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I
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
FERNANDA TAVARES BANDEIRA DE MELLO
PADRONIZAÇÃO DA PCR EM TEMPO REAL PARA A QUANTIFICAÇÃO
SIMULTÂNEA DE GENES DE VIRULÊNCIA DE Escherichia coli
ILHÉUS – BAHIA
2015
II
FERNANDA TAVARES BANDEIRA DE MELLO
PADRONIZAÇÃO DA PCR EM TEMPO REAL PARA A QUANTIFICAÇÃO
SIMULTÂNEA DE GENES DE VIRULÊNCIA DE Escherichia coli
Dissertação apresentada à Universidade Estadual de
Santa Cruz, como parte das exigências para
obtenção do título de Mestre em Ciência Animal.
Área de Concentração: Clínica e Sanidade Animal.
Orientador: Profª. Drª. Bianca Mendes Maciel
ILHÉUS – BAHIA
2015
III
M527 Mello, Fernanda Tavares Bandeira de. Padronização da PCR em tempo real para a quantificação simultânea de genes de virulência de Escherichia coli / Fernan- da Tavares Bandeira de Mello. – Ilhéus : UESC, 2015. 52f. : il. Orientadora : Bianca Mendes Maciel. Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual de Santa Cruz. Programa de Pós-graduação em Ciência Animal. Inclui referências. Bactérias gram-negativas – Brasil. 2. Microbiologia. 3. Intestinos – Parasito. 4. Segurança alimentar. I. Maciel, Bianca Mendes. II. Título. CDD - 574
IV
FERNANDA TAVARES BANDEIRA DE MELLO
BANDEIRA DE MELLO, F. T. Padronização da PCR em Tempo Real para a
Quantificação Simultânea de Genes de Virulência de Escherichia Coli.
2015. 52f. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal) – Programa de Pós
Graduação em Ciência Animal, Universidade Estadual de Santa Cruz, Bahia,
2015.
ERRATA
Folha Linha Onde se lê Leia-se
IV 1 e 2 PCR QUANTITATIVA EM TEMPO REAL PARA QUANTIFICAÇÃO DE
Escherichia coli PATOGÊNICA EM OSTRAS
DO LITORAL SUL DA BAHIA
PCR EM TEMPO REAL PARA A QUANTIFICAÇÃO
SIMULTÂNEA DE GENES DE VIRULÊNCIA DE Escherichia
coli
V
PCR QUANTITATIVA EM TEMPO REAL PARA QUANTIFICAÇÃO DE Escherichia coli PATOGÊNICA EM OSTRAS DO LITORAL SUL DA BAHIA
Ilhéus – BA, 23/07/2015
______________________________ Bianca Mendes Maciel – DSc
UESC/DCB (Orientadora)
______________________________ Rachel Passos Rezende – DSc
UESC/DCB
______________________________ Tharcilla Braz Alves Pessoa – DSc
Faculdade de Ilhéus
ILHÉUS – BA 2015
VI
DEDICATÓRIA
Dedico esse trabalho a minha mãe e meu avô Bandeira.
VII
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar, agradeço a minha mãe e aos meus avôs, por todo o incentivo, por sempre acreditar em mim, pelo apoio e por serem minha base, meu exemplo e minha inspiração. Ao apoio de meu pai. A minha orientadora, pelos puxões de orelha merecidos, pelos ensinamentos e paciência.
A Fabiana Santos, técnica do laboratório, pela sua imensa ajuda. As colegas de laboratório e projeto, a Daniele Rocha e profª Sônia pela colaboração e dicas preciosas. A minha querida amiga Aline Leite. A todos os colegas do PPGCA e a Eduardo, todos acrescentaram algo de bom nessa jornada. Aos meus ex-orientadores e amigos Jorge Del Rei e Pedro Leite pelo constante incentivo e conselhos, nos momentos mais complicados. Às professoras Ana Paula Uetanabaro e Rachel Rezende, com quem tive a oportunidade de estagiar.
Aos colegas do estágio de docência Polyane Pires e Denisson Chaves, e a “minha” turma de alunos da Agronomia.
À FAPESB pelo financiamento do projeto de pesquisa. À CAPES pela concessão da bolsa de estudos.
VIII
PADRONIZAÇÃO DA PCR EM TEMPO REAL PARA A QUANTIFICAÇÃO
SIMULTÂNEA DE GENES DE VIRULÊNCIA DE Escherichia coli
RESUMO
Espécies de Escherichia coli fazem parte da microbiota intestinal humana e
animal. No entanto, algumas estirpes são patogênicas, sendo subdivididas em
Escherichia coli patogênica extraintestinal (EXPEC) e Escherichia coli
diarreiogênica (DEC). DEC corresponde a um dos principais agentes
etiológicos envolvidos em surtos de doenças transmitidas por alimentos. O
objetivo deste estudo foi padronizar dois ensaios multiplex PCR quantitativo de
em tempo real (qPCR) para identificar simultaneamente genes relacionados a
fatores de virulência em DEC, como stxA1, stxA2, eaeA e virA. Para isso, foram
utilizadas as seguintes estirpes de referência de E. coli patogênicas: E. coli
enterohemorrágica – EHEC O157:H7 (CDC EDL-933 / INCQS 00171); E. coli
enteroinvasiva - EIEC (CDC EDL-1284 / INCQS 00170); E. coli
enteropatogênica - EPEC (CDC O55 / INCQS 00181). Após a extração do DNA
das estirpes de E. coli, uma PCR convencional foi realizada para amplificar os
genes alvos específicos dos fatores de virulência. Em seguida, o produto de
PCR foi purificado e quantificado, e diluições seriadas foram realizadas para
produzir as curvas padrão de cada gene, com os seguintes números de cópias:
stxA1 (2,8x105 a 2,8x101); stxA2 (1,24x105 a 1,24x101); eaeA (0,49x105 a
0,49x101); virA (1,72x105 a 1,72x101). Iniciadores e sondas específicas foram
desenhados para este experimento. Um ensaio triplex de qPCR foi realizado
para quantificar stxA1, stxA2 e eaeA, e uma reação duplex foi realizada para
quantificar os genes virA e eaeA, usando Master Mix Advanced TaqMan Fast
(Applied Biosystems). Os ensaios foram sensíveis apresentando um limite de
detecção de 17 cópias de stxA1; 6 cópias de stxA2; 5 cópias de eaeA e 8
cópias de virA. O coeficiente de determinação (R2) das curvas padrão foram de
0,99. Com base no coeficiente de variação (<1%), foi possível determinar a
reprodutibilidade da técnica intra e inter-ensaio.
Palavras-chave: O157:H7. Saúde Pública. Testes Rápidos. Ensaio multiplex.
Segurança dos Alimentos.
IX
STANDARDIZATION OF MULTIPLEX QUANTITATIVE REAL TIME PCR
ASSAYS FOR VIRULENCE FACTORS IN Escherichia coli
ABSTRACT
Escherichia coli species are part of the human and animal intestinal microbiota,
but some strains are pathogenic, being subdivided into Extraintestinal
pathogenic Escherichia coli (EXPEC) and Diarrheagenic Escherichia coli
(DEC). DEC is one of the main etiologic agents involved in foodborne disease
outbreaks. The aim of this study was to standardize two multiplex quantitative
real-time PCR (qPCR) assays to identify genes of virulence factors in DEC
simultaneously, such as stxA1, stxA2, eaeA and virA. For this, the following
reference strains of pathogenic E. coli were used: Enterohemorrhagic E. coli –
EHEC O157:H7 (CDC EDL-933 / INCQS 00171); Enteroinvasive E. coli – EIEC
(CDC EDL-1284 / INCQS 00170); Enteropathogenic E. coli – EPEC (CDC O55 /
INCQS 00181). After DNA extraction of E. coli strains, a conventional PCR was
performed to amplify the specific target genes of virulence factors. Then, the
PCR product was purified and quantified, and serial dilutions were performed to
produce the standard curves of each gene, with the following copy number:
stxA1 (2,8x105 to 2,8x101); stxA2 (1.24 x105 1.24 x101); eaeA (0.49 x105 0.49
x101); virA (1.72 x105 to 1.72 x101). Specific primers and probes were designed
for this experiment. A triplex qPCR reaction was performed to quantify stxA1,
stxA2 and eaeA, and a duplex reaction was performed to quantify virA and
eaeA using Master Mix Advanced TaqMan Fast (Applied Biosystems). The
assays were sensitive presenting a limit of detection of 17 copies of stxA1; 6
copies of stxA2; 5 copies of eaeA and 8 copies of virA. The coefficient of
determination (R2) of the standard curves were 0.99. Based on the variation
coefficient (<1%), it was possible to determine the reproducibility of intra- and
inter-experiment technique.
