UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DE LA

PROVINCIA DE BUENOS AIRES Facultad de Ciencias Exactas

Departamento de Ciencias Físicas y Ambientales

TESIS DOCTORAL

ANÁLISIS DE PLAGUICIDAS EN HORTALIZAS DE

HOJAS VERDES MEDIANTE ESPECTROSCOPÍA DE

PLASMAS PRODUCIDOS POR LÁSER

PRESENTADA POR

LIC. LUCILA MARTINO

DIRIGIDA POR

DR. CRISTIAN D’ ANGELO

TANDIL, 2020

DOCUMENTO PRESENTADO PARA LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO

DOCTORA EN CIENCIAS APLICADAS, MENCIÓN

AMBIENTE Y SALUD

ANÁLISIS DE PLAGUICIDAS EN HORTALIZAS DE HOJAS

VERDES MEDIANTE ESPECTROSCOPÍA DE PLASMAS

PRODUCIDOS POR LÁSER

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DE LA

PROVINCIA DE BUENOS AIRES Facultad de Ciencias Exactas

Departamento de Ciencias Físicas y Ambientales

Tandil, 2020

A mis viejos y hermano.

Especialmente a mi sobrino,

Faustino

Por enseñarme que cada pequeño paso, hace una gran diferencia.

i

AGRADECIMIENTOS

Esta Tesis Doctoral representa un largo camino de aprendizaje, el cual contó con momentos

satisfactorios y otros no tanto, que sirvieron tanto para un crecimiento académico como personal.

Hubiera sido imposible afrontar este proceso sin contar con el apoyo de mucha gente que me

acompañó, aconsejó y supieron sostenerme cuando fue necesario. Por esto, quiero empezar dando

las gracias.

Primero, a mi director Cristian, el “ingeniero en casi todo” y en especial, un amigo, el cual no sólo

me formó en el ámbito académico, sino también supo responder a mis cuestionamientos y

aconsejarme. Una persona que cree más en mi de lo que yo creo. Gracias por las infinitas charlas en

las largas horas de medición y por brindarme las muestras para llevar a cabo esta tesis.

A la Comisión del Doctorado en Ciencias Aplicadas, Mención Ambiente y Salud (DCAAS), de la

Facultad de Ciencias Exactas, por acompañarme en mí camino y fomentar nuestro crecimiento y

participación. Con esto extiendo mi agradecimiento también a la Universidad Nacional del Centro

de la Provincia de Buenos Aires (UNICEN).

Al Instituto de Física de Arroyo Seco (IFAS) donde realicé mis tareas de investigación. A todo el

personal científico y sobre todo técnico, por ayudarme a montar los equipos. En especial, a mis

amigos, compañeros de almuerzos y de risas.

A mis compañeros de oficina del grupo Espectroscopia-LIBS, a los que están y a los que estuvieron,

por el apoyo, las charlas y los mates de siempre.

A Claudia Marinelli y Rosana Cepeda, por enseñarme y brindarme su gran ayuda en el análisis

estadístico de los datos.

Al CONICET, quien me otorgó la beca para financiar mi investigación.

A mi familia, mi cable a tierra, por ser el apoyo incondicional, saber entenderme y darme ánimos. A

mi familia tandilense, a mi hermano y mi cuñada, a mi sobrino, Faustino, por enseñarme las

prioridades de la vida y darme tanto amor.

A mis amigos, de la vida, de la facultad, a mis colegas, a mis compañeras de cátedra y a los que me

acompañaron en el último tiempo.

A todos y a los que seguramente me olvido, que de una u otra manera formaron parte de mi vida

en este proceso, porque todo es aprendizaje.

Finalmente, a la educación pública, por permitir formarme y culminar mis estudios.

Infinitas GRACIAS.

ii

RESUMEN

La presencia de plaguicidas en los alimentos representa una amenaza importante para los

consumidores, sin embargo, la detección rápida directamente en las muestras implica una tarea

compleja. En este trabajo de investigación se evaluó la aplicación potencial de la técnica Laser

Induced Breakdown Spectroscopy (LIBS) para la medición rápida de determinados plaguicidas en

hortalizas de hojas verdes, identificándolos a partir del registro de las líneas de emisión que

componen los agentes activos. Los resultados obtenidos fueron exitosos, pudiendo encontrar

condiciones experimentales óptimas, posibilitando la identificación de los elementos en las

muestras pertinentes. A su vez, mediante la aplicación de análisis quimiométricos al conjunto de

datos LIBS, se pudo determinar que las muestras tienden a agruparse de acuerdo al plaguicida que

las compone, lo que posibilitó su clasificación. Por otro lado, fue posible cuantificar residuos de

plaguicidas mediante la medición de Cl, P y S. Se estableció una clara evidencia de la aplicabilidad

de esta técnica como una herramienta potencial para el estudio de plaguicidas en matrices

alimentarias. Esto se logró a partir de una preparación mínima de muestras, garantizando la rapidez

del análisis, bajos costos de aplicación, y sin producción de desechos tóxicos, evidenciando su uso

como técnica preliminar de evaluación o en forma complementaria a los métodos analíticos

tradicionalmente ya usados.

Palabras claves: Laser Induced Breakdown Spectroscopy; hortalizas; plaguicidas; métodos

quimiométricos; diagnóstica de plasmas.

iii

ABSTRACT

The use of pesticides in production systems is carried out in order to control pests and weeds.

However, due to use and abuse in their application, they cause adverse effects on white and non-

white organisms, reaching water bodies and air due to their drift. In turn, the presence of pesticide

residues in food represents an important threat to consumers, mainly due to the toxicity that they

can present in humans, finding evidence that determines the relationship of many diseases and even

deaths in the population by ingestion, contact, or mishandling of them.

From of the increasing knowledge about the potential dangers associated with the use of pesticides,

and the availability of data evidencing their presence in the environment, the need to introduce

controls on pesticide residues has become a matter of central concern for society.

Against this background, global environmental legislation fixes Maximum Residue Levels (MRLs),

which are increasingly stringent regulations for pesticide residues in water and food. These limits

are consistently exceeded as a result of the unreasonable application of pesticides, though. Non-

compliance with MRLs results in the presence of excessive amounts of pesticide residues in crop

products, leading to the accumulation of pesticide traces in the environment, the resurgence and

outbreak of resistant pests, and adverse health outcomes due to contaminated food consumption.

However, the techniques used for the detection and quantification of these residues require a long

procedure, use highly hazardous reagents, and offer no possibility of re-measuring the same sample.

Knowing the effects produced by the use of pesticides and with the premise that the maximum

permissible limits are exceeded in several cases, it is necessary to have rapid detection and

quantification methods that allow the analysis and evaluation of their presence, being the first step

to determine if the maximum allowed limits are exceeded with the consequent identification of risks

and decision making.

The Laser-Induced Breakdown Spectroscopy (LIBS) technique has made its way as a simple

diagnostic technique that allows rapid detection of interest elements in samples, regardless of their

state of aggregation. It is an analytical technique that relies on the formation and study of a plasma

induced by a focused high-power laser pulse on the surface of a sample to generate a plasma of high

temperature and electronic density around 10x1017 cm-3 , hence providing information about the

elements that it is composed of at the atomic level. The plasma emission produced, due to electronic

recombination, generates a spectrum. That spectrum is collected and its spectroscopic analysis

allows carrying out qualitative and/or quantitative analysis. LIBS has become established as an

important spectroscopic technique with enormous analytical potential due to its particular

characteristics and advantages over other techniques, such as no or minimal sample preparation,

iv

the capability of multielement analysis, no waste production, rapidity, affordable costs, and remote

sensing capability.

At present, the LIBS technique coupled with multivariate chemometric methods and data analysis

is being used as a new tool in the classification of samples. Chemometric techniques such as

principal component analysis (PCA) and linear discriminant analysis (LDA) are multivariate statistical

methods applied to: reduction of dimensional problems (number of variables), avoiding the loss of

essential information; pattern recognition; and characterization of two or more sample groups. At

the same time, the creation of calibration protocols using relatively simple experimental setups

allows finding detection and quantification limits with high precision.

With this, the objective of the present study was to evaluate and analyze the feasibility of using the

LIBS technique as a potential tool for the detection and quantification of some pesticides, including

herbicides and fungicides, in chard samples. The objectives proposed in this work were: i) to identify

the pesticides in contaminated chard samples based on the detection of the elements that make up

the active agents, ii) to characterize and classify the pesticides by chemometric methods, and iii)

establish routines for quantitative analysis. With the main purpose of contributing a new and/or

complementary analytical technique to the identification of pesticides in food or other matrices.

The research that has been carried out included systematic studies of laser-induced plasmas in order

to obtain advantageous information. An exhaustive study of the elements of difficult determination

that make up the active agents of pesticides was carried out, at atmospheric pressure and low

pressure with different experimental schemes, to obtain an optimal database that allows the

identification and characterization of pesticides starting from the application of chemometric

analysis. In turn, calibration protocols were carried out to study the sensitivity and precision of the

analytical technique, establishing the optimal plasma parameters. Finally, the plasmas produced

were characterized to evaluate their homogeneity and repeatability.

The results obtained from the LIBS signal records were successful, being able to find optimal

experimental conditions and allowing the identification of P, S, C, and Cl in all standard samples and

in the sample used for control purposes. A new signal registration acquisition method was also

developed, this guarantees the obtaining of several signal registrations with minimal sample

destruction and in a fast and versatile way. By applying multivariate analysis, it was observed that

the samples tend to group according to the pesticide that composes them and differ from the

control sample, in turn, differences in the classification of groups could be observed with a

confidence level of 95 %.

From the application of the LIBS technique, it was possible to quantify pesticide residues by

measuring Cl, P, and S, from a minimum preparation of the sample, guaranteeing the speed of the

analysis, low application costs, and no production of toxic waste. The proposed calibration models

were validated and it is concluded that they can be used in a complementary way to the analytical

methods traditionally used in the detection of pesticides.

v

Through this work, it has been shown that the LIBS technique can be used as a complementary tool

in agricultural applications and can in turn be applied to other matrices in addition to the one

presented in this work. Starting from new simple experimental configurations, with short execution

times, without the production of toxic waste and low application costs.

Keywords: Laser Induced Breakdown Spectroscopy; vegetables; pesticides; chemometric methods;

plasma diagnostics.

vi

TABLA DE CONTENIDO

1 Capítulo I: Introducción al problema de la investigación ......................................................... 1

Contextualización del problema ...................................................................................... 1

Hipótesis ........................................................................................................................ 3

Objetivos generales ........................................................................................................ 3

Plan de análisis propuesto .............................................................................................. 4

Factibilidad ..................................................................................................................... 5

Estructura de la tesis....................................................................................................... 5

2 Capítulo II: Conceptos básicos ................................................................................................ 7

Plaguicidas ...................................................................................................................... 7

2.1.1 Clasificación de plaguicidas ..................................................................................... 8

2.1.2 Límite Máximo de Residuos de Plaguicidas ............................................................ 11

2.1.3 Métodos analíticos convencionales para la detección de plaguicidas en alimentos 12

2.1.4 Situación actual en Argentina ................................................................................ 13

Marco Regulatorio en el control de plaguicidas: breve reseña. .................................. 13

Producción hortícola ................................................................................................. 14

Plaguicidas que pueden hallarse en los alimentos de consumo habitual .................... 15

Espectroscopia de Plasmas Producidos por Láser .......................................................... 22

2.2.1 Plasma y láseres .................................................................................................... 22

Técnica Laser Induced Breakdown Spectroscopy (LIBS) ................................................. 23

2.3.1 Fundamentos de la técnica LIBS ............................................................................ 26

2.3.2 Formación de plasmas LIBS (Cremers and Radziemsky 2006)................................. 27

2.3.3 Modelos de plasmas LIBS ...................................................................................... 28

Plasma absorbido homogéneo (Corney 1977a) ......................................................... 29

vii

Aproximación a plasma delgado (Corney 1977a) ....................................................... 30

2.3.4 Aspectos Analíticos de LIBS ................................................................................... 30

Análisis cualitativo .................................................................................................... 30

Análisis cuantitativo .................................................................................................. 34

Métodos quimiométricos aplicados a datos LIBS ........................................................... 39

2.4.1 Principios de quimiometría ................................................................................... 39

Análisis de Componentes Principales ........................................................................ 42

Análisis Discriminante Lineal ..................................................................................... 45

Análisis Multivariado de la Varianza (MANOVA) ........................................................ 48

3 Capítulo III: Materiales y Métodos ........................................................................................ 50

Equipo Experimental LIBS ............................................................................................. 50

3.1.1 Arreglo experimental 1: Registro de espectros de resolución media sin discriminación

temporal ………………………………………………………………………………………………………………………………50

3.1.2 Arreglo experimental 2: Registro de espectros de alta resolución y discriminación

temporal…………… ................................................................................................................. 51

3.1.3 Arreglo experimental 3: Registro de espectros de alta resolución y discriminación

temporal en condiciones de baja presión. ............................................................................ 53

Reactivos ...................................................................................................................... 54

Preparación de muestras .............................................................................................. 55

3.3.1 Preparación de muestras patrones ........................................................................ 55

3.3.2 Preparación de muestras de referencia con fines de calibración............................ 58

Obtención de registros de señales LIBS ......................................................................... 59

3.4.1 Pretratamiento de espectros................................................................................. 60

4 Capitulo IV: Identificación y caracterización de plaguicidas en muestras de acelga mediante la

técnica LIBS utilizando métodos quimiométricos .......................................................................... 61

Metodología ................................................................................................................. 62

Identificación de plaguicidas mediante el registro de señales LIBS ................................ 63

viii

4.2.1 Selección de líneas para registro de elementos ..................................................... 63

4.2.2 Condiciones experimentales de medición ............................................................. 65

4.2.3 Tiempos postbreakdown y de integración ............................................................. 66

4.2.4 Verificación de plasma delgado ............................................................................. 70

Metodología y cálculos ............................................................................................. 71

Aplicación directa ..................................................................................................... 73

Comparativa teórico – experimental ......................................................................... 73

4.2.5 Adquisición de datos LIBS ...................................................................................... 75

Obtención del número óptimo de adquisiciones LIBS ................................................ 75

Cálculo de relación señal-ruido ................................................................................. 77

Caracterización de plaguicidas ...................................................................................... 78

Discusión y conclusiones de la identificación y caracterización de plaguicidas ............... 83

5 Capítulo V: Cuantificación de plaguicidas .............................................................................. 85

Metodología ................................................................................................................. 85

5.1.1 Análisis cuantitativo .............................................................................................. 86

5.1.2 Figuras de mérito .................................................................................................. 87

Indicadores de capacidad de predicción: RMSE y MAE .............................................. 88

Cuantificación de Azufre ............................................................................................... 89

Cuantificación de Fósforo ............................................................................................. 92

Cuantificación de Carbono ............................................................................................ 96

Cuantificación de Cloro ................................................................................................. 97

5.5.1 Arreglo experimental LIBS ..................................................................................... 98

5.5.2 Obtención de parámetros espectroscópicos .......................................................... 99

5.5.3 Curva de calibración ............................................................................................ 102

Discusión y conclusiones de la cuantificación de plaguicidas ....................................... 104

6 Capítulo VI: Diagnóstica del plasma .................................................................................... 109

ix

Metodología ............................................................................................................... 110

6.1.1 Temperatura ....................................................................................................... 110

6.1.2 Densidad electrónica........................................................................................... 110

6.1.3 Equilibrio Termodinámico Local .......................................................................... 112

Estimación de Parámetros experimentales ................................................................. 112

6.2.1 Estimación de temperatura ................................................................................. 112

6.2.2 Estimación de densidad electrónica .................................................................... 115

6.2.3 Verificación de Equilibrio Termodinámico Local .................................................. 117

7 Capítulo VII: Conclusiones Generales y perspectivas ........................................................... 119

8 Referencias ........................................................................................................................ 123

1 ANEXOS.............................................................................................................................. 137

Características de un espectrómetro/monocromador. ........................................ 137

Rango de espectro libre (Free spectral range) .......................................................... 139

Resolución (poder resolvente). ............................................................................... 140

Análisis de la resolución (Anon 1972) ...................................................................... 142

Dispersión angular .................................................................................................. 144

Dispersión lineal (Anon 1972) ................................................................................. 145

Dispersión lineal en monocromador utilizado Jobin-Yvon THR ................................ 146

Comparación de medias para aplicación de métodos quimiométricos ................. 147

Análisis de la varianza: ANOVA ................................................................................ 147

Análisis de supuestos .............................................................................................. 149

Número óptimo de mediciones (jcgm 2008) ........................................................ 152

Evaluación tipo A de la incertidumbre típica ........................................................... 152

Número óptimo de mediciones: implementación en LIBS........................................ 154

Estimación de incertidumbres ............................................................................. 156

Estimación de incertidumbre en Plot de Boltzmann ................................................ 156

x

Estimación de incertidumbre de 𝑤𝐿′ (kT)............................................................... 157

Estimación de incertidumbre de 𝑛𝑒 𝑘𝑇 ................................................................... 157

Función transferencia ......................................................................................... 158

2 Lista de publicaciones declarada ........................................................................................ 159

xi

INDICE TABLAS

Tabla 2.1. Clasificación de plaguicidas según su campo de acción. .................................................. 9

Tabla 2.2. Clasificación de plaguicidas según el grupo químico. .................................................... 10

Tabla 2.3. Clasificación de plaguicidas según la toxicidad aguda. .................................................. 11

Tabla 3.1. Concentraciones de muestras de referencia de dimetoato y clorpirifos con fines de

calibración, y sus equivalencias de S, P, C y Cl. .............................................................................. 59

Tabla 4.1. Información espectroscópica de las líneas seleccionadas para la caracterización de

plaguicidas (Kramida, Olsen, and Ralchenko 2019). ...................................................................... 64

Tabla 4.2. Parámetros espectroscópicos para la detección de elementos en las muestras de estudio

mediante la técnica LIBS. ............................................................................................................. 69

Tabla 4.3. Potenciales de ionización de elementos seleccionados para justificar el modelo de plasma

delgado. ....................................................................................................................................... 72

Tabla 4.4. Relaciones señal-ruido para cada elemento medido en los plaguicidas de estudio. ...... 78

Tabla 4.5. Correlación de PC1 y PC2 con las variables originales. .................................................. 80

Tabla 4.6 Funciones discriminantes - datos estandarizados con las varianzas comunes. ............... 81

Tabla 4.7 Resultados de clasificación cruzada del análisis discriminante lineal (LDA). ................... 81

Tabla 4.8 Tabla resumen de análisis de varianza multivariante (MANOVA) que informa el resultado

de diferencias significativas entre los grupos de plaguicidas y la muestra control. ........................ 83

Tabla 5.1. Figuras de mérito calculadas para evaluar el desempeño del modelo de regresión de la

concentración de S II, a partir de diferentes modelos de validación. ............................................. 92

Tabla 5.2. LoD y LoQ para el S y el dimetoato. .............................................................................. 92

Tabla 5.3. Información espectroscópica de la línea de P II seleccionada para la cuantificación de

dimetoato. ................................................................................................................................... 93

Tabla 5.4. Figuras de mérito calculadas para evaluar el desempeño del modelo de regresión de la

concentración de P II, a partir de diferentes modelos de validación. ............................................ 95

Tabla 5.5. LoD y LoQ para el P y el dimetoato. .............................................................................. 96

Tabla 5.6. Información espectroscópica de la línea de Cl I seleccionada para la cuantificación. ..... 98

Tabla 5.7. Figuras de mérito calculadas para evaluar el desempeño del modelo de regresión de la

concentración de Cl I, a partir de diferentes modelos de validación. .......................................... 104

Tabla 5.8. LoD y LoQ para el Cl I y el clorpirifos. .......................................................................... 104

Tabla 5.9. LoD y LoQ para el C, S, P y Cl obtenidos a partir de la calibración con la técnica LIBS. 104

xii

Tabla 6.1. Datos espectroscópicos de líneas de emisión de Fe I seleccionadas para aplicación de plot

de Boltzmann. ............................................................................................................................ 114

Tabla 6.2. Obtención del criterio de McWhriter para verificación de LTE, a partir de la línea de Mg II.

