua origem ainda permanece obscura, apontada por E. P.
Killip como uma mutante ou híbrido selvagem (VANDERPLANK, 2000).
Em Passiflora, a confirmação de hibridação era feita apenas com base em
características morfológicas. Ela é simples e de baixo custo (SANTOS et al., 2012), uma vez
que não é necessário a utilização de grandes estruturas para esse fim. Geralmente, procura-se
analisar se os híbridos possuem características intermediárias entre as espécies genitoras,
porém, com o advento da biologia molecular e com os refinamentos das técnicas em
citogenética, novas ferramentas mais confiáveis foram surgindo.
16
Atualmente os marcadores moleculares têm sido empregados para confirmação de
hibridação em vários gêneros, tais como espécies do gênero Theobroma (FALEIRO et al.,
2003), Carica (MAGDALITA et al., 1997) e Passiflora (JUNQUEIRA et al., 2008;
CONCEIÇÃO et al., 2011; SANTOS et al., 2012), assim como o uso da citogenética
molecular, (FISH e GISH), que fornecem informações altamente confiáveis quanto à
confirmação de híbridos, tanto com a utilização de cromossomos marcadores com o uso de
FISH, utilizando DNAr 5S e 45S, por exemplo (SILVA, 2017), como com o uso de GISH,
utilizando DNA genômico como sonda (SCHWARZACHER et al., 1989; MARASEK, et al.,
2004; XIONG, et al., 2006; SILVA; SOUZA, 2013; SOUZA, 2018).
17
CAPÍTULO 1: Análises Cariotípicas Em Meloeiro (Cucumis melo L.)
Rita de Cássia Vital Santos Sanchês, Margarete Magalhães Souza, Claúsio Antônio Ferreira
Melo, Gonçalo Santos Silva, Matusalem Santos Campos, Ronan Côrrea
Xavier, Glauber
Henrique Sousa Nunes e Ioná Santos Araújo
Holanda.
Resumo
O meloeiro (Cucumis melo L.) é uma espécie da família Cucurbitaceae e constitui-se
de uma espécie herbácea, amplamente cultivado no Brasil, principalmente nas regiões
semiáridas do Nordeste. Originário da Península Ibérica é considerado um representante de
destaque econômico na família, o meloeiro, tem sido amplamente explorado em análises
genéticas descritivas, principalmente após o sequenciamento genômico do táxon e a
identificação e desenvolvimento de marcadores cromossômicos. Essa informação tem
contribuído para a análise da variabilidade e dos fatores citológicos e evolutivos, que
estiveram envolvidos no estabelecimento da cultura e de sua variabilidade. Considerando que
a análise citogenética é um recurso utilizado na caracterização de espécies vegetais
agronomicamente importantes, este estudo tem como objetivo revisar os principais trabalhos
que abordaram a análise citogenética convencionais, moleculares e o cariotípo no meloeiro
(Cucumis melo L.), através de uma revisão bibliográfica, com o intuito de retratar as
principais características cromossômicas da espécie em suas relações inter- e intraespecífica.
Desse modo, pretendeu-se compreender a estrutura física e molecular dos cromossomos,
assim como os elementos genômicos já estudados que favoreceram o entendimento citológico
da cultura. Aliada a abordagem interespecífica entre o táxon C. melo e representantes do
gênero, as técnicas citogenéticas moleculares têm trazido valiosas informações a respeito da
composição da distribuição da cromatina em C. melo e sua importância na filogenia e
diversificação das espécies do gênero Cucumis.
Palavras-chave: Citogenética Convencional, Citogenética Molecular, FISH, Melhoramento
Genético.
18
Abstract
The melon (Cucumis melo L.) is a species of the family Cucurbitaceae and is an herbaceous
species, widely cultivated in Brazil, mainly in the semi-arid regions of the Northeast.
Originating in the Iberian Peninsula is considered a prominent economic representative in the
family, melon, has been extensively explored in descriptive genetic analyzes, mainly after the
genomic sequencing of the taxon and the identification and development of chromosomal
markers. This information has contributed to the analysis of variability and cytological and
evolutionary factors that were involved in the establishment of the culture and its variability.
Considering that the cytogenetic analysis is a resource used in the characterization of
agronomically important plant species, this study aims to review the main works that
approached the conventional cytogenetic analysis, molecular and the karyotype in the melon
(Cucumis melo L.), through a review with the aim of portraying the main chromosome
characteristics of the species in its inter- and intraspecific relations. In this way, it was
intended to understand the physical and molecular structure of the chromosomes, as well as
the genomic elements already studied that favored the cytological understanding of the
culture. In addition to the interspecific approach between the C. melo taxon and
representatives of the genus, molecular cytogenetic techniques have brought valuable
information about the composition of the chromatin distribution in C. melo and its importance
in the phylogeny and diversification of species of the genus Cucumis.
Keywords: Conventional Cytogenetics, Molecular Cytogenetics, FISH, Genetic
Improvement.
19
1. INTRODUÇÃO
A família botânica Cucurbitaceae possui um grande número de espécies cultivadas,
principalmente nas regiões tropicais e subtropicais do mundo, sendo a temperatura um fator
limitante para sua distribuição geográfica e área de cultivo. Essa família abrange cerca de 118
gêneros com aproximadamente 950 espécies, sendo considerado um grupo diversificado
(JUDD, 2009; SCHAEFER; RENNER, 2011). Na região tropical da América são descritos 53
gêneros nativos e, aproximadamente 325 espécies (NEE, 2007; SCHAEFER; RENNER,
2011). No Brasil, verifica-se aproximadamente 29 gêneros no qual estão inseridas 155
espécies (GOMES-KLEIN et al., 2013), e somente na região Nordeste é possível encontrar
cerca de 52 espécies e 22 gêneros (GOMES-KLEIN, 2006).
O gênero Cucumis, amplamente distribuído no mundo consiste em 32 espécies, o que
inclui alguns vegetais economicamente importantes e amplamente cultivados no Brasil: o
meloeiro, o pepino (C. sativus L.) e o machiche (C. anguria L.) (HOSHI et al., 2013).
Encontram-se também mais três espécies de Cucumis (C. dipsaceus, C. hardwickii e C.
callosus) e cinco variedades de C. melo (C. melo var. ghurmi, C. melo var. momordica, C.
melo var. muskmelon, C. melo utilissimus e C. melo var. agrestis) que têm sido bastante
estudadas e discutidas de acordo com Singh e Roy (1974).
O melão é uma das frutas mais cultivadas no mundo e é de grande importância
econômica no Brasil onde cerca de 330 mil toneladas são produzidas por ano (FAO, 2016). A
grande distribuição mundial do cultivo do meloeiro confirma a condição de espécie com
maior variabilidade fenotípica do gênero Cucumis, sendo verificada nos frutos com diferentes
origens, cores, formatos e aromas. As cultivares de melão podem ser divididos em seis
grupos: valenciano, honeydew, caipira, pele de sapo, cantaloupe e charentais (JEFFREY,
1990; STEPANSKY et al., 1999).
A análise do cariótipo é um método eficiente para caracterização de germoplasma,
direcionando o germoplasma ao pré-melhoramento (MELO et al., 2016). Essa análise informa
parâmetros genômicos pela observação de cromossomos metafásicos, com o uso de técnicas
citogenéticas específicas, a localização e identificação de sequências e regiões
heterocromáticas (GUERRA; SOUSA, 2002).
A citogenética pode ser aplicada para a identificação cromossômica, análise
citogenética comparativa entre taxa do gênero, análise da distribuição da heterocromatina em
diferentes fases (SYBENGA, 1992), mais ainda a citogenética molecular, mapeamento físico
do DNA satélite centromérico e outras sequências repetitivas, na análise genômica sendo
20
amplamente utilizada na identificação de translocações, no mapeamento cromossômico,
unindo-se como ferramenta aos programas de melhoramento genético. Estes estudos são
importantes para a descrição da variabilidade genética e para o entendimento da dinâmica
cromossômica envolvendo a espécie (CASASSOLA; BRAMMER, 2012; MEHROTRA;
GOYAL, 2014).
O presente trabalho objetivou revisar os principais trabalhos que abordaram a análise
citogenética convencionais, moleculares e o cariotípo no meloeiro (Cucumis melo L.), com o
intuito de retratar as principais características cromossômicas da espécie em suas relações
inter- e intraespecífica.
1.1. ANÁLISE CITOGENÉTICA CONVENCIONAL E BANDAMENTO
CROMOSSÔMICO EM Cucumis melo L.
A caracterização citogenética com a utilização de corantes clássicos tem demonstrado
que C. melo é uma espécie diploide com número cromossômico estável de (2 n = 2 x = 24)
(TRIVEDI; ROY, 1970; SINGH; ROY, 1974; RAMACHANDRAN; SASHADRI, 1986;
DARYONO; KUMALAWATI, 2013). Não há relatos de acessos ou cultivares poliploides,
nem a ocorrência de híbridos interespecíficos envolvendo a citada espécie. Neste caso, a
estabilidade cromossômica numérica pode ser considerada um parâmetro monomórfico no
táxon.
Os diferentes estudos cariomorfológicos evidenciam o pequeno tamanho dos
cromossomos dessa espécie. A variação entre o tamanho cromossômico do primeiro ao último
par tem sido relatada por diversos autores, variando de 1.2 a 2.46 µm (TRIVEDI; ROY,
1970); 1.22 a 2.6 µm (SINGH; ROY, 1974), 1.1 a 1.9 µm (RAMACHANDRAN;
SASHADRI, 1986), 1.0 a 2.1 µm (HOSHI et al., 2013). Variações no tamanho
cromossômico entre variedades e cultivares refletem não apenas a variabilidade
intraespecífica em relação ao tamanho cromossômico, mas também, no conteúdo de DNA,
isso como reflexo do comprimento dos lotes cromossômicos. Adicionalmente, variação na
morfologia cromossômica e no índice de assimetria (TF%) também são parâmetros
comumente observados. Nos estudos com coloração convencional, o número de satélites tem
sido variável de um a dois pares de cromossomos satelitados, indicando que apenas a
coloração convencional não é suficiente para identificação correta dos satélites nestes
cromossomos diminutos (SINGH; ROY, 1974).
21
Na variedade C. melo var. ‘Phut’ foi observado o tamamho cromossômico médio de
1.63 µm com o comprimento cromossômico total de 39.32 µm. Nesse estudo não foi
observado a presença de cromossomos satelitados, mas foi revelado cromossomos
metacêntricos e submetacêntricos (TRIVEDI; ROY, 1970). Variabilidade detectada pela
coloração convencional também foi observada na análise comparativa entre variedades como:
C. melo var. agrestis, C. melo var. ghurmi, C. melo var. momordica, C. melo var. musk melon
e C. melo var. pinkling (TRIVEDI; ROY, 1970).
Em C. melo var. momordica, o tamanho cromossômico variou de 1.44 a 2.40 µm, com
três pares metacêntricos e nove pares submetacêntricos. O comprimento cromossômico total
foi de 40.66 µm e o T.F% de 39.79%. Nessa variedade não foi observado a presença de
cromossomo satelitado. Em C. melo var. musk melon, o tamanho cromossômico variou de
1.56 a 2.22 µm, com dois pares metacêntricos e 10 pares submetacêntricos. O comprimento
cromossômico total foi de 41.40 µm e o T.F% de 38.52%, sendo observada a presença de dois
pares satelitados (SINGH; ROY, 1974). E outra análise envolvendo a variedade C. melo musk
melon, o tamanho cromossômico variou de 1.1 a 1.9 µm e o tamanho cromossômico total foi
de 34.0 µm (RAMACHANDRAN; SASHADRI, 1986). Em C. melo var. ultissimus, o
tamanho cromossômico variou de 1.40 a 2.16 µm, com dois pares metacêntricos e 10 pares
submetacêntricos. O comprimento cromossômico total foi de 41.24 µm e o T.F% de 40.93%,
sendo observada a presença de um par satelitado (SINGH; ROY, 1974).
Nas análises cariomorfológicas mais recentes realizadas em variedades de meloeiro, a
variedade C. melo cv. ‘New melon’, apresentou o tamanho cromossômico variando de 1.0 a
2.1 µm, com o tamanho cromossômico total de 35.6 µm. Nesse estudo, os autores limitaram-
se na obtenção das medidas totais, não sendo realizada a medição dos braços para a
classificação dos cromossomos. Foi apenas observado que os centrômeros estão localizados
na região mediana dos cromossomos (HOSHI et al., 2013).
Na variedade C. melo var. Bartek, que possui indivíduos com frutos de três formas
diferentes, Yellow, Elipse-Green e Long-Green, o tamanho cromossômico variou de 1.84 a
1.16 µm, 1.84 a 1.11 µm e 1.88 a 1.11 µm, respectivamente. O tamanho cromossômico total
foi de 36.74 µm (Yellow), 35.36 µm (Elipse-Green) e 36.4 (Long-Green). Nessa análise todos
os cromossomos foram metacêntricos (DARYONO; KUMALAWATI, 2013).
O tamanho do genoma do melão é estimado em 450 Mb, semelhante à melancia e
relativamente maior que o do pepino (367 Mb) (HUANG et al., 2009). Estudos citogenéticos
anteriores mostraram que os cromossomos de C. melo são pequenos, mas pelo grande número
22
sugere um genoma de médio tamanho (TRIVEDI; ROY, 1970; BHADURI; BOSE, 1947;
SHIMOTSUMA, 1965; DANE; TSUCHIYA, 1976).
O cariótipo de C. melo tem sido estudado e estabelecido com a utilização de técnicas
clássicas como a morfologia cromossômica e, o bandamento C (RAMACHANDRAN;
SASHADRI, 1986; MA et al., 1995; ZHANG et al., 2005). Contudo, a discordância em
relação ao polimorfismo cariotípico observado por técnicas clássicas, levam a necessidade da
aplicação de técnicas mais elaboradas como a FISH, visando o refinamento do cariótipo de C.
melo e a identificação dos cromossomos do complemento (LIU et al., 2010).
Em estudo com os fluorocromos CMA3 e DAPI feito entre as espécies de C. melo e C.
mutuliferus, notou-se diferenciações entre os conjuntos cromossômicos das espécies quanto
ao tamanho dos cromossomos na metáfase mitótica, contudo, na prometáfase percebeu-se que
existe alta similaridade de caráter cromossômico com relação ao padrão de bandas, sendo
centrômeros e satélites com natureza rica em GC mostrando CMA3+/DAPI
- para C. melo
(HOSHI et al., 2013).
1.2. ANÁLISE CITOGENÉTICA MOLECULAR EM Cucumis melo L.
O sequenciamento do genoma do meloeiro (C. melo) em 2012 impulsionou o
mapeamento, a análise sintênica e genômica desta cultura de grande importância econômica
(GARCIA-MASA et al., 2012). Contudo, apesar do impacto do sequenciamento genômico de
C. melo para a análise genômica, muitas inferências citológicas e evolutivas sobre o táxon e a
espécie próxima, C. sativus quanto à sua composição e distribuição da heterocromatina já
haviam sido realizadas antes da publicação do genoma de C. melo (HAN et al., 2009; LIU et
al., 2010). O mapeamento físico do DNA satélite centromérico e outras sequências repetitivas,
têm sido utilizados como base para a identificação cromossômica e a análise citogenética
comparativa entre táxons do gênero Cucumis. Além do DNA repetitivo, utilizado para a
identificação cromossômica, a hibridação de fosmídios e a colinearidade de marcadores
citológicos têm contribuído para o entendimento da rota citogenética-evolutiva, atuante na
especiação e na estruturação cromossômica das espécies (HAN et al., 2009).
