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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
Alessandra Regina Dhom Pimentel de Moraes
“Avaliação da combinação da oxigenação hiperbárica com
óleos de Copaifera sp e Carapa guianensis
no tratamento da leishmaniose experimental”
CAMPINAS
2016
Alessandra Regina Dhom Pimentel de Moraes
“Avaliação da combinação da oxigenação hiperbárica com
óleos de Copaifera sp e Carapa guianensis
no tratamento da leishmaniose experimental”
Dissertação apresentada ao Instituto
de Biologia da Universidade Estadual
de Campinas como parte dos
requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Biologia
Animal na área de Relações Antrópicas,
Meio Ambiente e Parasitologia
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA ALESSANDRA REGINA DHOM PIMENTEL DE MORAES E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. SELMA GIORGIO
orientadora: SELMA GIORGIO
CAMPINAS
Campinas, 28 de julho de 2016.
COMISSÃO EXAMINADORA
Profa. Dra. Selma Giorgio (orientadora)
Profa. Dra. Regina Maura Bueno Franco
Prof. Dr. Carlos Emílio Levy
Profa. Dra. Eneida de Paula
Profa. Dra. Adriana Degrossoli
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
Nós vemos o Sol que vem brilhando
Por traz da mais alta serrania
Mostrando a todos que já vem o dia
Os pássaros começam logo cantando
Nós vemos o mundo clareando
O Sol mostra sua fortaleza
A gente admirando a grandeza
Nós sentimos do Sol tanta quentura
A Lua com aquela frieza pura
Manoel Lira
Dedico este trabalho ao meu pai (in memoriam), minha mãe, e minha família
que sempre me apoiaram.
AGRADECIMENTOS
A Deus, que me guia todos os dias.
A FAPESP, CAPES e CNPq pelo apoio.
À profa. Dra. Selma Giorgio, que confiou em mim e no projeto desde o início, me
ensinou e orientou transmitindo seu conhecimento com paciência, dedicação,
firmeza, incentivo e coragem.
Ao meu pai, Dimas, que me fez acreditar em mim sempre, à minha mãe, Nanci, com
seu carinho e apoio em todos os sentidos e minhas irmãs Dinan e Denise que
sempre se mantiveram ao meu lado.
Ao meu marido Gilson, companheiro de cada minuto, dedicado e compreensivo,
juntamente com nossos filhos doando bem mais que tempo.
Ao meu amigo Reinaldo, que me apresentou algumas qualidades dos produtos
naturais que utilizei nesse trabalho, me incentivou a vir para a UNICAMP e realizar o
mestrado.
Ao meu amigo Thiago e sua família, que me auxiliaram a adquirir os óleos naturais
no Acre, me conduzindo aos locais necessários.
Aos amigos do Laboratório de Leishmaniose que me apoiaram, me ensinaram, me
auxiliaram em tantos momentos, Solange, Myriam, Mariana, Bárbara, Luiz, Vanessa,
Izadora, Daniel, Ana, Juliana, Ademar e aos que foram chegando e sendo amigos
verdadeiros.
Aos funcionários do departamento de Biologia Animal João, Nilson, D. Tacilda, que
estiveram, com amizade e prontidão, auxiliando no que foi possível, em especial à
amiga Dra. Tatiana Steiner, que me auxiliou em diversos momentos com seus
conselhos e amizade.
Ao Marco Antônio da Pós Graduação com toda sua dedicação e paciência comigo.
Aos professores que me acolheram como aluna, e me ensinaram a base para que
esse trabalho acontecesse, Arício, Urara, Eliana, Luiz Augusto, Marlene, Silmara,
Danilo, e convidados de outros departamentos e de outras instituições.
À pesquisadora Dra. Sílvia Basso, da FUNTAC, Rio Branco, AC, pelas análises
fisicoquímica e cromatográfica dos óleos de copaíba e de andiroba.
À profa. Dra. Eneida de Paula, pelo auxílio para formulação das nanoemulsões.
Às amigas e alunas de doutorado do departamento de Biomembranas, Vivane
Guilherme e Lígia Nunes pelo apoio durante o desenvolvimento e caracterização das
nanoemulsões.
Ao prof. Dr. Nelson Duran, pelo uso de equipamentos de seu laboratório para
formulação e caracterização das nanoemulsões.
Ao prof. Dr. Guilherme Diniz Tavares, da UFMG, que me auxiliou na formulação das
nanoemulsões.
Ao pesquisador Dr. Allan Radaic, que me auxiliou a realizar as fotomicrografias das
nanoemulsões.
Às técnicas do laboratório de Microscopia Eletrônica, Ana Floriana Rodrigues e
Stella Maris Fick de Ferraz que me auxiliaram nos procedimentos realizados em
microscopia eletrônica.
Ao prof. Dr. Paulo Joazeiro que me forneceu o material usado para preparo dos
promastigotas para realização da microscopia eletrônica de varredura.
Ao prof. João Eduardo Pires, coordenador da faculdade de Medicina Veterinária da
ULBRA, Palmas TO, por ceder o laboratório da faculdade para leitura de lâminas.
Aos professores Danilo, Regina Maura e Guilherme que aceitaram fazer parte de
minha pré banca, mostrando pontos a serem melhorados.
A essa banca examinadora e suplentes.
Aos animais que foram utilizados nesse trabalho, meu respeito e gratidão.
RESUMO
A leishmaniose cutânea, causada pela espécie Leishmania amazonensis,
é caracterizada mais comumente pela presença de lesões cutâneas locais, podendo
evoluir para forma mucocutânea, mucosa ou disseminada. A leishmaniose causada
pela espécie L. infantum caracteriza-se por lesões viscerais e pode ser fatal. Os
cães são reservatórios domésticos e canídeos e marsupiais são os reservatórios
silvestres da L. infantum. Tanto a leishmaniose cutânea como a visceral têm a
quimioterapia como forma de controle, mas a toxicidade e as recidivas são
constantemente reportadas, e ainda não foram desenvolvidas vacinas efetivas.
Diante desse quadro, as pesquisas são intensas na busca por compostos sintéticos
ou produtos naturais para tratamento dessa parasitose. Nesse trabalho de mestrado
avaliamos o óleo extraído do tronco da árvore do gênero Copaifera, popularmente
conhecido como óleo de copaíba, e o óleo de andiroba originado da castanha da
árvore Carapa guianensis, ambos, provenientes do Acre, nos modelos in vitro e in
vivo das leishmanioses cutânea e visceral. Nanoemulsões dos óleos de copaíba e
de andiroba foram desenvolvidas e caracterizadas através da mensuração do
tamanho das partículas, polidispersão, a tensão do potencial zeta e microscopia
eletrônica de transmissão para obtenção das imagens. Os protocolos de tratamento
com oxigenação hiperbárica, terapia baseada em contato com ambiente 100%
oxigenado e pressão de 3 ATM, e com as nanoemulsões foram testados em
camundogos BALB/c infectados por L. amazonensis ou L. infantum. O uso de
nanoemulsões viabilizou a administração oral e a utilização dos óleos em
experimentos in vitro. A nanoemulsão de andiroba reduziu a proliferação dos
parasitos em 50% usando-se 5,9µL/mL de nanoandi3 para L. amazonensis e
3,63µL/mL de nanoandi3 para L. infantum. Nanocopa reduziu a proliferação dos
parasitos em 50% em dosagens de 0,3 µL e 0,18 µL/mL para L.amazonensis e
L.infantum, respectivamente, após 48hs. Os resultados indicaram que nanoemulsões
de ambos os óleos, têm efeito tóxico em promastigotas e amastigotas intracelulares
de L. amazonensis e L. infantum. As fotomicrografias eletrônicas de varredura de
promastigotas de L. amazonensis e de L. infantum tratados com as nanoemulsões
de copaíba ou andiroba mostraram presença de células de tamanho reduzido e com
deformidades celulares. Os camundongos infectados com L. amazonensis ou L.
infantum, e tratados por via oral com as nanoemulsões dos óleos de copaíba e de
andiroba, tiveram redução significativa da carga parasitária nas lesões e órgãos
avaliados. A terapia com a câmara hiperbárica nos animais infectados com L.
amazonensis e L. infantum reduziu a carga parasitária nas lesões e órgãos
avaliados, quando em conjunto com a administração oral de nanoemulsões de
copaíba. A análise histológica de vários órgãos coletados de camundongos tratados
com as nanoemulsões de andiroba e copaíba indicou que essas não foram tóxicas
para os animais nas dosagem utilizadas. Os resultados abrem perspectivas para
mais pesquisas com essas nanoemulsões para o tratamento de LC e LV.
ABSTRACT
Cutaneous leishmaniasis, caused by Leishmania amazonensis species is
most commonly characterized by the presence of local skin lesions, it may progress
to mucocutaneous, mucous or disseminated leishmaniasis. Leishmaniasis caused by
L. infantum species characterized by visceral lesions and can be fatal. Dogs are
domestic reservoirs and canids and marsupials are the wild reservoirs of L. infantum.
Both cutaneous leishmaniasis and visceral leishmaniasis have chemotherapy as a
method of control, but the toxicity and recurrences are constantly reported, and have
not yet developed effective vaccines. Given this situation, research is intense in the
search for synthetic compounds or natural products for treatment of this disease. In
this master's work we evaluated the oil extracted from the trunk of Copaifera tree,
popularly known as copaiba oil and andiroba oil originated from the chestnut tree
Carapa guianensis, both from Acre, in models in vitro and in vivo of cutaneous and
visceral leishmaniasis. Nanoemulsions of copaíba oil or andiroba oil were developed
and characterized by measuring the particle size, polydispersity, the tension of the
zeta potential and transmission electron microscopy to obtain the images. Treatment
protocols with hyperbaric oxygen therapy based contact 100% oxygenated
environment and 3 atm pressure, and the nanoemulsions were tested in BALB / c
mice infected with L. amazonensis and L. infantum. The use of nanoemulsions made
possible the oral administration and the use of oils in vitro experiments. The
nanoemulsion of andiroba nanoandi3 reduced the proliferation of parasites on 50%
L. amazonensis and L. infantum. Nanocopa
reduced the proliferation of parasites on 50% at dosages of 0.3 uL and 0.18 uL / mL
for L.infantum and L.amazonensis, respectively, after 48 hours. The results indicated
that nanoemulsions of both oils have a toxic effect on intracellular amastigotes and
promastigotes of L. amazonensis and L. infantum. Electronic photomicrographs
promastigotes scanning of L. amazonensis and L. infantum treated with
nanoemulsions of copaíba or andiroba showed the presence of small sized cells and
cell deformities. The mice infected with L. amazonensis or L. infantum and treated
orally with the nanoemulsion of copaiba oil or nanoemulsion of andiroba oil, had a
significant reduction in parasite load in the lesions and evaluated organs. Hyperbaric
oxygen therapy in animals infected with L. amazonensis and L. infantum reduced the
parasite load in the lesions and evaluated organs when in conjunction with oral
administration of nanoemulsions of copaiba. Histological analysis of various organs
collected from mice treated with the nanoemulsion of andiroba oil or nanoemulsion of
copaíba oil indicated that these were not toxic for the animals used in the dosage
form. The results open perspectives for further research with these nanoemulsions
for the treatment of LC and LV.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO..........................................................................................................
1.1 Histórico.................................................................................................................
1.2 O parasito...............................................................................................................
1.3 Vetores....................................................................................................................
1.4 Distribuição mundial das leishmanioses.................................................................
1.5 As Leishmanioses...................................................................................................
1.5.1 Leishmaniose tegumentar....................................................................................
1.5.2 Leishmaniose visceral..........................................................................................
1.5.3 Leishmaniose visceral canina..............................................................................
1.6 Prevenção e controle das leishmanioses...............................................................
1.7 Diagnóstico das leishmanioses...............................................................................
1.8 Tratamento das leishmanioses em humanos.........................................................
1.9 Medicamentos usados na leishmaniose visceral canina (LVC) .............................
1.10 Produtos naturais ................................................................................................
1.10.1 Óleo de Copaifera..............................................................................................
1.10.2 Óleo de Carapa guianensis...............................................................................
1.11 Tratamentos com a Câmara Hiperbárica (HBO) ..................................................
1.12 Leishmaniose experimental .................................................................................
1.13 Emulsões e nanoemulsões...................................................................................
1.13.1 Caracterização de sistemas nanoestruturados..................................................
2. OBJETIVOS...........................................................................................................
2.1 Objetivo geral.........................................................................................................
2.2 Objetivos específicos..............................................................................................
3. MATERIAIS E MÉTODOS........................................................................................
3.1 Parasitos.................................................................................................................
3.2 Animais...................................................................................................................
3.3 Fármacos................................................................................................................
3.4 Infecção dos animais com promastigotas de L.amazonensis e monitoramento....
3.5 Infecção dos animais com promastigotas de L.infantum e monitoramento .........
3.6 Óleos de Copaifera (copaíba) e C. guianensis (andiroba).....................................
3.7 Protocolos de emulsões ......................................................................................
3.8 Protocolos de nanoemulsões...............................................................................
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3.9 Caracterização das nanoemulsões por DLS........................................................
3.10 Caracterização das nanoemulsões por NTA.....................................................
3.11 Microscopia eletrônica de transmissão (MET) das nanoemulsões..................
3.12 Microscopia eletrônica de varredura de promastigotas ....................................
3.13 Ensaios de toxicidade em promastigotas...........................................................
3.14 Ensaios de toxicidade em macrófagos...............................................................
3.15 Ensaios de toxicidade em amastigotas intracelulares .......................................
3.16 Tratamentos dos camundongos com nanoemulsões.........................................
3,17 Tratamentos dos camundongos com a câmara hiperbárica..............................
3.18 Histologia............................................................................................................
3.19 Análise dos resultados.......................................................................................
4- RESULTADOS.......................................................................................................
4.1 Análise fisicoquímica dos óleos de Copaifera (copaíba) e C. guianensis
(andiroba) .....................................................................................................................
4.2 Análise cromatográfica dos óleos.........................................................................
4.2.1 Cromatograma do óleo de copaíba...................................................................
4.2.2 Cromatograma do óleo de andiroba..................................................................
4.3 Emulsões e nanoemulsões..................................................................................
4.3.1 Emulsões de óleo de copaíba e de andiroba....................................................
4.3.2 Nanoemulsões de óleo de copaíba e de andiroba ...........................................
4.4 Caracterização das nanoemulsões .....................................................................
4.4.1 DLS....................................................................................................................
4.4.2 NTA...................................................................................................................
4.4.3 MET das nanoemulsões....................................................................................
4.5 Toxicidade das emulsões em promastigotas.......................................................
4,6 Toxicidade das nanoemulsões em promastigotas...............................................
4.7 MEV dos promastigotas.......................................................................................
4.8 Toxicidade das nanoemulsões em macrófagos...................................................
4.9 Toxicidade das nanoemulsões em amastigotas intracelulares............................
4.10 Testes in vivo ....................................................................................................
4.11 Histologia dos órgãos e lesões...........................................................................
4.11.1 Análise histológica de camundongos infectados com L.amazonensis ............
4.11.2 Análise histológica de camundongos infectados com L.infantum....................
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5- DISCUSSÃO.............................................................................................................
6- CONCLUSÕES.........................................................................................................
7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.........................................................................
8- ANEXOS...................................................................................................................
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1 INTRODUÇÃO
1.1 Histórico
A primeira observação do parasito Leishmania foi feita por Cunnignham
em 1885. O parasito foi identificado no início do século XX, quando William
Leishman encontrou o protozoário no baço de um soldado indiano e Donovan, em
1903, foi o responsável pela primeira publicação. Em 1903, Ross criou o gênero
Leishmania e denominou Leishmania donovani o agente causador do calazar (do
indostão, Kala-azar, onde kala significa negro, e azar, doença). Em 1904, Leonard
Rogers conseguiu cultivá-lo e Patton observou diferentes formas morfológicas em
1907 (CABRERA, 1999). No Brasil, o primeiro a relatar a doença e a suspeitar do
papel dos flebotomíneos como vetores foi Cerqueira em 1885, na Bahia (GONTIJO
et al., 2003). A espécie foi descrita em 1908 por Charles Nicole como Leishmania
infantum (NICOLE, 1908). Em 1937, Chagas e Cunha descreveram a
espécie Leishmania chagasi como causadora da leishmaniose visceral na América
(CUNHA e CHAGAS, 1937). Pesquisas moleculares comprovaram que se tratavam
da mesma espécie, sendo então a L.chagasi considerada como sinônimo de L.
infantum tendo prioridade a nomenclatura mais antiga (MAURICIO et al., 2000).
1.2 O parasito
Os protozoários digenéticos da família Trypanosomatidae, ordem
Kinetoplastida, do gênero Leishmania são os parasitos responsáveis pelas
leishmanioses. Os organismos da ordem Kinetoplastida apresentam uma
mitocôndria única (denominada cinetoplasto) rica em DNA mitocondrial, o kDNA.
Apresentam uma forma flagelada e extracelular, o promastigota, e uma forma imóvel
e intracelular, o amastigota (Figura 1) (LAINSON, 2010).
A B
Figura 1. Fotomicrografia eletrônica de promastigota (A) e óptica das formas
intracelulares no interior de macrófagos murinos (B) (amastigotas indicados na seta)
(B) (fotos da autora).
O ciclo infectivo no hospedeiro vertebrado se inicia quando as formas
promastigotas metacíclicas são inoculadas pela fêmea do inseto vetor, durante o
repasto sanguíneo, no hospedeiro vertebrado. Essas formas são fagocitadas pelos
macrófagos teciduais e pelos neutrófilos (PETERS et al., 2009). Nos macrófagos,
promastigotas se transformam em amastigotas, e esses, não suportando a carga
parasitária, rompem-se e as formas amastigotas livres, assim como neutrófilos
infectados, são fagocitados por outros macrófagos (PETERS et al., 2009). As
fêmeas dos flebotomíneos, ao exercerem a hematofagia, ingerem, junto com o
sangue, os parasitos sob a forma amastigota, esses ainda no interior das células
infectadas. No interior do inseto ocorre a transformação para a forma promastigota
procíclica e posteriormente para a forma promastigota metacíclica, que se
encaminha para a probóscide do inseto (CABRERA, 1999) Figura 2.
Figura 2. Esquema demostrando o ciclo de vida da Leishmania (MONTEIRO, 2013).
1.3 Vetores
No Novo Mundo o inseto vetor é um flebotomíneo do gênero Lutzomyia e
no Velho Mundo do gênero Phlebotomus (OMS, 2014).
Os flebotomíneos são insetos dípteros, psicodídeos, de pequeno porte,
corpo piloso, delgado e diferem-se dos demais dípteros por, principalmente,
desenvolverem todo seu estádio larvar em matéria orgânica contida no solo e não
em água. Quando adultos, apresentam dimorfismo sexual, alimentam-se de seiva
para manter a homeostase, mas as fêmeas precisam de uma dieta sanguínea para
maturação ovariana, e assim prosseguir com a oviposição e manutenção do ciclo
vital (FORATTINI, 1960).