.................................................................................................................................................. 118

Tabla Anexo 1. Dispersión lineal de Jobin Yvon THR (muy alta resolución) con red de difracción de

2000 líneas/mm………………………………………………………………………………………………………………………….147

Tabla Anexo 2. Función instrumental para el monocromador Jobin Yvon THR 1500, para diferentes

rendijas (r) entrada/salida expresado en µm……………………………………………………………………………….159

xiii

INDICE FIGURAS

Figura 2.1. Los diez alimentos con mayor carga de plaguicidas en Argentina. Fuente: Informe del

SENASA (2011/2016). ................................................................................................................... 16

Figura 2.2 Los diez plaguicidas con mayor presencia en alimentos. Fuente: Informe del SENASA

(2011/2016). ................................................................................................................................ 16

Figura 2.3. Comportamiento de la técnica LIBS frente a los requerimientos ideales para una técnica

espectroscópica. (Adaptado de Moncayo 2017). .......................................................................... 25

Figura 2.4. Una descripción esquemática de la historia temporal de un plasma LIBS. Se muestran el

tiempo postbreakdown (tb) y tiempo de integración (tw). (Adaptado de Cremers 2006). .............. 28

Figura 2.5. Validación Cruzada dejando uno afuera (LOOCV). (Domenech 2011b). ....................... 37

Figura 2.6. k- fold validación cruzada. (Domenech 2011a). ........................................................... 38

Figura 2.7. Representación de la reducción de la dimensionalidad llevada a cabo por PCA desde un

sistema de tres variables a un sistema de dos componentes principales (CP1 y CP2). ................... 45

Figura 3.1. Arreglo experimental LIBS 1. Registro de espectros de resolución media sin

discriminación temporal. (Adaptado de Papuccio 2020). .............................................................. 51

Figura 3.2. Arreglo experimental LIBS 2. Registro de espectros de alta resolución y discriminación

temporal. ..................................................................................................................................... 53

Figura 3.3. Arreglo experimental LIBS 3. Registro de espectros de alta resolución y discriminación

temporal en condiciones de baja presión. .................................................................................... 54

Figura 3.4. Armado de pellets de acelga con plaguicidas para la aplicación de LIBS. ...................... 56

Figura 3.5. Pellets obtenidos a partir de diferentes hortalizas....................................................... 56

Figura 3.6. Espectros de emisión LIBS en diferentes hortalizas con agregado de agua destilada.

Identificación de componentes mayoritarios. ............................................................................... 57

Figura 4.1. Perfil de línea de emisión de Cl I (725.66 nm) registrado con rendija de entrada y salida

de 80 µm, en condiciones de presión atmosférica y en baja presión (6x10-2 mbar). ...................... 66

Figura 4.2. Evolución de la intensidad en función del tiempo postbreakdown para a) S II, b) P I, c) C I

y d) Cl I. ........................................................................................................................................ 68

Figura 4.3. Familia de curvas de relaciones teóricas 𝐼𝑘𝑇, 𝑛𝑒𝐴𝐼𝑘𝑇, 𝑛𝑒𝐵 , para kT típicas entre 1,2 y

1,4 eV, para diferente 𝑛𝑒 entre 5x1016 y 1x1017 cm-3. Se pude ver la superposición de la relación

experimental en 𝐼𝐴𝑝𝑒𝑠𝑡𝐼𝐵𝑝𝑒𝑠𝑡 en este grupo de curvas. ............................................................ 74

Figura 4.4. Zoom de Figura 4.2 para enfatizar los datos. ............................................................... 74

xiv

Figura 4.5. Número óptimo de adquisiciones LIBS, por elemento, para cada plaguicida en cuestión.

.................................................................................................................................................... 75

Figura 4.6. Perfil de línea de emisión de P I (253.56 nm) registrado con rendija de entrada y salida

de 80 µm y b) gráfica obtenida del nuevo método de medición descrito en la sección 3.4 para la

muestra de acelga contaminada con clorpirifos............................................................................ 76

Figura 4.7. Intensidades netas para la línea de emisión de Cl I obtenidos del nuevo método de

registro de línea, registradas para todas las muestras de estudio. ................................................ 77

Figura 4.8. Biplot del análisis de componentes principales (PCA) para muestras contaminadas con

diferentes plaguicidas y la muestra control. ................................................................................. 79

Figura 4.9. Visualización de representación de análisis discriminante lineal (LDA) a partir de la

preasignación de grupos. ............................................................................................................. 82

Figura 5.1. Perfil de línea de emisión de S II (416,26 nm), en una muestra que contiene 80 mg/kg de

dimetoato (22,37 mg/kg de s) registrado con rendija de entrada y salida de 100 µm.................... 90

Figura 5.2. Curva de calibración de la línea de S II (416,26 nm), concentración agregada a partir de

dimetoato en muestras de hortalizas. Las barras de error vienen dadas por la incerteza del valor

instrumental. ............................................................................................................................... 91

Figura 5.3. Evolución de la intensidad en función del tiempo postbreakdown para la línea de P II

(460,21 nm), elegida para la cuantificación de fósforo, y por lo tanto de dimetoato. .................... 93

Figura 5.4. Perfil de línea de emisión de P II (460,21 nm), en una muestra que contiene 80 mg/kg de

dimetoato (10,81 mg/kg de P) registrado con rendija de entrada y salida de 100 µm. .................. 94

Figura 5.5 Curva de calibración de concentración de P II (460,21 nm), concentración agregada a

partir de dimetoato en muestras de hortalizas. Las barras de error vienen dadas por la incerteza del

valor instrumental........................................................................................................................ 95

Figura 5.6. Intensidad neta de C en función de la concentración agregada de clorpirifos a muestras

de hortalizas. Las barras de error vienen dadas por la incerteza del valor instrumental. ............... 97

Figura 5.7. Arreglo experimental LIBS. Adquisición y cuantificación de Cl a baja presión. .............. 99

Figura 5.8. Evolución de la intensidad en función del tiempo postbreakdown para la línea de Cl I

(837,59 nm), elegida para la cuantificación de cloro, y por lo tanto de clorpirifos. ...................... 100

Figura 5.9. Perfil de línea de emisión de Cl I (837,59 nm), en una muestra que contiene 100 mg/kg

de clorpirifos (30,33 mg/kg de Cl) registrado con rendija de entrada y salida de 200 µm a partir de la

configuración experimental de la Figura 5.6. .............................................................................. 101

xv

Figura 5.10. Registros de señales obtenidos de la medición de la línea de Cl I (837,59 nm) en una

muestra de acelga con 50 mg/kg de clorpirifos (15,61 mg/kg de Cl), con su fondo correspondiente y

la línea de Fe I (838,78 nm), con el fin de demostrar la no interferencia en la medición. ............ 102

Figura 5.11. Curva de calibración de concentración de Cl I (837,59 nm), concentración agregada a

partir de clorpirifos en muestras de hortalizas. Las barras de error vienen dadas por la incerteza del

valor instrumental...................................................................................................................... 103

Figura 6.1. Evolución esquemática de los tiempos postbreakdown y de integración para el Cl, P y S,

usados para cálculos de temperatura y densidad electrónica. .................................................... 113

Figura 6.2. Plot de Boltzmann basado en los datos experimentales de la Tabla 6.1, con perfiles

registrados en 300 ns. La temperatura estimada fue de kT = (0,83 ± 0,10) eV. Las barras de error

fueron calculadas mediante el cálculo de propagación de incertidumbre de Iji y de Aji para cada

caso en particular....................................................................................................................... 115

Figura 6.3. Perfil de la línea de emisión de Mg II (280,27 nm) con su perfil Voigt, para un tiempo

postbreakdown de 300 ns y de integración de 400 ns. ............................................................... 116

Figura 6.4. Ajuste exponencial para anchos Stark tabulados en función de KT para la línea de Mg II

(280, 27 nm), con una 𝑛𝑒′ = 1017 𝑐𝑚 − 3, según datos de tabla publicados (referencia en texto).

.................................................................................................................................................. 117

Figura Anexo 1. Esquema de haz incidente (inciden light) y difractado (diffracted light) sobre una red

de difracción de reflexión. .......................................................................................................... 137

Figura Anexo 2. Esquema utilizado para explicar la resolución o poder resolvente de una red de

difracción. .................................................................................................................................. 141

Figura Anexo 3. Esquema final que permite ver la capacidad de un equipo espectroscópico de

separar dos líneas diferentes que se encuentren separadas una determinada distancia. ............ 142

Figura Anexo 4. Gráfico de medias para el azufre, con intervalos de confianza del 95 %. ............ 149

Figura Anexo 5. Gráfico de residuos vs. predichos para verificación de homocedasticidad. a) P, b) S,

c) Cl, d) C. ................................................................................................................................... 151

1

1 CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN AL PROBLEMA DE LA INVESTIGACIÓN

CONTEXTUALIZACIÓN DEL PROBLEMA

Suele argumentarse que la evolución tecnológica en la fabricación de plaguicidas, junto a otras

innovaciones en la agricultura, por ejemplo la labranza cero y la utilización de múltiples fertilizantes,

han contribuido a que la producción agrícola haya logrado mantenerse al nivel de los incrementos

en la demanda de alimentos. Sin embargo, este desarrollo no solo no logró erradicar el hambre en

el mundo, sino que también se obtuvo a expensas de la salud humana y el medio ambiente, debido

a la incorporación y presencia de plaguicidas en concentraciones elevadas (United Nations (ONU)

2017). Como consecuencia, se encuentra evidencia de la presencia de los mismos en el ambiente y

los alimentos (Akoto, Azuure, and Adotey 2016; Cabaleiro 2018; Paz 2016), lo cual representa un

riesgo que debe ser evaluado, con el objetivo de determinar si se superan los límites máximos

permisibles y así, poder brindar información y herramientas de gestión a los organismos de control

específicos.

A la luz del creciente conocimiento sobre los peligros potenciales asociados con el uso de

plaguicidas, y la disponibilidad de datos que evidencian su presencia en el medio ambiente (Akoto,

Azuure y Adotey 2016; Bernieri et al. 2019; Besson et al. 2017; Campos et al. 2016), la necesidad de

introducir controles sobre los residuos de plaguicidas se ha convertido en una preocupación central

para la sociedad. En este contexto, la legislación ambiental global fija los límites máximos de

residuos (LMR), que son regulados de forma cada vez más estrictas para los residuos de plaguicidas

en el agua y los alimentos (Boa 2016). Sin embargo, estos límites se superan constantemente como

resultado de la aplicación irresponsable de plaguicidas (Paz 2016). El incumplimiento de los LMR da

como resultado la presencia de cantidades excesivas en los productos de cultivos, lo que lleva a una

acumulación de trazas de los mismos y sus componentes degradados en el medio ambiente, el

resurgimiento y brote de plagas resistentes, resultados adversos para la salud debido a una

exposición prolongada y al consumo de alimentos contaminados (Bernieri et al. 2019; Campos et al.

2016; Elgueta et al. 2019).

2

Por otra parte, las técnicas tradicionales utilizadas para la detección y cuantificación de residuos de

plaguicidas requieren de un elevado tiempo de ejecución, utilizan reactivos altamente peligrosos,

no ofrecen la posibilidad de volver a medir sobre la misma muestra y presentan altos costos (Cajka

et al. 2012; Furlani et al. 2011; Gómez-Ramos et al. 2013). Por lo tanto, es necesario contar con

nuevos métodos de detección y cuantificación que permitan analizar y evaluar en forma rápida, la

presencia de plaguicidas en diferentes matrices.

Desde hace ya unos años, la técnica de Espectroscopía de Plasmas Producidos por Láser (LIBS, por

sus siglas en inglés) se ha abierto camino como una técnica de diagnóstico simple que permite la

detección rápida de elementos de interés en diferentes muestras, independientemente de su

estado de agregación. Esta técnica consiste en enfocar un láser pulsado de alta potencia en la

superficie de la muestra para generar un plasma de temperatura y densidad electrónica elevadas,

proporcionando así información sobre los elementos que componen la muestra a nivel atómico.

Algunos estudios han utilizado la técnica LIBS en la detección de elementos tóxicos presentes en los

alimentos (Senesi et al. 2019), y otros se han concentrado especialmente en su uso para la detección

de plaguicidas y nutrientes en muestras de frutas y verduras. Kim et al. 2012, detectaron clorpirifos

y nutrientes en arroz y espinacas, y también lograron distinguir las muestras contaminadas con

plaguicidas, a elevadas concentraciones, de las muestras no contaminadas, mediante la aplicación

de análisis multivariado. Por otro lado, Multari et al. 2013, estudiaron la aplicación de la técnica LIBS

para diferenciar muestras contaminadas con diferentes plaguicidas (hexano, aldrín, clorpirifos,

dieldrina y HPCDD) en matrices complejas (grasas de tejidos y aceites grasos). Du et al. 2015,

detectaron clorpirifos en las superficies de la manzana, pero no pudieron encontrar resultados

satisfactorios en muestras a bajas concentraciones del mismo (1: 100 y 1: 1000). Sin embargo, en su

último trabajo publicado, lograron reducir los límites de detección mediante la aplicación de LIBS

con nanopartículas de plata (Zhao et al. 2019).

A partir de las consideraciones anteriormente nombradas, se plantea el siguiente trabajo de

investigación, en donde el principal objetivo es evaluar la factibilidad de utilizar la técnica LIBS como

una potencial herramienta para la detección, clasificación y cuantificación de algunos plaguicidas

sobre muestras de hortalizas de hojas verdes, mediante una preparación mínima de las muestras,

garantizando la rapidez del análisis, bajos costos de aplicación, y sin producción de desechos tóxicos.

3

Con todo esto se pretende aportar una nueva y/o complementaria herramienta analítica a la

identificación de plaguicidas en alimentos u otras matrices.

HIPÓTESIS

Es posible aplicar la técnica LIBS al estudio de matrices complejas mediante la fabricación de

muestras específicas de material vegetal. A partir del armado de pellets resistentes que

proporcionen una superficie de muestra uniforme para obtener emisiones LIBS estables, y

garantizar la representación de la composición de las muestras en los estudios analíticos.

La técnica LIBS en conjunto con estadística básica y métodos quimiométricos integrados, son

una herramienta útil para el monitoreo rápido, y simple en la detección y clasificación de

plaguicidas en matrices vegetales.

Pueden detectarse y cuantificarse plaguicidas en muestras de hortalizas de hojas verdes a partir

de los elementos atómicos que componen a los agentes activos.

Mediante la optimización de los esquemas experimentales y un estudio detallado de las líneas

atómicas en estudio, es posible disminuir los límites de detección y cuantificación de elementos

de interés.

OBJETIVOS GENERALES

Demostrar la viabilidad de la técnica LIBS para el estudio de residuos de plaguicidas en matrices

vegetales como una técnica simple, rápida y económica, a partir del análisis de líneas de emisión

representativas.

Optimizar el esquema experimental en la formación de plasmas y la adquisición de datos para

lograr detectar líneas habitualmente de difícil observación, con el posterior fin de disminuir los

límites de detección y cuantificación.

Investigar, analizar y aplicar estadística simple y técnicas de análisis multivariado para la

interpretación de la información obtenida mediante la técnica LIBS, con el fin de detectar,

clasificar y cuantificar la presencia de plaguicidas en muestras vegetales.

4

Desarrollar nuevas metodologías que permitan potenciar la capacidad de la técnica LIBS para

análisis cualitativos y cuantitativos, con el fin de facilitar las tareas de detección de plaguicidas;

que contribuyan al aporte de una nueva herramienta analítica de control.

PLAN DE ANÁLISIS PROPUESTO

Se van a desarrollar estudios de señales LIBS, en aplicaciones sobre muestras de interés

medioambiental, específicamente en hortalizas de hojas verdes, para lograr detectar elementos que

están presentes en los agentes activos de los plaguicidas y con esto inferir la presencia de los mismos

en las muestras de estudio. Esto se pretende lograr a partir de estudios sistemáticos de los plasmas

inducidos por láser a fin de obtener información ventajosa para aplicaciones tecnológicas y

analíticas. En particular, para lograr detectar y cuantificar elementos presentes y establecer bases

de datos útiles a cualquier experiencia que se realice a presión atmosférica y a baja presión,

estableciendo los parámetros óptimos del plasma.

La caracterización de los plasmas producidos por láser provee considerable información útil para

posteriores aplicaciones. Con este objetivo primario se pretende cumplir con las siguientes

actividades:

1) Perfeccionar la preparación de muestras representativas mediante la disminución del efecto

matriz a partir de un polvo fino y homogéneo obtenido de las hortalizas.

2) Realizar un esquema de registros de líneas de estudio en forma simple, con un formato de

integración temporal y espectral de las mismas, de forma tal que se permita un estudio de

elementos en forma eficaz y menos invasivo sobre las muestras que los registros habituales.

3) Optimizar los esquemas experimentales en los registros LIBS, para lograr detectar elementos de

difícil determinación (como es el caso del Cl y el S). Para esto se propone trabajar en condiciones

de baja presión y con diferentes formatos de observación del plasma.

4) Realizar experiencias y registros que se adapten a diferentes modelos de plasmas que incluyan

condiciones aproximadas a las reales. Esto incluirá un estudio exhaustivo para el análisis de los

tiempos postbreakdown, tiempos de adquisición, anchos de líneas, densidad electrónica,

5

estimación de temperaturas electrónicas y zonas de registros del plasma, a fin de adaptar los

modelos de plasmas requeridos.

5) Detectar ciertas moléculas que componen los agentes activos de plaguicidas, presentes

inicialmente en las muestras, a partir de la detección de líneas atómicas, mediante la aplicación

de técnicas de análisis quimiométrico, para lograr una caracterización y discriminación de

plaguicidas.

6) Evaluar la factibilidad del uso de la técnica LIBS. Para ello se pretende: estudiar la sensibilidad y

precisión de la técnica analítica, lograr protocolos de calibración para diversas matrices y

establecer rutinas para análisis cuantitativos, obtener configuraciones sencillas y económicas

para el análisis de muestras de alimentos.

FACTIBILIDAD

El tema de Tesis Doctoral propuesto se incluye en el Proyecto PIP bajo el título “Espectroscopia de

Plasmas Inducidos por Láser y Aplicaciones” en desarrollo con el grupo Espectroscopia-LIBS del

Instituto de Física Arroyo Seco (IFAS), perteneciente al Centro de Investigaciones en Física e

Ingeniería del Centro de la Provincia de Buenos Aires (CIFICEN) de la Facultad Ciencias Exactas de la

UNCPBA, Tandil, Provincia de Buenos Aires.

En cuanto a la infraestructura y equipamiento disponible, el grupo de Espectroscopia-LIBS posee

dos laboratorios de aproximadamente 40 m2, los cuales poseen dos láseres pulsados, dos

monocromadores y sensores con características específicas que permitieron el desarrollo de las

actividades propuestas.

ESTRUCTURA DE LA TESIS

Esta Tesis ha sido distribuida en capítulos con el fin de organizar la información. Las discusiones y

conclusiones obtenidas de cada estudio en particular, se abordan dentro de cada capítulo.

A partir del Capítulo II se presentan los conceptos básicos, mediante el desarrollo de un marco

teórico-conceptual, que son necesarios para la comprensión y el seguimiento de esta Tesis. Este se

divide en tres grandes bloques, por un lado, conceptos relacionados con plaguicidas, su clasificación,

marcos legales y métodos tradicionales de detección. Por el otro, una introducción a la

6

espectroscopia de plasmas producidos por láseres, fundamentos y aspectos teóricos. Por último, se

desarrollan los métodos quimiométricos utilizados en el análisis de datos LIBS.

A continuación, en el Capítulo III se describen los equipos experimentales utilizados para el registro

de señales, se exponen las metodologías utilizadas para el armado de muestras analíticas

representativas y de calibración, y por último se detallan los métodos empleados para la adquisición

y el procesamiento de datos mediante la técnica propuesta.

En el Capítulo IV, se desarrolla el análisis propuesto para la identificación y caracterización de

plaguicidas en muestras vegetales. Esto, mediante un estudio exhaustivo de parámetros

espectroscópicos con la consecuente obtención de una matriz de datos afín, que cumpla con los

requerimientos para la aplicación de métodos quimiométricos.

Por otra parte, en el Capítulo V, se exhiben los métodos y análisis llevados a cabo para lograr

cuantificar los elementos que forman parte de la composición de plaguicidas. Esto conlleva un

estudio de las líneas de emisión elegidas, con el fin de registrar señales LIBS a baja concentración de

los elementos de estudio.

En el Capítulo VI, se presenta un estudio detallado de caracterización de plasmas LIBS a partir del

cálculo y obtención de la temperatura y densidad electrónica, con el fin de optimizar la capacidad

analítica y la repetitividad de la técnica.

Finalmente, en el Capítulo VII, se exponen las conclusiones generales y perspectivas a futuro para la

eventual aplicación de los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral.

7

2 CAPÍTULO II: CONCEPTOS BÁSICOS

PLAGUICIDAS

Desde el comienzo mismo de la agricultura, asociado con el inicio de la vida sedentaria de los

humanos, los cultivos padecieron el ataque de plagas que los destruían y/o reducían drásticamente

su producción y el acopio de alimentos. Es por esto que desde hace mucho tiempo, se han empleado

distintas sustancias con el fin de evitar, reducir o combatir los daños y ataques de plagas. En un

principio, estas sustancias eran obtenidas de la naturaleza, como por ejemplo el azufre, pudiendo

considerarse como las precursoras de los plaguicidas. De esta forma, puede definirse a los

plaguicidas como sustancias químicas, líquidas o sólidas, que producen efectos tóxicos sobre ciertos

organismos vivos y que se utilizan, principalmente, para controlar plagas de la agricultura (Bedmar

2011b). Según el Codex Alimentarius (OMS/FAO 2005), se entiende por plaguicida a “cualquier

sustancia destinada a prevenir, destruir, atraer, repeler o combatir cualquier plaga, incluidas

especies indeseadas de plantas o animales, durante la producción y/o almacenamiento, transporte,

distribución y elaboración de alimentos, productos agrícolas o alimentos para animales, o que pueda

administrarse a los animales para combatir ectoparásitos”.

