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INDUCCIÓN DE EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA EN EXPLANTES DE
CHILE CHILTEPÍN (Capsicum annuum var. glabriusculum)
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRO EN CIENCIAS APLICADAS
PRESENTA
IBT: Alfonso Soto Escarrega
DIRECTOR DE TESIS
Dr. Israel Benítez García
CODIRECTOR DE TESIS
Dr. Jesús Aarón Salazar Leyva
Mazatlán, Sinaloa, Noviembre 2017
UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE SINALOA
MAESTRÍA EN CIENCIAS APLICADAS
I
DEDICATORIA
A la primera persona a quien dedico es a mi madre que siempre me ha apoyado en todo
momento y fue lo suficientemente valiente para sacarme a delante a mí junto con
mis hermanos y siempre me enseño que la única manera de ser alguien es
mediante el estudio. Gracias a la vida por ser mi madre TE AMO.
A mis hermanos Alan y Fernanda que siempre me apoyaron en mis estudios y
comprendieron que era algo importante para mí, a mi hermano por no exigirme lo
que no le pude dar en cuestión económica y mi hermanita que me motivaba a
seguir al decir que quería ser como su mano Poncho.
Para mi Papa que me brindó su apoyo hasta donde la vida se lo permitió y que a pesar
de no ganar mucho lo primer que hacías era apartar el dinero de mi escuela antes
que nada, siempre te recordare con cariño. Mis hermanos que siempre me han
brindado su apoyo desde pequeño, alimentándome, cuidándome y respetándome,
por alentar mis ganas de seguir adelante en mis estudios y porque siempre están si
los necesito. Gracias en verdad gracias por ser un ejemplo para mí, por ser punto de
referencia en mi vida. Los amo!
Para mi abuelo Alfonso Soto López, que a pesar de los problemas siempre estuvimos
en contacto, y fue un pilar en mis estudios y vida, ya que todo lo que soy es gracias
a sus consejos, la vida me lo quito pero lo único que no me quitara son sus
enseñanzas siempre te voy a amar PONCHON.
II
AGRADECIMIENTOS
Para los doctores Israel Benítez García y Jesús Aron Salazar Leyva por apoyarme en
el transcurso de mis estudios de posgrado, por conferirme sus conocimientos, y
su tiempo dedicado a mí, y por permitirme ser parte de su grupo de trabajo.
Para el Dr. Leonardo German Gandarilla por su apoyo como alumno de licenciatura,
trabajador de UPSIN y como maestrante de posgrado, por animarme a estudiar
un posgrado en Biotecnología Vegetal y permitirme superarme.
A los M.C. Héctor Daniel Brito Rojas y Manuel de Jesús Sol Hernández por
compartir sus conocimientos estadísticos, por estar siempre a disposición para
revisar mis dudas en estadística, por sus comentarios para desenvolverme en las
exposiciones.
Al Dr. Enrique Jhonatan Romo Martínez por su apoyo en el posgrado y las
materias que me impartió.
Para el M.C. José Isidro Osuna López por su apoyo económico con la beca de 50%
de descuento en mensualidades de posgrado, por su amabilidad y atención
durante mi estancia en UPSIN.
III
Para la Dra. Rebeca Sánchez Cárdenas por su recibimiento a mí llegada al grupo de
investigación de su laboratorio en FACIMAR-UAS y por brindarme siempre toda
su confianza, así como sus conocimientos para el desarrollo de esta tesis entre
otras cosas de laboratorio.
A mi novia Kareli, porque siempre está conmigo brindándome su apoyo, comprensión
y motivación, pero sobre todo su amor y cuidado.
Mamá gracias porque de ti aprendí que si uno se lo propone puedes lograr cumplir
tus metas y que lo primero es echarse al agua y poco a poco aprenderás a nadar.
Gracias por enseñarme a salir adelante y no rendirse por más fea que este la
situación, y que a pesar de cualquier problema hay que salir con la frente en
alto.
A cada uno de los profesores que me brindaron su apoyo durante mis estudios de
maestría.
A todo el personal administrativo de la UPSIN.
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología CONACyT por la beca otorgada con
número de registro 720732 para poder realizar mis estudios de posgrado.
IV
ÍNDICE GENERAL
.CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN 1
ANTECEDENTES
I.I Género Capsicum spp 2
I.II Generalidades del chile Chiltepín
(C. annuumvar. glabriusculum) 2
I.III Distribución geográfica del chile Chiltepín 4 I.IV Importancia socioeconómica del chile Chiltepín 6
I.V Propagación ex vitro de chile Chiltepín 6
I.VI Cultivos in vitro de células vegetales 7
I.VII Micropropagación in vitro de plántulas del genero Capsicum 8
I.VIII Reguladores de crecimiento vegetal 10
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 13
JUSTIFICACIÓN 14
OBJETIVO GENERAL Y OBJETIVOS PARTICULARES 15
HIPÓTESIS 16
CAPÍTULO II: MATERIALES Y MÉTODOS 17
CAPÍTULO III: RESULTADOS 24
CAPÍTULO IV DISCUSIONES 38
CAPÍTULO V: CONCLUSIONES 41
CAPITULO VI: PERSPECTIVAS 41
REFERENCIAS 42
V
LISTA DE FIGURAS Pág.
Figura 1 Características morfológicas del chile chiltepín, A) Lámina foliar. B) Flores. C)
Frutos, D) Semillas……………………………………………………………………… 3
Figura 2 Distribución geográfica de plantas de chile Chiltepín en México. Información
obtenida de Montes, 2010……………………………………………………… 5
Figura 3 Respuestas observadas de los explantes en cultivo in vitro por efecto de las
auxinas y citocininas. A) Mayor concentración de auxinas con respecto a
citocininas, induce el proceso de embriogénesis somática, B) concentraciones
iguales de auxinas y citocininas inducen la desdiferenciación del tejido y C)
menor concentración de auxinas con respecto a las citocininas, induce la
formación de brotes…………………………………………………………….
9
Figura 4 Estructura química de diferentes auxinas……………………………………… 11
Figura 5 Estructura química de diferentes de citocininas……………………………….. 12
Figura 6 Diagrama de Pareto para efectos significativos estandarizados de
desinfestación…………………………………………………………………... 27
Figura 7 Diagrama de contorno con valores de Cl 2% y T20 al 1% graficados, para
desinfestación de explantes de chile Chiltepín………………………………... 28
Figura 8 Diagrama de contorno con valores de Cl 2% y ET70 graficados, para
desinfestación de explantes de chile Chiltepín………………………………… 29
Figura 9 Diagrama de contorno con valores de Cl 2% y ET96 graficados, para
desinfestación de explantes de chile Chiltepín.................................................... 30
Figura 10 Estructuras embrionarias en explantes de hojas de chile Chiltepín en medio de
inducción MS con AIA a 5 mg/L y sacarosa a 3% a los 10 días después de la
siembra…………………………………………………………………………...
31
Figura 11 Grafica de diferencia significativa entre tratamientos (T) de inducción de
embriones somáticos de Fisher (Barras verticales azules indican un LSD
=11.51), n=30………………………………………………………………….
33
Figura 12 Promedio de embriones maduros en medio MS con diferentes
concentraciones de sacarosa, 10 repeticiones…………………………..
34
Figura 13 Explante de Chiltepín con cambios morfogénicos A) Explantes con estructuras
embriogénicas día 0, B) Explantes con estructuras embriogénicas día 5, C)
VI
Explantes con estructuras embriogénicas y embriones somáticos en fase
globular día 12 al día 30…………………………………………………….…..