Os vetores Lutzomyia, antes encontrados apenas em ambientes
silvestres, tiveram, mais recentemente, a adaptação aos ambientes urbanos, em
periferias de grandes centros, principalmente na Região Sudeste (Brasil), podendo
ser encontrados no peridomicílio, em galinheiros, chiqueiro, canil, paiol, entre outros
ambientes e também no intradomicílio (SILVA et al., 2007). Em áreas tropicais, a
densidade populacional de flebotomíneos aumenta durante ou após períodos
chuvosos, pois a alta umidade resultante das primeiras chuvas proporciona a
eclosão das pupas (SHIMABUKURO e GALATI, 2011).
1.4 Distribuição mundial das leishmanioses
Estima-se em torno de 2 milhões de novos casos anuais de leishmanioses
por todo mundo, sendo que, entre 20 a 30 mil deles chegam a óbito. A leishmaniose
tegumentar (LT) é a forma mais comum da doença, e a leishmaniose visceral (LV) é
fatal se não tratada (OMS, 2015). Estima-se que 14 milhões de pessoas estejam
infectadas com o parasito Leishmania (DESJEUX, 2004) e que ocorram entre 0,7 a
1,3 milhões de novos casos de LT, anuais, principalmente no Afeganistão, Argélia,
Brasil, Colômbia, Irã e Síria (OMS, 2014) (Figura 3).
No Brasil, na década de 50, houve uma diminuição da LT, mas o número
de casos vem crescendo progressivamente nos últimos 20 anos nas regiões
Nordeste, Norte, Centro-Oeste, Sudeste e Sul (estado do Paraná). Os surtos são
associados à derrubada de matas para construção de estradas e criação de
povoados. Também ocorrem casos de leishmanioses em outras regiões do país em
áreas de colonização antiga, não associadas à derrubada de matas. Os cães,
eqüinos e roedores têm papel importante como reservatórios do parasito
(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2010).
Figura 3. Mapa de distribuição mundial de leishmaniose tegumentar (OMS, 2014).
Estima-se que 200 mil a 400 mil novos casos anuais de LV ocorram em
todo o mundo, sendo que mais de 90% dos novos casos ocorrem em 6 países:
Bangladesh, Brasil, Etiópia, Índia, Nepal e Sudão (OMS, 2015) (Figura 4). A LV é
endêmica em 88 países, com um total de 350 milhões de pessoas com o risco de
adquirir a doença (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014). Nas Américas, a LV abrange
desde o sul da Argentina até o sul do Canadá (DANTAS-TORRES, 2006). Na região
andina, entre os anos de 1996 e 1998, foram registrados mais de 14 mil casos de
leishmanioses em média, com 6.155 ocorridos na Colômbia, 2.668 no Peru, 2.240
na Bolívia, 1.936 na Venezuela e 1.084 no Equador (DAVIES et al., 2000).
Dentro das Américas, o Brasil é o país com o maior índice de ocorrência
da enfermidade (DANTAS-TORRES, 2006). A LV está sendo levada para os
grandes centros urbanos por meio da migração populacional em busca de melhores
condições socioeconômicas (DANTAS-TORRES, 2006).
Segundo o Ministério da Saúde do Brasil, de 1990 a 2014, das
notificações de LV em humanos, 61,21% ocorreram na região Nordeste
(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014).
Figura 4. Mapa de distribuição mundial da leishmaniose visceral (OMS, 2015).
A Leishmaniose Visceral Canina (LVC) é hoje uma das mais importantes
doenças de cães importados da Europa Central. As estimativas de soroprevalência
da leishmaniose canina relatada para a região da Espanha, por exemplo, é de 3,7%
para a província de Orense, no canto noroeste do país, e 34,6% para a província de
Málaga, na costa sul (MIRÓ et al., 2013).
No Brasil a LVC foi notificada em 19 das 27 unidades da federação, com
aproximadamente 1.600 municípios apresentando transmissão autóctone. Na
América Latina, a LVC já foi descrita em 12 países, sendo que 90% dos casos
ocorrem no Brasil. No país, há expansão e urbanização da leishmaniose visceral
com grande número de cães positivos em várias cidades de grande e médio porte
(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2011).
Em inquéritos censitários em quatro localidades do Distrito Federal foi
observada diferença de prevalência em relação a diversas localidades, assim como
em relação à idade e à presença ou ausência de sinais clínicos, nesse trabalho nota-
se que a LVC apresenta como maiores fatores de risco, a localidade, a idade e a
presença de alterações clínicas, sendo assim, o conhecimento obtido sobre a
prevalência da leishmaniose em cães foi um dos parâmetros usados para
estabelecer estratégias para ações de controle da doença (NASCIMENTO, 2011).
1.5 As Leishmanioses
1.5.1 Leishmaniose Tegumentar
Leishmaniose tegumentar (LT) é um conjunto de enfermidades causadas
por várias espécies de Leishmania, que acometem a pele e/ou mucosas do ser
humano, e de diferentes espécies de animais silvestres e domésticos das regiões
tropicais e subtropicais do Velho e Novo Mundo (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2010).
A LT é classificada de acordo com sua distribuição geográfica em
leishmaniose tegumentar do Velho Mundo e leishmaniose tegumentar do Novo
Mundo (leishmaniose tegumentar americana - LTA). As espécies de Leishmania
envolvidas na sua ocorrência são diferentes, assim como as espécies de
hospedeiros que as abrigam e as de insetos vetores que as transmitem. A LT é a
forma mais comum de leishmaniose e provoca lesões de pele, úlceras,
principalmente sobre as partes expostas do corpo, deixando cicatrizes ao longo da
vida e deficiência grave (OMS, 2014).
No Brasil, a LTA é uma afecção dermatológica que merece atenção,
principalmente pelo risco de ocorrência de deformidades que pode produzir no ser
humano, com envolvimento psicológico, com reflexos no campo social e econômico,
uma vez que, pode ser considerada uma doença ocupacional. A doença manifesta-
se de diferentes formas clínicas, mas normalmente inicia-se na pele e, dependendo
da resposta imune do hospedeiro e da espécie infectante, ela pode ficar limitada ao
local da inoculação do parasito, ou atingir novos locais na pele e nas mucosas do
nariz, orofaringe e laringe (MOURA, 2013).
A LTA pode se apresentar de forma cutânea, mucocutânea ou
disseminada. A leishmaniose cutânea é a forma mais comum no Brasil e é
caracterizada pela formação de uma ou mais lesões ulceradas, de bordas elevadas,
de cor avermelhada, que podem ser recobertas por secreção serosa ou
seropurulenta (graças à contaminação secundária por bactérias e leveduras), é
comumente limitada a uma ou mais úlceras de pele frequentemente encontradas em
membros, pavilhões auriculares e rosto. No local da inoculação, forma-se uma
mácula, pápula ou nódulo que pode estar coberta por crosta, após a remoção da
crosta expõe o aspecto ulcerado típico. Os pacientes raramente se queixam de dor
(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2010). A L. amazonensis produz lesões cutâneas únicas
ou em mais números. Não produz lesões mucosas, mas pode causar a leishmaniose
cutânea difusa ou a forma disseminada da doença em indivíduos imunossuprimidos
(FERREIRA, 2014).
A leishmaniose cutânea difusa (LCD) tem a L. amazonensis como a única
espécie considerada responsável pela forma clínica no Brasil. A LCD se complica
quando os pacientes não apresentam uma resposta satisfatória ao tratamento com
antimoniais (LAINSON, 2010)
A leishmaniose mucocutânea é a complicação mais severa da LTA,
afetando principalmente as mucosas da boca, nariz e faringe, sendo secundária a
lesão cutânea. Acredita-se que a lesão mucosa ocorra por disseminação
hematogênica ou linfática. Geralmente surge após a cura clínica da leishmaniose
cutânea de evolução crônica e curada sem tratamento ou com tratamento
inadequado (OMS, 2015).
A leishmaniose disseminada é uma forma emergente da leishmaniose.
Tem sido descrita no Brasil, nas regiões Norte e Nordeste, e seu principal agente
etiológico é a espécie L. braziliensis (SILVEIRA et al., 2005). Caracteriza-se pela
presença de múltiplas lesões de pele, ulceradas ou não, encontradas
simultaneamente em duas ou mais áreas do corpo do paciente. As lesões se
distribuem, principalmente, na face e nos membros superiores. A doença ocorre em
indivíduos sem distúrbio imunológico aparente; no entanto, a resposta imunitária
específica parece estar retardada, pois cerca de 30% dos doentes apresenta teste
Montenegro negativo, as lesões mucosas podem surgir junto com as lesões
cutâneas meses ou vários anos depois de as lesões cutâneas já terem cicatrizado
(CALVOPINA, 2004). É importante diferenciar a leishmaniose disseminada da forma
cutânea difusa, caracterizada pela presença de várias lesões nodulares não
ulceradas e por uma resposta imune celular muito pobre, geralmente associada a
uma imunodepressão do hospedeiro ( MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2010).
No Brasil a L. braziliensis e a L. amazonensis são as espécies mais
amplamente distribuídas (GRIMALDI JR., 1987).
1.5.2 Leishmaniose Visceral
A leishmaniose visceral é causada, nas Américas, pela espécie L.
infantum e tem como característica, em humanos, lesões viscerais, causando
principalmente esplenomegalia, hepatomegalia e afecções em medula óssea
levando a distúrbios hematopoiéticos, chegando a ser fatal, principalmente em
crianças e imunodeprimidos, se não tratados. É caracterizada por acessos
irregulares de febre, perda de peso, aumento de volume do baço e fígado e anemia
(MINISTERIO DA SAUDE, 2003). Suas características clínicas, histopatológicas e
imunológicas dependem da virulência do protozoário infectante e da suscetibilidade
do hospedeiro (QUEIROZ et al., 2004)). Caso não seja feito diagnóstico e tratamento
adequado a doença evolui para desnutrição, pele seca e cabelos opacos e
quebradiços, edema de membros, ascite, icterícia, hemorragias (MINISTÉRIO DA
SAÚDE, 2003). Na leishmaniose visceral, células fagocíticas se multiplicam e
abrigam grandes quantidades de amastigotas, resultando em aumento de volume e
disfunção dos órgãos. Ela é geralmente observada como uma doença debilitante e
crônica, com linfoadenopatia e anemia. Há infiltrado de formas amastigotas em
diferentes órgãos como fígado, baço, linfonodo, medula óssea, tendo sido
encontradas inclusive no cérebro de hospedeiros (OLIVEIRA et al, 2012).
O desenvolvimento da leishmaniose está diretamente relacionado a
competência imunológica do hospedeiro. Os linfócitos T desempenham papel
importante na resistência ou persistência da Leishmania no hospedeiro e na
progressão da infecção ou na cura clínica, pois essas células são capazes de mediar
resposta celular e humoral, regulam a produção de citocinas e de anticorpos. De
um modo geral, a população de linfócitos TCD4+ subdivide-se em duas populações:
Th1, que secreta IL-2, IFN- e TNF-
mediada por células, contribuindo para resolução da infecção, e Th2, que secreta
IL4, IL5 e IL10, relacionada à resposta mediada por anticorpos, não protetora no
caso da leishmaniose, fazendo com que haja progressão da infecção (CORRÊA,
2011).
1.5.3 Leishmaniose Visceral Canina
A L. infantum tem, no Brasil, como reservatórios na área urbana, o cão e
na região silvestre principalmente as raposas (Dusicyon vetulus e Cerdocyon thous)
e os marsupiais (Didelphis albiventris) (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2011).
Nos países onde a LV é zoonótica, como é o caso do Brasil, os cães
desempenham papel fundamental na epidemiologia, sendo considerados os
principais reservatórios para a doença humana, principalmente devido à riqueza de
formas amastigotas na pele do animal (ALVAR et al. 2004). A detecção precoce de
cães infectados é fundamental para impedir a expansão da doença e é essencial
para o seu controle (MAIA, 2008).
As lesões em cães podem ser classificadas em três formas: grave,
oligossintomática e assintomática, sendo essa a forma de maior importância para a
saúde pública devido a manter os parasitos ativos no ciclo da infecção humana
(DANTAS-TORRES et al., 2006) . Os sintomas são variados, inespecíficos e incluem
a linfadenopatia generalizada, perda de pêlos ao redor dos olhos, nariz, boca e
orelhas, lesões de pele com ou sem descamações e às vezes úlceras, perda de
apetite ocasionando depressão e emagrecimento, ornicogrifose dificultando a sua
locomoção, febre, distúrbios de coagulação, lesões renais, hepáticas e lesões
oculares (ALMEIDA et al., 2005).
A infecção no cão está associada a um aumento nos níveis de anticorpos
específicos e ausência de resposta mediada por células. As alterações patológicas
na leishmaniose visceral canina são causadas tanto pela ação direta do parasito nos
tecidos, levando à formação de lesões inflamatórias não supurativas, quanto pela
deposição de imunocomplexos em vários órgãos e tecidos, principalmente no fígado,
baço e rins. Apesar da grande diversidade de manifestações clínicas, existem
animais aparentemente saudáveis e aqueles que exibem sinais característicos de
estágios finais da doença. Um fato importante é que a doença canina pode
permanecer clinicamente inaparente por longos períodos (SILVA, 2009).
Inicialmente os parasitos estão presentes no local da picada infectiva, na
pele, posteriormente ocorre a infecção das vísceras e novamente a distribuição na
pele (MINISTERIO DA SAUDE, 2003). Em um trabalho visando estudar as
alterações fibróticas causadas pela LVC foi observado através de análise histológica,
deposição de fibras colágenas preferencialmente em fígado, pulmões, rins, em
linfonodos cervicais e baço, caracterizando um quadro de fibrose sistêmica
associada ao parasitismo tecidual e a processos degenerativos e inflamatórios
(SILVA, 2010).
1.6 Prevenção e controle das leishmanioses
Como medidas preventivas para o homem e a população canina, o
Ministério da Saúde no Brasil recomenda o uso de medidas de proteção pessoal
com uso de repelentes, saneamento ambiental, controle da população canina
errante, uso de telas em canis individuais e coletivos, uso de coleiras impregnadas
com deltametrina a 4% em cães (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2011).
Devido às características epidemiológicas, as estratégias de controle da
leishmaniose ainda são pouco efetivas e estão centradas no diagnóstico e
tratamento precoce dos casos em humanos, redução da população de
flebotomíneos, eliminação dos reservatórios e atividades de educação em saúde.
Para controle do vetor o governo local pode recorrer ao controle químico, com
borrifação de cipermetrina e deltametrina, sabendo, porém, que é dirigido apenas
para o inseto adulto e tem como objetivo reduzir o contato entre o inseto transmissor
e a população. A eutanásia de cães é recomendada a todos os animais
sororeagentes e ou parasitológico positivo. As orientações de educação sanitária
visam esclarecer a população sobre as ocorrências de casos no local, sinais clínicos,
medidas de diagnóstico e tratamento e também capacitar equipe de profissionais da
saúde (MINISTERIO DA SAUDE, 2014).
Não há vacinas para leishmanioses em humanos, mas atualmente,
existem duas vacinas contra a leishmaniose visceral canina, registradas no
Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento e comercializadas no Brasil: a
vacina Leish-tec® da marca Hertape Calier Saúde Animal S.A. e a vacina
Leishmune® da marca Zoetis Indústria de Produtos Veterinários Ltda. ( BORJA-
CABRERAA, 2008) que teve a licença suspensa temporariamente em 2014. O
Ministério da Saúde preconiza a eutanásia de animais soro-reagentes, mesmo
vacinados, que porventura sejam encontrados nas áreas de transmissão, em que os
inquéritos caninos estejam em andamento (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014).
1.7 Diagnóstico das leishmanioses
O diagnóstico das leishmanioses é feito por exame clínico e laboratorial
dos pacientes, tais como exame parasitológico direto, teste intradérmico, exames
sorológicos (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA e Reação de Imuno
Fluorescência Indireta, RIFI), imuno-histoquímica, reação em cadeia da polimerase
(PCR), acompanhado por hemograma e bioquímica sérica para acompanhamento
de reações inespecíficas (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006).
Em cães, são empregados o exame parasitológico direto e as técnicas
sorológicas. Os testes de RIFI e ELISA são os ensaios sorológicos recomendados
pelo Ministério da Saúde para estudos de soroprevalência em inquéritos caninos
amostrais e censitários. Para áreas não endêmicas, o Ministério da Saúde indica o
exame parasitológico direto como método confirmatório para cães com sorologia
positiva em virtude de sua elevada especificidade (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006).
O diagnóstico da leishmaniose visceral canina ainda enfrenta sérios desafios. O
diagnóstico clínico da LVC é precário e complexo, pois os sinais clínicos da doença
são variáveis e inespecíficos, comuns a outras enfermidades que acometem o cão, a
imunossupressão causada pela Leishmania pode gerar infecções oportunistas,
dificultando do mesmo modo o diagnóstico dessa parasitose, por esse motivo foi
mostrada a vantagem do uso da PCR como método diagnóstico na leishmaniose
visceral canina, porém a PCR ainda não é comumente utilizada como medida
diagnóstica pelo Ministério da Saúde (COSTA et al., 2015).
1.8 Tratamento das leishmanioses em humanos
O tratamento da leishmaniose foi introduzido pelo médico brasileiro
Gaspar Vianna, em 1912, com o uso do tártaro emético, antimonial trivalente;
atualmente o antimonial pentavalente é o fármaco de primeira escolha para o
tratamento das leishmanioses no Brasil (LIMA et al., 2007). O Glucantime®
(antimoniato de N-metil glucamina) possui algumas desvantagens como alto custo,
difícil administração e alta toxicidade, podendo desencadear vários efeitos colaterais
como artralgia, mialgia, cefaléias, distúrbios gastrointestinais, alterações
eletrocardiográficas, renais, hepáticas, erupção cutânea, entre outros. Além dos
efeitos adversos, tem se observado com frequência um aumento na incidência de
insucesso, recidiva e resistência ao tratamento (AMATO, 2006). Os antimoniais
pentavalentes parecem atuar no mecanismo bioenergético das formas amastigotas
da Leishmania, por meio de glicólise e beta-oxidação, que ocorrem nas organelas
denominadas glicossomas. Outro mecanismo proposto é o de ligação do composto
com sítios sulfidrílicos, levando a morte destes protozoários (BERMAN, 1997). A
estrutura molecular dos antimoniais, seu metabolismo e mecanismo de ação ainda
estão sendo investigados. Há estudos do desenvolvimento de formulações à base
de lipossomas e formulações à base de ciclodextrina para promover a distribuição
oral de antimónio (FRÉZARD et al., 2009).
Outros medicamentos como a anfotericina B, paromomicina, isotionato de
pentamidina e a miltefosina, têm sido utilizados sozinhos ou combinados, como
opções de tratamento das diversas formas de leishmanioses em humanos (OMS,
2014).