Os sítios de DNAr 5S e 45S são sequências conservadas nos cromossomos e podem
fornecer informações valiosas sobre a evolução do cariótipo e as inter-relações entre espécies.
Em trabalho utilizando a hibridação in situ fluorescente (FISH) para determinar o número e a
localização cromossômica de locus de DNAr 5S e 45S em oito espécies de Cucumis
diplóides, as espécies diploides analisadas apresentaram três tipos de padrões de distribuição
23
de DNAr, que forneceram evidências citogenéticas claras sobre a divergência entre C. melo e
espécies silvestres diploides africanas de Cucumis (LI et al., 2016). Os resultados não apenas
mostraram inter-relações entre espécies no gênero Cucumis, mas também que os padrões de
DNAr podem ser usados como marcadores citológicos para a discriminação de espécies
estreitamente relacionadas. Os dados serão úteis para que os produtores escolham as espécies
mais adequadas de várias espécies selvagens para melhorar o melão cultivado (LI et al.,
2016).
A FISH foi utilizada para diferenciar o conjunto cromossômico de duas espécies de
Cucumis, o C. metuliferus e o C. melo, obtendo como resultados dois sítios de DNAr 5S e
dois de DNAr 45S nas extremidades de cromossomos de C. metuliferus, onde o DNAr 5S
estavam localizadas nos dois cromossomos menores e os sinais de DNAr 45S nos dois
cromossomos de tamanho médio no complemento, identificando os cromossomos homólogos
(HOSHI et., al 2013). O C. melo mostram dois sítios de DNAr 5S e quatro sítios de DNAr
45S, que foram detectados nas extremidades dos cromossomos, sendo que, estes sítios foram
localizados em cromossomos diferentes. Nos sítios DNAr 45S, dois sinais foram maiores e
dois sinais foram menores. Como resultado da FISH, três pares de cromossomos metafásicos
foram facilmente identificados. Além disso, algumas bandas com características de marcação
com CMA3 permitiram a identificação de certos cromossomos que apareceram na
prometáfase (HOSHI et al., 2013). Os autores concluíram que se faz necessário maiores
estudos através da citogenética molecular para estabelecer melhores resultados.
A FISH, quando combinada com informações genômicas do C. sativus, através da
utilização de fosmídeos ancorados por marcadores SSR específicos para C. melo, atribuiu
cada clone de fosmídeos a um cromossomo distinto de melão, podendo ser utilizado como
marcadores citológicos confiáveis de melão; além de que, se faz possível a comparação de
distribuição dos marcadores nos cromossomos de melão e em pepino ao se fazer a
combinação do CentM (satélite centromérico de melão), DNAr 45S, DNAr 5S com fosmídeos
de pepino, evidenciando o processo evolutivo dessas espécies (LIU et al., 2010).
Pesquisas têm evidenciado cada vez mais que o pepino e o melão, evoluíram de um
ancestral comum; a utilização de sondas de DNAr 45S e CsCent1 para cromossomos 1 e 2 de
pepino em paquíteno, mostram uma distribuição diferente, do que é encontrado nos sinais de
FISH, que podem ter evoluído através de fusões do cariótipo do ancestral com número
cromossômico 12, fato constatado devido ao melão e pepino apresentarem sequências
centroméricas muito parecidas. No cromossomo 2 do pepino, através da presença de CsCent1,
foram constatadas sequências de DNAr 45S em ambas extremidades das sequências
24
centroméricas. Utilizando a técnica de FISH com BAC-E38, CsCent1 e sequências
mitocondriais repetidas, foi possível verificar uma alteração estrutural na região centromérica
do cromossomo 4 de pepino (KOO et al., 2010).
A biblioteca de fosmídeos da linhagem 9930 de C. sativus foi utilizada para a
hibridação cruzada em C. melo pela técnica de FISH, uma alternativa visando ampliar a
resolução do cariótipo do meloeiro, uma vez que as sondas para DNAr e DNA satélite
centromérico não possibilita a identificação cromossômica no meloeiro (LIU et al., 2010). No
entanto, a FISH com a utilização de 21 fosmídeos ancorados com sequências do tipo SSR
(Simple Sequence Repeat) e, sondas para DNA satélite centromérico (CentM), e para DNAr
45S e 5S permitiu não só a identificação de todos os cromossomos de C. melo, mas também a
distinção do braço cromossômico curto e longo (LIU et al., 2010). Em geral, os clones de
fosmídeos desenvolvidos para C. sativus e a sua hibridação cruzada em C. melo, sem perda de
resolução, levantam a hipótese da conservação das sequências nos clones de fosmídeos entre
ambas as espécies. Por outro lado, evidenciaram modificações estruturais, uma vez que a
ordem e os grupos de ligação nos quais esses fosmídeos hibridaram são distintos entre os
táxons (LIU et al., 2010).
A função do centrômero é determinada por mecanismos epigenéticos, o qual é o
responsável pela segregação do cromossomo, servindo de base para ancoragem e montagem
dos cinetócoros. A composição do centrômero é representada em grande parte por DNA
satélite repetitivo com distribuição centromérica e pericentromérica, o qual é geralmente
espécie-específico, quanto ao tamanho e composição da sequência e, o número de unidades de
repetição (PLOHL et al., 2014). Em Cucumis, diversos tipos de DNA satélites, restritos a
regiões centroméricas e pericentroméricas já foram identificados (HAN et al., 2008). Em C.
melo, o DNA repetitivo CentM é um satélite de 352 pb que está presente em todos os
cromossomos do complemento (HAN et al., 2009).
No entanto, C. sativus apresenta cinco tipos distintos de sequências repetitivas, o DNA
satélite do TipoI, TipoII, TipoIII, TipoIV e CsPc (KOO et al., 2010). O DNA satélite TipoIII
em C. sativus está estruturado em unidades de monômeros de 177 pb representando 4% do
genoma total da espécie, sendo distribuído em regiões centroméricas e pericentroméricas, mas
sem homologia com o CentM de C. melo. Apesar da facilidade de hibridação cruzada dos
clones de fosmídeos de C. sativus para C. melo, o mesmo fato não ocorre quando são
utilizadas sondas para os DNAs satélites de centrômeros de uma espécie na outra (HAN et al.,
2009). O DNA satélite CentM e TipoIII são importantes características de diferenciação
cariotípica de Cucumis, no sentido de auxiliarem a distinção dos cromossomos entre si e em
25
estudos evolutivos (HUANG et al., 2009; HAN et al., 2008). Mesmo evoluindo de um
ancestral comum, essas duas espécies não apresentam sinais de hibridação cruzada, indicando
que as repetições centroméricas destes são completamente divergentes (HAN et al., 2009).
A hibridação cruzada de fosmídeos e sequências repetitivas entre as espécies C. melo e
C. sativus é uma boa estratégia utilizada em estudos citogenéticos comparativos e para
inferências evolutivas entre ambos os táxons, tendo em vista a especiação dos mesmos de um
ancestral comum a aproximadamente nove milhões de anos atrás (SCHAEFER; RENNER
2009). Neste sentido, o mapeamento de fosmídeos construídos para C. sativus e sua aplicação
em C. melo revelaram eventos citológicos importantes, que ocorreram na especiação de
ambas as espécies, como, por exemplo, a inativação, ativação e reposicionamento de
centrômeros, e o acúmulo ou perda de heterocromatina centromérica e pericentromérica. O
reposicionamento de centrômeros paralelamente com o surgimento de neocentrômeros são
características evolutivas marcantes em Cucumis; porém tal característica evolutiva tem sido
pouco observada em outras angiospermas (HAN et al., 2009).
As similaridades em nível de sequência do DNA satélite centromérico, em ambas as
espécies, sugerem que os dois tipos de sequências satélites teriam existido no ancestral
comum, sendo apenas amplificada após ou durante o processo de especiação (KOO et al.,
2010). A hibridação de fosmídeos em C. sativus levou a especulação da ocorrência de fissão
cromossômica durante a sua evolução, uma vez que o cromossomo 6 desta espécie equivale a
dois cromossomos fundidos de C. melo (REN et al., 2009). A análise citogenética
comparativa entre C. sativus e C. melo indicaram que cinco cromossomos do primeiro táxon
derivaram de fusões entre dez cromossomos de C. melo (HUANG et al., 2009).
Outro evento relacionado ao DNA centromérico de Cucumis é a perda de
heterocromatina associada ao surgimento de neocentrômeros ou a inativação de centrômeros
vestigiais (HAN et al., 2009). A FISH com fosmídeos também revelou que poucas
modificações cromossômicas, podem ocorrer, uma vez que, o mapeamento físico do
cromossomo 7 de C. sativus e o cromossomo 2 de C. melo não indicam modificações
estruturais entre si. Desta forma, apenas o reposicionamento do centrômero e inversões
pericentroméricas podem ser especuladas como eventos evolutivos principais que atuaram
para a configuração física atual do cromossomo sete de C. sativus e cromossomo dois de C.
melo (HAN et al., 2009).
26
2. METODOLOGIA
2.1. Caracterização Geral e Organização da Revisão Bibliográfica
O presente trabalho foi realizado por meio de uma revisão bibliográfica sobre as
pesquisas de cunho citogenética realizadas em áreas pertencentes a todo território nacional e
internacional que trabalham com Cucumis melo L. e espécies próximas e que abordaram o uso
ou o conhecimento da citogenética clássica e molecular. Foram analisados e compilados
artigos científicos, tanto publicados em revistas nacionais como internacionais e livros.
A organização e seleção dos artigos foram realizadas utilizando-se como ferramentas
duas etapas: na primeira foi feito buscas em dois dos principais portais de busca de literaturas
científicas (Web of Science e Scopus). Para ambos os portais, depois de alguns testes, foi
padronizado a utilização das mesmas palavras chaves: “cytogentics + Cucumis”, palavras que
foram escolhidas prezando por uma maior abrangência de artigos que poderiam atender aos
critérios estabelecidos. A única particularidade de cada portal foi em relação gênero Cucumis
que poderia estar associado a qualquer espécie não somente ao Cucumis melo como busca,
relacionando a busca em ambos os portais a qualquer ano de publicação.
A segunda etapa serviu como forma de complementação, sendo realizada uma nova
busca, direcionada para os sites das principais revistas brasileiras com abertura para trabalhos
de citogenética: Revista Brasileira de Genética, Rodriguesia, Revista Brasileira de
Biociências, Acta Scientiarum (Jornal específico de Ciências Biológicas), Anais da Academia
Brasileira de Ciências. A busca foi realizada por meio do site disponível online de cada
revista, sendo analisados todos os artigos disponíveis a partir do primeiro volume de cada
revista até o último volume publicado referente ao ano de 2017.
2.2. Seleção de Artigos: Critérios de Inclusão e Exclusão Adotados
Para que os artigos fossem incluídos na revisão, os mesmos precisavam atender
conjuntamente aos seguintes critérios: 1) Possuir a área de estudo localizada totalmente ou
predominantemente sobre a área de citogenética; 2) Abordar sobre o conhecimento e/ou uso
citogenética (tanto clássica como molecular), podendo ser abordagens exclusivas sobre o
gênero Cucumis, abordagens conjuntas sobre as espécies mais próximas de Cucumis, sobre as
diversas categorias de citogenética desde que espécies estivessem presentes; 3) Ter sido
publicado até dezembro de 2017.
27
Prezando-se primeiramente pela compilação da revisão das espécies de Cucumis
considerando a citogenética, foram adotados critérios específicos para os casos de artigos que
compartilhavam o mesmo assunto e, em alguns casos, as mesmas espécies, excluindo-se dessa
forma possíveis pseudo-replicações de informação: 1) Para artigos realizados na mesma área
de estudo, com a mesma comunidade local, as mesmas espécies botânicas e que foram
originados a partir de um trabalho inicial (por meio do título e da metodologia dos trabalhos
fica claro que os artigos são provenientes da mesma pesquisa), foi considerado somente o
artigo mais antigo; 2) Para os artigos oriundos de um mesmo trabalho, realizados na mesma
área de estudo, envolvendo as mesmas comunidades, mas possuindo espécies distintas devido
a abordagem sobre categorias distintas em relação aos recursos vegetais estudados (por
exemplo, quando a pesquisa inicial abordou sobre várias categorias de uso, mas teve uma
publicação direcionada para a categoria citogenética com espécies de Cucumis, foi
selecionado somente o artigo que envolvia as duas categorias, considerado como mais
abrangente a citogenética.
Com relação ao 3) Para os artigos realizados na mesma área de estudo, na mesma
comunidade, que compartilhavam as mesmas espécies, mas que também possuíam algumas
espécies distintas (devido a uma metodologia diferente utilizada, ou pela realização do
trabalho por diferentes pesquisadores em épocas distintas), ambos os artigos foram
considerados porém computando-se somente uma vez as espécies compartilhadas, acrescidas
das espécies exclusivas do segundo artigo; 4) Para os artigos que compartilhavam a mesma
área de estudo, a mesma comunidade local, mas um dos dois se diferenciava por também ter
realizado o estudo em outra comunidade, foram considerados ambos os artigos, computando-
se apenas uma vez as mesmas espécies compartilhadas nos diferentes artigos para as mesmas
comunidades acrescidas das espécies exclusivas da comunidade nova de um dos artigos e 5)
Para os artigos que enfocaram somente uma espécie e a mesma já havia sido computada para
a mesma área de estudo, o artigo foi descartado.
Vários artigos citogenéticos trazem informações sobre espécies de Cucumis que são
utilizadas para fins clássicos, convencionais, moleculares, dentre diversas outras categorias,
sendo que em determinados artigos essas espécies são consideradas em uma categoria a parte,
enquanto que em outros são implicitamente consideradas como fruteiras de importância
econômica. Levando-se em conta a existência de uma ligação entre a economia aos e o porquê
dos estudos citogenéticos, sendo responsáveis por todas essas buscas, foi considerado no
presente estudo o Cucumis melo e as espécies relacionadas pelos artigos selecionados.
28
3. CONSIDERAÇÕES FINAIS
O estudo com citogenética convencional traz para o organismo não estudado ou pouco
estudado, informações importantes, como número cromossômico que são constantes na
espécie e pode-se usar como caráter taxonômico. A posição, o número, o tamanho das
constrições secundárias e satélites cromossômicos também podem ser avaliados em muitos
grupos de plantas por se mostrarem úteis na caracterização e distinção de espécies. Em
paralelo, o estudo com a citogenética molecular, traz metodologias empregadas para
identificação, caracterização e localização de sítios, utilizando a hibridação com sequências de
DNA repetitivo permitindo a identificação de alterações nos cromossomos. Esses efeitos das
alterações cromossômicas podem trazer benefícios, resultando em características de interesse,
que podem ser selecionadas e mantidas na população, ou ainda características indesejáveis e
serem descartadas.