35
Figura 14 Embriones somáticos en estado globular en callo embriogénico de hoja de
Chiltepín a los 12 dds .………………………………………………………….. 35
Figura 15 Ontogénesis de embrión somático de Chiltepín: A) Explante con presencia de
estructuras embrionarias; (B) Imagen de análisis histológico a explantes con
formación de células embriogénicas: (C) Imagen de análisis histológico a
embrión, (F) embrión en fase avanzada………………………………………….
36
Figura 16 (A) Presencia de anillo concéntrico con células con vacuolas pequeñas y
citoplasma prominente; (B) Actividad mitótica de células; (C–D) estructuras
proembrionarias (E–F) embriones globulares; (G) estructura globular en
estado avanzado………………………………………………………………..
37
Figura 17 Explante de hoja adulta de Chiltepín con estructuras embrionarias a los
10 dds…………………………………………………………………….
39
VII
LISTA DE TABLAS
Pág.
Tabla 1 Factores evaluados y tiempos de inmersión usados en diseño Box-Benkhen... 18
Tabla 2 Diseño experimental para inducción de embriones somáticos explantes de
Chiltepín………………………………………………………………………. 19
Tabla 3 Protocolo de deshidratación para tejidos Chiltepín (Capsicum annuum var.
glabriusculum)……………………………………………………………………….. 21
Tabla 4 Protocolo de tinción con Hematoxilina y Eosina de tejidos de Chiltepín……. 22
Tabla 5 Porcentajes de desinfestación de los diferentes tratamientos del diseño de
metodología de superficie de respuesta tipo Box-Bhenken de tiempos de
inmersión en agentes desinfestantes.…………………………………………. 25
Tabla 6 Análisis de varianza (ANDEVA) para la variable respuesta (desinfestación). 26
Tabla 7 Análisis de varianza ajustada (ANDEVA) para la variable respuesta
(desinfestación)……………………………………………………………..... 27
Tabla 8 Combinación de los niveles de los factores optimizados con MSR obtenidos
del modelo estadístico experimental ……………………………………….… 30
Tabla 9 Resultados de inducción de embriones somáticos de 30 repeticiones a los 10
dds……………………………………………………………………….…… 32
Tabla 10 Análisis de varianza (ANDEVA) de componentes entre grupos y dentro de
grupos de los diferentes tratamientos de inducción de
embriones………………………………...…………………………………… 32
VIII
RESUMEN
La planta de Capsicum annuum glabriusculum es una variedad de importancia
económica en México, sin embargo problemáticas de latencia en la semilla y de
adaptabilidad a las condiciones, han impedido su propagación y explotación comercial, lo
que hace que el fruto se obtenga por recolección en zonas silvestres, sin reponer los
genotipos naturales. Por lo anterior, resulta necesario un sistema biotecnológico
sustentable que pueda ser una alternativa viable para la inducción de embriones somáticos
que permita la micropropagación y conservación de la especie.
En este trabajo, se estableció el protocolo de desinfestación de explantes de Chiltepín
mediante la metodología de superficie de respuesta probando combinaciones de dos agentes
desinfectantes y un detergente, Etanol 96%, Hipoclorito de sodio 2%, Tween 20 al 1% y
etanol al 70%, a diferentes tiempos de inmersión. Posteriormente fueron sembrados en
medio Murashige y Skoog (MS), adicionado con sacarosa (30 g/L) ajustando el medio a un
pH de 5.8 usando como agente gelificante agar, colocando diez explantes en una caja petri
siendo cada uno igual al 10%, realizándose el experimento por triplicado. El medio de
cultivo se preparó con diferentes concentraciones de ácido indolacético (AIA) y
bencilaminopurina (BAP), siendo las combinaciones concentraciones de 0, 5 y 10 mg/L de
cada hormona. El mejor tratamiento de inducción de estructuras embrionarias fue de 5
mg/L, el cual indujo el mayor número de embriones con un 43.3% a los 10 días después de
la siembra (dds).
Las estructuras embrionarias obtenidas, se sometieron a histología para analizar sus
características, identificarlas al microscopio y cerciorarse de su origen embriogénico, una
vez identificadas las estructuras obtenidas en 5 mg/L de AIA se resembraron a diferentes
concentraciones de sacarosa (0, 15, 30 y 60 g/l ), para su maduración, siendo el medio con
60 g/L de sacarosa en donde se observó mayor número de embriones maduros con 6 de 10
explantes a los 12 dds.
Palabras claves: embriogénesis somática, medio MS, desinfestación, histología.
1
CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN
En México se cuenta con diferentes tipos de chiles (Capsicum spp.) que se
diferencian por su sabor, pungencia y pigmentación, los cuales son empleados como
plantas de ornato, para elaboración de pigmentos, remedios caseros o conocidos como
etnobotánicas y principalmente el consumo humano (Jiménez et al., 2015). Esto se ha
logrado, ya que durante el proceso de domesticación, las plantas cultivadas han
desarrollado características que son el resultado de adaptaciones a las condiciones
ecológicas de cultivo y las necesidades del ser humano, produciéndose cambios en el color
y tamaño del fruto. Una de las características fisiológicas que se han modificado en mayor
grado por la selección artificial es la pérdida de latencia de sus semillas, susceptibilidad a
plagas y enfermedades (Pérez, 2010).
Uno de los principales motivos para estudiar las plantas silvestres es que son
consideradas como reservorios invaluables de genes que pueden ser utilizado en la solución
de problemas agrícolas, proporcionando resistencia contra plagas y enfermedades o
aumentando la cantidad y calidad de la producción de los cultivos modernos. Sin embargo,
los sitios de distribución se han ido perdiendo por la deforestación o el cambio de uso de
suelo y la recolección no controlada de sus frutos, poniendo en riesgo a las especies
silvestres (Martínez et al., 2012).
La planta silvestre de chile Chiltepín (Capsicum annuum var glabriusculum)
presenta dificultad para lograr la germinación de sus semillas atribuible a una condición de
latencia o dormancia, ya que las semillas no se encuentran en sus condiciones silvestres
(Araiza et al., 2011). Por otro lado, se ha reportado que para romper la latencia y obtener la
germinación, es necesario retirar la cubierta seminal mediante tratamientos de
escarificación, hormonales u osmóticos, procesos que no garantizan el óptimo crecimiento
y rendimiento de las plántulas (Sandoval, 2011).
2
En relación con los protocolos para la germinación, el cultivo de tejidos vegetales in
vitro, permite la multiplicación asexual de plantas sin la necesidad de tener semillas
(Buchanan et al., 2000), así pues, existen ejemplos de su implementación en el género
Capsicum(Regla et al.,2015) Uno de los principales usos del cultivo de tejido vegetal es la
micropropagación y el estudio de adaptabilidad a diferentes condiciones de cultivo; en
plantas esta técnica ha avanzado vertiginosamente, con el objeto de lograr mayor eficiencia
y multiplicación de las mismas (Tovar et al.2016). Debido a que en la literatura no hay
protocolos de regeneración de Chiltepín (Capsicum annuum var. glabriusculum), en este
trabajo se implementó un sistema de inducción de embriogénesis somática.
I.I Género Capsicum spp
El cultivo de chile (Capsicum spp.) es uno de los más importantes del mundo, está
formado por 33 especies. Las especies que más se cultivan son C. annuum L., C. frutescens
L., C. pubescens, C. chínense Jacq. y C. baccatum L. (Pérez, 2010). Este género pertenece
a la familia de las Solanáceas un grupo muy representativo con alrededor de 200 variedades
cultivadas, con frutos que varían en tamaño, forma, pungencia y sabor (Hernández et al.,
2012). En el aspecto agrícola y económico, la especie más importante es C. annuum, la cual
se encuentra con gran diversidad en México y presenta gran variabilidad genética (Moreno
et al., 2011).