A anfotericina B é uma opção no tratamento de leishmaniose em gestantes
e em pacientes que manifestem toxicidade ou refratariedade relacionada ao uso dos
antimoniais pentavalentes. É a droga leishmanicida mais potente disponível
comercialmente, com ação nas formas promastigotas e amastigotas. Atualmente,
duas apresentações de anfotericina B são disponibilizadas pelo Ministério da Saúde:
o desoxicolato de anfotericina B e a anfotericina B lipossomal, com eficácias
comparáveis, sendo que esta última apresentou menor toxicidade (MINISTERIO DA
SAUDE, 2010). O mecanismo de ação da anfotericina B está baseado na ligação do
fármaco ao ergosterol da membrana celular da Leishmania. A ligação ao ergosterol
provoca uma desorganização estrutural na membrana, formando poros que alteram
sua permeabilidade ao potássio intracelular, acarretando em morte do parasito por
lise osmótica. Nos mamíferos, a anfotericina B se liga ao colesterol da membrana
celular, o que parece estar relacionado aos efeitos adversos do fármaco (BANETH,
2002).
A paramomicina ou aminosidina é um antibiótico aminoglicosídeo, possui
um amplo espectro de ação incluindo atividade contra protozoários, bactérias
(SUNDAR et al., 2007) e cestódios (WITTNER M et al., 1971). A aplicação de uma
formulação tópica de baixa toxicidade surge como uma possibilidade para auxiliar
contra a leishmaniose cutânea. No entanto, apesar desta opção ter sido avaliada há
muitos anos, seu uso clínico ainda não foi consagrado, devido aos resultados
variáveis (CARNEIRO, 2007).
O isotionato de pentamidina é um derivado sintético da amidina e é efetivo
contra aguns protozoários patogênicos. O seu mecanismo de ação se dá por
inibição de diferentes processos celulares ainda não elucidados inteiramente. Em
estudo realizado em 2011 para avaliar a eficácia e segurança dos esquemas de
tratamento na leishmaniose tegumentar ocasionada por L. guyanensis, foi visto que
a pentamidina possui eficácia similar ao antimonial pentavalente tendo como
principais efeitos colaterais dor ou enduração (OURIVES-NEVES et al., 2011).
A miltefosina é uma alquilfosfocolina, originalmente desenvolvida para o
tratamento de metástases cutâneas em carcinomas mamários; posteriormente, foi
testada no tratamento da LV através de uma iniciativa da Organização Mundial da
Saúde (OMS, 2010). Foi o primeiro fármaco de uso oral utilizado no tratamento da
LV. Os mecanismos de ação ainda não estão bem esclarecidos, mas sabe-se, que é
capaz de bloquear a síntese e alterar a composição da membrana plamática do
parasito (AMATO, 2006). Apresenta efeitos adversos ligados ao trato gastrointestinal
como vômitos e diarréia além de teratogenicidade e potencial para desenvolver
resistência (SEN & CHATTERJEE, 2011). Em 2008, Campos et al. testaram a ação
leishmanicida e sua eficácia no tratamento oral da leishmaniose cutânea
experimental, mostrando ação similar a do antimonial pentavalente (CAMPOS et al.,
2008).
Outros fármacos têm sido utilizados no tratamento das leishmanioses,
incluindo antifúngicos como os imidazóis, purinas (alopurinol) (CROFT, 2006), o
imiquimod (agente imunomodulador), sitamaquine, o medicamento anticancerígeno
tamoxifeno entre outros (MIGUEL, 2008) . Mas as avaliações do sucesso terapêutico
indicam respostas variadas conforme o local de incidência e espécies de Leishmania
envolvidas, sendo assim, se torna emergente o uso de terapias combinadas na
busca de novas alternativas de tratamento contra leishmaniose (MIGUEL, 2010).
1.9 Medicamentos usados na leishmaniose visceral canina (LVC)
Os principais fármacos utilizados no tratamento da LVC nos locais onde é
permitido o tratamento de cães são os antimoniais, o desoxicolato de anfotericina B
convencional ou encapsulada em lipossomas, aminosidina, alopurinol, pentamidina
e, recentemente, miltefosina, porém os cães mostram efeito variável às terapias
(SILVA, 2009).
Cães tratados com antimoniato apenas, ou em combinação com
alopurinol, tiveram em um estudo recente, melhora no quadro clínico e redução dos
parasitos da pele, diminuindo a infectividade aos flebotomíneos e, como
consequência, a transmissão do parasito (MIRÓ et al,2005). Verificou-se que em
cães infectados naturalmente e tratados exclusivamente com alopurinol, apesar da
melhora clínica, apresentaram recidiva da doença, mas nenhuma evidência de
disseminação do parasito na pele. Esta descoberta tem importantes implicações
epidemiológicas, pois indica que o alopurinol apesar de não ser um tratamento
eficaz, pode ser usado como tratamento de manutenção por tempo prolongado (6-12
meses), evitando a disseminação da leishmaniose a flebotomíneos (MIRÓ et al.,
2011).
No Brasil, o Ministério da Saúde ainda não reconhece essas e outras
formas de tratamento propostas até o momento como seguras, já que ainda é
preciso se certificar de que esses animais tratados não se tornem portadores sãos,
causando a disseminação da leishmaniose em humanos, após a supensão do
tratamento. É necessária a pesquisa de novas fontes de tratamento seguro aos cães
para que possam ser aprovadas para uso clínico. O uso de farmácos para
tratamento da leishmaniose humana, segundo recomendações do Ministério da
Saúde, está proibido para cães no Brasil. O objetivo é também evitar resistência do
parasito (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014).
1.10 Produtos Naturais
Muitas das substâncias produzidas pelo metabolismo secundário das
plantas possuem propriedades biológicas importantes diretamente envolvidas nos
mecanismos de adaptação da planta ao seu meio, tais como defesa contra
herbívoros e microrganismos, proteção contra raios UV, atração de polinizadores ou
animais dispersores de sementes (FUMAGALI et al., 2008). Muitas vezes, os
mesmos metabólitos secundários, tais como alcalóides, terpenóides e flavonóides
que podem destruir agentes invasores nas plantas podem oferecer alternativas de
tratamento contra doenças em animais e humanos, tais como a leishmaniose. Os
estudos químicos e imunofarmacológicos têm sido realizados com o intuito de
encontrar novos compostos menos tóxicos, economicamente mais viáveis, de efeito
específico e que reverta a resistência do parasito às drogas (BEZERRA, 2006).
Aproximadamente 25% dos medicamentos prescritos nas farmácias
americanas possuem extratos vegetais em sua composição, no Brasil esse
segmento corresponde a 7% do mercado terapêutico. Consequentemente, o
consumo mundial de plantas medicinais e seus produtos têm gerado interesses em
estudos científicos que confirmem suas propriedades farmacológicas (SIMÕES,
2001). A associação entre conhecimento popular de plantas com potencial
farmacológico e a busca de compostos bioativos para a produção de novos
fitoterápicos é importante para a descoberta de medicamentos mais efetivos no
tratamento de diversas patologias, além de fornecer subsídios para a implantação de
políticas públicas de conservação da biodiversidade de alguns gêneros botânicos do
país. O interesse internacional nas plantas medicinais do Brasil é grande devido à
vasta biodiversidade e a intensidade do uso popular de plantas (BRANDÃO et al.,
2006).
As espécies vegetais são a melhor e maior fonte de fármacos para a
humanidade (BEZERRA et al., 2006). Plantas usadas tradicionalmente pelas
populações de locais endêmicos no tratamento de doenças parasitárias têm sido
pesquisadas com o objetivo de se avaliar as atividades dos extratos e derivados. O
primeiro critério para se avaliar novas alternativas para o tratamento da leishmaniose
ou outras parasitoses é a obtenção de melhor eficácia com menor efeito colateral,
quando comparadas aos tratamentos usados na clínica (VILA-NOVA, 2008). Com
esse objetivo têm sido pesquisadas plantas e seus derivados, contendo
especialmente em seus princípios ativos, chalconas, flavonóides, saponinas,
quinonas, lignanos, tanino, alcalóides, terpenóides e oxilipinos (CHOUDHURY et al.,
2011). Sucessos obtidos nessas pesquisas têm como exemplo, desde o início do
século XVII, o tratamento da malária com quinina e da amebíase com emetina
obtidas da Cinchona e Cephalis, respectivamente, e mais recentemente a
artemisina, obtida da Artemisia, contra o Schistosoma mansoni (CORREA, 2015) .
As propriedades leishmanicidas de plantas do Cerrado brasileiro foram
avaliadas por Lima et al., realizando-se ,primeiramente, um levantamento
etnobotânico na região e sete espécies vegetais com as indicações terapêuticas
para antibiótico, antiinflamatório, analgésico, antiofídico e cicatrizante foram
encontradas, sendo feitos extratos hidroalcoólicos das plantas e em seguida foram
testadas quanto a sua atividade anti-promastigotas de L. amazonensis. Os vegetais
estudados foram: Terminalia fagifoli (Cachaporra do Gentio), Vellozia squanata
(Canela de Ema), Vochysia haenkeana (Pau Amarelo), Siparuna guianensis (Erva de
Rato), Lafoensia pacari (Dedaleiro), Galactia glauscecens (Favinha do campo) e
Plathymenia reticulata (Candeia). A IC 50 foi calculada em relação às culturas não
tratadas. Verificou-se a presença de flavonóides, triterpenoides, esteróides e taninos
que, são responsáveis pela atividade leishmanicida (LIMA et al., 2015).
Em outro estudo, foi demonstrada a atividade leishmanicida de extratos
de macroalgas sobre o crescimento de promastigotas de L. amazonensis. Dez
extratos diferentes foram testados e todos eles inibiram o crescimento dos parasitos
e apresentaram baixa toxicidade para células de mamíferos, inibindo também o
desenvolvimento das formas amastigotas no interior de macrófagos (ALIANÇA,
2012).
Em nosso laboratório Ayres et al. testaram algumas variedades de
própolis brasileiras na leishmaniose experimental cutânea e no parasito L.
amazonensis e a eficácia da terapia da oxigenação hiperbárica (HBO), aplicada em
combinação ou não com o tratamento com glucantime, durante a infecção
com Leishmania amazonensis. A linhagem murina susceptível, BALB/c, infectada no
dorso com L. amazonensis, tratada com glucantime e exposta a HBO, mostrou
durante o curso da doença, fases em que as lesões eram menores do que a de
camundongos apenas tratados com glucantime; observou-se revascularização da
pele da lesão e baixa produção de interferon-gama em células de linfonodos desses
animais. O tratamento com propaina gerou lesões menos exsudativas em animais
tratados com propaina ou propaina combinada ao tratamento com glucantime. Os
resultados demonstram que tanto HBO como a própolis vermelha em combinação
com glucantime, são promissoras no tratamento da leishmaniose cutânea (AYRES et
al., 2011).
Em trabalho de revisão realizado por Gil et. al. foram relacionadas
algumas plantas, suas famílias, distribuição geográfica, parte utilizada, tipos de
extratos mostrando serem opções terapêuticas tradicionais e atuais, cuja atividade
leishmanicida pode conduzir ao desenvolvimento de novos fármacos. Dos
compostos isolados observou-se um predomínio de alcalóides, triterpenos,
sesquiterpenos, lactonas, quinóides, flavonóides, dentre outros. Através desta
revisão bibliográfica verificou-se a necessidade de medicamentos mais eficazes para
tratamento de leishmaniose além de outras patologias, o que se agrava ainda mais
com os mecanismos de resistência aos fármacos em uso, assim sendo, o uso de
extratos de plantas e de produtos naturais leishmanicidas, além de compostos
purificados de plantas, representa uma excelente estratégia para busca de novas
drogas para tratamento de leishmaniose. A exploração sustentável de nossa
biodiversidade, com base na etnofarmacologia e medicina popular é um campo
ainda vasto e muito promissor (GIL et al., 2009).
1.10.1 Óleo de Copaifera
As árvores de copaíba (Figura 5) são comuns na América Latina e África
Ocidental, sendo encontradas no Brasil, nas regiões Sudeste, Centro-Oeste e
Amazônica. Elas chegam a viver 400 anos e têm como característica sua casca
aromática, folhagem densa, flores pequenas e frutos secos, do tipo vagem com
sementes pretas e ovóides ricas em lipídeos (PIERI et al., 2009)). Do tronco da
árvore é extraído um óleo-resina através de perfuração (Figura 5 B). O óleo tem a
cor que pode variar de amarelo a marrom, dependendo da espécie (Figura 6). O óleo
de copaíba é uma resina líquida rica em sesquiterpenos e diterpenos. Sua fração
volátil é composta por sesquiterpenos, enquanto a fração resinosa é composta por
diterpenos (CASCON & GILBERT, 2000).
A B C D
Figura 5. A) semente de copaíba com broto, B) detalhe circundado em vermelho de
orifício que é usado para a coleta do óleo de copaíba (com tampão), C) árvore de
copaíba na floresta e D) copa da árvore de copaíba com flores (fotos da autora).
Figura 6. Aspecto macroscópico do óleo de copaíba (foto da autora).
O óleo de copaíba em temperatura ambiente tem consistência líquida,
com aroma forte e sabor amargo (VEIGA JR. e PINTO, 2002). Ele apresenta uma
grande variabilidade em sua composição química, tendo sido identificados 72
sesquiterpenos e 27 diterpenos; o ácido copálico é o único diterpeno encontrado em
todos os óleos analisados, razão pela qual é sugerida sua utilização como marcador
biológico de óleos de copaíba (RIGAMONTE-AZEVEDO et al., 2004).
Na região do Acre, são encontradas principalmente as espécies de
copaíba C. paupera e C. reticulata (MARTINS-DA-SILVA et al., 2008). O óleo de C.
reticulata apresenta aspecto líquido, fino, odor fraco e de coloração amarelo-dourada
com viscosidade muito variável (18 a 187 Pa-s) e densidade média de 0,975±0,049
g/ cm3 (SILVA et al., 2012).
No ano de 1972, o Food and Drug Administration, órgão norte-americano
regulamentador de drogas, aprovou o óleo de copaíba, após ser submetido a testes
(VEIGA JUNIOR E PINTO, 2012).
A principal propriedade terapêutica entre as citadas na literatura é a
atividade antiinflamatória, com principais componentes responsáveis os
hidrocarbonetos, sesquiterpênicos, especialmente o -bisaboleno e -cariophileno. A
utilização do óleo de copaíba sobre as bactérias formadoras de placa dental foi
comprovada recentemente em estudo realizado em cães, tendo sido obtido ao final
do período experimental, redução significativa da formação da placa dental nos
animais com a utilização de solução a base do fitofármaco e a ação antimicrobiana
do óleo de copaíba, sobre a bactéria Streptococcus pyogenes, causadora de
inflamações de garganta, obtendo resultados positivos na inibição do crescimento
deste microrganismo (PIERI et al., 2009).
O ácido caurenóico, um diterpeno caurânico isolado do óleo de copaíba,
mostrou-se ativo in vitro contra formas tripomastigotas do Trypanosoma cruzi. Uma
ação lítica sobre os eritrócitos foi uma das limitações encontradas para esta
atividade (VIEIRA, 002).
Recentemente foi demonstrado efeito leishmanicida do óleo resina de C.
reticulata, semelhante ao da anfotericina B, em L. infantum (RONDON et al., 2012).
Em análise de frações do óleo de copaíba (ácidos diterpênicos) todas as frações
avaliadas tiveram atividade contra amastigotas e promastigotas de L. amazonensis,
sendo mais efetivas em amastigotas (SANTOS et al., 2013).
Vale ressaltar que nos trabalhos acima citados usando óleo de copaíba
em Leishmania, foram utilizados métodos de emulsificação contendo etanol ou
dimetil sufoxido (DMSO) ou os óleos não foram emulsificados, ficando em
suspensão nos meios de cultura.
1.10.2 Óleo de Carapa guianensis
A árvore Carapa guianensis (Figura 7) conhecida popularmente como
andiroba, andiroba-saruba, iandiroba, carapa e nandiroba pertence à família
Meliaceae. O termo andiroba é derivado da língua indígena onde iand significa óleo
e rob amargo (Silva,2011).
A B C D E
Figura 7. A) semente e broto da árvore de andiroba;, B) árvore jovem de andiroba
na floresta amazônica (5 anos) seta; C) castanha; D e E) castanha com semente de
andiroba ( fotos da autora, Rio Branco, AC).
O gênero Carapa tem duas espécies, C. procera e C. guianensis. A C.
guianensis ocorre em toda a região Amazônica, em várzeas secas e alagadiças,
beiras de rios e igarapés do Pará até a Bahia (LORENZI, 2002). A madeira é
moderadamente pesada, dura e pouco resistente às tempestades, porém é
inatacável por insetos, sendo bem utilizada na construção civil (EMBRAPA, 2002). A
árvore floresce duas vezes ao ano, agosto e setembro, janeiro e fevereiro, já os
frutos amadurecem em junho e julho, fevereiro e março. Possui sementes
vermelhas, coriáceas, convexas, angulosas e achatadas lateralmente (Figura 7 E).
Além de não ser destrutiva, como no caso da indústria madeireira, a coleta das
sementes demanda um pequeno investimento e os subprodutos provenientes do
óleo, como sabonetes e velas, são revendidos em feiras livres do norte do país,
tendo um grande impacto na economia de alguns estados da região. O óleo é
comercializado para diversas regiões do país e exportado principalmente para
indústria de cosméticos na França, Alemanha e Estados Unidos (GONÇALVES,
2001).
A produção de uma árvore de andiroba pode variar de 50 a 200 Kg de
semente por ano. As sementes quando acondicionadas em sacos plásticos
permanecem viáveis por um longo período, até sete meses, desde que mantidas em
câmara úmida (14ºC e 80% de Umidade Relativa - UR) ou câmara seca (12ºC e
30% de UR) (MIRANDA JÚNIOR, 2010).
O óleo de andiroba (Figura 8) pode ser extraído de duas maneiras, uma
artesanal e outra industrial e a composição química varia conforme o método de
extração. A extração de óleo de andiroba feita por método manual é utilizada pelas
comunidades indígenas e caboclas da Região Norte, este processo depende da
fermentação da semente cozida, seu descascamento e do lento escorrimento de
óleo da massa obtida (EMBRAPA, 2002).
Figura 8. Aspecto do óleo de andiroba com diferença de cor devido a formas de
extração diferentes e no fundo do frasco (seta) depósito da fração insaponificável
(foto da autora, amostras na FUNTAC).
O óleo é constituído principalmente de ácido palmítico, oléico (cerca de 50%)
e linoleico, além de uma fração insaponificável (Figura 8) (2 a 5%) constituída
principalmente de substâncias amargas, chamadas meliacinas ou limonóides, que
provavelmente são responsáveis pela atividade biológica do óleo (SILVA, 2011). Os
limonóides gedunina, andirobina e epoxiazadiradiona isolados desta espécie
apresentam importantes atividades biológicas: antiinflamatória (FERRARI, 1998),
repelente de insetos (MENDONZA et al., 2007) e anti-tumor (CHICARO, 2009). O
óleo de andiroba é utilizado popularmente para o tratamento de doenças febris,
malária (PEREIRA et al., 2014), como repelente para insetos, coceiras, cicatrizantes,
antiinflamatório e traumatismos (MENDONZA e FERRAZ, 2007). Ferrari et al.(2007)
investigaram uma suposta atividade fotoprotetora de emulsão do óleo de andiroba,
fundamentados nos conhecimentos populares. O óleo de andiroba e uma fração
purificada rica em limonóides são tóxicos para o Plasmodium falciparum, uma das
espécies causadoras da malária (MIRANDA JUNIOR, 2010). Baldissera et al.
demonstraram que o óleo de andiroba, copaíba e aroeira são tóxicos para
Trypanosoma evansi (BALDISSERA et al., 2014). Não há relatos, até o presente,
dos efeitos do óleo de andiroba em Leishmania.