Keywords: O157:H. Public Health. Rapid Tests. Multiplex assay. Food Safety.
X
LISTA DE FIGURAS
Figura Página
1. Elementos genéticos presentes em E. coli patogênicas. 17 2. Esquema do mecanismo de ação das diferentes cepas de
Escherichia coli diarreiogênicas. 19
3. Esquema da qPCR utilizando o SYBR® Green. 27
4. Esquema da qPCR com a sonda TaqMan®, representando a fase de polimerização da nova molécula de DNA.
27
5. Esquema da reação de qPCR multiplex usando sonda TaqMan®.
28
6. Surtos de DTA. Brasil, 2000 a 2014 32 7. Tabela relacionando os tipos alimentares envolvidos em
surtos de DTA nos últimos anos no Brasil. 33
8. Os principais agentes etiológicos envolvidos em surtos de DTA nos últimos anos no Brasil
34
9. Amplificação dos fragmentos dos genes alvos em E. coli 40 10. Curvas de amplificação e curvas padrão das diluições
seriadas dos genes de E. coli estudados, através da qPCR utilizando o sistema TaqMan.
42
XI
LISTA DE TABELAS
Tabela Página
1. Doenças associadas aos diferentes tipos de E. coli diarreiogênicas em humanos (modificada).
20
2. Relação de algumas pesquisas desenvolvidas no Brasil sobre a prevalência da E. coli em fezes e alimentos.
30
3. Iniciadores e Sondas utilizadas na PCR e qPCR. 36 4. Reprodutibilidade intra e inter-ensaio da qPCR. 43
XII
LISTA DE ABREVIATURAS
DTA Doenças Transmitidas por Alimentos
DEC Escherichia coli diarreiogênica
PCR Reação em Cadeia de Polimerase
qPCR Reação em Cadeia de Polimerase Quantitativa em Tempo Real
EXPEC Escherichia coli Extra-Intestinal
EPEC Escherichia coli Enteropatogênica
STEC Escherichia coli Produtora de Shiga Toxina
EHEC Escherichia coli Enterohemorrágica
EIEC Escherichia coli Enteroinvasiva
EAEC Escherichia coli Enteroagregativa
ETEC Escherichia coli Enterotoxigênica
DAEC Escherichia coli Difusamente Aderente
AIEC Escherichia coli Aderente Invasiva
tEPEC Escherichia coli Enteropatogênica típica
aEPEC Escherichia coli Enteropatogênica atípica
VTEC Escherichia coli produtora de Verotoxina
SHU Síndrome Hemolítica Urêmica
stx Gene para Shiga toxina
CT Cycle Thresold – Ciclo Limiar
MIQE Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time
PCR Experiments
CDC Center for Disease Control and Prevention
TSB Tryptic Soy Broth
BLAST Basic Local Alignment Search Tool
SD Desvio Padrão
CV Coeficiente de Variação
Tm Temperatura de Dissociação
R2 Coeficiente de Regressão
Eff% Eficiência da Amplificação
XIII
SUMÁRIO
Pag.
1. INTRODUÇÃO 14 2. OBJETIVOS 2.1. Geral 15 2.2. Específicos 15 3. REVISÃO DE LITERATURA 3.1. Escherichia coli 16 3.1.1. Escherichia coli Enteropatogênica 21 3.1.2. Escherichia coli Enterohemorrágica 23 3.1.3. Escherichia coli Enteroinvasiva 24 3.2. Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (qPCR) 25 3.3. Doenças Transmitidas por Alimentos 29 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1. PCR convencional para a amplificação dos genes alvos de
E. coli patogênicas 35
4.2. Produção das curvas padrão através da qPCR 37 4.3. Sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade das
reações de qPCR 38
5. RESULTADOS 5.1. Especificidade dos Iniciadores 39 5.2. Curva padrão para a quantificação de genes relacionados a
fatores de virulência em E. coli patogênica 41
5.3. Sensibilidade e Reprodutibilidade da Técnica 41
6. DISCUSSÃO 44
7. CONCLUSÃO 46
REFERÊNCIAS 47
14
1. INTRODUÇÃO
Escherichia coli é uma bactéria autóctone da microbiota intestinal de
animais de sangue quente e do ser humano. Com a evolução das cepas,
algumas adquiriram fatores de virulência que as tornaram patogênicas, estando
a maioria delas relacionadas a quadros diarréicos, mas outros sistemas podem
ser afetados. A cepa de E. coli O157:H7 é um grande exemplo dessa mutação
ocorrida através dos anos e hoje é considerada a mais virulenta da espécie,
estando relacionada a grandes surtos de doenças transmitidas por alimentos
(DTA) em todo o mundo. É responsável por causar colite hemorrágica que,
quando não tratada adequadamente, pode evoluir para um quadro de
Síndrome Hemolítico Urêmica ou para a morte do paciente.
Apesar das E. coli patogênicas serem um dos principais agentes etiológicos
envolvidos em quadro diarréicos, seu diagnóstico pode ser inconclusivo. O
método adotado no Brasil, por exemplo, é o isolamento da bactéria através de
meios de cultura específicos e a confirmação através de provas bioquímicas e
testes de sorotipagem da cepa. Além de serem técnicas demoradas, nem todas
as cepas de E. coli podem ser identificadas pelo processo de sorotipificação.
Testes moleculares já foram desenvolvidos, permitindo um diagnóstico mais
preciso e específico, como é o caso da Reação em Cadeia da Polimerase
(PCR). Com o avanço da tecnologia, a técnica da PCR em tempo real
possibilitou um diagnóstico mais sensível, mais específico e mais rápido,
principalmente quando se utiliza a padronização para detecção e quantificação
simultânea de mais de um gene alvo em uma única reação. Esses
aprimoramentos das técnicas diagnósticas são fundamentais, principalmente
quando se estuda a causa de surtos de DTAs, onde normalmente várias
pessoas são acometidas. A sensibilidade da técnica ajuda nos casos onde
poucas cepas são necessárias para causar a doença, pois é capaz de detectar
poucas células presentes em uma pequena amostra.
Este trabalho apresenta a padronização de dois ensaios multiplex de PCR
quantitativa em tempo real (qPCR) para cepas diarreiogênicas de Escherichia
coli, incluindo a cepa O157:H7. Os ensaios apresentaram alta sensibilidade e
reprodutibilidade.
15
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
Padronizar reações de PCR em tempo real para a quantificação simultânea
de genes de virulência de Escherichia coli.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Produzir curvas padrão para a quantificação simultânea de genes de
virulência de Escherichia coli enterohemorrágica – EHEC e
enteropatogênica – EPEC, através da técnica quantitativa de reação em
cadeia da polimerase em tempo real (qPCR);
Produzir curvas padrão para a quantificação simultânea de genes de
virulência de Escherichia coli enteroinvasiva - EIEC e enteropatogênica
– EPEC, através da qPCR.
16
3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1. Escherichia coli
Theodor Escherich foi um médico alemão que em 1885 identificou
bactérias em forma de bacilos nas fezes de uma criança com diarreia,
descrevendo pela primeira vez a Escherichia coli (MAINIL, 2013).