I.II Generalidades del chile chiltepín (C. annuum var. glabriusculum)
C. annuum var. glabriusculum (Jensen et al., 1979) (Figura 1) se conoce también como
chiltepín, piquín, mash, amashito y chiltepec, es un arbusto silvestre, perenne, herbácea o
trepadora, de hasta 4 m de altura, es de vida corta, con una flor por nudo (Figura 1A). Estas
plantas alcanzan su edad de reproducción entre los seis y diez meses de edad, sus semillas
son de color crema o amarilla (Figura 1B) y los frutos son verdes en su estado inmaduro y
conforme avanza su estado de madurez, su coloración pasa de púrpura oscuro a rojo (Figura
3
1C) El fruto maduro puede ser erecto, pequeño, globoso u ovoide de 3-6 mm de diámetro
(Figura 1D). Además de las características morfológicas antes mencionadas, en estado de
madurez la coloración rojiza se debe a la alta cantidad de pigmentos conocidos como
licopersinas o cetocarotenoides (Bañuelos et al., 2008).
Figura 1: Características morfológicas del chile chiltepín, A) Lámina foliar. B) Flores. C)
Frutos, D) Semillas.
Fuente: (A) https://goo.gl/8krp5b, (B) https://goo.gl/XxShbX, (C)https://goo.gl/Yu06lL ,(D)
https://goo.gl/wj9B2M.
4
I.III Distribución geográfica del chile Chiltepín.
El chile Chiltepín, se extiende desde el suroeste de los Estados Unidos, cruzando por
México y América central, hasta el noroeste de Sudamérica. En México, se encuentra
distribuido en la zona costera, desde Sonora hasta Chiapas por el Pacífico y de Tamaulipas
hasta Quintana Roo por el Golfo de México (Laborde & Pozo, 1984).
Las poblaciones silvestres de chile Chiltepín normalmente se encuentran en lugares
de poca elevación y raramente exceden los 1,000 metros sobre el nivel del mar (D'Arcy &
Eshbaugh, 1974). Se han encontrado plantas por arriba de los 1,000 m de altitud en
Coahuila (1,300 m) y en Querétaro (1,100 m), crece debajo árboles en lugares montañosos
cercanos a arroyos y cañones (Gentry, 1942; Nabhan,1985; Nabhan et al., 1990).
Tomando en cuenta la información de las bases de datos del Sistema Nacional de
Información de la Biodiversidad (SNIB) y de la Red Mundial de Información de la
Biodiversidad (REMIB) que maneja la Comisión Nacional de la Biodiversidad
(CONABIO), se presenta un mapa sobre la distribución en México de Chiltepín (C.
annuum var. Glabriusculum) (Figura 2) (Montes, 2010).
5
Figura. 2: Distribución geográfica de plantas de chile Chiltepín en México. Información
obtenida de Montes, 2010.
6
I.IV Importancia socioeconómica del Chiltepín
Un estudio realizado por Robles (2009), reportó que en la región del Río Sonora, la
derrama económica que dejó el chiltepín silvestre a recolectores y comerciantes, fue de
$18.2 millones de pesos, generada por la producción de 70, 000 kilogramos a un precio de
$ 260.00 por kg . Robles & Garza (2015), reportaron que en el año 2010 la producción de
Chiltepín en México cayó a 77.3 t y para 2011 colapsó hasta 46.7 t, lo cual propició
incrementos importantes en los precios, que aumentaron de los $ 260.00 en 2009 a los
$800.00 en 2010 y $1,200.00 en el 2011, dejando una derrama entre recolectores e
intermediarios por 70.9 millones de pesos para el último año en cuestión. Esta baja en la
productividad es ocasionada por la pérdida de ejemplares silvestres o su lento crecimiento,
la baja germinación de las semillas y la deforestación de las zonas en donde se distribuye la
especie, estos factores representan una limitante para la producción intensiva (Vásquez et
al., 2013).
I.V Propagación ex vitro de chile Chiltepín
Existen estudios en Capsicum annuum var. glabriusculum los cuales se centran en la
germinación y propagación de las plantas para una explotación comercial, basándose en
tratamientos a base de reguladores de crecimiento vegetal (RCV) en las semillas para
obtener mayor porcentaje de germinación, se han utilizado tratamientos de 4000 ppm de
ácido giberélico obteniendo una germinación de 75% 50 días después de la siembra (dds)
(Parra, 2006). De igual forma, se obtuvieron resultados de 46.77% en semillas tratadas con
ácido giberelico a una concentración de 5000 ppm con emergencia de plántula a los 18 días
(Sandoval, 2011). En otro estudio, se utilizó ácido giberelico a 400 ppm durante 20 horas y
se obtuvo un 97 % de germinación después de 4 semanas de siembra (Araiza et al., 2011).
Por otro lado, Jiménez et al., (2015) obtuvieron un 86.6% de germinación a los 12 dds
usando combinaciones de ácido giberelico 31 ppm, ácido indolacético 31 ppm y zeatina a
83 ppm.
7
El Chiltepín es el único chile que no se ha domesticado, ya que necesita condiciones
especiales de suelo, humedad y sombra, las cuales solo las brinda el medio ambiente
natural (Bañuelos et al., 2008). La problemática de germinación de la semillas parece
haber sido solucionada, pero existen otros factores limitantes en la propagación de esta
especie asociados a problemas de adaptabilidad de las plántulas a diversas condiciones
como lo son las fluctuaciones de agua, endurecimiento del suelo, enfermedades de las
plántulas, fertilidad y temperatura del suelo, presencia de materia orgánica, daños por el
viento, salinidad, época del año y estrés por temperatura, entre otras (Wall &Phillips,
2002).
I.VI Cultivo in vitro de tejidos vegetales
El cultivo in vitro de tejidos vegetales (CTV), comprende un grupo de técnicas mediante
las cuales un explante (parte aislada de la planta, puede ser tejido u órgano) es cultivado de
forma aséptica en un medio de composición química definida e incubado en condiciones
controladas con la finalidad de que las células del tejido se desdiferencien y vuelvan a
diferenciarse en tejido especializado formando embriones (Mulabagal&Tsay, 2004). Esto
gracias a la totipotencialidad de las células vegetales, que indica que cualquier célula
vegetal tiene la capacidad de generar una nueva planta completa ya que posee todo el
material genético de la planta de origen, sin importar su función o posición en ella (Street,
1977); lo anterior, depende de las concentraciones y tipos de hormonas en el medio, cuya
combinación puede originar diferentes procesos como: organogénesis directa, que es la
formación de órganos de las planta como raíz, tallo u hojas en el explante, y organogénesis
indirecta, donde las células vegetales se desdiferencian formando un callo (células
indiferenciadas) que es capaz de formar órganos, embriones somáticos (embriogénesis
indirecta) con la capacidad de regenerar una planta completa (Castellanos et al., 2006).
8
I.VII Micropropagación in vitro de plántulas del genero Capsicum
Sin duda el CTV permite la micro propagación masiva de plantas de interés
agroindustrial, enfocado a la mejora de productos hortícolas como el chile, principalmente
enfocado a la domesticación de variedades, mejora de nutrientes, resistencia a factores
bióticos y abióticos (Calva & Pérez, 2005). En este sentido, existen estudios para la
regeneración in vitro de plantas del género Capsicum a partir de diferentes tipos de
explantes (hoja, tallo, peciolo u cotiledones) en medio enriquecido con RCV (Robledo &
Carrillo, 2004). A manera de ejemplo, Prakashet al., (1997) lograron la regeneración de
Capsicum annuum vía organogénesis a partir de protoplastos usando diversas
combinaciones de auxinas y citocininas para realizar mejoras por hibridación somática.