1.11 Tratamentos com a Câmara Hiperbárica (HBO)
A Câmara Hiperbárica é um equipamento utilizado para terapia que
permite manter a pressão interna constante ou controlada. Trata-se de um
compartimento selado, para onde é bombeado oxigênio, ar comprimido ou mistura
respiratória, por meio decompressores. Medicina Hiperbárica é o ramo da medicina
responsável pelo estudo e implantação das normas técnicas e de segurança em
ambientes pressurizados. É também responsável pelo estudo e estabelecimento de
protocolos de tratamento para todas as patologias para as quais o oxigênio sob
pressão tem a função de auxiliar no tratamento (FERNANDES, 2009). A primeira
câmara hiperbárica foi construída na Europa em 1662 pelo padre inglês Henshaw. O
destaque ao oxigênio (O2), se deu em 1774, pelo cientista inglês Joseph Priestley
(MARCONDES e LIMA, 2003).
Atualmente a oxigenioterapia hiperbárica é um método terapêutico
adjuvante empregado em patologias infecciosas inflamatórias e isquêmicas
(LEWIS,1999). O O2 hiperbárico é bactericida quando usado isoladamente.
Entretanto, essa função requer a exposição bastante prolongada a esse gás e sob
pressões bastante elevadas, o que é viável nos laboratórios, mas ainda não no
tratamento clínico dos seres humanos (WILLERS, 2015). Meltzer comprovou o
aumento da angiogênese, com melhora da cicatrização tecidual quando ratos eram
submetidos ao hiperbarismo (MELTZER, 1986).
O nosso grupo de pesquisa demonstrou que lesões cutâneas murinas
causadas por L. amazonensis são hipóxicas, provavelmente devido ao prejuízo da
microcirculação no tecido, demanda metabólica, proliferação dos parasitos e
infecção bacteriana secundária (VIEIRA, 2012). Em trabalho também realizado em
nosso laboratório, foi demonstrado que a HBO (Figura 9) tem efeito tóxico e
irreversível em amastigotas e promastigotas e reduz a infecção em culturas de
macrófagos (ARRAIS-SILVA et al., 2005).
Figura 9. Câmera hiperbárica modular para uso em pequenos animais. Laboratório
de Leishmaniose, Depto. de Biologia Animal, IB, Unicamp. (foto da autora).
1.12 Leishmaniose experimental
Os modelos murinos têm sido amplamente utilizados para entender
melhor o ciclo de vida do parasito, o processo de infecção e a relação parasito-
hospedeiro. Diferentes linhagens de camundongos inoculados com L. donovani e L.
infantum apresentam cargas parasitárias variadas. Camundongos BALB/c são
suscetíveis e apresentam visceralizacão pricipalmente em baço e fígado havendo
diferença entre as cargas parasitárias encontradas nos dois órgãos, sendo maior em
fígado na fase inicial da infecção (30 dias) e havendo controle da infecção neste
órgão após o período de 60 dias e há aumento da carga parasitária em baço
comparado com fígado após os 60 dias (CORRÊA, 2011).
Em relação aos modelos experimentais para a L. amazonensis existem
duas linhagens murinas muito estudadas, camundongos C57BL/6, que controlam a
infecção e os BALB/c, suscetíveis ao parasito. Na grande maioria dos trabalhos
inocula-se L. amazonensis pela via subcutânea, no coxim plantar de uma das patas
traseiras e os animais são acompanhados semanalmente através de medição das
patas e na conclusão do experimento os animais são sacrificados e a carga
parasitária contada através de câmara de Neubauer (ARRAIS-SILVA et al., 2006).
Os sistemas in vitro são úteis na avaliação de compostos com atividade
biológica que determine citotoxicidade e atividade leishmanicida. O macrófago é a
célula mais diferenciada do sistema mononuclear fagocitário (VAN FURTH et al.,
1972) e extremamente efetivo na primeira linha de defesa imunológica e
homeostasia do organismo. Esta célula é ativada após contato com patógenos ou
moléculas provenientes desses, assim como citocinas e quimiocinas (GORDON,
2003). A grande maioria dos experimentos in vitro com leishmania é realizada com
macrófagos peritoneias e de medula óssea de camundongos e macrófagos de
linhagens tais como DH82 (MORAES et al, 2014), J774 (DEGROSSOLI et al., 2007).
Em um estudo, utilizando-se os óleos de copaíba e andiroba, visando
suas atividades antinflamatórias, foi verificada ação antineoplásica em células de
linhagem originadas de carcinoma de orofaringe denominadas FaDu (ADCC)
cultivadas in vitro , causando redução na proliferação dessas células porém não
indução de apoptose (CHICARO, 2009), sendo assim, não consideramos viável o
uso de células de linhagem para os testes das nanoemulsões de copaíba e andiroba
em amastigotas intracelulares nesse trabalho de mestrado.
Na análise histopatológica, na LV, verifica-se principalmente a
multiplicação de amastigotas em células mononucleares fagocíticas dos órgãos
internos tais como o baço, fígado e medula óssea (OLIVEIRA et al., 1993),
ocorrendo hiperplasia e hipertrofia das células. Outros órgãos como pulmões e rins
também são afetados durante a progressão da infecção. Na LV experimental,
causada pela L. donovani, L. infantum, a infecção hepática é geralmente
autolimitante com resposta inflamatória granulomatosa, envolvendo células de
Kupffer, monócitos e células TCD4+ e TCD8+ com eficiente formação de granuloma
hepático, esses granulomas são importantes na eliminação de Leishmania spp.
(MURRAY, 2001). O estudo da formação do granuloma hepático de cães com LVC
mostrou granulomas de tamanhos variados, constituídos por macrófagos,
parasitados ou não por formas amastigotas de L. infantum, algumas células
epitelióides, poucos linfócitos e plasmócitos e raros neutrófilos. Cães assintomáticos
apresentaram número maior de granulomas que oligossintomáticos e sintomáticos.
et al., 2007). Por outro lado, no estudo do baço de cães infectados naturalmente por
L. infantum, observou-se frequência alta de periesplenites, granuloma,
desorganização estrutural e atrofia de folículos linfóides e da zona marginal
(SANTANA et al., 2008).
1.13 Emulsões e nanoemulsões
As emulsões são dispersões de dois ou mais líquidos imiscíveis,
completamente difuso um no outro, termodinamicamente instáveis, e estabilizados
cineticamente (ANSEL et al., 2000), e são compostas de água, óleo e tensoativo. A
estrutura consiste em gotícula da fase dispersa envolta pela fase contínua e
classificadas de: água em óleo (A/O) ou óleo em água (O/A). Um dos métodos para
obtenção de emulsões é o da emulsificação direta, a fase dispersa é adicionada à
fase contínua sob intensa agitação ou por um processo denominado de inversão de
fases, onde se adiciona a fase que pretende ser a contínua à fase dispersa, até que
a inversão ocorra e o tipo de emulsão desejada se forme (emulsão de baixo gasto
de energia) (ANDRADE, 2008).
A nanoemulsão é um sistema heterogêneo composto por óleo em água
ou água em dispersão de óleo com agente tensoativo, com gotículas que variam de
tamanho de 20-600 nm (SOLANS, 2003). As nanoemulsões não se formam
espontaneamente, sendo necessário fornecimento de energia ao sistema, podendo
ser energia mecânica ou uso de propriedades fisicoquímicas do sistema
(CAMARGO, 2008).
As nanoemulsões apresentam um novo e promissor sistema de
veiculação para a tecnologia farmacêutica e cosmética evitando a ação da força da
gravidade (instabilidades como sedimentação e cremação). Diferentes das
microemulsões, que requerem uso de concentração de tensoativo superior a 20%,
as nanoemulsões são obtidas usando-se concentrações bem menores de
tensoativos, de 3 a 10% (OLIVEIRA, 2008).
As nanoemulsões são sitemas metaestáveis, ou seja, estáveis por um
longo período de tempo, sendo esta estabilidade diretamente relacionada ao
pequeno tamanho dos glóbulos, cujo movimento browniano diminui a ação da força
da gravidade causando flutuação das partículas e reduzindo a instabilidade,
permitindo que seja disperso em água. As dimensões das nanoemulsões permitem a
maior penetração em tecidos e a esterilização é realizada utilizando-se filtros de
membranas com diâmetros menores que os das bactérias (FERNANDEZ et al.,
2004).
A nanotecnologia tem contribuído para o aperfeiçoamento de
propriedades farmacológicas de fármacos convencionais, produzindo maior
biodisponibilidade, aumentando a solubilidade de substâncias pouco solúveis,
favorecendo a liberação controlada de substâncias, sendo assim, um dos materiais
mais promissores da atualidade são as nanodispersões, que possuem grande
potencial de aplicação em diversas áreas da indústria, incluindo a de produtos
farmacêuticos (WANG et al., 2009).
As nanodispersões são formadas por sistemas micelares que por sua vez,
são um conjunto de moléculas de tensoativos que se agrupam de forma espontânea
gerando agregados coloidais nanoestruturados em meio aquoso com tamanho de
partícula usualmente compreendido entre 30-300nm, quando utilizado como
transportador de fármacos aumenta a capacidade de permanecer em circulação
sistêmica por maior período de tempo, proporcionando acúmulo gradual do fármaco
na área requerida e acumulação do fármaco em regiões com vascularização
reduzida devido às dimensões reduzidas das partículas. A partícula em forma
micelar, ainda possui a capacidade de proteger o fármaco contra possível inativação
sob o efeito de um ambiente biológico, reduzindo efeitos colaterais indesejáveis, com
consequente aumento da biodisponibilidade. As nanopartículas possuem a
capacidade de aumentar significativamente a biodisponibilidade de substâncias
lipofílicas encapsuladas dentro de suas partículas (ESDRAS, 2016).
A redução do tamanho das partículas para valores inferiores a 500nm,
pode produzir uma maior absorção da substância ativa e maior captação de
partículas pelo organismo, sugerindo que a absorção da nanopartículas é um fator
importante na melhoria da biodisponibilidade (ACOSTA, 2009).
1.13.1 Caracterização de Sistemas Nanoestruturados
Após a obtenção de sitemas nanoestruturados, estes são submetidos a
caracterização sendo investigadas as propriedades dos materiais como tamanho e
distribuição de partículas, área superficial e porosidade, morfologia, estabilidade
física, química e físico-química, propriedades térmicas, propriedades de superfície
(carga superficial, quimica de superficie), propriedades estruturais, dentre outras,
analisados quanto a propriedades físicoquímicas e de imagem (RADAIC, 2013).
O aparelho Zetasizer Nano ZS® é usado para a medição do tamanho, do
potencial zeta de soluções coloidais e nanopartículas. Para Medição de Tamanho de
Partículas e Distribuição de nanomateriais em suspensão por Análise de
Rastreamento de nanopartículas é utilizado um aparelho como o Nano Sight NS300,
da Malvern, por exemplo. A Nanoparticle Tracking Analisis (NTA), ou seja, a análise
por rastreamento de nanopartículas, utiliza as propriedades de dispersão de luz e o
movimento browniano, a fim de obter a distribuição do tamanho de partícula das
amostras em suspensão líquida (RIBEIRO, 2016). O equipamento NanoSight
NS300 possibilita medir o tamanho (entre 1nm - 5 microm), a distribuição da
população (polidispersão), potencial elétrico de superfície e a concentração de
nanopartículas em suspensão, pelo rastreamento de partículas individuais (vídeo
microscopia). O NTA refere-se à medida do diâmetro das partículas que é feita pela
análise individual das mesmas (DE PAULA, 2014). As medidas por espalhamento de
luz dinâmico (DLS) considera o movimento browniano médio das partículas em
suspensão, em sistemas polidispersos. O equipamento Zeta Sizer Nano ZS90 é um
DLS de geometria de 90º, que mede o tamanho (2nm a 5,0 microm), a polidispersão
de materiais nanoparticulados, e o potencial elétrico diretamente pela mobilidade
eletroforética (GUILHERME, 2014).
Outra ferramenta usada para caracterização de sistemas
nanoestruturados é a Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET), já que as
técnicas de DLS e NTA exibem certas limitações como reconhecer a presença de
uma pequena população de partículas de tamanho diferente da maioria da
população presente em nanoemulsões, assim como a composição dos sistemas
coloidais (KLANG et al., 2012).
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
O objetivo geral desse trabalho é avaliar se os tratamentos com
nanoemulsões de óleo de copaíba e óleo de andiroba associados ou não a HBO tem
efeitos anti-Leishmania nos modelos in vitro e in vivo da LC e LV.
2.2 Objetivos Específicos
Analisar a pureza e caracterizar por cromatografia gasosa e espectometria de
massa dos óleos de Copaifera (copaíba) e C. guianensis (andiroba).
Desenvolver protocolos para produção de nanoemulsões dos óleos de
andiroba e de copaíba.
Analisar a toxicidade dos óleos de copaíba e andiroba em promastigotas de L.
amazonensis e L. infantum e em macrófagos peritoneais de camundongos
Balb/c.
Analisar a toxicidade das nanoemulsões dos óleos de copaíba e andiroba em
promastigotas de L. amazonensis e L. infantum e em macrófagos peritoneais
de camundongos Balb/c.
Avaliar a eficácia dos tratamentos com as nanoemulsões dos óleos de
copaíba e andiroba em camundongos Balb/c infectados com L. amazonensis.
Avaliar a eficácia dos tratamentos com as nanoemulsões dos óleos de
copaíba e andiroba em camundongos Balb/c infectados com L. infantum.
Avaliar a possível citotoxicidade dos tratamentos propostos nos camundongos
Balb/c infectados com L. amazonensis e L. infantum.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Parasitos
Os promastigotas de L. amazonensis (MHOM/BR/73/M2269) foram
cultivados em meio de cultura RPMI completo (0,1% de gentamicina e 10% de soro
fetal bovino SFB), a 26-28ºC, em frascos de cultivo (ARRAIS-SILVA et al., 2006).
Os promastigotas de L. infantum (MHM/BR/1972/LD) foram cedidos pela
Dra. Clara L. Barbieri Mestriner do Departamento de Microbiologia, Imunologia e
Parasitologia da Universidade Federal de São Paulo. Os parasitos foram cultivados
e, mantidos em estufa de 26-28ºC, em frascos de cultivo.
Os amastigotas de L. amazonensis foram mantidos em camundongos
BALB/c. Os animais foram inoculados com 1X106 promastigotas de L. amazonensis,
via subcutânea (sc), no coxim plantar da pata, membro posterior direito e mantidos
por 60 a 90 dias. Após esse período, para coleta dos amastigotas, os animais foram
eutanasiados por deslocamento cervical, e a lesão retirada e macerada com lâmina
de bisturi e solução salina estéril, e filtrada em gaze stéril.
Os amastigotas de L. infantum foram mantidos em camundongos BALB/c
conforme padronizado em nosso laboratório (MORAES et al., 2014). Os animais
foram inoculados com 1X 107 promastigotas, via intraperitoneal, e, mantidos por 60 a
90 dias. Após esse período os animais foram eutanasiados por deslocamento
cervical e tiveram o fígado e baço coletados, macerados com lâmina de bisturi,
lâmina de vidro e solução salina estéril. O material foi centrifugado em centrífuga
Eppendorf ® 5810R, em tubos de 15mL a 2296g por 5 minutos a 20ºC.
3.2 Animais
Os protocolos de tratamento de camundongos foram submetidos e
aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Unicamp (anexo).
Os camundongos de linhagem Balb/c, fêmeas, de 30 dias de vida, foram
obtidos do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica (CEMIB) da Unicamp.
3.3 Fármacos
Anfotericina B (Sigma®) e miltefosina (Cayman Chemical Company®)
foram estocadas a 4º sob a forma liofilizada. Ambas foram dissolvidas em água mili
Q no momento do experimento. As dosagens utilizadas foram, de Anfotericina B
20mg/mL e de miltefosina 5mg/ 300 µL.
3.4 Infecção dos animais com L. amazonensis e monitoramento
Os camundongos foram inoculados via subcutânea na pata direita traseira
com 1X106 promastigotas de L. amazonensis em fase estacionária de cultivo. As
lesões induzidas pela L. amazonensis foram monitoradas semanalmente, com
paquímetro (ARRAIS- SILVA et al.,2006). Após o período de 2 meses de infecção e
tratamento, os animais foram sacrificados por deslocamento cervical e tiveram os
seguintes parâmetros avaliados: carga parasitária, peso e medida das patas, além
da coleta de tecido da lesão e órgãos internos para analise histológica. A
determinação da carga parasitária da lesão foi realizada como descrita no item 3.1.
3.5 Infecção dos animais com L. infantum e monitoramento
Os camundongos foram inoculados via intraperitoneal (IP) com 1X107
promastigotas de L. infantum em fase estacionária de cultivo. Após 2 meses de
infecção e tratamento, os animais foram sacrfiicados por deslocamento cervical e
tiveram os seguintes parâmetros avaliados: carga parasitária, peso de baço e fígado,
e coleta de fragmento de baço e fígado para analise histológica. A determinação da
carga parasitária dos órgãos foi realizada como descrita e se fez por coleta de baço
e fígado conforme descritoa no item 3.1.
3.6 Óleos de Copaifera (copaíba) e C. guianensis (andiroba)
O óleo de copaíba é proveniente da Cooperiaco (Sena Madureira/ AC), e
o de andiroba da Cooperativa Ecojuruá, (Cruzeiro do Sul / AC). Ambos foram
analisados quanto à pureza e caracterizados por cromatografia gasosa e
espectometria de massas pelo Laboratório de Produtos Naturais da Fundação de
Tecnologia do Acre (FUNTAC), com a colaboração da Dra. Sílvia L. Basso. Os
laudos com os resultados e as notas fiscais dos óleos estão anexados nesse
trabalho.
3.7 Protocolos de Emulsões
Os seguintes protocolos foram realizados para desenvolvimento de
emulsões:
No primeiro protocolo, os volumes de 295 µL dos oleos de andiroba ou
copaiba foram diluidos em 5 µl de DMSO e 2700 µL de meio RPMI (MIRANDA-
JUNIOR, 2010).
No segundo protocolo há duas fases, aquosa e oleosa. Para a fase
aquosa adicionou-se propilenoglicol (2%), metilparabeno (0,2%) e água (9 mL). Na
fase oleosa juntou-se álcool cetoestearílico etoxilado (Emulgin B2, a 1%), óleo de
andiroba 1 mL, propilparabeno (0,1%), BHT (0,1%), álcool cetílico (1%) e álcool
estearílico (2%). E sob agitação mecânica de 500 rpm por 10 minutos a 70ºC, a fase
oleosa foi vertida na fase aquosa. A emulsão controle, sem o óleo, apenas com os
agentes emulsificantes, foi feita substituindo-se 1mL de óleo de andiroba por 1 mL
de água (FERREIRA, 2010).