Desse modo, compreender a estrutura física e molecular dos cromossomos, assim
como os elementos genômicos já estudados, favorece o entendimento citológico da cultura.
Aliada a abordagem interespecífica entre o táxon C. melo e representantes do gênero, as
técnicas citogenéticas moleculares têm trazido valiosas informações a respeito da composição
da distiribuição da cromatina em C. melo e sua importância na filogena e diversificação das
espeécies do gênero Cucumis. Desta maneira, o investimento na caracterização citogenética
clássica e molecular e ainda a acessibilidade destas informações proporcionará maior
eficiência para novos estudos citogenéticos buscando o estabelecimento das relações
genéticas, genômicas e filogenéticas entre as mais variadas famílias, gêneros e espécies.
4. AGRADECIMENTOS
Agradecimentos são dados à UESC (Universidade Estadual de Santa Cruz) pela
infraestrutura do Laboratório de Melhoramento de Plantas (LAMEP) e da Casa de Vegetação,
CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) e FAPESB
(Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia) pelo apoio financeiro à pesquisa;
CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) para as bolsas
concedidas ao primeiro, terceiro e quarto autores; CNPq pela bolsa concedida à segunda
autora.
29
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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33
CAPÍTULO 2: Caracterização Cariotípica De Acessos De Meloeiro (Cucumis melo L.)
Rita de Cássia Vital Santos Sanchês, Margarete Magalhães Souza, Claúsio Antônio Ferreira
Melo, Gonçalo Santos Silva, Ronan Corrêa
Xavier e Glauber Henrique Sousa
Nunes.
Resumo
O Cucumis melo (meloeiro) é uma espécie originária da Península Ibérica e está inclusa na
família Curcubitaceae. Apesar do conhecimento a respeito da estrutura física dos
cromossomos do meloeiro, pouco se conhece sobre a diversidade cariotípica intraespecífica
da espécie. Para estudar a diversidade cariotípica em oito acessos de meloeiro foram
utilizados a coloração de Giemsa 3%, aplicação de fluorocromos CMA3/DAPI e a localização
de sequências de DNAr 45S e 5S pela hibridação in situ fluorescente. A análise de coloração
convencional revelou estabilidade no número cromossômico, com os acessos apresentando 2n
= 24. Foi observado variações no tamanho cromossômico médio entre os acessos com efeito
significativo pela ANOVA, com tamanho cromossômico médio variando de 0,98 µm a 1,46
µm para os acessos A26 e A18, respectivamente. O agrupamento de Scott-Knott distribuiu os
acessos em dois grupos. Blocos heterocromáticos ricos em GC, CMA3+/DAPI
-, foram
observados em regiões pericentroméricas de todos os cromossomos do complemento. Blocos
CMA3+/DAPI
- foram localizados também em regiões terminais, sendo específicos de regiões
satélites. Sítios de hibridação de sondas de DNAr 45S revelaram a presença de um par
cromossômico com esse locus. Adicionalmente, sítios para DNAr 5S revelaram um par
cromossômico marcado. Não foi observada variação quantitativa nos sítios de DNAr entre os
acessos analisados, indicando esses marcadores como ideais para a verificação da estabilidade
cariotípica em C. melo. O número diploide foi confirmado com C. melo da variedade
momordica, corroborando com os dados reportados na literatura para a espécie. A avaliação
comparativa entre os acessos estudados permitiu constatar a ocorrência de um padrão
cariotípico dentro da espécie. A presença de blocos de CMA3+
nas regiões terminais de alguns
cromossomos, em geral, está relacionada com as regiões organizadoras de nucléolos,
observadas nas angiospermas. Os sítios de DNAr 5S e 45S são sequências conservadas nos
cromossomos e podem fornecer informações valiosas sobre a evolução do cariótipo as inter-
relações entre espécies. Essa caracterização possibilitou verificar a estabilidade dos
cromossomos através dos marcadores utilizados indicando que os mesmos são ideais para a
verificação cariotípica nesta espécie.
Palavras-chave adicionais: Melão, Citogenética, Fluorocromos, FISH.
34
Abstract
Cucumis melo (melon) is a species from the Iberian Peninsula and is included in the
Curcubitaceae family. Despite the knowledge about the physical structure of the melon
chromosomes, little is known about the intraspecific karyotype diversity of the species. To
study the karyotype diversity in eight melon accessions, the staining of Giemsa 3%,
application of CMA3 / DAPI fluorochromes and the localization of 45S and 5S rDNA
sequences by fluorescence in situ hybridization were used. The conventional staining analysis
showed stability in the chromosome number, with the accesses presenting 2n = 24. Variations
in the mean chromosome size were observed among the accesses with significant effect by
ANOVA, with a mean chromosome size varying from 0.98 μm to 1.46 μm for accesses A26
and A18, respectively. The Scott-Knott group distributed the accesses into two groups.
Heterochromatic blocks rich in GC, CMA3+/ DAPI-, were observed in pericentromeric
regions of all complement chromosomes. CMA3+/ DAPI- blocks were also located in
terminal regions, being specific to satellite regions. Hybridization sites of 45S rDNA probes
revealed the presence of a chromosomal pair with this locus. In addition, sites for 5S rDNA
revealed a labeled chromosomal pair. No quantitative variation was observed in the rDNA
sites between the accessions analyzed, indicating these markers as ideal for the verification of
karyotypic stability in C. melo. The diploid number was confirmed with C. melo of the
momordica variety, corroborating with the data reported in the literature for the species. The
comparative evaluation between the accesses studied allowed to verify the occurrence of a
karyotype pattern within the species. The presence of CMA3 + blocks in the terminal regions
of some chromosomes is generally related to the nucleoli organizing regions observed in
angiosperms. The 5S and 45S rDNA sites are conserved sequences on chromosomes and can
provide valuable information about the evolution of karyotype interrelationships between
species. This characterization made it possible to verify the stability of the chromosomes
through the markers used, indicating that they are ideal for karyotype verification in this
species.
Keywords: Melon, Cytogenetics, Fluorochromes, FISH.
35
1. INTRODUÇÃO
A família Cucurbitaceae Juss. pertence ao clado Curcubitales e a tribo Benincaseae
(SCHAEFER et al., 2009), as quais ocorrem principalmente nas regiões tropicais e
subtropicais do mundo, e poucas em regiões temperadas. A maioria das espécies é
extremamente sensível a baixas temperaturas, sendo um fator limitante para sua distribuição
geográfica e área de cultivo. Essa família possui 118 gêneros descritos e, aproximadamente
950 espécies, fazendo com que seja uma das famílias mais numerosas e heterogêneas
existentes (JUDD et al., 2009; SCHAEFER; RENNER, 2011).
Na região tropical da América são descritos 53 gêneros nativos e aproximadamente
325 espécies (NEE, 2007; SCHAEFER; RENNER, 2011). No Brasil ocorrem
aproximadamente 29 gêneros, no qual estão inseridas 155 espécies (GOMES-KLEIN et al.,
2015), e somente na região Nordeste é possível encontrar cerca de 52 espécies e 22 gêneros
(GOMES-KLEIN, 2006). O gênero Cucumis L. abrange de 32 espécies (HOSHI et al., 2013),
é um dos gêneros mais importantes em termos econômicos e inclui muitas hortaliças
cultivadas, como pepino, maxixe, e plantas ornamentais, como cabaça e abóbora. O melão se
destaca entre as hortaliças mais cultivadas do mundo (MULLER et al., 2013).
As informações citogenéticas têm permitido a comparação entre taxa e a identificação
de variações cromossômicas inter e intraespecíficas (SOUZA et al., 2010; MELO et al., 2011;
GUERRA, 2013; MELO et al., 2014; MELO et al., 2015; COELHO et al., 2016; MELO et
al., 2016; MELO et al., 2017). Avaliações mais detalhadas sobre a estrutura dos cromossomos
vêm sendo desenvolvidas em estudos que demonstram o potencial da análise citogenética
entre os táxons para comparações de mapas genéticos e citogenéticos, entre espécies e
gêneros de diferentes culturas vegetais (SNOWDON, 2007). As análises citológicas também
contribuem para os programas de melhoramento, permitindo a identificação de aneuplóides e
poliplóides, auxiliando na identificação de possíveis rearranjos cromossômicos (SATTLER et
al., 2016).
Os principais estudos sobre genética de melão reportam sobre o tipo de herança do
hábito de crescimento, da macho esterilidade, da cor da casca do fruto, da textura e da cor da
polpa, além da resistência a doenças (LOPES et al., 2003). Tem se encontrado alguns estudos
sobre Cucumis melo L. e Cucumis sativus L. (pepino) como: identificação cromossômica,
análise citogenética comparativa entre táxons do gênero, distribuição da heterocromatina,
mapeamento físico do DNA satélite, centromérico, DNAr 45S e 5S, análise genômica, além
de estudos com BACs (cromossomos artificiais de bactérias) e fosmídeos (TSUCHIYA &
36
GUPTA, 1991; KOO et al., 2010; LIU et al., 2010). A localização de marcadores
cromossômicos em C. melo, em comparação com C. sativus tem permitido identificar o
reposicionamento do centrômero como rota principal na diferenciação e organização
cariotípica entre as duas espécies (LIU et al., 2010).
Os cromossomos comumente servem como um dos aspectos moleculares mais
importantes do estudo da evolução das espécies. Assim, a maioria das mutações cruciais que
levaram à diferenciação de espécies durante a evolução ocorreu no nível cromossômico. Além
disso, a análise dos cromossomos parece ser uma ferramenta inestimável para o estudo da
evolução, devido à sua eficácia na identificação de cromossomos e mapeamento físico preciso
de genes e, podem ser utilizadas em programas de melhoramento (KOO et al., 2010).
O presente trabalho objetivou a realização da caracterização citogenética clássica e
molecular visando localizar a heterocromatina rica em GC e, sequências de DNA
ribossômicos em C. melo. Desta forma pretende-se verificar a diversidade cariotípica em
variedades comerciais de meloeiro para a análise da diversidade intraespecífica.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Material Vegetal
Foram utilizadas sementes de acessos mantidos no Banco Seminal de Germoplasma de
meloeiros amarelos (C. melo var. momordica) da UFERSA - Universidade Federal Rural do
Semiárido. Foram selecionados oito acessos de diferentes estados brasileiros, da variedade
momordica (exceto A15, sem informação), com exocarpo cor creme e endocarpo cor branca,
denominados A01, A09, A12, A15, A17, A18, A22, A26 (Tabela 1).
Tabela 1. Acessos de meloeiros com os seus respectivos códigos e locais de origem.
ACESSO LOCAIS DE ORIGEM*
A01 RN
A09 CE
A12 PE
A15 AL
A17 BA
A18 PI
A22 MA
A26 SE
*RN – Rio Grande do Norte; CE – Ceará; PE – Pernambuco; AL – Alagoas; BA – Bahia; PI – Piauí; MA –
Maranhão; SE – Sergipe.
37
2.2. Preparação Cromossômica
Sementes foram colocadas para germinar em placas de Petri com papel filtro
umedecido em temperatura ambiente (TA). As radículas foram pré-tratadas com a solução
antimitótica 8-hidroxiquinolina (Merck®
) a 0,002 M por 2 horas em TA, lavadas com água
destilada durante 5 min e em seguida fixadas em Carnoy (etanol:ácido acético glacial, 3:1
(v/v), (Merck®); JOHANSEN, 1940) durante 3 horas em TA e estocadas a -20ºC até a hora da
preparação cromossômica. Para preparação das lâminas foi seguido o protocolo proposto por
Guerra e Souza (2002). Ápices de raízes foram lavados em água destilada durante 5 min por
2x e incubadas em 50 µL de solução enzimática contendo celulase a 2% (Sigma®) e pectinase
a 20% (Sigma®), por 1 hora e 20 min a 37º C. As raízes foram lavadas com água destilada
durante 5 min por 2x e maceradas em 15 µL de ácido acético glacial a 45% (Merck®). Em
seguida, o material citológico foi espalhado com auxílio de agulha e pressionado levemente
entre papel filtro para espalhamento dos cromossomos. As lamínulas foram removidas após
congelamento em nitrogênio líquido e as lâminas secas ao ar, depois estocadas em freezer -
200C até a aplicação das técnicas.
2.3. Análise Cariomorfológica
2.3.1. Morfometria cromossômica
Para a análise cariomorfológica as lâminas foram coradas com Giemsa 3% (Merck®
)
por 20 min, secas em TA e montadas com Neomount (Merck®
). Cinco metáfases foram
usadas para medir o comprimento do lote haploide (HCL) (Levan et al., 1964) e o
comprimento médio dos cromossomos (x), (HUZIWARA, 1962). A fotodocumentação foi
realizada pelo sistema DP25 5 megapixels, software DP2-BSW (Olympus).
2.3.2. Análise estatística
O comprimento total dos cromossomos foi baseado nas cinco melhores metáfases de
cada acesso estudado, comparadas com melhor espalhamento e grau de condensação. As
metáfases foram medidas usando o software Image Tool versão 3,0. Os dados foram
submetidos à análise de variância com o auxílio do programa (ANOVA) e, as médias entre os
acessos em relação ao comprimento total dos cromossomos foram comparadas pelo teste de
Scott-Knott (p<0,05). Foi utilizado o software Sisvar versão 5.0 (FERREIRA, 2003).
38
2.4. Bandamento CMA3/DAPI
Lâminas envelhecidas por no mínimo três dias foram submetidas à dupla coloração
CMA3/DAPI de acordo com o protocolo descrito por Guerra e Souza (2002), com
modificação na concentração de CMA3. Foi aplicado 10 µL de CMA3 (0,25 mg-1
) sobre a
lâmina durante uma hora. A lâmina foi lavada em água destilada e seca ao ar. Em seguida foi
aplicado 10 µL de DA (0,1 mg-1
) durante 30 minutos. A lâmina foi lavada em água destilada e
seca ao ar. Foi aplicado 10 µL de DAPI (0.5 mg-1
) por 30 minutos. As lâminas foram lavadas,
secas e montadas com 15 µL glicerol/Macllvaine (1:1 v/v) + 2.5 mM MgCl2, utilizando
lamínulas 20 x 20 mm. As lâminas foram envelhecidas novamente por três dias antes da
análise microscópica. As imagens foram capturadas em microscópio de epifluorescência
Olympus BX41, equipado com câmara digital de 5MP Olympus DP25 5 megapixels e com o
software DP2-BSW. Para visualização do DAPI foi utilizado o filtro U-UTH (330-385 nm de
excitação/400 nm de emissão de corte dicroico/>420 nm) e para visualização do CMA3 foi
utilizado o filtro U-MWV (450-480 nm de excitação/500 nm de emissão de corte
dicroico/>515 nm). Para sobreposições das imagens, montagem dos cariogramas e confecção
das pranchas, foi utilizado o software Adobe Adobe® Photoshop CS5.