Jimarez (2014), reportó la regeneración de plantas de chile habanero (Capsicum chinense
Jaqc) para un propagación in vitro a partir de explantes de hipocotilos y a su vez, Zapata et
al., (2007) lograron la regeneración vía embriogénesis somática en chile habanero a partir
de explantes de hipocotilo en medio líquido con 2,4 D.
Lo anterior demuestra lo importante que es tener un sistema de regeneración de plantas
mediante el cultivo de tejidos vegetales, porque además de la regeneración para la
micropropagación, se puede emplear para complementar los métodos de mejora genética
(López et al., 2009). Sin embargo es necesario conocer el tipo de explante y la
concentración de RCV para lograr la micropropagación en cultivo in vitro.En la literatura
se reporta que el uso de altas concentraciones de RCV como auxinas con respecto a la
concentración de citocininas induce la formación de embriones, mientras que
concentraciones similares de citocininas y auxinas promueve el proceso de
desdiferenciación del tejido hasta la formación de callo, pero con una concentración menor
de auxinas con respecto a las citocininas, se induce la organogénesis (Figura 3); sin
embargo, esta respuesta dependerá del tipo de explante y la especie vegetal (Pérez-
Molpheet al., 1999).
9
Figura 3. Respuestas observadas de los explantes en cultivo in vitro por efecto de las auxinas y
citocininas. A) Mayor concentración de auxinas con respecto a citocininas, induce el proceso de
embriogénesis somática, B) concentraciones iguales de auxinas y citocininas inducen la
desdiferenciación del tejido y C) menor concentración de auxinas con respecto a las citocininas,
induce la formación de brotes (Pérez-Molpheet al., 1999).
ALTA
ALTA NULA
NULA
RESPUESTA Embriogénesis somática
Formación de callo
Formación de brotes (organogénesis)
CONCENTRACIÓN
DE CITOCININAS CONCENTRACIÓN
DE AUXINAS
10
I.VIII Reguladores de crecimiento vegetal
Los RCV son sustancias orgánicas que se sintetizan en las zonas apicales de la planta y
se trasladan a otro sitio donde ejercen su acción fisiológica en concentraciones por debajo
de otros compuestos como nutrientes y vitaminas (Izumi et al., 2009), participan en
variadas respuestas morfogenéticas, de esta manera una misma hormona puede estimular o
inhibir una respuesta, lo cual indica que hay una sinergia en el control de un mismo efecto.
Las diferentes respuestas ocurren en un tiempo determinado en el desarrollo de la planta y
se produce solo en un tejido específico u órgano dependiendo del estímulo biótico o
abiótico (Chattopadhyay et al., 2002).
De acuerdo con su estructura y función fisiológica, las hormonas han sido clasificadas
en varios grupos que comprenden a las auxinas, citoquininas, ácido abscísico, giberelinas,
etileno, jasmonatos, ácido salicílico, brasinosteroides, poliaminas entre otras (Kamiya,
2010).
Las auxinas (Figura 4) fueron unas de las primeras hormonas vegetales en ser
descubiertas y juegan un rol importante en el crecimiento de las plantas principalmente por
la elongación celular y participan en el desarrollo de la embriogénesis, controlan la división
celular en el cambium donde ocurre la diferenciación de las células que darán origen a los
elementos de floema y xilema. El transporte de auxina se realiza por gradiente de
concentración desde el ápice principal hacia la base de la planta reprimiendo el desarrollo
de brotes laterales a lo largo del tallo, manteniendo así lo que se denomina como
dominancia apical (Song, 2014).
11
Las citoquininas (Figura 5) participan en procesos de crecimiento y desarrollo de las
plantas, su síntesis acontece principalmente en la raíz, aunque también en el meristemo
apical y en semillas inmaduras (Kakimoto, 2003), se localizan en los sistemas conductores
floema y xilema y su presencia se considera como una posible señal vinculada con un
déficit de nutrientes en el suelo. Generan una dominancia apical reducida o anulada, con
brotación y crecimiento de yemas axilares, pueden inducir brotes adventicios en porciones
de las hojas, venas y pecíolos intactos, son las hormonas claves para iniciar la formación de
novo en diversos explantes in vitro (Howellet al., 2003).
Figura 4: Estructura química de diferentes auxinas
12
Figura 5: Estructura química de diferentes de citocininas
13
I.IX PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La recolección excesiva de las plantas silvestres de Chiltepín y la pérdida de las zonas en
la que la especie se distribuye, ha originado en los últimos años una disminución en la
colecta del fruto, impactando en la economía de los productores.
A pesar de los esfuerzos por domesticar y propagar esta variedad bajo condiciones de
invernadero o campo abierto, esto aún no se ha logrado, debido a la baja adaptabilidad a
las condiciones de siembra. Aunado a lo anterior, se han realizado investigaciones
enfocadas solo en la germinación de la semilla o propagación por estacas sin explorar
alternativas como el cultivo de tejidos vegetales (CTV), que en el campo de la
biotecnología se ha utilizado para el mejoramiento y multiplicación de especies vegétales.
Por lo que esta investigación se enfoca a responder si los explantes de hoja de Chiltepín
son susceptibles a la inducción de embriones somáticos por efecto de reguladores de
crecimiento vegetal RCV para su micropropagación.
14
I.X JUSTIFICACIÓN
El chile Chiltepín es una de las variedades con mayor importancia socioeconómica y
cultural en México, pero a la fecha no se ha podido explotar adecuadamente en la
agricultura. Lo anterior, es atribuible a problemas de germinación en las semillas y a la
disminución de su población por la sobre explotación y perdida de las zonas silvestre
donde se reproduce.
Los estudios realizados hasta la fecha para la propagación de Chiltepín, se enfocan a la
germinación de las semillas y propagación por estacas sin contemplar alternativas que
permitan la multiplicación de las plantas, conservación de germoplasma y estudios de su
fisiología. Aunado a esto, no se han reportado protocolos de regeneración de esta variedad
vía embriogénesis somática, por lo cual, en este trabajo se propone la inducción de
embriones somáticos de Chiltepín que permitirán su clonación y multiplicación, así como
realizar futuros estudios enfocados a la adaptabilidad y mejoramiento del cultivo.
15
OBJETIVOS
I.XI Objetivo general
Inducir embriogénesis somática en explantes de chile Chiltepín (Capsicum annuum var.
glabriusculum).
I.XII Objetivos particulares
1.-Establecer las condiciones de asepsia de explantes de C.annuum var.glabriusculum.
2.-Determinar las concentraciones de ácido indolacético (AIA) y bencilaminopurina
(BAP) para la inducción de embriones somáticos en hojas adultas de C. annuum var.
glabriusculum.
3.- Identificar células embriogénicas mediante análisis histológico en explantes
cultivados de Chiltepín.
4.- Determinar el efecto de diferentes concentraciones de sacarosa, para la maduración
de embriones.
16
I.XIII HIPÓTESIS
La variación de las concentraciones de los componentes del medio de cultivo (sacarosa y
reguladores de crecimiento como ácido indolacético y bencilaminopurina), influyen en la
inducción y maduración de embriones somáticos en explantes de chile Chiltepín.