Desde la Revolución Industrial, donde comenzaron las fumigaciones, se utilizaban productos

derivados del petróleo como plaguicidas (Bedmar 2011b). Luego, en 1920 se crearon la mayoría de

los compuestos sintéticos existentes en la actualidad, a partir de compuestos de nitrógeno. Por

último, el crecimiento exponencial se produjo durante la Segunda Guerra Mundial, cuando se

difundió un insecticida basado en cloro, el DDT (Bedmar 2011a). Desde entonces se crearon por

síntesis química un gran número de sustancias plaguicidas, más eficaces para combatir plagas, pero

mucho más susceptibles de contaminar el ambiente y deteriorar la salud humana, lo que conllevó a

que en la actualidad se prohíba la aplicación de muchos de los plaguicidas más antiguos (Bedmar

2011b).

El actual modelo de agricultura industrial o modelo extractivo ha pretendido que la química,

mediante la síntesis de plaguicidas, controle a la biología, simplificando así la toma de decisiones.

Sin embargo, dentro de este modelo, no se ha tenido en cuenta que el uso excesivo de plaguicidas

presupone un serio riesgo. La dependencia de plaguicidas es sólo una solución a corto plazo,

8

teniendo en cuenta que son sustancias tóxicas que exhiben una elevada peligrosidad en su

fabricación debido a sus formulados y conllevan peligros para los agricultores que están en contacto

con los mismos (Aparicio et al. 2015). También, presentan una marcada peligrosidad en el medio

ambiente debido a su persistencia en el suelo, cuerpos de agua y en el aire, y finalmente para los

seres vivos, consumidores de alimentos contaminados con residuos (Akoto, Azuure y Adotey 2016;

Elgueta et al. 2019).

En este contexto, el desafío que se plantea a quienes toman decisiones de manejo de sistemas

agrícolas, es lograr los máximos rendimientos con la mínima dependencia de insumos externos,

debido a los posibles perjuicios ambientales y sociales de su utilización.

Para asegurar que las aplicaciones de plaguicidas no tengan efectos tóxicos en organismos no

blancos (aquellos a los cuales no va dirigida la aplicación de estos químicos) y en el ambiente, se han

sancionado normas y establecido procedimientos que los fabricantes de estos productos deben

respetar. Las entidades legalmente competentes deben evaluar si es aceptable el riesgo que resulta

del almacenamiento de un plaguicida en centros de distribución, de la manipulación del envase por

el usuario final, de los procedimientos recomendados para cada aplicación, y de la distancia entre

el área a tratar y las zonas residenciales, entre otras cuestiones. Son los organismos de control

quienes deben verificar y controlar en forma sistemática tanto el cumplimiento de las normas de

uso y la contaminación ambiental, como los efectos agudos y crónicos que se puedan registrarse en

ámbitos hospitalarios. Sin embargo, en la mayoría de los países, incluida la Argentina, las entidades

públicas y privadas han hecho un seguimiento insuficiente del uso de plaguicidas, provocando de

esta forma la presencia de los mismos en el ambiente y los alimentos (Wolansky 2010).

2.1.1 Clasificación de plaguicidas

Actualmente se distinguen tres criterios diferentes para clasificar a los plaguicidas (Henao and Nieto

2003):

1) Clasificación de los plaguicidas según el tipo de organismo que se desea controlar, es decir

el campo de acción al que fueron destinados. Según este criterio, la Agencia de Protección

del Medio Ambiente de Estados Unidos (Environmental Protection Agency. 2020) clasifica a

los plaguicidas como se describe a continuación en la Tabla 2.1.

9

Tabla 2.1. Clasificación de plaguicidas según su campo de acción.

Tipo Acción principal

Insecticidas Control de insectos

Fungicidas Control de hongos causantes de

enfermedades

Herbicidas Luchan contra las malezas, ya sea de un modo

general o selectivo, es decir, dejando

indemne al cultivo y destruyendo todas o

buena parte de las malezas.

Acaricidas Combaten la araña roja y los ácaros

Nematicidas Control de nematodos

Molusquicidas Control de babosas y caracoles

Rodenticidas Control de roedores

Desinfectantes del suelo Su acción se extiende a nematodos, insectos,

hongos y malas hierbas que se encuentran en

los suelos destinados a cultivo

Antibióticos de uso agrícola Luchan contra las bacteriosis propias de los

cultivos

Reguladores fisiológicos Aceleran o retardan el crecimiento, estimulan

la floración o fructificación o cambian en

alguna forma el comportamiento normal de

la planta

Repelentes Usados para ahuyentar las plagas

Atrayentes Usados para atraer las plagas (trampa)

Defoliantes Provocan las caídas de las hojas sin matar las

plantas

2) Clasificación de los plaguicidas según el grupo químico (Mattice 2010), los más importantes

se describen a continuación en la Tabla 2.2:

10

Tabla 2.2. Clasificación de plaguicidas según el grupo químico.

Tipo Uso principal

Organoclorados Insecticida

Organofosforados Insecticida

Piretroides Insecticidas

Ureas sustituidas Herbicida

Carbamatos Insecticidas

Fenoles Insecticida

Triazinas Herbicida

Organometálicos Fungicida

Derivados de ácido carboxílico Herbicida

Neonicotinoide Insecticidda

3) Clasificación según la toxicidad aguda: La Organización Mundial de la Salud (OMS)

(Organización Mundial de la Salud 2019) ha recomendado - sujeta a actualizaciones

periódicas - una clasificación de plaguicidas según el grado de peligrosidad, entendiendo a

ésta como su capacidad de producir daño agudo a la salud cuando se dan una o múltiples

exposiciones en un tiempo relativamente corto. Uno de los métodos utilizados para

expresar la toxicidad aguda es la dosis letal media que corresponde a la cantidad de

plaguicida (dosis letal) necesaria para causar la muerte del 50% de los animales de

experimentación usados en una prueba. Generalmente se usan ratas para los ensayos y de

estas mediciones se estima el efecto que pueda tener en los seres humanos. Mientras más

tóxico es el plaguicida, menos cantidad se necesita para matar al animal de

experimentación. La dosis letal media se representa como DL50. Se expresa en miligramos

del ingrediente activo por kilogramo de peso vivo del animal (mg/kg). A partir de esto, se ha

establecido una clasificación toxicológica de los plaguicidas de uso agrícola de acuerdo con

el riesgo que representa su uso para las personas, con el fin de recomendar precauciones

para su manipulación y aplicación. Lo expuesto anteriormente puede observarse en la tabla

a continuación (Tabla 2.3).

11

Tabla 2.3. Clasificación de plaguicidas según la toxicidad aguda.

Clase Toxicidad DL50 (mg/kg)

Clase IA Extremadamente peligrosos 0 -5

Clase IB Altamente peligrosos 5-50

Clase II Moderadamente peligrosos 50-100

Clase III Ligeramente peligrosos 500

2.1.2 Límite Máximo de Residuos de Plaguicidas

La aplicación desmedida de plaguicidas, sin considerar buenas prácticas de manejo, en los cultivos

puede provocar la aparición de residuos, incluidos sus metabolitos y los productos resultantes de su

degradación o reacción en alimentos o el ambiente. Cuando un plaguicida es aplicado en vegetales

o frutas puede absorberse o quedar en la superficie del cultivo, a su vez, si es aplicado sobre el suelo

puede ser absorbido por las raíces. A medida que transcurren los días, su concentración empieza a

reducirse, a esa pequeña porción que permanece sobre el cultivo o suelo se denomina residuo de

plaguicida. De esta forma, los residuos excesivos de plaguicidas se han convertido en un “asesino”

oculto en la mesa y en una gran amenaza para la seguridad y la salud alimentaria (Gómez Ramos

2013).

El control de plaguicidas ha cobrado una mayor importancia para la sociedad debido al mayor

conocimiento de los potenciales peligros asociados a su uso junto con la disponibilidad de datos

sobre su presencia en el ambiente (Akoto, Azuure, and Adotey 2016; Besson et al. 2017; Campos et

al. 2016, Bernieri et al. 2019). En este sentido, la legislación ambiental mundial establece límites

máximos permitidos de residuos de plaguicidas en aguas y alimentos cada vez más estrictos, lo que

conlleva la necesidad de realizar varios controles para asegurar que los productos agroalimentarios

están exentos de plaguicidas o bien que éstos se encuentran en concentraciones inferiores a los

valores permitidos (Aparicio et al. 2015; Boa 2016).

En 1966, la comisión del Codex Alimentarius (OMS/FAO 2005) creó el Comité del Codex sobre

Residuos de Pesticidas (CCRP) con el objetivo de fijar los Límites Máximos de Residuos (LMR) en

productos de origen animal y vegetal. Según la misma, se entiende por residuos de plaguicida a

“cualquier sustancia especificada presente en alimentos, productos agrícolas o alimentos para

12

animales como consecuencia del uso de un plaguicida”. El término incluye cualquier derivado de un

plaguicida, como productos de conversión, metabolitos y productos de reacción, y las impurezas

consideradas de importancia toxicológica (Boa 2016). Por otro lado, también se define el límite

máximo para residuos de plaguicida (LMRP) como “la concentración máxima de residuos de un

plaguicida (expresada en mg/kg), recomendada, para que se permita legalmente su uso en la

superficie o la parte interna de productos alimenticios para consumo humano y de piensos”.

Por tanto, es absolutamente necesario un control exhaustivo de los niveles de presencia de

plaguicidas en los productos de origen agrícola y de ahí el interés de desarrollar una metodología

analítica adecuada y rápida para la detección y cuantificación de plaguicidas. También, es

importante señalar que si los plaguicidas se aplican correctamente a los cultivos para los que han

sido elaborados, siguiendo las correspondientes medidas de seguridad, aplicando las dosis

adecuadas y respetando los correspondientes días de descanso (tiempos de carencia), el riesgo de

contaminación se reduce considerablemente.

2.1.3 Métodos analíticos convencionales para la detección de plaguicidas en alimentos

A raíz del conocimiento de los peligros de la presencia de los residuos de plaguicidas en alimentos y

el ambiente, es necesario encontrar métodos analíticos que permitan su detección de forma rápida

y eficaz, lo que viene asociado al empleo de equipos e instalaciones y técnicas adecuadas (Aparicio

et al. 2015).

Los métodos analíticos para la detección de residuos de plaguicidas en alimentos, tradicionalmente

usados, se basan generalmente en separación cromatográfica, tanto líquida (CL) como gaseosa (CG).

Muchos métodos homologados de análisis están basados en esta técnica, en los que se utilizan

diferentes detectores, como el de nitrógeno y fósforo (NPD), de captura electrónica (ECD), de

ionización de llama (FID) o de espectrometría de masas (MS). En este último caso, dada las ventajas

actuales que presenta la detección por MS, ésta es cada vez más utilizada (Andreu and Picó 2004).

Sin embargo, existen una gran variedad de compuestos que, debido a su inestabilidad térmica, baja

volatilidad y/o alta polaridad, no pueden determinarse por cromatografía (Ding, Liu, and Yeh 2000).

Este hecho ha provocado que la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) haya ido ganando

terreno en el análisis de este tipo de compuestos, y más aún, con su versión acoplada a un

espectrómetro de masas (Beyer and Biziuk 2008).

13

Dado que las técnicas cromatográficas, si bien constituyen técnicas de referencia, requieren de

equipos costosos y personal altamente calificado. Además, son métodos que demandan una

preparación de muestra compleja y de una inversión inicial muy elevada. Es por esto que,

actualmente se ha trabajado en el desarrollo de alternativas analíticas que sean más simples,

rápidas y económicamente sustentables que los métodos cromatográficos tradicionales.

2.1.4 Situación actual en Argentina

Marco Regulatorio en el control de plaguicidas: breve reseña.

Como ya se nombró, la Comisión del Codex Alimentarius de la FAO y la OMS (OMS/FAO 2005), fijó

los LMRP en productos de origen animal y vegetal. A nivel europeo, existe el reglamento CE N°

396/2005 del parlamento y consejo europeo del 23 de febrero de 2005 que estableció los niveles

máximos de plaguicidas en productos de origen animal y vegetal, para todos los países miembros

de la Unión Europea en alimentos y piensos de origen vegetal y animal (Reglamento (CE) No

396/2005 del Parlamento Europeo y del Consejo 2005).

En Argentina, la norma de presupuestos mínimos actualmente existente es la Ley Nacional N° 27.279

“de productos fitosanitarios” que lo único que regula es la gestión de los envases vacíos de

plaguicidas y no los productos en sí. Existen otras Leyes Nacionales que están en relación al impacto

ambiental de sustancias químicas, la Ley Nacional N° 24.051 de Residuos Peligrosos, en la que se

mencionan algunos agroquímicos y las Leyes Nacionales de agroquímicos que se explican a

continuación (Aparicio et al. 2015):

• Ley Nacional N° 18073: Prohibición de sustancias para el tratamiento de praderas naturales o

artificiales y para el tratamiento de algunas especies animales. Esta Ley fue sancionada el

20/01/1969; promulgada el 20/01/1969 y publicada el 27/03/1969.

• Ley Nacional N° 18.796: Modificación al Régimen de Plaguicidas; sancionada el 20/10/1970;

promulgada el 02/10/1970 y publicada el 08/10/1970.

• Ley Nacional N° 20.418: Tolerancias y límites administrativos de residuos de plaguicidas;

sancionada el 18/05/1973; promulgada el 18/05/1973 y publicada el 22/06/1973.

14

Estas leyes se refieren a plaguicidas que han sido prohibidos a nivel nacional e internacional, como

por ejemplo los plaguicidas organoclorados. La normativa argentina con respecto a la regulación de

los plaguicidas en el territorio es escasa y es necesaria la actualización de las mismas.

Producción hortícola

En la Argentina la producción de cultivos se extiende a lo largo del país debido a la amplia diversidad

de climas. Más precisamente, el cultivo de hortalizas, campo de estudio en esta Tesis Doctoral, tiene

sus epicentros en ciertas provincias, a saber Buenos Aires, Mendoza, Córdoba, Santiago del Estero,

Misiones, Santa Fe, Corrientes, Tucumán, Formosa, Salta, Chaco, Jujuy, San Juan y Río Negro. La

diversidad de variedades, los altos rendimientos y la época de producción permiten abastecer a

diversos mercados durante todo el año (Adlercreutz et al. 2014; Aparicio et al. 2015). En la Provincia

de Buenos Aires los cinturones hortícolas se sitúan alrededor de ciudades densamente pobladas,

como la ciudad costera de Mar del Plata, Buenos Aires y La Plata.

La producción total hortícola en el país oscila entre los 8 y 10 millones de toneladas, de las cuales

nueve especies (papa, tomate, cebolla, batata, zapallo, zanahoria, lechuga, poroto, ajo) representan

el 65 %; participan con el 20 % otras ocho especies (acelga, mandioca, zapallito, sandía, melón,

choclo, berenjena y pimiento) y el restante 15 % está cubierto por las demás hortalizas (Ferratto et

al. 2010).

En la Argentina, es el Servicio de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (SENASA) (Paz 2016), es el

organismo estatal encargado de controlar los registros, las autorizaciones de uso y comercialización,

suspensión y/o cancelación de los plaguicidas, en el sistema productivo de cultivos extensivos y

frutihortícola. Este organismo depende del Ministerio de Agroindustria de la Nación y su

funcionamiento está regulado por una Resolución de la Ex Secretaria de Agricultura de la Nación

Nro 350/1999. Dicha resolución, conjuntamente con el Decreto del Poder Ejecutivo Nacional

1585/96 le otorga funciones al SENASA para establecer condiciones de uso de los plaguicidas, entre

ellas, los valores de LMRP. Es el SENASA quien debe controlar que los alimentos no superen esos

límites y se fijan sobre tres aspectos fundamentales: i) buenas prácticas agrícolas utilizadas en el

manejo de los productos fitosanitarios; ii) la toxicidad del producto que indica su peligrosidad y, iii)

la ingesta de un alimento por parte del consumidor que puede contener residuos de fitosanitarios,

lo que determina el grado de exposición de un consumidor a ese producto.

15

La Resolución 934/2010 del SENASA establece cuáles son los límites máximos de residuos de los

distintos plaguicidas; y cuentan con una regla por defecto según la cual si no se fijó un valor de LMRP

sobre un alimento determinado, se aplicará el valor 0,01 mg/kg. En la Unión Europea, se ha

avanzado en la fijación de valores de LMRP sobre los alimentos, siguiendo los lineamientos del

Codex Alimentarius, por lo tanto, la mayoría de los alimentos contienen, en Europa, un valor de

LMRP superior al 0,01 mg/kg (Reglamento (CE) No 396/2005 del Parlamento Europeo y del Consejo

2005). Sin embargo, estos valores escasas veces suelen alcanzarse en los alimentos de consumos,

en algunos casos encontrándose valores hasta tres órdenes de magnitud por encima (EFSA 2017;

Paz 2016).

Plaguicidas que pueden hallarse en los alimentos de consumo habitual

Los resultados de los controles llevados a cabo por SENASA (2011/2016) (Paz 2016), sobre frutas y

verduras, arrojaron la presencia de 80 plaguicidas; entre ellos, cuatro sustancias que están

prohibidas y otras seis que no están autorizadas. También hay que tener en cuenta que se utilizan

plaguicidas en cultivos que no cuentan con permisos, y otros que superan ampliamente los límites

máximos autorizados. En esa oportunidad, se informó que en el 63% de los controles realizados

entre 2011 y 2013 se detectó la presencia de restos de plaguicidas. Además, el 7% de las muestras

tomadas entre 2014 y 2016 tenían exceso de insecticidas, herbicidas y fungicidas. En la Figura 2.1

pueden visualizarse los diez alimentos que son consumidos por humanos y que arrojaron la mayor

carga de plaguicidas en el estudio.

16

Figura 2.1. Los diez alimentos con mayor carga de plaguicidas en Argentina. Fuente: Informe del SENASA

(2011/2016).

Al mismo tiempo, el SENASA comunicó en su informe los 10 plaguicidas con mayor presencia en

alimentos. Estos se pueden observar en la Figura 2.2.

Figura 2.2 Los diez plaguicidas con mayor presencia en alimentos. Fuente: Informe del SENASA (2011/2016).

Es por esto que, esta Tesis Doctoral se ha centrado en la detección de los principales cinco

plaguicidas de uso común en la producción agrícola intensiva y que han sido detectados en

19

20

21

22

23

24

25

26

Manzana Acelga Espinaca Lechuga Mandarina Pomelo Albahca Limón Naranja Achicoria

Can

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(u.a

.)

17

alimentos: clorpirifos, carbendazim, cipermetrina, imidacloprid y dimetoato. Se presenta a

continuación un breve resumen de los mismos agrupados según su clasificación química.

Insecticida neonicotinoide

Se los conoce como la generación moderna de insecticidas seguros. Pertenecen a la familia de

insecticidas que actúan en el sistema nervioso central de los insectos y, con menor toxicidad, en

vertebrados (aves y mamíferos). Los neonicotinoides están entre los más usados a nivel mundial,

pero recientemente el uso de ciertos productos químicos de esta familia está siendo restringido en

algunos países, debido a una posible conexión con el desorden del colapso de colonias apícolas (Gill,

Ramos-Rodriguez, and Raine 2012; Tsvetkov et al. 2017).

En 1991 Bayer AG comienza a comercializar el primer neonicotinoide, imidacloprid (CONFIDOR®).

El imidacloprid es una sustancia con actividad insecticida por vía sistémica, por lo que puede ser

aplicado tanto vía foliar como vía radicular, a través del agua de riego (Drop Data 2010). Tiene efecto

residual prolongado en el suelo y está etiquetado como utilizable para el control de plagas,

tratamiento de semillas, para el control de termitas y pulgas y como un insecticida sistémico

(cucarachas y hormigas). Es posiblemente el insecticida de uso más extendido, tanto en el modo de

acción como en el mercado global. Actualmente se aplica al suelo, semillas, madera y pastos, como

también en tratamientos foliares en cultivos como cereales, algodón, granos, leguminosas, papas,

arroz, frutales, césped y vegetales. Además, cabe destacar que las tasas de aplicación de los

insecticidas neonicotinoides son mucho menores que las de los insecticidas usados previamente

(Covance Inc 2020).

