Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ PÓS-GRADUAÇÃO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E
BIOLOGIA MOLECULAR
PERFIL PROTEÔMICO DA GERMINAÇÃO DE BASIDIÓSPOROS
DE MONILIOPHTHORA PERNICIOSA E SUA ANÁLISE EM
RESPOSTA AO LAVADO FOLIAR DE THEOBROMA CACAO
JOISE HANDER MARES
ILHÉUS – BAHIA – BRASIL
Fevereiro de 2016
JOISE HANDER MARES
PERFIL PROTEÔMICO DA GERMINAÇÃO DE
BASIDIÓSPOROS DE MONILIOPHTHORA PERNICIOSA E SUA
ANÁLISE EM RESPOSTA AO LAVADO FOLIAR DE THEOBROMA
CACAO
Tese apresentada à Universidade Estadual
de Santa Cruz, como parte das exigências
para obtenção do título de Doutora em
Genética e Biologia Molecular.
Área de concentração: Genética e
Biologia Molecular
ILHÉUS – BAHIA – BRASIL
Fevereiro de 2016
M325 Mares, Joise Hander. Perfil proteômico da germinação de basidióspo- ros de Moniliophthora perniciosa e sua análise em respostas ao lavado foliar de Theobroma cacao / Joise Hander Mares. – Ilhéus, BA : UESC, 2016. iv, 104f. : Il. Orientador: Carlos Priminho Pirovani. Tese (Doutorado) – Universidade Estadual de Santa Cruz. Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular. Inclui referências.
1. Cacaueiro – Doenças e pragas. 2. Fun- gos fitopatogênicos. 3. Proteínas. 4. Vassoura de bruxa (Fitopatologia). I. Título.
CDD 633.74
JOISE HANDER MARES
PERFIL PROTEÔMICO DA GERMINAÇÃO DE BASIDIÓSPOROS DE
MONILIOPHTHORA PERNICIOSA E SUA ANÁLISE EM RESPOSTA AO LAVADO
FOLIAR DE THEOBROMA CACAO
Tese apresentada à Universidade
Estadual de Santa Cruz, como
parte das exigências para a
obtenção do título de Doutora em
Genética e Biologia Molecular.
Área de concentração: Genética
e Biologia Molecular
Aprovada: 29 de fevereiro de 2016
Dr. Luis Eduardo Aranha Camargo Dra. Tahise Magalhães Oliveira
(Esalq/USP) (UESC)
Dr. Ronan Xavier Corrêa Dra. Luciana Rodrigues Camillo
(UESC) (UESC)
Dr. Carlos Priminho Pirovani
(UESC – Orientador)
Aos meus pais, pela educação,
amor, carinho e incentivo...
Dedico.
AGRADECIMENTOS
Agradeço à Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC), pela possibilidade de
realização deste trabalho.
Ao programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular, pela oportunidade de
realização do curso de Doutorado.
À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB), pela concessão da
bolsa de estudos e à Finep/CNPq, pelo auxílio à pesquisa.
Ao Prof. Dr. Carlos Priminho Pirovani, pela orientação, dedicação, confiança e marcante
presença perante a execução da pesquisa.
À co-orientadora Prof. Dr. Karina Peres Gramacho e o pessoal do CEPEC/CEPLAC, pela
contribuição com o material biológico e infraestrutura usada na produção dos
basidiósporos, inclusive à Louise, pelo cuidado com os basidiósporos.
Aos estudantes de Iniciação Científica Everton Cruz, Virgínia Lopes, Edson, Jefferson,
Cristiano e Monaliza, pelo auxílio e na execução dos trabalhos experimentais.
A toda a galera do Laboratório de Proteômica, que direta ou indiretamente contribuiu
para a realização deste trabalho, especialmente à Aurizângela e Juliano.
Aos amigos especiais que sempre acompanharam a caminhada de perto, participando
também das dificuldades e alegrias vividas, em especial Jamilly Azevedo, Lais Freire,
Luciana Camilo e Dayanne Monteiro.
Aos demais amigos (CBG’ets), que indiretamente participaram das principais realizações
deste trabalho.
E aos meus pais, por serem sempre a principal fonte de inspiração para todas as
conquistas conseguidas na minha vida.
“No meio da dificuldade encontra-
se a oportunidade.”
Albert Einsten
ÍNDICE
EXTRATO ............................................................................................................................... I
ABSTRACT .......................................................................................................................... III
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 1
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................................. 3
2.1 O fungo Monilliophtora perniciosa ............................................................................... 3
2.2A doença vassoura-de-bruxa do cacaueiro no Brasil ...................................................... 4
2.3 Os sintomas da doença .................................................................................................. 5
2.4 Disseminação e controle da doença ............................................................................... 6
2.5 A interação molecular do patossistema T. cacao x M. perniciosa ................................ 7
2.6 Características e bioquímica da germinação de esporos ............................................... 9
2.7 Estudos proteômicos em germinação fúngica ........................................................ 11
2.8 Características e importância da superfície da planta ............................................. 12
2.9 Composição proteica da superfície foliar .................................................................... 13
CAPÍTULO I ......................................................................................................................... 15
INTRODUCTION ................................................................................................................. 16
MATERIALS AND METHODS .......................................................................................... 17
Cultivation and obtainment of basidiospores .................................................................... 17
Germination of basidiospores and proteins extraction ...................................................... 17
2D electrophoresis ............................................................................................................. 18
Visualization of spots and image analysis ......................................................................... 18
Protein identification by mass spectrometry ..................................................................... 19
Validation of proteomic analysis by western blot ............................................................. 20
RESULTS .............................................................................................................................. 20
Protein profile in 2D-PAGE .............................................................................................. 20
Gene ontology classification and accumulation of proteins .............................................. 24
Analysis of accumulation by immunoblotting ................................................................... 25
DISCUSSION ........................................................................................................................ 26
Most spots of high molecular weight correspond to the enzymes associated with
metabolic processes. .......................................................................................................... 26
Proteins related to metabolism and energy ........................................................................ 27
Cell cycle-related proteins and septation of the primary hypha ........................................ 28
Response to stress-related proteins .................................................................................... 29
Fungal virulence-related proteins ...................................................................................... 30
CONCLUSION ..................................................................................................................... 31
REFERÊNCIAS .................................................................................................................... 32
ANEXOS ............................................................................................................................... 35
CAPÍTULO 2 – Análise comparativa do proteoma de basidiósporos de Monilliophtora
perniciosa submetidos à germinação em lavado foliar de variedades resistentes e
sucessíveis de Theobroma cacao ........................................................................................... 72
RESUMO 72
ABSTRACT 74
1 INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 75
2. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................... 76
2.1 Cultivo e obtenção dos basidiósporos .......................................................................... 76
2.2 Obtenção de lavado foliar de cacau das variedades CCN51 e Catongo ...................... 76
2.3 Germinação dos basidiósporos em lavado foliar de cacau .......................................... 78
2.4 Extração proteica ......................................................................................................... 78
2.5 Eletroforese 1 D e 2D .................................................................................................. 79
2.6 Visualização dos spots e análise de imagens ............................................................... 79
2.7 In-Gel Digestion, análise de MS/MS e identificação das proteínas............................. 80
2.8 Análise de acúmulo por Western blot .......................................................................... 80
2.9 Análise de Agrupamento hierárquico para a expressão diferencial das proteínas ....... 81
3. RESULTADOS ................................................................................................................. 81
3.1 Inibição da germinação de esporos em lavado de CCN51 .......................................... 81
Quantidade e qualidade das amostras proteicas ................................................................. 82
3.3 Variação dos perfis proteicos em 2D-PAGE de basidiósporos de Monilliophtora
perniciosa germinados em lavado foliar de cacau ............................................................. 84
3.4 Proteínas identificadas ................................................................................................. 88
3.5 Variação do perfil de expressão das proteínas identificadas ....................................... 96
3.6 Classificação por processos biológicos das proteínas diferencialmente expressas
entre basidiósporos germinados na ausência de lavado foliar e lavados foliares de
CCn51 e Catongo ............................................................................................................... 97
3.7 Acúmulo de proteínas por WesternBlotting ................................................................. 98
4. DISCUSSÃO ..................................................................................................................... 98
4.1 Inibição da germinação por lavado CCN51 ................................................................. 98
4.2 Proteínas relacionadas ao metabolismo ....................................................................... 99
4.3 Proteínas relacionadas à virulência ............................................................................ 100
4.4 Expressão de proteínas relacionadas com estresse oxidativo e fermentação ............. 101
5.CONCLUSÕES 102
REFERÊNCIAS .................................................................................................................. 102
CONCLUSÕES GERAIS 105
REFERÊNCIAS COMPLEMENTARES 106
I
EXTRATO
Mares, Joise Hander. Ds. Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus – Bahia.
Fevereiro de 2016. Perfil proteômico da germinação de basidiósporos de
moniliophthora perniciosa e sua análise em resposta ao lavado foliar de theobroma
cacao Orientador: Dr. Carlos Priminho Pirovani. Coorientadora: Dra. Karina Perez
Gramacho.
O fungo hemibiotrófico, basidiomiceto, Moniliophthora perniciosa (Aime &
Phillips-Mora, 2005) é o agente causal da doença vassoura-de-bruxa do cacau (Theobroma
cacao L.). Os basidiósporos do fungo infectam tecidos meristemáticos podendo penetrar
no hospedeiro de diferentes maneiras, induzindo uma variedade de sintomas, dependendo
do órgão infectado e do estágio de desenvolvimento. A proteção superficial de plantas
constituída pelas células epidérmicas e suas secreções. Pode ser considerada uma
estratégia de defesa inata em que microrganismos são diretamente inibidos em seu
primeiro ponto de contato com o hospedeiro. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi
analisar o perfil proteico das proteínas expressas durante a fase inicial da germinação in
vitro dos basidiósporos deste fungo. Além disso, verificar as alterações proteômicas do
metabolismo durante a germinação dos basidiósporos submetidos ao lavado foliar de
variedades de cacau resistente e suscetível. Para isso, análises em 2D-PAGE combinada à
espectrometria de massas (MS/MS) foi utilizada. A extração protéica foi baseada no uso
de SDS-denso seguida de sonicação para ruptura celular e extração fenólica. Os extratos
proteicos obtidos em três tempos iniciais de germinação (0, 2 e 4 horas) foram avaliados
quanto à distribuição em relação à massa molecular (MM), ponto isoelétrico (PI) e a
abundância relativa nos três tempos de germinação. Nos tratamentos 0, 2 e 4 horas após a
inoculação foram identificadas 319
II
proteínas totais. Proteínas relacionadas a virulência e septação foram identificadas e
diferencialmente expressas entre esporos germinados e não germinados. Os
basidiósporos germinados na presença de lavado foliar de CCN51 apresentam uma
diferença visual morfológica no crescimento do tubo germinativo. Um total de 64
proteínas foram identificadas. Proteínas relacionadas com a virulência fúngica em
resposta a mecanismos de defesa da planta foram exclusivamente expressas em
basidiósporos germinados em lavado foliar da variedade resistente CCN51. Estes
estudos podem revelar mecanismos de resistência e susctibilidade do hospedeiro bem
como mecanismos básicos de virulência do patógeno.
Palavras chave: Filoplano, fungo hemibiotrófico, basidiomiceto, proteínas de
virulência
III
ABSTRACT
Mares, Joise Hander. DR. Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus – Bahia.
Fevereiro de 2016. Perfil proteômico da germinação de basidiósporos de
moniliophthora perniciosa e sua análise em resposta ao lavado foliar de theobroma
cacao. Advisor: Dr. Carlos Priminho Pirovani. Advisor Committee Members: Dra
Karina Perez Gramacho
The hemibiotrophic fungus, basidiomycete, Moniliophthora perniciosa ( Aime & Phillips
-Mora , 2005) is the causative agent of the witch's broom disease of cocoa ( Theobroma
cacao L. ). The fungus basidiospores infect meristematic tissues. It may enter the host of
different ways, leading to a variety of symptoms, depending on the infected organ and
developmental stage. The surface protection of plants consist in epidermal cells and their
secretions can be considered an innate defense strategy in which microbes are directly
inhibited in their first point of contact with the host. Thus, the objective of this doctoral
thesis was to analyze the protein profile of proteins expressed during the early stage of the
in vitro germination of basidiospores of this fungus. Also, check the proteomic changes
during the metabolism of germination of basidiospores subjected to foliar washed resistant
and susceptible cocoa variety. For this, 2D-PAGE analysis combined with mass
spectrometry ( MS / MS ) was used. Protein extraction was based on the use of dense SDS
followed by sonication for cell disruption and extraction phenolic. The protein extracts
obtained from three initial germination time ( 0, 2 and 4 hours) were evaluated as the
distribution in relation to the MW (Molecular Weight ) and IP ( isoelectric point ) as well
as relative abundance in three times of germination. In treatments 0, 2 and 4 hours after
inoculation, 319 total proteins were identified. Related proteins to virulence and septation
were identified and differentially expressed between spores germinated and not
germinated. Basidiospores germinated in the presence of CCN51 foliar washed feature a
visual morphological difference in the growth of germ tube. The protein extracts obtained
IV
from germinated basidiospores in the presence of leaf wash were also evaluated for MM
and pI and differentially expressed proteins were subjected to identification by Mass
Spectrometry. A total of 64 proteins were identified. Proteins related to virulence and
fungal in response to plant defense mechanisms were exclusively expressed in
basidiospores germinated in leaf washed resistant variety CCN51. These studies may
reveal mechanisms of resistance and susctibilidade the host as well as basic mechanisms
of virulence of the pathogen.
Keywords: Phyloplan , hemibiotrophic fungus, basidiomycete, protein virulence
.
1
1 INTRODUÇÃO
O fungo hemibiotrófico, basidiomiceto, Moniliophthora perniciosa (Aime &
Phillips-Mora, 2005) é o agente causal da doença vassoura-de-bruxa do cacau (Theobroma
cacao L.). No Brasil, a produção anual de cacau caiu de 400.000 para 120.000 toneladas
com a disseminação da vassoura-de-bruxa nas regiões produtoras no estado da Bahia, a
partir de 1989 (Bowers et al., 2001).
Os basidiósporos do fungo infectam tecidos meristemáticos podendo penetrar no
hospedeiro de diferentes maneiras, sendo elas, diretamente através da cutícula intacta,
aberturas naturais da superfície cuticular, junções celulares da epiderme, base dos
tricomas e através de estômatos (Kilaru & Hasenstein, 2005; Sena, 2014).
Após a invasão do apoplasto, o micélio de M. perniciosa permanece na fase
parasítica neste espaço por um período que pode variar de 40 a 60 dias (Ceita et al., 2007).
Por outro lado, tem sido demonstrado também que a transição das fases ocorreu entre três
a cinco dias em folhas maduras, 10 a 12 dias em folhas meristemáticas e duas semanas em
tecidos de ramos de T. cacao (Kilaru & Hasenstein, 2004). Assim, especialmente na fase
inicial da doença o apoplasto é um campo de batalha molecular que pode implicar no
sucesso da infecção do patógeno ou na resistência da planta (Shepherd e Wagner, 2007).
Este campo de batalha age como um precursor, precedendo a evolução dos mecanismos de
translocação, pelos quais os patógenos manipulam o citoplasma do hospedeiro e suprime
por completo as suas repostas de defesa.
O início do ciclo da doença é disparado com a germinação do basidiósporo,
penetração do tubo germinativo e estabelecimento da hifa primária no espaço intercelular,
deve ser um momento estratégico para o bloqueio do ciclo de vida do fungo.
Considerando que o primeiro contato dos basidiósporos com a planta se dá, na maioria das
vezes, na superfície de folhas do cacaueiro é interessante conhecer quais os primeiros
mecanismos de defesa que ali acontecem e qual tipo de reação bioquímica acontece nesta
etapa inicial no metabolismo do fungo
2
A proteção superficial constituída pelas células epidérmicas e suas secreções pode ser
considerada uma estratégia de defesa inata em que micróbios são diretamente inibidos
em seu primeiro ponto de contato com o hospedeiro (Shepherd e Wagner, 2007). O
lavado foliar, coletado a partir da imersão de folhas jovens em água destilada à
temperatura ambiente contém substâncias solúveis que se acumulam do sobre a cutícula
vegetal.
Neste contexto, esta tese de doutorado mostra alterações na expressão de
proteínas durante o desenvolvimento inicial do basidiósporo deste fungo. Mostramos
um modelo comparativo dos principais fenômenos bioquímicos que ocorrem em
basidiósporos não germinados, duas e quatro horas após a inoculação. Além disso, os
resultados mostram que há uma alteração no perfil bioquímico dos basidiósporos
quando germinados em lavado foliar das variedades CCN51 e Catongo em relação aos
basidiósporos germinados na ausência de lavado foliar.
Desta maneira, as hipóteses deste trabalho são: basidióporos do fungo
Monilliophthora perniciosa apresentam alterações no perfil proteico durante a fase
inicial do seu desenvolvimento; e basidióporos do fungo Monilliophthora perniciosa
apresentam alterações diferenciais no perfil proteico quando submetidos à germinação
na presença de lavado foliar das variedades resistente (CCN51) e sussetivel (Catongo).
Para testar estas hipóteses, os objetivos do presente trabalho é estabelecer o perfil
proteômico comparativo de basidiósporos de M. perniciosa germinados e não
germinados para os tempos de duas e quatro horas após o início da germinação. Além
disso, comparar as alterações de expressão de proteínas em basidiósporos do fungo M.
perniciosa em resposta ao lavado foliar de cacau de duas variedades contrastantes em
relação à suscetibilidade ao patógeno.
Estes estudos podem revelar mecanismos de resistência e susctibilidade do
hospedeiro bem como mecanismos de virulência do patógeno.
3
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 O fungo Monilliophtora perniciosa
O fungo Monilliophtora perniciosa (Aime; Phillips-Mora, 2005) é
fitopatogênico, hemibiotrófico e capaz de colonizar várias espécies de plantas
hospedeiras além do cacau. Estas plantas incluem famílias como Bignoniaceae (Evans
1978, Hedger et al 1987), Bixaceae (Purdy and Schmidt 1996), Malpighiaceae (Bastos
et al 1998, Resende et al 2000), Solanaceae (Bastos and Evans 1985), and Sterculiaceae
(Evans 1978, Bastos et al 1988). Este fungo foi descrito em 1915 por Stahel como
Marasmius perniciosus, em 1942 Singer o reclassificou como Crinipellis perniciosa
(Stahel) (Singer, R. 1942) e em 2005 ele recebeu o nome atual: Moniliophthora
perniciosa [(Stahel) por Aime & Phillips-Mora (2005)] que demonstraram, por análises
de DNA, sua relação com as espécies de Crinipellis e a proximidade filogenética com
Moniliophthora roreri. Taxonomicamente, M. perniciosa é classificado na divisão
Eumycota, subdivisão Basidimycotina, classe Basidiomycetes, subclasse
Homobasidiomycetidae, ordem Agaricales e família Tricholomataceae (Purdy, L.H. et
al. 1996). Mais recentemente foi reclassificado como sendo da família Marasmiaceae
(Aime; Phillips-Mora, 2005).
Por ser um fungo hemibiotrófico, apresenta duas fases miceliais distintas no seu
ciclo de vida: a fase biotrófica/parasítica com hifas monocarióticas e a fase
necrotrófica/saprofítica com hifas dicarióticas (Evans, 1980). Em M. perniciosa,
atipicamente a fase biotrófica é extremamente prolongada. Durante esta fase, as hifas
crescem lentamente entre células do cacaueiro (Figura 1, A) e é encontrado em
densidade muito baixa dentro dos tecidos infectados (Purdy and Schmidt, 1996;
Meinhardt et al., 2008). Depois de 2 a 3 meses de desenvolvimento biotrófico, o tecido
infectado começa a necrosar e formar as chamadas vassouras-de-bruxa secas iniciando o
estágio necrotrófico do desenvolvimento e emissão dos corpos de frutificação –
basidiomas (Evans, 1980) (Figura 1, B).
4
Figura 1: Fases de desenvolvimento do fungo M. perniciosa. A: Hifa monocariótica
entre as células de meristema de cacaueiro representando a fase biotrófica. B: Necrose
dos tecidos (vassoura de-bruxa-seca) e emissão do basidioma representando a fase
necrotrófica. Adaptada a partir de Teixeira et al (2014) e Meinhardt et al (2008).
2.2 A doença vassoura-de-bruxa do cacaueiro no Brasil
O cacau, fruto do cacaueiro (Theobroma cacao L), possui sementes que após
serem fermentadas e secas, são a matéria prima para a produção de chocolate e de seus
derivados (Wood e Law, 1987). Esta planta é nativa das florestas tropicais úmidas da
Bacia Amazônica assim como o fungo supondo que a planta e o patógeno podem ter
passado por um processo de co-evolução (Purdy e Schmidt 1996). Os fungos
coevoluem com representantes de todas as formas de vida, de bactérias ao homem. Esta
relação pode ser simbiótica ou patogênica (Pirozynski e Hawksworth, 1988). Em
patossistemas o benefício é unidirecional onde o patógeno explora o hospedeiro. Este
processo enfatiza a atuação das forças evolutivas no processo de coevolução que gera
variabilidade tanto nas populações de plantas como de fungos (Barbieri & Carvalho,
2001).
Nos países onde a doença vassoura-de-bruxa foi introduzida, a produção de
cacau foi drasticamente reduzida. Relata-se perdas de até 97% na produção da
Venezuela, Equador e Colômbia (Ferraz, 1989). No Equador, a produção caiu para
menos da metade, sendo recuperada na década de 60 pela incorporação de novas áreas
(Adelbranth e Costa, 1993).
A doença vassoura-de-bruxa é uma das doenças de maior efeito destrutivo e
limitante da produção cacaueira no Brasil, causando perdas de que podem chegar a 70 a
5
90%, nas regiões Amazônica e no sul da Bahia (Almeida et al. 1998; Santos Filho et al.
1998). Em 1989 foi verificada a primeira incidência do fungo Moniliophthora
perniciosa, mais precisamente nos municípios de Uruçuca e Camacã, locais centrais da
produção cacaueira no sul da Bahia (Pereira et al, 1996). Essa região era muito propensa
à irradiação da doença pois possuía aproximadamente 700 mil hectares contínuos de
cacaueiros suscetíveis onde a chuva é distribuída uniformemente durante o ano com
estiagens curtas. Esta condição é essencial para a formação de basidiocarpos e para
emissão de tecidos meristemáticos, fatores determinantes para o caráter mais agressivo
da doença (Almeida et al. 1997).
Atualmente, os produtores vêm buscando alternativas para burlar um dos seus
grandes desafios que é a baixa rentabilidade financeira das fazendas de cacau. Com
variedades melhoradas geneticamente, grande parte do cultivo passou a ser voltada para
a produção de cacau fino (Santos, et al., 2012).
2.3 Os sintomas da doença
Os basidiósporos, os únicos propágulos infectantes do fungo, possuem a
capacidade de penetrar em qualquer tecido meristemático do cacaueiro. Nos brotos
vegetativos, o fungo em sua fase monocariótica, causa hipertrofia e hiperplasia,
acompanhadas de proliferação de brotos axilares. Além disso, observa-se perda da
dominância apical com entrenós curtos e folhas geralmente grandes, curvadas ou
retorcidas. Estes sintomas culminam na formação de ramos anormais que apresentam
cor verde mais claro, características da chamada “vassoura-verde” (Lawrence et al.
1991; Almeida et al. 1997). Essa alteração na coloração pode estar relacionada à
diminuição da capacidade fotossintética da planta em decorrência da infecção pelo
fungo (Scarpari et al., 2005). Os primeiros sintomas da morte da vassoura é a
senescência prematura de suas folhas, seguidos pela necrose do ramo (Orchard &
Hardwick, 1988). As vassouras não formam flores, o que resulta numa redução do
potencial de produção de frutos (Bowers et al., 2001). Porém, nas almofadas florais
podem surgir flores anormais hipertrofiadas que dão origem à frutos partenocárpicos
deformados, com aspecto de “morango”, que não se desenvolvem. Os frutos infectados
mais desenvolvidos, ao atingirem a fase adulta, exibem uma mancha negra e dura,
6
denominada “podridão negra” (Almeida et al. 1997). Plantas infectadas severamente
produzem um número maior de folhas arranjadas irregularmente (Orchard & Hardwick,
1988).
O estímulo ao desenvolvimento dos sintomas da vassoura-de-bruxa pode ser
liberado diretamente pelo fungo ou produzido pelo hospedeiro como resposta à presença
desse patógeno. Essas mudanças podem ser atribuídas a um regulador específico do
crescimento das plantas (fitohormônio) ou ao balanço entre diferentes reguladores de
crescimento (Scarpari, 2005). Associado a isso Orchard et al. (1994) encontraram
quantidades significativamente maiores de zeatina ribosídica nas plantas doentes, nos
três diferentes estágios da doença analisados: inicial, intermediário e final (3, 6 e 8
semanas após a inoculação, respectivamente).