2.5. Preparo de Sonda para Hibridação in situ Fluorescente (FISH)
Primers para amplificação parcial do gene 26S de Passiflora Pe26S-rDNA-F 5'-
GGCTGAATCTCAGTGGATCG-3' e Pe26S-rDNA-R 5'-GCTGTCGGTGGACTG CTC-3'
(Silva, 2017) foram utilizados para a elaboração de sondas para sítios de DNAr 45S, as quais
foram marcadas com biotin16-dUTP via Nick translation seguindo o protocolo do fabricante
(Roche Diagnostics®).
As sondas para sítios de DNAr 5S foram obtidas a partir do produto da reação em
cadeia da polimerase (PCR) com o par de primer específico para Passiflora 5'-
GTGCGATCATACCAG C(AG)(CT)TAATGCACCGG-3' e 5'-
GAGGTGCAACACGAGGACTTCCCAGGA GG-3' (Gottlob-McHugh et al., 1990) e
marcada com digoxigenina-11-dUTP (Roche Diagnostics ®). As sondas foram marcadas via
Nick translation (Roche Diagnostics ®).
39
2.6. Tratamento de Lâminas para FISH
O tratamento das lâminas seguiu o protocolo proposto por Schwarzacher e Heslop-
Harrisson (2000), com modificações de Souza et al. (2010). Lâminas contendo as preparações
citológicas foram secas em estufa a 37 °C pelo tempo mínimo de 1 h. Após aplicação de 50 µl
de RNase (Sigma ®) a 1 µg/mL em tampão 2xSSC (cloreto de sódio a 0,3 M, Sigma ®;
citrato de sódio a 0,03 M, Sigma ®), as lâminas foram incubadas em câmara úmida por 1 h a
37°C. As lâminas foram imersas em 2xSSC em TA duas vezes por 5 min cada; 50 µL de HCl
(Vetec) a 10 mM foi adicionado sobre as metáfases por 5 min, e após retirada do HCl, foi
adicionado 50 µL de pepsina (Sigma ®) [pepsina a 10 mg/mL; HCl a 10 mM (1:100 v/v)] e as
lâminas foram incubadas em câmara úmida por 20 min a 37°C. As etapas de lavagens citadas
a seguir foram realizadas em plataforma agitadora a 120 rpm (Biomixer, Mos-1). As lâminas
foram lavadas em 2xSSC em TA duas vezes por 5 min cada, imersas em paraformaldeido
(Sigma ®) a 4% em TA por 10 min, e novamente lavadas em 2xSSC duas vezes por 5 min
cada. As preparações citológicas foram desidratadas em etanol 70% e etanol 100% por 5 min
cada, para imediata aplicação da técnica de FISH.
2.7. Aplicação da FISH
Após a secagem das lâminas em TA por 30 min, foi adicionada a mistura de
hibridação com o volume final de 15µl, sendo formamida 50% (Sigma ®), dextram sulfato
10% (Sigma ®), 2xSSC (Sigma), SDS 0,13% (Sodium dodecyl sulfate - Bio Agency) e as
sondas. Foram utilizados 50 ng da sonda DNAr 26S e 50 ng da sonda 5S. A mistura de
hibridação foi aquecida a 75 °C por 10 min em termociclador (Eppendorf, Mastercycler) e
transferida imediatamente para gelo por 5 min. As preparações citológicas contendo a mistura
de hibridação foram desnaturadas em termociclador contendo um adaptador para lâminas
(Techne, TC-412) a 75 °C por 10 min e incubadas overnight a 37 °C em câmara úmida. Após
a hibridação, as lâminas foram imersas em 2xSSC em TA por 5 min para a remoção das
lamínulas. Os banhos pós-hibridação a seguir foram realizados em banho Dubnoff (Quimis,
9226ML), a 42 ºC, consistindo em duas imersões em 2xSSC por 5 min cada, duas em
0,1xSSC por 5 min cada, e mais duas imersões em 2xSSC por 5 min cada. As lâminas foram
imersas em solução com 4xSSC/Tween 20 a 0,2% (Sigma ®) em TA por 5 min e tratadas
com 50µl de BSA (Sigma) a 5%. As sondas marcadas com biotina foram detectadas com 0,7
40
µl de avidina-FITC (Vector ®) mais 19,3 µL BSA 5% por lâmina. As sondas marcadas com
digoxigenina foram detectadas com 0,7 µL anti-digoxigenina-rodamina (Roche ™) mais 19,3
µL de BSA 5% por lâmina. As lâminas contendo os anticorpos para a detecção foram
incubadas em câmara úmida por 1 h a 37 °C. Para a remoção do excesso de anticorpo, foram
realizados três banhos por 5 min cada com 4xSSC/Tween 20 a 0,2% em TA. As lâminas
foram brevemente imersas em 2xSSC e as preparações citológicas foram simultaneamente
montadas e contracoradas com DAPI/Vectashield ® (H-1200). As lâminas foram estocadas a
+ 8 - 10 °C até análise.
2.8. Fotodocumentação
As metáfases foram fotodocumentadas com a utilização do microscópio de
epifluorescência Olympus BX41, equipado com câmera digital de 5M Olympus DP25 pelo
software DP2-BSW. As hibridações detectadas com avidina-FITC foram visualizadas com o
uso do filtro U-MWV (450-480 nm de excitação/500 nm de emissão de corte dicroico/>515
nm) e as hibridações detectadas com antidigoxigenina-rodamina foram visualizadas com o
uso do filtro U-MWG (510-550 nm de excitação/570 nm de corte dicroico/ emissão>590 nm).
As confecções de pranchas, cariogramas e sobreposições FITC/RODAMINA/DAPI foram
realizadas com o uso do software Photoshop SC5.
3. RESULTADOS
Os oito acessos de C. melo analisados nesse trabalho são diploides, 2 n = 24, não
apresentando variação no número cromossômico. A localização e identificação de satélites
pela coloração convencional permitiu a observação de dois pares cromossômicos satelitados
em todos os acessos analisados, exceto no acesso A18, sendo observado apenas um par
cromossômico com satélite (Figura 1).
As medições cromossômicas revelaram variação quanto aos tamanhos cromossômicos
médios do primeiro ao segundo par cromossômico, variando de 1,85 µm para o primeiro par
cromossômico no acesso A18 a 0,78 µm para o último par cromossômico do acesso A26
(Tabela 2). Os cálculos do desvio padrão das médias dos comprimentos totais foram de baixa
magnitude, indicando que as repetições metafásicas apresentavam padrão de condensação
semelhantes entre si, ampliando a confiabilidade dos dados métricos obtidos.
41
Figura 1. Metáfases mitóticas de variedades comerciais de Cucumis melo (2 n = 24). A) A12;
B) A15; C) A17; D) A18; E) A26; F) A22; G) A01; H) A09. Barra = 10µm. As setas indicam
os satélites.
42
Tabela 2. Médias dos comprimentos totais dos cromossomos e desvio padrão em oito acessos
de Cucumis melo.
Crom
Acessos
A01_RN# A9_CE A12_PE A15_AL A17_BA A18_PI A22_MA A26_SE
*CT/SD CT/SD CT/SD CT/SD CT/SD CT/ SD CT/ SD CT/ SD
1 1,59±0,13 1,74±0,12 1,41±0,09 1,36±0,06 1,68±0,13 1,85±0,12 1,72±0,10 1,22±0,15
2 1,51±0,16 1,56±0,15 1,33±0,06 1,27±0,05 1,56±0,16 1,76±0,09 1,59±0,08 1,11±0,11
3 1,43±0,15 1,52±0,13 1,27±0,04 1,21±0,03 1,53±0,18 1,65±0,03 1,47±0,02 1,06±0,07
4 1,38±0,09 1,42±0,13 1,22±0,04 1,18±0,04 1,43±0,14 1,59±0,06 1,41±0,03 1,03±0,07
5 1,33±0,09 1,38±0,09 1,19±0,04 1,14±0,05 1,36±0,16 1,53±0,09 1,35±0,04 1,01±0,06
6 1,30±0,09 1,30±0,10 1,15±0,04 1,11±0,05 1,30±0,16 1,47±0,07 1,31±0,03 0,98±0,06
7 1,27±0,09 1,31±0,13 1,11±0,03 1,09±0,05 1,29±0,15 1,44±0,08 1,26±0,04 0,96±0,06
8 1,23±0,11 1,23±0,11 1,08±0,04 1,06±0,04 1,23±0,14 1,37±0,07 1,22±0,05 0,95±0,06
9 1,19±0,13 1,20±0,12 1,06±0,04 1,02±0,02 1,16±0,09 1,32±0,07 1,18±0,05 0,92±0,05
10 1,16±0,14 1,14±0,13 1,05±0,05 0,99±0,01 1,12±0,08 1,25±0,04 1,13±0,04 0,89±0,04
11 1,11±0,14 1,07±0,11 1,03±0,04 0,94±0,01 1,06±0,06 1,19±0,02 1,06±0,05 0,84±0,05
12 1,02±0,12 1,01±0,12 0,95±0,03 0,87±0,05 0,94±0,08 1,11±0,05 0,98±0,06 0,78±0,04
*CT = Comprimento total; SD = Desvio padrão.
#RN = Rio Grande do Norte; CE = Ceará; PE = Pernambuco; AL = Alagoas; BA = Bahia; PI = Piauí; MA = Maranhão;
SE = Sergipe.
A ANOVA revelou diferença significativa para o tamanho cromossômico médio entre
os acessos (Tabela 3). O agrupamento de Scott-Knott distribuiu os acessos em dois grupos de
médias (Tabela 4). Os acessos A18 e A26 revelaram maiores e menores comprimentos
médios dos cromossomos, respectivamente.
Tabela 3. Resumo da análise de variância para comprimento cromossômico total entre os
acessos de Cucumis melo.
FV GL Quadrado médio (CT)
Acesso 7 0,277320*
Erro 88 0,034107
CV (%) 14,81
Média 1,24
FV = Fonte de variação; GL = Grau de liberdade; CV = coeficiente de variação; CT = comprimento total,
*significativo a 5% pelo teste F.
43
Tabela 4. Comprimento cromossômico total de acessos de Cucumis melo.
Acessos Médias
A01 1,29 a
A09 1,32 a
A12 1,15 b
A15 1,10 b
A17 1,31 a
A18 1,46 a
A22 1,31 a
A26 0,98 b
Letras iguais nas médias não diferem entre os acessos significativamente pelo agrupamento Scott-Knott
(p<0.05).
A dupla coloração com fluorocromos evidenciou blocos heterocromáticos
CMA3+/DAPI
- na região pericentromérica de todos os cromossomos, em todos os acessos
analisados (Figura 2 – 3), sendo os cromossomos menores de difícil visualização (Figura 4).
A heterocromatina rica em GC e restrita a região pericentromérica e centromérica revelou
variações em relação ao tamanho do bloco CMA3+/DAPI
- e intensidade de coloração (Figura
4). Foram evidenciadas regiões ricas em GC em dois pares cromossômicos em constrições
secundárias, revelando o número e a localização de cromossomos satelitados (Figura 3 - 4).
44
Figura 2. Bandamento CMA3/DAPI e sobreposições em metáfases mitóticas de Cucumis
melo (2 n = 24). A-C) A09; D-F) A12; G-I) A15; J-L) A17; M-O) A18. Barra = 10µm. As
setas indicam blocos CMA3+/DAPI
-.
45
Figura 3. Bandamento CMA3/DAPI e sobreposições em metáfases mitóticas de Cucumis
melo (2 n = 24). A-C) A22, D-F) A26; G-I) A01. Barra = 10µm. As setas indicam blocos
CMA3+/DAPI
-.
46
Figura 4. Cariogramas com sobreposições CMA3/DAPI em metáfases mitóticas de Cucumis
melo (2 n = 24). A) A01; B) A09; C) A12; D) A15; E) A17; F) A18; G) A22; H) A26. Barra
10 µm.
A hibridação de sondas de DNAr 45S revelaram quatro sítios de hibridação,
localizados no primeiro e segundo par cromossômico (Figura 5 - 6). Apenas um par
cromossômico revelou sítio de hibridação para sondas de DNAr 5S (Figura 5 - 6). Todos os
acessos apresentaram locus 5S de DNAr no sexto par cromossômico, exceto o acesso A09,
que revelou esse locus no terceiro par cromossômico (Figura 6).
47
Figura 5. Hibridação in situ fluorescente com sondas 45S (verdes) e 5S (vermelho) em
acessos de Cucumis melo (2 n = 24). A) A01; B) A 09; C) A12; D) A15; E) A17; F) A18; G)
A22; H) A26. Barra 10 µm.
48
Figura 6. Cariogramas com sobreposições DNAr 45S (verde) e 5S (vermelho) em metáfases
mitóticas de Cucumis melo (2 n = 24). A) A01; B) A09; C) A12; D) A15; E) A17; F) A18; G)
A22; H) A26. Barra 10 µm.
4. DISCUSSÃO
O gênero Cucumis tem sido amplamente estudado quanto às características
cariotípicas com o uso da coloração convencional, fornecendo informações relevantes acerca
da diversidade interespecífica (TRIVEDI; ROY, 1970; SINGH; ROY, 1974; DANE;
TSUCHIYA, 1976; REMACHANDRAN; SESHADRI, 1986). O número cromossômico varia
entre as espécies, apresentando em sua maioria espécies diploides (2 n = 14 ou 24),
tetraploides (2 n = 48 cromossomos) e hexaploide (2 n = 72 cromossomos) (WANG et al.,
2017). O número cromossômico básico do gênero tem sido considerado como x = 7 ou x = 12,
sendo o último o número cromossômico básico da família Cucurbitaceae para a maioria das
espécies diploides e cultivares de C. melo já analisadas (SINGH; ROY, 1974, DANE;
49
TSUCHIYA, 1976). O número diploide (2 n = 24) foi confirmado em C. melo da variedade
momordica, corroborando com os dados reportados na literatura para a espécie.
Nas variedades momordicas analisadas, o pequeno comprimento dos cromossomos
dificultou o estabelecimento da fórmula cariotípica, sendo difícil medir separadamente braço
curto de braço longo. Ainda assim, houve visualização de um a dois pares de constrições
secundárias diferentes dos resultados já relatados (SINGH; ROY, 1974). A fórmula
cariotípica haploide n = 12: 3m + 9sm foi observada para as variedades momordicas,
evidenciando diferenças quanto aos pares cromossômicos, porém não caracterizando
constrições secundárias (SINGH; ROY, 1974).
Nas variedades momordicas, foi observado variação de 0,98 µm a 1,46 µm no
comprimento total dos cromossomos. Contudo, maior variação foi relatada (1,44 µm a 2,40
µm) em outras variedades do C. melo L (SINGH; ROY, 1974). Há diferentes relatos para a
variação encontrada no comprimento total dos cromossomos, sendo de 1,20 a 2,50 µm
(TRIVEDI; ROY, 1970), e de 1,1 µm a 1,9 µm (REMACHANDRAN; SESHADRI, 1986). A
variação encontrada quanto ao comprimento total dos cromossomos nas variedades de C.
melo pode ser explicada por essa espécie ser derivada de outra espécie de Cucumis, podendo
ter ocorrido translocações (SINGH; ROY, 1974).