A E. coli é uma bacilo Gram-negativo que pertence à família
Enterobacteriacea. São micro-organismos anaeróbios facultativos (YANG;
WANG, 2014), redutores de nitrato, oxidase-negativos, fermentadores de
glicose (TRABULSI, 2005). Crescem de preferência a 37°C, podem ou não ser
móveis, possuindo flagelos peritríquios. Algumas estirpes são fermentadoras
de lactose, porém, a maioria das E. coli enteroinvasiva não fermenta este
acúcar (CROXEN et al., 2013).
A E. coli é uma bactéria que faz parte da microbiota do trato
gastrointestinal dos homens e dos animais, porém algumas cepas patogênicas
podem causar infecções intestinais (grupo denominado E. coli diarreiogênicas –
DEC)e infecções extra-intestinais (EXPEC), como meningites e infecção
urinária (NATARO; KAPER, 1998; DE MOURA et al., 2012; CROXEN et al.,
2013). O que diferencia a cepa autóctone da cepa patogênica é a presença dos
fatores de virulência (Figura 1) nas cepas patogênicas (CFSPH, 2009). Mesmo
as cepas não patogênicas de E. coli podem causar infecções em pacientes
imunossuprimidos ou debilitados (NATARO; KAPER, 1998).
17
Figura 1: Elementos genéticos presentes em E. coli patogênicas. São vários os fatores de
virulência envolvidos na patogenicidade das cepas bacterianas. Dentre eles pode-se citar: os
transposons (Tn – como exemplo, a enterotoxina termoestável [ST] da ETEC); os plasmídeos
(por exemplo, a enterotoxina termolábil [LT] da ETEC, além dos fatores de invasão da EIEC);
os bacteriófagos (como as toxinas Shiga da EHEC); ilhas de patogenicidade (PAI – como
exemplo têm o locus of enterocyte effacement [LEE], da EPEC/EHEC). Deleções, mutações
pontuais e rearranjos de DNA, também podem contribuir com a virulência, dando origem a
cepas patogênicas causadoras de diarreia (EPEC, EHEC, EAEC e DAEC), disenteria (EIEC),
Síndrome Hemolítico Urêmica (EHEC), meningite (MNEC) e infecção do trato urinário (UPEC).
Fonte: Kaper et al. (2004a).
18
Após a contaminação, cada estirpe possui seu mecanismo de
patogenicidade (Figuras 2). Nataro e Kaper (1998) classificaram as DEC em:
as que causam aderência íntima com sinalização da membrana (EPEC e
EHEC), as produtoras de enterotoxinas (ETEC e EAEC) e as invasoras (EIEC).
Gouali e Weil (2013) resumiram as principais características das cepas
diarreiogênicas de E. coli e as manifestações clínicas e doenças a que estão
associadas (Tabela 1).
19
Figura 2: Esquema do mecanismo de ação das diferentes cepas de Escherichia coli
diarreiogênicas. a) As cepas de EPEC formam uma microcolônia, que se aderem nos
enterócitos causando a lesão A/E, levando ao ‘apagamento’ das microvilosidades da célula.
Outra característica dessa cepa é a estimulação da criação de uma espécie de pedestal. Em
ambos os casos ocorre uma diminuição da superfície de absorção de nutrientes pela célula,
levando a um quadro de diarreia. b) As cepas de EHEC, assim como as cepas de EPEC,
causam a lesão do tipo A/E, porém sem a formação de microcolônias, e ocorre a formação dos
pedestais. Outro mecanismo desenvolvido por esta cepa é a produção de uma enterotoxina
semelhante a produzida pela bactéria Shigella (stx), que é liberada no interior do enterócito,
levando a um quadro diarréico. c) As cepas de ETEC produzem dois tipos de enterotoxinas, a
termoestável (ST) e a termolábil (LT). d) As cepas da EAEC formam um biofilme que se adere
a superfície do enterócito, liberando enterotoxinas e citotoxinas em seu interior. e) As cepas de
EIEC possuem mecanismo semelhante ao da Shigella. Após invadir a célula hospedeira,
multiplicam-se e invadem as células adjacentes, gerando uma resposta inflamatória resultando
em um quadro de diarreia. f) As cepas de DAEC induzem um efeito de transdução de sinal
característico nos enterócitos, onde ocorre o crescimento das microvilosidades, que englobam
as bactérias.
Fonte: Kaper et al. (2004c).
20
Tabela 1: Doenças associadas aos diferentes tipos de E. coli diarreiogênicas
em humanos (modificada).
Cepas Doença associada Características das cepas
EPEC Diarreia aquosa aguda ou persistente
Adesão localizada em enterócitos e células in vitro Adesão “íntima” com enterócitos e destruição das microvilosidades (lesão attachement-effacement)
ETEC Diarreia aquosa aguda Adesão a enterócitos através de pili específico Produção de enterotoxinas termoestável (ST) e termolábil (LT)
EHEC Diarreia aquosa aguda; Colite Hemorrágica, Síndrome Hemolítica Urêmica, Púrpura Trombocitopênica Trombótica
Produção de Shiga toxina (stx) Lesão A/E nos enterócitos
EIEC Diarreia aquosa, Disenteria É semelhante geneticamente com a Shigella SP. Invasão e proliferação em células epiteliais
EAEC Diarreia persistente Fatores de virulência heterogêneos: adesinas, toxinas e fatores enteroagregativos Adesão do tipo “tijolos empilhados”
DAEC Diarreia aquosa aguda Adesão difusa Produção de adesina afimbrial Não produz enterotoxina ou stx
EPEC: E. coli enteropatogênica; ETEC: E. coli enterotoxigênica; EHEC: E. coli enterohemorrágica; EIEC: E. coli enteroinvasiva; EAEC: E. coli enteroagregativa; DAEC: E. coli difusamente aderente.
Moreno et al. (2010), apontaram que os maiores causadores de diarreia
infantil na década de 1980 eram as EPEC, porém este quadro vem mudando,
sendo a EAEC e a EPEC atípica (aEPEC) as cepas mais encontradas
atualmente.
A doença diarréica é uma das principais causas de mortalidade e
morbidade em crianças, principalmente quando associada à gastrenterite (DE
MOURA et al., 2012). A E. coli é um dos principais agentes etiológicos da
21
diarreia e também um dos mais estudados (TRABULSI, 2005; CROXEN et al.,
2013).
A contaminação normalmente ocorre em casos de surtos devido a
ingestão de alimentos e/ou água contaminada por fezes humanas ou de
animais portadores do patótipo. Os sintomas são variados, porém podem
evoluir para morte do indivíduo. A dose infectante, dependendo da estirpe,
pode ser baixa, o que se torna uma grande preocupação para a saúde pública.
Programas de vigilância sanitária foram criados em diversos países com a
finalidade de monitorar esses surtos e ajudar na prevenção de novos surtos,
porém a subnotificação dos casos ainda é grande (TRABULSI, 2005; CROXEN
et al., 2013; RITTER; TONDO, 2014). No Brasil, os estados do sul e sudeste do
país são os que mais notificam (RITTER; TONDO, 2014).
A identificação de E. coli não deve ser feita apenas por meios de cultura
e provas bioquímicas, pois muitas vezes é impossível diferenciar as cepas
patogênicas das cepas presentes na microbiota do homem e/ou animais. Com
o advento da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), é possível identificar
um micro-organismo de forma mais confiável e rápida, pois a técnica possui
elevada sensibilidade e especificidade (BUERIS et al., 2007).
3.1.1. Escherichia coli Enteropatogênica (EPEC)
Foi a primeira DEC identificada em diarreia humana entre as décadas de
1920 e 1930, na Alemanha. É normalmente associada a diarreia infantil em
países em desenvolvimento (NATARO; KAPER, 1998; TRABULSI, 2005).