2.4 Disseminação e controle da doença
Uma vez necrosadas as vassouras secas infectadas começam a produzir os
basidiomas (fig. 1 B). O micélio frutifica em resposta a fatores ambientais. Em
condições naturais são produzidos após dias chuvosos com temperaturas amenas
(Evans, 1981) ou após períodos alternados de umidade e seca (Almeida, et al. 1995). A
produção de basidiomas está relacionada com a idade das vassouras, quanto mais velha
menos ela produz. Isso ocorre, possivelmente, porque a disponibilidade de fatores de
crescimento nos tecidos diminui com o tempo (Almeida et al. 1997). A liberação dos
basidiósporos ocorre normalmente nas madrugadas, sob condições de humidade relativa
elevada e temperatura amena e são disseminados pelo vento (Bastos 1989b).
Um basidioma pode esporular em médias por cinco dias. Aqueles produzidos na
parte aérea das plantas, geralmente são os mais eficientes na dispersão dos esporos e,
consequentemente, na propagação da doença (Silva, et al. 2002).
A disseminação do fungo a longas distâncias pode ser feita através de transporte
de sacaria de cacau ou de sementes contaminadas em frutos infectados, as quais podem
ser usadas como material de plantio. Além disso, o transporte de mudas infectadas pode
ser arriscado devido a dificuldade de se fazer um diagnóstico face ao longo período de
incubação do patógeno (Lawrence et al. 1991).
Os níveis de infecção também podem derivar de uma possível dispersão dos
isolados mais virulentos, ou a partir de um aumento na pressão de inóculo pela
7
intensificação da epidemia da doença (Albuquerque et al., 2009).
As principais formas de controle da doença baseiam-se na eliminação de tecidos
propensos a produção dos basidiomas. E dentre estas, a mais utilizada é a poda
fitossanitária, que consiste na remoção dos tecidos infectados. Todavia, a eficiência e
custo desta prática dependem de vários fatores, como a severidade da doença, o nível de
infecção da lavoura, a altura das plantas e a situação epidêmica de cada local
(Andebrhan et al. 1998).
Alternativa para a tentativa de controle da doença é o uso de fungicida químico.
Essa proposta também tem baixa eficiência uma vez que o patógeno ataca somente os
tecidos meristemáticos em atividade. Isso torna anti-econômico o controle através de
fungicidas protetores à base de cobre, devido ao crescimento rápido desses tecidos e à
necessidade de aplicações contínuas (Bastos 1989a). Outro método atualmente utilizado
é o controle biológico. Análises com o fungo Trichoderma stromaticum mostraram
expressiva inibição do desenvolvimento de basidiocarpos do Mp (Bastos, 2000;
Loguercio et al., 2009). Os experimentos resultaram no produto TRICOVAB, bastante
utilizado contra a doença (Bezerra et al., 2000; Meinhardt et al., 2008).
O uso de variedades resistentes ainda é o método mais eficiente de controle da
doença até o momento. Na década de 40, plantas de uma mesma família foram trazidas
ao Brasil por apresentarem-se completamente livres de infecção. (Andebrhan et al.
1998).
2.5 A interação molecular no patossistema T. cacao x M. perniciosa
Diante dos prejuízos causados pela vassoura-de-bruxa, estudos que buscam
revelar os processos metabólicos e bioquímicos que ocorrem durante a infecção na
planta vem sendo realizados. Dias et al (2011) analisaram a produção de H2O2 e o
conteúdo de Ácido Oxálico livre e Ácido ascórbico como o principal precursor de
Ácido Oxálico em plantas de cacau e mostraram que a quantidade de cristais de Oxalato
de Cálcio e os níveis de H2O2 presentes em duas variedades (suscetível vs resistente)
apresentaram padrões temporais e genótipo-dependente distintos. O genótipo resistente,
TSH1188, apresenta uma produção de peróxido mais elevada que o suscetível, Catongo,
entre 24 e 72 horas após inoculação. Aneja e Gianfagna (2001) analisaram a indução da
síntese de cafeína em folhas jovens de cacau e mostraram altos níveis em folhas
8
infectadas com M. perniciosa, cerca de 7 a 8 vezes mais que em folhas saudáveis.
Orchard e Hardwick (1988) estudaram a fotossíntese, translocação de carboidratos e
metabolismo de sementes de cacau infectadas com M. perniciosa e observaram que a
capacidade fotossintética de folhas infectadas é dependente da severidade da infecção e
que o fungo não causa um fluxo preferencial de carboidratos das partes saudáveis da
planta para os tecidos infectados. Scarpari et al (2005) mostraram que as alterações
bioquímicas associadas com a infecção sugerem que a planta usa mecanismos
inespecíficos para tentar eliminar o fungo, como o aumento de alcaloides, compostos
fenólicos e taninos.
Visando estudar as alterações bioquímicas que ocorrem no fluido apoplástico de
cacau inoculado com esporos de M. perniciosa, Pirovani (2008) verificou que o fluido
apoplástico das plantas da variedade Catongo (suscetível) sadio inibiu em 22% a
germinação de basidiósporos do fungo, enquanto o fluido das plantas inoculadas
(previamente elicitadas) não apresentou atividade inibitória. Isso sugere que
mecanismos bioquímicos de defesa pré-existentes no genótipo suscetível são
desativados pelo patógeno, nas primeiras horas após a infecção, aumentando a
suscetibilidade das plantas. Por outro lado, o genótipo resistente após elicitado
aumentou a inibição da germinação de 20 para 50%.
Buscando entender como o patógeno modula a resposta na planta, um banco
genômico do fungo foi criado (www.lge.ibi.unicamp.br/vassoura) a partir de bibliotecas
de DNA total (Rincones et al, 2008). Este banco foi utilizado para estudos de expressão
gênica, tais como análise de microarranjo de DNA para verificar a expressão diferencial
de genes entre estágios saprofíticos e biotróficos do fungo. Os resultados deste trabalho
indicaram diferenças no metabolismo de carbono e nitrogênio entre os dois estágios
miceliais esclarecendo informações sobre vias metabólicas que podem ser essenciais
para a patogenicidade do basidiomiceto. Este banco possibilitou ainda a caracterização
de componentes de rotas metabólicas exclusivas do fungo no patossistema, como a rota
da quitina (Lopes et al., 2008). Já foram também analisadas proteínas secretadas
relacionadas com a morfologia da hifa (Alvim, 2009).
Um banco de cDNA da interação patógeno-hospedeiro também tem
possibilitado a identificação de genes do patógeno e do hospedeiro (Gesteira et al.,
2007). Além disso, métodos de extração de proteínas de diferentes tecidos de cacau já
foram estabelecidos (Pirovani et al., 2008), marcando o início dos estudos proteômicos
do hospedeiro nesse patossistema. O tamanho do genoma, o polimorfismo
9
cromossômico, a variabilidade genética e o genoma mitocondrial de M. perniciosa já
foram descritos (Rincones et al., 2003 , Formighieri et al., 2008; Teixeira et al, 2014).
2.6 Características e bioquímica da germinação de esporos
O termo germinação, aplicado em fungos, refere-se basicamente aos processos e
mudanças que ocorrem durante a retomada do desenvolvimento de uma estrutura que
estava em repouso e a sua transformação em uma estrutura morfologicamente diferente
(Allen, 1965). Neste processo, três estágios podem ser visualmente distinguidos: (a) um
estágio de inchaço inicial; (b) emergência de um tubo germinativo e; (c) o
desenvolvimento inicial do tubo germinativo, seguido de sua emergência. Com
referência à essa forma, o termo germinação geralmente implica na emergência de um
tubo germinativo definido (Allen, 1965).
A germinação da maioria dos esporos fúngicos é estritamente um processo
aeróbico. Alguns esporos podem ser capazes de germinar a uma taxa reduzida de
oxigênio ou realizar metabolismo anaeróbico, mas a respiração aeróbica mostra ser uma
fonte essencial de energia para a germinação natural (Wood-Baker, 1955).
A maioria dos esporos possui baixo teor de umidade e estes devem ser
reidratados antes do desenvolvimento retomar. Se toda a água absorvida fosse retida
como água livre, resultaria num aumento de cerca de cinco vezes no volume do esporo
(Allen, 1965).
A taxa de inchaço do esporo é independente da pressão osmótica externa,
enfatizando o fato de que o inchaço não é puramente um fenômeno osmótico (Ekundayo
e Carlile, 1964). Parece representar uma parte intrínseca do processo de crescimento
correspondendo ao aumento da atividade metabólica e peso seco.
Os processos de proteólises são eventos essenciais na germinação de esporos,
como estabelecido desde a década de 50 (Powell and Strange, 1953). Para testar esta
hipótese foram realizados ensaios da inibição do processo proteolítico pelo uso de
inibidores de proteases como o PMSF (Phenil Methyil Sulfonil Fluoride). Dessa
maneira foi mostrado que a proteólise era essencial para a germinação e esporulação de
espécies de Bacillus (Strange and Dark, 1957), macronídeos de Microsporum gypsum
(leighton and Stock, 1969) e esporos de Aspergillus nidulans (Yanagita and Nomachi.
10
1967), entre outros.
O conteúdo de lipídio em esporos fúngicos varia consideravelmente de acordo a
espécie e condições de formação do esporo, mas varia entre 1 e 35% por peso seco de
esporo. Em basidiomicetos como algumas espécies do gênero Ustylago a quantidade de
lipídeos é consideravelmente baixa variando de 0,4 % (U. maydis) a 14,5 % (U. levis)
(Packter, 1981). Além de serem usados como fonte de carbono para manutenção do
metabolismo, os lipídios são constituintes estruturais das paredes celulares. Em
Sacharomyces cerevisae o conteúdo lipídico da parede celular é em média 5,8%
(Packter, 1981). Em estudos com esporos do fungo micorrízico vesicular-arbuscular,
Glomus caledonius, Beilby and Kidby (1980) observaram a síntese de alguns, incluindo
esterois e (n-3 ) e ( n-6 ) ácidos graxos poli-insaturados durante a germinação e
crescimento do tubo germinativo.
A glicose é a principal fonte de carbono para o desenvolvimento de fungos,
principalmente, trealose e glicose na maioria das espécies. Caltrider (1963) estudaram
vários aspectos das alterações metabólicas que ocorrem durante a germinação de
uredosoporos da ferrugem de trigo e do feijão e descobriram que há uma diminuição na
quantidade de lipídios e um aumento em hidrocarbonetos, principalmente após a
germinação do esporo e durante o crescimento de tubo germinativo. Em esporos de
Phycomyces blakesleeanus, assim que a germinação é ativada, alguns compostos como
piruvatos, lactatos e principalmente glicerol são sintetizados (Van Laere, 1986). A
síntese de glicerol, necessária para a germinação de esporos, parece ser regulada por
fosforilação dependente de cAMP. Além disso, como a trealase, a glicerol-3-fosfatase
pode ser ativada in vitro por incubação de um extrato com cAMP e MgATP. Esta
ativação é encontrada apenas quando a atividade é medida na presença de 1 mM de
fosfato. Quando medida sob estas condições, a ativação pelo calor ou acetato provoca
um aumento de várias vezes na atividade da glicerol-3-fosfatase in vivo (Van
Schaftingen e Van Laere, 1985).
O tipo de dormência em esporos também pode ser dependente de sua
composição química durante essa fase. Uma comparação de células dormente de
esporos de Talaromyces macrosporus (ascósporos e conídios) permitiu o
estabelecimento de diferenças significativas nas propriedades físico-químicas do seu
citoplasma (Feofilova, 2012). Em ascósporos, a viscosidade do citoplasma é mais alta e
diminui significativamente quando se inicia a degradação da trealose e glicose
(Dijksterhuis, 2007).
11
2.7 Estudos proteômicos em germinação fúngica
Os eventos bioquímicos que ocorrem durante a germinação fúngica vêm sendo
estudados em ascósporos e conídios de Neurospora Crassa (Sussman, 1973, Schmit,
1976, D’enfert, 1997). Alguns estudos proteômicos mais recentes de esporos de fungos
filamentosos foram realizados identificando proteínas envolvidas no metabolismo de
carboidratos, lipídeos e proteínas em conidiósporos de Blumeria graminis (Noir, et al
2009).
Outras análises realizadas durante a fase inicial da germinação de conídios de
Aspergillus nidulans mostrou alta expressão de proteínas associadas com metabolismo
energético, síntese proteica e processo de dobramento proteico além de terem sido
identificadas também proteínas envolvidas com processos de desintoxicação de
oxigênio reativo como a catalase A, a tioredoxina redutase e a peroxiredoxina
mitocondrial (Taek Oh, et al 2009). Outros trabalhos descrevem vias regulatórias da
germinação de conídios incluindo a via da AMPc proteína kinase A (Lafon et al. 2005,
2006) e a via RAS/proteína quinase mitógeno-ativadora (Osherov e May, 2000).
Uma análise proteômica foi realizada em conídios de Botritis cinerea revelando
que alguns produtos de virulência são pré-formados, principalmente, no interior dos
conídios não germinados, permitindo um rápido desenvolvimento do fungo nas fases
iniciais de germinação dos conídios (González-Rodríguez et al., 2015). Em Rhizoctonia
solani, estudos proteômicos revelaram que proteínas relacionadas à função de dois
vacúolos foram altamente induzidas ao longo da maturação dos escleródios, este achado
foi também confirmado em nível de RNA por RT- PCR quantitativo (Kwon et al.,
2014). Trezentos e sessenta e cinco proteínas foram identificadas em conídios em
Colletotrichum acutatum durante a germinação. Todas essas proteínas foram
classificadas de acordo com sua função molecular e seu envolvimento em processos
biológicos, incluindo a produção de energia celular, metabolismo oxidativo, estresse,
síntese de ácidos graxos, síntese de proteínas e dobramento proteico (El-Akhal et al.,
2013).
Em M. perniciosa (Mares et al, 2016) estabeleceram metodologias para estudos
proteômicos do esporo desse fungo. Um método de extração de proteínas e a quantidade
12
de basidiocarpos e basidiósporos requeridos para estudos proteômicos foi estabelecida,
o que permitiu a construção de um mapa de referência baseado em 2D-PAGE com 178
proteínas identificadas por espectrometria de massas. Além disso, uma rede de interação
de proteínas foi construída através da identificação das proteínas no esporo não
germinado.
2.8 Características e importância da superfície da planta
A proteção superficial de plantas, constituída pelas células epidérmicas e suas
secreções pode ser considerada uma estratégia de defesa inata em que micróbios são
diretamente inibidos em seu primeiro ponto de contato com o hospedeiro (Shepherd e
Wagner, 2007).
Sobre a superfície das plantas, distribuídas entre as células epidermais, existem
células ou estruturas que desempenham diversas funções relacionadas à proteção da
folha. Hidatódios, lenticelas, glândulas de óleo, glândulas de sal, dutos resinosos e
outras aberturas que podem expelir substâncias antimicrobianas do interior da planta
(Phillips e Croteau,1999; Grunwald et al., 2003).
Além disso, a folha pode ser habitada por um conjunto qualitativa e
quantitativamente diversificado de micro-organismos, incluindo fungos, leveduras,
bactérias e bacteriófagos (Last e Deighton, 1965). Tais micro-organismos podem
participar da defesa inata da planta simplesmente pela competição por nutrientes e
muitas vezes são alvos de estudo como controle biológico (Blakeman e Fokkema,
1982).
Os estudos de superfície foliar com base química de proteção em plantas têm-se
centrado em metabólitos secundários secretados como exsudados de tricomas
glandulares (Shepherd, et al. 2005), proteínas (Shah, 2005) ou peptídeos
antimicrobianos (De Lucca, et al. 2005). A biossíntese e secreção de proteínas
antimicrobianas em superfícies de contato da planta com microrganismos pode
combater a invasão do patógeno antes do estabelecimento da doença. Proteínas de
defesa como β-1,3-glucanases e proteínas transportadoras de lipídeos, são secretadas de
exudatos de raízes de feijão-de-corda (Vigna unguiculata) e essas proteínas tem
13
mostrado inibição contra o fungo Fusarium oxysporum (Nobrega, 2005).
Estudos recentes sobre a capacidade biosintética da epiderme de folhas
revelaram novas proteínas de superfícies chamadas filoplaninas (Shepherd et al. 2005).
O lavado foliar coletado a partir da imersão de folhas jovens em água destilada à
temperatura ambiente contém substâncias solúveis que se acumulam sobre a cutícula
vegetal (Shepherd et al. 2005).
2.9 Composição proteica da superfície foliar
As secreções por células epidermais podem ser expelidas do apoplasto para o
filoplano, mas a deposição na superfície por proteínas altamente carregadas ou polares
provavelmente é limitada por hidrofobicidade da cutícula. Esse método de deposição
pode ser possível através de estômatos e outros poros epidermais (Shepherd e Wagner,
2007).
Existem vias através da cutícula das plantas que permitem a passagem de
carboidratos, sais, e outras moléculas advindas de outras partes da planta (Kerstiens,
2006). Análise do secretoma de Arabidopsis foi identificada uma lipase que é induzida
no apoplasto após o contato com o patógeno Alternaria brassicicola (Oh, et al, 2005).
No fluido expelido pelos hidatódios durante a gutação também podem conter proteínas
defensoras. Uma peroxidase catiônica foi encontrada no fluido de gutação de arroz
(Oriza sativa) durante a infecção com o patógeno bacteriano Xanthomonas oryzae
(Young, et al, 1995).
O principal componente proteico de tricomas secretores glandulares são enzimas
responsáveis pela produção de metabólitos secundários de exudatos foliares. A enzima
Polifenol oxidase é o principal componente da secreção de tricomas do tipo A em
tomate (Solanum berthaultti) (Kowalski, et al 1992) .
Um estudo comparativo com proteínas isoladas de tricomas de N. tabacum com
proteínas coletadas de tecido total de folhas revelou que os tricomas possuem mais
proteínas de defesa como quitinases e superóxido dismutase (Amme, 2005). O inibidor
de protease da família PIN2 tem sido encontrado expresso constitutivamente em
tricomas glandulares de Solanum americanum (Liu, et al, 2006).
Shepherd, et al (2005) mostrou que o lavado foliar de N. tabacum contém alto
nível da proteína filoplanina. Esta proteína é codificada pelo gene T-phylloplanin e
14
inibiu a germinação de esporos do oomiceto de Peronospora tabacina. As filoplaninas
também podem compartilhar características similares com peptídeos antimicrobianos
conhecidos (Hancock e Lehrer, 1998), com proteínas hidrofóbicas e com proteínas
básicas como as saponinas animais que são secretadas pelo epitélio (Schram, et al,
2003)
15
CAPÍTULO I
Proteomic analysis during early development of the fungus Moniliophthora
perniciosa, the causal agent of witches’ broom disease in cacao
Joise Hander Mares1, Karina Peres Gramacho
2, Everton Cruz Santos
1, André da Silva
Santiago3, Fátima Cerqueira Alvim
1, Carlos Priminho Pirovani
1
1Laboratory of Proteomics, Center of Biotechnology and Genetics, State University of
Santa Cruz (UESC), Ilhéus (Bahia, Brazil)
2Laboratory of Plant Pathology, Cacao Research Center, CEPLAC, Ilhéus
3Center for Molecular Biology and Genetic Engineering (CBMEG) Unicamp - SP
Abstract
Moniliophthora perniciosa is a phytopathogenic fungus responsible for witches’ broom
disease in the cacao tree (Theobroma cacao L.). Understanding the molecular events that
occur during germination may enable the development of strategies for disease control in
these economically important plants. In this study, we established a comparative
proteomic profile of M. perniciosa basidiospores during germination through 2D-SDS-
PAGE and mass spectrometry. A total of 319 proteins were identified. Molecular changes
that occur during the development of the germinative tube were identified from a
hierarchical clustering analysis based on the differential accumulation of proteins. Proteins
associated with fungal filamentation, such as septin and kinesin, were found within only 4
hours of inoculation. A transcription factor related to biosynthesis of the secondary
metabolite fumagillin, which can form hybrids with polyketides, was induced 2 hours after
inoculation (HAI) and polyketide synthase was observed 4 HAI. The accumulation of
ATP synthase, BiP, and catalase were validated by western blot with polyclonal
antibodies. We discuss these results and propose a model for the germination of the
fungus M. perniciosa. These studies can help determine the mechanisms underlying basic
16
processes of host invasion and establish strategies for control of the disease.
Keywords: Theobroma cacao, witches’ broom, 2D SDS-PAGE, mass spectrometry
Introduction
Moniliophthora perniciosa is a phytopathogenic fungus that belongs to the class
Basidiomycetes, order Agaricales, family Marasmiaceae (Aime and Phillips-Mora
2005). This fungus causes witches’ broom disease in the cacao tree (Theobroma cacao
L.) and led to the loss of about 90% of cacao production in Central and South America
in 1990 (Purdy and Schmidt 1996). M. perniciosa is classified as hemibiotrophic,
showing two stages in its life cycle, the biotrophic (parasitic) phase with monokaryotic
hyphae, and the necrotrophic phase (saprophytic) with dikaryotic hyphae containing
clamp connections (Evans 1980). Basidiospores are the infective propagules and can
penetrate the host directly through the intact cuticle, natural openings of the cuticular
surface, epidermal cell junctions, at the base of trichomes, or stomata (Kilaru and
Hasenstein 2005; Sena et al. 2014). The mycelium forms as hyphae grow within the
plant, penetrating the plant tissue in direct contact with the host protoplasm, or
mycelium can also form on the plant surface (Anderbrhan 1984). Recent observations
show that penetration of the basidiospore is related to the formation of a germination
pore directly in the meristematic cuticle, followed by the emergence of a germinative
tube (Sena et al. 2014). During this infection phase, the fungus induces drastic
physiological and morphological changes in the plant (Meinhardt et al. 2008; Scarpari
et al. 2005). After 2 to 3 months, the infected tissue enters a state of necrosis and the
branch of the plant dries and resembles a broom; this is the characteristic feature for
which the disease is named (de Oliveira Ceita et al. 2007; Evans 1980).
Accession and germination of fungal spores on the surface of plants are the
initial steps essential for host penetration and colonization. Some studies have focused
on molecular analysis of the germination of conidia and other types of phytopathogenic
fungi spores. Differentially expressed genes were identified in teliospores of Ustilago
maydis, (Zahiri et al. 2005), in conidia of Fusarium graminearum (Seong et al. 2008),
and in Botrytis cinerea (Doehlemann et al. 2006). In addition, analysis of protein
profiles of filamentous fungi spores identified proteins involved in the metabolism of
carbohydrates, lipids, and proteins in Blumeria erysiphe (Noir et al. 2009). Analysis of
early stages of germination shows high expression of proteins associated with energy
metabolism in conidia of both Aspergillus nidulans (Oh et al. 2010) and Colletotrichum
17
acutatum (El-Akhal et al. 2013). Understanding molecular events that occur during
germination may enable better strategies for disease control in these economically
important plants. However, few studies have been conducted to characterize and
identify proteins involved in the germination of phytopathogenic fungi such as M.
perniciosa.
Recently, our team established methodologies for proteomic studies of this
fungus’ spores (Mares et al., 2016). A protein extraction method and the quantity of
basidiocarps and basidiospores required for proteomic studies were established, which
allowed the construction of a reference map based on 2D-PAGE. A network of protein
interactions was built through the identification of proteins in non-germinated spores. In
this study, we established the comparative proteomic profile of germinated and non-
germinated basidiospores. In addition to the 175 spots identified by coincidence with
the reference map for non-germinated spore proteins (Mares et al., 2016), we identified
over 141 unique protein spots seen 2 and 4 HAI. Molecular changes that occur during
the development of the germinative tube were identified from a hierarchical clustering
analysis based on the differential accumulation of proteins.
Materials and methods
Cultivation and collection of basidiospores
About 300 dry branches of a susceptible cacao cultivar (Catongo) between 30 and 50
cm long that were infected with rosy mycelium of M. perniciosa (Pires et al. 2009) were
randomly collected in the field (CEPLAC/CEPEC-Ilhéus, Bahia) according to
methodology described by Mares et al. (2016). Basidiospores were produced according
to the method of Frias et al. (Frias et al. 1991) and stored in liquid nitrogen as described
by Frias (Frias et al. 1995) until use.
Germination of basidiospores and protein extraction
Each aliquot of basidiospores was defrosted on ice, diluted in distilled water to
reduce the concentration of glycerol to 3%, and incubated in the dark at 25°C.
Germination rates and the length of the germinative tubes were monitored and measured
with a graduated lens in an optical microscope (Bioval L2000A) at 40 magnification.
The 0, 2, and 4 HAI samples were collected by centrifugation for 20 min at 5,000g in
3% glycerol. Supernatants were discarded, then sediments were snap frozen in liquid
18
nitrogen and stored at -80°C until protein extraction. The samples stored at -80°C were
defrosted and washed with cold acetone containing 0.07% v•v-1
β-mercaptoethanol.
Then, protein extraction and quantification were performed according to methods
described by Mares et al. (2016).
2D electrophoresis
For proteomic analysis in 2D PAGE, 350 µg of total protein diluted in 250 µL of
rehydration solution was used. Gel strips (containing immobiline) 13 cm in length with
immobilized nonlinear pH gradient from 3 to 10 (Amersham Biosciences,
ImmobilineTM Dry-Strip) were hydrated for 12 h in the rehydration buffer/protein
solution using methods described by Mares et al. (2016) in an Ettan IPGphor 3
Isoelectric Focusing System. The second dimension was performed in a 12.5%
polyacrylamide gel in a HOEFER SE 600 Ruby vertical electrophoresis system
(Amersham Bioscience). The run started with an electrical current of 15 mA/gel for 15
min, followed by 30 µA/gel for 30 min, and 50 µA/gel for 3.5 h, totaling a time of 4.25
h. Gels were prepared in triplicate for each time of germination.