A avaliação comparativa entre os acessos estudados permitiu constatar a ocorrência de
um padrão cariotípico dentro da espécie. Foram observadas variações intraespecíficas
apresentando diferenças significativas (P< 0,5) com relação aos tamanhos de comprimentos
totais dos cromossomos. As poucas variações na análise comparativa entre os acessos da
espécie C. melo var. momordica demonstrou alterações na cromatina, que foi dificultada pela
pouca variação cariotípica, com efeitos na identificação dos cromossomos; o uso de
marcadores cromossômicos específicos surge como uma ferramenta útil em C. melo (LIU et
al., 2010).
A quantidade de GC pode variar muito e reflete características significativas na
posição dos genomas das plantas. A presença de blocos CMA3+
na região terminal de alguns
cromossomos, em geral, está relacionada com as regiões organizadoras dos nucléolos
(RON’s), observado nas angiospermas (GUERRA, 2000). Em espécies do gênero Passiflora,
as regiões ricas em GC detectadas pelo fluorocromo CMA3 são observadas apenas em locais
de DNA satélite/45S (MELO et al., 2001; VIANA; SOUZA, 2012, MELO et al., 2014; BELO
et al., 2015). Em algumas espécies do gênero Citrus, foram analisadas a distribuição de DNA
satélite/45S em relação com CMA3 e ambas as sondas hibridaram apenas com CMA3 e os
centrômeros (SILVA et al., 2010).
50
As variedades de C. melo mormordicas apresentaram o padrão de bandas
CMA3+/DAPI
- distribuídos por regiões centroméricas e satelitadas, indicando uma quantidade
elevada de heterocromatina rica em GC. Em comparação com Hoshi et al. (2013), apenas as
regiões centroméricas e satelitadas são ricas GC. Porém, em C. melo o DNA satélite do tipo
CentM se localiza em regiões pericentroméricas (LIU et al., 2010). Assim, através do
bandamento CMA3+ foi possível a identificação dos satélites de forma segura, o que os
tornam bons marcadores citológicos; sendo que neste estudo não foi possível identificar a
localização e número de satélites (constrição secundária) através da coloração convencional,
visto que foi possível a visualização de metáfases, mas de forma imprecisa.
No presente estudo, os sítios de hibridação de sondas de DNAr 45S foram observados
em dois pares cromossômicos e sítios DNAr 5S em um par cromossômico, corroborando com
estudos anteriores (CHEN et al., 1999; LIU et al., 2010; HOSHI et al., 2013; LI et al., 2016).
Em C. sativus, mesmo gênero que o C. melo, pesquisas com a aplicação da FISH usando as
sondas de DNAr 45S e 5S, o resultado encontrado coincide com o trabalho em questão,
obtendo mais um resultado porque consegue identificar em quais cromossomos foram
marcados, tendo em vista, que os cromossomos do C. sativus são maiores que os de C. melo
(KOO et al., 2002). Em outros gêneros como Oryza L. (XIONG et al., 2006) e Lilium L.
(MARASEK et al., 2004) por exemplo, a aplicação da FISH utilizando as sondas de DNAr
45S e 5S, obtiveram os mesmos resultados deste trabalho.
Os sítios de DNAr 5S e 45S são sequências conservadas nos cromossomos e podem
fornecer informações valiosas sobre a evolução do cariótipo e as inter-relações entre espécies,
tendo em vista que foram utilizados marcadores citológicos de C. sativus em C. melo e através
da FISH, mostraram sinais distintos e óbvios nos cromossomos de C. melo, derivados de
genes do genoma de C. sativus, considerados de DNA repetitivo (LIU et al., 2010). Estas
espécies têm relativamente genomas pequenos e são semelhantes em tamanho e ainda há
evidências entre elas de conservação dessas sequências.
Neste trabalho não houve variação com relação ao número e tamanho de sítios de
hibridação das sondas para DNAr 5S e 45S, sendo uma característica também observada em
outros estudos com C. melo, por exemplo, em estudo para mapeamento cromossômico de C.
melo em comparação com C. sativus usando sequências repetitivas, foi encontrado também o
mesmo número e tamanho de sítios (KOO et al., 2010). O mesmo resultado foi encontrado na
caracterização do C. melo através do uso de FISH, o mesmo número e tamanho de sítios
(CHEN et al., 1999; LIU et al., 2010). O DNAr 5S tem sido observado como mais variável,
que a sequência do DNAr 45S, geralmente cada espécie possui uma só sequência de DNAr 5S
51
repetida em tandem muitas vezes em um único par cromossômico ou, menos frequente em
dois ou mais pares (GUERRA, 2004).
Os acessos diploides, deste trabalho, apresentaram o mesmo padrão de distribuição de
DNAr quando comparados com indivíduos da mesma espécie, mas de regiões diferentes, não
diferindo entre elas. Outras espécies diploides analisadas apresentaram três tipos de padrões
de distribuição de DNAr, que forneceram evidências citogenéticas claras sobre a divergência
entre C. melo e espécies silvestres diploides africanas de Cucumis. Os resultados não apenas
mostraram inter-relações entre espécies no gênero Cucumis, mas também que os padrões de
DNAr podem ser usados como marcadores citológicos para a discriminação de espécies
estreitamente relacionadas (LI et al., 2016). O número de sítios de DNAr não está sempre
associado ao nível de ploidia, a exemplo no gênero Solanum, onde tetraploides tem o número
igual de sítios que os diploides (MELO et al., 2011), porém, a relação entre a ploidia e o
número de sítios de DNAr 45S e 5S é associada ao processo de diploidização, visto em
poliploides e neopoliploides (WOLFE, 2001).
5. CONCLUSÕES
A caracterização citogenética clássica e molecular dos acessos de C. melo var.
momordica da UFERSA possibilitou estabelecer que todos os acessos analisados apresentam
o mesmo número cromossômico constante, no entanto, existem variações em relação aos
comprimentos totais dos cromossomos. A distribuição da heterocromatina rica em GC
(CMA3+/DAPI
-) permitiu verificar que essas regiões não são restritas apenas aos satélites,
mas, ao centrômero e regiões pericentroméricas, constatando abundância de GC no DNA
CentM. Com o uso da FISH foi possível verificar a estabilidade cromossômica nestes
marcadores, indicando que os mesmos são ideais para a verificação da estabilidade cariotípica
nesta espécie.
6. AGRADECIMENTOS
Agradeço à UESC (Universidade Estadual de Santa Cruz) pela infraestrutura do
Laboratório de Melhoramento de Plantas (LAMEP) e da Casa de Vegetação, CNPq (Conselho
Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) e FAPESB (Fundação de Amparo à
Pesquisa do Estado da Bahia) pelo apoio financeiro à pesquisa; CAPES (Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) para as bolsas concedidas ao primeiro,
52
terceiro e quarto autores; CNPq pela bolsa concedida à segunda autora; Viviane pela
excelente ajuda nas fotodumentações e na estatística.
53
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BELO, G. O.; SOUZA, M. M.; SOUZA, V. O.; MELO, C. A. F. Reproductive and
cytogenetic characterization in Passiflora sublanceolata. Biologia. v. 70, p. 733-743, 2015.
CHEN, R. Y.; STAUB, J. E.; ADELBERG, W.; JIANG, J. M. Physical mapping of 45S
rRNA genes in Cucumis species by fluorescence in situ hybridization. Can Journ. Bot. v. 77,
p. 389-393, 1999.
COELHO, M. S. E.; BORTOLETTI, K. C. A.; ARAÚJO, F. P.; MELO, N. F. Cytogenetic
characterization of the Passiflora edulis Sims x Passiflora cincinnata Mast. interspecific
hybrid and its parents. Euphytica DOI 10.1007/s10681-016-1704-4. (2016)
DANE, F.; TSUCHIYA, T. Chromosome studies in the genus Cucumis. Euphytica. v.25, p.
367-374, 1976.
FERREIRA, D. F. Programa Sisvar. Software 5.0. UFLA, Lavras, 2003.
GOMES-KLEIN, V. L. Cucurbitaceae. In Checklist das plantas do nordeste brasileiro:
angiospermae e gymnospermae. Ministério da Ciência e Tecnologia, Brasília, 64-66, 2006.
GOMES-KLEIN, V. L.; LIMA, L. F. P.; GOMES-COSTA, G. A.; MEDEIROS, E. S.
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58
CAPÍTULO 3: Organização e Evolução Cariotípica em Híbridos Triplos de Passiflora L.
Rita de Cássia Vital Santos Sanchês, Margarete Magalhães Souza, Cláusio Antônio Ferreira
de Melo, Viviane de Oliveira Souza
RESUMO
Híbridos interespecíficos de passiflora têm sido obtidos e utilizados de diversas formas, seja
na caracterização e melhoramento para a resistência a fatores bióticos e abióticos, a uso na
ornamentação. Contudo, pouca informação está disponível a respeito do estabelecimento e
evolução do germoplasma e recurso genético híbrido, principalmente sobre híbridos com mais
de dois genomas na sua constituição cariotípica. Neste âmbito o objetivo do presente trabalho
foi obter, confirmar e caracterizar a organização cariotípica de híbridos triplos artificiais
oriundos de espécies do gênero Passiflora, visando esclarecer as modificações e estabilidade
cromossômica. Para isso foram cruzados três genótipos híbridos HD25 (Passiflora coccinea x
P. hatschbachii) com três espécies distintas: P. cincinnata, P. thollozani e P. mucronata,
obtendo-se três híbridos triplos (HD28, HD29 e HD30). Os híbridos foram confirmados por
hibridação genômica in situ (GISH) que permitiu a visualização de um conjunto
cromossômico de uma espécie progenitora. Todos os híbridos triplos foram confirmados pela
GISH, a qual permitiu também a observação de um cromossomo com recombinação entre P.
coccinea e P. hatschbachii. A descrição dos híbridos permitiu a indicação deste germoplasma
ao uso como ornamental, exceto o híbrido HD28, o qual não floreceu durante o estudo. A
localização da hetercromatina rica em GC, dos marcadores cromossômicos para DNAr 45S,
5S e telomérico indicaram estabilidade cromossômica em relação tanto a estrutura quanto em
número de cromossomos homeólogos de cada complemento. A localização e análise de
elementos repetitivos dispersos indicaram que esses não são marcadores adequados para a
análise da herança em híbridos. Contudo, a análise dos elementos CL15 e CL86 reveloram
variações na distribuição em relação à espécie P. edulis, utilizada no isolamento destes
elementos, sugerindo retração ou expansão genômica.
Palavras-chave: Citogenética Molecular, Genômica, DNA Repetitivo, FISH, GISH.
59
ABSTRACT
Passiflora interspecific hybrids have been obtained and used in several ways, either in
characterization and improvement for resistance to biotic and abiotic factors, for use in
ornamentation. However, little information is available regarding the establishment and
evolution of germplasm and hybrid genetic resource, especially on hybrids with more than
two genomes in their karyotypic constitution. In this context, the objective of the present work
was to obtain and characterize the triple hybrid karyotype, a result of the crossing between
species of the genus Passiflora. Three hybrid genotypes HD25 (Passiflora coccinea x P.
hatschbachii) were crossed with three distinct species: P. cincinnata, P. thollozani and P.
mucronata, yielding three triple hybrids (HD28, HD29 and HD30). Hybrids were confirmed
by genomic in situ hybridization (GISH) that allowed the visualization of a chromosomal set
of one of the progenitor species. Hybrids were confirmed by genomic in situ hybridization
(GISH) that allowed the visualization of a chromosomal set of a parent species. All triple
hybrids were confirmed by GISH, which also allowed the observation of a chromosome with
recombination between P. coccinea and P. hatschbachii. The description of the hybrids
allowed the indication of this germplasm to be used as ornamental, except the hybrid HD28,
which did not flower during the study. The localization of GC rich heterchromatin from
chromosomal markers to 45S, 5S and telomeric DNAs indicates chromosomal stability in
relation to both the structure and number of homeopathic chromosomes of each complement.
The location and analysis of scattered repetitive elements indicates that these are not suitable
markers for the analysis of the inheritance in hybrids. However, the analysis of the CL15 and
CL86 elements revealed variations in the distribution in relation to P. edulis species, used in
the isolation of these elements, suggesting retraction or genomic expansion.
Key words: Molecular Cytogenetics, FISH, GISH, Genomics, Karyotype Evolution.
60
1. INTRODUÇÃO
A obtenção de híbridos interespecíficos envolvendo espécies do gênero Passiflora é
uma prática cada vez mais explorada no melhoramento genético, gerando plantas voltadas a
aplicações diversas, como por exemplo, o melhoramento da resistência a doenças e pragas, e a
obtenção de novas cultivares de uso ornamental (ABREU et al., 2009). Ao longo das últimas
décadas, diversos trabalhos almejando a obtenção e caracterização de híbridos F1 com elevada
heterose foram realizados, gerando germoplasmas segregantes para a ornamentação de
interiores e exteriores. Assim foi possível a obtenção de novas cultivares como P. ‘Alva’, P.
‘Aninha’, P. ‘Priscilla’ (SANTOS et al., 2012), P. ‘Gabriela’ e P. ‘Bella’ (BELO et al.,
2018). Adicionalmente, híbridos também foram obtidos por cruzamentos entre P. gardneri vs.
P. alata, P. watsoniana vs. P. alata, P. watsoniana vs. P. gardneri e P. gardneri vs. P.
gibertii (CONCEIÇÃO et al., 2011). A realização de cruzamentos interespecíficos com
espécies de Passiflora têm gerado genótipos com flores de cores e formatos intrínsecos,
levando a sua utilização para o agronegócio de plantas ornamentais (SANTOS et al., 2011),
sendo importante a identificação de plantas favoráveis para produção de híbridos heteróticos
(VIANA et al., 2007).
O primeiro híbrido produzido envolvendo espécies do gênero Passiflora ocorreu em
1819, através do cruzamento de P. caerulea e P. racemosa, obtendo o híbrido denominado P.
‘Violacea’, segundo a fórmula de hibridação descrita por Jean-Louis-Auguste-Loiseleur-
Destongchamps, em 1928 (KING, 2011). Em Passiflora a obtenção de híbridos
interespecíficos, através da hibridação simples, é fácil devido às fracas barreiras reprodutivas
que existem entre as espécies do gênero, assim, verifica-se a importância das relações
citogenéticas e filogenéticas entre as espécies genitoras para o sucesso da hibridação (ABREU
et al., 2009; SANTOS et al., 2012).
A existência de híbridos naturais em Passiflora é sugerida, uma vez constatada a
origem de algumas espécies do gênero por meio da hibridação como rota de especiação, como
por exemplo, a origem de P. edulis f. flavicarpa, que não é totalmente esclarecida, pois
supõem-se que ela foi originada do cruzamento natural ou por mutação entre entre P. edulis e
P. ligularis Juss (POPE, 1935; VANDERPLANK, 2000). Por outro lado, não apenas os
híbridos naturais têm papel na análise e inferências evolutivas do gênero, uma vez que, as
obtenções de híbridos artificiais são ótimas estratégias de estudo e, também no uso do recurso
genético vegetal (SANTOS et al., 2012; BELO et al., 2018; CONCEIÇÃO et al., 2011).