Imidacloprid está catalogado actualmente como "moderadamente tóxico" por la OMS (Organización

Mundial de la Salud 2019) y la Agencia de Protección del Medio Ambiente de Estados Unidos

(Morera Rodríguez 2015) (Clase II o III, requiriendo una etiqueta de "Peligro" o "Precaución"), y una

potencialidad de ser contaminante de aguas subterráneas. Está catalogado como "probable"

carcinógeno por la EPA (grupo E), y no está en la lista de tóxicos para el sistema endocrino,

reproductivo o de desarrollo, o como un producto químico con problemas especiales con alguna

especie. No está prohibida, restringida o es ilegal su importación en ningún país. Sin embargo, ha

sido prohibido su uso como pesticida en Francia desde 1999. La tolerancia de residuos de

18

Imidacloprid en los alimentos varía entre las 0,02 mg/kg en los huevos a los 3,0 mg/kg en lúpulo

(Wagner 2016).

Fórmula semidesarrollada: C9H10ClN5O2

Fórmula molecular:

Insecticida organofosforado

Se comenzaron a utilizar luego de ser comprobada la toxicidad de plaguicidas organoclorados,

surgiendo como una segunda gran generación de plaguicidas no- bioacumulables, pero de toxicidad

alta en mamíferos (Carod Benedico 2002). Son sustancias orgánicas derivadas de la molécula de

ácido fosfórico y tuvieron un uso extendido histórico como “gases nerviosos” durante la segunda

guerra mundial (Carod Benedico 2002).

El dimetoato es un insecticida y acaricida organofosforado ampliamente utilizado. Fue patentado e

introducido en la década de 1950 por American Cyanamid. Al igual que otros organofosforados, el

dimetoato es un inhibidor de la acetilcolinesterasa que desactiva la colinesterasa, una enzima

esencial para la función del sistema nervioso central (Dauterman et al. 1960). Actúa tanto por

contacto como por ingestión. Se absorbe y distribuye fácilmente a través de los tejidos de las

plantas, y se degrada con relativa rapidez (Dauterman et al. 1960). Su periodo de semidegradación

oscila entre 18 horas y 8 semanas, y no es previsible que perdure en el agua, aunque es

relativamente estable a pH de 2 a 7 (Organización Mundial de la Salud 2012). Se ha calculado que la

ingesta diaria total procedente de los alimentos es de 0,001 μg/kg de peso corporal (Organización

Mundial de la Salud 2019). Fue catalogado como "moderadamente peligroso" por la OMS

(Organización Mundial de la Salud 2019) y la Agencia de Protección del Medio Ambiente de Estados

Unidos (clase II, moderadamente tóxico) (Morera Rodríguez 2015).

19

Fórmula química: C5H12NO3PS2

Fórmula molecular:

Por otra parte, el Clorpirifos es un organofosforado, este producto fue registrado por primera vez

en los Estados Unidos de América en 1965, fue permitido para uso residencial hasta el año 2000

cuando fue restringido por la EPA (Environmental Protection Agency 2006).

Los residuos de clorpirifos han sido asociados con una disminución en los niveles de la Hormona

Tiroxina (T4) y con un aumento en los niveles del estradiol en ovejas (Morales and Rodríguez 2004).

Se ha asociado además con bajo peso al momento del nacimiento, menor circunferencia craneal en

niños cuyas madres fueron expuestas en forma crónica al pesticida y efectos neurológicos en el feto

y los niños, incluso en cantidades muy pequeñas (Morales and Rodríguez 2004). Para los efectos

agudos, la EPA clasifica el clorpirifos como Clase II: Moderadamente tóxico (Morera Rodríguez

2015).

Fórmula química: C9H11Cl3NO3PS

Fórmula molecular:

Insecticida Piretroide

20

Se los conoce como los insecticidas más seguros en comparación a los organoclorados y

organofosforados. Los piretroides son un grupo de pesticidas artificiales desarrollados para

controlar preponderantemente las poblaciones de insectos plaga (Costa, Galli, and Murphy 1987).

Son neurotóxicos y actúan modulando los canales de sodio y potasio en las membranas neuronales.

Poseen una toxicidad alta para insectos y muy baja para mamíferos (Agencia para sustancias Tóxicas

y Registro de Enfermedades 2003). Son altamente bioconcentrados en peces, dependiendo de la

especie, la edad y otros factores; sin embargo no sufren biomagnificación en cadenas tróficas

(Agencia para sustancias Tóxicas y Registro de Enfermedades 2003). Su presencia en los sedimentos

de fondo en ecosistemas acuáticos puede resultar tóxica para organismos bentónicos, si están

biodisponibles, o para invertebrados de niveles tróficos inferiores, por poseer sistemas de

detoxificación deficientes (Agencia para sustancias Tóxicas y Registro de Enfermedades 2003).

La cipermetrina es un insecticida del grupo de los piretroides. Actúa como insecticida del estómago

y de contacto (Leahey 1985). Tiene amplitud de usos en el algodón, los cereales, los vegetales y las

frutas, para el almacenaje de la comida, en salud pública y en la cría de los animales. La cipermetrina

está clasificada por la OMS, como "moderadamente dañina" (clase II) (Organización Mundial de la

Salud 2019). Esta interactúa con los canales de sodio en las células nerviosas. Estos canales pueden

permanecer abiertos por segundos, a diferencia del período normal de pocas milésimas de segundo,

después de la transmisión de la señal (Vergara-Chen et al. 2019). La cipermetrina también interfiere

con otros receptores en el sistema nervioso, el efecto resultante es una larga secuencia de impulsos

repetitivos en los órganos sensitivos (Vergara-Chen et al. 2019).

Fórmula química: C22H19Cl2NO3

Fórmula molecular:

Fungicidas

21

Los fungicidas son sustancias tóxicas que se emplean para impedir el crecimiento o eliminar los

hongos y mohos perjudiciales para las plantas o los animales (Barioglio 2006). Todo fungicida, por

más eficaz que sea, si se utiliza en exceso puede causar daños fisiológicos a la planta (Barioglio 2006).

El carbendazim se utiliza ampliamente como fungicida bencimidazólico de amplio espectro (Cámara

de Sanidad Agropecuaria y Fertilizantes 2011). Si bien es de baja toxicidad aguda, está relacionado

con múltiples efectos crónicos en la salud (Red de Acción en Plaguicidas y sus alternativas para

América Latina (RAP-AL) 2008). Los efectos incluyen toxicidad hepática, toxicidad para el desarrollo,

como malformaciones en los ojos del feto, malformaciones en el cerebro, aumento de la mortalidad

y efectos reproductivos (principalmente en los testículos). Es considerado como posible cancerígeno

para seres humanos, mientras que la toxicidad aguda según la OMS es U (poco probable que

presente toxicidad aguda en uso normal) (Organización Mundial de la Salud 2019).

Fórmula química: C9H9N3O2

Fórmula molecular:

22

ESPECTROSCOPIA DE PLASMAS PRODUCIDOS POR LÁSER

2.2.1 Plasma y láseres

La clasificación de los cuatro elementos clásicos que definieron los antiguos griegos, tierra, aire,

agua y fuego (denominados elementos aristotélicos), data de aproximadamente 450 años a. C.,

estos persistieron hasta el Renacimiento y constituían toda la materia terrenal. Durante muchos

siglos, se consideró que sólo se encontraban tres estados de la materia, sólido, líquido y gaseoso,

siendo el agua la sustancia que mejor los representa, por ser la única que existe de forma natural

en los tres estados (Bellan 2008). Estos estados suelen encontrarse bajo determinadas

características y presentan propiedades particulares. Pero el desarrollo de nuevas tecnologías, para

producir en los laboratorios condiciones cada vez más extremas y energéticas, ha permitido que en

los últimos años se hayan descubierto otros estados. Así surge el estado plasma, siendo la forma en

la que se presentan los gases contenidos en el interior de las luces de neón, los tubos fluorescentes

y, por supuesto, las pantallas de plasma (Bellan 2008). También es el estado que caracteriza a las

auroras boreales y a los rayos. De hecho, se estima que el 99% de la materia del universo observable

es plasma formando parte del Sol, estrellas, nebulosas y pueden ser fácilmente detectables ya que

emiten luz. En cambio, en la Tierra los plasmas son mucho más escasos (Gurnett and Bhattacharjee

2005).

La denominación “plasma” se le atribuye, por primera vez, a Irving Langmuir, en la década del 90,

(premio Nobel en Química en 1932). Se puede definir como un medio parcial o totalmente ionizado,

en el que coexisten electrones libres, aniones, cationes y átomos neutros. La densidad de cargas

positivas y negativas es igual y por tanto se puede considerar electrónicamente neutro. En cuanto a

su comportamiento es similar al de los gases, con la excepción que dentro del plasma las partículas

tienen un comportamiento colectivo, encontrándose ligadas a través de fuerzas electromagnéticas

generadas entre ellas, siendo un buen conductor eléctrico (Bellan 2008). Otra importante diferencia

es la posibilidad de confinamiento lejos de las paredes del recipiente donde fue generado, así como

su manejo espacial (Fitzpatrick 2008).

Por otro lado, el gran poder del láser se demostró poco después de su invención cuando un rayo

láser enfocado produjo un destello en el aire similar a la chispa producida por la descarga de un rayo

entre dos nubes (Singh and Thakur 2007). Esto es debido a que, cuando se enfoca un rayo láser de

23

alta intensidad se genera un plasma a partir del material ablacionado. Los efectos del láser han

encontrado muchas aplicaciones tecnológicas, en el campo de la metalúrgica, producción de plasma

y semiconductores (J. P. Singh and Thakur 2007).

En los últimos años ha habido un notable interés tanto en una mayor comprensión de los plasmas

producidos por láser (Laser-Induced Plasma, LIP por sus siglas en inglés) como en el desarrollo de

sus aplicaciones. La espectroscopia de emisión se utiliza para el análisis elemental de objetos a partir

de los cuales se genera el plasma luminoso, obteniendo información valiosa en la composición de la

muestra y también se puede aplicar para determinar la temperatura, la densidad de electrones y

densidad de átomos en el LIP (Rusak et al. 1997).

TÉCNICA LASER INDUCED BREAKDOWN SPECTROSCOPY (LIBS)

La técnica Laser Induced Breakdown Spectroscopy (LIBS) ha resultado ser una herramienta de gran

utilidad, complementaria de la Espectrometría Analítica desde las últimas décadas (Winefordner et

al. 2004). Los principios de este tipo de análisis son similares a los utilizados por la Espectrometría

de Emisión Atómica (AES) convencional, que hace uso de plasmas de relativamente baja

temperatura, con un determinado protocolo de preparación de muestras. Estos procedimientos de

preparación son innecesarios en la técnica LIBS, lo cual da una ventaja considerable en dicho análisis

(C. A. D’Angelo et al. 2015).

Las técnicas de Espectrometría con Láser resultan versátiles para análisis químico debido a que

pueden hacerse monitoreos a tiempo real con buena sensibilidad y buena selectividad (Cremers and

Radziemski 1989). Sin embargo, pese a esos atributos, para que resulte de interés tecnológico o

como instrumental de campo, requiere otro nivel de investigación y desarrollo. Esto, con el fin de

demostrar en qué condiciones se puede asegurar estabilidad, confiabilidad y reproducibilidad de las

señales.

Los inicios de la técnica LIBS coinciden con la aparición del láser en la década del 60, donde aparecen

registros del análisis de plasmas generados por la interacción de láseres con medios gaseosos o

sólidos (Maiman 1969; Schawlow and Townes 1958). La técnica analítica LIBS emerge como tal en

1981 y es atribuida a los investigadores pioneros, que desarrollaron las primeras publicaciones de

plasmas generados sobre medios líquidos. En 1981 Loree et al. con su trabajo “Laser-induced

breakdown spectroscopy: Time-integrated applications” (Loree and Radziemski 1981) rebautizaron

24

la técnica con el acrónimo LIBS y a partir de entonces, esta técnica comenzó a ser de mayor

relevancia, y un número mayor de investigadores comenzó a trabajar con la misma permitiendo un

gran avance tanto en su conocimiento como sus aplicaciones. A su vez, los desarrollos actuales de

esta técnica para el análisis químico también se remontan al trabajo de Radziemski y Cremers

(Cremers and Radziemski 1989) y sus colaboradores, los cuales desarrollaron la técnica de

resolución temporal TRELIBS (time-resolved laser-induced breakdown spectroscopy) para controlar

y monitorear en tiempo real trazas de especies espectroscópicamente (Dudragne, Adam, and

Amouroux 1998).

En los últimos años, gran parte del trabajo de investigación en relación con esta técnica se ha

centrado en el desarrollo de instrumental, lo cual permitió que hoy pueda contarse con equipos

comerciales compactos, portátiles y sistemas para su uso en laboratorio con múltiples posibilidades

(Cremers and Radziemski 1989). Son varias las aplicaciones de esta técnica, se encuentran trabajos

realizados en diversos sólidos: metales, cerámicos, semiconductores, polímeros, preparados

farmacéuticos, suelos, dientes, metales sumergidos, hormigón, etc. (Garcimuño, Díaz Pace, and

Bertuccelli 2013; Labutin et al. 2014; L. J. Martino et al. 2019; Rehan et al. 2019; Santos et al. 2012;

Yao et al. 2017). En líquidos: agua, fundidos metálicos/vidrios, preparados farmacéuticos, fluidos

biológicos, aceites, lodos, etc. (Adamson et al. 2007; Ferrer et al. 2005; Multari et al. 2013; Terán et

al. 2019). Y por último, en gases: escapes industriales, monitoreo ambiental, combustibles,

aerosoles, etc. (Adamson et al. 2007; Gallou et al. 2011).

Comparada con otras técnicas de análisis químico presenta las siguientes ventajas (Fu et al. 2018):

1. Equipo simple: pocos instrumentos, bajo costo y fácil integración.

2. Análisis sin contacto: LIBS utiliza un láser pulsado como fuente de excitación y el estudio del

plasma se lleva a cabo mediante un análisis óptico. Esto hace que el análisis se produzca sin

contacto, especialmente en un entorno peligroso o en el campo de exploración espacial, lo que

conlleva a que tenga amplias posibilidades de aplicación.

3. Nula o escasa preparación de muestras: LIBS enfoca directamente el disparo del láser pulsado

sobra la muestra sin procesar o con un procesamiento mínimo.

4. Utilización de muestras en diferentes estados de agregación: las muestras pueden ser gases,

aerosoles, líquidos o sólidos.

25

5. Análisis no destructivo: el láser converge a la superficie de la muestra y solo se excita una

pequeña cantidad de la misma. Puede considerarse como no destructivo o casi no destructivo.

6. Análisis tridimensional: LIBS puede enfocar el láser en diferentes posiciones en la superficie de

la muestra, o repetir mediciones en la misma ubicación o en diferentes profundidades, para

extraer información de su composición y contenido.

7. Análisis de elementos totales: la energía del láser puede excitar simultáneamente todos los

elementos de la muestra, por lo que permite un análisis en forma simultánea.

8. Análisis remoto: el análisis de larga distancia del LIBS se puede lograr transmitiendo de forma

remota la energía del láser y recogiendo el espectro de emisión de plasma a través de una fibra

óptica o por la atmósfera.

9. Análisis en línea: LIBS es una tecnología muy rápida que proporciona resultados analíticos en

segundos, lo que la hace particularmente adecuada para análisis rápidos o monitoreo industrial

en línea.

En la Figura 2.3 se muestra el comportamiento de la técnica LIBS frente a los requerimientos ideales

de las técnicas espectroscópicas:

Figura 2.3. Comportamiento de la técnica LIBS frente a los requerimientos ideales para una técnica

espectroscópica. (Adaptado de Moncayo 2017).

0123456789

Preparación demuestras

Líquidos, sólidos y gases

Interferenciasespectrales

Efecto matriz

CalibraciónUso de varias regiones

espectrales

Adquisición simultáneadel espectro

Adquisición simultáneade elementos

Compatibilidad conotras técnicas

Características espectroscópicas LIBS

26

Dentro de las desventajas podemos mencionar que, aunque la técnica es simple, los procesos

involucrados: ablación, atomización y excitación, son complejos y difíciles de reproducir. Por otra

parte se pueden enumerar las siguientes limitaciones (Cremers and Radziemsky 2006):

1. Inestabilidad de las señales espectroscópicas.

2. Fluctuaciones de la intensidad láser.

3. Parámetros geométricos que varían.

4. Efectos matriz propios de la composición de la muestra (composición química, propiedades

físicas, compactación, humedad).

A pesar de sus limitaciones anteriormente mencionadas, existen distintas maneras de mejorar y

superar la mayoría de los inconvenientes, optimizando tanto la sensibilidad como la

reproducibilidad, con el fin de disminuir los límites de detección y cuantificación de la técnica.

2.3.1 Fundamentos de la técnica LIBS

LIBS es una técnica analítica, relativamente sencilla y útil para el análisis cualitativo y cuantitativo

de la composición química de muestras, ya sean sólidas, líquidas o gaseosas. Esto se realiza

mediante el análisis de las líneas de emisión atómica a partir de un plasma creado en el blanco

(Cremers and Radziemsky 2006). La técnica utiliza, como fuente de excitación, un láser pulsado de

alta energía enfocado dentro o en la superficie del medio en estudio, provocando una chispa

(plasma) apta para el diagnóstico, que brinda información respecto de los componentes del medio

en cuestión. Esto es a partir del estudio de las líneas espectrales de emisión de las especies que

conforman el plasma: iones, átomos neutros y moléculas simples. En el plasma formado se alcanzan

temperaturas de aproximadamente 15000 K, y se obtienen densidades electrónicas del orden de

1017 electrones/cm3; en esas condiciones el material se separa en sus componentes atómicos y con

alto grado de ionización produciendo emisión muy intensa de luz. Una parte de la luz del plasma se

recoge y un espectrómetro dispersa la luz emitida por las especies atómicas e iones excitados, un

detector registra las señales de emisión dispersadas, y por medio de una configuración electrónica

se digitalizan y muestran los resultados para su posterior análisis.

27

2.3.2 Formación de plasmas LIBS (Cremers and Radziemsky 2006)

En una primera instancia el pulso laser es enfocado sobre la superficie de un material, el material

absorbe la energía de la luz láser aumentando su temperatura casi instantáneamente en

aproximadamente 15000 K. Esta alta temperatura provoca la fusión y la evaporación del material,

debido a esto ocurre la ruptura de los enlaces que ligan a los átomos, luego se da la ionización y por

consecuencia se forma el plasma. Tras la finalización del pulso de luz láser, el plasma continúa

expandiéndose rápidamente en el entorno provocando una onda de choque (que se caracteriza por

su sonoridad); al mismo tiempo, se pueblan los niveles excitados de los átomos por medio de

procesos colisionales y absorción multifotónica. Posteriormente, hay una intensa emisión de luz que

formará un espectro característico.

La luz emitida por el plasma se caracteriza por tener un espectro de emisión continuo y discreto. El

continuo se debe principalmente a eventos bremsstrahlung y recombinación. En el proceso

bremsstrahlung, los fotones son emitidos por electrones acelerados o desacelerados en colisiones.

La recombinación ocurre cuando un electrón libre es capturado en un nivel de energía iónica o

atómica y abandona su exceso de energía cinética en forma de fotón. La luz del plasma es producida

por las emisiones de las transiciones espontaneas de los iones, átomos y moléculas en el plasma.

En un rango de tiempo de alrededor de 100 ns y algunas decenas de microsegundos, la emisión del

fondo del plasma es mínima y prevalecen las emisiones atómicas de los elementos, las cuales

ofrecen información analítica del material. En este rango de tiempo se recomienda llevar a cabo el

registro del plasma. Finalmente, ocurre su enfriamiento, se condensa el plasma y se depositan

partículas residuales en la superficie del material ablacionado.

El registro temporal del plasma producido por láser se observa en la Figura 2.4, donde se muestra

que el plasma se inicia casi con el pulso láser. En los primeros instantes de tiempo, la luz del plasma

se caracteriza por un espectro de emisión continuo. Conforme avanza el tiempo el plasma decae

seguido por un espectro discreto de los iones, átomos neutros y moléculas que se forman a partir

de la recombinación de átomos.

28

Figura 2.4. Una descripción esquemática de la historia temporal de un plasma LIBS. Se muestran el tiempo

postbreakdown (tb) y tiempo de integración (tw). (Adaptado de Cremers 2006).

La resolución temporal de la intensidad de emisión del plasma permite la discriminación a favor de

la región temporal, donde predominan las señales que se ajustan a un modelo de plasma

determinado. Dos parámetros observables en la Figura 2.4 permiten encontrar esta región, el

tiempo postbreakdown o tiempo de retardo (tb), representa el tiempo transcurrido desde el inicio

del pulso láser hasta el inicio de la adquisición de la señal del espectro LIBS. El mismo comprende

tiempos del orden de las centenas de ns para plasmas a baja presión y de microsegundos para

presión atmosférica. Por otro lado, el tiempo de integración (tw), este representa el intervalo de

tiempo entre el inicio y el final de la adquisición del espectro LIBS, con magnitudes de decenas de

ns hasta varios microsegundos.