Visualization of spots and image analysis
After electrophoresis, the polyacrylamide gels were placed in fixation buffer
(40% ethanol and 10% acetic acid) for 1 h, then the buffer was replaced with colloidal
Coomassie Blue dye (8% ammonium sulfate, 0.8% phosphoric acid, 0.08% Coomassie
Brilliant Blue G-250, and 20% methanol) and was incubated for 5 days under gentle
agitation. The dye was replaced with distilled water, and the gels were kept under gentle
agitation with daily water changes until excess dye was removed.
Gel images were scanned with a Labscanner (Amersham Bioscience) and
analyzed for detection and relative quantification of protein spots using the
ImageMaster 2D Platinum 7.0 (GE HealthCare) software, considering the area and the
intensity of the spots. The reference gels (master gel) from triplicates were used to
identify the unique spots and compare the relative accumulation of proteins present in
the different treatments. The spots previously identified in the reference map (Mares et
al., 2016) were compared with the spots on gels for 2 and 4 HAI. For the spots seen in
common between the different treatments, those who showed a relative fold change in
abundance greater than 1.5 were considered to be differentially expressed, and statistical
significance was determined if p<0.05 for the ANOVA test. The gels from 2 and 4 hour
19
treatments were compared with gels of non-germinated spores obtained by Mares et al.
(2016), which was used as reference (Tables 1 and 2).
Protein identification by mass spectrometry
The spots differentially expressed 2 and 4 HAI were excised from gels and
placed in microtubes. Then, they were bleached and subjected to trypsin digestion
(Villela-Dias et al. 2014). Then, the samples containing recovered peptides were
vacuum concentrated until they reached a volume of 10-15 µL.
The resulting peptides from tryptic digestion underwent a liquid chromatography
in tandem with mass spectrometry (LC-MS/MS) in a nanoAcquity system (Waters,
Milford, MA) attached to a Q-ToF micro mass spectrometer (Waters), according to
methods described by (Villela-Dias et al. 2014). The raw data were processed and the
resulting spectra were analyzed with the program ProteinLynx Global Server 4.2
(WATERS) and compared with the SWISSPROT database
(http://www.uniprot.org/downloads, October 2011). For comparison with the NCBI
database, the MASCOT tool MS/MS IonSearch (www.matrixscience.com) was used
with the following parameters: tryptic digestion, with 1 cleavage site lost, cysteines
modified by carboxamidomethylation and methionine oxidation, error tolerance for the
peptide of 30 ppm, and fragment mass error of MS/MS equal to 0.1 Da. According to
MASCOT analysis probability, only the significant “hits” (p< 0.05) were accepted.
After protein identification, their ontology and biological processes were classified in
Blast2Go.
Validation of proteomic analysis by western blot
Western blotting was also used to validate proteomic data. Aliquots of 10 µg
total basidiospore protein (0, 2, and 4 HAI) were separated by 12.5% SDS-PAGE and
transferred to a nitrocellulose membrane using the iBlot Dry Blotting System
(Invitrogen) according to manufacturer's instructions. The membrane was blocked with
5% skim milk (w/v) in TBS-T buffer (Tris-HCl 100 mmol•L-1
, pH 8.0; NaCl 140
mmol•L-1
; Tween 20 0.05% v•v-1
). BiP (71 kDa), catalase (83 KDa), and ATP synthase
(53 kDa) proteins were detected using the following polyclonal primary antibodies at
1:2000 dilutions: anti-BiP of Arabidopsis thaliana (Agrisera-AS09481), anti-catalase of
A. thaliana (501,100 AgriseraAS09) and anti-ATP synthase of A. thaliana (Agrisera-
AS05085). Membranes were incubated with the appropriate primary antibody for 60
20
min. After washing 3 times with TBS-T buffer, the membranes were incubated for 60
min with a secondary antibody of goat anti-rabbit IgG conjugated with alkaline
phosphatase (ThermoFisher Scientific-65-6122) for 60 min. The phosphate of 5-bromo-
4-chloro-3-indolyl (BCIP) and p-nitrotetrazolium (NBT; Promega, USA) were used as
substrates for the colorimetric reaction of alkaline phosphatase activity. The
accumulation of BiP, catalase, and ATP synthase proteins were quantified from
membrane images using the GelQuant.Net 1.8.0 software
(www.biochemlabsolutions.com).
Hierarchical clustering analysis-HCA
Clustering was performed using the Cluster 3.0 + Java TreeView program
(http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). To do this, the matrix
was built with normalized, log-transformed ratio values for each protein spot from the
analysis of gel images using Image Master 2D Platinum 7.0 software (GE Healthcare)
(Supplemental Table 2). Euclidean Distance (ED) was used to calculate the distance or
dissimilarity between individuals and Complete Link was used for clustering.
Results
Protein profile in 2D SDS-PAGE
2D gels of basidiospore proteins for inoculation times 0, 2, and 4 h were
analyzed for variation in abundance and distribution of spots to obtain protein profiles
(Figure 1A). Proteins were visualized in the whole pH range and molecular weight
(MW) was noted. A greater abundance of proteins with MW above 90 kDa is seen in
the 2 and 4 HAI samples compared to baseline (Figure 1A). The gel analysis revealed
510, 430, and 504 spots for the inoculation times 0, 2, and 4 h, respectively. A total of
242 spots were common among all three treatments (Figure 1B). Thirty percent (153
spots) of spots identified in non-germinated basidiospores were unique to this group.
Basidiospores after 2 h of inoculation presented 26% (112 spots) unique spots.
Basidiospores after 4 h of inoculation presented 37% (187 spots) unique spots.
21
Figure 1: Protein profile in 2DE-PAGE at different stages of M. perniciosa spore
germination. A: Non-germinated basidiospores of M. perniciosa (0 h) (Mares, et al.,
2016) with 2 and 4 h after inoculation. The samples were focused in strips of 13 cm
with nonlinear (NL) pH gradient 3-10. Black numbers correspond to unique spots for
each treatment. Red numbers correspond to spots common between treatments with fold
change > 1.5. B: Venn diagram of the distribution of spots detected in gels of 0 (Mares
et al., 2016), 2, and 4 hours after basidiospore inoculation.
All treatments were evaluated concerning the distribution of spots relative to
their MW and isoelectric point (pI) (Figures S1 and S2). Most proteins that compose the
proteomic map for the 3 studied times are distributed in the range of 30 to 60 kDa
(63.4%, 64.8%, and 53.5% for 0, 2 and 4 h, respectively). A 31.5% increase was
observed in the percentage of proteins with MW greater than 60 kDa in the spores 4 h
after inoculation. The percentage of spots with MW less than 30 kDa increased about
6% from 0 to 2 h after inoculation and decreased by 10% from 2 to 4 h (Figure S1). The
images show a predominance of acidic proteins (isoelectronic points less than 5.5) on
non-germinated basidiospores compared to germinated spores. On the other hand, the
number of basic proteins (isoelectric points greater than 7.5) in non-germinated spores
was generally less than the number of basic proteins detected in germinated spores.
22
Although the gels for 2 and 4 h samples do not have spots on all pH ranges seen on the
0 h gels, the distribution of proteins on the basis of their pIs was homogeneous in the
ranges that presented spots (Figure S2).
A total of 109 spots common to all 3 treatments, identified by MS/MS, were
analyzed and clustered according to their profile. Proteins that presented similar
accumulation patterns were clustered by hierarchical clustering (Figure 2). In group A,
proteins that showed reduced expression over time after inoculation were grouped. In
group B were proteins that showed an increase in expression 2 HAI but then were
repressed 4 HAI. In group C, proteins that showed increased accumulation during
germination were grouped. More information on the identification of spots can be found
in Supplemental Table 1.
23
Figure 2: Bi-directional Hierarchical Clustering Analysis generated by Cluster 3.0
software showing the global profile of differential expression of proteins common to the
24
three inoculation times. A: Proteins repressed 4 hours after inoculation. B: proteins
repressed 2 hours after inoculation. C: Proteins induced 4 hours after inoculation.
Gene ontology classification and accumulation of proteins
Unique and differentially expressed proteins were classified in categories
according to their biological processes by Blast2GO software. Some categories were
chosen to be discussed because of their differential accumulation between 2 and 4 HAI,
using non-germinated spores (Mares et al., 2016) as a reference. The categories chosen
were oxidation-reduction, development, biosynthetic, and metabolic processes, the
stress response, and regulation. When compared with non-germinated spores, 40% (6)
and 46.1% (6) of proteins related to the oxidation-reduction were repressed in the
treatments of 2 and 4 HAI, respectively. Two proteins related to fungal development
showed increased accumulation 2 HAI and one was increased 4 HAI. Among all
proteins detected in non-germinated spores, 15 were classified in the category related to
biogenesis and biosynthetic processes yet none of these proteins appeared 2 HAI. Four
HAI, 79.2% of biosynthetic proteins showed reduced accumulation and 20.8% showed
increased accumulation. The category related to metabolic processes was most
represented with 40% of the proteins showing reduced accumulation and 60% showing
increased accumulation 2 HAI, and in 4 HAI 52.7% of proteins showed reduced
accumulation and 51.3% showed increased accumulation. For proteins involved with
stress response, 80% of proteins showed reduced accumulation and 20% showed
hyperaccumulation in 2 and 4 HAI, respectively. After 2 hours of inoculation, 62.5% of
the proteins involved with regulation showed increased accumulation, and after 4 hours
of inoculation, 60% of the proteins showed decreased accumulation (Figure 3).
Figure 3: Classification of biological processes for differentially expressed proteins
identified in non-germinated spores of M. perniciosa, compared with 2 and 4 hours after
inoculation. Classification was performed using Blast2GO software.
25
Analysis of accumulation by immunoblotting
Western blot analysis was performed to confirm expression changes of some
proteins identified in the proteomic analysis. Specific antibodies were used to the BiP,
catalase, and ATP synthase beta proteins (Figure 4A).
Compared to non-germinated basidiospores, BiP showed an increase of about
2.8-fold 2 HAI and about 3.4-fold 4 HAI. This corresponded with the expression of a
few spots regarding HSP 70 (spots 268 and 278) that were common among the
treatments. ATP synthase also increased about 2.5-fold in spores 2 HAI compared with
non-germinated basidiospores. The increased expression of three spots related to the
ATP synthase protein (spots 99, 197, and 204) was also observed in analyses by 2D-
PAGE. Catalase protein already presented greater accumulation 2 HAI. The expression
of some spots common among the treatments corresponded to the expression of proteins
analyzed by western blot.
Figure 4: Accumulation of BiP, Catalase, and ATP synthase (beta chain) by western
blot and analysis of spots. A: Image of a nitrocellulose membrane hybridized with Anti-
BiP, Anti-Catalase, and Anti-ATP synthase (beta chain) of Arabidopsis. B: Relative
accumulation determined from images of the nitrocellulose membrane, using the Gel
26
Quant. Net 1.8.0 software. C: Relative quantification of each spot corresponding to
proteins analyzed by western blot.
Discussion
Previously, we established a reference map for proteins in non-germinated M.
perniciosa spores (Mares et al., 2016). In this study, we established the protein profile
of M. perniciosa spores 2 and 4 hours after inoculation and compared them with the
previously generated data. A total of 141 proteins were identified by mass spectrometry,
totaling 319 when combined with those identified by Mares et al. (2016). The number
of proteins identified in other proteomic studies included 118 in Botrytis cinerea spores
(Gonzalez-Rodriguez et al. 2015), 130 in Rhizoctonia solani AG-1 sclerotia maturation
(Kwon et al. 2014), and 365 in Colletotrichum acutatum conidia germination (El-Akhal
et al. 2013). Thus, the current study identified one of the highest numbers of proteins in
spores of a phytopathogenic fungus. In addition, the accumulation of BiP, catalase A,
and ATP synthase beta proteins was validated by western blot with antibodies against
the A. thaliana proteins. The homology of these M. perniciosa proteins with the
corresponding A. thaliana proteins are 66%, 48% and 66% respectively. Alignments
between the proteins of these two species showed blocks of conserved amino acids long
enough for the presence of reactive epitopes that can be detected by polyclonal
antibodies (Supplemental Figure 3). Next, we present the discussion of comparative
proteomic profiles during the germination of M. perniciosa basidiospores.
Most spots with high molecular weight correspond to enzymes associated with
metabolic processes
The increase in the amount of high molecular weight proteins in spores 4 HAI
can be related to the increased expression of energy production machinery. Most high
molecular weight spots correspond to enzymes associated with metabolic processes
such as ATP Synthase (68.1 KDa), ATP-binding proteins (68.8 KDa), and succinate
dehydrogenase (62.3 KDa).
The distribution of spots in gels is a qualitative result that facilitates the choice
of pH and MW range in the following studies. Twenty acidic proteins were identified by
mass spectrometry. Acidic protein enrichment techniques in samples have been tested in
2-DE to analyze differences in the accumulation between acidic subproteomes of yeast
27
and hyphae in Candida albicans (Monteoliva et al. 2011). This analysis can also be
performed to identify proteins in acidic subproteomes of phytopathogenic fungi such as
M. perniciosa, M. roreri, and others. The acidic proteins identified in this study are
involved in regulating important molecular functions (spots 15, 36, 77, 80, and 88),
cytoskeleton organization (spots 97 and 305), energy metabolism (spots 19, 160, 184,
195, 304, and 700) and stress response (spots 270, 337, 714, 751, and 811). Of these
proteins, the only ones related to energy metabolism that were repressed 2 and 4 HAI
were Translation Initial Factor C (spot 19) and the ATP synthase beta subunit (spot
160), respectively.
Proteins related to metabolism and energy
Proteins associated with protein metabolism showed reduced abundance
throughout germination. Translation Initial Factor (spot 19) and nucleoside diphosphate
kinase (spot 297) decreased 2 HAI (Table 1), and Small ribosomal subunit (spot 109)
and heat shock protein (spot 263) decreased 4 HAI (Table 2). In addition to these, two
other proteins showed reduced expression after the onset of germination (spots 34 and
44) (Figure 2A). Although these proteins were not characterized in the M. perniciosa
database, BLASTP analysis shows that these spots correspond to proteins involved in
the metabolism of proteins such as 60S ribosomal protein (spot 34) and serine protease
inhibitor (spot 44). This could be related to the stress response and synthesis of new
proteins in the basidiospore’s attempt to prepare for growth of the germinative tube
(Mares et al., 2016). In addition, several heat shock proteins and other stress-related
proteins have been shown to improve the ability of non-germinated conidia to survive
environmental stresses (Cooper et al. 2006).
Other proteins related to protein metabolism were induced and some were
exclusively found 4 HAI (Figure 2). These proteins include nucleoside triphosphate
hydrolase proteins (spot 384), constituents of larger subunits of ribosomes (spot 397),
Translation elongation factor 1-alpha (spot 383), folding protein (spot 390), and HSP 70
(spot 522) (Supplementary Table 1). As expected, the final germination phase of M.
perniciosa basidiospores requires expression of several of these proteins for
transcription and synthesis of new proteins. In addition, an increase in BiP, a molecular
chaperone in the HSP 70 family (Spot 278) resident in the endoplasmic reticulum (ER),
occurred 4 HAI as shown by the cross-reaction with anti-BiP of A. thaliana (Figures 4A
and B). BiP also has a central role as a sensor of environmental stresses in the ER,
28
affecting the assembly and folding of proteins (Hendershot 2004; Malhotra and
Kaufman 2007). BiP induction during the germination of M. perniciosa suggests an
increase in ER secretory activity (Reis et al. 2011). This coincides with proteomic
studies of A. nidulans germination, in which multiple heat shock proteins were
upregulated 30 and 60 minutes after inoculation (Oh et al. 2010).
Proteins with increased expression during germination were clustered (Figure
2B). Among these, 6 are members of the ATP synthase family (spots 204, 95, 242, 99,
187, 266). An increase in the accumulation of ATP synthase can be noted in western
blot analysis (spots 197 and 204) performed in this study. These proteins may be related
to a direct increase in metabolic activity and energy production needed to meet the
energy demand for the development of the germinative tube. Conversely,
glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (spot 128, Figure 2A) showed reduced
expression after the onset of germination. This may be related to the temporary
accumulation of glycerol during germination. This phenomenon has been observed in
Phycomyces blakesleeanus and seems to occur due to the activation of cAMP-
dependent glycerol-3-phosphatase, an enzyme that indirectly participates in the
glycolytic pathway (van Schaftingen and van Laere 1985). Excessive increase of
glycerol production during spore germination can generate an increase in intracellular
osmotic pressure (d'Enfert 1997). This may explain the swelling observed in M.
perniciosa basidiospores before the start of the germinative tube emission, i.e. from 0 to
30 minutes after defrosting and introduction of basidiospores (Mares et al., 2016).
Cell cycle-related proteins and septation of the primary hypha
Interestingly, a Valosin-containing protein (VCP) was identified (spot 304). This
protein is a member of the AAA ATPase family (ATPases associated with a variety of
activities) and is characterized by the presence of two conserved domains also called
AAA (Neuwald et al. 1999). VCP is a homologue of CDC48p, which is well-conserved
among all eukaryotes and is essential for growth in Saccharomyces cerevisiae (Frohlich
et al. 1991). This protein plays a critical role in regulation of the cell cycle, and is
required for entry into mitosis (Fu et al. 2003). During the germination of basidiospores,
this protein can be associated with the process of cell division and consequently to the
growth of hyphae. Similarly, a kinesin (spot 395) was identified, a motor protein with
an important role in cell division. The kinesins are essential for the length and sliding of
microtubules inside the spindle during prophase and metaphase, as well as microtubule
29
depolymerization during anaphase (Goshima and Vale 2005).
Septin (spot 488) was another protein found only in spores 4 HAI. Since its
discovery in S. cerevisiae (Byers and Goetsch 1976) other septins have been found in
eukaryotes, especially in filamentous fungi where they control the filamentous
morphology. During septum formation, the septin ring splits in two to form a double
ring. Due to their lack of septa, septin mutants are highly sensitive, and damage in a
single hypha can result in complete lysis of a young mycelium (Pan et al. 2007). In
studies conducted with phytopathogenic basidiomycete U. maydis, the gene Sep3
played important roles in morphogenesis of the filamentous cells, in the corn infection
process, and in symptom development (Boyce et al. 2005). In Magnaporthe oryzae,
septins mediate cortex rigidity and curvature of the membrane necessary for spore
penetration of a rigid plant part, like the cuticle of the leaf, to facilitate infection
(Dagdas et al. 2012). To analyze septin function, some targeted drugs can be used,
however, for the most part these compounds are not readily available. One such
compound is forchlorfenuron (FCF; N-(2-Chloro-4-pyridyl)-N′-phenylurea; HPM300),
a plant cytokinin able to quickly induce production of abnormal septin structures in S.
cerevisiae (Iwase et al. 2004). To get an insight of how FCF binds to septin proteins,
simulations were carried out in silico from alignment of FCF’s structure to all high-
resolution crystallized structures of septin available. These studies suggested that FCF
mimics nucleotides and thus interferes with the dynamics of GTP-binding proteins by
modifying the mounting base of septin filaments (Angelis et al. 2014). In this regard,
we suggest that the septin protein might be targeted in studies focused on containing the
invasion of the fungus M. perniciosa in young tissues of cacao plants.
Response to stress-related proteins
Proteins involved with the stress response are present among the ones detected
exclusively in non-germinated basidiospores. Oxidoreductases (spots 684 and 687) and
ascorbate peroxidase (spot 688) belong to this category (Figure 3). These proteins may
be involved in a fungal adaptation to neutralize reactive oxygen species (ROS)
produced by plants as a defense mechanism (González-Rodríguez et al., 2015). In
addition, other studies have indicated that oxidative respiration is absolutely required
for germination of fungal spores (Brambl 1975; Taubitz et al. 2007).
The relative expression of catalase A detected in 2D gels of proteins 0, 2, and 4
HAI correlates with the expression of this protein detected by western blotting using an
30
anti-CatA antibody for the A. thaliana protein (Figure 4A-C). An increase in catalase
expression can be observed 2 HAI. This may contribute to the high survival of
basidiospores and mycelium of biotrophic type of M. perniciosa treated with 4 mM
hydrogen peroxide in vitro (Pungartnik et al. 2009). In addition, there was an increase in
superoxide dismutase (SOD, spot 32) 2 HAI (Table 1). SOD expression, combined with
the accumulation of a peroxiredoxin (spot 47) (Figure 2B) and catalase, suggests the
need for free radical neutralization within the germinative tube during germination.
Similarly, an increase in the accumulation of catalase A during the germinative process
of A. nidulans in the first 30 minutes after germination was previously observed (Oh et
al. 2010).
Fungal virulence-related proteins
The peptidyl-prolyl cis-trans isomerase (spot 695) is an important protein that
was detected exclusively in non-germinated spores (Supplementary Table 1). This
protein is associated with pathogenicity in B. cinerea, being characterized as an
important virulence factor in host invasion (Viaud et al. 2003). This suggests that non-
germinated basidiospores of M. perniciosa accumulate virulence factors essential for a
quick attack on the host in a similar manner to conidia of B. cinerea (Gonzalez-
Rodriguez et al. 2015).
Our results suggest that a secondary terpenoid metabolite synthesis route
associated with polyketides (Lin et al. 2013) can be enabled in M. perniciosa during
germination. The transcription factor FapR (Table 1, spot 323), that regulates both
clusters of genes involved in the biosynthesis of secondary metabolites fumagillin and
pseurotin in Aspergillus fumigatus (Wiemann et al. 2013), was induced 2 HAI. The
metabolite fumagillin is a hybrid polyketide-terpenoid compound (Lin et al. 2013).
Additionally, a polyketide synthase (gi|392596225) was identified exclusively 4 HAI
(Table 2, spot 388). The polyketide synthase belongs to a large family of enzymes
responsible for production of various secondary metabolites such as pigments, toxins,
antibiotics, and signaling molecules (Schumann and Hertweck 2006). This protein
catalyzes the first reaction of melanin biosynthesis (Butler and Day 1998) and may be
involved in the synthesis of fumagillin (Lin et al. 2013). Melanin production by
pathogenic fungi can contribute to their virulence toward human beings and cultivated
plants (Eisenman and Casadevall 2012).
31
Conclusion
Generally, the comparative proteomic analysis obtained by the combination of 2D-SDS-
PAGE with MS/MS enabled the establishment of a general scheme of biological
processes that occur during the initial developmental phase of the fungus M. perniciosa
(Figure 5).
Figure 5: General scheme of the distribution of proteins according to their biological
process, over the first 4 hours of M. perniciosa basidiospores germination.
In conclusion, in this study we showed variations in protein expression during
the early germination stages of the fungus M. perniciosa. Some proteins related to
metabolism are expressed as the germinative tube develops. Protein synthesis is
intensified during germination, as suggested by the increase in the accumulation of
ribosomal components, elongation factors, and BiP. The increase in the expression of
oxidative stress-related proteins such as superoxide dismutase and catalase can assist in
the detoxification of free radicals inside the primary hypha. Proteins associated with
fungal filamentation and, consequently, with virulence, were detected in basidiospores 4
HAI such as septin and kinesin. This indicates germinative tube is preparing for primary
hypha differentiation and host invasion. These proteins are potential targets in strategies
for fungal control, once there are inhibitory compounds readily available. Additionally,
it is possible that pathogenicity-related proteins are specific to each step of the process
of fungal infection. Virulence factors such as polyketide synthase and FapR are present
in basidiospores and the primary hypha. Thus, we proposed a likely model for the
germination of the fungus M. perniciosa (Figure 5). These studies may help to unravel
the mechanisms involved in basic processes that this pathogen evolved to survive and
32
invade the host tissue, causing one of the diseases that generates huge losses to cacao
cultivation in South and Central America.
References
Aime, M. C., and Phillips-Mora, W. 2005. The causal agents of witches' broom and
frosty pod rot of cacao (chocolate, Theobroma cacao) form a new lineage of
Marasmiaceae. Mycologia 97:1012-1022.
Anderbrhan, T. 1984. Studies on the epidemiology and control of witches’ broom
disease of cocoa in the Brazilian Amazon. Page 8 in: 9th International Cocoa
Research Conference.
Angelis, D., Karasmanis, E. P., Bai, X., and Spiliotis, E. T. 2014. In silico docking of
forchlorfenuron (FCF) to septins suggests that FCF interferes with GTP binding.
PloS one 9:e96390.
Boyce, K. J., Chang, H., D'Souza, C. A., and Kronstad, J. W. 2005. An Ustilago maydis
septin is required for filamentous growth in culture and for full symptom
development on maize. Eukaryotic cell 4:2044-2056.
Brambl, R. 1975. Characteristics of developing mitochondrial genetic and respiratory
functions in germinating fungal spores. Biochimica et biophysica acta 396:175-
186.
Butler, M. J., and Day, A. W. 1998. Fungal melanins: a review. Canadian Journal of
Microbiology 44:1115-1136.
Byers, B., and Goetsch, L. 1976. A highly ordered ring of membrane-associated
filaments in budding yeast. The Journal of cell biology 69:717-721.