17
CAPÍTULO II: MATERIALES Y MÉTODOS
II.I Desinfestación del material vegetal de C. annuum var. glabriusculum
Se utilizaron hojas adultas de chile Chiltepín de plantas compradas en la ciudad de
Guasave, Sinaloa y que se mantuvieron en el invernadero de la Universidad Politécnica de
Sinaloa
El diseño experimental y análisis estadístico fueron generados usando el software
STATGRAPHICS Centurión XVI.I (StatPoint Technologies, Inc., Warrenton, VA, USA).
Para la optimización del experimento se realizaron estudios preliminares para determinar el
efecto de los agentes en la desinfestación y en los explantes. Basado en los resultados del
estudio preliminar, se aplicó un diseño experimental de Metodología de Superficie de
Respuesta (MSR) tipo Box-Behnken, la cual es una colección de técnicas estadísticas y
matemáticas útiles para desarrollar, mejorar y optimizar procesos en los cuales una
respuesta de interés es influenciada por diferentes variables, de esta forma se optimiza la
respuesta (Baş & Boyacı, 2007). Los factores que fueron evaluados son mostrados en la
Tabla 1. La técnica de MSR utilizada, fue con el objetivo de optimizar las condiciones de
asepsia de explantes de C.annuum var.glabriusculum, utilizando diversos agentes
desinfestantes (factores) y variando el tiempo de inmersión (niveles) (Tabla 1).
El efecto de los tratamientos se determinó a los 5 días después de la siembra (dds)
tomando como explantes desinfestados aquellos que no presentaban visualmente
contaminación, se consideró como variable respuesta (Y) el porcentaje de explantes
desinfestados (I). Se realizaron 3 réplicas por cada tratamiento, cada replica era una caja
petri, cada una con 10 repeticiones siendo cada explante una repetición igual al 10%. Se
realizaron un total de 27 corridas experimentales de 4 factores en 4 niveles cada uno; el
experimento fue analizado con un modelo de segundo orden con 3 puntos centrales para dar
ajuste.
18
Tabla 1.Factores evaluados y tiempos de inmersión usados en
diseño Box-Benkhen
Factor
Nivel bajo
(minutos)
Nivel central
(minutos)
Nivel alto
(minutos)
Etanol 96° (ET96) 0 7.5 15
Cloralex 2% (Cl2%) 0 7.5 15
Tween 20 1% (T20 1%) 0 7.5 15
Etanol 70% (ET70) 0 7.5 15
Se utilizaron explantes de hoja adulta de Chiltepín, los cuales se lavaron con agua
destilada y se dejaron secar sobre un papel de estraza dentro del laboratorio. Una vez secos,
se procedió a introducirlos en una campana de flujo laminar (LABCONCO®, Purifier®
Biological safety Cabinets, Clase II, Tipo A2) donde fueron lavados con agua destilada
estéril al inicio y después de cada tratamiento de desinfestación. Las hojas se diseccionaron
en tamaños 0.5-1 cm de largo con un bisturí, eliminando las zonas dañadas por los agentes
desinfestantes. Posteriormente, se sembraron los explantes en cajas petri con medio
Murashige and Skoog (MS), adicionado con 3% de sacarosa y a un pH ajustado a
5.8±0.02, usando agar-agar a 15 g/l como agente gelificante. Cabe resaltar que los agentes
desinfestantes se tomaron a partir de lo reportado por Spurlin, (2003) y Badoni y Chahuan,
(2010).
(I)
y= Porcentaje de desinfestación total
a= Porcentaje de desinfestación de la réplica 1
b= Porcentaje de desinfestación de la réplica 2
c= Porcentaje de desinfestación de la réplica 3
19
II.II Inducción de embriones somáticos
Para evaluar el efecto de la concentración de los reguladores de crecimiento vegetal
sobre la inducción de embriones somáticos, se realizó un diseño experimental factorial
aleatorio (Tabla 2), siendo ácido indolacético (AIA) y bencilaminopurina (BAP) los
factores a usar, teniendo como nivel bajo, medio y alto 0, 5 y 10 mg/l de hormona
respectivamente. Se utilizaron cajas petri con medio Murashige y Skoog (MS), adicionado
con 3% de sacarosa y a un pH ajustado a 5.8±0.02, usando agar-agar como agente
gelificante a 15 g/l. Los cultivos se mantuvieron en condiciones controladas a una
temperatura de 25 ± 2° C en condiciones de obscuridad; el porcentaje de proembriones
presentes se determinó tomando en cuenta los explantes que presentaron estructuras pro
embrionarias, realizando 3 réplicas por cada tratamiento, cada uno con 10 repeticiones
siendo cada explante una repetición igual al 10%, la diferencia significativa entre
tratamientos del experimento se determinó utilizando un análisis de varianza (ANDEVA) y
se discriminó su efecto con una prueba LSD de Fisher .
Tabla 2: Diseño experimental para inducción de
embriones somáticos explantes de Chiltepín
Tratamiento AIA (mg/l) BAP (mg/l)
1 10 10
2 0 0
3 5 5
4 0 5
5 5 0
20
II.III Histología
Las estructuras embrionarias, embriones maduros y partes de la planta (hoja, tallo y
ápices) se fijaron en una solución de formol al 10% durante 24 horas. Posteriormente, se
realizó el proceso de deshidratación como se muestra en la tabla 3, en un procesador de
tejidos (ThermoScientific™ Excelsior™ AS). Los tejidos deshidratados se colocaron en un
inclusor de parafina (Thermo ScientificMicrom EC 350 Modular tissue embedding center)
para obtener bloques con el tejido en parafina. A partir de dichos bloques se prepararon
secciones (láminas de 4 micras de grosor) con un micrótomo (ThermoScientific™ Rotary
MicrotomeMicrom HM355S) para después teñir dichas secciones. En este estudio se
utilizaron Hematoxilina y Eosina las cuales permitieron elucidar la estructura de los tejidos
vegetales, el análisis histológico se estandarizó variando los tiempos de inmersión de las
diferentes soluciones de los protocolos de Humason, (1979) y Buesa & Peshkov, (2009)
(Tabla 4), los tejidos teñidos fueron observados en un microscopio.
21
Tabla 3: Protocolo de deshidratación para tejidos Chiltepín
(Capsicum annuum var. glabriusculum)
SOLUCIÓN TEMPERATURA TIEMPO
Etanol 70% 35° 60 min
Etanol 80% 35° 60 min
Etanol 90% 35° 60 min
Isopropanol 95% 35° 60 min
Isopropanol 100% 35° 60 min
Isopropanol :aceite mineral 50° 90 min
Isopropanol :aceite mineral 50° 90 min
aceite mineral 50° 40 min
aceite mineral 50° 40 min
Parafina 68° 45 min
Parafina 68° 60 min
Parafina 68° 120 min
22
Tabla 4: Protocolo de tinción con Hematoxilina y
Eosina de tejidos de Chiltepín
Solución Tiempos de diferentes
zambullidas
Xileno 6 min
Xileno 6 min
Xileno 6 min
2 lavados en etanol
100%
20 seg
Etanol 95% 20 seg
Etanol 80% 20 seg
Agua corriente 1 min
Hematoxilina 5 min
Agua corriente 1 min
Etanol acido 3 seg
Agua corriente 2 min
Agua mineral 1 min
Agua corriente 3 min
Etanol 80% 30 seg
Eosina 3 min
Etanol 95% 20 seg
Etanol 100% 20 seg
2 lavados en etanol
100%
40 seg
3 lavados en Citrysol 1 min
23
II.IV Maduración de embriones somáticos
Para evaluar el efecto de la concentración óptima de sacarosa en la maduración de
embriones somáticos de Chiltepín se utilizaron cuatro concentraciones de sacarosa (0, 15,
30, 60 g/l). Los embriones obtenidos en el medio con 5 mg/l de AIA, se transfirieron a
medio de maduración con un pH ajustado a 5.8±0.2; los explantes se incubaron a 25 ± 2° C
en un cuarto de cultivo bajo condiciones de fotoperiodos luz de 16 horas, se realizaron
10repeticiones por cada tratamiento, cada repetición era una caja petri con 1 explante una
repetición, la diferencia significativa entre tratamientos del experimento se analizó con un
análisis de varianza (ANDEVA) y se discriminó su efecto con una prueba LSD de Fisher,
tomando en cuenta el número de estructuras globulares presentes en cada explante.