No terceiro protocolo, foram realizados testes com diferentes volumes de
acetona e água, com os seguintes constituintes nas diferentes fases: fase aquosa
Tween 80 (polietilenosorbitol éster) (1%), água destilada e fase orgânica óleo
andiroba 10% do volume final, Span 80 (sorbitan monooleato) (2%) e acetona. A
proporção de acetona e água foi mantida em 1:2 em todas as formulações
(OLIVEIRA, 2008).
No quarto protocolo, foi repetido o procedimento do terceiro protocolo e a
emulsão formada submetida à agitação em 10.000 rpm por 3 minutos em
Ultraturrax® (IKA® T18 basic). Para melhor homogeneização e redução do tamanho
das partículas foi submetida à sonicação em ultra sonicador de alta intensidade
50watt por 3 minutos a 40 Kv com tempo de pausa de 1 minuto, em banho Maria
com gelo picado para evitar aumento de temperatura da amostra. A emulsão
formada após sonicação foi colocada em rotavapor por duas horas até que se
obtivesse o volume final de 10 mL.
No quinto protocolo a emulsão foi feita adicionando-se 0,4 g de Tween®
80 em 10mL de água sob agitação em agitador mecânico a 500 rpm, 70ºC por 10
minutos (fase aquosa). Paralelamente, foi adicionado 0,4g de Span® 80 a 1g de
óleo de copaíba ou andiroba, sendo mantida a agitação por 10 minutos a 70ºC
temperatura (fase orgânica). Em seguida, a fase orgânica foi vertida na fase aquosa
sob agitação de 500 rpm e se manteve a agitação por mais 10 minutos a 70ºC
(Oliveira, 2008). A emulsão do óleo de copaíba ou de andiroba obtida, foi submetida
à agitação em 10.000 rpm por 3 minutos em equipamento Ultraturrax® (IKA® T18
basic) .
Emulsão controle com Tween 80 e Span 80 (TS) foi realizada repetindo-
se o quinto protocolo, porém subtituindo-se os óleos por água.
3.8 Protocolos de nanoemulsões
Os seguintes protocolos foram realizados para obtenção de
nanoemulsões.
Nanoandi 1
Após a realização do terceiro protocolo de emulsão de andiroba, foi
realizada a evaporação da acetona, em aparelho de rotavapor até a redução do
conteúdo a 10mL.
Nanoandi 2
Após a realização do quarto protocolo de emulsão de andiroba, foi
realizada a evaporação da acetona, em aparelho de rotavapor até a redução do
conteúdo a 10mL.
Nanoandi 3
A emulsão de andiroba, segundo o quinto protocolo, foi submetida à
ultrassom em sonicador de ponta (Vibracell Sonic & Materials Inc.®) potência de
60W e 40Khz de frequência nominal por 25 minutos (BARBOSA, 2013). A
nanoemulsão formada foi submetida a avaliação físico química logo após ser obtida,
e depois de 30, 60 e 90 dias.
Nanocopa
A emulsão de copaíba feita no quinto protocolo foi submetida à ultrassom
em sonicador de ponta (Vibracell Sonic & Materials Inc.®) potência de 60W e 40Khz
de frequência nominal por 25 minutos. A nanoemulsão formada foi submetida a
avaliação físico química logo após ser obtida e depois de 30 dias, 60 e 90 dias.
Nanoemulsão controle (TS)
A emulsão controle feita com os emulsificantes hidrofílico e orgânico,
respectivamente, Tween e Span, foi submetida a ultrassom e sonicador de ponta
repetindo os procedimentos realizados na Nanocopa e Nanoandi 3.
3.9 Caracterização das nanoemulsões por espalhamento dinâmico de
luz (do ingês Dynamic Light Scattering) (DLS)
A caracterização físico-química das nanoemulsões foi feita por medição
do seu diâmetro hidrodinâmico, potencial zeta e índice de polidispersão (PDI) ,
avaliada pelo espalhamento de luz dinâmico do sistema Malvern Zetasizer Nano
(Malvern Instruments Ltd. , Worcestershire, UK) equipado com laser 633 nm
(Laboratório de Biomembranas). As medições foram realizadas a 25ºC em cuvetes
de polistireno com um comprimento de percurso de 10 mm.
3.10 Caracterização das Nanoemulsões por Análise de
Nanopartículas por Rastreamento (Nanoparticle Tracking Analysis NTA)
Tanto a nanoandi 3 como a nanocopa foram analisadas por NTA
(NanoSight NS300), (Laboratório de Biomembranas) para se verificar tamanho,
potencial zeta e comparar as imagens aos outros parâmetros, DLS e Microscopia
Eletrônica de Transmissão
.
3.11 Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) das
nanoemulsões
As imagens das nanoemulsões foram obtidas por microscopia eletrônica
de transmissão para estudo da estrutura e morfologia (COSTA et al., 2014). As
amostras foram diluídas em água deionizada a 10%, incluídas em microplacas de
cobre revestidas com Formvar (polivinilformal modificado) e negativamente coradas
com acetato de uranila por 3 min, à temperatura ambiente. Para secagem a
temperatura ambiente foi utilizado papel de filtro Whatman (KLANG et al.,2012). As
amostras foram observadas com Microscópio Eletrônico de Transmissão (LEO 906,
Carl Zeiss) no Laboratório de Microscopia Eletrônica do IB/Unicamp. As imagens
foram adquiridas em micrografias por câmara acoplada ao aparelho de MET
operando a 60Kv, com magnitude variando de de 27.800 a 129.300.
3.12 Microscopia eletrônica de varredura (MEV) dos promastigotas
Promastigotas de L. amazonensis (106 céls/mL), previamente tratados
com diferentes doses de nanoemulsões de copaíba ou de andiroba durante 24 horas
e um grupo controle sem tratamento, foram centrifugadas em centrífuga Eppendorf
® 5810R, em tubos de 2mL a 27g por 10 min a 20ºC. O pellet foi resuspenso com
2,5% de Glutaraldeído e 1% de ácido tânico em tampão cacodilato de sódio 0,1M, e
mantidas por 40 min em placas de 24 poços. Após fixação, as células foram lavadas
por duas vezes com tampão cacodilato 0,1M e adicionadas em lamínulas redondas
com Poli-L-Lisina (Sigma). As lamínulas foram lavadas com tampão cacodilato de
sódio 0,1M e fixadas com 1% de tetróxido de ósmio em banho de gelo por 45 min.
As lamínulas foram lavadas com água destilada e transferidas para um suporte para
ponto crítico, onde foram desidratadas com gradientes de etanol (50, 70 e 90%
durante 5 min. e 2x 100% durante 10 min. (EATON et al., 2013). As lamínulas foram
cobertas por evaporação com ouro (Sputter, Balzers SCD 050) e observadas em
Micróscopio Eletrônico de Varredura (10kV, SM 58.00 LV). As imagens digitais e
micrografias, foram realizadas em diferentes aumentos (1.000 a 9.000 X). Culturas
de promastigotas de L. infantum e de L. amazonensis, foram mantidas em contato
com as nanoemulsões dos óleos de copaíba (nanocopa) e de andiroba (nanoandi 3)
por 24 hs nas seguintes dosagens de cada: 2µL e 10µL em 1 mL de meio de cultura
L. amazonensis ou para L. infantum.
Dois grupos foram mantidos por 1h em contato com as nanoemulsões na dose
Foram realizadas 40 fotos, das quais foram selecionadas as mais
representativas com relação às imagens que pudemos registrar, compatível com o
que pode ser observado no momento da contagem da curva de crescimento das
culturas, nos testes realizados posteriormente descritos, com a câmara de Neubauer
em microscópio óptico.
3.13 Ensaios de toxicidade em promastigotas
Os promastigotas de L. amazonensis ou L. infantum, em fase estacionária
de cultivo (1X106/mL em placas de 24 pocinhos foram tratados com doses variadas
de óleos de copaíba ou andiroba). Os parasitos foram incubados durante 48 ou 72
horas em meio de cultura RPMI ou Schneider´s em estufa de 26°C, e após esses
períodos, as contagens foram realizadas em câmara de Neubauer (microscópio
óptico Carl Zeiss, Primo Star ) (AYRES et al., 2007). Foi calculada a IC 50 para
essas nanoemulsões utilizando-se o programa de computador OriginLab 8.5 .
3.14 Ensaios de toxicidade em macrófagos
Camundongos BALB/c sadios de 90 dias de vida foram eutanasiados por
deslocamento cervical, e solução salina estéril injetada na cavidade peritoneal. O
exsudato retirado e o número de células contado em câmara de Neubauer,
considerando-se que 50% das células eram macrófagos (BARBIERI et al., 1993).
Os macrófagos peritoneais foram então cultivados em placas de 24 poços (5X105
macrófagos por poço/mL) com lamínulas redondas de 13mm de diâmetro. Após,
duas 2 horas à temperatura ambiente para a adesão dos macrófagos, as lamínulas
foram lavadas com solução salina e adicionado meio RPMI completo. As placas
foram mantidas por 24hs em estufa incubadora úmida (5% CO2, 95% ar) a 37ºC
(COLHONE et al., 2004). As células foram então submetidas a diversas dosagens de
emulsão ou nanoemulsão dos óleos de copaíba ou de andiroba. As lamínulas foram
então lavadas com solução salina estéril duas vezes, fixadas com metanol e coradas
com Giemsa. Após a coloração, as lamínulas secaram à temperatura ambiente e
foram aderidas em lâminas de vidro com Entellan. Os macrófagos foram contados
em 20 campos e avaliados quanto à estrutura morfológica em microscópio óptico,
aumento 1000X. As fotos foram registradas em microscópio óptico.
3.15 Ensaios de toxicidade em amastigotas intracelulares
Os macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c foram coletados e
cultivados conforme descrição no item 3.11 durante por 24 hs em estufa umidificada
a 21% de O2, 5% de CO2, a 37ºC. Os promastigotas em fase estacionária de cultura
(2,5X106/mL) L. infantum ou L. amazonensis foram adicionados às culturas de
macrófagos e mantidos por 24hs. Após esse período o meio de cultura foi renovado
e as células foram então tratadas com os óleos de copaíba ou andiroba ou com a
nanoemulsão dos óleos por 24hs como descrito no item 3.14. Após esse período as
lamínulas com os macrófagos foram lavadas por duas vezes com solução salina,
fixadas com metanol e coradas com Giemsa. Contagens de 200 células foram
realizadas em microscópio óptico em aumento de 1000 X para avaliação da carga
parasitária (numero de macrófagos infectados e numero de amastigotas
intracelulares) (DEGROSSOLI et al., 2011). As fotos foram registradas em um
microscópio óptico.
Foi calculada a IC 50 para essas nanoemulsões utilizando-se o programa
de computador OriginLab ® 8.5 .
3.16 Tratamentos dos camundongos com nanoemulsões
Camundongos Balb/c, fêmeas, de 60 dias de idade, foram usados nesses
experimentos e cada grupo experimental era composto de 3 animais. O peso médio
dos animais era de 25 gramas.
Os camundongos foram infectados com L. amazonensis ou L. infantum
conforme descrito nos itens 3.4 e 3.5 respectivamente.
Quatro dias após a infecção, iniciou-se o tratamento via oral (VO) com
micropipeta de 2-100 microlitros, durante 60 dias. Os grupos foram os seguintes:
.
-GRUPO 1 Nanoandi Dose de 40 µL de nanoemulsão de óleo de andiroba 10%,
equivalente a 100mg/ml ou 160mg de óleo de andiroba/kg peso vivo (PV), durante
60 dias.
GRUPO 2 Nanocopa- dose de 25 µL de nanoemulsão de óleo de copaíba 10%,
equivalente a 100mg/ml ou 100mg de óleo de copaíba/kg peso vivo (PV), durante 60
dias.
GRUPO 3- Controle Miltefosina - dose de 30 µL, equivalente a 20mg/Kg de PV . O
tratamento teve início na 3ª semana após a infecção e foi mantido até a conclusão
do experimento (COSTA FILHO et al., 2008).
GRUPO 4- Controle sem tratamento Os animais foram infectados mas não
receberam qualquer tratamento.
GRUPO 5- Controle não infectados Nanoandi - Os animais foram mantidos em
tratamento semelhante ao GRUPO 1, mas não foram infectados.
GRUPO 6- Controle não infectados Nancopa - Os animais foram mantidos em
tratamento semelhante ao GRUPO 2, mas não foram infectados.
3.17 Tratamentos dos camundongos com Câmara Hiperbárica (HBO)
Os camundongos BALB/c infectados com L. amazonensis ou L. infantum,
e tratados com nanoemulsão dos óleos de copaíba ou andiroba, foram expostos ao
ambiente de câmara hiperbárica modular (Research Chamber, model HB 1300B,
Sechrist Inc., Inaheim, CA USA).
Os animais infectados com L. amazonensis foram expostos a HBO da
segunda semana de infecção em diante.
Os animais infectados com L. infantum foram expostos a HBO desde a
sexta semana de infecção, durante 15 dias
A câmara foi pressurizada com 100% de O2 medicinal (White Martins
Campinas) durante 5 minutos, até a pressão de 3 ATA ser atingida (ARRAIS-SILVA
et al., 2006). Após 1 hora de tratamento de tratamento dos animais, a câmara foi
despressurizada durante 5 minutos, até a pressão de 1 ATA. As temperaturas,
interna e externa, da câmara foram monitoradas com termômetro analógico TB0261
(22ºC).
Os grupos foram os seguintes
GRUPO HBO (sem o tratamento com as nanoemulsões)- os animais foram
infectados com 1X106 promastigotas de L. amazonensis ou 1X107 promastigotas de
L. ifantum conforme descrito no item 3.16, e iniciaram o tratamento na HBO na 2ª
semana de infecção ( L. amazonensis) ou na 6ª semana de infecção( L. infantum) .
O tratamento foi realizado diariamente, durante 45 dias ( L. amazonensis) ou 15 dias
( L. infantum).
GRUPO Nanoandi+ HBO - Os animais foram infectados com 1X106 promastigotas
de L. amazonensis ou 1X107 promastigotas de L. infantum conforme descrito no
item 3.16, e tratados com nanoandi 3 durante 57 dias. Iniciaram o tratamento na
HBO na 2ª semana de infecção ( L. amazonensis) ou na 6ª semana de infecção( L.
infantum). O tratamento foi realizado diariamente, durante 45 dias ( L. amazonensis)
ou 15 dias( L. infantum).
GRUPO Nanocopa + HBO- Os animais foram infectados com 1X106 promastigotas
de L. amazonensis ou 1X107 promastigotas de L. ifantum conforme descrito no item
3.16, e tratados com nanocopa durante 57 dias. Iniciaram o tratamento na HBO na
2ª semana de infecção ( L. amazonensis) ou na 6ª semana de infecção( L. infantum).
O tratamento foi realizado diariamente, durante 45 dias (L. amazonensis) ou 15 dias
(L. infantum).
3.18 Histologia
Os fragmentos de fígado, baço, estômago, rim, intestino delgado e pata,
foram fixados em formalina 10 % e mantidos em álcool 70º. O processamento
hematoxilina/eosina) foi realizado no Serviço de Soluções em Anatomia Patológica,
HISTOCELL, São Paulo, SP. As micrografias foram realizadas em microscópio
óptico (marca Carl Zeiss, Primo Star).
3.19 Análises dos resultados
Os ensaios foram realizados em triplicata e os resultados de cada
experimento, expressos pela média + SD. Para os cálculos de IC 50 das
nanoemulsões em promastigotas foi usado o programa Originlab® modelo 8.5. As
diferenças significativas entre os grupos experimentais foram analisadas usando-se
o Teste Anova com p<0,05, programa utilizado foi o Sisvar ® modelo 5.6 para
Windows.
4- RESULTADOS
4.1 Análise fisicoquímica dos óleos de Copaifera (copaíba) e C.
guianensis (andiroba)
Primeiramente, realizou-se a análise fisicoquímica dos óleos de Copaifera
(copaíba) e C. guianensis (andiroba) no Laboratório de Produtos Naturais da
(Fundação de Tecnologia do Acre. Os dados são compatíveis com aqueles da
literatura, tanto para o óleo de copaíba (SILVA et al., 2012) quanto para o óleo de
andiroba (SILVA et al., 2011) (Anexo III e IV).
4.2 Análise cromatográfica dos óleos
4.2.1 Cromatograma do óleo de copaíba
A análise cromatográfica do óleo de copaíba (Figura 10) mostrou duas
regiões de eluição específicas, a primeira região de eluição (pico 1) é a de menor
tempo de retenção, e apresentou grande sobreposição de picos, correspondentes
aos hidrocarbonetos sesqui -copaeno (pico 3) (VEIGA
JUNIOR et al., 1997). A segunda região (pico 2) corresponde a eluição dos ésteres
metílicos de ácidos diterpênicos, sendo o ácido caurenóico (pico 4), um diterpeno
ativo isolado do óleo de copaíba (VIEIRA, 2002).
Figura 10. Cromatograma de amostra do óleo de copaíba. Analise realizada por
cromatografia gasosa e espectometria de massas.
4.2.2 Cromatograma do óleo de andiroba
Na Figura 11, observamos no cromatograma a composição do óleo de
andiroba com a presença de ácido palmítico (ou hexadecanóico) (pico 2), ácido
oléico (pico 3) e ácido linoléico ou octadecanóico (pico 4), além dos limonóides (pico
1).
Figura 11. Cromatograma de amostra de óleo de andiroba. Analise realizada por
cromatografia gasosa e espectometria de massas.
4.3 Emulsões e nanoemulsões
4.3.1 Emulsões
Para obter emulsões vários protocolos foram testados.
Na primeira tentativa utilizou-se DMSO, com óleo de copaíba ou andiroba.
Mas a emulsão resultante, não era estável, pois ocorreu a separação em duas fases
(óleo - água) quando diluída em meio de cultura, (Figura 12).
(A) (B)
Figura 12. Aspecto da emulsão em que se utilizou DMSO. Emulsão de
óleo de andiroba (A) e emulsão de óleo de copaíba (B) em DMSO (0,17%) e meio
RPMI.
Nossa segunda tentativa foi fazer a emulsão com propilenoglicol (2%),
metilparabeno (0,2%) e água (9 mL) e na fase oleosa, álcool cetoestearílico
etoxilado (Emulgin B2, a 1%), óleo de andiroba 1 mL, propilparabeno (0,1%), BHT
(0,1%), álcool cetílico (1%) e álcool estearílico (2%). Como pode-se observar na
figura 13 o meio de cultura está turvo. Essa emulsão juntamente com a emulsão
controle (sem adição do óleo) foram testadas em meio de cultura com promastigotas
e, mostrara-se extremamente tóxica para os parasitos.