Cooper, B., Garrett, W. M., and Campbell, K. B. 2006. Shotgun identification of
proteins from uredospores of the bean rust Uromyces appendiculatus.
Proteomics 6:2477-2484.
d'Enfert, C. 1997. Fungal Spore Germination: Insights from the Molecular Genetics of
Aspergillus nidulans and Neurospora crassa. Fungal Genetics and Biology
21:163-172.
Dagdas, Y. F., Yoshino, K., Dagdas, G., Ryder, L. S., Bielska, E., Steinberg, G., and
Talbot, N. J. 2012. Septin-mediated plant cell invasion by the rice blast fungus,
Magnaporthe oryzae. Science (New York, N.Y.) 336:1590-1595.
de Oliveira Ceita, G., Macêdo, J. N. A., Santos, T. B., Alemanno, L., da Silva Gesteira,
A., Micheli, F., Mariano, A. C., Gramacho, K. P., da Costa Silva, D., Meinhardt,
L., Mazzafera, P., Pereira, G. A. G., and de Mattos Cascardo, J. C. 2007.
Involvement of calcium oxalate degradation during programmed cell death in
Theobroma cacao tissues triggered by the hemibiotrophic fungus
Moniliophthora perniciosa. Plant Science 173:106-117.
Doehlemann, G., Berndt, P., and Hahn, M. 2006. Different signalling pathways
involving a Galpha protein, cAMP and a MAP kinase control germination of
Botrytis cinerea conidia. Molecular microbiology 59:821-835.
Eisenman, H. C., and Casadevall, A. 2012. Synthesis and assembly of fungal melanin.
Applied microbiology and biotechnology 93:931-940.
El-Akhal, M. R., Colby, T., Cantoral, J. M., Harzen, A., Schmidt, J., and Fernandez-
Acero, F. J. 2013. Proteomic analysis of conidia germination in Colletotrichum
acutatum. Archives of microbiology 195:227-246.
33
Evans, H. C. 1980. Pleomorphism in Crinipellis perniciosa, causal agent of witches'
broom disease of cocoa. Transactions of the British Mycological Society
74:515-523.
Frias, G. A., Purdy, L. H., and Schimidt, R. A. 1991. Infection biology of Crinipellis
perniciosa on vegetative flushes of cacao. Plant Disease 75:6.
Frias, G. A., Purdy, L. H., and Schimidt, R. A. 1995. An Inoculation Method for
Evaluating Resistance of Cacao to Crinipellis perniciosa. . Plant Disease 79:5.
Frohlich, K. U., Fries, H. W., Rudiger, M., Erdmann, R., Botstein, D., and Mecke, D.
1991. Yeast cell cycle protein CDC48p shows full-length homology to the
mammalian protein VCP and is a member of a protein family involved in
secretion, peroxisome formation, and gene expression. The Journal of cell
biology 114:443-453.
Fu, X., Ng, C., Feng, D., and Liang, C. 2003. Cdc48p is required for the cell cycle
commitment point at Start via degradation of the G1-CDK inhibitor Far1p. The
Journal of cell biology 163:21-26.
Gonzalez-Rodriguez, V. E., Lineiro, E., Colby, T., Harzen, A., Garrido, C., Cantoral, J.
M., Schmidt, J., and Fernandez-Acero, F. J. 2015. Proteomic profiling of
Botrytis cinerea conidial germination. Archives of microbiology 197:117-133.
Goshima, G., and Vale, R. D. 2005. Cell cycle-dependent dynamics and regulation of
mitotic kinesins in Drosophila S2 cells. Molecular biology of the cell 16:3896-
3907.
Hendershot, L. M. 2004. The ER function BiP is a master regulator of ER function. The
Mount Sinai journal of medicine, New York 71:289-297.
Iwase, M., Okada, S., Oguchi, T., and Toh-e, A. 2004. Forchlorfenuron, a phenylurea
cytokinin, disturbs septin organization in Saccharomyces cerevisiae. Genes &
genetic systems 79:199-206.
Kilaru, A., and Hasenstein, K. H. 2005. Development and pathogenicity of the fungus
Crinipellis perniciosa on interaction with cacao leaves. Phytopathology 95:101-
107.
Kwon, Y. S., Kim, S. G., Chung, W. S., Bae, H., Jeong, S. W., Shin, S. C., Jeong, M. J.,
Park, S. C., Kwak, Y. S., Bae, D. W., and Lee, Y. B. 2014. Proteomic analysis
of Rhizoctonia solani AG-1 sclerotia maturation. Fungal biology 118:433-443.
Lin, H. C., Chooi, Y. H., Dhingra, S., Xu, W., Calvo, A. M., and Tang, Y. 2013. The
fumagillin biosynthetic gene cluster in Aspergillus fumigatus encodes a cryptic
terpene cyclase involved in the formation of beta-trans-bergamotene. Journal of
the American Chemical Society 135:4616-4619.
Malhotra, J. D., and Kaufman, R. J. 2007. The endoplasmic reticulum and the unfolded
protein response. Seminars in cell & developmental biology 18:716-731.
Meinhardt, L. W., Rincones, J., Bailey, B. A., Aime, M. C., Griffith, G. W., Zhang, D.,
and Pereira, G. A. 2008. Moniliophthora perniciosa, the causal agent of witches'
broom disease of cacao: what's new from this old foe? Molecular plant
pathology 9:577-588.
Monteoliva, L., Martinez-Lopez, R., Pitarch, A., Hernaez, M. L., Serna, A., Nombela,
C., Albar, J. P., and Gil, C. 2011. Quantitative proteome and acidic subproteome
profiling of Candida albicans yeast-to-hypha transition. Journal of proteome
research 10:502-517.
Neuwald, A. F., Aravind, L., Spouge, J. L., and Koonin, E. V. 1999. AAA+: A class of
chaperone-like ATPases associated with the assembly, operation, and
disassembly of protein complexes. Genome research 9:27-43.
Noir, S., Colby, T., Harzen, A., Schmidt, J., and Panstruga, R. 2009. A proteomic
34
analysis of powdery mildew (Blumeria graminis f.sp. hordei) conidiospores.
Molecular plant pathology 10:223-236.
Oh, Y. T., Ahn, C. S., Kim, J. G., Ro, H. S., Lee, C. W., and Kim, J. W. 2010.
Proteomic analysis of early phase of conidia germination in Aspergillus
nidulans. Fungal genetics and biology : FG & B 47:246-253.
Pan, F., Malmberg, R. L., and Momany, M. 2007. Analysis of septins across kingdoms
reveals orthology and new motifs. BMC evolutionary biology 7:103.
Pires, A. B., Gramacho, K. P., Silva, D. C., Goes-Neto, A., Silva, M. M., Muniz-
Sobrinho, J. S., Porto, R. F., Villela-Dias, C., Brendel, M., Cascardo, J. C., and
Pereira, G. A. 2009. Early development of Moniliophthora perniciosa
basidiomata and developmentally regulated genes. BMC microbiology 9:158.
Pungartnik, C., Melo, S. C., Basso, T. S., Macena, W. G., Cascardo, J. C., and Brendel,
M. 2009. Reactive oxygen species and autophagy play a role in survival and
differentiation of the phytopathogen Moniliophthora perniciosa. Fungal genetics
and biology : FG & B 46:461-472.
Purdy, L. H., and Schmidt, R. A. 1996. Status of cacao witches' broom: biology,
epidemiology, and management. Annu Rev Phytopathol 34:573-594.
Reis, P. A., Rosado, G. L., Silva, L. A., Oliveira, L. C., Oliveira, L. B., Costa, M. D.,
Alvim, F. C., and Fontes, E. P. 2011. The binding protein BiP attenuates stress-
induced cell death in soybean via modulation of the N-rich protein-mediated
signaling pathway. Plant physiology 157:1853-1865.
Scarpari, L. M., Meinhardt, L. W., Mazzafera, P., Pomella, A. W., Schiavinato, M. A.,
Cascardo, J. C., and Pereira, G. A. 2005. Biochemical changes during the
development of witches' broom: the most important disease of cocoa in Brazil
caused by Crinipellis perniciosa. Journal of experimental botany 56:865-877.
Schumann, J., and Hertweck, C. 2006. Advances in cloning, functional analysis and
heterologous expression of fungal polyketide synthase genes. Journal of
biotechnology 124:690-703.
Sena, K., Alemanno, L., and Gramacho, K. P. 2014. The infection process of
Moniliophthora perniciosa in cacao. Plant Pathology 63:1272-1281.
Seong, K. Y., Zhao, X., Xu, J. R., Guldener, U., and Kistler, H. C. 2008. Conidial
germination in the filamentous fungus Fusarium graminearum. Fungal genetics
and biology : FG & B 45:389-399.
Taubitz, A., Bauer, B., Heesemann, J., and Ebel, F. 2007. Role of respiration in the
germination process of the pathogenic mold Aspergillus fumigatus. Current
microbiology 54:354-360.
van Schaftingen, E., and van Laere, A. J. 1985. Glycerol formation after the breaking of
dormancy of Phycomyces blakesleeanus spores. Role of an interconvertible
glycerol-3-phosphatase. European journal of biochemistry / FEBS 148:399-404.
Viaud, M., Brunet-Simon, A., Brygoo, Y., Pradier, J. M., and Levis, C. 2003.
Cyclophilin A and calcineurin functions investigated by gene inactivation,
cyclosporin A inhibition and cDNA arrays approaches in the phytopathogenic
fungus Botrytis cinerea. Molecular microbiology 50:1451-1465.
Villela-Dias, C., Camillo, L. R., de Oliveira, G. A., Sena, J. A., Santiago, A. S., de
Sousa, S. T., Mendes, J. S., Pirovani, C. P., Alvim, F. C., and Costa, M. G. 2014.
Nep1-like protein from Moniliophthora perniciosa induces a rapid proteome and
metabolome reprogramming in cells of Nicotiana benthamiana. Physiologia
plantarum 150:1-17.
Wiemann, P., Guo, C. J., Palmer, J. M., Sekonyela, R., Wang, C. C., and Keller, N. P.
2013. Prototype of an intertwined secondary-metabolite supercluster.
35
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America 110:17065-17070.
Zahiri, A. R., Babu, M. R., and Saville, B. J. 2005. Differential gene expression during
teliospore germination in Ustilago maydis. Molecular genetics and genomics :
MGG 273:394-403.
Supplemental Figures:
Supplemental Figure 1: Distribution of the spots and their respective molecular weight
in the 0, 2 and 4 HAI.
36
Supplemental Figure 2: Distribution of the spots and their respective isoelectric point
in the 0, 2 and 4 HAI.
37
Supplemental Figure 3: Sequence alignment of the target proteins identified in the
38
western blots and their homologous in plant recognized by the antibodies. A – Sequenc
ealignment between BiP from A. thaliana and the HSP70 from Moniliophthora
perniciosa. B – Sequence alignment of the ATP synthase from A. thaliana and its
homologous in Moniliophthora perniciosa. C – Sequence alignment of the catalase A
from A. thaliana and its homologous in Moniliophthora perniciosa
39
Supplemental Tables
Supplemental Table 1: Total spots identified in the MS/MS. In sequence, mw corresponds to a molecular mass values, the isoelectric point pI
estimated; number of peptides by MS / MS; Score of sequence, sequence coverage and peptide sequence. All values were calculated by Mascot
at http:. //www.matrixscience.com
Spot
number
Acession
number
NCBI nr
Protein name (Putative function) MW pI cal.
Masc
peptide n Score coverage
%
15 gi|61676645 14.3.3 protein ( mecanism regulatory) 28817 4,71 2 154 9
19 gi|145228831 eukaryotic translation initiation factor 5A 18007 4,5996 1 83 7,6
20 gi|169869524 structural constituent of ribosome 16396 10,34 1 61 8
22 gi|170087590 nucleoside-triphosphatase activity 90430 4,92 6 203 7
25 gi|238596609 PPIases accelerate the folding of proteins 21614 7,77 3 108 9
27 gi|238597794 oxidoreductase activity 19773 7,07 3 57 16
32 gi|75991675 superoxide dismutase activity 22144 7,07 2 96 13
34 gi|238585898 hypothetical protein MPER_09632 23860 10,47 3 206 15
36 gi|429116 putative heat-shock protein 70 kDa, partial 55388 4,55 1 180 3
38 gi|238565951 glycolipid transporter activity 16.945 8,93 2 124 18
39 gi|70986899 L-malate dehydrogenase activity 35876 9,08 3 75 11
40
41 gi|238579796 pyridoxamine-phosphate oxidase activity 22372 5,97 5 202 22
44 gi|238616305 hypothetical protein MPER_00237 7148 6,18 2 125 43
45 gi|353235779 elated to HSP70 heat shock protein 70 (hsp70) 70700 5,9 3 141 4
47 gi|238604003 peroxiredoxin activity 13731 8,15 3 125 19
49 gi|325662687 CRISPR-associated protein cas1 39687 9,2 8 70 12
55 gi|71005690 nucleocytoplasmic transport/GTPase activity 24485 6,6 3 140 15
56 gi|238588706 nucleotide binding 17163 8,76 2 70 15
57 gi|392562483 ATPase V1/A1 complex subunit E 25622 5,65 4 220 13
58 gi|238604003 hypothetical protein MPER_03743 13731 8,15 3 95 21
61 gi|238589203 catalytic activity/Putative uncharacterized protein 28846 5,23 5 89 26
67 gi|302680901 6-phosphogluconolactonase activity 28823 5,87 2 109 12
72 gi|238610635 hypothetical protein MPER_01744 17988 9,59 4 175 27
74 gi|71024269 actin [Ustilago maydis 521] 41674 5,56 4 76 10
75 gi|238592806 6-phosphogluconolactonase activity 26464 5,7 2 85 8
76 gi|238568761 hypothetical protein MPER_15220 19779 8,88 3 100 21
77 gi|170091548 14-3-3 protein 29025 4,72 25 356 49
78 gi|170094730 ATP binding 67109 5,49 4 261 8
80 gi|6692796 protein domain specific binding 29009 4,67 2 124 8
82 gi|392593057 ribosomal protein S3Ae 29643 9,89 4 195 12
85 gi|320454976 ATP synthase beta subunit 53091 5,02 2 61 7
41
86 gi|241729762 hydrogen ion transporting ATP synthase activity,
rotational mechanism
60811 5,63 11 380 8
88 gi|238577244 hypothetical protein MPER_12668 13013 4,88 4 101 17
89 gi|238591230 Hipotetical protein 14077 9,74 4 206 39
90 gi|134093561 GTP cyclohydrolase I activity 29267 5,6 1 68 4
92 gi|302695459 inorganic diphosphatase activity 33083 5,55 2 79 6
93 gi|238601242 hypothetical protein MPER_04599 23278 6,58 3 142 18
94 gi|170087348 predicted protein 57818 5,56 3 188 6
95 gi|238576941 hypothetical protein MPER_12791 26384 9,23 3 90 12
97 gi|71005404 GTPase activity 49585 4,92 2 62 6
99 gi|522048074 F0F1-type ATP synthase, beta subunit, putative 60811 8,66 3 380 37
102 gi|170087850 phosphoglucomutase 61035 5,63 3 129 6
107 gi|238608426 Hypotetical protein 26620 9,61 12 262 22
109 gi|238608426 small ribosomal subunit 26620 9,61 2 125 10
112 gi|238593443 hypothetical protein MPER_07111 18178 9,5 7 302 35
115 gi|170117359 predicted protein 36315 6,42 10 129 8
121 gi|61676637 glutamine synthetase 39369 6,05 4 217 13
122 gi|71406398 transaldolase 36595 5,96 2 72 6
124 gi|1507725 Aspartic protease /aspartic-type endopeptidase
activity
49673 7,69 2 57 2
42
126 gi|308197112 Nautilin-63/ chitin binding 33147 9,2 1 65 6
127 gi|238578412 hypothetical protein MPER_12242 34479 5,49 7 346 27
128 gi|70780048 Glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase/glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase (NAD+) (phosphorylating) activity
37133 7,07 4 160 7
129 gi|238593443 Malate dehydrogenase/nucleotide binding 18178 9,5 4 129 44
131 gi|238583801 Putative uncharacterized protein/hydrolase
activity, hydrolyzing O-glycosyl compounds
22597 5,47 4 155 28
135 gi|238578673 hypothetical protein MPER_12143 36086 5,47 5 177 20
137 gi|238578673 hypothetical protein MPER_12143 36086 5,47 5 106 22
139 gi|58262444 acyl-CoA oxidase 47644 6,02 1 59 2
141 gi|302686514 hypothetical protein SCHCODRAFT_85085 90228 261 8 261 5
146 gi|299755136 succinate-CoA ligase 45011 5,91 3 86 5
149 gi|238593028 transaminase activity 17324 5,26 1 60 6
151 gi|170095049 structural constituent of ribosome 29347 9,07 3 90 12
153 gi|14194452 Actin-2/ATP binding 41979 5,31 19 768 39
158 gi|393215294 actin 1 41987 5,31 749 31
160 gi|1374715 ATP synthase subunit beta, mitochondrial/ATP
binding, calcium ion binding, hydrogen ion
transporting ATP synthase activity, rotational
51171 4.92 9 332 15
43
mechanism, hydrogen-exporting ATPase activity,
phosphorylative mechanism, lipoprotein particle
receptor activity
162 gi|393215294 Actin 1 41987 5.31 8 347 19
164 gi|6628 Actin-1/3 , /ATP binding 42024 5.30 3 71 10
165 gi|238565140 /transferase activity, transferring acyl groups other
than amino-acyl groups
16427 9.87 10 429 54
168 gi|238565140 /transferase activity, transferring acyl groups other
than amino-acyl groups
16427 9.87 2 72 23
169 gi|169844380 6-phosphogluconate dehydrogenase 53846 6.17 23 466 17
170 gi|302677927 S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase 47366 5.83 10 328 18
171 gi|238577896 hypothetical protein MPER_12437 44352 6.37 5 170 15
174 gi|238585247 ATP synthase subunit alpha/proton-transporting
ATPase activity, rotational mechanism
38935 9.33 4 205 16
177 gi|169869158 ATP-dependent RNA helicase eIF4A/nucleic acid
binding
45456 5.15 5 254 14
178 gi|238566324 /translation elongation factor activity 20427 64
181 gi|170096756 Adenosylhomocysteinase/adenosylhomocysteinase
activity
47098 5.88 3 86 6
182 gi|398392944 cdc12 like protein 44197 8,55 3 122 8
44
183 gi|288905378 O-acetylhomoserine (Thiol)-lyase /lyase activity 46511 5.02 1 64 2
184 gi|238611335 metalloendopeptidase activity 16273 4.59 2 77 14
187 gi|238600618 ATP binding 26977 5.16 2 111 14
188 gi|238566324 translation elongation factor activity 20427 8.80 4 159 26
189 gi|390604703 rab GDP-dissociation inhibitor [Punctularia
strigosozonata HHB-11173 SS5]
50272 5,24 8 337 18
190 gi|238614748 GTP binding, structural molecule activity 18573 6.63 2 76 16
191 gi|238573081 Transferase activity, transferring alkyl or aryl
(other than methyl) groups
11457 7.90 1 82 12
195 gi|238611335 hypothetical protein MPER_01542 16387 4,59 2 80 14
197 gi|393245698 ATP synthase F1, beta subunit 58080 5.89 64 191 14
199 gi|238583897 /glycine hydroxymethyltransferase activity 29799 6.62 5 258 11
200 gi|67043884 Translation elongation factor 1-alpha/translation
elongation factor activity
35859 8.53 2 89 9
203 gi|169844380 6-phosphogluconate dehydrogenase/
decarboxylating/phosphogluconate dehydrogenase
(decarboxylating) activity
53846 6.17 5 157 10
204 gi|393245698 ATP synthase F1, beta subunit 58080 5.89 8 450 18
207 gi|238585247 hipotetical protein 38935 9.33 56 798 47
209 gi|336366127 hypothetical protein SERLA73DRAFT_188396 54135 7,69 3 137 8
45
210 gi|630173551 hypothetical protein Moror_17341 57098 5.19 4 204 8
213 gi|238585247 Moniliophthora perniciosa FA553 38935 9.33 3 216 11
215 gi|238601659 hypothetical protein MPER_04475 36552 6.35 4 126 14
217 gi|170099379 acyl-CoA-dehydrogenase, peroxisomal 57898 8.04 9 151 7
223 gi|238603349 hypothetical protein MPER_03935 20501 5.87 2 169 14
224 gi|169861658 Coprinopsis cinerea okayama 49695 5.13 14 225 13
226 gi|170097792 UTP-glucose-1-phosphate
uridylyltransferase/UTP:glucose-1-phosphate
uridylyltransferase activity
56858 8.49 9 343 17
229 gi|75910334 Response Regulator Receiver Signal Transduction
Histidine Kinase/protein-glutamate methylesterase
activity
49964 5.33 7 79 19
231 gi|238585247 hypothetical protein MPER_09856 38935 9.33 11 525 29
233 gi|238585247 hypothetical protein/hydrogen ion transporting
ATP synthase activity, rotational mechanism
proton-transporting ATPase activity, rotational
mechanism
38935 9.33 5 298 18
234 gi|3318722 Chain E, Leech-Derived Tryptase
InhibitorTRYPSIN COMPLEX/serine-type
endopeptidase activity
24142 8.26 4 191 17
46
236 gi|238600895 hypothetical protein MPER_04711 19701 9.81 3 149 20
239 gi|238590475 /nucleotidyltransferase activity 21068 6.11 7 391 47
240 gi|238608124 hypothetical protein MPER_02477 30472 4.89 2 65 8
242 gi|229485425 FMRFamide-7 972 5.91 1 28 87
247 gi|238590475 Nucleotidyltransferase activity 21068 6.11 3 132 21
249 gi|302681769 succinate dehydrogenase activity 62272 8.11 14 508 16
250 gi|390594669 chaperonin GroL 62301 5.38 15 532 18
252 gi|302681769 hypothetical protein SCHCODRAFT_69018 62272 8.11 15 350 13
253 gi|302681769 hypothetical protein SCHCODRAFT_69018
succinate dehydrogenase activity
62272 8.11 7 233 4
262 gi|170094730 predicted protein 68830 5.49 3 115 4
263 gi|299754101 heat shock protein 67280 5.33 5 278 10
265 gi|238593465 hypothetical protein MPER_07102 8983 9.70 2 67 29
266 gi|302692408 hypothetical protein SCHCODRAFT_81271 68105 5.48 5 164 7
267 gi|71005380 unfolded protein binding/hypothetical protein
UM01209.1
72321 5.63 4 201 3
268 gi|299753594 Heat shock cognate 70 / ATP binding 70717 5.09 16 748 20
270 gi|148271329 molecular chaperone DnaK /unfolded protein
binding
67112 4.65 2 147 4
278 gi|390598102 heat shock cognate 70 70364 5,13 6 229 12
47
284 gi|299738966 aconitase/aconitate hydratase activity 84985 6.23 3 130 3
287 gi|116196472 CHGG_04834 ATP binding 84800 5.07 2 154 3
297 gi|170093996 predicted protein 16753 6.84 3 76 13
301 gi|238584385 hypothetical protein MPER_10155 heme binding 14254 4.81 5 146 26
304 gi|169848944 valosin-containing protein / nucleoside-
triphosphatase activity
90192 4.91 5 200 6
305 gi|238606531 Putative uncharacterized protein 18936 4.99 8 285 31
306 gi|595780898 hypothetical protein FOMMEDRAFT_148130 16262 5,26 4 206 33
310 gi|238565140 hypothetical protein MPER_16210 / transferase
activity, transferring acyl groups other than amino-
acyl groups
16427 9.87 ? 113 45
311 gi|58258893 Acetyl-CoA C-acyltransferase, putative /
transferase activity, transferring acyl groups other
than amino-acyl groups
43760 7.01 1 60 5
312 gi|169864529 Succinate dehydrogenase/oxidoreductase activity 31286 8.49 2 77 7
314 gi|238588195 electron carrier activity 29113 8.46 3 65 11
320 gi|395334576 succinate-CoA ligase 34700 9,36 2 134 7
324 gi|336364162 oxidoreductase activity 38339 5.62 4 168 12
325 gi|238588592 Aspartate aminotransferase/pyridoxal phosphate
binding
21992 7.31 9 414 30
48
326 gi|238588592 Aspartate aminotransferase/pyridoxal phosphate
binding
21992 7.31 3 95 12
337 gi|238568934 protein disulfide oxidoreductase activity 17653 4.64 6 285 44
341 gi|302695081 Pyruvate kinase/pyruvate kinase activity 58231 6.00 2 99 3
346 gi|170097613 Predicted protein/ATP binding 73590 5.17 14 662 15
351 gi|392597904 enolase 47350 6,12 4 188 9
353 gi|170097613 ATP binding 73590 5.17 3 146 4
359 gi|390598392 nucleoside diphosphate kinase 16822 6,97 3 92 25
362 gi|18654466 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 18169 5.93 1 84 7
378 gi|169849981 argininosuccinate synthetase 47673 5,28 8 276 10
381 gi|393220879 isocitrate dehydrogenase 47350 5,99 9 301 14
383 gi|66473253 translation elongation factor 1-alpha 39018 7,29 4 198 13
384 gi|392597600 P-loop containing nucleoside triphosphate
hydrolase protein
94732 6,19 4 165 6
385 gi|170094810 Ligase 74987 7,57 1 84 1
386 gi|299749855 6-phosphofructokinase 91797 8,44 3 119 4
388 gi|392596225 polyketide synthetase 115428 5,9 8 366 8
390 gi|238591928 hypothetical protein MPER_07626 40526 8,84 1 66 4
395 gi|392566811 kinesin heavy chain 107763 5,8 5 241 7
397 gi|440640565 large subunit ribosomal protein L30e 11916 9,7 6 240 22
49
398 gi|238592521 hypothetical protein MPER_07428 42668 6,62 1 60 3
399 gi|395328573 NAD-dependent glutamate dehydrogenase 119422 6,39 4 260 6
400 gi|390602556 RNA-binding domain-containing protein 15629 6,54 3 93 9
402 gi|242212506 60S ribosomal protein L17/L23 14811 10,2 5 207 30