2.3.3 Modelos de plasmas LIBS

En las experiencias LIBS a presión atmosférica las líneas observadas presentan una alta absorción y

el plasma formado es generalmente inhomogéneo en los tiempos de registro habituales. En donde

se entiende por inhomogeneidad a la distribución desigual de temperatura en el volumen del

mismo. Esto origina inconvenientes a la hora de usar las intensidades de líneas espectrales medidas

para cuantificar el contenido de un componente en el plasma. Los modelos de emisión atómica en

los plasmas se plantean a partir de relaciones entre emisividad y absorbancia de dentro del mismo

(Corney 1977b).

29

Plasma absorbido homogéneo (Corney 1977a)

Como primera aproximación al caso general de plasma inhomogéneo, se tiene al modelo de plasma

absorbido homogéneo en donde se presenta una misma temperatura en todo el volumen del

plasma. La intensidad de emisión de radiación del plasma para este modelo queda expresada como:

𝐼(𝜆, 𝐿, 𝑘𝑇) =2ℎ𝑐2

𝜆5

(1 − exp [−𝜅(𝜆)𝐿])

(exp [𝐸𝑗 − 𝐸𝑖

𝑘𝑇] − 1)

(ec. 2.1)

En donde, 𝐸𝑗 − 𝐸𝑖 es la diferencia de energía entre el nivel superior j y el inferior 𝑖, 𝑇 es la

temperatura del plasma, 𝑘 es la constante de Boltzmann, ℎ es la constante de Planck, 𝑐 es la

velocidad de la luz y 𝜅(𝜆)𝐿 es el espesor óptico, expresado por:

𝜅(𝜆)𝐿 =𝜆2

4𝑁𝑘𝐴𝑗𝑖

𝑔𝑗

Q𝑘(T)exp (−

𝐸𝑖

𝑘𝑇) [1 − exp(−(𝐸𝑗 − 𝐸𝑖)/𝑘𝑇)] 𝑃(𝜆)𝐿

(ec. 2.2)

Siendo 𝑁𝑘 la densidad de los emisores en el plasma de un elemento k, con su correspondiente

estado de ionización. En este caso 𝜆 es la longitud de onda expresada en nm, 𝑔𝑗 es el peso

estadístico del nivel superior, Q𝑘(T) es la función partición del elemento involucrado en un

determinado estado de ionización, Aji la probabilidad de transición espontánea, 𝑃(𝜆) es la función

forma de línea que depende exclusivamente de 𝜆 y la longitud de la columna del plasma 𝐿.

En un plasma homogéneo, el espesor óptico determina la proporción de la intensidad de emisión,

dada por 𝐼, en donde se ve atenuada debido a los fotones que son absorbidos por emisores

desexcitados antes de abandonar el volumen del plasma. El valor de este término da información

del tipo de plasma, ya sean delgados, gruesos, o extremadamente gruesos. Este término es

independiente de las coordenadas de posición en todo el plasma.

El espesor óptico, como se puede ver en la ecuación (ec. 2.1), depende de los parámetros

espectroscópicos de línea de emisión considerada, temperatura, densidad electrónica, como así

también de la densidad de las especies emisoras presentes en el plasma. Es el responsable de la

saturación de las líneas debido a la absorción.

30

En muchos trabajos encontrados en la literatura se utiliza la aproximación a plasma homogéneo

para llevar a cabo los análisis (D’Angelo et al. 2015; Martino et al. 2019; Terán et al. 2019).

Aproximación a plasma delgado (Corney 1977a)

Si el término de 𝜅(𝜆)𝐿 (ec. 2.2) es suficientemente bajo, los efectos de autoabsorción son

despreciables, y el plasma se define como fino o delgado. En este caso, es posible hacer una

expansión del término exponencial de la ecuación (ec. 2.1) y se toman solamente los dos primeros

términos. Con esto, la intensidad de la línea espectral, correspondiente a la transición entre los

niveles 𝐸𝑗 𝑦 𝐸𝑖 de las especies atómicas con concentración 𝑁𝑘, vendrá dada por la conocida

expresión de plasma delgado (ec. 2.3).

𝐼(𝜆, 𝐿, 𝑘𝑇) =ℎ𝑐2

2𝜆3𝐴𝑗𝑖𝑁𝑘

𝑔𝑗

Q𝑘(T)exp (−

𝐸𝑗

𝑘𝑇) 𝑃(𝜆) 𝐿

(ec. 2.3)

2.3.4 Aspectos Analíticos de LIBS

La base de toda medición de LIBS es el espectro del plasma que contiene información acerca de los

elementos presentes en la muestra, donde pueden ser utilizados como una “huella digital espectral”

para diferenciar muestras mediante el uso de herramientas adecuadas. Esta información está en

forma de líneas de emisión localizadas en una región del espectro en particular, con una intensidad

de línea también particular. Dada su versatilidad la técnica LIBS ha sido aplicada en el análisis de un

gran número de muestras de diferente procedencia y con diferentes fines (Han et al. 2018; Hussain

and Gondal 2008; L. J. Martino et al. 2019).

Análisis cualitativo

Los análisis cualitativos son llevados a cabo con el fin de identificar muestras, clasificar una muestra

desconocida entre dos a más clases a partir de utilizar la misma matriz en el análisis, o determinar

presencia o ausencia de algún elemento. Para esto, es necesario establecer un cierto límite de

detección, este se define como la concentración que produce una intensidad neta de línea

equivalente a tres veces la desviación estándar del fondo, medidas en cercanías de la misma

(Internation Union of Pure and Applied Chemistry 1997). Puede evaluarse mediante la expresión:

31

𝐿𝑜𝐷 = 𝑘𝜎𝑏

𝑎

(ec. 2.4)

Donde 𝜎𝑏 es la desviación estándar del fondo y 𝑎 la sensibilidad, dada por la pendiente de la recta

de calibración. Se utiliza a menudo un nivel de confianza del 90% con k =3.

El límite de detección se debe considerar como la cantidad mínima de analito que puede

determinarse con un nivel aceptable de exactitud (Cremers and Radziemsky 2006). A su vez, puede

verse afectado por muchos parámetros de medición tales como la energía del láser, así como las

características de la muestras.

Es importante mencionar que cuando la línea o líneas de interés no son detectadas no implica

necesariamente que el elemento no está presente en la muestra, sino que puede encontrarse a una

concentración menor al límite de detección de la técnica y el correspondiente arreglo experimental.

Para lograr realizar la identificación cualitativa de la composición de un material es necesario tener

en cuenta algunos aspectos (Cremers and Radziemsky 2006):

▫ Conocimiento de la muestra.

En algunos casos es posible tener conocimiento de la composición elemental de la muestra, esto

permite realizar las mediciones sobre ciertos elementos que se garantiza que van a estar presentes

en las mismas. A su vez, permite que sea posible determinar o inferir la presencia de ciertos

compuestos moleculares en las muestras a partir del registro de líneas de emisión atómicas de las

mismas.

▫ Aparición en el espectro de varias líneas de emisión características de cada elemento.

Cuanto mayor sea el número de líneas de emisión que pueda asignarse a un mismo elemento, mayor

será la certeza que se tenga sobre su identificación.

▫ Contar con una base de datos de las líneas de emisión de los elementos.

En un plasma LIBS característico, es posible registrar varias líneas que pertenezcan a diversos

elementos que forman parte de la muestra, por lo que es crucial una identificación confiable y rápida

de las líneas de emisión en la ablación con láser de muestras multicomponentes. En la identificación

de elementos mediante LIBS, se utiliza la base de datos de espectros atómicos del Instituto Nacional

de Estándares y Tecnología (NIST, por sus siglas en inglés) (Kramida, Olsen, and Ralchenko 2019).

32

Esta base de datos informa, además de las líneas de emisión, las intensidades relativas medidas por

distintos métodos de excitación y las principales constantes espectroscópicas. A su vez, contar con

una base de datos propia, creada en iguales condiciones a las propuestas para el análisis con el fin

de ser representativas, puede ser de gran aporte en la identificación de líneas características. Las

mismas pueden ser creadas a partir de materiales de referencia o muestras creadas con tal fin,

donde se garantice la presencia del elemento a determinar.

▫ Grado de ionización del elemento.

En un plasma LIBS frecuentemente se encuentran especies neutras o una vez ionizadas. Si en la base

de datos, dos elementos tienen líneas que interfieren espectralmente, y una línea pertenece a una

especie neutra o una vez ionizada y la otra línea pertenece a una especie doble o triplemente

ionizada, lo más probable es que la línea observada pertenezca a la primera especie propuesta.

▫ Intensidad relativa de líneas.

Las intensidades relativas de las líneas (Rel. Int. (Kramida, Olsen, and Ralchenko 2019)) proporcionan

una descripción cualitativa de cómo se ve el espectro de emisión de un elemento particular en una

fuente particular y se pueden utilizar como una guía para ayudar a la identificación. Sin embargo,

cabe señalar que las intensidades relativas de las especies neutras e ionizadas no son directamente

comparables entre las etapas de ionización. Además, las intensidades relativas de las líneas de

emisión LIBS dependen, en cierta medida, de la matriz de la muestra, de las condiciones de

excitación y de las tasas de emisión/absorción.

▫ Condiciones experimentales.

Ciertas condiciones experimentales determinan la observación de los elementos presentes en una

muestra. Por ejemplo algunas líneas son observadas simplemente en condiciones de presión

atmosférica, sin embargo, para ciertos elementos atómicos es necesario contar con condiciones de

baja presión (Lochte - Holtgreven 1968). De esta forma, se produce un aumento de la intensidad de

emisión y de la relación señal/ruido. La mejora observada se debe principalmente a la reducción de

la protección del plasma, lo que resulta en una mayor ablación y un aumento de camino medio ente

colisiones. En los plasmas producidos en condiciones de baja presión o en presencia de un gas

determinado, la dinámica de la pluma del mismo es afectada, así como también las características

de emisión del plasma, el tamaño del cráter y la cantidad de muestra ablacionada (Effenberger and

Scott 2010).

33

▫ Condición de la superficie de la muestra.

Uno de los factores que afecta las mediciones llevadas a cabo mediante la técnica LIBS es causada

por la condición de la superficie de la muestra. En LIBS, este efecto, se manifiesta por ejemplo

cuando la intensidad de las líneas de emisión de un grupo de elementos, que se observa en el

espectro no mantiene condiciones de repetitividad adecuadas de la señal entre diferentes puntos

de la misma muestra. Esto conduce a que no siempre sea posible establecer una relación directa

entre la intensidad de emisión de un dado elemento y la concentración media de la muestra, lo que

determina una limitación para las mediciones llevadas a cabo con la técnica. La principal causa de

este comportamiento es atribuida a la ablación selectiva, donde la vaporización y extracción de cada

uno de los constituyentes del material que compone la muestra depende de sus propiedades y

características. En resumen, cada plasma generado en distintos puntos de la muestra es diferente

en cuanto a su composición, parámetros y geometría. En consecuencia hay que obtener varios

registros en diferentes puntos para que sean representativos con las proporciones de las muestras.

En muestras vegetales la distribución del tamaño de partícula es un parámetro clave para la

composición de pellets prensados (Gustinelli et al. 2015). Existen algunos indicios donde los efectos

de matriz pueden ser reducidos mediante el análisis de pellets preparados a partir de partículas

pequeñas (orden de los 100 µm) (Santos et al. 2012; da Silva Gomes et al. 2011). La descomposición

de partículas y la vaporización, así también como la atomización del analito y las eficiencias de

excitación dentro de los plasmas inducidos por láser, generalmente se favorecen cuando son

ablacionadas las partículas de menor tamaño. En general, hay un límite superior de tamaño de

partícula más allá del cual la misma no se vaporiza por completo, disminuyendo así la relación entre

el tamaño de partícula y la intensidad de la línea de emisión (Asgill and Hahn 2009; Cremers and

Radziemski 1985; Gallou et al. 2011). De esta forma, es importante considerar estos aspectos en el

armado de muestras, ya que el rendimiento de los métodos microanalíticos pueden verse afectados

críticamente (Zeisler 1998) debido a que la pequeña porción ablacionada puede no representar la

composición real de la muestra, conduciendo a resultados imprecisos e inexactos.

En esta Tesis Doctoral, con el fin de lograr la detección confiable de los elementos presentes en las

muestras de estudio, varios de los aspectos mencionados con anterioridad se tuvieron en cuenta.

Un abordaje más detallado será discutido en los capítulos a continuación.

34

Análisis cuantitativo

La aplicación de la técnica LIBS ha evolucionado gracias a la posibilidad de realizar análisis

cuantitativos o semicuantitativos multielementales de forma sencilla o incluso in-situ, de la mayoría

de elementos en diversas situaciones (Cremers and Radziemsky 2006).

El método utilizado para lograr la cuantificación de las especies en una muestra son las curvas de

calibración (Cremers and Radziemsky 2006). Las curvas de calibración relacionan la intensidad de

emisión de una línea espectral de un determinado elemento medida en muestras de referencia, con

las correspondientes concentraciones conocidas en el rango de interés.

En general, para bajas concentraciones la curva de calibración es lineal, respondiendo al modelo de

plasma delgado, dado por la ecuación (ec. 2.3). En donde las intensidades de las líneas (integradas

en λ) son proporcionales a la concentración de elementos presente en el plasma, que a su vez es

proporcional a la que existe en la muestra.

La calibración es por lo general, fuertemente dependiente de las condiciones experimentales de

análisis. En un análisis LIBS hay muchos parámetros que afectan a las mediciones, algunos de estos

pueden ser controlados, tales como la energía de pulso de láser, y otros son dependientes del

procedimiento de obtención de la muestra y sobre las que no puede haber un alto grado de control.

En general, por diferentes efectos puede variar la ablación pulso a pulso, generando distintos

plasmas y finalmente las intensidades son diferentes. Dentro de los factores que pueden afectar el

análisis cuantitativo usando LIBS, se pueden encontrar (Cremers and Radziemsky 2006):

1. Láser: Longitud de onda, energía y duración del pulso, tasa de repetición.

2. Parámetros de muestreo: Distancia de la lente con la muestra, presión y composición de la

atmósfera circundante.

3. Muestra: Uniformidad en la composición, uniformidad de la superficie, efectos químicos y

físicos de matriz (compactación, composición física [por ejemplo, tamaño de partícula de

los componentes de las muestras], humedad, cantidad de agregado de aglutinante),

presencia de aerosoles (polvo) generados por cada pulso.

4. Espectrómetro: Poder de resolución.

5. Detector: Sensibilidad del detector, linealidad de la respuesta, área efectiva de iluminación.

35

Por otra parte, para llevar a cabo la cuantificación es necesario en este punto, considerar el límite

de cuantificación del esquema experimental o sistema de medición, en este caso se define como el

límite de concentración más bajo para mediciones cuantitativamente precisas, y viene dado por 3,3

veces el límite de detección, su expresión se representa en la ecuación a continuación (ec. 2.5)

(Internation Union of Pure and Applied Chemistry):

LoQ = 3,3 LoD (ec. 2.5)

Validación de modelos de calibración.

La validación es el proceso establecido para la obtención de pruebas documentadas, mediante

estudios sistemáticos de laboratorio y demostrativos, que un método de análisis es lo

suficientemente fiable y reproducible para producir el resultado previsto dentro de intervalos

definidos (Magnusson and Örnemark 2014). El proceso de validación permite el conocimiento de

las características de funcionamiento del método y proporciona un alto grado de confianza en el

mismo y en los resultados obtenidos al aplicarlo.

La validación de métodos permite demostrar que un método es "apropiado", es decir que el

resultado analítico es idóneo para el propósito deseado y es confiable para que cualquier decisión

basada en él pueda tomarse con total confianza.

Un método debe ser validado cuando es necesario demostrar que sus características de desempeño

son adecuadas para el uso previsto. La validación implica su aplicación a un número de muestras de

las que se conoce la propiedad a determinar y que no han sido utilizadas en la etapa de construcción

del modelo. De esta forma se verifica que el modelo construido constituye una correcta descripción

del sistema en estudio.

Después de construir un modelo de calibración, es interesante determinar la precisión del mismo al

predecir el resultado de nuevas observaciones que no se utilizan para construir el modelo y/o se

utilizan con fines de validación. En otras palabras, se pretende estimar el error de predicción.

Para llevarlo a cabo, la estrategia básica es (María Antonia and Marcos 2008):

1. Construir el modelo sobre un conjunto de datos de entrenamiento.

2. Aplicar el modelo en un nuevo conjunto de datos de prueba patrones para hacer predicciones.

3. Calcular los errores de predicción.

36

Las métricas estadísticas para cuantificar la calidad general de los modelos de regresión incluyen

(María Antonia and Marcos 2008):

▫ R al cuadrado (R2), que representa la correlación al cuadrado entre los valores de resultado

observados y los valores predichos por el modelo. Cuanto mayor sea el R2 ajustado, mejor será

el modelo.

▫ R Pearson, es una medida de dependencia lineal entre dos variables aleatorias cuantitativas.

▫ Error cuadrático medio (RMSE), que mide el error de predicción promedio realizado por el

modelo al predecir el resultado de una observación. Es decir, la diferencia cuadrática media

entre los valores de resultado conocidos observados y los valores predichos por el modelo.

Cuanto menor sea el RMSE, mejor será el modelo.

▫ Error absoluto medio (MAE), una alternativa al RMSE que es menos sensible a los valores

atípicos. Corresponde a la diferencia absoluta promedio entre los resultados observados y los

predichos. Cuanto más bajo sea el MAE, mejor será el modelo.

En la configuración de clasificación, la tasa de error de predicción se estima como la proporción de

observaciones mal clasificadas.

Metodologías aplicadas para la validación cruzada

i) Leave-one-out cross validation (LOOCV) (Amat 2016)

Este método funciona de la siguiente manera:

1. Dejar un punto de datos fuera y crear el modelo con el resto del conjunto de datos.

2. Probar el modelo con el punto de datos que se dejó en el paso 1 y registrar el error de prueba

asociado con la predicción.

3. Repetir el proceso para todos los puntos de datos.

4. Calcular el RMSE y MAE general tomando el promedio de todas estas estimaciones de error de

prueba registradas en el paso 2.

Esto puede observarse en la figura a continuación (Figura 2.5).

37

Figura 2.5. Validación Cruzada dejando uno afuera (LOOCV). (Domenech 2011b).

ii) K-fold validación cruzada (Amat 2016)

El método de validación cruzada k-fold evalúa el rendimiento del modelo en diferentes

subconjuntos de los datos de entrenamiento y luego calcula el error de predicción promedio. El

algoritmo es el siguiente:

1. Dividir aleatoriamente el conjunto de datos en k-subconjuntos (o k-fold).

2. Reservar un subconjunto y entrenar el modelo en todos los demás subconjuntos.

3. Probar el modelo en el subconjunto reservado y registrar el error de predicción.

4. Repetir este proceso hasta que cada uno de los k subconjuntos haya servido como conjunto de

prueba.

5. Calcular el promedio de los k errores registrados. Esto se llama el error de validación cruzada

que sirve como la métrica de rendimiento para el modelo.

La validación cruzada k-fold es un método robusto para estimar la precisión de un modelo.

La ventaja más obvia de k-fold en comparación con LOOCV es computacional. Una ventaja menos

obvia pero potencialmente más importante de k-fold es que a menudo proporciona estimaciones

más precisas de la tasa de error de prueba que LOOCV (James et al. 2014).

38

Figura 2.6. k- fold validación cruzada. (Domenech 2011a).

iii) K-fold validación cruzada repetida (Amat 2016)

El proceso de dividir los datos en k-fold puede repetirse varias veces, esto se denomina validación

cruzada repetida de k-fold. El error final del modelo se toma como el error medio del número de

repeticiones.

39

MÉTODOS QUIMIOMÉTRICOS APLICADOS A DATOS LIBS

En la mayoría de las investigaciones científicas nos encontramos con múltiples variables de interés.

A partir de esto, surgen algunas preguntas: ¿Deberíamos evaluar una variable a la vez? ¿Qué se

puede perder al realizar un análisis univariado? ¿En qué se diferencian los análisis de datos

multivariados de los métodos univariados que son más familiares? ¿Por qué necesitamos el análisis

multivariado?

Extraer información de un gran volumen de datos mediante gráficos simples y métodos de análisis

univariados es una misión casi imposible y a veces hasta errónea. Aunque en algunos casos puede

tener sentido aislar cada variable y estudiarla por separado, en la mayoría de los casos esto no es

así. Las variables están relacionadas en mayor o menor grado y en consecuencia, si cada variable se

analiza aisladamente, la estructura completa de los datos puede no ser revelada (Ferrero and López

2018). Los datos complejos requieren métodos de análisis que puedan hacer frente a múltiples

variables simultáneamente, que no sólo revelen variables influyentes sino también la relación que

dichas variables tienen entre sí para comprender completamente la estructura y las características

clave de los datos. Por ejemplo, no podemos simplemente utilizar la estación del año para predecir

el tiempo, ya que muchas otras variables son parte de la relación con el clima, esto es porque la

mayoría de los problemas reales son de naturaleza multivariada, lo que significa que existen

múltiples variables que contribuyen a ellos. En resumen, el análisis univariado no necesariamente

cuenta la historia completa de los datos o pueden ni siquiera ser exactos, en cambio, el análisis

multivariado es una herramienta para encontrar patrones y relaciones entre varias variables

simultáneamente.