61
Em Passiflora a hibridação torna-se um requisito importante para produção de plantas,
considerando a grande variabilidade genética encontrada nas espécies. Através desse
mecanismo, que é responsável pelo fluxo gênico entre indivíduos que possuem complexos
gênicos diferentes, podem ser interespecífica e intraespecífica, e tem como consequência
dessa variabilidade à recombinação (MAROSTEGA, 2014).
Híbridos triplos de Passiflora obtidos através dos cruzamentos F1 (P. edulis f.
flavicarpa x P. coccinea) x P. edulis f. flavicarpa, F1 (P. edulis f. flavicarpa x P. setacea) x P.
edulis f. flavicarpa e F1 (P. coccinea x P. setacea) x P. edulis f. flavicarpa, tem como
objetivo aumentar o grau de resistência a doenças por meio dessas hibridações
interespecíficas, assim se faz necessário conhecer melhor o germoplasma das espécies quanto
a sua diversidade e compatibilidade genética, bem como sua variabilidade (JUNQUEIRA et
al., 2005).
Em híbridos de Passiflora, os estudos citogenéticos envolvendo híbridos F1 oriundos
do cruzamento de duas espécies genitoras ainda são pouco frequentes. Contudo,
modificações cromossômicas como, por exemplo, a eliminação cromossômica e translocações
têm sido relatadas envolvendo germoplasma híbrido (SANTOS et al., 2012) e retrocruzado
(MELO et al., 2017), indicando mudanças genômicas que podem estar associadas ao
estabelecimento e fixação do híbrido mesmo em condições primárias de evolução (LIM et al.,
2004).
Técnicas citogenéticas moleculares têm possibilitado a análise cariótipica de espécies
e híbridos do gênero Passiflora com o uso da hibridação in situ fluorescente (FISH) (MELO;
GUERRA 2003; SOUZA et al., 2010; COELHO et al., 2016; MELO et al., 2017: SILVA et
al., 2017 in press) e hibridação genômica in situ (GISH) (MELO et al., 2015; COELHO et al.,
2016; MELO et al., 2017; SILVA et al., 2017 in press). Essas técnicas permitiram o
conhecimento do modo de organização da cromatina, tanto na sua constituição quanto na
quantificação, e também em regiões heterocromáticas e sítios para DNA repetitivo em
espécies e híbridos de Passiflora (MELO et al., 2017; SILVA et al., 2017 in press).
O presente trabalho objetivou obter, confirmar e caracterizar a organização cariotípica
de híbridos triplos artificiais oriundos de espécies do gênero Passiflora, visando esclarecer as
modificações e estabilidade cromossômica.
62
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Material Vegetal e Hibridações Interespecíficas
A hibridação interespecífica entre as espécies P. coccinea e P. hatschbachii resultou
na obtenção do híbrido simples F1 HD25 (SOUZA, 2018). Através do cruzamento com
genótipos das progênies HD25 com as espécies de P. cincinnata, P. tholozanii e P. mucronata
foram obtidos três híbridos triplos denominados de HD28, HD29 e HD30, respectivamente.
Esses cruzamentos foram realizados no período de maio de 2016 a outubro de 2016 (Tabela
1), estando às matrizes mantidas no Banco Ativo de Germoplasma de Passifloras (BAG-
passifloras) da Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC), Ilhéus, Bahia, Brasil (longitude
39° 10' W, latitude 14° 39' S, altitude 78 m).
As hibridações foram realizadas de acordo com o período de florescimento de cada
espécie. O híbrido HD25 participou como genitor materno dos cruzamentos interespecíficos,
pelo fato de apresentar antese diária e diurna, facilitando a condução das hibridações
(SOUZA, 2018). As espécies P. cincinnata, P. tholozanii e P. mucronata foram utilizadas
como genitores masculinos, por apresentarem características contrastantes e, mesmo número
cromossômico. Um dia antes do florescimento, os botões florais foram protegidos com sacos
de papel para não haver nenhum tipo de polinização indesejada, seguindo de emasculação
antes da antese. Foram realizadas as polinizações manuais, procedendo-se com a inoculação
do pólen das espécies no estigma dos híbridos F1 com o auxílio de pinça. Os botões
polinizados foram novamente protegidos e, após cinco dias, foi apurado se houve fecundação
do botão floral. Os frutos resultantes das hibridações foram protegidos com tela de náilon até
que eles caíssem (BRUCKNER; OTONI, 1999). Foi verificado o número fruto obtidos, e o
número de total de sementes. As sementes foram retiradas dos frutos, em seguida lavadas e
secas à temperatura ambiente (TA) e algumas armazenadas a 10º C até utilização.
63
Tabela 1. Espécies de Passiflora utilizadas nos cruzamentos interespecíficos.
Espécie Subgênero Secção Acesso Localização Número cromossômico diploide
Passiflora hatschbachii
Cervi
Passiflora Setacea 446 Leopoldina MG 2n = 18 (MELO et al., 2014)
P. coccinea Aubl. Passiflora Coccinea 505 Pontes de Lacerda
MT
2n = 18 (BEAL, 1971; MAYEDA, 1997; MELO et al.,
2001)
P. cincinnata Mast. Passiflora Passiflora 504 Itabuna BA 2n = 18 (HEITZ, 1926; BOWDEN, 1945; BECKETT,
1960)
P. mucronata Lam. Passiflora Granadillastrum 509 Ilhéus BA 2n = 18 (GUERRA, 1986; MELO et al., 2001; SOUZA et
al., 2003)
P. tholozanii Sacco Distephana - 133 Embrapa Amazônia
Ocidental Manaus
AM
2n = 18 (OLIVEIRA, 2017)
64
2.2. Germinação das Sementes e Condições de Cultivo
A germinação das sementes dos híbridos triplos foi realizada em bandejas de isopor
contendo terra vegetal, as quais foram mantidas em casa de vegetação. O número de sementes
postas para germinar correspondeu à quantidade de 10 - 20 sementes. Após o surgimento da
folha verdadeira, as plântulas foram transferidas para sacos de polietileno preto, com
capacidade de 0,5 L. Quando chegaram a uma altura de aproximadamente 0,5m de
comprimento foram transferidos para vasos com capacidade de 25 L contendo solo. Os
híbridos foram propagados por estaquia, as quais foram retiradas da parte intermediária dos
ramos, preparadas e padronizadas com dois nós e duas folhas reduzidas à metade de sua área,
seccionadas em bisel e imersas em auxina sintética (ácido indol-3 butírico – AIB).
As estacas foram estaqueadas em sacos de polietileno com capacidade de 1,5 L,
contendo areia lavada para enraizamento, sendo irrigadas diariamente. Os híbridos foram
conduzidos em sistema de espaldeira vertical, com mourões de 2,5 m de altura e fio de arame
1,8 m do solo, utilizando-se o espaçamento de meio metro entre as plantas. Foi realizada poda
quando necessário e a adubação a cada 30 dias de N4P14K8 num total de 225,85 mg [66,7 mg
de potássio, 44,40 mg de ureia e 114,75 mg de sulfato de fósforo] distribuídos nos vasos
igualmente, durante todo o experimento.
2.3. Descrição Morfológica dos Híbridos
A descrição morfológica utilizada para esta avaliação foi realizada com base em
características incluídas nos descritores para plantas ornamentais, confeccionados pelo
Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA, 2008) e, alguns com base no
manual prático da EMBRAPA (JESUS et al., 2015). As características morfológicas avaliadas
foram as seguintes: diâmetro da flor (DF), diâmetro da corona (DCO), largura da pétala
(LPE), comprimento da pétala (CPE), largura da sépala (LSE), comprimento da sépala (CSE),
largura da bráctea (LBR), comprimento da bráctea (CBR), tamanho dos primeiros filamentos
da corona (TF1), tamanho dos segundos filamentos da corona (TF2), tamanho dos terceiros
filamentos da corona (TF3), comprimento do pedúnculo floral (CPED), comprimento do
androginóforo (CA), comprimento de folha (CF), largura de folha (LF), área foliar (AF),
diâmetro do caule (DC), comprimento do entrenó do ramo principal (CEN); profundidade do
limbo foliar (PFL): 1) profunda, 2) média, 3) ausente; antocianina no filete (AF): 1) forte, 2)
65
média, 3) fraca, 4) ausente; antocianina no estilete (AE): 1) forte, 2) média, 3) fraca;
bandamento na corona (BAND): 1) presente, 2) ausente.
Quanto à caracterização morfológica, esta foi relacionada à coloração das folhas
baseada na carta de cores de Munsell para tecidos vegetais (MUNSELL, 1977) e sua
nomeação de acordo com códigos de letra e números.
2.4. Preparação Cromossômica
Raízes com aproximadamente um cm de comprimento foram coletadas das estacas. As
radículas foram pré-tratadas com a solução antimitótica 8-hidroxiquinolina (Merck®) a 0,002
M por 1hora em TA mais 21 horas em geladeira, lavadas com água destilada durante 5 min e
em seguida fixadas em Carnoy (etanol:ácido acético glacial, 3:1 (v/v), (Merck®); Johansen,
1940) durante 3 horas em TA e estocadas a -20ºC até a hora da preparação cromossômica. As
raízes foram lavadas em água destilada durante 5 min por 2x e incubadas em 50 µL de
solução enzimática contendo celulase a 2% (Sigma®) e pectinase a 20% (Sigma®), por 1
hora e 20 min a 37º C. As raízes foram lavadas com água destilada durante 5 min por 2x e
maceradas em 15 µL de ácido acético glacial a 45% (Merck®). Em seguida, o material
citológico foi espalhado com auxílio de agulha e pressionado levemente entre papel filtro para
espalhamento dos cromossomos. As lamínulas foram removidas após congelamento em
nitrogênio líquido e, as lâminas secas ao ar, depois estocadas em freezer -20ºC até a aplicação
das técnicas de CMA3/DAPI, FISH e GISH
2.5. Coloração com Fluorocromos CMA3 e DAPI
Lâminas envelhecidas por no mínimo três dias foram submetidas à dupla coloração
CMA3/DAPI, de acordo com o protocolo descrito por Guerra e Souza (2002), com
modificação na concentração de CMA3. Foi aplicado 10 µL de CMA3 (0,25 mg-1) sobre a
lâmina durante uma hora. A lâmina foi lavada em água destilada e seca ao ar. Em seguida foi
aplicado 10 µL de DA (0,1 mg-1) durante 30 minutos. A lâmina foi lavada em água destilada
e seca ao ar. Foi aplicado 10 µL de DAPI (0.5 mg-1), por 30 minutos. As lâminas foram
lavadas, secas e montadas com 15 µL glicerol/Macllvaine (1:1 v/v) + 2.5 mM MgCl2,
utilizando lamínulas 20 x 20 mm. As lâminas foram envelhecidas novamente, por três dias,
antes da análise microscópica. As imagens foram capturadas em microscópio de
epifluorescência Olympus BX41, equipado com câmara digital Olympus DP25 5 megapixels
66
e, com o software DP2-BSW. Para visualização do DAPI foi utilizado o filtro U-UTH (330-
385 nm de excitação/400 nm de emissão de corte dicroico/>420 nm) e para visualização do
CMA3 foi utilizado o filtro U-MWV (450-480 nm de excitação/500 nm de emissão de corte
dicroico/>515 nm). Para sobreposições das imagens e confecção das pranchas, foi utilizado o
software Adobe Adobe® Photoshop CS5.
2.6. Extração do DNA e Produção das Sondas para GISH e FISH
Para o procedimento da GISH foi realizada a extração do DNA genômico dos
genitores de acordo com o protocolo proposto por Doyle e Doyle (1990), com algumas
modificações (MELO et al., 2015), sendo coletadas folhas jovens em duplicata, maceradas em
nitrogênio líquido, colocadas em tampão de extração CTAB 2% [NaCl a 1,5 M; EDTA a 20
mM; Tris-HCl a 100 mM; BMercaptoetanol a 0,2%]. Os ácidos nucleicos foram isolados com
solução (24:1) clorofórmio: álcool isoamílico e a ressuspensão do DNA foi realizada em
tampão TE [Tris a 10 mM; EDTA a 1 mM]. A concentração do DNA genômico extraído foi
inferido com base na comparação com 100 ng de DNA lambda em eletroforese em gel de
agarose 1% (Pronadisa), corado com SYBR safe (Invitrogen®). Aproximadamente 20 μg de
DNA genômico dos genitores em um volume final de 200 μL foi fragmentado com o auxílio
de um sonicador (Qsonica, Q125), com a programação para a amplitude 40%, 2 segundos
ligado e 2 segundos desligado, com o tempo total de 5 minutos (JAUHAR; PETERSON,
2006). O tamanho dos fragmentos foi detectado em gel de agarose 2% (Pronadisa) utilizando
como parâmetro o marcador ladder 100 pb (NEB, new england biolabs). Posteriormente, foi
realizada a purificação do DNA fragmentado com 2% do volume final de acetato de sódio a 3
M mais 200% do volume final de etanol P. A. O material foi colocado a -20 ºC overnight e,
no dia seguinte, centrifugado por 10 min a 14.000 rmp a 20ºC para a eliminação do
sobrenadante e posterior secagem em TA por no mínimo 1 hora. A ressuspensão do pellet foi
realizada com Tris (10 mM pH 8.0) com o volume necessário para concentração final de 1,1
μg/μL de DNA clivado. A marcação da sonda dos genitores maternos (HD25 141, 173, 208)
foi realizada por Nick translation com Digoxigenina-11-dUTP (Roche Diagnostics®) e dos
genitores paternos (P. cincinnata, P. tholozanii e P. mucronata) com Biotina-16-dUTP, na
concentração final de 1 μg de DNA clivado, seguindo o protocolo proposto pelo fabricante.
Para a FISH foram usados os primers para a amplificação dos sítios de DNAr 45S,
DNAr 5S, DNA telomérico e DNA repetitivo (elementos transponíveis). Os primers e as
moléculas marcadoras das sondas para FISH seguiram de acordo com a tabela 2. As sondas
67
foram marcadas via Nick translation, com concentração final de 1 μg de DNA clivado,
seguindo o protocolo proposto pelo fabricante.
68
Tabela 2. Caracterização das sondas e primers utilizados no mapeamento cromossômico.
Espécie Sonda Primers (5’-3’) Sonda marcada
Referência
P. edulis DNAr 45S F: GGCTGAATCTCAGTGGATCG
R: GCTGTCGGTGGACTG CTC
biotina-16-dUTP Silva et al.,
2017
P. edulis DNAr 5S F: GTGCGATCATACCAG C(AG)(CT)TAATGCACCGG
R: GAGGTGCAACACGAGGACTTCCCAGGA GG
digoxigenina-11-dUTP Melo e
Guerra, 2003
HD13* Telomérica F: AAATCCCAAATCCCAAATCCCAAATCCCAAATCCCAAATCCC
R: TTTAGGGTTTAGGGTTTAGGGTTTAGGGTTTAGCGTTTAGG
digoxigenina-11-dUTP Belo et al.,
2015
P. edulis Ty3/Gypsy/
Chromovírus
F: AGGGAGCAGCAGTATTTTCG
R: GCTTGTCTCGGAGCGTTT
biotina-16-dUTP Silva, 2017
P. edulis Ty1/Gypsy/
Maximus-
SIRE
F: AGCTGTGTTAACGGCTTCAG
R: ACTTGGGCATGCTAGTTTTG
biotina-16-dUTP Pamponét,
2017
* Passiflora sublanceolata x P. foetida (Santos et al., 2012)
69
2.7. Aplicação de FISH e GISH
O tratamento das lâminas seguiu o protocolo para FISH proposto por Schwarzacher e
Heslop-Harrison (2000) e Souza et al. (2010), com modificações realizadas por Melo et al.