24
CAPÍTULO III: RESULTADOS
III.1 Resultados de desinfestación
La tabla 5, muestra los resultados de desinfestación de los 27 combinaciones de los 4
factores que fueron seleccionados (Etanol 96°, CLORALEX® 2%, Tween 20 al 1% y
Etanol 70%) para optimizar la desinfestación de explantes de chile Chiltepín. Los
resultados de los tratamientos 11, 12,14, 24, 26 y 27 presentaron 100% de desinfestación,
mientras que el resto de los tratamientos mostró porcentajes por debajo del 100% (Tabla 5),
así mismo, se puede observar que los porcentajes de desinfestación son mayores al 50%.
Para determinar cuáles factores tenían un efecto significativo, el modelo estadístico
presentó 86.25% de la variabilidad entre los tratamientos, tomando en cuenta todos los
factores estudiados, en el diagrama de Pareto (Figura 6) se aprecia como Cl2% y su
interacción con T20 al 1% y ET70 muestra un efecto significativo en la variable estudiada,
de igual manera la interacción de T20 al 1% y ET70 presenta el mismo efecto, se puede
visualizar como los efectos cuadráticos de Cl2%, T20 al 1% y ET70 sobrepasan la línea
vertical azul la cual representa el valor estadístico de distribución t para indicar efecto
significativo. Como se observa en la tabla 6, el ET96 y sus interacciones no representan
significancia, por lo tanto es una variable que se descarta para la desinfestación de los
explantes.
25
Tabla 5: Porcentajes de desinfestación de los diferentes tratamientos del diseño de metodología de
superficie de respuesta tipo Box-Bhenken de tiempos de inmersión en agentes desinfestantes
Tratamiento
ET96
(minutos de
inmersión)
Cl2%
(minutos de
inmersión)
T20 1%
(minutos de
inmersión)
ET70
(minutos de
inmersión)
Porcentaje de
desinfestación
(Y)
1 0 0 7.5 7.5 93.33±5.77
2 15 0 7.5 7.5 83.33±15.28
3 0 15 7.5 7.5 93.33±11.55
4 15 15 7.5 7.5 93.33±5.77
5 7.5 7.5 0 0 93.33±11.55
6 7.5 7.5 15 0 70.00±36.06
7 7.5 7.5 0 15 90.00±10
8 7.5 7.5 15 15 90.00±0
9 0 7.5 7.5 0 93.33±5.77
10 15 7.5 7.5 0 96.67±5.77
11 0 7.5 7.5 15 100.00±0
12 15 7.5 7.5 15 100.00±0
13 7.5 0 0 7.5 76.67±20.82
14 7.5 15 0 7.5 100.00
15 7.5 0 15 7.5 80.00±10
16 7.5 15 15 7.5 93.33±5.77
17 0 7.5 0 7.5 96.67±5.77
18 15 7.5 0 7.5 93.33±5.77
19 0 7.5 15 7.5 90.00±0
20 15 7.5 15 7.5 96.67±5.77
26
Cada valor es la media de tres determinaciones ± desviación estándar (n=30)
Tabla 6: Análisis de varianza
(ANDEVA) para la variable respuesta
(desinfestación).
Fuente Razón-F Valor-P
A:ET96 0.03 0.8572
B:Cl 2% 10.95 *0.0062
C:T20 1% 2.74 0.1239
D:ET70 2.16 0.1671
AA 0.74 0.4077
AB 0.91 0.3583
AC 0.91 0.3583
AD 0.10 0.7556
BB 13.98 *0.0028
BC 0.91 0.3583
BD 25.96 *0.0003
CC 6.01 *0.0305
CD 4.97 *0.0457
DD 6.94 *0.0218
*Efecto significativo
R-cuadrada = 86.25%
R-cuadrada (ajustada por g.l.) = 70.21% A= Etanol 96°, B=Cl 2%, C= Tween 20 1%, D=Etanol 70%, AA= Efecto cuadrático de etanol 96°,
BB= Efecto cuadrático de Cl 2%, CC= Efecto cuadrático de Tween 20 1%, DD= Efecto cuadrático
etanol 70%, AB=Combinación de efectos de etanol 96° con Cl 2%, BC= Combinación de efectos
de Cl 2% con Tween 20 1%, CD= Combinación de efectos de Tween 20 al 1% con etanol 70%,
AC= Combinación de efectos de etanol 96° con Tween 20 1%, AD= Combinación de efectos de
etanol 96° con etanol 70%, BD= Combinación de efectos de Cl 2% con etanol 70%.
21 7.5 0 7.5 0 93.33±11.55
22 7.5 15 7.5 0 73.33±5.77
23 7.5 0 7.5 15 66.67±15.28
24 7.5 15 7.5 15 100.00±0
25 7.5 7.5 7.5 7.5 96.67±5.77
26 7.5 7.5 7.5 7.5 100.00±0
27 7.5 7.5 7.5 7.5 100.00±0
27
Figura 6: Diagrama de Pareto para efectos significativos estandarizados de desinfestación
Con la información presentada en el diagrama de Pareto, el modelo se ajustó mediante el
coeficiente de determinación (R2) ajustada eliminando los factores e interacciones que no
sobrepasaron la línea azul, ya que este valor ajustado corrige el valor de R2 para el tamaño
de la muestra y los números de términos del modelo; en este contexto, el valor R2 ajustado
más alto fue de 74.17 % con un valor de R2 de 82.12% contemplando los factores no
significativos de T20 1% y ET70, ya que se muestra que sus interacciones son
significativas (Tabla 7).
Tabla 7: Análisis de varianza ajustada (ANDEVA)
para la variable respuesta (desinfestación).
Fuente Razón<F Valor<P
B:Cl 2% 10.95 *0.0062
C:T20 1% 2.74 0.1239
D:ET70 2.16 0.1671
BB 13.98 *0.0028
BD 25.96 *0.0003
CC 6.01 *0.0305
CD 4.97 *0.0457
DD 6.94 *0.0218 *Efecto significativo
R-cuadrada = 82.12 porciento
R-cuadrada (ajustada por g.l.) = 74.17 porciento
Diagrama de Pareto Estandarizada para Desinfestación
0 1 2 3 4 5 6
Efecto estandarizado
A:ET96
AD
AA
AB
BC
AC
D:ET70
C:T20 1%
CD
CC
DD
B:Cl 2%
BB
BD+-
28
Con los valores del modelo estadístico se generó una ecuación de predicción (II) con la
cual se obtuvo el diagrama de contorno (figura 7), donde se muestra el efecto de los agentes
desinfestantes evaluados sobre la variable respuesta. Se puede observar, que al mantener la
inmersión en ET70 durante 7.6 minutos y aumentar el tiempo de inmersión en el agente Cl2
%, el porcentaje de desinfestación incrementa en un rango de entre 94 y 98%, y al aumentar
el tiempo de T20 al 1% a 7.9 minutos la desinfestación se logra en un 100%.
y=93.1173 + 1.32099x2+ 0.54321x3-0.493827x4 -0.16214x22+0.237037x24-0.110288x3
2+
0.103704x34-0.117695x42+ ε (II)
Figura 7: Diagrama de contorno con valores de Cl 2% y T20 al 1% graficados, para desinfestación
de explantes de chile Chiltepín
A su vez, como se aprecia en la figura 8, al aumentar el tiempo de inmersión en Cl2% de
manera individual no se logra una desinfestación, al igual que al aumentar la inmersión en
ET70, pero si se utilizan los dos factores en conjunto se observa interacción por lo cual se
logra un 100% de desinfestación.