2.4.1 Principios de quimiometría

La quimiometría es una disciplina metrológica que aplica conocimientos matemáticos,

especialmente estadísticos. Específicamente, se orienta a procesos químicos, extrayendo la mayor

cantidad posible de información y extendiendo el conocimiento de los sistemas químicos, a partir

de datos experimentales. Además, es necesario discriminar entre la información importante y la no

tan relevante, siendo esta, otra rama de estudio de la quimiometría (Mongay Fernandez 2005). El

Prof. Massart (1997) la define como “La quimiometría es la parte de la Química que se sirve de la

matemática, estadística y lógicas formal para: diseñar o seleccionar procedimientos experimentales

40

óptimos, proporcionar información química relevante a partir del análisis de señales analíticas, y

finalmente adquirir conocimiento de los sistemas químicos” (Ziegel et al. 2000).

Algunas áreas de aplicación principales de la quimiometría incluyen: (1) calibración, validación y

pruebas de significación; (2) optimización de mediciones químicas y procedimientos

experimentales; y (3) la extracción del máximo de información química de datos analíticos.

Nace como disciplina científica en la década del 70 con el desarrollo de la instrumentación y el gran

auge de la microinformática, especialmente en el área de instrumentos computarizados para

química analítica (Mongay Fernandez 2005). Estos han habilitado y permitido un alto crecimiento

en el campo de la quimiometría en los últimos 30 años. Sin embargo, los cálculos y algoritmos

necesarios para llevar a cabo ciertos análisis quimiométricos tuvieron que esperar para su desarrollo

hasta la aparición de los dispositivos informáticos actuales, capaces de procesar y realizar cálculos

de grandes conjuntos de datos sin mayor dificultad. En este período, los desarrollos se han centrado

en métodos multivariados (Gemperline 2006). Dado que el mundo que nos rodea es

inherentemente multivariado, tiene sentido tratar múltiples mediciones simultáneamente en

cualquier procedimiento de análisis de datos.

Las técnicas quimiométricas aplicadas al establecimiento de modelos de reconocimiento de pautas

se pueden subdividir en dos subclases (Mongay Fernandez 2005):

Técnicas de reconocimiento de pautas no supervisadas: Estos se basan en descubrir

agrupaciones de pautas en un espacio de N-dimensiones sin saber a priori a qué clase pertenece

cada muestra, es decir, sin información previa de las mismas. Es posible distinguir dos tipos:

técnicas de análisis exploratorio de datos como es el caso del Análisis Multivariado de la

Varianza (MANOVA, por sus siglas en inglés) o el Análisis de Componentes Principales (PCA, por

sus siglas en inglés), y las técnicas de análisis de agrupamiento, como el Análisis de Categorías

(CA, por sus siglas en inglés).

Técnicas de reconocimiento de pautas supervisadas: En este caso, la clasificación se basa en un

aprendizaje previo del sistema, con conjuntos de calibración o entrenamiento de objetos que

permiten definir cada clase, ya que estos objetos son de conocida pertenencia a una de las clases

y luego se utilizarán para predecir ese mismo tipo de información sobre muestras desconocidas.

La calidad de los resultados de la clasificación vendrá influenciada por la calidad de los conjuntos

41

de entrenamiento. Estos métodos pueden ser divididos a su vez en dos subgrupos: métodos

discriminantes y métodos de modelado (Derde and Massart 1986). Los métodos discriminantes

dividen el espacio en tantas regiones como clases haya en el conjunto de entrenamiento,

creando límites compartidos por los espacios; por ello, toda muestra desconocida siempre

podrá ser clasificada como perteneciente a una de las clases. Los más comunes son: Análisis

Discriminante (DA) y Vecino k más Cercano (k-Nearest Neighbour).

Por su parte, los métodos de modelado se basan en la creación de volúmenes en el espacio,

cada uno de los cuales presenta límites para cada una de las clases. Por ello, una muestra puede

clasificarse como perteneciente a alguna de las clases o a ninguna de ellas. Entre estos métodos

se cuentan el Reconocimiento de Pautas mediante Análisis Independiente Multicategórico

(PRIMA), las Clases Desigualmente Dispersas (UNEQ), el Modelado Blando Independiente de

Analogías de Clases (SIMCA) que es probablemente el más conocido y las Redes Neuronales

Artificiales Supervisadas (SANN).

En la última década, algunos autores han empleado herramientas quimiométricas para mejorar la

implementación de la técnica LIBS mediante la extracción de información útil a partir de la gran

cantidad de datos generados en estudios tanto cualitativos como cuantitativos (T. Zhang, Tang, and

Li 2018). En particular, varios algoritmos, típicamente empleados en quimiometría, han sido

aplicados al reconocimiento (tanto supervisado como no supervisado) de patrones en estudios de

tipo cualitativo, y a la calibración multivariada en estudios cuantitativos. Entre las herramientas más

frecuentemente empleadas se pueden mencionar el análisis de conglomerados (CA) (Yueh et al.

2009), análisis de componentes principales (PCA) (Markiewicz-Keszycka et al. 2018), el análisis

discriminante por cuadrados mínimos parciales (PLS-DA)(Kim et al. 2012), la regresión por

componentes principales (PCR), la regresión por cuadrados mínimos parciales (PLSR) (Markiewicz-

Keszycka et al. 2018) y las redes neuronales artificiales (ANN) (Manzoor et al. 2014). A pesar que,

tanto la técnica LIBS como los métodos de análisis multivariado son ampliamente conocidos

actualmente, la combinación de ambos todavía se encuentra en pleno desarrollo.

A continuación se va a proceder a describir sólo las técnicas multivariadas que han sido utilizadas

en el análisis de datos obtenidos en esta Tesis Doctoral.

42

Análisis de Componentes Principales

El Análisis de Componentes Principales (Jackson 1991; Jolliffe 2002; Wilmot and Mansell 2014; Ziegel

et al. 2000) es una técnica de descomposición/proyección bilineal capaz de condensar grandes

cantidades de datos en pocos parámetros. Estos se denominan componentes principales (PCs), y

contienen los niveles, diferencias y similitudes entre las muestras, y las variables que constituyen

los datos modelados. Dado un conjunto particular de datos multivariados, el PCA decide cuál es la

proyección óptima para poder analizar la estructura de esos datos (de variación o estructura de

covarianza).

La proyección se elige de modo que la mayor cantidad de la variabilidad de los datos sea retenida,

utilizando el menor número de direcciones ortogonales posibles.

El PCA constituye:

▫ un método para graficar datos multivariados en unas pocas dimensiones (2 en general);

▫ un método para hallar aquellas direcciones en las que los datos muestran mayor

variabilidad;

▫ un método para transformar las variables originales -generalmente correlacionadas- en

nuevas variables que son claramente ortogonales o incorrelacionadas.

Si se considera una matriz de datos S de covarianzas de n p (filas por columnas), donde se cuenta

con n unidades de análisis (individuos), a quienes se les han medido p características (variables),

como se muestra a continuación:

S

p Variables

n In

div

idu

os

43

PCA busca encontrar un número reducido k (2 ó 3, en general) de combinaciones lineales de las

variables originales que expliquen la mayor parte de la variabilidad presente en los datos.

El PCA utiliza generalmente la matriz de covarianzas (S). Si los datos están estandarizados, la matriz

de covarianzas coincide con la matriz de correlación (R). Como ambas matrices son simétricas, el

PCA puede llevarse a cabo con cualquiera de ellas. Si las variables originales tienen rangos de

variación o escalas muy diferentes, es conveniente estandarizar los datos para el PCA.

Se derivan las Componentes Principales para un conjunto de datos provenientes de una muestra

aleatoria. Sea S o R la matriz de orden p obtenida a partir de una muestra en la que se han medido

variables. El PCA se basa en la descomposición canónica de dicha matriz:

S = QQ’

donde:

Q = [q1,q2 … qp] Matriz de autovectores de S

= diag(1, 2,… , p) Matriz de autovalores de S

Entonces si la descomposición canónica de R (ó S) es

'q

'q

'q

00

0

0

00

qqqQ'QR

p

2

1

p

2

1

p21

las Componentes Principales son las nuevas variables [CP1 … CPp] que se definen mediante:

p)j(1

X

X

X

'q C

p

2

1

jj

Se puede probar que 𝑉𝑎𝑟(𝐶𝑗) = 𝜆𝑗. Es decir, los autovalores de R (ó S) son las varianzas de las

Componentes Principales.

44

Una medida que indica la variabilidad de un conjunto de datos multivariados es la llamada varianza

total. Se define como la suma de las varianzas de las variables originales. En términos matriciales,

es la traza (S) con los datos crudos ó traza (R) con los datos estandarizados. En cualquier caso,

mediante la descomposición canónica se tiene que:

traza(R) = traza()

y por lo tanto

VTot = traza() = λ1 +λ2 + … +λp = Var(CP1) + … + Var(CPp)

De este modo, las Componentes han redistribuido la Varianza Total, haciendo que las primeras

acumulen la mayor parte. La Componente Cj acumula una proporción (%) de VTot igual a

λ j /VTot %

Entonces, si se eligen las primeras k Componentes (k<p) éstas acumulan una proporción de la

variabilidad total de los datos igual a

(1 + 2 + … + k ) / VTot %

Si el porcentaje anterior es elevado, se pueden reemplazar las p variables originales por un número

mucho menor k de componentes, con poca pérdida de información en términos de su variabilidad.

Dado que Q es una matriz ortogonal, nos permite interpretar a las componentes como

combinaciones lineales de las variables originales que resultan de una rotación de los ejes

coordenados. Esto asegura que las distancias entre los individuos se conserven; son las mismas si se

calculan con los valores originales o con los valores que corresponden a las componentes

principales.

La rotación que se mencionó se efectúa de manera que hace coincidir:

▫ el primer eje PC1 con la dirección en la que los datos muestran mayor variabilidad;

▫ el segundo eje PC2 con la dirección de mayor variabilidad entre las ortogonales a PC1;

▫ el tercer eje PC3 con la dirección de mayor variabilidad entre las ortogonales a PC1 y a PC2;

y así siguiendo con las restantes.

Lo expuesto anteriormente puede observarse en la figura a continuación (Figura 2.7).

45

Figura 2.7. Representación de la reducción de la dimensionalidad llevada a cabo por PCA desde un sistema

de tres variables a un sistema de dos componentes principales (CP1 y CP2).

Habitualmente se trabaja con las componentes principales centradas que surgen de centrar las

variables. Las componentes principales centradas tienen su valor promedio en el 0; es decir en el

punto en el que todos los ejes se cortan. De este modo, los individuos que queden cerca del 0

respecto a un eje tendrán un comportamiento promedio, mientras que los que estén más alejados

serán los más diferentes del promedio.

Dado que las CP son combinaciones lineales de las variables originales, es razonable pensar que las

variables originales que estén más fuertemente correlacionadas con ellas, serán las que más

aporten a su interpretación. Es necesario prestar atención a los signos de las correlaciones: si todas

las correlaciones tienen el mismo signo la componente en cuestión puede interpretarse como

“abundancia” o “escasez” de las variables involucradas. Si hay correlaciones con signos opuestos

existe una oposición entre las variables de uno y otro signo: hay individuos que tienen mucho de las

variables negativas y poco de las positivas y viceversa.

Análisis Discriminante Lineal

El método descrito hasta el momento, no sirve para ver si los objetos forman grupos cuando no se

tiene ningún conocimiento a priori. En cambio, el Análisis Discriminante (DA) se basa en el

reconocimiento de pautas supervisado, el punto de inicio es una serie de objetos cuya pertenencia

a un determinado grupo es conocida (Miller and Miller 2002).

X

Y

Z

PC1

PC2

PC1

PC2

46

El DA es una técnica estadística que se utiliza para clasificar a distintos individuos en grupos, o

poblaciones, alternativos, a partir de los valores de un conjunto de variables sobre los individuos a

los que se pretende clasificar. Cada individuo puede pertenecer a un solo grupo. El mismo, como

método de análisis multivariante, permite:

▫ “Explicar” la pertenencia de un individuo a uno u otro grupo en función de variables

independientes, cuantificando la importancia relativa de cada una de ellas.

▫ “Predecir” a que grupo pertenece un individuo que no forma parte de los datos analizados,

y del cual se conoce el valor de las variables de ese individuo, pero no sabemos a qué grupo

pertenece.

La estructura de la matriz de datos utilizada para aplicar un DA se observa a continuación:

En este caso, el conjunto de datos es de dimensión nxp, y hay una columna adicional que identifica

los grupos a los que se quiere asignar a los individuos. La pregunta es: ¿Las variables difieren según

el grupo de observaciones y, si lo hacen, qué variables? Dicho de otra manera, ¿se puede discriminar

entre grupos definidos a priori usando las variables? ¿Qué variables son las mejores para

discriminar?

El punto de partida del Análisis Discriminante Lineal (LDA, por sus siglas en inglés) es encontrar una

función discriminante lineal, Y, que sea combinación lineal de las variables originales, X1, X2, etc.

𝑌 = 𝑎1𝑋1 + 𝑎2𝑋2 + ⋯ + 𝑎𝑛𝑋𝑛

Las n medidas originales para cada objeto se combinan en un único valor de Y, de manera que los

datos se han reducido de n dimensiones a una dimensión. Los coeficientes de los términos se eligen

de manera que Y refleje la diferencia entre los grupos tanto como sea posible: los objetos en el

mismo grupo tendrán valores similares de Y y los objetos en grupos diferentes tendrán valores muy

p Variables

n In

div

idu

os p1 p2 p3 …. pn Grupo

47

diferentes de Y. En consecuencia, la función discriminante lineal proporciona un medio de

discriminación entre los grupos.

El éxito del LDA al distribuir o asignar un objeto correctamente se puede verificar de varias formas.

La más simple es utilizar la regla de clasificación para clasificar cada objeto en el grupo y registrar si

dicha clasificación es correcta. La tabla donde se resumen los resultados de este procedimiento

suele llamarse matriz de confusión o clasificación cruzada.

Un método alternativo para utilizar cuando se tiene más de dos grupos para clasificar es el análisis

de variables canónicas. Éste resulta ser una extensión del LDA que encuentra una serie de variables

canónicas Y1, Y2, que nuevamente, son combinaciones lineales de las variables originales.

En PCA no había supuestos subyacentes, excepto que las relaciones entre las variables deberían ser

lineales. En DA, hay toda una serie de suposiciones, y su validez dicta la utilidad del método para sus

propios datos (Goodstein 1987). Estos supuestos son los siguientes:

▫ Las observaciones se pueden dividir a priori en al menos dos grupos. Cada observación sólo

puede estar en un grupo.

▫ Hay al menos dos individuos por grupo.

▫ El número de individuos en el grupo más pequeño es mayor que el número de variables.

▫ Las variables están en una escala continua. Como se calculan las matrices de covarianza, no

puede usar variables nominales en el conjunto de datos. Puede convertirlos en variables ficticias

con ceros y unos, pero esto viola otros supuestos.

▫ Las relaciones entre las variables son lineales. Esto se debe a que se utilizan matrices de

covarianza.

▫ No existe una colinealidad del 100% entre las variables.

▫ Las variaciones dentro del grupo son aproximadamente similares entre los grupos. Esto también

se llama suposición de homogeneidad. Significa que la propagación de una variable particular

debe ser (aproximadamente) la misma para cada grupo de observaciones.

▫ Las relaciones entre variables deben ser similares para diferentes grupos. También significa que

una variable dentro de un grupo no puede tener el mismo valor (por ejemplo, cero) para cada

observación, ya que esto evita el cálculo de la matriz de covarianza. Algunos programas seguirán

produciendo resultados razonables incluso si no se cumple esta suposición.

48

▫ Las pruebas de hipótesis suponen la normalidad multivariada de las n variables dentro de cada

grupo.

▫ Los individuos son independientes. Esto significa que no se pueden utilizar series temporales,

datos parciales y comparaciones de antes y después.

Análisis Multivariado de la Varianza (MANOVA)

El análisis multivariado de la varianza (MANOVA) es una extensión del análisis de varianza común

(ANOVA). En ANOVA, se estudian las diferencias entre las diversas medias grupales en una variable

de respuesta única. En MANOVA, el número de variables de respuesta se incrementa a dos o más.

La hipótesis se refiere a una comparación de vectores de medias grupales (Foster, Barkus, and

Yavorsky 2014). El MANOVA es una técnica de dependencia que permite estimar las diferencias

entre las medias de varias categorías o tratamientos, mediante la comparación conjunta de las

variables dependientes observadas. Las categorías vienen dadas por el conjunto de criterios que

definen distintos estados, cuadros patológicos, grupos humanos, dosis, tratamientos, etc. Las

condiciones necesarias para utilizar el MANOVA son:

a) Hay varios tratamientos o grupos que se definen por el grado, la ausencia o presencia de una o

más variables independientes,

b) al interior de cada tratamiento o grupo seleccionado, hay varios individuos o sujetos, y

c) las mediciones para cada individuo o sujeto son independientes.

Se asume hipótesis nula cuando las medias no difieren significativamente (p 0,05) y se asume

hipótesis alternativa cuando las medias difieren significativamente (p < 0,05). Para la comparación

de las medias se usan varios métodos basados en la t de student.

A continuación se enumeran los supuestos estadísticos de esta técnica:

▫ Las variables se distribuyen de manera normal en conjunto, lo cual se evalúa mediante los test

de Mardia (distribución normal multivariada).

▫ Las varianzas de cada variable resultan iguales cuando son comparadas entre los grupos

(homocedasticidad).

▫ Los coeficientes de correlación (usualmente r de Pearson) entre dos variables para un mismo

grupo son comparables, asimismo para todos los grupos.

49

▫ Las variables dependientes se correlacionan entre sí.

Cuando se cumplen los supuestos para MANOVA y no hay interacciones presentes, esta técnica

funciona satisfactoriamente para probar la igualdad o la diferencia en las medias entre los grupos.

Sin embargo, se considera que el MANOVA (al igual que el LDA) es robusto a violaciones moderadas

de la normalidad, siempre que la violación sea creada por asimetría y no por valores atípicos

(Tabachnick and Fidell 2007).

Para los datos multivariados, casi siempre se puede considerar como una mejor opción que las

técnicas univariadas correspondientes (Stahle and Wold 1990).

Usualmente se aplica MANOVA en dos situaciones en particular: i) se quiere obtener información

de una prueba estadística en general, sobre varias variables dependientes correlacionadas en lugar

de realizar múltiples pruebas individuales, ii) explorar cómo varias variables independientes influyen

en algunos patrones de respuesta de las variables dependientes (Stahle and Wold 1990).

50

3 CAPÍTULO III: MATERIALES Y MÉTODOS

EQUIPO EXPERIMENTAL LIBS

Los equipos experimentales LIBS poseen la característica de presentar una configuración sencilla.

En líneas generales, es necesario contar con un láser con suficiente potencia y una lente de enfoque

para la generación del plasma sobre la superficie de la muestra. Luego, la emisión es dirigida dentro

de un espectrógrafo, donde se dispersa la luz y se descompone en componentes espectrales. A

continuación, es necesario convertir la señal de salida dispersada en una señal eléctrica mediante

un sensor que puede ser un fotomultiplicador, un arreglo de fotodiodos, una cámara CCD (Charge-

Coupled Device) o ICCD (Intensified Charge-Coupled Device). Finalmente, se procesa la señal emitida

por el plasma mediante una PC, donde se registran los datos con el fin de analizar los resultados

obtenidos.

3.1.1 Arreglo experimental 1: Registro de espectros de resolución media sin

discriminación temporal

Los plasmas se generaron con un láser Nd: YAG Q-switched pulsado (Laser Big Sky, Model Ultra,

Laser Technologies, Inc., USA), que opera en la longitud de onda fundamental de 1064 nm, con una

tasa de repetición de 2 pulsos/s, un ancho de pulso de 5 -7 ns y una energía de 50 mJ/pulso.

Los pulsos láser fueron enfocados sobre la superficie de la muestra en forma normal y en aire a

presión atmosférica, con una lente (L1) de 200 mm de longitud focal. Las muestras a ser analizadas

se ubicaron en un soporte rotativo a fin de realizar disparos con el láser en distintos lugares y evitar

cráteres por ablación que afectan a la señal.

La luz del plasma es colectada mediante una segunda lente de cuarzo (L2) de 100 mm de longitud

focal, y se forma la imagen del plasma sobre la rendija de entrada (100 μm) de un monocromador

(Model VM-504, Acton Research Corporation, USA, longitud focal 0,39 m) y posee una dispersión

lineal recíproca de 2.1 nm/mm en todo el espectro. La luz dispersada se detectó con un arreglo de

fotodiodos lineales (PDA) no intensificado (Model RY-1024, PDA, Princeton Instruments, Inc., USA),

y sin discriminación temporal. Este sistema permite medir un rango espectral de 200 a 1000 nm,

dividido en porciones de 50 nm cada una.