(2015). As lâminas com as metáfases mitóticas foram secas em estufa a 37 °C por 1 h e logo
após foi aplicado de 50 μl de RNase (Sigma®) a 1 μg/mL em tampão 2xSSC (cloreto de sódio
a 0,3 M, Sigma®; citrato de sódio a 0,03 M, Sigma®) nas mesmas, as quais foram incubadas
em câmara úmida por 1 h a 37°C. As lâminas foram imersas em 2X SSC em TA, duas vezes
por 5 min cada; 50 μL de HCl a 10 mM foi adicionado sobre as metáfases por 5 min, e após
retirada do HCl, foi adicionado 50 μL de pepsina (Sigma®) [pepsina a 10 mg/mL; HCl a 10
mM (1:100 v/v)] e as lâminas foram incubadas em câmara úmida por 20 min a 37°C. As
lâminas foram lavadas em 2xSSC, em TA, duas vezes por 5 min cada, em plataforma
agitadora a 120 rpm (Biomixer, Mos-1), imersas em paraformaldeido a 4% em TA por 10
min, e novamente lavadas em 2xSSC duas vezes por 5 min cada. O material citológico foi
desidratado em etanol 70% e etanol 96% por 5 min cada, para imediata aplicação da técnica.
Após a secagem das lâminas em TA por 30 min, foi adicionada a mistura de hibridação com o
volume final de 15μl, sendo formamida 50% (Sigma®), dextran sulfato 10% (Sigma®),
2xSSC, SDS 0,13% (Dodecil sulfato de sódio) (Bioagency).
Para a FISH, foram utilizados 50 ng das sondas. Para GISH, foram utilizados 33 ng de
cada sonda no mix de hibridação. A mistura de hibridação foi aquecida a 75 °C por 10 min
em termociclador (Eppendorf, Mastercycler) e transferida para gelo por 5 min. As lâminas
contendo a mistura de hibridação foram desnaturadas em termociclador contendo um
adaptador para lâminas (Techne, TC-412) a 75 °C por 10 min e, incubadas overnight a 37 °C
em câmara úmida. Após a hibridação, as lâminas foram imersas em 2xSSC em TA por 5 min
para a remoção das lamínulas. Os banhos pós-hibridação foram realizados em banho Dubnoff
(Quimis, 9226ML), a 42 ºC, consistindo em duas imersões em 2XSSC por 5 min cada, duas
em 0,1xSSC por 5 min cada, e mais duas imersões em 2xSSC por 5 min cada. As lâminas
foram imersas em 4xSSC/Tween 20 a 0,2% (Sigma®) em TA por 5 min e tratadas com 50μl
de BSA (Sigma) a 5%. As sondas marcadas com biotina foram detectadas com 0,7 μl de
avidina-FITC (Vector®) e as sondas marcadas com digoxinenina foram detectadas com 0,7 μl
anti-digoxigenina-rodamina (Roche) mais 19,3 μL BSA 5% por lâmina. As lâminas contendo
o anticorpo para a detecção foi incubada em câmara úmida por 1 h a 37 °C. Foram realizados
três banhos, por 5 min cada, para a retirada do excesso de anticorpo com 4xSSC/Tween 20 a
70
0,2% em TA. As lâminas foram rapidamente imersas em 2xSSC e logo foram montadas e
contracoradas com Vectashield® Antifade Mounting Medium DAPI (H-1200), estocadas a ±
8 - 10 °C até análise. Com a utilização do microscópio de epifluorescência Olympus BX41
equipado com câmera digital de 5M Olympus DP25, pelo software DP2-BSW as metáfases
foram fotodocumentadas. As hibridações detectadas com avidina-FITC foram visualizadas
com o uso do filtro U-MWB (excitação 450-480nm/dichroic cutoff 500nm/emissão > 515nm).
As hibridações detectadas com anti-digoxigenina-rodamina foram visualizadas com o filtro
U-MWG (excitação 510-550 nm /dichroic cutoff 570nm/emissão > 590nm). Foi detectada a
contracoloração com DAPI através do filtro U-MWU (excitação 330-385nm/dichroic cutoff
400nm/emissão > 420nm). A confecção da prancha e sobreposições FITC/rodamina foi
realizada com o uso do software photoshop SC5.
3. RESULTADOS
3.1. Obtenção e Descrição dos Híbridos Triplos
Foram realizados cruzamentos interespecíficos entre as espécies Passiflora cincinnata,
P. tholozanii e P. mucronata com três genótipos híbridos HD25 (P. coccinea vs. P.
hatschbachii). De todas as vias de cruzamentos testadas apenas os cruzamentos em que o
híbrido HD25 foi receptor do polén resultaram na formação de frutos, sendo que, os
cruzamentos HD25 vs. P tholozanii (HD29) produziu apenas um fruto com 44 sementes,
enquanto que os cruzamentos entre HD25 vs. P. cincinnata (HD28) e HD25 vs. P. mucronata
(HD30) produziram seis frutos cada, com média de 30 e 27 sementes, respectivamente. Cada
plântula oriunda dos cruzamentos apresentou aspecto vigoroso e ausência de clorose. Esses
cruzamentos resultaram no total de 16 plantas híbridas, cujas progênies foram denominadas
de HD28 (8), HD29 (4) e HD30 (4). Sendo posteriormente selecionada pelo vigor, uma única
planta de cada progênie para a condução das caracterizações e análises.
A descrição da morfologia floral foi realizada apenas nos híbridos triplos HD29 e
HD30, pelo fato do híbrido HD28 não apresentar flores ao longo do tempo de
experimentação, não havendo indícios ou relatos de botões florais em nenhuma estação em 14
meses de observação.
Foram observadas com base nos descritores morfológicos florais e vegetativos,
características qualitativas e quantitativas existentes nos híbridos HD29 e HD30. O
bandamento da corona foi o descritor floral mais relevante para a distinção dos híbridos em
71
relação aos seus genitores, sendo que, o HD29 apresentou dois filamentos e o HD30
apresentou três filamentos, onde deram origem às cultivares Passiflora ‘vitalli’ (HD29) e
Passiflora ‘leonel´s’(HD30) (Figura 1) as quais serão registradas na Passiflora Society
International (www.passiflorasociety.org).
Passiflora ‘vitalli’ - apresentou as seguintes características médias: caule cilíndrico de
3.60 cm de diâmetro; entrenó 5.30 cm de comprimento; folha simples, membranácea, com
10.1 cm de comprimento e 7.00 cm de largura, cor verde variando a tonalidade entre verde
escuro e claro (6/8 7.5GY – 3/4 7.5GY); pendúnculo de 9.80 cm de comprimento; flores de
coloração vermelha, com 8.50 cm de diâmetro; pétalas vermelhas de 5,20 cm de comprimento
e 1,20 cm de largura; sépalas vermelhas de 5.00 cm de comprimento e 1.30 cm de largura;
bráctea 3.60 cm de comprimento e 1,80 com de largura; corona com os primeiros filamentos
externos de coloração vermelha de 2.20 cm de comprimento e corona com os segundos
filamentos internos de coloração alternada vermelho e branca de 0.60 cm de comprimento;
forma do limbo foliar ovada, divisão do limbo foliar inteira e ausência de sinus no limbo
foliar; a antocianina no androginóforo, filete e estilete apresentou a cor forte; anteras de
vermelho-claro; estames vermelho; pólen amarelo; estilete vermelho-forte; estigma verde-
claro. Apresentou florescimento apenas no mês de julho/agosto.
Passiflora ‘leonel´s’ - apresentou as seguintes características médias: caule cilíndrico
de 5.50 cm de diâmetro; entrenó 4.26 cm de comprimento; folha simples, membranácea, com
10.1 cm de comprimento e 7.00 cm de largura, cor verde variando a tonalidade entre verde
escuro e claro (6/8 7.5GY – 3/4 7.5GY); pendúnculo de 10.3 cm de comprimento; flores de
coloração vermelha, com 8.50 cm de diâmetro; pétalas vermelhas de 4.00 cm de comprimento
e 0.80 cm de largura; sépalas vermelhas de 3.40 cm de comprimento e 1.10 cm de largura;
bráctea 3.20 cm de comprimento e 1,50 com de largura; corona com os primeiros filamentos
externos de coloração vermelha de 1.40 cm de comprimento, corona com os segundos
filamentos externos de coloração alternada vermelho e branca de 0.80 cm de comprimento e o
terceiro filamento (interno) de cor branco de 0.20 cm de comprimento; forma do limbo foliar
ovada, divisão do limbo foliar inteira e ausência de sinus no limbo foliar; a antocianina no
androginóforo, filete e estilete apresentou a cor forte; anteras de vermelho-claro; estames
vermelho; pólen amarelo claro; estilete vermelho-forte; estigma verde-claro. Apresenta
florescimento contínuo com maior produção de flores (Figura 1 H).
72
Figura 1. Flores das espécies e híbridos de passifloras utilizadas em hibridações triplas
interespecíficas: (A) P. coccinea; (B) P. hatschbachii; (C) HD25; (D) P. cincinnata; (E) P.
tholozanii; (F) P. mucronata; (G) P. caerulea; (H) HD30. Fotos por Rita de Cássia Vital
Santos Sanchês (A, D, G, H). Viviane de Oliveira Souza (C). Cedida por Mauro Peixoto,
www.brazilplants.com (B, E, F).
73
3.2. Identificação Genômica e Confirmação de Genomas em Híbridos
Foi realizada a GISH nos híbridos HD28, HD29 e HD30 com pretenção de identificar
o genoma de, ao menos, uma das espécies progenitoras do híbrido F1 HD25, como parte
constituinte do cariótipo dos híbridos triplos. Desta forma, a identificação de no máximo
cinco cromossomos de uma espécie progenitora confirma positivamente que o híbrido em
análise possui três genomas como parte integrante do seu DNA nuclear (Figura 2 A - C).
Como exemplo, do sucesso na identificação foi possível verificar que o genótipo HD34
(HD25 x P. caerulea) não foi considerado híbrido triplo por possuir dois conjuntos haploides
dos progenitores (P. coccinea e P. hatschbachii) (Figura 2 D).
No híbrido triplo HD28 (HD25 x P. cincinnata), cinco cromossomos com maior
porção do genoma da espécie P. cincinnata foram identificados (Figura 2 A amarelo). Já no
híbrido triplo HD29 (HD25 vs. P. tholozanii), cinco cromossomos com maior proporção
genômica da espécie genitora P. tholozanii foram observados (Figura 1 B verde). No híbrido
triplo HD30 (HD25 vs. P. mucronata) foram identificados cinco cromossomos do genoma da
espécie progenitora P. mucronata (Figura 1 C verde). Apenas um cromossomo recombinado
entre os genomas dos progenitores P. coccinea e P. hatschbachii foi observado no híbrido
triplo HD30 (Figura 2 C seta). Contudo, nos demais híbridos não foram observados
cromossomos recombinados como resultado da meiose do híbrido F1 HD25.
74
Figura 2. Hibridação genômica in situ (GISH) em cromossomos metafásicos em híbridos
triplos interespecíficos de Passiflora e no híbrido F1 HD34, sonda marcada com digoxigenina
e detectada com antidigoxigenina-rodamina (cromossomos amarelos), sondas marcadas com
biotina e detectada com estreptavidina (cromossomos verdes). (A) HD28 evidenciando cinco
cromossomos de P. cincinnata (cromossomos amarelos); (B) HD29 revelando cinco
cromossomos de P. tholozanii (cromossomos verdes); (C) HD30 demonstrando cinco
cromossomos de P. mucronata (cromossomos verdes). A seta indica cromossomo
recombinado. (D) Híbrido F1 HD34 evidenciando genomas de P. coccinea (cromossomos
amarelos) e de P. hatschbachii (cromossomos verdes). Barra = 10 µm.
3.3. Localização da Região Heterocromática Rica em GC
A localização de regiões heterocromáticas foi realizada pela aplicação de
fluorocromos base-específicos CMA3 e DAPI, e revelou regiões heterocromáticas ricas em
GC representadas pelos blocos CMA3+/DAPI
- em constrições secundárias, estendendo-se aos
satélites (Figura 3). Neste caso, foram observados dois pares cromossômicos em todas as
espécies progenitoras e genitoras. Resultado semelhante foi observado em todos os híbridos
triplos analisados, indicando o total de quatro cromossomos satelitados.
75
Figura 3. Coloração com fluorocromos utilizando CMA3 e DAPI para localização de
heterocromatina em progenitores, genitores e híbridos triplos interespecíficos de Passiflora (2
n = 18). (A) P. coccinea, (B) P. hatschbachii, (C) P. cincinnata, (D) P. tholozanii, (E) P.
mucronata (F) HD28, (G) HD29 e (H) HD30. As setas indicam blocos CMA3+. Barra = 10
µm.
76
3.4. Localização de Sequências Genômicas Repetidas
A localização de sequências repetitivas de DNAr 45S via FISH revelou quatro bandas
em dois pares cromossômicos em todas as espécies analisadas. Resultado semelhante foi
observado nos híbridos triplos HD28, HD29 e HD30, onde quatro cromossomos, com sítios
de DNAr 45S, foram observados (Figura 4). Em alguns cromossomos a localização dos sítios
de DNAr 45S ocorreu distante do braço cromossômico contracorado com DAPI, indicando
distenção em constrições sencundárias (Figura 4 A). A localização de sítios de DNAr 5S
revelou apenas um par cromossômico com marcação tanto nas espécies utilizadas nas
hibridações quanto nos híbridos triplos analisados (Figura 4). A localização nas regiões
teloméricas evidenciou a presença de sequências teloméricas restritas a porção terminal de
todos os cromossomos do germoplasma analisado (Figura 5).
A localização dos dois tipos de sequências de DNA repetitivo, CL15
Gypsy/Chromovírus e CL86 Gypsy/Maximus-SIRE, isolados da espécie comercial P.edulis
permitiu a identificação segura destes elementos repetitivos no genoma das espécies e
consequentemente nos híbridos triplos analisados (Figuras 6 e 7). O elemento repetitivo CL15
Gypsy/Chromovirus (Figura 6) apresentou menor abundância em relação ao elemento
repetitivo CL86 Gypsy/Maximus-SIRE (Figura 7) em relação ao número de sítios de
hibridação. Contudo, foi observado que tanto o número, quanto a intensidade desses sítios de
DNA repetitivo, influencia na condensação cromossômica.