404 gi|238584385 hypothetical protein MPER_10155 14254 4,81 1 62 14
405 gi|238606531 hypothetical protein MPER_02967 18936 4,99 23 867 59
407 gi|170106427 60S ribosomal protein L18 20994 11,04 1 81 6
408 gi|238609693 hypothetical protein MPER_02009 14957 5,72 4 140 47
410 gi|392569814 40S ribosomal protein S5-1 22628 9,84 4 266 18
412 gi|393215789 ATP synthase d subunit 19217 6,93 3 117 12
413 gi|336373463 hypothetical protein SERLA73DRAFT_103829 22597 5,7 12 427 24
415 gi|390599287 60S ribosomal protein L10 25270 10,3 5 191 18
416 gi|238579620 hypothetical protein MPER_11800 35911 6,06 2 134 7
417 gi|409082095 hypothetical protein AGABI1DRAFT_111072 33918 6,07 4 230 16
418 gi|70780048 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 37133 7,07 4 235 12
419 gi|395335098 proteasome subunit alpha type 5 27015 5,05 14 426 29
420 gi|238566502 hypothetical protein MPER_15840 11063 5,01 3 159 35
421 gi|393217697 40S ribosomal protein S8 C170:C191 23846 10,93 3 159 12
424 gi|170089877 20S proteasome subunit 27962 7,85 2 143 7
425 gi|58258181 prohibitin PHB1 30376 7,9 3 101 11
50
428 gi|307206434 Succinate dehydrogenase [ubiquinone] iron-sulfur
subunit, mitochondrial [Harpegnathos saltator]
26478 8,94 3 162 10
429 gi|238579307 hypothetical protein MPER_11912 22361 10,56 4 113 15
430 gi|238568133 hypothetical protein MPER_15399 10878 8,52 5 253 43
431 gi|2706555 succinate dehydrogenase iron-sulfur subunit 28836 8,13 3 230 9
432 gi|1749530 unnamed protein product 56165 8,09 1 59 3
435 gi|238568133 hypothetical protein MPER_15399 10878 8,52 5 229 49
438 gi|392597175 hypothetical protein CONPUDRAFT_161234 29741 6,86 5 195 15
441 gi|238605728 hypothetical protein MPER_03217 11553 8,26 7 308 61
442 gi|353237732 probable 40S ribosomal protein S2 28426 10,25 4 183 17
445 gi|393243068 voltage-dependent ion-selective channel 31922 9,05 2 146 6
446 gi|238588195 hypothetical protein MPER_08879 29113 8,46 2 71 10
447 gi|238566278 hypothetical protein MPER_15904 13255 4,94 1 50 11
450 gi|392593057 ribosomal protein S3Ae 29643 9,89 3 92 9
451 gi|238605728 hypothetical protein MPER_03217 11553 8,26 2 85 26
452 gi|238588748 hypothetical protein MPER_08697 15466 6,58 4 126 21
453 gi|238577092 hypothetical protein MPER_12724 33843 6,34 1 74 4
454 gi|336383933 F-actin capping protein 30913 4,82 3 150 11
456 gi|299743770 2-nitropropane dioxygenase 36153 8,2 3 107 4
457 gi|238579827 hypothetical protein MPER_11741 32143 6 2 60 9
51
458 gi|302678229 hypothetical protein SCHCODRAFT_44661 27409 8,83 1 63 3
460 gi|238584839 hypothetical protein MPER_09999 38146 5,78 1 62 5
461 gi|6015061 Elongation factor 1-alpha 50444 9,2 7 262 13
464 gi|238579827 hypothetical protein MPER_11741 32143 6 16 435 37
465 gi|299752705 proteasome regulatory subunit 12 37925 5,28 2 223 9
466 gi|6015061 Elongation factor 1-alpha 50444 9,2 9 345 16
467 gi|58758727 translation elongation factor EF1-alpha 44499 8,55 5 201 17
469 gi|238597707 hypothetical protein MPER_05711 29403 5,4 17 791 55
470 gi|1535 unnamed protein product 38195 5,94 1 53 4
471 gi|392593272 acetolactate synthase 38789 7,85 5 193 20
472 gi|395334576 succinate-CoA ligase 34700 9,36 2 135 7
473 gi|58758727 translation elongation factor EF1-alpha 44499 8,55 4 171 12
474 gi|409081769 actin 1 42052 5,31 9 433 25
476 gi|393248185 translation elongation factor 50380 9,2 17 491 23
477 gi|34330248 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 36760 7,6 4 134 8
478 gi|238608655 hypothetical protein MPER_02316 17291 4,98 5 212 25
479 gi|238588592 hypothetical protein MPER_08751 21992 7,31 7 370 31
480 gi|328766758 hypothetical protein BATDEDRAFT_37532 31328 5,54 2 67 4
481 gi|58758727 translation elongation factor EF1-alpha 44499 8,55 19 443 19
482 gi|392560351 GDP-mannose 4,6-dehydratase 45689 7,16 9 348 22
52
483 gi|170084477 predicted protein 94069 6,24 3 88 2
484 gi|409081931 hypothetical protein AGABI1DRAFT_97319 36121 5,24 3 140 7
486 gi|169848944 valosin-containing protein 90192 4,91 9 354 8
487 gi|169864162 60S ribosomal protein L4 40999 11,36 7 372 25
488 gi|299755817 septin 42130 5,08 3 187 9
490 gi|170095049 40S ribosomal protein S3 29347 9,07 4 246 17
491 gi|21229690 3-oxoacyl-ACP synthase 36891 5,58 3 65 3
492 gi|238613709 hypothetical protein MPER_00887 17901 6,67 3 107 16
493 gi|402225401 heat shock cognate 70 70687 5,12 6 303 11
494 gi|238565140 hypothetical protein MPER_16210 16427 9,87 5 261 34
495 gi|393245698 ATP synthase F1, beta subunit 58080 5,89 13 530 23
498 gi|393220373 26S proteasome subunit P45 46624 5,36 16 584 27
499 gi|393245927 26S proteasome subunit P45 50830 5,95 7 441 19
500 gi|389741848 2-methylcitrate dehydratase 60866 8,58 9 514 15
501 gi|336371323 hypothetical protein SERLA73DRAFT_179784 53397 6,22 8 141 15
502 gi|169844743 26S proteasome non-ATPase regulatory subunit
12
54847 7,19 6 257 11
505 gi|170096726 aconitate hydratase 2 83306 6 4 115 3
506 gi|238570854 hypothetical protein MPER_14616 15274 5,34 2 90 11
507 gi|389744766 26S proteasome subunit P45 47457 4,95 13 532 31
53
508 gi|170087850 phosphoglucomutase 61035 5,63 6 358 11
509 gi|299744867 phosphoglucomutase 63398 5,49 9 272 12
512 gi|238595936 hypothetical protein MPER_06279 32157 5,87 6 296 21
514 gi|389739603 T-complex protein 1 60005 5,86 2 90 4
515 gi|170085801 calnexin 60167 4,85 2 59 4
516 gi|238588310 hypothetical protein MPER_08844 41095 6,08 9 299 36
517 gi|393216883 heat shock protein HSS1 72717 5,17 7 336 13
518 gi|238591928 hypothetical protein MPER_07626 40526 8,84 1 99 4
519 gi|238583378 hypothetical protein MPER_10535 53875 8,87 7 119 16
520 gi|238602887 hypothetical protein MPER_04084 24760 4,57 3 108 7
521 gi|397648746 dihydroxyacetone synthase 71858 6,27 14 596 25
522 gi|299741158 hsp70-like protein 71962 5,11 24 911 21
524 gi|395331560 glycyl-tRNA synthetase 72984 5,93 4 174 4
525 gi|238576970 hypothetical protein MPER_12779 64963 6,02 3 191 7
526 gi|409081292 ATP1 alpha subunit of the F1 sector of
mitochondrial F1F0 ATP synthase [Agaricus
bisporus var. burnettii JB137-S8]
58272 9,15 7 312 15
528 gi|242780882 spore-specific catalase CatA 83951 6,68 2 81 2
529 gi|238589951 hypothetical protein MPER_08293 16701 6,74 3 117 35
530 gi|238586468 hypothetical protein MPER_09428 38972 5,36 3 111 8
54
531 gi|238592521 hypothetical protein MPER_07428 42668 6,62 3 98 6
532 gi|392597600 P-loop containing nucleoside triphosphate
hydrolase protein
94732 6,19 9 414 13
533 gi|353227227 probable EFT2-translation elongation factor eEF2 87854 6,23 6 211 12
534 gi|238592521 hypothetical protein MPER_07428 42668 6,62 7 290 19
537 gi|118594750 phosphoserine aminotransferase 40630 6,02 1 93 3
538 gi|238591077 hypothetical protein MPER_07904 31652 7,66 4 183 12
539 gi|392567159 Adenylosuccinate synthetase 47778 6,48 6 275 14
542 gi|392571029 eukaryotic translation elongation factor 2 94118 6,15 4 220 4
543 gi|170084477 predicted protein 94069 6,24 7 125 11
544 gi|170097792 UTP-glucose-1-phosphate
uridylyltransferase+C258:C279
56858 8,49 17 707 33
545 gi|238603498 hypothetical protein MPER_03886 13557 8,87 2 89 2
546 gi|170104184 beta-tubulin 1 tubb1 50416 4,79 15 464 27
547 gi|238583862 hypothetical protein MPER_10349 22351 7,42 2 73 6
548 gi|170116680 60S ribosomal protein L23 14816 10,07 2 62 10
549 gi|389742654 transaldolase 36245 5,84 3 188 9
551 gi|238565140 hypothetical protein MPER_16210 16427 9,87 9 390 46
555 gi|238585247 hypothetical protein MPER_09856 38935 9,33 13 321 45
556 gi|389629144 vacuolar protein sorting-associated protein 1 77325 8,5 2 104 4
55
557 gi|238585247 hypothetical protein MPER_09856 38935 9,33 7 153 27
558 gi|238587386 hypothetical protein MPER_09111 27196 5,78 2 92 11
562 gi|170085801 calnexin 60167 2 112
619 gi|390597964 inositol phosphatase 37052 5 152
635 gi|1749530 6-phosphogluconate dehydrogenase,
decarboxylating
56165 2 102
638 gi|238600618 ATP-binding 26977 2 79
642 gi|389745484 ATP synthase F1 alpha subunit 58733 11 386
645 gi|189191514 dihydrolipoyl dehydrogenase, mitochondrial
precursor
54684 2 64
649 gi|170097792 UTP-glucose-1-phosphate uridylyltransferase 56858 5 113
651 gi|170087850 phosphoglucomutase 61035 5 180
655 gi|392569756 chaperonin-containing T-complex zeta subunit
Cct6
60044 6.59 2 84 4
658 gi|302692708 Oxirredutase 70947 3 92
667 gi|392571029 eukaryotic translation elongation factor 2 94118 2 108
668 gi|238589951 hypothetical protein MPER_08293 16701 6.74 2 59 17
670 gi|392571029 eukaryotic translation elongation factor 2 94118 4 198
672 gi|238603935 hypothetical protein MPER_03761 21676 1 60
673 gi|71020137 ATPase activity 117438 2 68
56
684 gi|238585695 oxidoreductase activity 20750 6.17 3 102 21
687 gi|238576941 oxidoreductase activity 26384 9.23 4 193 19
688 gi|559005 Ascorbate peroxidase/heme binding 27656 5.43 1 63 4
695 gi|237824249 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase/protein folding 17721 8.99 9 402 45
698 gi|238588282 aldehyde-lyase activity 9966 5.37 6 257 37
700 gi|238584608 ATP binding 29158 4.54 8 396 18
707 gi|215463501 MPER_05655 29725 5,34 7 61 33
710 gi|170094152 Proteasome subunit alpha type/ threonine-type
endopeptidase activity
29740 8.35 3 118 14
714 gi|7549229 heat shock protein 90 ATP binding, unfolded
protein binding
78939 4.82 2 97 3
717 gi|238593443 Malate dehydrogenase/nucleotide binding 18178 6 217
718 gi|73745439 Heat shock protein 90/ ATP binding, unfolded
protein binding
14204 7.98 2 90 19
719 gi|238593443 hypothetical protein MPER_07111 18178 9.50 6 217 36
727 gi|238570289 Putative uncharacterized protein/None 9911 9.53 1 64 13
728 gi|238588592 hypothetical protein MPER_08751 21992 7.31 4 153 24
732 gi|7199 Actin-3/structural constituent of cytoskeleton 42117 5.25 3 80 10
735 gi|70780048 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 37133 7,07 3 79 6
739 gi|302690980 Heat-shock protein 90/ATP binding,unfolded 80266 3 139
57
protein binding
742 gi|50424825 DEHA2F14740p /nucleoside-triphosphatase
activity
46556 5.43 2 91 5
747 gi|238605505 Putative uncharacterized protein/None 17558 8.61 2 104 15
751 gi|302690980 heat-shock protein 90 80266 4.95 3 139 5
759 gi|170087204 predicted protein 71300 5,12 8 80 12
769 gi|1703157 Actin/ATP binding 41938 5.38 3 85 13
772 gi|170097792 UTP-glucose-1-phosphate
uridylyltransferase/UTP:glucose-1-phosphate
uridylyltransferase activity
56858 8.49 3 122 5
773 gi|238575793 Putative uncharacterized protein 38029 6.08 12 600 36
774 gi|170084385 Predicted protein . 57773 5.77 3 153 8
776 gi|169861658 Alpha1 tubulin/structural molecule activity 49695 5.13 4 197 10
780 gi|82561913 ATP synthase F0 subunit 9 1658 8.53 1 30 94
782 gi|238608426 hypothetical protein MPER_02384 26620 9.61 2 153 10
786 gi|238594848 hypothetical protein MPER_06644 30095 6,85 1 87 5
788 gi|170094730 Predicted protein/ATP binding 67109 5.49 3 90 6
789 gi|390598102 heat shock cognate 70 [ 70364 5,13 8 315 14
792 gi|170097613 predicted protein 73590 5,17 5 214 8
793 gi|490512397 arginine repressor 17357 9,1 5 65 18
58
811 gi|302690980 heat-shock protein 90 80266 4.95 4 165 6
Supplemental Table 2: Ratio values for each protein spot used to perform the hierarchical clustering analysis.
Spot
number:
Protein name (Putative
function):
gel3_0: gel1_0: gel2_0: r 1 2hs: r 2 2hs: r 3 2hs: r 1 4hs: r 2 4hs: r 3 4hs:
19 eukaryotic translation initiation
factor 5A
1,67089 1,15852 1,96513 0,56952
9
0,56922
6
0,59312
8
0,77900
2
0,76086 0,93370
7
20 structural constituent of ribosome 2,17848 0 1,45791 0,68544 0,68507
6
0,71384
2
0,85094
8
1,44017 0,98813
7
25 PPIases accelerate the folding of
proteins
1,07795 1,13136 1,57934 0,86654
7
0,86608
7
0,90245
3
0,90736
3
0,75291
7
0,91597
9
27 oxidoreductase activity 0,85989
4
1,30874 0,84284
3
1,14573 1,14512 1,19321 0,91810
3
0,75496
2
0,83140
1
32 superoxide dismutase activity 0,80424
6
0,69498
5
1,04364 1,23861 1,23795 1,28993 1,14572 0,65096 0,89396
6
34 hypothetical protein
MPER_09632
2,46838 2,35232 1,0005 0,52510
9
0,52483 0,54686
7
0,73306
9
0,49696
2
0,35195
8
38 glycolipid transporter activity 1,11979 1,4911 1,27897 0,81356 0,81312
7
0,84727 0,80793
4
0,98404
7
0,84420
9
39 L-malate dehydrogenase activity 0,94991 0 0,75450 0,85406 0,85360 0,88944 1,00034 2,57416 1,12397
59
2 7 6 8
41 pyridoxamine-phosphate oxidase
activity
0,66058
8
0,64704
9
0,94796
5
1,2073 1,20666 1,25732 1,11121 0,81955
5
1,14235
44 sequencia incompleta 1,52667 1,89212 1,74351 0,64664
1
0,64629
8
0,67343
5
0,68234
7
0,57505
8
0,61392
1
47 peroxiredoxin activity 0,75079
1
0,63650
4
0,98118
3
1,14938 1,14877 1,19701 1,42914 0,75809
9
0,94913
49 triosephosphate isomerase 0,74057
3
0,63414
9
0,95049
8
1,23966 1,239 1,29103 0,91747
9
0,92055
7
1,06705
55 nucleocytoplasmic
transport/GTPase activity
1,80493 1,11747 1,00196 0,84046
8
0,84002
1
0,87529
3
0,93210
4
0,85765
9
0,73009
3
56 nucleotide binding 0,84959
1
0,98774
1
1,15749 0,93941 0,93891
1
0,97833
5
1,2405 1,29368 0,61433
9
57 hydrogen ion transporting ATP
synthase activity, rotational
mechanism
1,07089 1,11483 1,51566 0,76214 0,76173
4
0,79371
9
0,87437
5
0,97871
6
1,12792
58 Belongs to the peptidase T1B
family./ Threonine protease
0,76082
2
0,96457 1,24135 1,11591 1,11532 1,16215 1,00331 0,71517
1
0,92139
2
61 catalytic activity/Putative
uncharacterized protein
1,17072 1,0187 1,10157 0,89960
7
0,89912
8
0,93688
2
1,25374 0,84288
2
0,87677
6
60
67 6-phosphogluconolactonase
activity
1,10859 1,06426 1,40426 0,84011
7
0,83967
1
0,87492
8
1,00385 0,89438
6
0,96993
4
72 Cryptococcus gattii WM276 1,3433 1,487 0,45943
5
1,10287 1,10228 1,14856 0,67226
4
1,08858 0,59570
8
74 actin [Ustilago maydis 521] 0,62854 0,89783
3
0 1,20975 1,20911 1,25988 1,24549 1,33153 1,21788
75 6-phosphogluconolactonase
activity
1,40028 1,05558 1,30406 0,88349
8
0,88302
8
0,92010
6
0,92024
6
0,74696
4
0,88623
7
76 hypothetical protein
MPER_15220
0,97922
2
0,79885
7
1,33828 1,17117 1,17055 1,2197 0,86924
4
0,68592 0,76707
77 14-3-3 protein 1,20268 1,25912 1,10413 0,99258
1
0,98851
1
1,03002 0,82973
8
0,66905
1
0,92417
6
78 ATP binding 1,42531 1,39868 1,44438 1,03764 1,03708 1,08063 0,60488
7
0,37185 0,59953
5
80 protein domain specific binding 1,20354 0,99679 1,45504 0,92871
4
0,92822 0,96719
6
1,02841 0,70583
9
0,78625
82 Ribossomal protein 1,57043 1,40456 0,46631
1
0,90297
6
0,90249
6
0,94039
1
0,75756
5
1,26762 0,78765
6
86 hydrogen ion transporting ATP
synthase activity, rotational
2,04589 2,08648 2,51133 0,41493
8
0,41471
8
0,43213
1
0,40237
6
0,33898
6
0,35315
2
61
mechanism
88 Hypothetical protein
MPER_12668
0,55151
8
0,54144
4
0,78962 1,29219 1,2915 1,34573 1,04723 1,22119 0,91957
9
89 Hipotetical Moniliophthora
perniciosa FA553
0,44013
7
0,50881
2
0,62145
2
1,45816 1,45738 1,51858 0,96226
1
0,79771
2
1,23551
90 GTP cyclohydrolase I activity 0,71636
3
0,48591
9
0,83268
3
1,21677 1,23394 1,27843 1,18024 1,01135 1,04431
92 inorganic diphosphatase activity 1,12226 1,2254 1,57631 0,76459
6
0,76419 0,79627
7
0,84519
4
0,85747
7
1,04829
93 Hypothetical protein
MPER_04599
0,70162
6
0,54518
5
0,76402
9
1,35486 1,35414 1,411 0,86026
9
0,86255
9
1,14633
94 hypothetical protein
MPER_04451
1,6188 0,82081
4
0 1,28063 1,27995 1,3337 0,76549
5
0,95131
8
0,94929
1
95 hypothetical protein
MPER_12791
0,37042
6
0,48597
6
0,55679
2
1,17916 1,17853 1,22802 1,88465 0,92087
7
1,19557
97 GTPase activity 1,13781 0,78484
5
1,94903 0,66055
8
0,66020
7
0,68792
8
1,1014 0,75054
9
1,26767
99 F0F1-type ATP synthase, beta
subunit, putative
0,40918
8
0,60517
4
0,66898
5
1,23192 1,23126 1,28296 1,09813 1,18339 1,28899
102 phosphoglucomutase 0,66739 0,64852 0,98169 1,19017 1,18954 1,23949 0,83371 0,92335 1,32612
62
2 4 5 5 1
107 hypothetical protein
MPER_07111
0,95302 0,94905
3
1,10192 0,92062
4
0,92013
4
0,95877 1,17384 0,83079
1
1,19185
112 hypothetical protein
MPER_07111
0,56485
7
0,51780
2
0,83879
1
1,17096 1,17034 1,21948 1,25399 0,74674
8
1,51704
115 Predicted protein 0,43926
1
0,54186
2
0,74073
7
1,26068 1,26792 1,31164 1,21264 0,84676
6
1,37849
119 Trpsin 0,57281
7
0,48094
5
0,79288
9
1,27066 1,26999 1,32332 0,97285
6
1,01528 1,30124
121 Ligase 0,49087
3
0,45638
9
0,55971
2
1,37337 1,37264 1,43027 1,26241 0,86831 1,18603
122 TAL1 1,07109 1,36255 1,46346 0,86678
5
0,86632
4
0,9027 0,93401
3
0,66305
9
0,87002
2
126 Nautilin-63/ chitin binding 0,54549
1
0,48932
6
0,64072
1
1,27519 1,27451 1,32803 1,07993 1,05411 1,3127
127 Putative uncharacterized protein/
peptidase activity
1,37003 1,3945 1,81083 0,94764
6
0,94714
2
0,98691
2
0,45613
8
0 1,0868
128 Glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase/glyceraldehyde-3-
phosphate dehydrogenase
0,83623
8
1,51827 1,55755 0,59335
9
0,59304
4
0,61794
5
0,60718 2,19517 0,48124
3
63
(NAD+) (phosphorylating)
activity
129 Malate dehydrogenase/nucleotide
binding
0,98957
6
0,78659
3
0,77481
5
1,11388 1,11329 1,16003 1,01242 0,86997
2
1,17942
131 Putative uncharacterized
protein/hydrolase activity,
hydrolyzing O-glycosyl
compounds
0,80119
5
0,88154 1,55091 1,03914 1,03858 1,08219 0,92358
9
0,68772
1
0,99513
6
135 hypothetical protein
MPER_12143
1,4437 1,31435 1,25945 0,63045
6
0,63012
1
0,65657
9
1,00435 1,00952 1,05145
139 acyl-CoA oxidase 1,26994 1,12298 0,68719
7
0,92613
5
0,88194
3
0,92471
6
0,87817
3
1,12607 1,18285
141 acyl-CoA oxidase 1,93382 1,79978 2,04049 0,41861
2
0,41838
9
0,43595
7
0,73915
8
0,54718
7
0,66659
9
146 Actin-2/ATP binding 1,08963 1,19317 1,19974 0,71732
9
0,71694
8
0,74705
2
1,1017 1,10526 1,12918
149 Putative uncharacterized protein
/transaminase activity
1,21867 0 1,29407 1,15229 1,15168 1,20003 1,47651 0,90320
9
0,60354
1
151 Predicted protein/ structural
constituent of ribosome
2,60556 1,37608 0,41112
2
0,63522
8
0,63489 0,66154
9
0,66746
5
1,251 0,75710
7
64
153 Actin-2/ATP binding 1,42048 1,40782 1,64922 0,68905
1
0,68868
5
0,71760
2
0,67505
1
0,77197
9
0,98011
8
158 actin-1 0,87633
5
0,80507
3
0,82742 1,12172 1,12112 1,1682 0,86106
8
1,07564 1,14343
160 ATP synthase subunit beta,
mitochondrial/ATP binding,
calcium ion binding, hydrogen
ion transporting ATP synthase
activity, rotational mechanism,
hydrogen-exporting ATPase
activity, phosphorylative
mechanism, lipoprotein particle
receptor activity
1,32567 1,39754 1,52465 0,70029
5
0,69992
3
0,72931
2
0,87236
1
0,71326 1,03699
164 Actin-1/3 , /ATP binding 1,42043 1,1381 1,74639 0,55308
6
0,55279
2
0,57600
4
1,11026 0,97248
9
0,93045
5
165 Putative uncharacterized protein
/transferase activity, transferring
acyl groups other than amino-acyl
groups
0,27893
6
0,46879
7
0,42931
9
2,3121 2,31087 1,10671 0,61409
6
0,61972
4
0,85944
8
168 Putative uncharacterized protein 0,58284 0,79795 0,62772 1,22852 1,22786 1,27942 1,0196 1,11842 1,11764
65
/transferase activity, transferring
acyl groups other than amino-acyl
groups
7 5 9
169 6-phosphogluconate
dehydrogenase
0,58012
6
0,40242 1,33536 1,02902 1,10119 1,13626 1,21996 1,03261 1,16305
170 S-adenosyl-L-homocysteine
hydrolase
0,61042
2
0,36353
3
0,36198
7
1,15661 1,13995 1,24999 1,35731 1,60469 1,15551
171 hypothetical protein
MPER_12437
0,30336 0,30515
6
0,68234
3
1,62681 1,62595 1,69422 0,80940
1
0,88788
6
1,06488
177 ATP-dependent RNA helicase
eIF4A/nucleic acid binding
0,68266
8
0,62315
5
0,77620
9
1,22433 1,2416 1,29216 1,04136 0,77179
9
1,34672
182 Cdc12 like protein 0,22388
2
0,51404
6
0,36990
9
1,455 1,45423 1,51529 1,09903 0,89266
8
1,47594
184 Putative uncharacterized protein
/metalloendopeptidase activity
1,36495 1,56584 1,71388 0,63515
9
0,63482
2
0,66147
8
0,71458 0,82654
8
0,88274
8
187 Putative uncharacterized
protein/ATP binding
0,76224
5
0,69300
3
0,83903
6
1,07654 1,0964 1,13045 1,16375 1,14723 1,09134
188 Putative uncharacterized
protein/translation elongation
factor activity
1,03266 0,86657
7
0,95681
4
1,01645 1,01591 1,05856 1,15281 0,88617
4
1,01406
66
189 RAB GDP-dissociation inhibitor
/Rab GDP-dissociation inhibitor
activity
0,67266
7
0,70564
4
0,87781
4
1,16478 1,16416 1,21304 1,12683 0,90861
5
1,16646
190 Putative uncharacterized protein
/GTP binding, structural molecule
activity
1,1555 0,89919
7
1,31507 0,61459
1
0,61426
4
0,64005
6
0,84816
2
1,28934 1,62383
191 Putative uncharacterized protein
/transferase activity, transferring
alkyl or aryl (other than methyl)
groups
0,66082
7
0 0,70096
5
1,34005 1,33934 1,39558 1,01248 1,17363 1,37713
195 Hypothetical protein
MPER_01542
1,46744 1,59093 0,99757 0,94968
7
0,94918
2
0,98903
8
0,75025
7
0,72738
2
0,57851
1
197 ATP synthase F1, beta subunit 0,62882
5
0,69919 0,71559
6
1,27553 1,27485 1,32838 1,11046 0,93291
9
1,03426
199 Putative uncharacterized protein
/glycine
hydroxymethyltransferase activity
0,33458
3
0,49785
3
0,40545
7
1,67234 1,67145 1,74163 0,61294
2
0,49896
4
1,56479
200 Translation elongation factor 1-
alpha/translation elongation factor
activity
1,28368 1,2837 0,21063 0,76980
4
0,76939
5
0,80170
1
1,42473 1,59494 0,86140
7
67
203 6-phosphogluconate
dehydrogenase/
decarboxylating/phosphogluconat
e dehydrogenase
(decarboxylating) activity
1,05053 0,75255
8
0 1,55164 1,55082 1,61594 0,97430
3
0 1,50421
204 Auricularia delicata TFB-10046
SS5
0,54530
1
0,83340
2
0,92222
1
1,17108 1,17045 1,2196 0,99804
5
1,04005 1,09985
207 Moniliophthora perniciosa FA553 0,49985
3
0,15194
7
0,61816
8
1,90405 1,90304 1,98295 1,03066 0,90934
1
0
209 Putative uncharacterized
protein/metalloexopeptidase
activity
0,64591
1
0,57354
6
0,81580
2
1,18282 1,18219 1,23183 0,89395
9
0,89939
3
1,57455
210 Hypothetical protein
Moror_17341
1,13088 1,26034 1,3755 0,82851
7
0,82807
6
0,86284
7
0,82723 0,96702
1
0,91958
5
213 Moniliophthora perniciosa FA553 0,91059
9
0,89890
7
1,28576 1,00962 1,00908 1,05145 0,82338
8
0,86296
2
1,14824
215 hypothetical protein
MPER_04475 [Moniliophthora
perniciosa FA553]
1,08386 0,93698
9
1,45779 0,78519
7
0,78477
9
0,81773
2
1,10944 0,94339
1
1,08083
217 Acyl-CoA-dehydrogenase 0,13527 0,20728 0,11595 1,58554 1,58469 1,65123 1,18072 1,02958 1,50973
68
5 6 1
223 Putative uncharacterized
protein/None.