As infecções por EPEC estão associadas às famílias de baixa de renda
de países em desenvolvimento, devido às condições precárias de higiene pela
falta de abastecimento de água potável e tratamento de esgoto (FAGUNDES-
NETO; SCALETSKY, 2000).
As EPEC podem ser subdivididas em típica (tEPEC) e atípica (aEPEC),
o que distingue esses grupos é a presença do plasmídio EAF (EPEC
Adherence Factor) na tEPEC (TRABULSI, 2005; AIDAR-UGRINOVICH et al.,
22
2007; HERNANDES et al., 2009). A tEPEC tem como hospedeiro o humano,
enquanto a aEPEC pode ser encontrada no intestino de homens e animais.
Uma característica da aEPEC é que está fortemente relacionada com as STEC
(TRABULSI et al., 2002).
Um dos mecanismos de patogenicidade da EPEC ocorre quando as
cepas se aglomeram na superfície celular, formando microcolônias densas,
onde as bactérias se ligam umas às outras através de adesinas fimbriais do
tipo BPF (Bundle-forming pilus), resultando na formação de adesão localizada
(LA) (Figura 2. a) (GARCIA; LE BOUGUÉNEC, 1998; TRABULSI, 2005).
A cepa também pode se aderir na superfície dos enterócitos. Esse
mecanismo é mediado pela proteína intimina, que é codificada pelo gene eae
(localizado na ilha de patogenicidade LEE – Locus of Enterocyte Effacement),
que vai interagir com o receptor Tir na superfície da célula intestinal. Ocorre
então a formação da lesão A/E (attaching and effacing), onde a bactéria se liga
e “apaga” as microvilosidades das células intestinais, resultando em má
absorção dos fluidos e nutrientes (Figura 3.a). Caso haja persistência deste
quadro, o indivíduo pode desenvolver uma intolerância alimentar temporária
(NATARO; KAPER, 1998; FAGUNDES-NETO; SCALETSKY, 2000; TRABULSI,
2005). O gene eae está ausente nas cepas de E. coli autóctones, porém está
presente em todas as cepas de EPEC e EHEC, além das bactérias Citrobacter
rodentium e Hafnia alvei (DONNENBERG et al., 1993; NATARO; KAPER,
1998).
Além da perda da microvilosidade, ocorre perda do glicocálice, presença
de uma pseudomembrana revestindo a parte mucosa das células. O aumento
da permeabilidade celular pode gerar uma resposta inflamatória, favorecendo
um quadro diarréico (NATARO; KAPER, 1998; FAGUNDES-NETO;
SCALETSKY, 2000).
Outra característica relatada por Fagundes-Neto e Scaletsky (2000)
sobre o mecanismo de ação da EPEC é a formação de pedestais, devido ao
acúmulo de proteínas do citoesqueleto (alfa-actinina, talina e ezrina),
resultando na atrofia das microvilosidades do enterócitos (GARCIA; LE
BOUGUÉNEC, 1998).
23
3.1.2. Escherichia coli Enterohemorrágica (EHEC)
A E. coli Enterohemorrágica é citada por alguns autores como E. coli
produtora de Shiga toxina (STEC) ou E. coli produtora de Verotoxina (VTEC).
A STEC representa um grande problema para a segurança alimentar,
pois tem se tornado um dos principais agentes envolvidos em surtos de DTA
(AIDAR-UGRINOVICH et al., 2007; CAPRIOLI et al., 2014). É a cepa mais
estudada, estando relacionada a uma grande diversidade de linhas de
pesquisa, seja na microbiologia clínica e alimentar, devido ao seu importante
papel na saúde pública (CROXEN et al., 2013; CAPRIOLI et al., 2014).
Os bovinos são considerados os principais reservatórios dessa bactéria,
sendo suas fezes a principal fonte de contaminação de alimentos destinados
ao consumo humano, como os produtos de origem animal (carne, leite cru e/ou
pasteurizado), água e vegetais (AIDAR-UGRINOVICH et al., 2007; CARLOS et
al., 2011; CROXEN et al., 2013; FORANO et al., 2013; FERREIRA et al., 2014).
De acordo com Nataro e Kaper (1998), a EHEC pode produzir uma
diarréia sem sangue devido às lesões do tipo A/E no cólon, ou diarréia
sanguinolenta e colite hemorrágica, quando a cepa possui o gene stx (Figura 2.
b). No último caso, os quadros se resolvem sem maiores problemas, porém em
crianças e idosos, o quadro pode evoluir para Síndrome Hemolítica Urêmica
(SHU), que se caracteriza por causar insuficiência renal aguda. A principal
cepa relacionada à SHU é a E. coli O157:H7, sendo também a mais
pesquisada (KARCH et al., 2005; FERREIRA et al., 2014). Também pode
ocorrer diarreia não sanguinolenta, disseminação assintomática e em casos
mais graves evoluir para morte (BARI; INATSU, 2014). A dose infecciosa da
EHEC é baixa, necessitando de poucas células para instalar um quadro
diarréico (NATARO; KAPER, 1998).
Segundo Bari e Inatsu (2014), foi em 1982 que a EHEC O157 foi
reconhecida como patógeno humano. Essa cepa evoluiu por meio da aquisição
dos genes para Shiga toxina (stx). São encontrados dois tipos, stx1 e stx2, que
são codificados em um bacteriófago lambdóide introduzido no cromossomo da
EHEC O157. Pennington (2010), relata que o primeiro passo evolutivo para
24
essa cepa ancestral foi a aquisição da toxina Shiga 2 (stx2), posteriormente
ocorreu a substituição do antígeno somático de O55 e O157, para a aquisição
do plasmídeo pO157; perda da capacidade de fermentação do sorbitol e por
fim a obtenção da toxina Shiga 1 (stx1).
As toxinas stx são heterotetrâmeros, compostos por uma subunidade A
(sua função é a atividade enzimática da N-glicosidase sobre a subunidade 28S
do ribossomo) e por cinco subunidades B, cuja função é se ligar ao receptor
celular. O stx1 é 99% idêntico à toxina Shiga produzida pela Shigella, enquanto
o stx2 é 55% idêntico ao stx1, sendo este último produzido por cerca de 97%
das EHEC, com ou sem a produção simultânea do stx1. (GARCIA; LE
BOUGUÉNEC, 1998; GOUALI; WEIL, 2013).
Além dos bacteriófagos LEE e Stx, onde estão localizados os genes eae
e stx1 e stx2, respectivamente, a patogênese da EHEC pode estar relacionada
com outros fatores de virulências codificados por outros fagos, outras ilhas de
patogenicidade (PAI) e pelo plasmídeo pO157. Este plasmídeo transporta os
genes responsáveis pela produção de enterohemolisina e outros agentes como
uma protease de serina e uma catalaseperoxidase (KELLY et al., 2009).
3.1.3. Escherichia coli Enteroinvasiva (EIEC)
A EIEC e a Shigella são responsáveis por causar febre e disenteria
bacilar (diarreia sanguinolenta profusa com presença de muco) (FORSYTHE,
2002; LAMPEL, 2014). Essa enfermidade continua a ser um grande problema
de saúde pública em comunidades pobres, onde não há saneamento básico e
acesso a água potável (MAURELLI, 2013).
Segundo Maurelli (2013), a dose infecciosa da EIEC é baixa, o que a
torna perigosa, principalmente para a população de risco. A bactéria invade as
células epiteliais do cólon, secretando enterotoxinas que desencadeiam a
patogênese da diarréia (NATARO; KAPER, 1998).
A EIEC possui um sistema de secreção do tipo III mediada por
plasmídeos, por onde injeta proteínas através das membranas células,
25
permitindo, assim, a invasão da bactéria na célula hospedeira (PAGE; LILES,
2013). Após invadir, ocorre a ruptura do fagossomo e, livre no interior da célula,
a bactéria se multiplica e migra para as células adjacentes (Figura 2. e). Seu
mecanismo de ação é similar ao da Shigella (KAPER et al., 2004b; CROXEN et
al., 2013).