94.0
98.0
Contornos de la Superficie de Respuesta Estimada
ET96=0.0,ET70=7.6
0 3 6 9 12 15
Cl 2%
0
3
6
9
12
15
T2
0 1
%
Desinfestación
66.0
70.0
74.0
78.082.0
86.0
90.0
94.0
98.0
102.0
29
Figura 8: Diagrama de contorno con valores de Cl 2% y ET70 graficados, para desinfestación de
explantes de chile Chiltepín
En la figura 9, se puede observar que el ET96 no produce un efecto significativo en la
desinfestación por lo cual al aumentar o disminuir el tiempo de inmersión con este agente
no se observa ningún cambio, pero al aumentar el tiempo de inmersión en Cl2% se obtiene
una desinfestación del 100%, el efecto del ET96 se puede sustituir aumentando el tiempo
de inmersión en Cl2% por lo tanto pudo ser eliminado de protocolo de desinfestación.
94.0
98.0
Contornos de la Superficie de Respuesta Estimada
ET96=0.0,T20 1% =7.9
0 3 6 9 12 15
Cl 2%
0
3
6
9
12
15E
T7
0Desinfestación
66.070.074.078.082.086.090.0
94.098.0102.0
30
Figura 9: Diagrama de contorno con valores de Cl 2% y ET96 graficados, para desinfestación de
explantes de chile Chiltepín
Después de trabajar con los tiempos óptimos de inmersión mostrados en la Tabla 8, los
cuales fueron obtenidos a partir de la ecuación del modelo estadístico experimental (ec. II)
no hubo presencia de explantes contaminados, por lo cual el uso de Cl 2%, en combinación
con T20 al 1% y ET70 mostró un efecto en la desinfestación efectivo.
Tabla 8: Combinación de los niveles de los factores
optimizados con MSR obtenidos del modelo
estadístico experimental
Factor Bajo Alto Óptimo(minutos)
Cl 2% 0.0 15.0 6.8
T20 1% 0.0 15.0 7.9
ET70 0.0 15.0 7.6
*El protocolo de desinfestación se comprobó con 30 repeticiones sin presencia de
contaminación
94.0
98.0
Contornos de la Superficie de Respuesta Estimada
T20 1% =7.9,ET70=7.6
0 3 6 9 12 15
ET96
0
3
6
9
12
15
Cl 2%
Desinfestación66.070.074.078.082.086.090.0
94.098.0102.0
31
III.II Resultados inducción de embriones somáticos
Bajo las condiciones experimentales trabajadas, se obtuvo la inducción de embriones
somáticos en hojas de Chiltepín (C. annuum var. glabriusculum) a los 10 días después de la
siembra, en zonas donde la epidermis del explante había sido removida dejando expuestas
las células de parénquima sobre el medio de cultivo y favoreciendo la rediferenciación
celular hasta la formación de células embriogénicas (Figura 10). Los explantes sembrados
en el medio de cultivo adicionado con 5 mg/L de AIA mostraron mayor porcentaje de
estructuras proembrionarias (43%), mientras que en los medios adicionados con la
combinación de AIA y BAP a una concentración similar de 5 mg/L y 10 mg/L
respectivamente mostraron inducción de 26.67 y 30% (tabla 9), cabe resaltar que los demás
tratamientos indujeron menos del 15% de estructuras.
Figura 10: Estructuras embrionarias en explantes de hojas de chile Chiltepín en medio de
inducción MS con AIA a 5 mg/L y sacarosa a 3% a los 10 días después de la siembra.
0.1 mm
32
Tabla 9: Resultados de inducción de embriones somáticos de 30
repeticiones a los 10 dds
Tratamiento
AIA-BAP
No.
R1
R2
R3
%Embriones
somáticos
10-10 1 30 30 20 26.67±5.77
0-0 2 0 0 0 0±0
5-5 3 40 30 20 30±10
0-5 4 20 10 10 13.33±5.77
5-0 5 50 40 40 *43.33±5.77
*Mayor porcentaje de inducción de embriones somáticos
El ANDEVA realizado indica que existe una diferencia significativa (P<0.05) entre las
medias de los 5 tratamientos para la inducción de embriones en explantes de Chiltepín
(Tabla 10); por otro lado, la prueba de Fisher (Figura 11) mostró que existe diferencia entre
el tratamiento 5 con respecto a los demás.
Tabla 10: Análisis de varianza (ANDEVA) de componentes entre grupos y dentro de
grupos de los diferentes tratamientos de inducción de embriones
Fuente Gl Razón-F Valor-P
Entre grupos 4 20.58 *0.0001
Intra grupos 10
Total (Corr.) 14 *Diferencia significativa
33
Figura 11: Grafica de diferencia significativa entre tratamientos (T) de inducción de embriones
somáticos de Fisher (Barras verticales azules indican un LSD =11.51), n=30
III.III Maduración de embriones somáticos
Para la maduración de embriones somáticos, las estructuras obtenidas de Chiltepín
fueron colocadas en medio MS a diferentes concentraciones de sacarosa 0, 15, 30 y 60 g/L,
generando promedios de maduración de estructuras globulares de 0.7, 25.7,16.1 y 35.4
respectivamente, siendo para este caso el tratamiento de 60 g/L el que indujo mayor
numero embriones maduros (Figura 12).
% d
e in
du
cció
n d
e e
mb
rio
nes
T1 T2 T3 T4 T5
Medias y 95.0% de Fisher LSD
-6
4
14
24
34
44
54
34
Figura 12: Promedio de embriones maduros en medio MS con diferentes concentraciones
de sacarosa, 10 repeticiones.
Las estructuras globulares se observaron a los 12 días después de la siembra (Figura 13 y
14). Por otro lado, medios de cultivo sin sacarosa produjeron oxidación en todos los
explantes del tratamiento, en el caso de 15 g/L hubo un 50 % de oxidación de explantes y
un 50% de pigmentación verde, el tratamiento a 30 g/L oxidó 70 % de explantes con un
10% de pigmentación y el tratamiento a una concentración de 60 g/L generó oxidación de
50% y un 20% de pigmentación verde. Cabe destacar que solo se generaron fases
globulares y los explantes se mantuvieron durante 30 días (Figura 15) en cultivo con
resiembra a medio de nuevo a los 20 dds.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 g/L 15 g/L 30 g/L 60 g/L
Pro
med
io d
e e
stru
ctu
ras
glo
bu
lare
s m
ad
uras
Tratamientos de induccion de embriones
35
Figura14: Embriones somáticos en estado globular en callo embriogénico de hoja de
Chiltepín a los 12 dds.
1 mm
Figura 13: Explante de Chiltepín con cambios morfogénicos A) Explantes con estructuras
embriogénicas día 0, B) Explantes con estructuras embriogénicas día 5, C) Explantes con
estructuras embriogénicas y embriones somáticos en fase globular día 12 al día 30.