0,68546 0,44163
4
0,54269
4
1,26224 1,26157 1,31454 1,38927 1,18391 0,91867
8
224 Alpha-tubulin 0,90691
9
0,95444
3
0,88889 1,13208 1,13148 1,17899 0,67402
2
0,78971
1
1,34347
226 UTP-glucose-1-phosphate
uridylyltransferase/UTP:glucose-
1-phosphate uridylyltransferase
activity
0,25052 0 0,72400
4
1,63997 1,6391 1,70792 1,19685 0,71880
5
1,12282
229 Response Regulator Receiver
Signal Transduction Histidine
Kinase/protein-glutamate
methylesterase activity
0,82778
8
0,73626
7
0 1,19632 1,19568 1,24589 1,22765 1,21586 1,35456
231 Hypothetical protein
MPER_09856
0,58434
2
0,38411
7
0,58365
7
1,52902 1,5282 1,59237 0,80144
4
0,82458
7
1,17226
234 Chain E, Leech-Derived Tryptase
InhibitorTRYPSIN
COMPLEX/serine-type
endopeptidase activity
0,39725
2
0,60101
5
0,57278
8
1,39737 1,39662 1,45527 1,04754 0,92827
3
1,20387
236 Hypothetical protein 1,11703 0,81801 1,15007 0,94135 0,94084 0,98035 1,17044 0,94887 0,93302
69
MPER_04711 1 9 5 4 5
239 Putative uncharacterized
protein/nucleotidyltransferase
activity
0,67379 0,51273
8
0,61016
2
1,32211 1,32141 1,37689 1,11262 0,99219 1,07808
242 RecName: Full=FMRFamide-7 0,57734
3
0,83074
6
0,73452
5
1,0752 1,07463 1,11975 1,35822 1,08774 1,14186
247 Putative uncharacterized protein
/nucleotidyltransferase activity
0,29820
2
0,21467 0,24738
1
1,45379 1,48847 1,49887 1,08697 1,616 1,09564
249 hypothetical protein
SCHCODRAFT_69018/succinate
dehydrogenase activity
0,60105
4
0,37560
4
0,4539 1,36429 1,36357 1,42082 1,13704 1,07567 1,20805
250 Chaperonin GroL 0,64343
9
0,50790
4
0,65842
3
1,41373 1,41298 1,47231 0,92565
5
0,82567
6
1,13988
252 Hypothetical protein
SCHCODRAFT_69018
0,59926 0,93765
9
0,73253
3
1,37964 1,37891 1,43681 0,80223
4
0,61800
9
1,11495
253 hypothetical protein
SCHCODRAFT_69018
[Schizophyllum commune H4-
8]/succinate dehydrogenase
activity
0,63662
3
0,40144
6
0,95169
7
1,0861 1,08552 1,1311 1,67951 1,3078 0,72021
4
70
262 Predicted protein 0,77906 0,82126
5
1,01908 0,96159 0,96107
9
1,00143 0,95321
4
1,12678 1,3765
265 hypothetical protein
MPER_07102 [Moniliophthora
perniciosa FA553]/None.
1,0057 0,63568
5
0,77893 1,07139 1,07082 1,11578 1,0334 1,09835 1,18996
266 hypothetical protein
SCHCODRAFT_81271
[Schizophyllum commune H4-
8]/hydrogen ion transporting ATP
synthase activity, rotational
mechanism
0,53420
1
0,49297
4
0,66178
1
0,99440
1
0,99387
3
1,03561 1,17053 1,55549 1,56114
267 unfolded protein
binding/hypothetical protein
UM01209.1
0,91067
1
0,96448
7
1,01525 0,99288 0,99235
2
1,03402 0,57864
4
1,02657 1,48513
268 Heat shock cognate 70 / ATP
binding
0,94994
2
0,96635
6
1,42642 1,03872 1,03817 1,08176 0,88082
5
0,73933
1
0,87847
9
287 hypothetical protein
CHGG_04834 [Chaetomium
globosum CBS 148.51]/ATP
binding
0,90893
6
0,81366
2
0,71552
8
1,07177 1,0712 1,11618 0,92340
6
1,14478 1,23454
71
297 predicted protein 1,65535 1,81358 2,09642 0,50584
8
0,50558 0,52680
9
0,61454
5
0,70945
8
0,57240
9
325 Aspartate
aminotransferase/pyridoxal
phosphate binding
0,63542
2
0,99338
6
0,78625
4
1,30288 1,30219 1,35687 0,92944
5
0,72581
4
0,96774
1
337 Putative uncharacterized
protein/protein disulfide
oxidoreductase activity
0,80387
5
1,35321 0,84307 1,1326 1,132 1,17953 1,16715 0,44326
8
0,94529
7
353 predicted protein [Laccaria
bicolor S238N-H82]/ATP binding
0,25147 0,37890
1
0 1,64022 1,63935 1,70818 1,39646 0,78466
6
1,20075
359 Protein F25H2.5, confirmed by
transcript evidence/nucleoside
diphosphate kinase activity
1,46391 1,42652 2,31029 0,62171
4
0,63981
3
0,65204
9
0,53155
6
0,70566
7
0,64848
8
362 glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase
0,61884
6
0,51825
6
1,03662 1,33316 1,33245 1,3884 0,69897
6
0,93064
9
1,14264
72
CAPÍTULO 2 – Análise comparativa do proteoma de basidiósporos de Monilliophtora
perniciosa submetidos à germinação em lavado foliar de variedades resistentes e
sucessíveis de Theobroma cacao
RESUMO
A superfície de plantas pode ser considerada uma barreira de defesa em que
microrganismos são diretamente inibidos em seu primeiro ponto de contato com o
hospedeiro. Buscando entender este mecanismo de defesa na interação Monilliophtora
perniciosa x Theobroma cacao, o objetivo deste trabalho foi comparar as alterações de
expressão de proteínas em basidiósporos do fungo M. perniciosa em resposta ao lavado
foliar de duas variedades de cacaueiro contrastantes quanto à resistência à doença
vassoura-de-bruxa. Um total de 8,1 x 108 de basidiósporos foram usados para cada
tratamento contendo lavado foliar. Basidiósporos germinados na ausência de lavado foliar
foram usados como controle. A análise proteômica foi realizada a partir da técnica 2D-
PAGE combinada à Espectrometria de Massas (ms/ms) foi utilizada. A extração protéica
foi baseada no uso de SDS-denso seguida de sonicação para ruptura celular e extração
fenólica. Sessenta e quatro proteínas tiveram variação de acúmulo quando comparadas ao
controle (ausência de lavado foliar). Foram identificadas proteínas associadas com
metabolismo energético (ATP sintase) e proteico (BiP) cujo acúmulo foi reduzido em
basidiósporos germinados em lavado foliar de catongo. A redução da ATP sintase nos
basidiósporos germinados no lavado foliar de catongo sugere uma mudança do
metabolismo aeróbio para o fermentativo no fungo em resposta aos componentes do
lavado foliar. Além disso, foram identificadas proteínas envolvidas com virulência e
resistência do fungo como a poliquetide ciclase, glicoside hidrolase e proteína
transportadora de multidrogas (MFS) e proteínas relacionadas com estresse oxidativo e
fermentação como a catalase A e a álcool desidrogenase (ADH). Neste trabalho
mostramos que há um efeito de substâncias do filoplano do cacaueiro na germinação dos
basidiósporos do fungo. Estes estudos podem revelar mecanismos de resistência e
73
suscetibilidade do hospedeiro bem como mecanismos básicos de virulência do
patógeno.
74
ABSTRACT
The surface of plants can be considered a defense barrier that microorganisms are directly
inhibited in their first point of contact with the host. To understand this defense
mechanism in Monilliophtora perniciousa interaction x Theobroma cacao, the aim of this
study was to compare the changes in protein expression in basidiospore M. perniciosa
fungus in response to foliar washed of two contrasting cocoa varieties for resistance to
witches' broom disease. A total of 8.1 x 108 basidiospores were used for each treatment
containing washed leaf. Germinated basidiospores in the absence of leaf wash were used
as control. The proteomic analysis was performed from the 2D-PAGE technique
combined with Mass Spectrometry (MS / MS). Protein extraction was based on the use of
SDS-dense followed by sonication for cell disruption and phenol extraction. Sixty-four
proteins had accumulation of variation when compared to the control (no leaf washed).
Proteins were identified associated with energy metabolism (ATP synthase) and protein
(BiP) whose accumulation was reduced by basidiospores germinated in leaf washed
Catongo. The reduction in ATP synthase germinated basidiospores the leaf washed
Catongo suggests a shift from aerobic to the fermentation in the fungus in response to
components of the washed leaf. Furthermore, proteins involved in virulence have been
identified and fungus resistance as poliquetide cyclase, glycoside hydrolase, and multidrug
transporter protein (SFM) and proteins related to oxidative stress and fermentation as
catalase A and alcohol dehydrogenase (ADH). We show that there is a phylloplane
substances effect of cocoa on the germination of the fungus basidiospores. These studies
may reveal mechanisms of resistance and host susceptibility and basic mechanisms of
virulence of the pathogen.
75
1 INTRODUÇÃO
O fungo hemibiotrófico, basidiomiceto, Moniliophthora perniciosa (Aime &
Phillips-Mora, 2005) é o agente causal da doença vassoura-de-bruxa do cacau (Theobroma
cacao L.). No Brasil, a produção anual de amêndoas de cacau caiu de 400.000 para
120.000 toneladas com a disseminação da vassoura-de-bruxa nas regiões produtoras no
estado da Bahia, a partir de 1989 (Bowers et al., 2001).
O início da infecção é disparado com a germinação do basidiósporo, penetração do
tubo germinativo e estabelecimento da hifa primária no espaço intercelular, pode ser
considerado um momento estratégico para o bloqueio do ciclo de vida do fungo.
A proteção superficial de plantas, constituída pelas células epidérmicas e suas
secreções pode ser considerada uma estratégia de defesa inata em que microrganismos são
diretamente inibidos em seu primeiro ponto de contato com o hospedeiro (Shepherd e
Wagner, 2007). Os estudos de superfície foliar com base química de proteção em plantas
têm centrado em metabólitos secundários secretados como exsudados de tricomas
glandulares (Shepherd, et al. 2005), proteínas (Shah, 2005) ou peptídeos antimicrobianos
(De Lucca, et al. 2005).
Além disso, a folha pode ser habitada por um conjunto qualitativa e
quantitativamente diversificado de micro-organismos, incluindo fungos, leveduras,
bactérias e bacteriófagos (Last e Deighton, 1965). Tais micro-organismos podem induzir
defesa da planta simplesmente pela competição por nutrientes e muitas vezes são alvos de
estudo como controle biológico (Blakeman e Fokkema, 1982). O lavado foliar, coletado a
partir da imersão de folhas jovens em água destilada à temperatura ambiente contém
substâncias solúveis que se acumulam sobre a cutícula vegetal (Shepherd, et al. 2005). Em
nosso laboratório, estudos com lavado foliar bruto de cacau inibiu até 90% da germinação
de basidiósporos do fungo M. perniciosa (Almeida, 2012). Trinta e quatro proteínas
extraídas do lavado foliar da variedade resistente de cacau CCN51 foram identificadas por
espectrometria de massas. Dentre elas 23 foram proteínas
76
de espécies vegetais variadas e 11 foram proteínas de bactérias. Além disso, a
severidade da doença foi menor em plantas de cacau, cuja irrigação era feita
diretamente no solo, previamente à inoculação com M. perniciosa. Este fato pode
sustentar a ideia de que as plantas devem acumular compostos e proteínas no filoplano
que podem participar no combate inicial ao patógeno (Almeida, 2012).
Considerando que o primeiro contato dos basidiósporos com a planta ocorre, na
maioria das vezes, na superfície de folhas do cacaueiro é interessante conhecer os
primeiros mecanismos de defesa do filoplano e as variações no metabolismodo esporo
fúngico durante o contato com os compostaos do filoplano. Neste sentido, o objetivo
deste trabalho foi comparar as alterações de expressão de proteínas em basidiósporos do
fungo M. perniciosa em resposta ao lavado foliar de duas variedades de cacaueiro
contrastantes quanto à resistência à doença vassoura-de-bruxa.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1Cultivo e obtenção dos basidiósporos
Aproximadamente 300 ramos secos e infectados de cacau suscetível (Catongo),
contendo micélio róseo do fungo M. perniciosa (Pires, et al. 2009) foram coletados
aleatoriamente em campo de cultivo (CEPLAC/CEPEC-Ilhéus, BA) da variedade de
cacau Catongo, de acordo com a metodologia descrita por Mares et al, (2012). Os
basidiósporos foram produzidos de acordo com o método de Frias et al, (1991) e
estocados em nitrogênio líquido como descrito por Frias et al (1995) até o uso.
2.2 Obtenção de lavado foliar de cacau das variedades CCN51 e Catongo
Plantas de cacau das variedades consideradas contrastantes quanto à resistência ao
fungo foram cultivadas em casa de vegetação sob irrigação por gotejamento, para
prevenir a lavagem da superfície foliar. As variedades utilizadas foram CCN51
(resistente) e Catongo (suscetível) (Figura 1).
77
Figura 1: Plantas de cacau das variedades catongo e CCN51 em casa de vegetação no
CEPEC/CEPLAC-Ilhéus-BA, sob sistema de irrigação por gotejamento.
O lavado foliar foi obtido através da lavagem de folhas jovens de tamanho
médio (Figura2), de acordo o protocolo de Shepherd et al. (2005). Foram lavadas 1.829
folhas de cacau da variedade catongo e 1.604 folhas de cacau da variedade CCN51. As
folhas foram lavadas dentro de um becker contendo 200 – 300 mililitros de água
destilada através de agitação manual suave por 30 segundos. Os pecíolos e folhas que
apresentavam alguma lesão não foram expostos à lavagem.
O lavado foliar foi filtrado uma vez em papel filtro esterilizado para remoção de
resíduos sólidos. Posteriormente, foi filtrado duas vezes, a primeira em membranas de
celulose 0,45 μm, seguido de membrana de 0,22 μm.para excluir fungos e bactérias. Em
seguida, o lavado foi distribuído em tubos falcons de 50 mL, congelado a -80 ºC e
liofilizado a vácuo em Freezone 6 (Labconco) até a completa eliminação de água da
amostra. O lavado liofilizado foi ressuspenso em 2 mL para cada 50 folhas Para este
trabalho foi escolhida a diluição do “lavado bruto” em 50 x (1:50), de acordo Almeida
(2012), que demonstrou uma inibição cerca de 20 % da germinação de basidiósporos.
78
Figura 2: Folhas jovens de cacau da variedade Catongo e CCN51 usadas para obtenção
do lavado foliar.
2.3 Germinação dos basidiósporos em lavado foliar de cacau
Após a obtenção dos basidiósporos de M. perniciosa e do lavado foliar dos
genótipos resistente (CCN51) e suscetível (Catongo) à vassoura de bruxa foi realizado
os tratamento de germinação. As alíquotas de basidiósporos foram descongeladas
lentamente em banho de gelo. Um total de 8,1 x 108 de basidiósporos foram usados para
cada tratamento. A solução contendo os basidiósporos foi diluída com o lavado até
reduzir a concentração de glicerol para 3%. Basidiósporos germinados apenas em
glicerol 3% e MES (ausência de lavado foliar), foram usados como controle.
Os basidiósporos foram incubados no escuro a 25 ºC por 4 horas. As taxas de
germinação e o comprimento dos tubos germinativos foram monitorados e mensurados
através de lente graduada em microscópio óptico Bioval L2000A, aumento de 40x.
Após 4 horas de incubação, os basidiósporos foram submetidos a temperatura de 8 ºC,
por 30 minutos, para interromper a germinação. Em seguida, foram concentrados, por
centrifugação, para a extração proteica.
2.4 Extração proteica
Depois de incubados para germinação, os basidiósporos foram sedimentados por
centrifugação a 5.000 x g por 20 min. O sobrenadante foi descartado e o precipitado foi
lavado em acetona contendo β-mercaptoetanol 0,07%. A extração proteica foi feita de
acordo Mares et al (2016).
As proteínas foram quantificadas com 2D-Quant Kit (GeHealthCare), de acordo
79
as instruções do fabricante, utilizando BSA como padrão.
2.5 Eletroforese 1D e 2D- PAGE
Para a análise proteômica em 2D PAGE foram usadas 350 µg de proteína total
diluída em 250 µL de solução de reidratação (ureia 7 mol.L-1, tiouréia 2 mol.L-1,
CHAPS 2% e azul de bromofenol 0,002 %). As strips (tiras de gel contendo imobilinas)
de 13 cm de comprimento, com gradiente de pH imobilizado entre 3 e 10 NL
(Amersham Biosciences, ImmobilineTM Dry-Strip) foram hidratadas por 12 h no
tampão de reidratação contendo as proteínas com parâmetros de acordo com Mares et al
(2016), no Ettan IPGphor 3 Isoelectric Focusing System. A segunda dimensão foi
realizada em gel de poliacrilamida 12,5 % no sistema de eletroforese vertical HOEFER
SE 600 Ruby (Amersham Bioscience). A corrida foi iniciada com uma corrente elétrica
de 15 mA/gel por 15 minutos, seguido de 30 µA/gel por 30 minutos e 50 µA/gel por
3:30 h, totalizando um tempo de 3:45 h. Os géis foram preparados em triplicatas para
cada tempo de germinação.
2.6 Visualização dos spots e análise de imagens
Após a eletroforese, os géis de poliacrilamida foram colocados em tampão de
fixação (etanol 40% e ácido acético 10%) por 1 hora; em seguida, este tampão foi
substituído por corante Azul de Coomassie Coloidal 0,08 % (Neuhof et al., 1988) onde
permaneceram por 5 dias, sob suave agitação. O corante foi substituído por água
destilada, onde os géis foram mantidos sob suave agitação com trocas diárias da água,
até a remoção do corante impregnado no gel.
As imagens dos géis foram digitalizadas com o Lab scanner (Amersham
Bioscence) e, em seguida, analisadas para a detecção e quantificação relativa dos spots,
usando o software Image Master 2D Platinum 7.0 (GE HealthCare), considerando a área
e intensidade dos spots. As replicatas foram alinhadas automaticamente a partir de um
gel escolhido como referência de cada tempo de germinação, visando atribuir
identidades comuns entre os spots das diferentes repetições, sendo estes detectados pelo
programa e, posteriormente editados manualmente quando necessário. Os géis de
referência (master gel) proveniente das triplicatas foi utilizado para identificação dos
80
spots exclusivos e comparação do acúmulo relativo das proteínas presentes nos
diferentes tratamentos. Para os spots comuns nos diferentes tratamentos, foi considerado
acúmulo diferencial daqueles que apresentaram uma variação de abundância relativa
superior a 1,5 vezes (Fold >1.5) e estatisticamente significativo (p < 0.05) para o teste
de ANOVA. Os géis referentes aos tratamentos com lavado de Catongo e CCN51 foram
comparados com o gel de basisiósporos germinados em glicerol 3 %, que foi usado
como controle.