Além do mecanismo de ação semelhante, a EIEC possui uma
similaridade genética com a Shigella. Portanto, podem ocorrer casos de
subnotificação da EIEC, além de ser uma das cepas que causam
manifestações clínicas com menor gravidade (VAN DEN BELD; REUBSAET,
2012; CROXEN et al., 2013).
A EIEC não é muito associada a surtos de DTA, mas ocasionalmente
ocorrem casos. Não é muito encontrada em países industrializados e em
desenvolvimento (LAMPEL, 2014).
3.2. Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (qPCR)
Os laboratórios de diagnósticos e de análise de alimentos dependem
cada vez mais de técnicas moleculares sensíveis, específicas e que permitam
uma detecção rápida dos patógenos. Com isso é possível um diagnóstico mais
rápido, um tratamento mais eficaz e um melhor prognóstico da enfermidade
(KURKELA; BROWN, 2009; RODRIGUÉZ-LÁZARO; HERNÁNDEZ, 2013a;
ELIZAQUÍVEL et al., 2014; NAVARRO et al., 2015).
A Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa em Tempo Real
(qPCR) é uma técnica versátil, podendo ser utilizada nos vários ramos da
ciência, nos diagnósticos clínicos, na garantia de segurança e qualidade dos
alimentos, na investigação forense, na identificação de resistência microbiana a
antibióticos, na quantificação de organismos geneticamente modificados, e em
diversas áreas da genética (RODRÍGUEZ-LÁZARO et al., 2013b; BINET et al.,
2014; ELIZAQUÍVEL et al., 2014; NAVARRO et al., 2015).
A qPCR é uma técnica molecular em tubo fechado (evita contaminação),
que permite detectar e quantificar o DNA durante a amplificação, podendo ser
26
analisada em tempo real, dispensando a etapa de revelação pela eletroforese.
Durante a amplificação das cópias do ácido nucléico ocorre a emissão de um
sinal fluorescente, permitindo assim sua detecção. A quantidade de cópias
iniciais também é importante, pois quanto maior o número, mais cedo ocorre
sua identificação, e quanto maior o número de amplificações, maior o sinal de
fluorescência emitido (FAWLEY; WILCOX, 2005; KURKELA; BROWN, 2009;
GADKAR; FILION, 2014; NAVARRO et al., 2015).
Inicialmente foi utilizado um sistema de moléculas intercalantes de DNA
que se ligava de forma inespecífica ao ácido nucléico, como o SYBR Green I
(Figura 3) e EvaGreen. Mas já são utilizados oligonucleotídeos marcados com
fluoróforos que se acoplam na região alvo, e no momento da amplificação é
liberado, emitindo fluorescência (FAWLEY; WILCOX, 2005; NAVARRO et al.,
2015). De acordo com Navarro et al. (2015):
Esses oligonucleotídeos podem ser subdivididos de acordo com o
tipo de moléculas fluorescentes utilizadas: (i) iniciadores-sondas
(Scorpions, Amplifluor®, LUX
™, Cyclicons, Angler
®); (ii) sondas:
hidrólise (TaqMan [Figura 4], MGB-TaqMan, Snake assay) e
hibridização (Hybprobe ou FRET, Molecular Beacons, HyBeacon™
,
MGB-Pleiades, MGB-Eclipse, ResonSense®, Yin-Yang ou de
deslocamento); e (iii) PNA, LNA®, ZNA
™, bases não-naturais: iniciador
Plexor™
, Tiny-Molecular Beacon).
27
Figura.3: Esquema da qPCR utilizando o SYBR® Green. 1. O corante SYBR Green se liga a
molécula de DNA; 2. Na fase de desnaturação, ocorre a redução da fluorescência devido ao desligamento do corante do DNA; 3. Na fase de anelamento, ocorre o pareamento dos iniciadores, gerando um novo segmento de DNA; 4. Com a formação da nova cadeia dupla de DNA, o corante se liga a essa molécula, emitindo fluorescência, que é captada pelo equipamento. Fonte: adaptado de Boeyr e Combrisson (2013).
Figura 4: Esquema da qPCR com a sonda TaqMan®, representando a fase de polimerização
da nova molécula de DNA. 1. Na sonda TaqMan, os corantes de fluorescência repórter (R) e inibidor (Q), estão ligados nas extremidades 5’ e 3’ da sonda, respectivamente; 2. Enquanto a sonda estiver intacta, não ocorre a emissão de fluorescência; 3. Durante a fase de extensão, ocorre a fragmentação da sonda, liberando primeiramente o corante repórter da sonda e começando a emissão da fluorescência; 4. Com o término da polimerização e a quebra completa da sonda, ocorre a excitação dos corantes, atingindo o ápice da liberação da fluorescência. Fonte: adaptado de Boeyr e Combrisson (2013).
28
Uma das vantagens da técnica é permitir a amplificação de milhões de
cópias de DNA do patógeno a partir de uma pequena amostra clínica. É uma
técnica mais sensível e específica quando comparadas aos outros testes.
Assim como na PCR convencional, é possível ser realizado um teste multiplex
(Figura 5), permitindo a detecção simultânea de mais de um patógeno no
mesmo ensaio (KURKELA; BROWN, 2009).
Figura 5: Esquema da reação de qPCR multiplex usando sonda TaqMan
®. O desenho
representa vários ensaios de qPCR juntos, utilizando alvos diferentes que são amplificados simultaneamente. Cada sonda contém um corante que emite fluorescência com espectros distintos. Fonte: adaptado de Boeyr e Combrisson
(2013).
O equipamento da qPCR é composto por um termociclador que possui
uma fonte de luz que excita a molécula fluorescente, que é captada pelo
fluorímetro. Um computador, com um software que analisa os resultados,
apresentados na forma de gráficos, com as curvas de amplificação (SOHEILI;
SAMIEI, 2005; NAVARRO et al., 2015).
Para a construção da curva padrão, é utilizada uma diluição seriada de
uma concentração conhecida do alvo e do gene de referência. Com isso é
gerada uma curva CT (cycle thresold) baseada na diluição. Ao testar amostras
desconhecidas, os valores de CT gerados são comparados com os valores da
curva padrão (BOOTH et al., 2010).
29
Com a crescente demanda de pesquisas envolvendo esta técnica,
Bustin et al. (2009) resolveram elaborar um guia com as diretrizes para
publicação denominado “The MIQE Guidelines: Minimum Information for
Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments”. No MIQE encontram-
se informações sobre as nomenclaturas corretas, condições experimentais e
características dos testes, validação dos protocolos e até a forma de
apresentação dos resultados encontrados.
3.3. Doenças Transmitidas por Alimentos relacionadas a E. coli
De acordo com o Ministério da Saúde (BRASIL, 2010), a Doença
Transmitida por Alimento (DTA):
É um termo genérico, aplicado a uma síndrome geralmente
constituída de anorexia, náuseas, vômitos e/ou diarreia,
acompanhada ou não de febre, atribuída à ingestão de alimentos ou
água contaminados. Sintomas digestivos, no entanto, não são as
únicas manifestações dessas doenças, podem ocorrer ainda
afecções extraintestinais, em diferentes órgãos e sistemas como:
meninges, rins, fígado, sistema nervoso central, terminações
nervosas periféricas e outros, de acordo com o agente envolvido.
Segundo Ritter e Tondo (2014), as DTAs são causadas pelo consumo
de alimentos contaminados por patógenos e/ou suas toxinas. Possui
sintomatologias diversas, desde desordens gastrintestinais a morte.
As doenças diarréicas ainda são um grande problema de saúde pública,
principalmente em países em desenvolvimento, sendo a principal causa de
mortalidade em crianças menores de cinco anos (FAGUNDES-NETO;
SCALETSKY, 2000).