51

El PDA está sincronizado con los pulsos láser por una señal de trigger, luego la luz es integrada en

todo el tiempo de vida del plasma. La adquisición de los datos del detector y la parametrización de

ciertos datos de los registros (como por ejemplo, el tiempo de exposición) así como la visualización

y el almacenamiento de los espectros se realiza por medio de una PC.

Esta configuración es muy eficaz para análisis rápidos, utilizada con muy buenos resultados en

detección de componentes mayoritarios, aunque no tanto para la cuantificación de elementos. Una

descripción del mismo puede observarse en la Figura 3.1.

Figura 3.1. Arreglo experimental LIBS 1. Registro de espectros de resolución media sin discriminación

temporal. (Adaptado de Papuccio 2020).

3.1.2 Arreglo experimental 2: Registro de espectros de alta resolución y discriminación

temporal

En este caso, se utilizó un láser Nd: YAG Q-switched pulsado (Continuum Surelite II), que opera en

la longitud de onda fundamental de 1064 nm y ancho de pulso de alrededor de los 7 ns, con una

tasa de repetición de hasta 10 pulsos/s y una energía 100 mJ/pulso.

Los pulsos láser fueron enfocados sobre la superficie de la muestra en dirección normal, con una

lente (L1) con recubrimiento antirreflejo y de longitud focal de 100 mm.

52

Las muestras a ser analizadas se ubicaron en un soporte rotativo durante la medición, para evitar la

formación de cráteres profundos por el proceso de ablación, mejorando así la reproducibilidad, y

permitiendo el análisis de distintas zonas de las muestras.

La luz emitida por el plasma fue colectada mediante una segunda lente (L2) de 200 mm de longitud

focal (para líneas en la zona UV del espectro la señal fue colectada mediante una lente de cuarzo de

100 mm) y las mismas forman la imagen del plasma sobre la rendija de entrada (ancho de 100 μm)

de un monocromador (Jobin Yvon THR 1500, configuración Czerny - Turner, longitud focal 1.5 m).

La dispersión se produce mediante una red de difracción holográfica de 2000 líneas/mm, con esto

se tiene una resolución de R=300000 en doble pasaje a λ = 300 nm (tal como se utilizó en esta Tesis),

y una dispersión línea recíproca en el plano de la rendija de salida que se encuentra detallada en el

Anexo 1. Una cierta apertura de la rendija de entrada del monocromador permite el registro de una

correspondiente sección transversal del plasma. En este caso, la sección de los plasmas observados

se refiere al registro de señales provenientes de una porción determinada del volumen total del

plasma. Por otro lado, también se tiene una imagen del plasma formado por una lente sobre una

pantalla para lograr un ajuste de alineación del plasma en forma visual. La posición de esta imagen

en la pantalla permite reproducir la posición del enfoque del láser sobre la muestra luego de cada

cambio de la misma, con muy buena precisión.

La luz es detectada por un fotomultiplicador (Hamamatsu modelo R928) y la señal eléctrica es

discriminada en el tiempo y promediada por un promediador Boxcar (Standford Research System,

módulos SR 250, SR 280). La discriminación temporal se lleva a cabo con determinados tiempos de

retardo postbreakdown (coordinada con una señal trigger proveniente del láser) y tiempos de

integración adecuados (tiempos de adquisición o acumulación de señal). Luego es promediada

(promedio por cada 3 muestras), enviada a un convertidor analógico-digital, y finalmente es

registrada por una PC.

La señal final registrada está dada por la intensidad de luz medida en la ventana temporal

seleccionada. Para analizar una porción del espectro se hace un barrido de una determinada zona

espectral, mediante la rotación de la red de difracción del monocromador con una velocidad

determinada. Esto permite hacer registros espectrales con una muy buena resolución en función de

la cantidad de disparos láser.

Esta configuración experimental es muy eficaz para análisis muy detallados, especialmente para el

análisis de líneas muy débiles o difíciles de observar. La gran capacidad de este arreglo está

53

orientada al estudio de la física de plasmas específicamente cuando es necesario el estudio de

perfiles de líneas. Una descripción del mismo puede observarse en la Figura 3.2.

Figura 3.2. Arreglo experimental LIBS 2. Registro de espectros de alta resolución y discriminación temporal.

3.1.3 Arreglo experimental 3: Registro de espectros de alta resolución y discriminación

temporal en condiciones de baja presión.

Hay ciertos elementos que requirieron que su obtención se lleve a cabo en condiciones de baja

presión, con el fin de obtener mayor intensidad en la medición. Para esto, fue necesario montar un

nuevo arreglo experimental, a partir del equipo experimental 2, crear una celda de vacío con

características específicas para este fin y utilizar nuevo equipamiento.

Las muestras se colocaron sobre un dispositivo rotativo adosado a un motor (220 V a 3 rev/min)

dentro de un soporte en Grilón preparado para trabajar en vacío. Luego, la sección posterior del

soporte se conectó mediante una manguera al sistema de vacío. Para sellar el sistema se utilizó un

cilindro de vidrio (103 mm de largo y 93.5 mm de diámetro interno) diseñado especialmente para

encastrar en el soporte. La junta entre el cilindro y el soporte plástico se aseguró por una junta tórica

recubierta por grasa siliconada de vacío.

54

El vacío dentro de la cámara se creó mediante una bomba mecánica (Varían SD 451) conectada a la

celda de la muestra mediante mangueras plásticas. Al sistema de vacío también se conectó un

manómetro analógico (Edwards Pirani PR 25-S) que permitió monitorear la presión dentro de la

cámara. La presión en equilibrio obtenida por la bomba y que se utilizará a lo largo de todo el trabajo

estuvo en el rango de 0,6 - 4x10-1 mbar. Un esquema de la configuración experimental al vacío,

puede observarse en la Figura 3.3.

Figura 3.3. Arreglo experimental LIBS 3. Registro de espectros de alta resolución y discriminación temporal

en condiciones de baja presión.

REACTIVOS

Como ya se discutió en la sección 2.1.6 los plaguicidas utilizados para el siguiente estudio de

investigación fueron: clorpirifos (C9H11Cl3NO3PS), carbendazim (C9H9N3O2), dimetoato

(C5H12NO3PS2), imidacloprid (C9H10ClN5O2) y cipermetrina (C22H19Cl2NO3), los mismos fueron

obtenidos en agronomías locales. El clorpirifos, imidacloprid y cipermetrina son insecticidas, el

dimetoato a su vez, es acaricida y el carbendazim es un fungicida. Los ingredientes activos poseen

una concentración de 250 g/L, 75 g/L, 500 g/L, 200 g/L y 125 g/L respectivamente.

55

PREPARACIÓN DE MUESTRAS

Una de las ventajas más ampliamente citadas de LIBS es que no requiere una significativa

preparación de las muestras de estudio, aunque esto también pude ser una limitación en la

adquisición de registros de señales (repetitividad de la señal, ablación extrema de la muestra, etc).

A partir de esto, se presentan a continuación las metodologías utilizadas con el fin de disminuir las

limitaciones mencionadas.

3.3.1 Preparación de muestras patrones

Para poner a punto la técnica fue necesaria la obtención y fabricación de muestras de hortalizas

como patrones, con este fin se seleccionaron muestras de acelga (Beta vulgaris var. Cicla). Este

vegetal ha sido considerado como alimento básico de la nutrición humana durante mucho tiempo

y a su vez, la elección vino aparejada a que es un cultivo que puede obtenerse a lo largo de todo el

año, independiente de las condiciones estacionarias y las marcadas diferencias de temperaturas que

se tienen en nuestra zona. De esta forma se garantizó la obtención continua de la misma para la

realización de muestras con fines analíticos. Estas fueron obtenidas de una huerta donde se lleva a

cabo una producción orgánica, es decir, sin la aplicación de plaguicidas o fertilizantes que pudieran

provocar interferencias en las mediciones.

Los pasos a seguir para la preparación de muestras contaminadas con diferentes plaguicidas se

pueden observar en la Figura 3.4. En una primera instancia, las hojas frescas de acelga se sometieron

a un lavado bajo agua de red, con el fin de eliminar restos de suciedad y microorganismos que

pudieran quedar adheridos sobre la superficie. Luego se procedió a un lavado con agua destilada, y

secado en un horno a 60 °C hasta peso constante. Una vez obtenido el material seco, fue pulverizado

y tamizado por medio de un tamiz de 60 mesh (250 µm) para obtener tamaños de partículas

homogéneos, debido a que como se informa en la literatura, la distribución del tamaño de partícula

afecta críticamente el desempeño de los métodos microanalíticos (Gustinelli et al. 2015). Luego,

alícuotas de 2.5 g de acelga pulverizada se mezcló y homogeneizó con 0.75 mL de cada plaguicida y

se dejaron secar a temperatura ambiente. Para fines de control, también se preparó una muestra

de acelga a través del mismo proceso, pero en esta ocasión se mezcló y se homogeneizó con 0,75

mL de agua destilada. Por último, se prepararon pellets mediante un compactador a 140 MPa por 1

min, con tamaños aproximadamente de 30 mm de diámetro y 2 y 4 mm de espesor. De esta forma

56

se proporciona una superficie de muestra más uniforme para obtener emisiones LIBS más estables

y se garantiza la representación de la composición de las muestras en los resultados analíticos

(Gondal et al. 2007).

Figura 3.4. Armado de pellets de acelga con plaguicidas para la aplicación de LIBS.

Por otro lado, con el fin de probar la reproducibilidad de aplicación de la técnica LIBS sobre

diferentes hortalizas, se crearon muestras de rúcula, lechuga y espinaca con el procedimiento

anteriormente descrito y el agregado de agua destilada. Los pellets obtenidos pueden observarse

en la Figura 3.5.

Figura 3.5. Pellets obtenidos a partir de diferentes hortalizas.

Hojas de acelga frescas

Polvo fino Plaguicidas Pellets

57

A partir del registro de señales mediante el arreglo experimental 1, se identificaron algunos

elementos típicos de las hortalizas elegidas. Para este fin, se registró un intervalo de 50 nm de

longitud de onda, centrado en 300 nm. A continuación, en la Figura 3.6 se presentan los espectros

obtenidos.

275 286 297 308 319 3300

1500

3000

275 286 297 308 319 3300

1500

3000

275 286 297 308 319 330

1500

3000

275 286 297 308 319 3300

1500

3000

Longitud de onda (nm)

Espinaca

Rúcula

Inte

nsid

ad (

u.a

.)

Lechuga

Al I

Mg II

Mg II Ca IIMg II

AcelgaMg II

Ca I Al IFe II

Si I

Figura 3.6. Espectros de emisión LIBS en diferentes hortalizas con agregado de agua destilada. Identificación

de elementos típicos.

A partir del análisis de los registros pudieron observarse líneas de emisión de elementos tales como

aluminio (Al), calcio (Ca), magnesio (Mg), hierro (Fe) y silicio (Si).

58

Las hortalizas, en general, aportan nutrientes necesarios que el organismo necesita para funcionar

y su proporción responde, en gran medida, al tipo de suelo del cultivo. En particular, los vegetales

de hojas verdes aportan macronutrientes, tales como Mg, Na, K, Ca, Si, entre otros. En la Figura 3.5

pueden observarse líneas de emisión características de algunos de estos elementos en las cuatro

hortalizas medidas. Por otro lado, el Fe, oligoelemento, sólo se observa en la acelga y la espinaca,

esto es debido a que, este mineral se encuentra en mayor concentración en estas hortalizas, siendo

las principales fuente de Fe de origen vegetal (3,3 mg/100 g y 2,7 mg/100 g), a diferencia de la

lechuga y de la rúcula, en donde su concentración es mucho menor (1,2 mg/100 g y 1,4 mg/100 g)

(Martinez Centelles 2020).

A partir de esto, se puede concluir que, al presentar matrices similares, se garantizaría la

reproducibilidad de la aplicación de la técnica LIBS, por tanto, sería posible aplicar los resultados

obtenidos de esta tesis a hortalizas de hojas verdes en general.

3.3.2 Preparación de muestras de referencia con fines de calibración

Siguiendo el mismo procedimiento de la sección anterior, se fabricaron muestras de referencia para

fines de calibración y para la validación del rendimiento analítico del método LIBS. Se adoptó el

enfoque de calibración de adición estándar debido a que emplea las propias muestras analíticas

para evitar cambios de matriz que pudieran alterar las mediciones. Las muestras de referencia con

concentraciones conocidas fueron obtenidas a partir de diluir los plaguicidas en cuestión, con

volúmenes apropiados de agua destilada. De esta forma se obtuvieron muestras de dimetoato, las

cuales contienen concentraciones crecientes de P y S, y por otro lado, muestras de clorpirifos,

utilizadas para el registro de C y Cl a diferentes concentraciones. Las mismas fueron creadas en los

rangos de concentración de plaguicidas de 0–80 mg/kg y 0-250 mg/kg, respectivamente. En la Tabla

3.1 se pueden observar las concentraciones de referencias obtenidas y sus equivalentes en

concentración para el S, P, Cl y C, calculados a partir de la proporción de estos elementos en los

plaguicidas mencionados.

59

Tabla 3.1. Concentraciones de muestras de referencia de dimetoato y clorpirifos con fines de calibración, y

sus equivalencias de S, P, C y Cl.

Dimetoato

(mg/kg) S (mg/kg) P (mg/kg)

Clorpirifos

(mg/kg) C (mg/kg) Cl (mg/kg)

0 0 0 0 0 0

10 2,796 1,352 20 6,16 6,066

20 5,592 2,704 50 15,4 15,165

40 11,184 5,408 80 24,64 24,264

50 13,98 6,76 100 30,8 30,33

80 22,368 10,816 250 77 75,825

OBTENCIÓN DE REGISTROS DE SEÑALES LIBS

Para la adquisición de los registros de señales LIBS se implementó un nuevo método de integración

óptico, a fin de mejorar y simplificar mediciones del tipo analíticas. Este método consistió en

aprovechar la gran sensibilidad del fotomultiplicador, junto a la resolución temporal para el análisis

de la señal dada por el boxcar y la alta resolución del monocromador. El mismo fue utilizado como

un espectrógrafo de integración de línea completa, de manera que es posible integrar todo el perfil

de una línea en cada plasma producido, sin detalles de la misma, pero obteniendo la intensidad

total. Para cada elemento, se seleccionó la porción del espectro que contiene solamente la línea

elegida y es totalmente registrada por el fotomultiplicador, lo cual se realizó seleccionando un

determinado ancho de la rendija de salida en función de la dispersión lineal del monocromador (ver

Anexo 1). Esto, se llevó a cabo para optimizar el registro de la línea seleccionada por el

fotomultiplicador, dejando fuera parte del espectro que interfiera con la señal final registrada. De

esta forma, permitió realizar un análisis rápido, con mínima destrucción de la muestra (menos

disparos de láser), pero al mismo tiempo con mayor adquisición de datos de intensidades de línea,

con el fin de realizar una buena estadística y compensar la limitación de repetitividad de LIBS.

Asimismo, se realizaron pruebas preliminares para determinar los valores óptimos para los

siguientes parámetros: elección de las líneas de emisión, tiempo postbreakdown y tiempo de

integración, número de registros de plasmas, sección a observar del plasma (discriminación en la

60

imagen del plasma en el plano de la rendija de entrada) y porción espectral a integrar (ancho de

rendija de salida).

3.4.1 Pretratamiento de espectros

Por otro lado, con el fin de aumentar la representatividad de los registros de señales LIBS, fue

necesario normalizar las intensidades de las señales del analito en estudio utilizando un parámetro

representativo de las condiciones de plasma reales. Dado que, al trabajar con diferentes plaguicidas,

las muestras a analizar presentaban diferencias de matriz debido a propiedades diferentes entre los

plaguicidas seleccionados, se procedió al procesamiento analítico de los datos. Para esto, se llevó a

cabo una normalización de los registros de línea obtenidos, los datos fueron normalizados con

respecto a un fondo medido con la función de obtenerlos en la misma escala.

Estos resultados ya habían sido estudiados en otras ocasiones. Castro and Pereira-Filho 2016

utilizaron doce tipos diferentes de normalización de datos para reducir la interferencia por matriz y

mejorar los modelos de calibración. Sus hallazgos muestran que la aplicación de los modelos de

normalización fue útil para compensar las diferencias entre las matrices de las muestras. Los

modelos sin normalizar presentaron errores de dos a cinco veces mayores. Por su lado, Karki et al.

2016 estudiaron el rendimiento analítico de varias técnicas de normalización de espectro diferentes,

a saber, normalización interna, normalización con luz total, normalización con fondo junto con el

métodos de suavizado de tres puntos, entre otras, para la cuantificación de Cr, Mn y Ni en acero

inoxidable. En este caso, los resultados finales mostraron la superioridad de la técnica de

normalización interna sobre el resto, independientemente de si se trata de análisis de Cr, Ni o Mn.

61

4 CAPITULO IV: IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE PLAGUICIDAS EN

MUESTRAS DE ACELGA MEDIANTE LA TÉCNICA LIBS UTILIZANDO

MÉTODOS QUIMIOMÉTRICOS

La cantidad de trabajos de análisis LIBS que incorporan técnicas quimiométricas, ha aumentado en

forma constante desde la década de los 90 (Cremers, Radziemski, and Gottfried 2013). En los inicios,

el uso de la quimiometría se restringía para análisis cuantitativo, en la determinación de

concentraciones. En cambio, en los últimos años, la mayoría de los artículos LIBS se han centrado

en el análisis cualitativo, es decir, reconocimiento de patrones y clasificación de muestras.

La aplicación exitosa de la quimiometría a los datos espectrales depende de los propios datos, que

contienen información relacionada con las propiedades que se describirán y/o predecirán (Cremers,

Radziemski, and Gottfried 2013). Por esta razón, es esencial asegurar que se usen los espectros de

mejor calidad posible para construir el modelo quimiométrico apropiado. Esto incluye, no solo la

mejor relación señal/ruido de las líneas espectrales relevantes, sino también un buen control (o al

menos comprensión) de los parámetros experimentales. A su vez, se debe garantizar que las

características que utiliza el modelo para diferenciar las muestras (por ejemplo, líneas de emisión

seleccionadas) sean relevantes para la aplicación.

Las técnicas quimométricas, tales como el análisis de componentes principales (PCA) y el análisis

discriminante lineal (LDA), son métodos estadísticos multivariados aplicados a: reducción de

problemas dimensionales (número de variables), evitando así la pérdida de información esencial;

reconocimiento de patrones; y caracterización de un conjunto de muestras (Hopke 2003; Marini

2013; Miller and Miller 2002). Aunque las técnicas de análisis quimiométrico multivarial se han

aplicado a la clasificación de alimentos (Bilge et al. 2015; Markiewicz-Keszycka et al. 2018; Temiz et

al. 2018; Yuan et al. 2016), actualmente no se informan estudios que implementen LIBS junto con

técnicas quimiométricas para la caracterización de plaguicidas en vegetales.

En el presente estudio se evaluó la aplicabilidad de la técnica LIBS, combinada con métodos

quimiométricos, para la detección y caracterización rápida de plaguicidas, incluidos herbicidas y

fungicidas, en muestras de acelga. Por lo tanto, se estudió la viabilidad de la técnica LIBS para su

aplicación como una técnica simple y económica en la detección de plaguicidas en matrices

62

vegetales. Los objetivos propuestos en este capítulo fueron: i) identificar los plaguicidas en muestras

de acelga contaminadas con base en la detección de los elementos que componen los agentes

activos, y ii) caracterizar y clasificar los plaguicidas por métodos quimiométricos.

METODOLOGÍA

Para llevar a cabo los objetivos planteados, se utilizaron las muestras de acelga creadas siguiendo

las directrices enunciadas en la sección 3.3.1, contaminadas con los siguientes plaguicidas:

dimetoato, cipermetrina, imidacloprid, clorpirifos y carbendazim. Además se utilizó la muestra de

acelga con agua destilada con fines de control. Estos plaguicidas presentan en sus moléculas ciertos

elementos atómicos que se encuentran presentes en diferentes proporciones, o en algunos casos,

ausentes, y que sirven para diferenciar los agentes activos de estudio. Partiendo de la base que, la

selección de variables es especialmente importante para la construcción de análisis quimiométricos,

y que los mismos deben ser representativos del conjunto de muestras a medir, los elementos

atómicos elegidos para el análisis fueron: azufre, fósforo, carbono y cloro. Dentro de los plaguicidas

seleccionados, se encuentras tres insecticidas con presencia de Cl, el imidaclorpid, la cipermetrina

y el clorpirifos, a su vez, este último contiene en su forma molécular P y S, mismos elementos que

se encuentran en la molécula de dimetoato. El carbendazim, por su lado, presenta una fórmula

molecular más simple, pudiendo diferenciar a este plaguicida por la ausencia de los otros elementos

y las diferencias en la proporción de C, elemento en común entre los plaguicidas de estudio.