2.7 Digestão em gel, análise de espectrometria de massas e identificação das
proteínas
Os spots exclusivos e diferencialmente expressos (com valor de fold > 1,5 e
valor de ANOVA com p< 0,05) nos tratamentos com lavado de Catongo e CCN51
foram excisados dos géis, digeridos e identificados, de acordo com a metodologia de
Shevchenko, (2006). Os espectros foram analisados com o programa ProteinLynx
Global Server 4.2 (WATERS), sendo comparados com o banco de dados do SWISS-
PROT. Para a comparação com o banco do NCBI, a ferramenta MASCOT MS/MS Ion
Search (www.matrixsciesce.com) foi utilizada, configurados para digestão tríptica, com
1 sítio de clivagem perdida, cisteínas modificadas por carboxamidometilação e as
possíveis modificações, como oxidação de metionina, erro tolerante de 30 ppm e
tolerância para erro de massa igual a 0,3 Da
2.8 Análise de acúmulo por Western blot
Análise por Western blot foi usada para verificar a expressão de algumas
proteínas. Para isso, uma quantidade equivalente a 10 µg de proteínas totais de
basidiósporo de M. perniciosa germinados em lavado de Catongo, CCN51 e controle
foram separadas por SDS-PAGE 12,5 % e transferidas para uma membrana de
nitrocelulose usando o i®blot Dry Blotting System (Invitrogen), de acordo as instruções
do fabricante. A membrana foi bloqueada com leite em pó desnatado 5% (w/v) em
tampão TBS-T (Tris-HCl100 mmol.L-1
, pH 8.0, NaCl 140 mmol.L-1
, Tween 20, 0.05 %
v.v-1
). As proteínas BiP (71 kDa), catalase (83 Kda), ATP syntase (53 kDa) e ADH
foram detectadas, utilizando, respectivamente, os anticorpos primários policlonais anti-
81
BiP (Agrisera - AS09481), anti-catalase (AgriseraAS09 501100), anti-ATPB syntase
(Agrisera - AS05085) e anti- ADH produzidos em coelho contra proteínas de
Arabidopsis thaliana. A diluição utilizada foi de 1:2000. As membranas foram
incubadas com os respectivos anticorpos primários por 60 min. Após lavadas três vezes
com o tampão TBS-T, as membranas foram incubadas por 60 min com o anticorpo
secundário IgG de cabra anti-coelho conjugado com fosfatase alcalina (Thermo Fisher
Scientific- 65-6122) por 60 min. O fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolil (BCIP) e p-
nitrotetrazólio (NBT; Promega, EUA) foram utilizados como substratos para a reação
colorimétrica da atividade da fosfatase alcalina. Os níveis de acúmulo das proteínas
BiP, Catalase, ATP synthase e ADH foram quantificados a partir de imagens da
membrana utilizando o software GelQuant.Net 1.8.0 (www.biochemlabsolutions.com).
2.9 Análise de Agrupamento hierárquico para a expressão diferencial das
proteínas
A análise dos perfis de expressão diferencial das proteínas identificadas foi
realizada através de agrupamento hierarquizado. O programa R com o pacote Heatmap
2 foi utilizado para a construção do heatmap. Para isso, os valores de expressão (% de
volume), dados pelo programa de análise das imagens dos géis ImageMaster 2D
Platinum 7.0 (GE Healhcare) para cada spot, foram transformados em Z-score. Os
parâmetros utilizados para os cálculos de distância foi a função <dist> (distância
euclidiana). E o método máximo de clusterização, com a função <hclust> (clusterização
hierárquica de dissimilaridade) como método completo.
3. RESULTADOS
3.1 Inibição da germinação de esporos em lavado de CCN51
Houve alterações morfológicas entre os padrões de germinação dos esporos na
presença de lavado foliar dos genótipos CCN51 e Catongo. Qualitativamente, pode-se
observar uma menor quantidade de basidiósporos germinados no lavado foliar de
CCN51. Adicionalmente, os esporos germinados na presença do lavado foliar de
CCN51 apresentam tubos germinativos mais curtos do que aqueles germinados no
82
lavado foliar de Catongo (Figura 3).
Figura 3: Fotos em triplicata de basidiósporos de M. perniciosa submetidos à
germinação em lavado foliar da variedade resistente CCN51 e da suscetível, Catongo.
As setas vermelhas representam tubos germinativos curtos ou esporos não germinados.
Setas pretas representam tubo germinativo bem desenvolvido.
3.2 Quantidade e qualidade das amostras proteicas
Os esporos germinados na presença do lavado foliar de CCN51 renderam uma
massa proteica de 3280 µg, correspondendo a menos de 80 % em relação ao rendimento
dos demais tratamentos.
83
Tabela1: Massa proteica obtida a partir do método de extração utilizado por Mares,
2012.
Tratamentos Massa proteica obtida (µg)
Basidiósporo germinado na ausência
de Lavado foliar (controle)
4240
Basidiósporo germinado em Lavado
foliar de Catongo
4160
Basidiósporo germinado em Lavado
foliar de CCN51
3280
A integridade da amostra proteica obtida e, consequentemente, a eficiência do
método de extração, foi verificada através de SDS-PAGE 12,5 % com 30 µg de proteína
total (Figura 4). O perfil proteico não evidencia bandas super abundantes em relação às
demais, com uma distribuição relativamente homogênea de 14 a mais de 100 kDa.
Figura 4: Perfil de proteínas de basidiósporos de M. perniciosa germinados em lavado
de cacau de variedades suscetível (Catongo) e resistente (CCN51). A primeira coluna
(M) representa o marcador de peso molecular e a última (C) coluna representa o
controle.
84
3.3 Variação dos perfis proteicos em 2D-PAGE de basidiósporos de Monilliophtora
perniciosa germinados em lavado foliar de cacau
A partir dos extratos proteicos obtidos foi possível visualizar o perfil de proteína
para cada tratamento realizado em triplicatas. Amostras proteicas de basidiósporos
germinados na ausência de lavado foliar foram utilizadas como controle (Figura 5).
Figura 5: Perfil proteico de basidiósporos de M. perniciosa germinados na ausência de
lavado foliar (controle) e em glicerol 3% com lavado foliar de cacau das variedades
Catongo e CCN51. Cada gel representa uma réplica de cada tratamento.
Os géis 2D foram produzidos em triplicatas para cada a fim de verificar a
reprodutibilidade das amostras na análise realizada através do software ImageMaster 2D
Platinum 7.0 (GE USA). O software mostrou que os géis tiveram uma boa
reprodutibilidade com 0,92 de correlação entre as réplicas do tratamento controle 0,94
85
entre as replicas do tratado com lavado de Catongo em glicerol 3% e 0,88 de correlação
entre as réplicas do tratado com lavado de CCN51 em glicerol 3%.
A análise dos géis resultou na detecção de 850 spots no gel de referência do
tratamento controle (ausência de lavado foliar), 642 no gel de referência do tratamento
com lavado foliar de Catongo e 610 spots no gel de referência do tratamento com
lavado foliar de CCN51. Quinhentos e vinte e sete spots foram comuns entre os géis do
controle e lavado foliar de Catongo, 323 spots foram exclusivos do controle e 115
exclusivos de Catongo (Figura 7, A). Quatrocentos e quarenta e quatro spots foram
comuns entre os géis controle (glicerol 3%) e lavado foliar de CCN51, 406 foram
exclusivamente expressos no controle e 166 foram exclusivamente expressos em
CCN51(Figura 7, B). Quatrocentos e trinta e oito spots foram comuns entre os géis dos
tratamentos com os lavados foliares. Duzentos e quatro foram exclusivos para o
tratamento com lavado foliar de Catongo e 172 spots foram exclusivos para o
tratamento com o lavado foliar de CCN51 (Figura 7, C).
86
Figura 7: Distribuição dos spots detectados a partir dos basidósporos germinados em
Lavado foliar de cacau. Em A: comparação do controle e lavado foliar de Catongo. B:
comparação do (controle) e lavado foliar de CCN51. C: Comparação entre os
tratamentos com Lavado foliar de Catongo e Lavdo foliar de CCN51.
Na avaliação dos tratamentos quanto à distribuição dos spots em relação à MM e
pI, verificou-se que há diferenças no MM entre controle e tratamentos (Figura 8). A
maioria das proteínas encontradas no tratamento controle (Ausência de lavado foliar)
possui peso molecular acima de 60 Kda diferentemente dos tratamentos com Catongo e
CCN51 que possuem a maioria de suas proteínas com peso molecular entre 30 e 60 kDa
(Figura 8).
87
Figura 8: Distribuição dos spots detectados nos géis 2-D de cada tratamento de acordo
com a massa molecular (kDa).
Em relação ao ponto isoelétrico das proteínas distribuídas nos géis 2D ocorreram
poucas com pI abaixo de 4 (Figura 9). Apenas 1 único spot do tratamento com lavado
de Catongo tem pI 3,2. Nenhum dos tratamentos apresentou proteínas com pI entre 3,5 e
4.
Figura 9: Distribuição dos spots detectados no controle (Glicerol 3%) e tratamentos
(catongo e CCN51) em relação ao Ponto Isoelétrico (3 a 10).
88
3.4 Proteínas identificadas
Do total de 527 spots comuns entre lavado foliar de Catongo e controle, 72
proteínas foram diferencialmente expressas (valor de ANOVA com p <0,05 e Fold>
1,5). Dentre estes, 13 foram identificados por espectrometria de massas (Tabela 2). Do
total de 115 spots exclusivos de Catongo, 9 foram identificados (Tabela 3). Na
comparação do controle com CCN51, do total de 444 spots comuns, 44 tiveram
expressão estatisticamente significativa e destes 17 foram identificados (Tabela 4). Dos
166 spots exclusivamente expressos em CCN51, 27 foram identificadas por
espectrometria de massas (Tabela 5)
89
Tabela 2: Proteínas identificadas por Espectometria de Massas diferencialmente expressas entre basidiósporos germinados em Lavado foliar de
Catongo e controle
Spot
number
Acession number
NCBI nr
Protein name (putative function) MW pI Cal
Masc
Score Peptide
671 gi|808370041 MFS (Pseudozyma hubeiensis SY62) 55502 6.08 23 1
664 gi|169763206 MFS transporter (Aspergillus orizae RIB 40) 66209 6.07 31 1
*641 gi|67764239 40S ribosomal protein S5, partial [Siniperca chuatsi] 9426 11,24 17 1
614 gi|385305092 yor052c-like protein [Brettanomyces bruxellensis
AWRI1499]
22435 9,54 30 25
613 gi|258566924 NOC3p protein (Unicocarpus reesii 1704) 44857 9.14 14 1
*590 gi|328925356 NADH dehydrogenase subunit 9, partial (mitochondrion)
[Silene subconica]
18017 8,78 53 33
557 gi|296818477 Conserved hypothetical protein (Arthroderma otae CBS
113480)
26931 5.20 15 1
*298 gi|764974770 polyketide cyclase [Bradyrhizobium sp. LTSP885] 15252 5,27 52 13
*292 gi|167045435 hypothetical protein
ALOHA_HF4000APKG10F15ctg7g3 [uncultured marine
crenarchaeote HF4000_APKG10F15]
21395 6,92 28 1
282 gi|389642539 hypothetical protein MGG_14712 [Magnaporthe oryzae
70-15]
460951 3,53 19 3
90
271 gi|323355965 Rsa4p [Saccharomyces cerevisiae VL3] 57629 9.01 44 1
*225 gi|946783301 PREDICTED: growth-regulated protein homolog gamma-
like [Myotis brandtii]
16252 8,74 55 17
*92 gi|209876249 14-3-3 family protein [Cryptosporidium muris RN66] 28927 4,93 62 3
* Amostras com resultados que não são de fungos, mas com identidade com o banco de Moniliophthora roreri ou Moniliophthora perniciosa.
91
Tabela 3: Proteínas identificadas por Espectometria de Massas exclusivas de basidiósporos germinados em Lavado foliar de Catongo quando
comparadas ao controle.
Spot number
Acession numer NCBI nr
Protein name (putative function) MW pI Cal Masc
Score Peptide
982 gi|646284114 hypothetical protein BOTBODRAFT_181932 [Botryobasidium botryosum FD-172 SS1]
8673 11,8 49 17
*903 gi|215261486 Chain E, Structural Insights Into Lysine Multiple Methylation By Set Domain Methyltransferases, Set8-Y334f H4-Lys20me2 Adohcy
1261 11,72 20 10
*896 gi|648586731 MULTISPECIES: TetR family transcriptional regulator [Streptomyces]
24686 10,76 58 12
*876 gi|556603263 hypothetical protein [Actinoplanes friuliensis] 8044 6,82 44 11
875 gi|169613949 hypothetical protein SNOG_10109 [Parastagonospora nodorum SN15]
13461 4,82 15 3
*872 gi|738243225 hypothetical protein [Lysinibacillus sinduriensis] 8285 10,13 20 13
831 gi|154323320 conserved hypothetical protein [Botrytis cinerea B05.10]
25619 12,03 20 5
813 gi|169613949 hypothetical protein SNOG_10109 [Parastagonospora nodorum SN15]
13461 4,82 15 1
804 gi|116179428 hypothetical protein CHGG_00342 [Chaetomium globosum CBS 148.51]
29231 5.52 14 1
* Amostras com resultados que não são de fungos, mas com identidade com o banco de Moniliophthora roreri ou Moniliophthora perniciosa.
92
Tabela 4: Proteínas identificadas por Espectometria de Massas diferencialmente expressas entre basidiósporos germinados em Lavado foliar de
CCN51 e controle
Spot
number
Acession numer
NCBI nr
Protein name (putative function) MW pI Cal
Masc
Score Peptide
396 gi|448530708 Pmt6 protein mannosyltransferase [Candida orthopsilosis Co 90-125] 48381 6.06 49 1
284 gi|110349607 elongation factor-1 alpha, partial [Agaricus bisporus] 20092 7.04 33 1
239 gi|299738765 hypothetical protein CC1G_15401 [Coprinopsis cinerea
okayama7#130]
62362 8.13 52 1
199 gi|299738765 hypothetical protein CC1G_15401 [Coprinopsis cinerea
okayama7#130]
62362 8.13 56 1
192 gi|628245481 hypothetical protein A1O1_05272 [Capronia coronata CBS 617.96] 47284 4.91 16 1
182 gi|750956207 hypothetical protein PISMIDRAFT_688827 [Pisolithus microcarpus
441]
22386 5.61 36 1
158 gi|299738765 hypothetical protein CC1G_15401 [Coprinopsis cinerea
okayama7#130]
62362 8.13 52 1
*138 gi|335340207 hypothetical protein Halxa_0203 [Halopiger xanaduensis SH-6] 11050 4,53 18 1
122 gi|70780048 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase [Moniliophthora
perniciosa]
37133 7.07 70 1
122 gi|347842072 predicted protein [Botrytis cinerea T4] 4525 6.70 20 9
125 gi|323355965 Rsa4p [Saccharomyces cerevisiae VL3] 57629 9.01 44 1
93
116 gi|242218874 40S ribosomal protein S3 [Postia placenta Mad-698-R] 29339 8.96 46 1
89 gi|749769966 hypothetical protein PLICRDRAFT_675583 [Plicaturopsis crispa
FD-325 SS-3]
99980 5.61 53 1
86 gi|700489534 hypothetical protein PITC_019720 [Penicillium italicum] 8263 6.02 31 2
66 gi|323355965 Rsa4p [Saccharomyces cerevisiae VL3] 57629 9.01 43 1
33 gi|576033794 peptidyl-tRNA hydrolase-like protein [Chaetomium thermophilum
var. thermophilum DSM 1495]
25897 5.99 30 19
14 gi|630184253 macrolide-binding protein fkbp12 [Moniliophthora roreri MCA 2997] 11684 5.78 47 2
* Amostras com resultados que não são de fungos, mas com identidade com o banco de Moniliophthora roreri ou Moniliophthora perniciosa.
94
Tabela 5: Proteínas identificadas por Espectometria de Massas exclusivas de basidiósporos germinados em Lavado foliar de CCN51 quando
comparadas ao controle
Spot number
Acession numer NCBI nr
Protein name (putative function) MW pI Cal Masc Score Peptide
798 gi|525582112 hypothetical protein PDE_03308 [Penicillium oxalicum 114-2]
24390 6.49 15 1
794 gi|323355965 Rsa4p [Saccharomyces cerevisiae VL3] 57629 9.01 46 1
783N gi|597939188 hypothetical protein SERLADRAFT_479587 [Serpula lacrymans var. lacrymans S7.9]
11387 9.79 20 25
777 gi|354547031 hypothetical protein CPAR2_214080 [Candida parapsilosis]
25524 5.56 17 8
*773 gi|954357247 hypothetical protein T03_16569, partial [Trichinella britovi]
8240 8,48 58 5
770 gi|323355965 Rsa4p [Saccharomyces cerevisiae VL3] 57629 9.01 46 2
*764
gi|476122536 hypothetical protein ECBCE019MS13_1390 [Escherichia coli BCE019_MS-13]
6609 6,25 46 6
761 gi|323355965 Rsa4p [Saccharomyces cerevisiae VL3] 57629 9.01 51 2
*757 gi|874566308 hypothetical protein (plasmid) [uncultured prokaryote]
14921 5,29 52 5
755 gi|323355965 Rsa4p [Saccharomyces cerevisiae VL3] 57629 9.01 38 1
744 gi|323355965 Rsa4p [Saccharomyces cerevisiae VL3] 57629 9.01 39 2
741 gi|299738765 hypothetical protein CC1G_15401 [Coprinopsis cinerea okayama7#130]
62019 8.13 52 1
731 gi|607959296 hypothetical protein H113_08705 [Trichophyton rubrum MR1459]
17341 11,21 60 9
*729 gi|601421973 two-component system response regulator protein [Acinetobacter baumannii 16553_3]
4861 6,12 59 5
718 gi|597984475 hypothetical protein DICSQDRAFT_56664 [Dichomitus squalens LYAD-421 SS1]
14790 10,65 41 16
95
715N gi|816335180 hypothetical protein AOCH_005056 [Aspergillus ochraceoroseus]
36907 9.51 16 1
702 gi|972232466 hypothetical protein ASPCAL10486 [Aspergillus calidoustus]
134417 8,63 52 35
693 gi|58259137 60S ribossomal protein l7 (Cryptococcus neoformans var. neoformans JEC 21)
28319 6.09 13 1
693,2 gi|255936377 hypothetical protein [Penicillium rubens Wisconsin 54-1255]
70187 7.64 36 2
685 gi|302505483 hypothetical protein ARB_07010 [Arthroderma benhamiae CBS 112371]
20374 10,21 68 10
681 gi|927394367 glycoside hydrolase family 10 protein [Trichoderma atroviride IMI 206040]
34948 7,01 96 4
*676 gi|504929984 pyridoxamine 5'-phosphate oxidase [Rivularia sp. PCC 7116]
25123 5,77 47 11
673 gi|595783492 hypothetical protein FOMMEDRAFT_160547 [Fomitiporia mediterranea MF3/22]
23371 8,78 42 9
671 gi|808370041 major facilitator super [Pseudozyma hubeiensis SY62] 55502 9.27 23 1
*670 gi|938817167 transposase, partial [Enterobacter cloacae subsp. cloacae]
20094 10,24 63 11
*667 gi|948600442 glutamine transport ATP-binding protein [Lactobacillus bifermentans DSM 20003]
26962 6,32 47 8
664 gi|169763206 MFS transporter [Aspergillus oryzae RIB40] 66209 8.59 31 1
* Amostras com resultados que não são de fungos, mas com identidade com o banco de Moniliophthora roreri ou Moniliophthora perniciosa
96
3.5 Variação do perfil de expressão das proteínas identificadas
Sessenta e quatro proteínas tiveram variação de acúmulo quando comparadas ao
controle (ausência de lavado foliar). Estas proteínas foram agrupadas de acordo com o
seu padrão de acúmulo. O grupo lilás mostra um padrão de expressão de proteínas que
somente foram expressas nos tratamentos com lavado de CCN51. O grupo azul mostra
um padrão de acúmulo de proteínas que foram detectadas no tratamento com CCN51 e
Catongo. O grupo representado pela cor vermelha mostra um padrão de proteínas que
tiveram seu acúmulo reprimido no controle. O grupo preto mostra proteínas que
apresentaram maior acúmulo no controle. Por fim, o grupo verde mostra proteínas que
não foram expressas no tratamento com lavado foliar de Catongo (Figura10).
Figura 10: Agrupamento hierárquico das proteínas identificadas, diferencialmente
acumuladas entre basidiósporos germinados na ausência de lavado foliar (controle), e na
presença dos lavados foliares de CCN51 e Catongo. O Heatmap foi feito utilizando o
software R, pacote Heatmap.2. As proteínas estão identificadas pelo número de acesso
(gi) e o número do spot entre parênteses. Na escala, a cor lilás representa proteínas
reprimidas e a cor vermelha representa proteínas induzidas.
97
3.6 Classificação por processos biológicos das proteínas diferencialmente expressas
entre basidiósporos germinados na ausência de lavado foliar e lavados foliares de
CCn51 e Catongo
As proteínas diferencialmente expressas entre basidiósporos germinados no
controle e lavados foliares de CCN51 e Catongo distribuíram-se em categorias de
acordo com o seu processo biológico. A categoria que apresentou maior número de
proteínas está relacionada à processos metabólicos, tanto no tratamento com lavado
foliar de Catongo quanto no tratamento com lavado foliar de CCN51. O diferencial das
duas distribuições foi a presença de uma proteína com resposta imune e uma proteína
com resposta a químicos no Tratamento com lavado de Catongo (Figura 11).
Figura 11: Distribuição dos processos biológicos das proteínas diferencialmente
expressas identificadas entre basidiósporos germinados no controle e na presença do
lavado foliar de Catongo e entre controle e lavado foliar de CCN51.
98
3.7 Acúmulo de proteínas por WesternBlotting
A análise por Western blot foi realizada para verificar alterações do nível de
algumas proteínas nos tratamentos com lavado foliar de CCN51 e Catongo. Para isso,
foram usados anticorpos contra as proteínas Catalase, ADH (álcool desidrogenase),
Beta ATP synthase e Bip (Figura 12A)
A proteína Catalase teve um aumento de expressão cerca de 4,3 e 3,8 vezes em
basidiósporos germinados em lavado foliar de Catongo e CCN51, respectivamente, em
relação ao controle. Já a proteína ADH não foi detectada no controle. Esta proteína foi
mais expressa em lavado foliar de Catongo em relação à CCN51. A Beta ATP sintase
teve seu acúmulo reduzido em basidiósporos germinados em lavado foliar de Catongo
quando comparado com o controle e lavado foliar de CCN51. A proteína Bip teve seu
acúmulo reduzido para mais da metade em basidiósporos germinados no lavado foliar
de CCN51 em relação ao controle e lavado de Catongo (Figura 12B).
Figura 12: Acúmulo de Catalase, ADH, Beta ATP sintase por Western blot. A: Imagem
da membrana de nitrocelulose hibridizada com Anti-Catalase A, Anti-ADH, Anti-Beta
ATP sintase e Anti-Bip de Arapdopsis thalyana. B: Acúmulos relativos determinados a
partir das imagens da membrana de nitrocelulose, utilizando o software Gel
Quant.Net1.8.0.
4. DISCUSSÃO
4.1 Inibição da germinação por lavado CCN51
Segundo o experimento de Almeida (2012), o lavado aquoso de 50 folhas
99
ressuspendido em volume de 2 mL inibe 100% da germinação de basidiósporos de
Monilliophtora perniciosa e foi considerado lavado bruto. Para este trabalho, o lavado
foi diluído 50x com intuito de alcançar uma inibição de apenas 20% da germinação.
Porém, foi possível visualizar uma maior inibição da germinação na presença de lavado
foliar de CCN51 em relação ao lavado foliar de Catongo (Figura 3). Isso nos possibilita
sugerir que inibição da germinação provavelmente por compostos presentes no lavado
de CCN51 que não são encontrados no lavado de Catongo.
De acordo com o Registro Nacional de Cultivares publicado pela Comissão
Executiva do Plantio da Lavoura Cacaueira (CEPLAC), clones da variedade CCN51 são
selecionados pela resistência à vassoura-de-bruxa, características de fruto e semente
bem como pela produtividade (Ceplac, 2005). Entre outras características agronômicas
favoráveis à sua resistência, as folhas jovens de cacau da variedade CCN51 apresentam
o dobro do número de tricomas no filoplano em relação ao lavado Catongo (Almeida,
2012). Consequentemente, isso pode ter contribuído para o aumento de proteínas ou
metabólitos secundários envolvidos nos mecanismos de defesa na folha aumentando seu
efeito na inibição da germinação dos basidiósporos.
4.2 Proteínas relacionadas com o metabolismo
A maioria das proteínas identificadas nos basidiósporos germinados nos
tratamentos com os lavados foliares está relacionada com metabolismo energético
(Figura 11). Polipeptídios metabólicos são muitas vezes mais abundantes em amostras
proteicas solúveis e são bem representados em estudos proteômicos. Isso também se
aplica à análises em proteomas fúngicos, por exemplo, proteínas envolvidas em
processos metabólicos representou cerca de 66% do total de proteínas identificadas em
uredósporos do basidiomiceto fitopatogênico Uromyces apendiculatus (Cooper et al,
2006). Similarmente, proteínas responsáveis pelo metabolismo do processo germinativo
representaram 75% das proteínas identificadas em análises proteômicas de
conidiósporos do fungo fitopatogênico Blumeria graminis f.sp.hordei causador do
míldio em cevada (Noir, et al, 2010).
Curiosamente, o acúmulo de proteínas associadas com metabolismo energético
(ATP sintase) e proteico (BiP) foi reduzido em basidiósporos germinados em lavado
foliar de catongo ( Figura 12). A redução da ATP sintase juntamente com a detecção e
100
aumento da ADH nos basidiósporos germinados no lavado foliar de catongo sugere uma
mudança do metabolismo aeróbio para o fermentativo no fungo em resposta aos
componentes do lavado foliar.
Já a dimuição de proteínas BiP nos basidiósporos germinados em lavado de
catongo talvez esteja relacionada uma menor síntese de proteínas, especialmente,
aquelas direcionadas à rota secretora. Sugere também baixo nível de estresse ao nível de
retículo endoplasmático, uma vez que estas proteínas Bip também têm um papel central
como sensor de estresses ambiental no ER que afeta a montagem e o dobramento de
proteínas (Hendershot, 2004).