Surtos de DTAs relacionados a E. coli afetam milhares de pessoas
anualmente (NATARO; KAPER, 1998). No Brasil, pesquisas sobre a
prevalência desses micro-organismos são desenvolvidas desde a década de
1980. Dados obtidos em levantamento feito sobre casos de prevalência em
30
fezes de crianças (com e sem diarreia) e em fezes de animais (risco de
contaminação de alimentos) são apresentados na Tabela 2.
Tabela 2: Relação de algumas pesquisas desenvolvidas no Brasil sobre a
prevalência da E. coli em fezes e alimentos.
Estudo Local/Época Genes ou
Cepas/Frequência
Autores
Frequência de E. coli em crianças com e sem diarreia
Rio de Janeiro 1994-1995
EAEC (96); AEEC (29); ETEC (21); tEPEC (7); aEPEC (7); EIEC (1)
(REGUA-MANGIA et al., 2004)
Análise das fezes de crianças frequentadoras da creche da Unicamp
Campinas, São Paulo
eae (19); stx1/stx2 (1) (DE MOURA et al., 2012)
Crianças entre 3-5 anos de idade, com e sem diarréia
Teresina, Piauí 2004-2007
eae (63); stx1 (1) (NUNES et al., 2012)
Estudo realizado com crianças de uma comunidade quilombola
Espírito Santo EPEC (9,3%); EIEC (0,9%); STEC (0,2%)
(LOZER et al., 2013)
Estudo realizado em creche com crianças com e sem diarreia
São José do Rio Preto, São Paulo
EPEC (20); EIEC (4); O157:H7 (3)
(CASTRO et al., 2015)
Prevalência de STEC em fezes de ovinos
São Paulo stx1 (16); stx2 (5); stx1 e stx2 (21)
(VETTORATO et al., 2003)
Prevalência de EHEC em fezes de bezerros
São Paulo stx1 (12); stx2 (4); stx1 e stx2 (8); eae (9)
(LEOMIL et al., 2003)
Pesquisa em fezes de animais
São Paulo
stx1 (267); stx2 (87); stx1 e stx2 (185)
(AIDAR-UGRINOVICH et al., 2007)
Pesquisa do perfil de virulência de STEC em fezes de animais de produção
Minas Gerais stx1 (15,6%, 26,7% e 24,1% em gado de corte, de leite e caprino) stx2 (30%, 53,3% e 34,7% em gado de corte, de leite e caprino) eae (15% e 0,8% em gado de leite e de corte)
(OLIVEIRA et al., 2008)
Contaminação microbiológica da água e de moluscos bivalves
Vitória, Espírito Santo 2008-2009
E. coli Água (1,58x10
2, 7,2x10
1
e 2,37x103)
Mexilhões (1,86x104)
(KELLER et al., 2013)
EAEC: E. coli enteroagregativa; AEEC: E. coli attaching and effacing; ETEC: E. coli enterotoxigênica; tEPEC: E. coli enteropatogênica típica; aEPEC: E. coli enteropatogênica atípica; EIEC: E. coli enteroinvasiva; STEC: E. coli produtora de Shiga toxina.
31
Os casos de DTA têm aumentado de modo significativo em todo o
mundo. Os fatores que mais contribuem para esse quadro são o aumento da
população e seu crescimento desordenado, o aumento da produção de
alimentos, sem a devida preocupação com a qualidade desses produtos,
mudanças dos hábitos alimentares, aumento do consumo de fast-food
(BRASIL, 2010), e mais recentemente nos food truck.
Além dos problemas já mencionados, são poucos os municípios
brasileiros que possuem dados epidemiológicos acerca das DTAs, sobre os
patógenos mais comumente envolvidos e alimentos mais frequentemente
contaminados (BRASIL, 2010).
Alves (2014) apresenta dados interessantes do Ministério da Saúde
sobre os surtos de DTA. Na figura 6, pode-se observar que no período entre os
anos 2000 a 2014, quase dois milhões de pessoas foram expostas a algum
patógeno, sendo que destas, quase 200.000 adoeceram. A autora mostra na
figura 7 quais os alimentos relacionados com esses surtos, sendo os pescados,
frutos do mar e processados relacionados a 92 casos, ocupando o 10° lugar.
Na figura 8, encontram-se os agentes etiológicos relacionados aos surtos. A
Escherichia coli ocupa o terceiro lugar, estando associada a 547 casos, nesse
período de 15 anos.
32
Figura 6: Surtos de DTA. Brasil, 2000 a 2014* (dados incompletos para o ano de 2014)
Fonte: (ALVES, 2014)
33
Figura 7: Tabela relacionando os tipos alimentares envolvidos em surtos de DTA nos últimos anos no Brasil. Fonte: (ALVES, 2014)
34
Figura 8: Os principais agentes etiológicos envolvidos em surtos de DTA nos últimos anos no Brasil. Em destaque, ocupando o terceiro lugar em ocorrências, encontra-se a bactéria Escherichia coli. Fonte: (ALVES, 2014).
35
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. PCR convencional para a amplificação dos genes alvos de E.
coli patogênicas
Cepas de E. coli patogênicas, adquiridas da Coleção de Culturas
Microbianas do Instituto Oswaldo Cruz (RJ), foram utilizadas para a
amplificação dos genes alvos relacionados à virulência da cepa, conforme
descrito na Tabela 3.
Uma colônia de cada cepa bacteriana foi cultivada em 1,0 mL de caldo
TSB (Tryptic Soy Broth, Acumedia®), incubadas a 37°C por 18-24h em estufa
bacteriológica e 500 µL da suspensão bacteriana foram utilizados para
extração do DNA. Utilizou-se o kit de extração e purificação de DNA PureLink™
Genomic DNA Mini Kit (Invitrogen, Carlsbad,CA, USA), conforme as instruções
do fabricante.
Uma PCR convencional foi realizada utilizando o DNA bacteriano como
molde e iniciadores específicos para a amplificação de fragmentos dos genes
alvos de cada cepa de E. coli patogênica, em reações individuais (Tabela 4).
As amplificações foram realizadas em um volume total de 50 µL, contendo
tampão da Taq 1X, 1.5 mM MgCl2, 200 µM dNTP, 0.4 µM de cada iniciador
(senso e anti-senso), 2 U Taq DNA Polimerase e 2 µL de DNA. As reações
foram realizadas no termociclador Veriti™ 96-Well Thermal Cycler (Applied
Biosystems™) sendo um ciclo inicial (94º C por 5 min), 32 ciclos (94ºC por 60s,
57ºC por 60s, 72ºC por 60s) e um ciclo de extensão final (72ºC por 7 min). Os
produtos da PCR foram visualizados através do gel de agarose a 1% corados
com SYBR® Safe DNA gel stain (Invitrogen, Carlsbad,CA, USA).
Em seguida, os produtos de PCR foram purificados utilizando o kit
PureLink™ Quick Gel Extraction & PCR Purification Combo Kit (Invitrogen,
Carlsbad,CA, USA) e mensurados a absorbância a 260 e 280 nm através do
espectrofotômetro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific). Os produtos de PCR
(50 ng/µL) foram utilizados na produção da curva padrão da qPCR.
36
Tabela 3: Iniciadores e Sondas utilizadas na PCR e qPCR.