(I) (II) I I III
Figura 13. Aspecto das emulsões (óleo+meio de cultura). (13 A) emulsão
controle em meio Schneider (I); emulsão de óleo de andiroba em meio Schneider (II).
(13 B) (I) emulsão de óleo de andiroba em meio RPMI; (II) emulsão controle em meio
RPMI; (III) apenas meio RPMI.
As emulsões que foram usadas para a posterior etapa de
desenvolvimento das nanoemulsões foram aquelas em que se utilizou acetona,
tween 80 e span 80. O nosso objetivo era obter na etapa de nanoemulsões, o menor
tamanho de partículas possível, que possibilitasse ficar distribuída de forma
homogênena no meio de cultura com menor quantidade de agentes emulsificantes e
ainda obter a filtração em filtros de esterilização de 0.25 uM.
4.3.2 Nanoemulsões
Nanoemulsão do óleo de andiroba (Nanoandi 1)
Essa nanoemulsão foi desenvolvida usando-se rotaevaporador para
retirada da acetona, após submeter a nanoemulsão (nanoandi 1) a caracterização
por DLS (Figura 14) detectamos o tamanho das partículas em 559,7 nm), o que leva
a instabilidade. Considerando-se essas observações e a necessidade filtração em
250nM, realizamos mais testes e desenvolvemos outra nanoemulsão (nanoandi 2).
Nanoemulsão do óleo de andiroba (Nanoandi 2)
A segunda nanoemulsão foi desenvolvida utilizando-se a emulsão 2
(ainda com acetona), acrescentando o aparelho sonicador por três minutos à
metodologia de nanoemulsificação, após a caracterização por DLS detectamos que
o tamanho ideal ainda não havia sido atingido (310,4 nM) (Figura 15). Por isso
desenvolvemos a nanoemulsão 3.
Nanoemulsão do óleo de andiroba (Nanoandi 3)
A nanoandi 3 foi obtida utlizando-se o aparelho sonicador por 35 minutos
como método nanoemulsificador e a emulsão feita sem acetona, sua
caracterização por DLS mostrou que um tamanho menor foi atingido (133,3 nM)
Figura 15. Pela microscopia eletrônica de transmissão confirmamos esse dados
assim como com NTA ( Análise de Nanopartículas por Rastreamento).
A nanoandi 3 foi então utilizada em testes com promastigotas de L.
amazonensis e L. infantum, amastigotas intracelulares de L. amazonensis e L.
infantum, assim como em testes de citotoxicidade em macrófagos e oferecida via
oral em testes in vivo a camundongos infectados com L. amazonensis ou L.
infantum.
Nanoemulsão de copaíba (Nanocopa)
A nanocopa, obtida conforme com método semelhante aquele
desenvolvido para nanoandi 3, foi caracterizada por DLS, NTA e Microscopia
eletrônica de transmissão e observamos que o tamanho das partículas foi de 85nM.
4.4 Caracterização das Nanoemulsões
4.4.1 DLS ( Espalhamento de luz dinâmico)
Antes de iniciar os experimentos com parasitos fizemos uma
caracterização detalhada das nanoemulsões. As medidas de DLS das
nanoemulsões de andiroba foram realizadas para caracterização das mesmas e os
resultados representados na figura 15 e tabela 1. Obteve-se o tamanho das
partículas, assim como parâmetros como Pdi (polidispersão) e potencial zeta para
determinar a respectivamente a dispersão das partículas nas amostras e a carga de
potencial iônico na superfície dessas partículas, mostrando a qualidade da
nanoemulsão, o resultado mostrou que as nanoemulsões Nanoandi 3 e Nanocopa
estavam com estabilidade suficiente para serem utilizadas nos testes com animais e
parasitos .
Nanoandi 1 tamanho 559,7nM
Nanoandi 2- tamanho 310,4 nM
Nanoandi 3 tamanho 110nM
Figura 14. Gráficos obtidos no aparelho de DLS para as nanoemulsões nanoandi1,
nanoandi 2 , nanoandi 3.
Figura 15. Gráfico da Nanocopa obtido em aparelho de DLS .
Os procedimentos de nanoemulsificação de nanocopa mantiveram-se
estáveis.
Os resultados de tamanho, PDI e potencial zeta de nanoandi 3 e
nanocopa, no dia da sua produção, 30, 60 e 90 dias depois são mostrados na tabela
1. Os dados comprovam a estabilidade de ambas, pois são semelhantes em todos
os tempos medidos.
Nano
Andi 3
Dias Tama
nho
PDI Zeta Nano
copa
Dias Tama
nho
PDI Zeta
0 88,23 0,18 -1,55 0 74,8 0,156 -2,55
87,07 0,168 -3,71 75,12 0,148 -2,05
89,23 0,151 -6,49 75,58 0,132 -3,05
30 88,2 0,158 -3,86 30 78,35 0,132 -2,79
89,77 0,16 -5,57 78,35 0,155 -4,85
88,44 0,171 -9,28 80,2 0,169 -6,27
60 92,2 0,207 -2,32 60 79,07 0,111 -1,95
92,72 0,194 -3,1 78,07 0,145 -2,66
92,86 0,164 78,62 0,131 -5,99
90 93,06 0,21 -2,76 90 80,39 0,139 -1,92
92,27 0,19 -2,54 80,55 0,14 -5,11
92,19 0,192 -8,39 79,25 0,132 -8,09
Tabela 1. Medidas por DLS de nanoandicopa e nanoandi 3.
4.4.2 Análise de Nanopartículas por Rastreamento (NTA)
Essa técnica foi utilizada a fim de confirmar os resultados obtidos por
DLS. Os dados obtidos pela caracterização por NTA foram comprobatórios e
repetiram o resultado de tamanho das amostras obtidos por DLS tanto para
nanopartículas de nanocopa como de nanoandi 3 (Figuras 16 e 17).
Nanocopa
Figura 16. Medida do tamanho das nanopartículas da nanoemulsão de
Copaíba, contendo a maioria das partículas no tamanho médio de 80nm
aproximadamente, compatível com o dado fornecido pelo DLS.
Nanoandi 3
Figura 17. Medida do tamanho das nanopartículas da nanoemulsão de
andiroba, contendo a maioria das partículas no tamanho médio de 90nm
aproximadamente, compatível com o dado fornecido pelo DLS.
Na figura 18 observa-se a aparência de distribuição das amostras. Tanto
nanocopa como nanoandi 3 são homogeneamente distribuidas. Além dos gráficos
representativos das medidas das nanopartículas fornecido pelo aparelho NTS,
ilustrados acima, na figura 16 e na figura 17, o aparelho nos fornece mais
informações importantes, entre elas um vídeo das partículas em momento real
enquanto essas passam pela câmera para serem analisadas conforme ilustrado um
momento do vídeo fotografado e registrado na figura 18.
Nanocopa Nanoandi 3
Figura 18. Imagens de parte do vídeo obtidas em aparelho NTS.
Essas imagens foram obtidas do vídeo de 10segundos fornecido pelo
aparelho para registro ilustrativo da aparência de distribuição das amostras. No
vídeo acompanhamos também o movimento browniano das partículas, o que é
utilizado para as medidas de tamanho assim como a distribuição e homogeneidade
da amostra.
Através das técnicas de caracterização acima, pudemos verificar a
qualidade das nanoemulsões, como tamanho das nanopartículas, homogeneidade,
distribuição e potencial zeta, verificando-se a estabilidade das mesmas, podendo-se
utilizá-las para os testes in vitro com os parasitos e in vivo com os camundongos.
4.4.3 Microscopia eletrônica de transmissão das nanoemulsões
As nanoemulsões foram preparadas conforme protocolo descrito no item
3.11 de Materiais e Métodos, e submetidas a caracterização por imagem de
microscopia eletrônica de transmissão.
Nas micrografias registradas da amostra de nanoemulsão de andiroba,
nanoandi 3 (Figura 19), pode-se perceber uma imagem escura no centro de cada
partícula, sugerindo a presença de conteúdo sólido, como acontece no caso das
partículas nanolipídicas sólidas, o que é compatível com a constituição desse óleo.
Figura 19. Micrografia de nanoemulsão de andiroba nanoandi3. Fotografias
registradas em Microscópio Eletrônico de Transmissão. (A) 27800x (B) 77500 x (C)
Conforme barra de escala , podemos notar que o tamanho é compatível
com as outras caracterizações (DLS e NTA) além de confirmar o formato
arredondado das nanopartículas.
A B C
Figura 20. Micrografia das amostras de nanoemulsão de copaíba, nanocopa, em
vários aumentos (20 A)- 167000x; (20 B)- 100000x e (20 C)- 77500 x.
As imagens obtidas confirmaram a forma arredondada da nanoemulsão
de copaíba.
4.5 Toxicidade de emulsões em promastigotas de L. infantum
Quando testamos a toxicidade de emulsões feitas com propilenoglicol
(2%), metilparabeno (0,2%), álcool cetoestearílico etoxilado (Emulgin B2, a 1%),
propilparabeno (0,1%), BHT (0,1%), álcool cetílico (1%) e álcool estearílico (2%) e
óleo de andiroba (10%) juntamente com meio Schneider´s em promastigotas de L.
infantum, observamos na figura 21A que o tratamento com emulsão de andiroba nas
concentrações de 12,5µL e 25µL/mL, durante 48 horas, resultou em reduzida taxa
de proliferação (50% menos do que aquela observada em promastigotas cultivados
apenas em meio de cultura). Entretanto, observamos que a emulsão controle (sem
óleo de andiroba) (Figura 21B) também foi tóxica para os parasitos nas doses
testadas (12,5µL/ml e 25µL/mL).
A B C
Figura 21. Curva de proliferação de promastigotas de L. infantum tratados com
emulsões. (A) Curva de crescimento de promastigotas tratados com emulsão de
andiroba (1,25; 6; 12,5 e 25µL/mL) e controle (sem emulsão) durante 24 e 48 horas.
(B) Curva de crescimento de promastigotas tratados com emulsão controle (sem
óleo de andiroba). Os resultados foram expressos em número de parasitos/ mL.
4.6 Toxicidade de nanoemulsões em promastigotas de L. infantum e
L. amazonensis
Promastigotas tratados com nanoandi 3 em doses acima de 3,12 uL/ml
proliferam menos do que parasitos controle. Quando tratamos promastigotas de L.
amazonensis, notamos que doses maiores que 6,25 uL/mL também prejudicam a
proliferação dos parasitos. Em relação a nanocopa observamos que doses iguais ou
maiores que 0,2 ul/mL prejudicam a proliferação de L. infantum e doses iguais ou
maiores que 0,1 ul/mL alteram a proliferação de promastigotas de L. amazonensis.
As doses acima de 12,5 µL de nanoandi3 /mL de meio, ou 1 µL/mL de nanocopa
tiveram efeito na proliferação dos promastigotas semelhante a um medicamento
usado na clinica, a anfotericina B (0,3 µg/mL). (Figura 22 A).
As IC50 foram obtidas, baseando-se nos dados da figura 22. Os
resultados de IC50, isto é, a dose necessária para eliminar metade dos
promastigotas, variou tanto em relação ao tempo como a espécie do parasito
testada. Nanoandi 3 é mais eficiente em 48 horas para promastigotas de L.
amazonensis e igualmente tóxica em 24 e 48 horas para L. infantum. A IC50 de
Promastigotas de L.infantum + segunda
emulsão de andiroba
A B
nanoandi 3 às 48 horas de tratamento para as duas espécies varia de 2,6 a 3,2 para
L. amazonensis e L. infantum, respectivamente e a IC50 de nanocopa é similar para
as duas espécies tanto em 24 como em 48 horas de tratamento (0,18 a 0,2 uL/mL)
(Tabela 2).
Promastigotas L. infantum +
nanoandi 3
Promastigotas L. infantum +
nanocopa
A
B
Promastigotas L. amazonensis +
nanoandi 3
Promastigotas L. amazonensis +
nanocopa
C
D
Figura 22. Curva de proliferação de promastigotas de Leishmania tratados com
nanoemulsões. (A) L. infantum tratados com nanoandi 3, (B) L. infantum tratados
com nanocopa, (C) L. amazonensis tratados com nanoandi 3, (D) L. amazonensis
tratados com nanocopa (E) L. amazonensis tratados com controle sem os óleos
(TS). Os controles foram: nanoemulsão TS ( sem óleo, apenas Tween80 e span 80
em meio de cultura) e Anfotericina B (0,3 µg/mL). Os resultados foram expressos
em número de promastigotas/ mL.
Promastigotas L. infantum +
TS
E
Tabela 2 - IC50 das nanoemulsões Nanoandi3 e Nanocopa
IC50 24hs 48hs
Nanoandi + L. amazonensis 5,9µL 2,6 µL
Nanoandi + L. infantum 3,63 µL 3,2 µL
Nanocopa + L. amazonensis 0,16 µL 0,18 µL
Nanocopa + L. infantum 0,18 µL 0,2 µL
Cálculo de IC 50 das nanoemulsões nanocopa ou nanoandi para promastigotas
cultivados 24 e 48 horas a 26oC. Os parasitos foram contados em câmara de
Neubauer. Foi utilizado o programa Originlab 8.5 ®.
4.7 Microscopia eletrônica de varredura dos promastigotas (MEV)
Alterações morfológicas dos promastigotas de L. amazonensis e L.
infantum tratados com as nanoemulsões em doses e tempos diferentes foram
avaliadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Os resultados de MEV
mostraram que a nanoemulsão de andiroba nanoandi3 assim como a nanocopa, nas
doses utilizadas, induziram a retração celular e arredondamento nos promastigotas
tratados, que tornaram-se significativamente menores e com deformidades celulares
e em flagelo. Essas alterações mostraram ser dose e tempo dependentes (Figura
23).
Figura 23. (A) e (B) promastigotas de L. infantum sem tratamento ; (C) e (D)
promastigotas de L. amazonensis sem tratamento; (E) e (F) promastigotas de L.
infantum + 2µL de nanoandi/mL (24hs); (G) e (H) promastigotas de L. amazonensis
+ 2µL de nanoandi/mL (24hs); (I) e (J) promastigotas de L. infantum 2µL de
nanocopa/mL (24hs); (K) e (L) promastigotas de L. amazonensis + 2µL de
nanocopa/mL (24hs); (M) e (N) promastigotas de L. infantum + 10µL de nanoandi/mL
(24hs); (O) e (P) promastigotas de L. infantum + 10µL de nanoandi (1h);(Q)
promastigotas de L. amazonensis + 2µL de nanocopa/mL (1h). Diversos aumentos,
(barras de medida nas figuras)
Nota-se que promastigotas de L. infantum tratados com 2 µL de
nanoandi/mL, (dosagem abaixo da IC 50 )(Figura 23 E e F) durante 24 hs
apresentam visível redução de tamanho e alteração do formato quando comparados
com o controle sem tratamento (Figura 23 A e B). Promastigotas de L. amazonensis
expostos ao mesmo tratamento apresentam alteração na morfologia e tamanho
celular (Figura 23 C), sendo alguns vistos com forma arredondada e tamanho
reduzido (Figura 23 D).
Quando tratados com 2µL de nanocopa/mL ( IC 50 para nanocopa em
L.amazonensis e L.infantum), em 1h em L.amazonenis (Figura 23 Q) já percebemos
alterações de tamanho e formato (menor e arredondado); em 24 hs nos
promastigotas de L. infantum (Figura 23I e J) e L. amazonensis (Figura 23 K e L)
vemos deformidades celulares.
Ao tratar os parasitos com a dose 10µL /mL de nanoandi, sendo bem
acima da IC50, os parasitos apresentam deformidades mais acentuadas quando
comparados aos grupos controle sem tratamento e aos tratados com as
nanoemulsões após 1 h de tratamento (Figura 23 O e P) em 24 hs (Figura 23 M e
N).
4.8 Toxicidade das nanoemulsões em macrófagos
Considerando-se os resultados positivos obtidos com as nanoemulsões
em promastigotas, avaliamos a toxicidade em macrófagos, célula hospedeira de
Leishmania. Na figura 24 observamos que a nanoemulsão nanoandi3, nas
dosagens de 1 e 2 µL/mL não são tóxicas para os macrófagos, assim como a
nanocopa, na dosagens de 0,1 e 0,3µL/mL. As dosagens de 3 µL/mL da nanoandi e
de 0,9µL/mL da nanocopa tiveram toxicidade comparável a do medicamento controle
anfotericina B.
A
Figura 24. Toxicidade de nanoemulsões em macrófagos peritoneais murinos.
Macrófagos peritoneais de camundongos Balb/c foram cultivados com
nanoemaulsões em diferentes dosagens (µL) durante 24hs e as células contadas
como descrito em Materias e Métodos. Andi 1, 2 e 3 correspondem as
concentrações 1 uL, 2uL e 3uL de nanoandi, respectivamente. Anfo = anfotericina b
Nanocopa 0,1; 0, e, 0,9 correspondem as concentrações de 0,1 uL, 0,2 uL, 0,9
uL.23B, 23C. A nanoemulsão controle TS (Apenas Tween 80 e Span80 sem óleo)
em diferentes dosagens em µL.
B
C
4.9 Toxicidade das nanoemulsões em amastigotas intracelulares
Foram realizados testes de toxicidade usando-se as nanoemulsões em
macrófagos infectados com amastigotas intracelulares de L. infantum e L.
amazonensis, e os resultados de taxa de infecção foram estatisticamente
comparadas com os controles (sem tratamento), usando-se o teste ANOVA com
(Figura 25).
Figura 25. Toxicidade de nanoemulsões em macrófagos peritoneais murinos
infectados com amastigotas intracelulares de L.amazonensis ou de L. infantum. Nas
figuras 25 A, B, C e D os macrófagos foram infectados com L.amazonensis e nas
figuras 25 E e F, G e H e 25 I e J os macrófagos foram infectados com L. infantum.
Os astericos(*) indicam as dosagens que apresentaram diferenças estatísticas
comparando-se grupos tratados com as nanoemulsões com os grupos de controles
sem tratamento (teste ANOVA, p 0,05).
Nas células infectadas com L. amazonensis nota-se redução de carga
parasitária quando tratadas com doses de 3uL de nanoandi3/mL (Figura 25 A e B) e
de 0,9 uL de nanocopa/mL (Figura 25 C e D). Nas dosagens de 3uL/mL de nanoandi
3 (Figura 25 B) e 0,9uL/mL de nanocopa (Figura 25D) existe a redução da carga
parasitária semelhante a que ocorre com o medicamento anfotericina B nos
macrófagos infectados com L. amazonensis. Nas dosagens acima de 2uL de
nanoandi3 ( Figura 25 E e F) e de 0,3uL de nanocopa ( Figura 25 G e H), podemos
houve redução da carga parasitária nos macrófagos infectados com L.infantum.
Os testes realizados com o controle somente com tween e span, sem os
óleos, mostram que os resultados obtidos nas dosagens testadas são referentes aos
princípios ativos dos óleos e não aos agentes emulsificantes (Figura 25 I e J).
As imagens das lâminas com os macrófagos foram observadas em
microscópio óptico e as micrografias mais representativas desses macrófagos
infectados estão expostas na figura 26 (L. infantum) e na figura 27 (L. amazonensis).