4.3 Proteínas relacionadas com a virulência
Uma poliquetide ciclase (spot 298) foi induzida nos esporos germinados em
lavado foliar de CCN51 e Catongo quando comparados ao controle (Figura 10, grupo
azul escuro) Quando os tratamentos foram comparados, esta proteína teve expressão
maior nos basidiósporos germinados em lavado foliar de CCN51 em relação ao
Catongo. Esta proteína está relacionada à virulência fúngica. Uma variedade de tipos de
micotoxinas são derivadas de poliketides cyclases (Brase, 2009). Neste caso, o
basidiósporo pode ter sido induzido a aumentar seus mecanismos de virulência para o
ataque em um hospedeiro mais resistente.
A Glicoside hidrolase (Spot 681) foi exclusivamente expressa em basidiósporos
germinados em lavado foliar de CCN51 (Figura 10, grupo azul escuro). Glicoside
hidrolases da família 10 são um grupo de enzimas que hidrolisam a ligação glicosídica
entre dois ou mais carboidratos, ou entre um carboidrato e uma porção não carboidrato.
Mais de 100 membros desta família de proteínas já foram classificadas de acordo com a
similaridade de suas sequencias (Henrissat, 1991). Estas enzimas tais como celulases,
xilanases e poligalacturonases degradam os principais polissacarídeos de paredes
celulares de plantas, enfraquecendo a primeira barreira física contra o ataque de agentes
patogênicos durante a colonização de plantas (Albersheim, 1969). Este achado sugere
que o basidiósporo pode se preparar rapidamente para o processo de infecção
produzindo enzimas de degradação para rápida liberação de nutrientes. Além disso, a
liberação destas enzimas ativa o sistema imune inato de plantas por ambos os padrões
moleculares associados a agentes patogênicos e padrões moleculares associados a
101
danos. No mecanismo desencadeado por padrões moleculares associados a agentes
patogênicos, pode elicitar respostas de defesa, independentemente da sua atividade
enzimática, tal como demonstrado para outras xilanases fúngicas (Furman-Matarasso,
1999), que são reconhecidas por receptores específicos na superfície da célula de planta
como acontece em Nicotiana tabacum (Hanania and Avni, 1997). Isso pode contribuir
para a resistência da variedade CCN51 à doença vassoura-de-bruxa em relação ao
Catongo já que esta proteína foi exclusivamente expressa em basidiósporos germinados
em lavado de CCN51.
Outra proteína interessante relacionada à resistência do patógeno ao ataque do
hospedeiro é a Transportadora de multidrogas (MFS) (spot 664). Esta proteína também
foi exclusivamente expressa em basidiósporos germinados em lavado foliar de CCN51
(Figura 10, grupo azul escuro). MFS são transportadores secundários capazes de
transportar solutos em resposta a um gradiente quimiosmótico, geralmente estão
envolvidos no efluxo de compostos tóxicos naturais ou fungicidas (Del Sorbo et al.,
2000). Desta maneira o basidiósporo pode estar reconhecendo fatores de defesa
existentes na superfície foliar da variedade CCN51 e utiliza este mecanismo como meio
de sobrevivência.
4.4 Expressão de proteínas relacionadas com estresse oxidativo e fermentação
O aumento significativo da expressão da proteína Catalase A nos basidiósporos
germinados na presença dos lavados foliares pode evidenciar a presença de substâncias
elicitoras de defesa da planta na superfície foliar (Figura 12). Isso mostra que o fungo é
capaz de ativar seus mecanismos de defesas contra espécies reativas de oxigênio
liberadas pela planta mesmo antes de invadir o tecido. O acúmulo da Catalase A foi
maior na variedade suscetível, apesar deste experimento não ter sido avaliado “in
planta”, isso pode estar associado ao aumento dos níveis de H2O2 nas duas variedades
de cacau apresentarem padrões temporal e funcional distintos. Uma vez que, produzidos
no início da infecção pela variedade resistente pode contribuir para o controle da
infecção e resistência. Em estágios avançados da doença na variedade suscetível, isso
pode promover o desenvolvimento do patógeno (Dias, 2011).
Apesar de todos os meios de germinação (controle e lavados foliares) em que os
102
basidiósporos foram submetidos conterem glicerol como fonte de carbono não
fermentável. A detecção da proteína álcool desidrogenase (ADH) somente nos
basidiósporos germinados na presença dos lavados foliares sugere uma preparação
prévia da hifa para o estabelecimento da fase biotrófica onde a difusão de oxigênio para
o interior da hifa pode ser baixa (Figura12). Além disso, compostos da superfície celular
podem desencadear a produção de açucares como lactatos já que a ADH converte
piruvato em lactato. Em esporos de Phycomyces blakesleeanus, assim que a germinação
é ativada, alguns compostos como piruvatos, lactatos e principalmente glicerol são
sintetizados (Van Laere, 1986).
5. CONCLUSÕES
A partir deste estudo puderam-se verificar alterações morfológicas entre os
padrões de germinação dos esporos na presença de lavado foliar dos genótipos CCN51 e
Catongo. Qualitativamente, pode-se observar uma menor quantidade de basidiósporos
germinados no lavado foliar de CCN51. Corroborando nossa hipótese, foi visto que
também houve alterações nos perfis de expressão proteômicos dos basidiósporos
submetidos aos tratamentos com os lavados foliares.
Além disso, proteínas envolvidas com virulência e resistência do fungo como a
poliquetide ciclase, glicoside hidrolase e proteína transportadora de multidrogas (MFS)
e proteínas relacionadas com estresse oxidativo e fermentação como a catalase A e a
álcool desidrogenase (ADH) foram identificadas. Estas proteínas tiveram expressão
diferencial entre os tratamentos mostrando que o fungo usa mecanismos específicos em
resposta à defesa do hospedeiro. A redução da ATP sintase nos basidiósporos
germinados no lavado foliar de catongo sugere uma mudança do metabolismo aeróbio
para o fermentativo no fungo em resposta aos componentes do lavado foliar.
REFERÊNCIAS
Aime, M. C., and Phillips-Mora, W. 2005. The causal agents of witches' broom and
frosty pod rot of cacao (chocolate, Theobroma cacao) form a new lineage of
Marasmiaceae. Mycologia 97:1012-1022.
103
Albersheim P., Jones T. M., English P. D. Biochemistry of the cell wall in relation to
infective processes. Annu. Rev. Phytopathol. 7, 171–194,1969.
Almeida, D. S. M. Identificação de proteínas do filoplano do Theobroma cacao L.
Dissertação de mestrado. Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, Bahia, (2012).
Blakeman, J.P., Fokkema, N.J.,.Potential for biological control of plant diseases on
thephylloplane. Annu. Rev. Phytopathol. 20, 167–192, 1982.
Bowers JH, Bailey BA, Hebbar PK, Sanogo S and Lumsden RD (2001) The impact of
plant diseases on world chocolate production. Disponível em:
http://www.plantmanagementnetwork.org/pub/php/review/cacao/ junho, 2016
Brase S, Encinas A, Keck J, Nising CF. Chemistry and Biology of Mycotoxins and
Related Fungal Metabolites. Chem Rev.;109:3903–3990, 2009
Ceplac - A Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira. Lista de clones.
Disponível em: <http://www.ceplac.gov.br/radar/ListaClones.asp>. 1 Mai. 2015.
Cooper, B., Garrett, W. M., and Campbell, K. B. 2006. Shotgun identification of
proteins from uredospores of the bean rust Uromyces appendiculatus. Proteomics
6:2477-2484.
De lucca, AJ et al, Plant-derived antifungal protein and peptides. Can. J. Microbial. 51,
1001-1014, 2005.
Del Sorbo, G H. Schoonbeek, M.A. De Waard Fungal transporters involved in efflux of
natural toxic compounds and fungicides Fungal Genet. Biol., 30 , pp. 1–15, 2000
Dias CV, et al. Hydrogen peroxide formation in cacao tissues infected by the
hemibiotrophic fungus Moniliophthora perniciosa Plant Physiology and Biochemistry
49 917-922, 2011.
Frias, GA, Purdy LH, and Schimidt, R A. An inoculation method for evaluating
resistance of cacao to Crinipellis perniciosa. Plant. Dis, 79: 787-791, 1995.
Hanania U. and Avni A. High-affinity binding site for ethylene-inducing xylanase
elicitor on Nicotiana tabacum membranes The Plant Journal (1997) 12(1), 113-120
104
Hendershot LM The ER function BiP is a master regulator of ER function. Mt Sinai J
Med 71: 289–297, 2004.
Henrissat B. "A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence
similarities". Biochem. J. 280 (2): 309–16, 1991.
Last F T, Deighton F C. The non-parasitic microflora on the surfaces of living leaves.
Trans Br Mycol Soc.48:83–99, 1965.
Mares, JH. 2012. Análise proteômica de basidiósporos do fungo Moniliophthora
perniciosa durante a germinação. Dissertação de mestrado. Universidade Estadual de
Santa Cruz, Ilhéus, BA, Brasil
Mares JH, Gramacho KP, Dos Santos EC, Santiago Ada S, Silva EM, Alvim FC1,
Pirovani CP. Protein profile and protein interaction network of Moniliophthora
perniciosa basidiospores. BMC Microbiol. 2016 Jun 24;16(1)
Neuhoff V, Arold N, Taube D, Ehrhardt W.. Improved staining of proteins in
polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at
nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.
Electrophoresis 9: 255-262
Noir, S., Colby, T., Harzen, A., Schmidt, J., and Panstruga, R. 2009. A proteomic
analysis of powdery mildew (Blumeria graminis f.sp. hordei) conidiospores. Molecular
plant pathology 10:223-236.
Shah, J. Lipids, lipases, and lipid-modifyng enzymes in plant disease resistance. Annu.
Rev. Phytopathol. 43, 229-260, 2005.
Shepherd, RW. et al Phylloplanins of tobacco are defensive proteins deployed on serial
surfaces by short glandular trichomes. Plant Cell 17, 1851-1861, 2005
Shepherd RW and Wagner GJ Phyloplane proteins: emerging defenses at the aerial
frontline? Trends in Plant Science. V.12, 2, 1360-1385, 2007.
Shevchenko A1, Tomas H, Havlis J, Olsen JV, Mann M. In-gel digestion for mass
spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 2006;1(6):2856-
60.
Van Laere, A. J. Biochemistry of spore germination in Phycomyces. FEMS
Microbiology Reviews, v. 1, n. 3-4, p. 189-198, 1986
CONCLUSÕES GERAIS
Foi visto que alterações moleculares que ocorrem durante o desenvolvimento do
tubo germinativo foram identificadas a partir de uma análise de agrupamento hierárquico
baseada no acúmulo diferencial das proteínas. Proteínas associadas à filamentação fúngica
como a septina e quinesina foram detectadas somente com 4 horas de germinação. Os
acúmulos da beta ATP sinthase, BiP e catalase foram validados por Western blot com
anticorpos policlonais. Com base nestes resultados propusemos um modelo da expressão
de proteínas nos principais eventos que ocorrem durante a germinação do fungo M.
perniciosa
Neste trabalho mostramos também que há um efeito de substâncias do filoplano do
cacaueiro na germinação dos basidiósporos do fungo. Há alterações na expressão de
proteínas que estão relacionadas com a resposta a proteínas de defesa das plantas de
variedades resistentes e suscetível à doença. O fungo, em sua fase inicial apresenta
proteínas de virulência quando em contato com elicitores da variedade resistente e
aumenta sua expressão de Catalase A na variedade suscetível, o que é compatível com o
estabelecimento da doença. Além destes achados, vimos que em seu desenvolvimento
inicial, o fungo utiliza fonte de carbono fermentável para sua sobrevivência no apoplasto,
onde provavelmente a fonte de oxigênio será menor.
Estes estudos podem ajudar a desvendar os mecanismos que estão envolvidos em
processos básicos de invasão do hospedeiro, bem como, estabelecer estratégias para o
controle da doença.
REFERÊNCIAS COMPLEMENTARES
Aime, M. C., Phillips-Mora, W. The causal agents of witches' broom and frosty pod rot of
cacao (chocolate, Theobroma cacao) form a new lineage of Marasmiaceae. Mycologia.
97, 1012-22, 2005.
Albersheim P., Jones T. M., English P. D. Biochemistry of the cell wall in relation to
infective processes. Annu. Rev. Phytopathol. 7, 171–194,1969.
Allen, P. J. Metabolic Aspects of Spore Germination in Fungi. Annual Review of
Phytopathology, v. 3, n. 1, p. 313-342, 1965.
Almeida, a. A. F., Aguilar, m. A. G. And Araújo, I. S. Anatomical modifications in two
cacao genotypes infected by Crinipellis perniciosa. Agrotrópica, v. 10, n.3, p. 199-202,
1998.
Almeida, C., Bastos, c. N., Ferreira, N. P. Produção de basidiocarpos de Crinipellis
perniciosa em dois sistemas de cultivo do cacueiro. Fitopatol Bras, v. 20, n.1, p. 60-64,
1995.
Almeida, o. C., Chiacchio, f. P. B., Rocha, h. M. Sobrevivência de Crinipellis perniciosa
(Stahel) Singer em vassouras secas de cacaueiros (Theobroma cacao L.) do estado da
Bahia. Agrotrópica, v. 9, n.1, p. 23-28, 1997.
Almeida, D. S. M. Identificação de proteínas do filoplano do Theobroma cacao L.
Dissertação de mestrado. Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, Bahia, (2012).
Amme, S. et al. A proteome approach defines protective functions of tobacco leaf
trichomes. Proteomics 5, 2508-2518, 2005.
Andebrhan T, Costa, JCB, Carvalho, ALP, Albuquerque, P. Comparative epidemiology
experimente: Brazil. In Rudgard, AC; Maddison, AC.; Andebrhan, T. (Ed.) Disease
management in cocoa: comparative epidemiology of withes’ broom. London:
Chapman & Hall p. 33-92, 1993.
Barbieri, Rosa L. & Carvalho, Fernando I. F. de. Coevolução de plantas e fungos
patogênicos. Rev. Bras. de Agrociência, v.7 n. 2, p. 79-83 mai-ago, 2001
Bastos CN, Andebrhan T, Almeida LC de. Comparacões morfológicas e patológica de
Crinipellis perniciosa. Fitopatol Bras 13:202–206, 1988.
Bastos, C. Trichoderma stromaticum sp. nov. na produção de basidiomas e infecções
de ramos e almofadas florais do cacaueiro por Crinipellis perniciosa. Agrotrópica, v.
12, p. 59–62, 2000.
Beilby JP, Kidby DK. Biochemistry of ungerminated and germinated spores of the
vesicular-arbuscular mycorrhizal fungus, Glomus caledonius: changes in neutral and
polar lipids. J Lipid Res. 21(6):739-50, 1980.
Bezerra, J.; costa, J. E pomela, AWV & Almeida, O. Como produzir Tricovab para
controlar a vassoura-de-bruxa do cacaueiro. Fitopatologia Brasileira, v. 25 p. 359,
2000.
Blakeman, J.P., Fokkema, N.J.,.Potential for biological control of plant diseases on
thephylloplane. Annu. Rev. Phytopathol. 20, 167–192, 1982.
Brase S, Encinas A, Keck J, Nising CF. Chemistry and Biology of Mycotoxins and
Related Fungal Metabolites. Chem Rev.;109:3903–3990, 2009
Caltrider, P. G., Ramachandran, S., and Gottlieb, D. Metabolism during germination
and function of glyoxylate enzymes in uredospores of rust fungi. Phytopathology, 53,
86-92, 1963
Ceita G de O, Macêdo JN, Santos TB, Alemanno L, Gesteira AS, Micheli F, Mariano,
AC, Gramacho KP, Silva DC, Meinhardt L, Mazzafera P, Pereira GAG, Cascardo, JM,
Involvement of calcium oxalate degradation during programmed cell death in
Theobroma cacao tissues triggered by the hemibiotrophic fungus Moniliophthora
perniciosa. Plant Science 173:106–117, 2007.
Ceplac - A Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira. Lista de clones.
Disponível em: <http://www.ceplac.gov.br/radar/ListaClones.asp>. 1 Mai. 2015.
De lucca, AJ et al, Plant-derived antifungal protein and peptides. Can. J. Microbial. 51,
1001-1014, 2005.
Del Sorbo, G H. Schoonbeek, M.A. De Waard Fungal transporters involved in efflux of
natural toxic compounds and fungicides Fungal Genet. Biol., 30 , pp. 1–15, 2000
Dias CV, et al. Hydrogen peroxide formation in cacao tissues infected by the
hemibiotrophic fungus Moniliophthora perniciosa Plant Physiology and Biochemistry
49 917-922, 2011.
Dijksterhuis J., Nijsse J. Hoekstra FA. and Golovina. EA. High Viscosity and
Anisotropy Characterize the Cytoplasm of Fungal Dormant Stress-Resistant Spores.
Eukaryotic Cell v. 6 no. 2 157-170, 2007
El-Akhal, M. R., Colby, T., Cantoral, J. M., Harzen, A., Schmidt, J., and Fernandez-
Acero, F. J. 2013. Proteomic analysis of conidia germination in Colletotrichum
acutatum. Archives of microbiology 195:227-246.
Ekundayo, J. A.; Carlile, M. J. The Germination of Sporangiospores of Rhizopus
arrhizus; Spore Swelling and Germ-Tube Emergence. Microbiology, v. 35, n. 2, p. 261-
269, 1964.
Evans HC.. A new pathotype of Crinipellis perniciosa (witches’ broom disease) on
solanaceous hosts. Plant Pathol 34:306–312, 1985.
Evans HC.. Witches’ broom disease of T. cacao (Crinipellis perniciosa) in Ecuador: 1.
The fungus. Ann App Biol 89:185–192, 1978.
Feofilova AA. Ivashechkinb AI, Alekhinc, and Ya. E. Sergeeva. Fungal Spores:
Dormancy, Germination, Chemical Composition, and Role in Biotechnology. Applied
Biochemistry And Microbiology v. 48 n. 1, 2012
Ferraz, ECA A vassoura-de-bruxa na Bahia. Plano integrado de ações. Ilhéus,
CEPLAC, 44, 1989
Frias G A, Purdy LH, Schimidt RA. Infection biology of Crinipellis perniciosa on
vegetative flushes of cacao. Plant Disease;75(6):552–6, 1991.
Frias, GA, Purdy LH, and Schimidt, R A. An inoculation method for evaluating
resistance of cacao to Crinipellis perniciosa. Plant. Dis, 79: 787-791, 1995.
Furman-Matarasso N., Cohen E., Du Q., Chejanovsky N., Hanania U., Avni A. A point
mutation in the ethylene-inducing xylanase elicitor inhibits the beta-1–4-endoxylanase
activity but not the elicitation activity. Plant Physiol. 121, 345–351, 1999.
Gesteira, A.S.; et al. Isolation and purification of functional total RNA from different
organs of cocoa tree during its interaction with the pathogen Crinipellis perniciosa.
BioTechniques. Vol. 35, 494-500. 2007
Grunwald, I. et al. Identification of guttation fluid proteins: the presence of
pathogenesis-related proteins in non-infected barley plants. Physiol. Plant. 119, 192–
202, 2003.
Hanania U., Avni A. High-affinity binding site for ethylene-inducing xylanase elicitor
on Nicotiana tabacum membranes. Plant J. 12, 113–120, 1997.
Hendershot LM The ER function BiP is a master regulator of ER function. Mt Sinai J
Med 71: 289–297, 2004.
Henrissat B. "A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence
similarities". Biochem. J. 280 (2): 309–16, 1991.
Kerstiens, G. Water transport in plant cuticles: an update. J. Exp. Bot. 57, 2493-2499,
2006
Kowalski, SP, et al. Purification and characterization of polyphenol oxidase from
trichomes of Solanum berthaultii. Plant Physiol. 100, 677-684, 1992.
Van Laere, A. J. Biochemistry of spore germination in Phycomyces. FEMS
Microbiology Reviews, v. 1, n. 3-4, p. 189-198, 1986
Last F T, Deighton F C. The non-parasitic microflora on the surfaces of living leaves.
Trans Br Mycol Soc.48:83–99, 1965.
Lawrence JS, Campêlo AMFL, Figueiredo JM. Enfermidades do cacaueiro. II -
Doenças fúngicas que ocorrem nas folhas, ramos e tronco. Agrotrópica, v. 3, n.1, p. 1-
14, 1991.
Leighton TJ, and Stock JJ. Biochemical Changes During Fungal Sporulation
and Spore Germination. I. Phenyl Methyl Sulfonyl Fluoride Inhibition of Macroconidial
Germination in Microsporum gypseum Journal Of Bacteriology, p. 931-940, 1970.
Liu J, et al,. The nightshade proteinase inhibitor IIb gene is constitutively expressed in
glandular trichomes. Plant Cell Physiol. 47, 1274-1284, 2006.
Loguercio, L. L. et al. Canopy-microclimate effects on the antagonism between
Trichoderma stromaticum and Moniliophthora perniciosa in shaded cacao. Plant
Pathology, v. 58, n. 6, p. 1104–1115, 2009.
Mares JH, Gramacho KP, Dos Santos EC, Santiago Ada S, Silva EM, Alvim FC1,
Pirovani CP. Protein profile and protein interaction network of Moniliophthora
perniciosa basidiospores. BMC Microbiol. 2016 Jun 24;16(1)
Meinhardt, L. W. et al. Moniliophthora perniciosa, the causal agent of witches’
broom disease of cacao: what's new from this old foe? Molecular Plant Pathology, v.
9, n. 5, p. 577–588, 2008.
Nobrega, F.M et al. Antimicrobial proteins from cowpea root exudates: inhibitory
activity against Fusarium oxysporum and purification of a chitinase-like protein. Pant
Soil 272, 223-232, 2005.
Oh, IS. et al. Secretome analysis reveals an Arapdopsis lipase involved in defense
against Alternaria brassicicola. Plant Cell 17, 2832-2847, 2005.
Orchard J, Collin HA, Hardwick K, Isaac S.. Changes in morphology and measurement
of cytokinin levels during the development of witches brooms on cocoa. Plant
Pathology 43, 65-72, 1994.
Packter, NM. Lipid biochemistry of fungi and other organisms: By JD Weete. pp 388.
Plenum Press, New York and London. 1980. Biochemical Education, v. 9, n. 4, p. 156-
156, 1981
Pirovani C. P and Micheli F. Protein extraction for proteome analysis from cacao leaves
and meristems, organs infected by Moniliophthora perniciosa, the causal agent of the
witches' broom disease. Electrophoresis 29(11): 2391-2401, 2008.
Phillips, M.A. and Croteau, R.B. Resin-based defenses in conifers. Trends Plant Sci. 4,
184–190, 1999.
Powell, J. F., and R. E. Strange. Biochemical changes occurring during the germination
of bacterial spores. Biochem. J. 54:205-209, 1953.
Purdy LH, Schmidt RA. Status of cacao witches’ broom: biology, epidemiology and
management. Ann Rev Phytopatho 34:573–594, 1996.
Rincones, J. et al. Differential gene expression between the biotrophic-like and
saprotrophic mycelia of the witches’ broom pathogen Moniliophthora perniciosa Mol.
Plant Microbial. Interactions 21, 891–908. 2008
Santos AM; Santos GBM. Cacau fino no Brasil : conceitos e evolução.
Revista de Difusão Agropecuária, CEPLAC- Bahia, vol 4, n. 1, p 1-18, 2012
Singer, R.. "Monograph study of the genera Crinipellis and Chaetochalatus." Liloa 8(7):
503, 1942.
Scarpari LM. et al. Biochemical changes during the development of witches’
broom: the most important disease of cocoa in Brazil caused by Crinipellis perniciosa.
Journal of Experimental Botany, v. 56, n. 413, p. 865–877, 2005.
Shah, J. Lipids, lipases, and lipid-modifyng enzymes in plant disease resistance. Annu.
Rev. Phytopathol. 43, 229-260, 2005.
Shepherd, RW. et al Phylloplanins of tobacco are defensive proteins deployed on serial
surfaces by short glandular trichomes. Plant Cell 17, 1851-1861, 2005
Shepherd RW and Wagner GJ Phyloplane proteins: emerging defenses at the aerial
frontline? Trends in Plant Science. V.12, 2, 1360-1385, 2007.
Strange, R. E., and E. A. Dark.. A cell-wall lytic enzyme associated with spores of
Bacillus species. J. Gen. Microbiol. 16:236-249, 1957.
Van Schaftingen, E.; Van Laere, A. J. Glycerol formation after the breaking of
dormancy of Phycomyces blakesleeanus spores. European Journal of Biochemistry,
v. 148, n. 2, p. 399-404, 1985.
Wood-Baker, A. Effects of oxygen-nitrogen mixtures on the spore germination of
mucoraceous moulds. Transactions of the British Mycological Society, v. 38, n. 3, p.
291-297, 1955.
Yanagita, T., and Y. Nomachi. Kinetic analysis of the region of protease formation in
the hypha of Aspergillus niger. J. Gen. Appl. Microbiol. 13:227-235, 1967.
Young, SA, et al. Rice cationic peroxidase accumulates in xylem vessels during
incompatible interactions with Xanthomonas oryzae pv oryzae. Plant Physiol.
107, 1333-1341, 1995.