Amostra de Referência
Gene Alvo (N° de acesso GenBank)
Iniciador 1 (5’-3’)a Pb Referência Iniciador 2 (5’-3’) e Sondab
Pb
E. coli EHEC (O157H7) INCQS 00171 (CDC EDL-933)
stxA1: Shiga toxina 1 (VT1) (AF461172)
D: GAAGAGTCCGTGGGATTACG R: AGCGATGCAGCTATTAATAA
130 Pollard et al. (1990)
D: TCCGTGGGATTACGCACAA R: CATCAGAATTGCCCCCAGAGT S: AAAATATTGTGGGATTCATC (Sonda FAM)
62
stxA2 :Shiga toxina 2 (VT2) (AY143337)
D: ACCGTTTTTCAGATTTT(G/A)CACATA R: TACACAGGAGCAGTTTCAGACAGT
298 Svenungsson et al. (2000)
D: GAACGTTCCGGAATGCAAA R:CCATTAACGCCAGATATGATGAAA S: CAGTCGTCACTCACTG (Sonda VIC)
61
E. coli EPEC INCQS 00181 (CDC O55)
eaeA: E. coli attaching and effacing
(AE005595)
D: AAAAACGCTGACCCGCACCTAAAT R:CACACGAATAAACTGACTAAAATG
376 Svenungsson et al. (2000)
D: TGACCCGCACCTAAATTTGC R: CAGGTCGGAGCGCGTTA S: AAAGCGGGAGTCAAT (Sonda NED)
56
E. coli EIEC INCQS 00170 (CDC EDL-1284)
virA: invasão = Shigella (NC_004851.1)
D: CTGCATTCTGGCAATCTCTTCACA R: TGATGAGCTAACTTCGTAAGCCCTCC
215 Villalobo e Torres (1998)
D: CCGAAAACATAGAAAACAGGCTTAA R: GGGACAACTGCGTTGATTTTTAT S: TTCATGCCTGAACAAC (Sonda VIC)
91
a Utilizado na PCR convencional para a amplificação do gene alvo. O produto do PCR foi utilizado na produção da curva padrão da qPCR;
b Desenhado neste estudo através do Programa Primer Express
® Software For Real-Time PCR, versão 3.0 (Applied Biosystems™).
para
37
4.2. Produção das curvas padrão através da qPCR
Curvas padrão utilizadas na qPCR foram construídas utilizando diluições
seriadas de 105 a 101 cópias dos fragmentos dos genes alvos de cada cepa,
sendo: stxA1 (2,8x105 a 2,8x101); stxA2 (1,24x105 a 1,24x101); eaeA (0,49x105
a 0,49x101) e virA (1,72x10
5 a 1,72x10
1).
Para determinar o número de cópias, foi utilizada a seguinte fórmula:
O sistema SYBR Green (Power SYBR® Green, Applied Biosystems,
Warrington, UK) foi utilizado, inicialmente, para a padronização da quantidade
de iniciadores através da análise da curva de dissociação, buscando uma
maior eficiência da reação. As amplificações foram realizadas em um volume
total de 20 µL contendo 0,5 µL de cada iniciador a 5µM, 10 µL de SYBR®
Select Master Mix (Applied Biosystems), 2 µL de DNA a 50ng/µL. A qPCR foi
realizada na plataforma AB 7500 fast (Life Technologies, Carlsbad, Califórnia,
EUA). A corrida utilizou um ciclo (95°C por 20s) e 40 ciclos (95°C por 03s, 60°C
por 30s), Melt Curve (95°C por 15s, 60°C por 60s, 95°C por 15s, 60°C por 15s).
Uma vez padronizadas as quantidades de iniciadores, uma nova curva-
padrão utilizando as mesmas diluições seriadas 10X dos fragmentos
purificados de cada gene alvo foi realizada através do sistema TaqMan
(Applied Biosystems), utilizando sondas MGB TaqMan marcadas com corantes
fluorescentes, conforme Tabela 3. As amplificações foram realizadas em um
volume total de 20 µL contendo 0,5 µL de cada iniciador a 5 µM, 0,5 µL de
sonda a 5 µM, 10 µL de TaqMan® Fast Advanced Master Mix (Applied
Biosystems), 2 µL de DNA a 50 ng/µL. O volume final da reação foi completado
com água livre de DNAse e RNAse estéril. Foi utilizado um ciclo (95°C por 20s)
e 40 ciclos (95°C por 03s, 60°C por 30s), na plataforma AB 7500 fast (Life
Technologies). Para a padronização da curva padrão da qPCR, também foram
levadas em consideração as corridas que apresentaram valores do slope
(inclinação da curva) próximas a -3,32, que representa 100% de eficiência de
amplificação.
38
Reações multiplex de qPCR foram realizadas para a detecção de até
três genes de virulência de E. coli por reação, através da utilização das sondas
MGB TaqMan, marcadas com diferentes fluoróforos (Tabela 3). As reações
foram realizadas nas mesmas condições descritas anteriormente, sendo:
- Multiplex 1: Detecção e quantificação do gene stxA1; gene stxA2 e
gene eaeA;
- Multiplex 2: Detecção e quantificação do gene eaeA e do gene virA.
4.3. Sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade das reações de
qPCR
A sensibilidade da técnica foi avaliada para determinar o limite mínimo
detectável de cada gene. Para isso, foram realizadas diluições seriadas 1:2,
utilizando os seguintes números de cópias: stxA1 (140; 70; 35; 17,5); stxA2 (62;
31; 15,5; 7,75); eaeA (49; 24,5; 12,25; 6,13) e virA (86; 43; 21,5; 10,75).
A fim de confirmar a especificidade dos iniciadores e sondas utilizadas
na qPCR, as sequências das regiões dos genes alvos foram inicialmente
pesquisadas no programa Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)
(http://blast.ncbi.nlm.gov/Blast.cgi) para verificar a similaridade das mesmas
com as sequências depositadas no banco de dados. Além disto, uma PCR
convencional foi realizada com cada par de iniciadores utilizando o DNA
extraído das diferentes cepas bacterianas utilizadas neste estudo.
Para avaliar a reprodutibilidade intra- e inter-experimento, a média do
limiar do ciclo (CT), o desvio padrão (CT SD) e o coeficiente de variação (CV)
foram calculados em três diferentes corridas, incluindo três replicatas de cada
gene alvo, utilizando as concentrações conhecidas de 105 a 101 número de
cópias.
39
5. RESULTADOS
5.1. Especificidade dos Iniciadores
Os iniciadores para os genes stxA1 e stxA2 foram específicos para a
cepa O157:H7 (EHEC), e virA para a cepa EIEC O gene da intimina (eaeA),
além de amplificar as cepas de EPEC, amplificou também a cepa de EHEC,
como foi possível mostrar neste trabalho (Figura 10).
Através do Programa BLASTn, todas as sequências amplificadas pelos
iniciadores deste estudo apresentaram 100% de similaridade com as regiões
específicas dos genes stxA1, stxA2, eaeA e virA, de acordo com os números
de acesso no GeneBank® AF461172, AY143337, AE005595 e NC_004851.1,
respectivamente.
A análise da curva de dissociação através do sistema SYBR Green
demonstrou que os iniciadores apresentaram uma temperatura de dissociação
(Tm) de 73°C para stxA1, 75°C para stxA2, 79°C para eaeA e 73°C para virA.
Um único pico foi observado em cada Tm, não sendo, portanto, detectados
dímeros de primers (Figura 9).
40
virA
215 pb
stxA1
130 pb
stxA2
298 pb
eaeA
376 pb
EHEC - + + +
EPEC - - - +
EIEC + - - -
(C)
Curva de
Dissociação
Tm 73°C 73°C 75°C 79°C
(1) Marcador de peso molecular 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen™) (2-5): amplificação dos genes virA (2); stxA1 (3); stxA2 (4); eaeA (5).
Figura 9: Amplificação dos fragmentos dos genes alvos em E. coli. (A) Gel de agarose
apresentando os produtos das amplificações (1- Marcador de peso molecular 1 Kb Plus DNA Ladder
(Invitrogen™); 2-5 - amplificação dos fragmentos dos genes virA [2]; stxA1 [3]; stxA2 [4]; eaeA [5]. virA,
stxA1, stxA2 e eaeA. (B) Resultado da PCR utilizando as cepas patogênicas de E.coli
Enterohemorrágica (EHEC – O157:H7 - INCQS 00171 / CDC EDL-933);E. coli Enteroinvasiva
(EIEC - INCQS 00170 / CDC EDL-1284); E. coli Enteropatogênica (EPEC - INCQS 00181 /
CDC O55. (C) Curvas de dissociação através do sistema SYBR Green apresentando as
temperaturas de dissociação durante a amplificação dos fragmentos dos genes alvos.