Nota-se o aspecto espraiado dos macrófagos e vários amastigotas em
culturas não tratadas (Figura 26B).
Na figura 26 C observamos macrófagos com aspecto distorcido porém
ainda a presença de amastigotas em culturas tratadas com anfotericina B (30
µg/mL).
Nota-se nas figuras 26 F e 26 G que a nanoemulsão nanoandi3, nas
dosagens de 1 e 2 µL/mL não são tóxicas para os macrófagos, preservando o
aspecto espraiado das células.
Nas figuras 26 I e 26 J, macrófagos tratados com nanocopa na dose de
0,1 e 0,3 µL/mL respectivamente apresentaram aspecto preservado de morfologia.
Figura 26. Micrografias de macrófagos infectados com amastigotas intracelulares de
L.infantum frente a diferentes tratamentos. (A) macrófagos peritoneais não
infectados e não tratados, (B)- macrófagos infectados e não tratados, (C)-
macrófagos infectados e tratados com anfotericina B, (D)-macrófagos infectados e
tratados com 6,25µL de nanoemulsão controle TS, (E)-macrófagos infectados e
tratados com 12,5 µL de nanoemulsão controle TS, (F)- macrófagos infectados e
tratados com 1 µL de nanoandi 3, (G)- macrófagos infectados e tratados com 2µL de
nanoandi 3, (H)- macrófagos infectados e tratados com 3µL de nanoandi 3, (I)-
macrófagos infectados e tratados com 0,1µL de nanocopa, (J)- macrófagos
infectados e tratados com 0,3µL de nanocopa, (K)-macrófagos infectados e tratados
com 0,9µL de nanocopa. Aumento de 400X.
Podemos notar que macrófagos infectados com L. amaozonensis e
tratados com as nanoemulsões nas dosagens de 2µL de nanoandi (Figura 27 C) ou
de 0,3µL de nanocopa (fig 27 F) tem a estrutura preservada. Já na imagem do
tratamento com anfotericina há uma perda da morfologia das células (fig 27 G).
Figura 27. Micrografias de amastigotas intracelulares de L.amazonensis frente a
diferentes tratamentos.A- macrófagos infectados e não tratados, B- macrófagos
infectados e tratados com 1 µL/mL de nanoandi 3, C- macrófagos infectados e
tratados com 2µL/mL de nanoandi 3, D- macrófagos infectados e tratados com
3µL/mL de nanoandi 3, E- macrófagos infectados e tratados com 0,1µL/mL de
nanocopa, F- macrófagos infectados e tratados com 0,3µL/mL de nanocopa, G-
macrófagos infectados e tratados com 0,9µL/mL de nanocopa. Aumento de 400X.
4.10 Testes in vivo
Os dados dos experimentos in vitro mostraram que as nanoemulsões têm
efeitos tóxicos tanto em promastigotas quanto em amastigotas intracelulares das
duas espécies de Leishmania. Assim, o próximo passo foi avaliar o efeito das
nanoemulsões em modelo animal.
Camundongos Balb/c foram infectados com L. amazonensis e então
tratados oralmente com as nanoemulsões e um dos grupos, exposto a HBO. Na
figura 28 observa-se que animais não tratados apresentam lesões que aumentam
com o tempo. Animais tratados com nanocopa têm lesões menores que aquelas do
controle durante várias semanas do monitoramento. O controle positivo, a
miltefosine, fármaco usado na clinica, controlou eficientemente o desenvolvimento
da lesão. Os animais tratados com nanoandi 3 não apresentaram redução no
tamanho das lesões, entretanto o tratamento conjunto nanoandi 3 e HBO foi efetivo
na redução do tamanho.
Figura 28 A, 28B e 28C. Curso da infecção de L. amazonensis em camundongos
Balb/c. Animais foram infectados no coxim plantar com L amazonensis. Os animais
foram: (A) tratados com nanocopa oralmente, miltefosine (0,5mg/30µL) ou não
tratados (controle). (B) tratados com nanoandi 3 oralmente, miltefosine ou não
tratados. (C) tratados com nanoandi e exposto a HBO, controle (não tratados e não
expostos a HBO ou tratados com nanocopa oralmente e expostos a HBO. As patas
com lesão foram medidas com paquímetro, semanalmente durante 7 semanas. As
flechas indicam os dias de início do tratamento com as nanoemulsões (azul), com
miltefosine (vermelha) e exposição a HBO (verde).
Figura 29. Carga parasitária de lesões de camundongos Balb/c infectados com L.
amazonensis. O número de amastigotas foram contados após serem coletados das
lesões das patas dos camundongos de diferentes grupos após 60 dias da infecção
(andi = nanoemulsão nanoandi3; andi+HBO = nanoandi3 e exposição a HBO; copa
= nanoemulsão nanocopa; copa+HBO = nanocopa e exposição a HBO, ; Milte=
miltefosine, HBO = hiperbárica; sem trat = sem tratamento,(*) Resultados
significativos de redução de carga parasitária, analisados pelo teste ANOVA
comparando os grupos tratados com o controle sem tratamento 05.
Os animais inoculados com L. amazonensis na pata direita traseira foram
tratados com nanoemulsões e ou expostos a HBO; observamos na Figura 29 que há
queda da carga parasitária nas patas em animais tratados com as nanoemulsões via
oral, quando comparados aos grupos sem esse tratamento, com o p=0,012 para
nanocopa, p=0,016 para nanocopa+HBO e p=0,005 para nanoandi, p=0,005 para
nanoandi+HBO.
Observa-se aos 30 dias de infecção que animais tratados com nanoandi
(Figura 30 A) e nanocopa (Figura 30 E) têm lesões menores que aquelas do controle
sem tratamento.
* *
*
*
O controle positivo, a miltefosine, fármaco usado na clinica, controlou
eficientemente o desenvolvimento da lesão após 30 dias de tratamento oral (Figura
30 N).
Comparando-se aos 30 dias de infecção, as lesões de animais tratados
com nanocopa e HBO (Figura 30 G) com animais não tratados (Figura 30 I) percebe-
se o aspecto diferenciado da lesão.
O tratamento somente com HBO sem as nanoemulsões não foi efetivo no
controle da lesão.
Figura 30. Evolução da leishmaniose cutânea experimental. Camundongos BALB/C
Infectados com 1X106 promastigotas de L.amazonensis, coxim plantar, membro
posterior direito, fotografados aos 30 e 60 dias após a infecção. Os animais foram
tratados com nanoemulsão de andiroba (nanoandi3) (A- 30 dias)(B- 60 dias),
nanoandi3 + HBO (C- 30 dias)(D- 60 dias), nanoemulsão de copaíba (nanocopa)
(E 30 dias)(F- 60 dias), nanocopa + HBO (G- 30 dias)(H- 60 dias) , sem
tratamento (I- 30 dias)(J- 60 dias) , tratado somente com HBO (K- 30 dias)(L- 60
dias), tratados com miltefosine (M- 30 dias)(N- 60 dias).
Quando animais inoculados com L. infantum, espécie que causa infecção
visceral, foram tratados com nanoemulsões e ou expostos a HBO, como visto na
figura 31 A, não houve diferença estatística de peso entre os grupos de animais
tratados e não tratados, o que indica que o tratamento não é tóxico aos animais não
causando queda de peso nem redução na alimentação. Cada grupo teve n=4, a
diferença estatística comparando cada grupo tratado com o grupo controle não
tratado foi de p=0,07.
Figura 31. Peso dos camundongos infectados por L infantum ( A ), e respectivos
órgãos (baço- B e fígado C) em grupos tratados com nanoandi3 e nanocopa e
comparados aos grupos controles.
Ao comparar o peso dos órgãos de animais tratados com o de animais do
grupo controle não tratado, cada grupo com n=4, usando-se ANOVA, o p = 0,1 para
peso de baço e p=0,06 para peso de fígado, mostra que a diferença entre os grupos
não foi significativa.
Ao comparar a carga parasitaria de animais infectados com L.infantum e
tratados com as nanoemulsões juntamente com HBO, ou não, observamos na figura
32, que a carga parasitária no baço e figado em animais tratados com as
nanoemulsões via oral, foi significativamente reduzida quando comparamos com
animais não tratados com n=4 para cada grupo e p=0,00 para nanocopa, com e
sem exposição a HBO, assim como para nanoandi3. A exposição a HBO juntamente
com o tratamento com nanoemulsões reduziu a carga parasitária tanto no baço
como no figado quando comparamos com animais apenas expostos a HBO.
Figura 32. Carga parasitária de L. infantum em baço (A) e em fígado figura (B) nos
diferentes grupos do experimento in vivo com L.infantum e nanoemulsões. (*) Os
dados de significância para os resultados de carga parasitária foram analisados pelo
teste ANOVA com comparando os grupos tratados com o controle sem
tratamento.
* * * * ** *
*
A B
4.11 Histologia
4.11.1 Análise histológica de camundongos infectados com
L.amazonensis
Com o objetivo de avaliar o efeito do tratamento com diferentes
nanoemulsões em camundongos susceptíveis BALB/c infectados com L.
amazonensis, as lesões foram processadas em parafina e coradas pelo método de
Hematoxilina e Eosina.
Lesões de camundongos BALB/c infectados após 8 semanas
apresentaram tecido conjuntivo com uma grande quantidade de macrófagos com
vacúolos parasitóforos contendo amastigotas além da presença de infiltrado
inflamatório. Nestas lesões, também observamos adipócitos e tecido muscular na
região subcutânea.
Figura 33. Histologia de cortes das patas de camundongos, infectadas com L.
amazonensis e tratados com nanoemulsão de andiroba nanoandi3 (A), nanoemulsão
de copaíba nanocopa (B), miltefosina (C), não tratados (D) e não infectados (E).
Fotomicrografias feitas com aumento de 400X em microscópio óptico. Amastigotas
em vacúlos parasitóforos(seta). Células inflamatórias (*).
* *
No material coletado de lesão de camundongos tratados com nanoandi 3
(Figura 33A) foi observada a presença de grande quantidade de células
inflamatórias junto a macrófagos infectados diferente do controle não tratado (Figura
33D). Podemos ver células com vacúolos parasitóforos e amastigotas no interior de
macrófagos locais.
Animais tratados com nanocopa (33 B) apresentaram também células
com vacúolos parasitóforos e amastigotas no interior de macrófagos locais (seta).
Nos cortes histológicos das patas dos animais tratados com miltefosina
(Figura 33 C) podemos observar uma camada ampla de tecido conjuntivo fibroso,
com intenso infiltrado de células linfocitárias em tecido subcutâneo além de células
de musculatura, porém ainda apresenta parasitos em vacúolos parasitóforos de
macrófagos locais.
Em lesões de animais não tratados infectados com L. amazonensis
(Figura 33 D) observa-se a desorganização do tecido conjuntivo, tecido conjuntivo
não vascularizado e apresentando muitos macrófagos infectados com amastigotas
(seta).
Corte histológico de pata de camundongo sem infecção (Figura 33 E.),
mostrando a organização de tecido epitelial e conjuntivo de um animal normal (seta).
4.11.2 Análise histológica de camundongos infectados com
L.infantum
Visando avaliar o efeito do tratamento com diferentes nanoemulsões, em
conjunto ou não com HBO, em camundongos susceptíveis BALB/c, infectados com
L. infantum, as secções do baço e do fígado (órgãos alvo desse parasito) foram
processados em parafina e corados com Hematoxilina e Eosina (Figuras 34 e 35).
Camundongos BALB/c às 8 semanas após infecção apresentam
granulomas em órgão alvo como baço. Observa-se também no baço, a presença de
um intenso infiltrado de células inflamatórias, além de tecido conjuntivo fibroso e
desorganização das células.
Figura 34. Fotos dos cortes histológicos do baço de camundongos não infectados e
não tratados, infectados com L. infantum não tratados, tratados oralmente: apenas
com Tween e Span (TS), com nanocopa ou nanoandi juntamente com HBO ou sem
HBO. (A) não infectado e não tratado, (B)- camundongo não infectado e tratado com
nanoandi 3, (C)- não infectado e tratado com nanocopa, (D)- infectado com L.
infantum e não tratado, (E)- infectado com L. infantum e tratado com nanoandi 3, (F)-
infectado com L. infantum e tratado com nanoandi3 +HBO, (G)- infectado com L.
infantum e tratado com nanocopa, (H)- infectado com L. infantum e tratado com
nanocopa+ HBO, (I)- infectado com L. infantum e tratado com nanoemulsão controle
TS, (J)- infectado com L. infantum e tratado com nanoemulsão controle TS+ HBO,
(K)- infectado com L. infantum e tratado apenas com HBO. Micrografias realizadas
em microscópio óptico Zeiss, aumento de 400X. (FL) folículo linfóide, (+) infiltrado de
células inflamatórias. (setas) granulomas.
Com relação aos efeitos dos tratamentos propostos, verificou-se que os
animais tratados, tanto com as nanoemulsões em conjunto com HBO ( Figura 34 F
e 34 H) quanto os apenas tratados com as nanoemulsões( Figura 34 E e 34 G),
mesmo os sem infecção e tratados com as nanoemulsões (Figura 34 B e 34 C)
apresentaram maior infiltrado de células inflamatórias.
Foi observada com maior evidência folículo linfóide (LF) no baço de
animais tratados apenas com controle sem os óleos (TS) juntamente com HBO
(Figura 34-J). Já a desorganização tecidual foi vista mais frequentemente nos
animais infectados e não tratados, ou apenas tratados com Tween e Span quando
comparados com os animais controle não infectados ou tratados com as
nanoemulsões.
Quando se comparou fígado de animais controle infectados com os
controles não infectados e animais tratados com as nanoemulsões, verificou-se com
maior freqüência nos infectados sem tratamento ou apenas tratados com TS
(nanoemulsão controle sem os óleo) hiperemia, congestão vascular, células
dilatadas e vacuolisadas com aspecto granuloso, inflamação e reação
granulomatosa.
Nos animais não infectados e não tratados (Figura35 A) assim como nos
apenas tratados, porém sem infecção (Fig 35B e 35C) notamos a vascularização
assim como a estrutura do órgão preservados, sem o aspecto hipertrófico e
vacuolizado das células, notado nos casos dos animais infectados.
Figura 35. Fotos realizadas dos cortes histológicos do fígado de camundongos não
infectados e não tratados, infectados com L. infantum não tratados, tratados
oralmente: apenas com Tween e Span (TS), com nanocopa ou nanoandi juntamente
com HBO ou sem HBO. (A) não infectado e não tratado, (B) não infectado e tratado
com nanoandi, (C)- não infectado e tratado com nanocopa, (D)- infectado com
L.infantum e não tratado, (E)- infectado e tratado com nano andi, (F)- infectado e
tratado com nanoandi +HBO, (G)- infectado e tratado com nanocopa, (H)- infectado
e tratado com nanocopa+ HBO, (I)- infectado e tratado com nanoemulsão controle
TS, (J)- Corte histológico de fígado de camundongo infectado e tratado com
nanoemulsão controle TS+ HBO, (K)- Corte histológico de fígado de camundongo
infectado e tratado apenas com HBO. Aumento 400X. (*) congestão vascular.
(círculo vermelho) células dilatadas e vacuolisadas com aspecto granuloso. (SETA)
inflamação e reação granulomatosa.
Uma das lesões observadas com maior frequência neste estudo em
animais infectados foi a degeneração hidrópica, também chamada de degeneração
vacuolar, caracterizada pelo acúmulo citoplasmático de água e eletrólitos, deixando
as células com citoplasma claro à coloração histológica, com aspecto granuloso e
alteração da proporção citoplasma/núcleo, (destaque dado como exemplo em
detalhe circulado em vermelho, animais infectados e não tratados (Figura 35 D),
semelhante com o descrito por COELHO (2011).
Nos cortes de fígado de animais infectados e tratados com nanocopa e
expostos a HBO (Figura 35 H) notamos a morfologia do órgão semelhante à vista
em animais sem infecção (Figuras 35 A, B ou C).
Um dos parâmetros utilizados para se verificar se houve alguma
toxicidade nos animais com os tratamentos propostos no presente estudo foi a
histologia dos órgãos como fígado, baço, estômago, intestino e rim (o baço e fígado
foram mostrados nas figuras 34 e 35).
Não foi notada alteração de tecido de estômago em animais tratados com
nanoandi3 (figura 36 B) ou com nanocopa (figura 36 C) quando comparados com
grupo controle não tratado (Figura 36 A).
O estômago dos animais tratados com miltefosina (Figura 36 D)
apresentou vilosidades de tamanho reduzido, aumento de tecido glandular e
camada de muco mais acentuada quando comparados com os outros grupos,
indicando atividade secretora mais intensa deste órgão, o mesmo que ocorre em
algumas gastropatias conforme descrito por outros autores (RODRIGUES, 2008).
Tanto o intestino delgado (figuras 36 E, F, G e H) como o rim ( figuras 36
I, J, K e L) de animais tratados com as nanoemulsões nanandi3 ou nanocopa ou
tratados com o medicamento miltefosina não apresentaram alterações histológicas
quando comparados ao grupo controle sem tratamento.
Figura 36. Fotos realizadas dos cortes histológicos de estômago, intestino e rim de
camundongos sem tratamento ou tratados oralmente com nanocopa (, nanoandi3 ou
miltefosina (20mg/Kg). (A) estômago não tratado, (B) estômago tratado com
nanoandi, (C)- estômago tratado com nanocopa, (D) estômago tratado com
miltefosina, vilosidades de tamanho reduzido (*), aumento de tecido glandular
(SETA) e camada de muco mais acentuada (+) , (E)- intestino não tratado, (F)-
intestino tratado com nanoandi, (G)- intestino tratado com nanocopa, (H)- intestino
tratado com miltefosina, (I)- rim não tratado, (J)- rim tratado com nanoandi, (K)- rim
tratado com nanocopa (L) rim tratado com miltefosina. Micrografias registradas em
microscópio óptico Zeiss, aumento 400X.
5- DISCUSSÃO
Os estudos científicos são de grande importância para validar o uso das
plantas como terapia e desenvolver novos fármacos na busca do alívio de doenças
que acometem a população (RODRIGUES, 2009). Devido à gravidade das lesões
encontradas em pacientes com LC e LV (OMS, 2015), às dificuldades de controle,
prevenção e tratamento das leishmanioses (TEODORO et al., 2006) faz-se
necessária a busca por novos métodos terapêuticos (MIGUEL, 2011). A literatura
cientifica tem apontado o potencial leishmanicida de diversos compostos
provenientes de vegetais (MENNEGUETI et al., 2015), microorganismos,
organismos invertebrados, derivados de outras moléculas ( CROFT et al., 2006),
medicamentos já utilizados na clínica para outras doenças (MIGUEL et al., 2008).
O principal objetivo deste trabalho foi avaliar se tratamentos com óleo de
copaíba ou óleo de andiroba associados ou não a HBO tem efeitos anti-Leishmania
nos modelos in vitro e in vivo da LC e LV.