1 mm
36
El análisis histológico demostró la presencia y formación de embriones (Figura 15 A)
que muestra un grupo de células embriogénicas individualizadas y separadas por una pared
fina identificada como protodermo. Estos embriones, muestran una región apical de células
muy pequeñas con un citoplasma muy denso (Fig. 15 B) que se encuentran envueltos en
una estructura bipolar e independiente (Figura 15 C y D).
A B
D C
A
Figura 15: Ontogénesis de embrión somático de Chiltepín: A) Explante con presencia
de estructuras embrionarias; (B) Imagen de análisis histológico a explantes con
formación de células embriogénicas: (C) Imagen de análisis histológico a embrión, (F)
embrión en fase avanzada
0.1 mm
37
La transición de estructura embrionaria a estructura globular (embrión somático) se
caracterizó por la formación de anillos concéntricos de células con una pequeña vacuola y
un citoplasma prominente (Figura 16 A). En los centros de estas estructuras se observó
actividad mitótica (Figura 16 B). Un complejo de células alrededor de la masa
embriogénica fue perfectamente distinguible, produciendo células aisladas zonas
identificadas como estructuras proembrionarias (Figura 16 C-D), en las estructuras
globulares se observó el desarrollo del protodermo, la capa más externa de un embrión en
desarrollo, el protodermo se distinguió en los primeros estadios globulares (Figura 16 E-F),
pero se definió mejor en la fase globular tardía ,así como también se observó la formación
de diversos orgánulos y estructuras internas (Figura 16 G).
A C B
A B C D
E F G
Figura 16: (A) Presencia de anillo concéntrico con células con vacuolas pequeñas y citoplasma
prominente; (B) Actividad mitótica de células; (C–D) estructuras proembrionarias (E–F)
embriones globulares; (G) estructura globular en estado avanzado.
40X 40X 40X 4X
40X 4X 4X
38
CAPÍTULO IV: DISCUSIONES
IV.I Desinfestación
En el presente trabajo se obtuvo la optimización del protocolo de desinfestación de
explantes de hoja de plantas de Chiltepín. Los resultados obtenidos difieren de lo reportado
en la literatura para otras especies de chiles. Por ejemplo: Avilés et al. (2012) Reportaron la
obtención de explantes hipocótilo de Capsicum chinensis desinfestados con ET 70% (5
min) y CL 1.8% (15 min), así mismo, se han empleado CL y ET para desinfestar semillas
de C. annuum (Santana-Buzzy et al., 2009), incluso para otras especies vegetales, se
reportado que el uso de CL y ET favorecen la desinfestación de tejidos vegetales, como lo
reporta Spurlin (2003) quien obtuvo un protocolo eficiente de desinfestación en Huperzia
lucidula utilizando combinaciones de Cl2% y T20 al 1%, y lo reportado por Badoni &
Chahuang (2010), quien realizó un protocolo de esterilización in vitro para la regeneración
de Solanum tuberosum. La desinfestación de explantes para el establecimiento del cultivo
de tejidos vegetales (CTV) depende del tipo de especie vegetal, tejido, y agentes
desinfestantes.
IV.II Inducción de embriones somáticos
La respuesta morfogénica en células en cultivo de Chiltepín sucedió a los 10 días
después de la siembra (Figura 17), tiempo similar al publicado por Mezghaniet al. (2007)
quienes observaron la presencia de callo embriogénico de C. annuum a los 12 días después
de realizar el cultivo en medio MS utilizando combinaciones de AIA y BAP con
porcentajes de hasta 58.7% de inducción y con Alva et al. (2014), quienes lograron la
inducción de embriones a partir de hojas adultas de C. chinensis a los 16 dds, utilizando
una combinación de 1 mg/l de 2,4-D para formar callos embriogénicos y 5 mg/l de BAP en
el crecimiento del embrión. Cabe resaltar que bajo nuestras condiciones experimentales, la
aplicación de BAP a 5 mg/L tuvo un bajo porcentaje (13.33%) de inducción de embriones
los cuales mostraron oxidación y oscurecimiento con respecto a los cultivados en AIA,
39
suceso similar a lo descrito por Ogita (2005), quien reportó que el BAP causó un fuerte
oscurecimiento de tejidos en Bamboo (Phyllostachisnigra) y por Gatica et
al.(2010) quienes reportaron oxidación en frijol (Phaseolus vulgaris) en concentraciones
entre 5 y 10 mg/l, atribuyendo a que el BAP induce la oxidación de componentes fenólicos
en los explantes, propiciando así el oscurecimiento. Esto coincide con lo reportado por
Vélez et al. (2010), quienes lograron la obtención de embriones en explantes de anteras de
chile Miahuateco (Capsicum annuum L.) a partir de la aplicación de una auxina (AIA) en
combinación con citocinina (furfurilaminopurina).
Figura 17: Explante de hoja adulta de Chiltepín con estructuras embrionarias a los 10 dds.
1 mm
40
IV.III Maduración de embriones somáticos
La inducción y maduración de embriones somáticos inducidos en los explantes de
Chiltepín en medio MS enriquecido con sacarosa 60 g/L concuerda con lo reportado por
Kaparakis & Alderson,(2008), quienes obtuvieron estructuras globulares a los 14 días y a lo
descrito por Harini & Lakshmi, (1993) quienes obtuvieron un mayor número de estructuras
globulares en Capsicum annuum L. en concentraciones de sacarosa por arriba de 60 g/L
(6%) y a su vez por lo reportado por Klimaszewska & Cyr, (2002) quienes enfatizan que el
uso de concentraciones de 6% favorece la inducción y maduración de la embriogénesis
somática. Por otro lado, bajo nuestras condiciones de experimentación, los embriones
somáticos no germinaron, caso similar al de Alva et al. (2014), quien obtuvo formación de
embriones somáticos en Capsicum chinensis pero sin que estos germinaran.
La identificación histológica de los embriones inducidos en los explantes de hoja de
Chiltepín, concuerdan con lo reportado por Santana et al. (2009) en embriones de C.
chinensis donde se identificaron la presencia de núcleo prominente, vacuolas fraccionadas,
pared celular delgada y presencia de protodermo.
41
CAPÍTULO V: CONCLUSIONES
El protocolo de desinfestación obtenido mediante la metodología de superficie de
respuesta para la desinfestación del material vegetal fue eficiente, ya que se logró obtener el
100% del material vegetal desinfestado y con capacidad de generar estructuras
proembrionarias, a su vez se logró optimizar permitiendo no usar etanol al 96°.
De acuerdo a los resultados obtenidos, la concentración de 5 mg/l de AIA permitió un
mayor número de inducción de embriones somáticos en los explantes de hoja en
comparación al resto de tratamientos probados. El medio de cultivo sin reguladores de
crecimiento vegetal RCV a una concentración de 60 g/l fue el tratamiento que permitió la
maduración de mayor número de embriones somáticos en fase globular.
Mediante un análisis histológico a las estructuras globulares, se pudo constatar la
presencia de embriones somáticos, al mostrar las características principales de un embrión.
En todos los casos, las estructuras globulares mostraron un anillo concéntrico, con células
con vacuolas pequeñas y fraccionadas, núcleo y citoplasma prominentes, y a su vez, se
apreció actividad mitótica de células en las estructuras en estado avanzado.
CAPÍTULO VI: PERSPECTIVAS DE INVESTIGACIÓN
A partir de la investigación realizada se propone lo siguiente:
1. Determinar por microscopia electrónica, de barrido y/o fuerza
atómica en las células en de los cultivos e identificar los cambios morfológicos y
estructurales que se llevan a cabo.
2. Trabajar con una fuente de carbono diferente a la sacarosa para para
evaluar su efecto en la germinación de embriones somáticos
42
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