77
Figura 4. Hibridação in situ fluorescente (FISH) com sondas para sítios de DNAr 5S e DNAr
45S em progenitores, genitores e híbridos triplos interespecíficos de Passiflora (2 n = 18). (A)
P. coccinea, (B) P. hatschbachii, (C) P. cincinnata, (D) P. tholozanii, (E) P. mucronata (F)
HD28, (G) HD29 e (H) HD30. Setas vermelhas indicam sítios de hibridação de DNAr 5S e
setas brancas apontam sítios de hibridação de DNAr 45S. Barra = 10 µm.
78
Figura 5. Hibridação in situ fluorescente (FISH) com sondas para sítios teloméricos em
progenitores, genitores e híbridos triplos interespecíficos de Passiflora (2 n = 18). (A) P.
coccinea, (B) P. hatschbachii, (C) P. cincinnata, (D) P. tholozanii, (E) P. mucronata (F) HD
28, (G) HD29 e (H) HD30. Barra = 10 µm.
79
Figura 6. Hibridação in situ fluorescente (FISH) de retrotransposons LTR de cromossomos
metafásicos em progenitores, genitores e híbridos triplos interespecíficos de Passiflora (2 n =
18) usando CL15 Gypsy/Chromovírus. (A) P. coccinea, (B) P. hatschbachii, (C) P.
cincinnata, (D) P. tholozanii, (E) P. mucronata (F) HD28, (G) HD29 e (H) HD30. Barra = 10
µm.
80
Figura 7. Hibridação in situ fluorescente (FISH) de retrotransposons LTR de cromossomos
metafásicos em progenitores, genitores e híbridos triplos interespecíficos de Passiflora (2 n =
18) usando CL86 Gypsy/Maximus-SIRE. (A) P. coccinea, (B) P. hatschbachii, (C) P.
cincinnata, (D) P. tholozanii, (E) P. mucronata (F) HD28, (G) HD29 e (H) HD30. Barra = 10
µm.
81
4. DISCUSSÃO
A obtenção de híbridos de Passiflora têm sido um método amplamente explorado no
melhoramento genético de Passiflora, tendo em vista o uso da variabilidade para a formação
de novas combinações em descritores florais e vegetativos em plantas híbridas (ABREU et al.,
2009; SANTOS et al., 2012; BELO et al., 2018). Em passifloras, a obtenção de híbridos F1 e
retrocruzados têm sido o modo mais comum para gerar germoplasma aplicável à
ornamentação (ABREU et al., 2009; SANTOS et al., 2012; MELO et al., 2014; BELO et al.,
2018). Contudo, a obtenção e, principalmente, a caracterização genética de híbridos triplos
têm sido fato inexplorado no gênero.
No presente trabalho a obtenção de híbridos triplos de Passiflora contendo três
genomas de espécies silvestres em sua constituição genômica foi realizada com sucesso.
Foram obtidos três híbridos triplos denominados HD28, HD29 e HD30, resultado do
cruzamento entre um genótipo híbrido F1 HD25 (P. coccinea x P. hatschbachii) com três
espécies distintas P. cincinnata, P. tholozanii e P. mucronata, respectivamente.
A hibridação interespecífica é favorecida pelas fracas barreiras reprodutivas entre
espécies, principalmente quando as espécies são taxonomicamente próximas. Neste estudo, as
espécies P. cincinnata e P. mucronata são da mesma série botânica (Passiflora) que as
espécies P.coccinea e P. hatschbachii (progenitoras dos híbridos triplos), o que,
provavelmente, favoreceu a obtenção do germoplasma híbrido relatado neste trabalho.
Contudo, apesar de P. tholozanii ser de série botânica distinta (Distephana) das espécies
progenitoras, o uso da mesma como genitora do híbrido triplo permitiu a obtenção de um
genótipo em potencial. Neste caso, a compatibilidade cromossômica numérica já relatada
entre P. tholozanii pode ter sido um fator crucial para o sucesso no uso desta espécie como
genitora do híbrido triplo HD29. Adicionalmente, a espécie P. tholozanii compartilha uma
sequência repetitiva semelhante a P. coccinea, sugerindo hibridação ou, o fato de ambos
compartilharem o mesmo ancestral comum (OLIVEIRA, 2017). No estudo realizado com
espécies comerciais e silvestres de Passiflora foi verificada alta compatibilidade de algumas
combinações híbridas sendo promissoras para programas de melhoramento (OCAMPO et al.,
2016).
Semelhanças cromossômicas numéricas entre espécies têm sido um importante fator
relacionado à obtenção de híbridos F1 (SANTOS et al., 2012; BELO et al., 2018). Entretanto,
o número cromossômico distinto permitiu o retrocruzamento entre híbridos F1 e o genitor
82
materno (P. sublanceolata), possibilitando a obtenção de genótipos com número
cromossômico desbalanceado (MELO et al., 2017). Neste aspecto, não apenas questões
taxonômicas devem ler levadas em consideração na escolha de espécies aplicadas em
hibridações, mas também características cromossômicas e filogenéticas. No presente trabalho,
o número cromossômico tem sido o mesmo das espécies envolvidas nas hibridações, quando
da obtenção do hibrido F1 HD25. Esse fato pode levar a hipótese de que poucas
irregularidades meióticas envolvendo a formação de gametas não reduzidos podem estar
associadas à meiose do híbrido HD25. Entretanto, apenas a análise meiótica pode refutar ou
corroborar essa ideia, revelando dados referentes a compatibilidade entre cromossomos
homeológos (LAVINSCKY et al., 2017).
Dos cruzamentos artificiais entre um híbrido F1 e espécies de Passiflora L., sendo
eles: HD25 vs. P. cincinnata, HD25 vs. P. tholozanii e HD25 vs. P. mucronata foram
desenvolvidos os novos híbridos triplos interespecíficos de Passiflora: P. ‘vitalli’ e P.
‘leonel’s’, os quais apresentam características relevantes para serem utilizados no mercado
ornamental. Flores de coloração vermelha intensa e forte; flores com um bom período de
tempo abertas, aproximadamente 12h de duração; floração contínua (P. ‘leonel’s’) e a
presença ou não de bandamento na corona.
Na maioria das espécies, as flores de Passiflora apresentam autoincompatibilidade,
que favorecem a fecundação cruzada (RÊGO et al., 1999), contudo, o maior percentual de
germinação não implica em obtenção de maior quantidade de plântulas ou produção de
descendentes. Estes fatores podem estar relacionados à incongruência devido a barreiras pós-
fertilização, como a morte do embrião a partir de degeneração do endosperma e a esterilidade
total ou parcial dos híbridos (FREITAS et al., 2015), o que pode explicar a ausência de flores
no híbrido triplo HD28, mesmo pertencendo ao mesmo gênero, subgênero e secção
Passiflora.
Apesar da ausência de anormalidades fenotípicas, o híbrido triplo HD28 não floresceu
em nenhum momento da condução do presente trabalho. Por ser considerada uma planta anual
a ausência de floração não era fato esperado. Contudo, apesar da estabilidade cromossômica
numérica e nos marcadores cromossômicos utilizados, a floração ausente pode ser resultado
de mudanças nos padrões de expressão de características comumente relatados em híbridos.
Essas alterações ocorrem como resultado das diferenças gênicas e de expressão alélica entre
as espécies utilizadas na obtenção de híbridos, mesmo quando são espécies filogeneticamente
próximas (LIM et al., 2004).
83
A utilização da hibridização genômica in situ foi utilizada para a identificação de um
genoma de uma espécie genitora do híbrido F1 HD25. Com a identificação de cinco
cromossomos das espécies genitora do híbrido F1 é possível confirmar que o híbrido em
análise é triplo. De fato, o híbrido F1 HD25 possui número diploide 2 n = 18 cromossomos,
sendo n = 9 cromossomos da espécies P. coccinea juntamente com n = 9 cromossomos da
espécie P. hatschbachii. A meiose deste híbrido resultará em cinco e quatro cromossomos de
cada espécie, segundo os princípios de segregação independente, isso desconsiderando a
recombinação entre homeólogos. Neste sentido, identificar cinco cromossomos do progenitor
nos híbridos obtidos no presente estudo certifica a composição genômica tripla dos genomas.
No nosso trabalho os híbridos triplos apresentaram o padrão quantitativo esperado:
50% do genoma de duas espécies progenitoras (P. coccinea e P. hatschbachii) em conjunto
com 50% do genoma de uma espécie utilizada como genitora: P. cincinnata ou P. tholozanii
ou P. mucronata, no caso de HD28, HD29 e HD30. Contudo, a GISH possibilitou a
identificação de cinco cromossomos da espécie progenitora, o que representa 27,77% do
genoma desta espécie, exceto no caso do híbrido triplo HD30 que revelou um cromossomo
recombinado entre os genomas das espécies P. coccinea e P. hatschbachii, como resultado da
meiose do híbrido HD25. A GISH têm se mostrado eficiente na identificação de cromossomos
recombinados de Passiflora, mesmo em cromossomos pequenos, como foi observado em
híbridos retrocruzados (MELO et al., 2017). Cromossomos recombinados em híbridos, apenas
têm sido observados em híbridos retrocruzados, mas apesar de não terem sido observados em
híbridos de gerações posteriores a F1, já foram observados em pareamentos entre
cromossomos homeólogos na meiose, o que favorece a recombinação (LAVINSCKY, 2016).
A localização da heterocromatina rica em GC utilizando fluorocromos base-específico
permitiu a visualização de dois pares cromossômicos nas espécies progenitoras e genitoras
dos híbridos triplos avaliados. Em Passiflora essa heterocromatina tem sido observada apenas
em regiões de constrições secundárias e satélites. De acordo com Silva (2017) os contigs
relacionados ao DNAr 45S, restritos a regiões de constrições secundárias apresentaram cerca
de 62% a 68% de guanina e citosina, o que explica a sua visualização nas regiões
organizadoras do nucléolo pela coloração diferencial com CMA3 e DAPI.
Em Passiflora os blocos CMA3+/DAPI
-, demonstrando a heterocromatina rica em GC
têm sido utilizada como um excelente marcador filogenético e taxonômico. Sendo geralmente
constante em espécies do mesmo subgênero e secção botânica. Espécies do subgênero
Passiflora têm sido observadas contendo de dois a três pares cromossômicos com blocos
CMA3+/DAPI
- (MELO et al., 2014). No presente trabalho o número de blocos CMA3
+/DAPI
-
84
observados nos híbridos triplos foi semelhante aos das espécies progenitoras e genitoras,
indicando que essas regiões estão localizadas no mesmo cromossomo do complemento.
Variações no número de satélites têm sido relatadas em híbridos retrocruzados de Passiflora
(MELO et al., 2017).
Tanto a localização da heterocromatina rica em GC quando a localização in situ de
sítios de DNAr 45S apresentaram resultados semelhantes, isso pelo fato da especificidade da
FISH se restringir ao locus 45S de DNAr (MELO et al., 2017; SILVA, 2017). Sítios de DNAr
5S têm sido quantitativamente inferiores ao número de sítios de hibridação de DNAr 45S
(BELO et al., 2015; MELO et al., 2017), corroborando com o observado no presente trabalho.
Neste estudo, os marcadores cromossômicos de DNAr 45S e 5S se mostraram estáveis nos
híbridos em relação as espécies progenitoras e genitoras, sugerindo estabilidade
cromôssomica em relação a esses sítios.
A localização de sequências teloméricas restrita a regiões terminais nos híbridos
triplos permite indicar que existe conservação na morfologia e estrutura cromossômicas deste
germoplasma. Ausência de modificações cromossômicas envolvendo regiões teloméricas tem
sido observada em Passiflora, mesmo em genótipos retrocruzados com recombinações entre
cromossomos não homólogos ou poliploides (MELO et al., 2017).
A localização de elementos repetitivos posteriormente isolados de P. edulis por Silva
(2017) e Pamponét (2017) e hibridado no germoplasma em análise, indica que tanto o
elemento CL15 Gypsy/Chromovírus e CL86 Gypsy/Maximus-SIRE estão presentes em outras
espécies do subgênero Passiflora. A visualização destes elementos com variações
quantitativas e qualitativas na sua distribuição permite inferir que apesar de ambos os
elementos estarem presentes no genoma das espécies e híbridos analisados, existem variações
no número e na localização destas sequências em relação a P. edulis. A dificuldade do uso da
informação gerada por alguns elementros repetitivos está na localização dispersa destas
sequências no genoma. Adicionalmente, a grande variação na quantidade destes sítios de
hibridação também dificulta a sua predição e análise da herança e distribuição destes
elementos repetitivos em híbridos. Além da capacidade migratória, muitos destes elementos
repetitivos variam em número de monômeros entre as gerações, indicando expanção ou
retração genômica em regiões repetitivas (KAWAKAMI et al., 2011).
85
5. CONCLUSÃO
A obtenção de híbridos triplos de Passiflora é um método eficiente para a obtenção de
plantas citologicamente estáveis, sem o indicio de modificações cromossômicas que possam
alterar os padrões citológicos mais observados em espécies diploides do gênero. Contudo, a
caracterização meiótica e reprodutiva é indicada para prospecção de características
reprodutivas para se avaliar a pré- e pós-meiose indicando assim a inclusão deste
germoplasma ao melhoramento genético de Passifloras, contudo o uso direto do germoplasma
híbrido é indicado.
6. AGRADECIMENTOS
Agradeço à UESC (Universade Estadual de Santa Cruz) pela infraestrutura do
Laboratório de Melhoramento de Plantas (LAMEP) e da Casa de Vegetação, CNPq (Conselho
Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) e FAPESB (Fundação de Amparo à
Pesquisa do Estado da Bahia) pelo apoio financeiro à pesquisa; CAPES (Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) para as bolsas concedidas ao primeiro,
terceiro e quarto autores; CNPq pela bolsa concedida à segunda autora; Viviane pela
excelente ajuda nas fotodumentações.
86
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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92
8. CONSIDERAÇÕES FINAIS
A espécie Cucumis melo apesar de possuir um elevado número de variedades com
ampla variação fenotípica relacionada a descritores florais, vegetativos e de qualidade do
fruto, apresenta estabilidade em termos citológicos relacionada ao número cromossômico e a
marcadores citogenéticos como o DNAr 45S e 5S. Neste âmbito a variação encontrada na
espécie é reflexo de características gênicas relacionada tanto a variação de base como as
variações em expressão, sugerindo-se a prospecção em estudos moleculares para a análise da
diversidade intraespecífica.
A obtenção de híbridos triplos no subgênero Passiflora possibilita a obtenção de
germoplasmas com cariótipos estáveis tanto em número quanto na quantidade de marcadores
cromossômicos esperados em espécies e genótipos diploides do subgênero. Esses dados
indicam que os híbridos em análise podem ser úteis para o uso direto, contanto que essas
informações sejam conciliadas com dados fenotípicos indicando a aplicação deste recurso
genético.
Os híbridos triplos de passifloras possuem bom potencial evolutivo em relação à
estabilidade genômica e cromossômica. Retração ou a expansão genômica pode ser um dos
eventos evolutivos relacionados ao estabelecimento recente de híbridos triplos de Passiflora.
Contudo, a análise meiótica é indicada para verificar o potencial reprodutivo, o que deve ser
considerado como parâmetro importante para o estabelecimento e evolução deste
germoplasma.
93
9. REFERÊNCIAS COMPLEMENTARES
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