Primeiramente, esses óleos foram analisados quanto à pureza e
caracterização cromatográfica. Visto que após os óleos serem testados com DMSO
(MIRANDA- JUNIOR, 2010) não formaram emulsões, estes foram também testados
com propilenoglicol, metilparabeno, álcool cetoestearílico, propilparabeno, BHT (do
inglês butylated hydroxytoluene), álcool cetílico e álcool estearílico (FERREIRA,
2010), mas sem resposta satisfatória, devido à falta de estabilidade das emulsões e
toxicidade contra os parasitos. Diante desses resultados, os óleos foram
nanoemulsificados. As vantagens da nanoemulsão relacionam-se ao fato de
poderem ser distribuídos em meios de cultura de maneira uniforme, filtrados para
uso estéril em filtros de 0,22 µm, e usados em tratamento por via oral, com maior
segurança de absorção no trato gastrointestinal e com menor toxicidade aos animais
(WANG et al., 2009).
As nanoemulsões foram desenvolvidas baseando-se em técnicas
descritas previamente (BALDISSERA et al., 2014; BARBOSA, 2013) e adaptadas
para esse trabalho.
A primeira nanoemulsão foi desenvolvida com protocolo semelhante ao
usado para preparação de nanopartículas lipídicas sólidas, técnica alternativa de
encapsular princípios ativos (SOUTO et al., 2011). Inicialmente, devido ao tamanho
das nanopartículas lipídicas formadas serem maiores que 0,22 µm (tamanho dos
poros do filtro para esterilização) e as características como polidispersão (Pdi) e
tensão das partículas (potencial zeta) indicarem pouca estabilidade, decidimos por
desenvolver outras nanoemulsões estéreis e mais estáveis, modificando a
metodologia, aumentando a agitação na fase de emulsificação para agitação
mecânica (ultra-turrax) e ultrassom (3 minutos). Ainda assim, as nanopartículas que
se formaram, não chegaram às medidas desejadas. Modificamos novamente a
metodologia, retirando a fase de dissolução do lipídeo em solvente (acetona),
portanto, sem a necessidade do rotavapor, e aumentando o tempo de ultrassom.
Nesse protocolo a emulsão foi agitada em alta velocidade (10.000 rpm, 3 min) e a
emulsão foi submetida à ultrassom por 30 minutos (BARBOSA, 2013). Desta forma
foram obtidas as nanoemulsões com tamanho (de 70 a 110nm) e estabilidade
desejados.
A primeira técnica de caracterização usada nas nanoemulsões foi a de
espalhamento de luz dinâmico (DLS), obtendo-se por esse método resultados de
tamanho (pela média das partículas analisadas), polidispersão e potencial zeta das
partículas (GUILHERME, 2014). Com as medidas de tamanho, Pdi e potencial Zeta
alcançados, nossas amostras têm estabilidade compatíveis com a descrita na
literatura de nanocompostos em que se utilizaram óleos. Por exemplo, o trabalho de
Pires et al., que desenvolveram microemulsões de óleos essenciais obtidos a partir
das espécies Cymbopogon citratus e Cymbopogon nardus para testes em L.infantum
(PIRES et al., 2015).
Outra técnica usada para a obtenção das imagens das nanopartículas e
comparação de tamanho, foi a microscopia eletrônica de transmissão (RAIDAC et
al., 2015). Nas imagens da nanocopa observam-se partículas de 80nm, e partículas
menores de até 5nm, incompatíveis com os dados de DLS. Esses dados sugerem
que ocorreu alteração das partículas durante a preparação das lamínulas ou que as
partículas realmente eram menores do que as vistas no DLS. Nas imagens da
nanoandi3, foram observadas partículas com dispersão e tamanho homogêneos e
compatíveis com os dados obtidos pela técnica de DLS, e posteriormente
confirmados por NTA, de aproximadamente 80nm.
Um terceiro método de caracterização para a medição e confirmação do
tamanho de partículas e distribuição dos nanomateriais em suspensão foi a análise
de rastreamento de nanopartículas (NTA) (RIBEIRO, 2016). O NTA origina dados
das propriedades de dispersão de luz e o movimento browniano individual de cada
partícula, a fim de obter o diâmetro das partículas (RIBEIRO, 2016). Confirmando o
tamanho das nanoemulsões (nanocopa e nanoandi3) inferiores a 0,22µm de
tamanho. Oliveira et al. com métodos diferentes de emulsificação, e com diferentes
concentrações de tensoativos com os óleos de copaíba e de andiroba, usaram o
método de NTA de medida de tamanho dos glóbulos e observaram tamanhos de
175 a 3000nm (OLIVEIRA et al., 2008). Em nosso trabalho, conseguimos obter os
tamanhos de 80nm para a nanocopa e nanoandi3. Assim como os autores
observamos que as medidas com NTA foram compatíveis com dados obtidos por
outras técnicas de caracterização de nanomateriais, como o DLS e e no caso da
nanoandi, compatíveis com as fotos da microscopia eletrônica de transmissão.
Após esses testes com as amostras das nanoemulsões nanoandi3 e
nanocopa, comprovou-se que as mesmas tinham tamanho adequado e eram
estáveis o suficiente para utilização dos óleos de copaíba e andiroba em forma de
nanocompostos em testes in vitro e in vivo de LC e LV.
As formulações utilizadas nesse trabalho contém 10% de óleo de copaíba
ou de andiroba em água, ou seja, em volume de 1mL da nanoemulsão tem 100mg
de óleo de copaíba ou de óleo de andiroba, porcentagem semelhante a trabalhos
que também utilizaram esses óleos (BALDISSERA et al., 2014). As dosagens das
nanoemulsões utilizadas em nossos experimentos in vitro e in vivo são expressas
os dados obtidos utilizando esse
volume das nanoemulsões com os dados obtidos utilizando o mesmo volume do
controle feito apenas com os agentes emulsificantes (Tween e Span), sem os óleos.
Em nosso trabalho, pudemos observar que a IC 50 da nanoemulsão de
copaíba em promastigotas de L.amazonensis é de 0,18 µL/mL, contendo 18 µg do
óleo de copaíba/mL. Santos et al., em outro trabalho, observou que óleos de 9
espécies copaiba emulsificados com DMSO, tiveram efeito tóxico em promastigotas,
sendo mais efetivo o óleo de C. reticulata, proveniente do Acre, sendo a IC50 para
promastigotas de L. amazonensis, a dose de 5µg/mL (SANTOS et al., 2013).
Observamos que o uso de DMSO não foi adequado para emulsificação do óleo de
copaíba, obtivemos emulsões instáveis.
As culturas de promastigotas usadas nos tratamentos com as
nanoemulsões foram com parasitos recém cultivados e diferenciados. As IC50 de
nanoandi foram de 5,9µL/mL às 24 hs para promastigotas de L. amazonensis e de
3,63µL/mL para promastigotas de L. infantum. As IC50 de nanocopa foram 0,3µL e
0,18µL/mL para L.amazonensis e L.infantum, respectivamente, no tempo de 48hs.
Os dados indicaram que as doses necessárias para redução da proliferação desses
promastigotas (L. infantum e L. amazonensis) foram menores para a nanocopa. A
L.infantum se mostrou mais susceptível a nanocopa e nanoandi3 em comparação
com a L.amazonensis.
Para registrar as imagens de promastigotas tratados e compará-las a
parasitos não tratados, foi utilizada a técnica de microscopia eletrônica de varredura
(CODONHO, 2014). Pudemos avaliar algumas alterações morfológicas que os
tratamentos causaram nos promastigotas de L.amazonensis e de L.infantum, antes
da morte dos mesmos, como redução de tamanho e formas arredondadas entre
outras deformidades celulares. E pudemos perceber que em apenas 1 hora de
contato com as nanoemulsões, os promastigotas apresentaram alerações
morfológicas, acentuadas com o passar do tempo e/ou aumento das doses. Em um
estudo com óleos de copaíba, as micrografias de microscopia eletrônica também
demonstraram alterações morfológicas, SANTOS et al. (2012) demonstraram que o
tratamento com o óleo de Copaifera reticulata levou a ruptura da membrana
plasmática de promastigotas e amastigotas de L. amazonensis, além disso, foi
demonstrado que o tratamento com o óleo de Copaifera martii induz o aparecimento
de células igualmente aberrantes (SANTOS et al., 2012). Esse foi o único estudo
publicado até hoje, com nanoemulsões de andiroba em promastigotas.
Após os resultados positivos obtidos com as nanoemulsões em
promastigotas, avaliamos a toxicidade em macrófagos, célula hospedeira de
Leishmania, onde observamos que a nanoemulsão nanoandi3, nas dosagens de 1 e
2 µL/mL não são tóxicas para os macrófagos, assim como a nanocopa, na dosagens
de 0,1 e 0,3µL/mL. As dosagens maiores têm toxicidade comparável a do
medicamento controle anfotericina B. De fato, a medicação antileishmania de
indicação na clínica e usada nesse trabalho, como controle, causa lise do parasito,
mas também tem como efeitos adversos em mamíferos febre, calafrios, flebite,
arritmias, mialgia, convulsões, trombocitopenia, anemia e toxicidade renal
(BANETH,2002).
Vimos nesse trabalho, a redução na taxa de infecção em amastigotas
intracelulares L. amazonensis e L. infantum na dose de 3 µL de nanoandi3, contendo
300 µg de óleo de andiroba/mL, semelhante à ação de anfotericina B (na dosagem
de 30 µg/mL. Não foi encontrado na literatura trabalho com esse mesmo óleo ou
fração dele em Leishmania, mas em outro parasito intracelular, como o Plasmodium
falciparum, o mesmo óleo foi utilizado emulsificado em DMSO, induzindo redução da
carga parasitária de 30% (dose de 820µg/mL nas primeiras 24 hs e 8,2 µg/mL após
48hs), isto é maior sensibilidade do parasito ao óleo de andiroba após 48hs . Em
nosso trabalho notamos que com o DMSO, como agente emulsificante para o óleo,
não obtínhamos uma emulsão estável.
Na dose de 0,3µL da nanocopa, contendo 30µg/mL de óleo de copaíba,
vimos a redução da taxa de infecção de macrófagos peritoneais murinos com L.
amazonensis em 30% após 24 hs de tratamento. Na dose de 0,9 µL da nanocopa,
contendo 90µg/mL de óleo de copaíba, de meio, observamos redução de 80% da
infecção, semelhante ao resultado obtido com a anfotericina B. Santos et al.,
avaliando o efeito leishmanicida em amastigotas axênicos, necessitaram de uma
dose de 100 µg/mL de óleo de copaíba com DMSO, para redução da taxa de
infecção em 44,5% em 2 hs de tratamento (SANTOS et al., 2013).
Em relação às culturas de células infectadas com os parasitos é
importante salientar que as taxas de infecção dos macrófagos tanto com L.
amazonensis (aproximadamente 80% de células infectadas, com 5
amastigotas/macrófago) como com L. infantum (aproximadamente 90% de
macrófagos infectados) foram elevadas, e assim podem ter interferido no efeito dos
tratamentos com as nanoemulsões. Não foram testados tratamentos com
nanoemulsões em culturas de macrófagos com taxas mais baixas de infecção, o que
talvez resulte reduções de taxas de infecção ainda mais efetivas dos que as obtidas
nesse trabalho.
Deve-se salientar que nos testes in vitro, a redução da proliferação dos
promastigotas e da taxa de infecção de macrófagos, após os tratamentos com as
nanoemulsões dos óleos de copaíba ou de andiroba foram específicas, pois, as
nanoemulsões controle (apenas com Tween80 e Span 80 sem os óleos) não tiveram
efeito anti-Leishmania. Os dados indicam que há componentes presentes nos óleos
de copaíba ou de andiroba com ação anti-Leishmania. Quais são esses
componentes ainda não se sabe, mas Santos et al. (2013), utilizando ácido
hidroxicopálico e metilcopalato isolados de óleo de copaíba, demonstraram a
inibição da proliferação de promastigotas. Em outro estudo, Santos et al. (2008)
testaram fração do óleo de andiroba rica em limonóides em Plasmodium falciparum
obtendo efeitos promissores ligados a esses limonóides (SANTOS et al, 2008).
Sabe-se que os principais princípios ativos do óleo de andiroba para ação
antinflamatória são os limonóides e triterpenos (TAPPIN, 2008), agem inibindo a
ciclo-oxigenase COX-2, enzima envolvida em respostas inflamatórias. Assim como o
exato mecanismo de ação antinflamatório do óleo é ainda é desconhecido, o mesmo
ainda acontece para o mecanismo anti-Leishmania (SHIN et al., 2005).
Após os testes in vitro, foi avaliada a eficácia dos tratamentos com as
nanoemulsões dos óleos de copaíba e andiroba em camundongos Balb/c infectados
com L. infantum ou L. amazonensis. Os camundongos Balb/c são excelentes
modelos experimentais para estudos sobre leishmaniose (PAIVA et al., 2015 ;
MORAES et al., 2014). Não há dados na literatura avaliando o tratamento por via
oral de nanoemulsão de óleo de andiroba e copaíba, para comparação com os
nossos dados. O tratamento com as nanoemulsões foi eficiente, isto é, os animais
infectados com L. infantum apresentaram diminuição da carga parasitária nos órgãos
alvo, baço e fígado e os animais infectados com L. amazonensis apresentaram
retardo do aparecimento das lesões aos 30 dias.
Assim como em outros estudos usando óleos naturais para tratamento por
via oral em camundongos, por exemplo, Monzote et al., testaram óleo essencial de
Chenopodium ambrosioides (erva de Santa Maria) em camundongos Balb/c
infectados por L.amazonensis (MONZOTE et al., 2007), também em nosso trabalho,
tratamento oral com as nanoemulsões de copaíba ou de andiroba em camundongos
Balb/c infectados com L.amazonensis demonstrou retardar a infecção quando
comparados a controles não tratados, além de reduzir a carga parasitária nas
lesões.
Orgãos como estômago, intestino, baço, fígado, e rim foram
histologicamente analisados, para avaliar a toxicidade dos tratamentos propostos.
Os camundongos oralmente tratados com nanoemulsão de copaíba ou de andiroba
não apresentaram lesões teciduais, indicando que não houve toxicidade, dados
semelhantes foram reportados por Baldissera et al. (2014) em seu experimento
utilizando óleo de andiroba em camundongos infectados com Trypanosoma evansi
(BALDISSERA et al., 2014).
O uso da câmara hiperbárica se mostrou eficaz como adjuvante em nosso
trabalho, pois observamos que ao ser utilizado em conjunto com a nanocopa,
reduziu de forma significativa a carga parasitária no baço dos camundongos
infectados com L.infantum com p = 0,01 quando comparado ao controle. Os motivos
que nos levaram a testar HBO como um tratamento adjuvante foi o trabalho de Ayres
et al. (2007), que avaliou o uso conjunto de HBO com própolis. ARRAIS-SILVA et al.
(2006) verificaram que o tratamento com HBO, retarda o aparecimento das lesões
causadas por L. amazonensis mesmo sem o uso de outro medicamento,
demonstrando efeito anti- Leishmania e de melhora nas condições de cicatrização
das lesões (ARRAIS-SILVA et al., 2006).
O tratamento oral com miltefosina na dose de 20mg/Kg, mostrou-se
eficiente contra L. amazonensis, reduzindo a taxa de infecção nos animais, mas
após 30 dias de tratamento ainda apresentaram parasitos nas lesões,
diferentemente do que foi relatado por Costa-Filho et al.(2008) e Campos et al.
(2008) que não encontraram parasitos nas lesões (COSTA-FILHO et al., 2008;
CAMPOS et al., 2008). A miltefosina apresenta como efeitos indesejáveis alterações
ligadas ao trato gastrointestinal como vômitos e diarréia além de teratogenicidade e
potencial para desenvolver resistência (SEN & CHATTERJEE, 2011). Em nossos
estudos, a dose e o tempo de tratamento com miltefosina causaram alterações nos
animais como atrofia de vilosidades e hipertrofia glandular em mucosa gástrica além
de aumento da quantidade de muco vista na histologia revelando aumento da
atividade de secreção de muco em estômago assim como também é visto em outros
trabalhos que descrevem gastropatias (RODRIGUES, 2007).
Baseados em nossos dados relacionados à ação das nanoemulsões de
copaíba e andiroba em camundongos infectados com L. amazonensis e L.infantum,
sugerimos uma potente atividade leishmanicida das nanoemulsões. Os nossos
resultados e de outros grupos de pesquisa, com óleos essenciais contra parasitos do
gênero Leishmania (SANTOS et al., 2011; ROTTINI, 2011; BEZERRA et al., 2006)
abrem novas perspectivas para o tratamento e mais pesquisas para o
desenvolvimento de produtos para tratamento oral à base de óleos de copaíba ou
de andiroba. Adicionalmente pode-se considerar a associação de óleos essenciais
com outras medidas de combate a leishmaniose tegumentar e leishmaniose visceral.
Sendo a leishmaniose uma doença de tratamento controlado, com uso de
quimioterápicos de difícil aplicação, um tratamento natural e oral, como esse que
desenvolvemos aqui, diminuiria os custos, facilitaria a administração do
medicamento, além de reduzir ou até mesmo eliminar os efeitos colaterais
observados no tratamento tradicional, por exemplo, com glucantime.
6- CONCLUSÃO
Com base nos resultados obtidos nesse trabalho, podemos concluir que:
- O uso de nanoemulsões mostrou-se eficaz para distribuir os óleos em meio
aquoso.
- As nanoemulsões de copaíba e de andiroba apresentam ação leishmanicida em
promastigotas de L.amazonensis e L. infantum.
- Em macrófagos peritoneais murinos, tanto a nanoandi como a nanocopa não
apresentaram toxicidade nas doses de 2µL/mL e 0,3µL/mL quando comparadas ao
fármaco usado como controle (Anfotericina B).
- As nanoemulsões de copaíba ou de andiroba reduzem a infecção de culturas de
macrófagos peritoneais infectados com amastigotas de L. amazonensis e L.
infantum.
- Os tratamentos com nanoemulsões sozinhos ou juntamente com HBO resultaram
em retardo na evolução do tamanho das lesões em camundongos infectados com L.
amazonensis.
- As análises histológicas do estômago, rim, fígado e baço de camundongos
submetidos ao tratamento oral com as nanoemulsões não mostraram alterações
quando comparado ao tecido do grupo controle sem tratamento.
- HBO apresenta efeito leishmanicida no modelo de infecção de camundongos,
quando usada em conjunto com nanoemulsão de copaíba.
- Nos grupos de animais infectados com L. amazonensis ou com L. infantum tratados
com HBO em conjunto com nanoandi e nanocopa via oral, foi observada redução da
carga parasitária em lesões e órgãos alvo.
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Anexos
Abaixo constam o certificado de aprovação da CEUA, a declaração
de direitos autorais, as notas fiscais dos óleos de andiroba e de copaíba
(certificação de procedência), as analises físico-quimicas dos óleos de
andiroba e de copaíba.
Nota fiscal do óleo de andiroba.
Nota fiscal do óleo de copaíba.
Análise físico-química do óleo de copaiba
Análise físico-química do óleo de andiroba