(B)
(A)
41
5.2. Curva padrão para a quantificação de genes relacionados a
fatores de virulência em E. coli patogênica
Os resultados do slope (que indica a inclinação da curva) encontrados
nas curvas padrão para quantificação de stxA1, stxA2, eaeA e virA utilizando o
sistema TaqMan foram -3,588; -3,825; -3,255 e -3,469, respectivamente, sendo
esses valores próximos do esperado que é de -3,32. As curvas apresentaram
os seguintes valores de coeficientes de determinação (R2): 0,997 para stxA1,
0,998 para stxA2, 1 para eaeA e 0,999 para virA (Figura 10).
5.3. Sensibilidade e Reprodutibilidade da Técnica
O limite mínimo de detecção de cada gene foi: stxA1: 17 cópias; stxA2: 6
cópias; eaeA: 5 cópias e virA: 8 cópias. O coeficiente de variação (CV) dos
ensaios intra e inter-experimentos foram estatisticamente baixos (< 2% e < 1%,
respectivamente) (Tabela 4).
42
Figura 10: Curvas de amplificação (esquerda); curvas padrão (direita) das diluições seriadas dos fragmentos dos genes de E. coli estudados, através da qPCR utilizando o sistema TaqMan. Número de cópias de cada gene: A. stxA1 (2,8x10
5 a 2,8x10
1); B. stxA2 (1,24 x10
5 a
1,24 x101); C. eaeA (0,49 x10
5 a 0,49 x10
1); D. virA (1,72 x10
5 a 1,72 x10
1). Os pontos 5 a 1,
correspondem às quantidades de 105 a 10
1 cópias de cada gene, respectivamente.
1
5 4 3 2 1
1
5 4 3 2 1
1
5
4
3
2
5 4 3 2 1
5
4
3
2
5 4 3 2 1
5
4
3
2
1
Target: stxA2 R2: 0.998 Eff%: 82.579
Target: eaeA R2: 1 Eff%: 102.888
Target: virA R2: 0.999 Eff%: 94.212
A
B
C
D
2
3
4
5
Target: stxA1 R2: 0.997 Eff%: 89.98
43
Tabela 4: Reprodutibilidade da qPCR intra e inter-experimento.
Reprodutibilidade Intra-
experimento
Reprodutibilidade Inter-
experimento
Concentração do
DNA Ct (média) CV (%) Ct (média) CV (%)
stxA1 (limite de detecção: 17 cópias)
2,8 x 105 cópias 22,87 0,17 21,75 0,28
2,8 x 104 cópias 26,25 0,04 25,03 0,20
2,8 x 103 cópias 29,71 0,10 27,84 0,25
2,8 x 102 cópias 32,68 0,91 31,04 0,16
2,8 x 101 cópias 33,65 0,27 33,91 0,27
stxA2 (limite de detecção: 6 cópias)
1,24 x 105 cópias 22,50 0,58 20,06 0,30
1,24 x 104 cópias 26,57 0,15 25,49 0,20
1,24 x 103 cópias 29,97 0,07 28,78 0,07
1,24 x 102 cópias 31,44 0,45 30,43 0,16
1,24 x 101 cópias 34,98 0,91 33,42 0,30
eaeA (limite de detecção: 5 cópias)
0,49 x 105 cópias 20,02 0,90 22,22 0,38
0,49 x 104 cópias 23,72 1,48 25,70 0,32
0,49 x 103 cópias 26,94 0,45 29,07 0,23
0,49 x 102 cópias 30,06 0,13 33,01 0,18
0,49 x 101 cópias 33,68 1,16 33,71 0,15
virA (limite de detecção: 8 cópias)
1,72 x 105 cópias 23,72 0,08 23,65 0,51
1,72 x 104 cópias 31,06 0,35 27,53 0,22
1,72 x 103 cópias 34,91 0,34 31,93 0,31
1,72 x 102 cópias 37,59 0,32 21,54 0,56
1,72 x 101 cópias 37,91 0,16 30,46 0,40
Ct: Cycle threshold; CV: Coeficiente de variação.
44
6. DISCUSSÃO
Neste trabalho, foi possível a padronização de dois ensaios de qPCR
multiplex para a quantificação simultânea de genes de virulência de E. coli. Um
envolveu três e o outro dois fatores de virulência. No primeiro ensaio os genes
stxA1, stxA2 e eaeA foram utilizados, permitindo identificar e quantificar cepas
de E. coli que possuam o gene relacionado a produção da Shiga toxina (STEC)
e o gene da intimina (eaeA), que está mais associado as cepas de EPEC, mas
também é possível amplificar cepas de EHEC. O segundo ensaio utilizou os
fatores de virulência eaeA e virA, permitindo a amplificação das cepas de
EPEC e EIEC, respectivamente. De acordo com Taminiau et al. (2014), é
importante escolher os genes alvos que amplifiquem um fragmento conservado
do DNA. Para facilitar e agilizar o diagnóstico, Bustin et al.(2009) relataram a
possibilidade de padronização de ensaios de qPCR multiplex, permitindo a
pesquisa simultânea de mais de um patógeno.
Conforme já demonstrado em diversos trabalhos (GUION et al., 2008;
CHASSAGNE et al., 2009; FUJIOKA et al., 2009; NUNES et al., 2012) o gene
da intimina (eaeA), além de estar presente em cepas de EPEC, é detectado
também nas cepas de EHEC, como foi possível mostrar neste trabalho (Figura
9). Já os iniciadores para os genes stxA1 e stxA2 foram específicos para a
cepa O157:H7 (EHEC), e virA para a cepa EIEC (Figura 9). No entanto,
estudos demonstram que o gene virA está presente também em cepas das
espécies Shigella sp (VILLALOBO; TORRES, 1998), Streptococcus suis (LI et
al., 2010) e Agrobacterium (ENDOH et al., 1990; LEE et al., 1998).
Villalobo e Torres(1998) (1998) afirmam que o gene virA é altamente
sensível e específico para detectar as bactérias E. coli enteroinvasiva e
Shigella, porém não foram encontrados artigos utilizando a técnica qPCR em
ensaio simples ou multiplex contendo esse gene associado a EIEC.
O ensaio de qPCR apresentou alta sensibilidade, sendo possível
determinar o limite mínimo de detecção de cada gene em baixo número de
cópias, sendo 17 cópias do gene stxA1, 6 cópias do stxA2, 5 cópias do eaeA e
8 cópias do virA. Esse dado é importante, pois em casos de surtos é possível
estimar a dose infectante de cada cepa, além de gerar dados quantitativos que
permitem a realização da análise de risco microbiano e uma intervenção
45
precoce de estratégias de controle. Esta técnica também demonstrou ser
altamente reproduzível, como demonstrado na tabela 4, pois apresentou
valores do coeficiente de variação menores que 2%, tanto intra-experimento,
quanto para inter-experimento.
46
7. CONCLUSÃO
Devido à importância para a saúde pública dos surtos de origem
alimentar e da gravidade do quadro clínico, é necessária a padronização de
métodos diagnósticos rápidos, sensíveis e específicos. Com este trabalho foi
possível padronizar dois ensaios multiplex para cepas diarreiogênicas de
Escherichia coli, incluindo a cepa O157:H7, considerada a mais perigosa do
grupo das E. coli patogênicas, agilizando o resultado e possibilitando um menor
gasto no uso de reagentes e em menor espaço de tempo.
Outro êxito obtido com esse trabalho foi a possibilidade de detectar
poucas células, confirmando a sensibilidade da técnica. Isso é importante, pois
muitas cepas necessitam de uma baixa dose infectante para causar doença.
47
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