Se midieron registro de señales de P, S, C y Cl tanto en las muestras de acelga contaminadas con los

plaguicidas seleccionados como en la muestra de control. El conjunto de datos obtenido fue

posteriormente utilizado en la aplicación de análisis quimiométricos, para la caracterización y

clasificación de plaguicidas según las variables de estudio. Previamente, se realizó un análisis

estadístico para verificar si existen diferencias significativas entre las medias de las variables que

conforman los plaguicidas, mediante la aplicación de ANOVA, con un nivel de significancia p˂0,05.

A su vez, se verificaron los supuestos de normalidad (test Shapiro-Wilks) y homocedasticidad

(gráfico de dispersión) correspondientes (ver Anexo 2).

Luego, se aplicó un Análisis de Componentes Principales con las variables de estudio para analizar

la estructura de covariación, reducir la dimensión de información y lograr una representación

63

conjunta de datos. Como ya se mencionó, PCA es una técnica no supervisada ya que no se asigna

información de grupo (es decir, clase) a los datos del modelo.

A continuación, se aplicó una técnica supervisada, mediante un Análisis Discriminante Lineal, con el

fin de buscar relaciones lineales entre las variables continuas que mejor discriminan a los grupos a

los que se asignaron previamente las unidades de muestra. Cabe recordar, que el LDA genera grupos

homogéneos de acuerdo con la función que los clasifica. Las asignaciones de la función

discriminante pueden coincidir o no con la preasignación, a partir de la cual se construyó una tabla

de clasificación cruzada entre la asignación realizada por el método y la asignación propuesta.

Finalmente, se realizó un análisis de varianza multivariante, mediante el uso de la prueba de

Hotelling para detectar diferencias significativas entre los grupos, considerando un nivel de

confianza del 95%.

Los espectros fueron procesados usando el software Microcal Origin. Por otro lado, Rstudio Core

Team (2016) (Core Team) e InfoStat (2018) se utilizaron como softwares para los análisis

estadísticos.

IDENTIFICACIÓN DE PLAGUICIDAS MEDIANTE EL REGISTRO DE SEÑALES LIBS

Para la caracterización de los plaguicidas se registraron las líneas de emisión de los elementos P, S,

Cl y C. La adquisición de datos LIBS fue obtenida mediante los equipos experimentales de alta

resolución 2 y 3 (sección 3.1.2 y 3.1.3).

Las líneas seleccionadas, las condiciones experimentales y los tiempos de medición fueron elegidos

para cada elemento a partir de un estudio exhaustivo, que permitió encontrar las mejores

condiciones experimentales. Con el objetivo de garantizar intensidad máxima y que las líneas en

cuestión se encuentren relativamente aisladas y libres de interferencias con líneas de elementos

posiblemente presentes en las muestras.

4.2.1 Selección de líneas para registro de elementos

En una primera instancia, fue necesario realizar un estudio sobre las líneas de emisión de las

variables seleccionadas. Para esto se realizó una búsqueda en la base de datos de espectros

atómicos de NIST (Kramida, Olsen, and Ralchenko 2019), en donde se observó la intensidad relativa

64

reportada, la probabilidad de transición (Aji) y los niveles de energía (Ej, Ei), ya sean de elementos

en estado neutro o una vez ionizados. En esta instancia, se buscaba que la intensidad relativa y la

probabilidades de transición fueran las más altas posibles, mientras que los niveles de energía

fueran bajos o inclusive transiciones que involucren el estado fundamental (líneas resonantes). Sin

embargo, algunas de las características anteriormente mencionadas, no fueron posibles de

encontrar. En la tabla a continuación (Tabla 4.1) pueden observarse las líneas elegidas

conjuntamente con sus datos espectroscópicos.

Tabla 4.1. Información espectroscópica de las líneas seleccionadas para la caracterización de plaguicidas

(Kramida, Olsen, and Ralchenko 2019).

S II P I C I Cl I

Líneas seleccionadas (nm) 416,26 253,56 415,33 725,66

Probabilidad de transición (s-1) 2,3e+08 9,5e+07 ------ 1,5e+07

Ej (eV) 18,921905 7,2127021 7,94627039 10,6297964

Ei (eV) 15,944264 2.324457 10,930438 8,9216999

gj* 10 4 7 4

gi* 8 4 5 6

Término y configuración del

nivel superior**

3s23p2(3P)4

d- 4F

3s23p2(3P)4s -

2P 2s22p7 - 3D

3s23p4(3P)4p

- 4S°

Término y configuración del

nivel inferior **

3s23p2(3P)4

p - 4D° 3s23p3 - 2P° 2s2p3 - 3D°

3s23p4(3P)4s

- 4P

*Peso estadístico correspondiente a cada nivel

**Estructura electrónica correspondiente a cada nivel

Como se puede ver en la Tabla 4.1, las energías de excitación correspondientes a las transiciones de

las líneas seleccionadas son muy elevadas respecto a líneas resonantes. Esto representa una gran

dificultad a la hora de observar las correspondientes emisiones de estos elementos presentes en las

muestras.

Por otro lado, cabe destacar, que las líneas más intensas de algunos de los elementos seleccionados

(P, C y S), se encuentran en la región espectral ultravioleta del vacío (VUV) (Labutin et al. 2014; Lee

et al. 2017), imposible de registrar con la configuración experimental que contempla cierta

versatilidad.

65

4.2.2 Condiciones experimentales de medición

Hay trabajos recientes que ya han observado limitaciones en el registro de ciertas líneas y optaron

por superarlas de diferentes formas. Zhang et al. 2020 compararon medidas registradas con LIBS

tradicional y LIBS combinado con dispersión de resonancia Raman (LIBS-RRS) en la cuantificación de

S, logrando una mejora muy aceptable en la detección del elemento. Para ello, implementaron un

esquema experimental a presión atmosférica e irradiaron el plasma con un láser OPO (láser

sintonizable en longitud de onda de oscilador paramétrico óptico) para registrar la emisión Raman.

Por su parte, Labutin et al. 2014 determinaron concentraciones de Cl, S y C en la estructura de

hormigón, considerando que estos elementos son muy importantes en la corrosión del material.

Con tal fin, aplicaron la técnica LIBS con doble pulso, observando líneas en el espectro visible, UV e

IR. Por otro lado, en un trabajo muy reciente, Fernández-Menéndez et al. 2020 estudiaron la

evolución temporal de la emisión molecular de CaF junto con la emisión atómica de Ca en diferentes

regiones del plasma, logrando un nuevo método para el análisis cuantitativo de F y otros halógenos.

En nuestro caso, la detección S se vio dificultada a presión atmosférica debido justamente a las altas

energías de los niveles electrónicos excitados. Es por esto que se optó por llevar a cabo el registro

de señales a baja presión, con el esquema que ya fue descrito en la Figura 3.6.

Por otra parte, para el caso del P, se seleccionó la línea 253,56 nm de P I, y presión atmosférica,

debido a las limitaciones de observar líneas por debajo de 300 nm con la celda de vacío. Esto último

se debe a que la celda utilizada en estas mediciones estaba construida con vidrio BK7, que atenúa

totalmente la señal por debajo de la longitud de onda referida. Considerando, a su vez, que la línea

presentaba registros de señales óptimos.

El C también se eligió medir a baja presión debido a la mejor observación de la línea 415,33 nm, en

lugar de la 247,85 nm observable a presión atmosférica y generalmente estudiada (Labutin et al.

2014), cuyo registro de intensidad relativa era mucho menor.

Por último, en los trabajos encontrados en la literatura (Du et al. 2015; Tran et al. 2001; Zhao et al.

2019) demostraron que la detección de Cl se realiza mediante el estudio de la línea de emisión

837,59 nm. Sin embargo, para esta parte del trabajo se eligió estudiar la línea 725,66 nm, en

condiciones de baja presión, debido a especificaciones limitantes del monocromador utilizado, que

no permite la visualización de líneas por encima de los 800 nm.

66

Utilizando la configuración descripta en una superficie a presiones por debajo de la atmosférica

(Arreglo experimental 3), los registros LIBS obtenidos dieron como resultado espectros mejorados.

En la Figura 4.1 puede observarse, a modo de ejemplo, claramente la diferencia obtenida en el

registro de línea de Cl I (725,66 nm), en la muestra patrón obtenida por el agregado de clorpirifos,

registrada en condiciones de presión atmosférica y baja presión.

725,62 725,64 725,66 725,68 725,700,010

0,015

0,020

0,025

0,030

0,035

0,040

Inte

nsid

ad (

u.a

.)

Longitud de onda (nm)

Cl I (725.66 nm)

Baja presión

Cl I (725.66 nm)

Presión atm

Figura 4.1. Perfil de línea de emisión de Cl I (725.66 nm) registrado con rendija de entrada y salida de 80

µm, en condiciones de presión atmosférica y en baja presión (6x10-2 mbar).

4.2.3 Tiempos postbreakdown y de integración

Los tiempos de medición para cada elemento en particular fueron obtenidos mediante un estudio

de la línea de emisión integrada en cuestión a lo largo de diferentes tiempos postbreakdown. De

esta forma, se registraron señales para un tiempo de integración determinado, y se estudiaron las

variaciones de intensidades a lo largo del tiempo para encontrar condiciones experimentales donde

el plasma sea delgado (ec. 2.3) y como resultado, la intensidad fuera proporcional a la concentración

del elemento en la muestra.

Para cada línea seleccionada se eligieron rangos de tiempos determinados y con el fin de asegurar

una integración completa en el monocromador, se utilizaron rendijas de entrada y salida de 300 µm.

En las figuras a continuación (Figura 4.2) se observan los registros netos, obtenidos luego de realizar

67

la diferencia entre el promedio de tres mediciones en cada elemento, y sus respectivos fondos,

donde se aseguró que fueran obtenidos en zonas donde no exista presencia de otros elementos

posiblemente presentes en las muestras.

(a)

(b)

(c)

68

(d)

Figura 4.2. Evolución de la intensidad en función del tiempo postbreakdown para a) S II, b) P I, c) C I y d) Cl I.

Como puede observarse, en el caso del S II, el registro de intensidad neta marca una gran diferencia

alrededor de los 300 ns, tiempo elegido para el registro de señal de este elemento. Para el P I hay

dos zonas donde la diferencia es evidente, sin embargo se eligió llevar a cabo las mediciones con un

tiempo postbreakdown de 8 µs debido a que las señales eran más estables. Cabe destacar, que en

este caso la inestabilidad de las señales registradas es propia de la configuración experimental a

69

presión atmosférica utilizada, en comparación con las señales registradas a baja presión. En el

registro de señal de C I, la mayor diferencia neta se encuentra en 400 ns, y por úlitmo, para el caso

del Cl I la mayor diferencia se encuentra alrededor de los 250 ns. De esta forma, fue posible decidir

los tiempos postbreakdown, como así también, los tiempos de integración óptimos para llevar a

cabo los registros LIBS.

A modo de síntesis, los parámetros espectroscópicos obtenidos mediante el análisis de los registros

LIBS, se observan en la Tabla 4.2. La integración espectral fue estimada a partir de la rendija de salida

para la dispersión lineal en cada longitud de onda (ver Anexo 1).

Tabla 4.2. Parámetros espectroscópicos para la detección de elementos en las muestras de estudio mediante

la técnica LIBS.

P I S II C I Cl I

Línea medida 253,56 nm 416,26 nm 415,33 nm 725,66 nm

Condición

experimental

Presión

atmosférica Baja presión Baja presión Baja presión

Tiempo

postbreakdown 8 µs 300 ns 400 ns 250 ns

Tiempo de

integración 15 µs 4 µs 4 µs 4 µs

Rendijas entrada

y salida 300/300 µm 300/300 µm 300/300 µm 300/300 µm

Integración

espectral

0,049 nm 0,046 nm 0,046 nm 0,034 nm

Cabe destacar también, que al observarse los elementos que componen a los plaguicidas se

evidencia la presencia de hidrógeno, nitrógeno y oxígeno. Sin embargo, estos elementos no fueron

70

medidos debido a limitaciones propias de la configuración experimental y teniendo en cuenta que

se encuentran a altas concentraciones en el aire. Por otra parte, se considera, que los elementos

elegidos son representativos del sistema que se está investigando.

4.2.4 Verificación de plasma delgado

Al indicar que la intensidad del plasma es proporcional a la concentración de emisores, se asume

que el modelo de plasma elegido es el correspondiente a plasma delgado (ec. 2.3). Esta

aproximación se obtiene evaluando en el modelo de plasma absorbido homogeneo, un espesor

óptico (L) muy bajo (Corney 1977a). Generalmente se da con determinados valores de

temperatura del plasma (kT), concentración baja de emisores, y niveles Ej de energía excitados

(relativamente altos y bajo espesor de columna del plasma (L)).

A partir de la ec. 2.3 y con la forma de línea integrada, la intensidad se expresa de la siguiente

forma:

𝐼(𝑘𝑇, 𝑛𝑒 , 𝐿) =ℎ 𝑐2

2 𝑁𝑘 (𝑘𝑇, 𝑛𝑒)

𝑄(𝑇) 𝐴𝑗𝑖𝑔𝑗

𝜆𝑗𝑖3 𝑒𝑥𝑝 (

−𝐸𝑗

𝑘𝑇) 𝐿

(ec. 4.1)

Para verificar la condición de plasma delgado, se llevaron a cabo relaciones de dos líneas,

correspondientes a dos elementos con concentraciones relativas conocidas entre ellos. De este

modo, se tienen dos líneas integradas, A y B respectivamente, y se puede considerar una relación

entre las dos líneas a partir de la siguiente expresión:

(𝐼(𝑘𝑇, 𝑛𝑒))𝐴

(𝐼(𝑘𝑇, 𝑛𝑒))𝐵

=

(𝑁𝑘 (𝑘𝑇, 𝑛𝑒)

𝑄(𝑇) 𝐴𝑗𝑖 𝑔𝑗

𝜆𝑗𝑖3 𝑒𝑥 𝑝 (

−𝐸𝑗

𝑘𝑇 ) 𝐿)𝐴

(𝑁𝑘 (𝑘𝑇, 𝑛𝑒)

𝑄(𝑇) 𝐴𝑗𝑖𝑔𝑗

𝜆𝑗𝑖3 𝑒𝑥 𝑝 (

−𝐸𝑗

𝑘𝑇 ) 𝐿)𝐵

(ec. 4.2)

Experimentalmente, es necesario considerar ciertas condiciones para simplificar esta relación:

a) La longitud de columna del plasma L es la misma para todos los elementos involucrados en la

aproximación.

71

b) Se supone que en la ablación de un disparo del láser sobre la muestra se “arrancan”

concentraciones de elementos con densidades proporcionales a los existentes en la muestras. Esto

involucra una homogeneidad en la distribución de los elementos en la misma.

c) Contar con información clara de la relación de concentraciones de los elementos seleccionados.

Para esto, se tiene la fórmula conocida de los plaguicidas utilizados, con las relaciones de los

diferentes elementos.

d) Además de la ecuación de plasma delgado, y debido a la distribución de concentraciones de iones

dentro del plasma, se debe considerar la aplicación de la ecuación de Saha (Lochte - Holtgreven

1968). Esta ecuación establece una relación entre dos concentraciones de elementos de grados de

ionización consecutivos, y viene dada por:

𝑛𝑒

𝑁𝑧

𝑁𝑧−1= 𝑆𝑧−1 =

𝑄𝑍(𝑇)

𝑄𝑧−1(𝑇) 6.041786𝑥1021 (𝑘𝑇)

32 𝑒−(𝜒𝑧−1 𝑘𝑇⁄ )

(ec. 4.3)

En donde,

𝑛𝑒: Es la densidad electrónica en cm-3.

𝑁𝑧: Densidad de emisores considerando el grado de ionización z, expresada en cm-3.

𝑁𝑧−1: Densidad de emisores considerando el grado de ionización z-1, expresada en cm-3.

𝜒𝑧−1: Es el potencial de ionización del elemento en estado de ionización (z-1).

kT: Temperatura del plasma expresada en eV.

Metodología y cálculos

En primer lugar, para la demostración es necesario considerar dos elementos que están presentes

en plaguicidas con una relación bien conocida. Para esto se seleccionó al clorpirifos, y los elementos

Cl y S. A partir de los datos espectroscópicos de la Tabla 4.2 y los potenciales de ionización de las

líneas seleccionadas (Tabla 4.3), se cuenta con los datos necesarios para aplicar esta propuesta de

aproximación.

72

Tabla 4.3. Potenciales de ionización de elementos seleccionados para justificar el modelo de plasma

delgado.

Elemento

y estado de ionización

𝟀I (eV) 𝟀II (eV)

S II 10,36001 23,81364

Cl I 12,967632 23,33788

Para el modelado teórico se plantea la aplicación de la ecuación de relación (ec. 4.2) en comparación

con la relación de medidas experimentales y con parámetros típicos de plasmas LIBS.

Se tuvieron en cuenta los emisores 𝑁𝑘 (en donde k es el estado de ionización) para los diferentes

elementos, y se expresaron en función del N total del elemento presente en el plasma, a fin de

utilizar el dato de relaciones de elementos presentes en la muestra. Para esto último, se puede decir

que la concentración total de un determinado elemento es posible escribirla como una suma de la

concentración del elemento en su estado neutro y las correspondientes a los estados ionizados. En

este caso en particular, se descarta la posibilidad de tener presente a 𝑁𝐼𝐼𝐼 ya que los potenciales de

ionización de 𝑁𝐼𝐼 son lo suficientemente altos (II en Tabla 4.3), y con las temperaturas y densidades

electrónicas típicas en LIBS, se puede suponer 𝑁𝐼𝐼𝐼 despreciable. De este modo se puede expresar:

𝑁 = 𝑁𝐼 + 𝑁𝐼𝐼 (ec. 4.4)

Por otro lado, se tiene a la ecuación de Saha (ec. 4.3), para los elementos 𝑁𝐼 y 𝑁𝐼𝐼 , la cual se pude

reescribir de la forma:

𝑛𝑒

𝑁𝐼𝐼

𝑁𝐼= 𝑆𝐼 =

𝑄𝐼𝐼(𝑇)

𝑄𝐼(𝑇) 6.041786𝑥1021 (𝑘𝑇)

32 𝑒−(𝜒𝐼 𝑘𝑇⁄ )

(ec. 4.5)

Como se busca dejar expresado a 𝑁𝑘 en función del N total, se puede ver que a partir de las

ecuaciones (ec. 4.4) y (ec. 4.5), es posible obtener las concentraciones de los diferentes estados de

ionización según sea necesario:

𝑁𝐼 =𝑛𝑒

𝑛𝑒 + 𝑆𝐼 𝑁 (ec. 4.6)

73

𝑁𝐼𝐼 =𝑆𝐼

𝑛𝑒 + 𝑆𝐼 𝑁

(ec. 4.7)

Aplicación directa

Considerando al Cl como elemento A y el S como B, la relación de la (ec. 4.3), se puede expresar

como:

(𝐼(𝑘𝑇, 𝑛𝑒))𝐴

(𝐼(𝑘𝑇, 𝑛𝑒))𝐵

=

(1

𝑄(𝑇) 𝐴𝑗𝑖𝑔𝑗

𝜆𝑗𝑖3 𝑒𝑥𝑝 (

−𝐸𝑗

𝑘𝑇))

𝐴

(1

𝑄(𝑇) 𝐴𝑗𝑖𝑔𝑗

𝜆𝑗𝑖3 𝑒𝑥𝑝 (

−𝐸𝑗

𝑘𝑇))

𝐵

(𝑛𝑒

𝑛𝑒 + 𝑆𝐼)

𝐴

(𝑆𝐼

𝑛𝑒 + 𝑆𝐼)

𝐵

𝑁𝐴

𝑁𝐵

(ec. 4.8)

En donde se consideró la ecuación (ec. 4.6) para expresar la línea de Cl I, y la ecuación (ec. 4.7) para

el S II. Por otro lado, 𝑁𝐴

𝑁𝐵 es la relación de las concentraciones de Cl/S en el plaguicida elegido para la

verificación. En este caso, al elegir clorpirifos (C9H11Cl3NO3PS), en consecuencia, 𝑁𝐴

𝑁𝐵= 3.

Comparativa teórico – experimental

Experimentalmente, se tiene que la relación debe hacerse con las intensidades netas de los

elementos de los plaguicidas, esto es la diferencia entre intensidades de las líneas de los elementos

de las muestras con el plaguicida y la muestra de acelga sin contaminar. Por otro lado, hay que tener

en cuenta la eficiencia cuántica para cada longitud de onda de las líneas involucradas, para el sensor

utilizado. Con todo esto se obtuvo una relación experimental:

𝑅𝐴𝐵 =𝐼𝐴

𝐼𝐵 = 0,374 ± 0,050

(ec. 4.9)

Para hacer una comparativa con el modelo de relación de líneas de plasma delgado teórico (ec.

4.8) se graficó una familia de curvas, para diferentes 𝑛𝑒 típicas de LIBS, entre 5x1016 - 1x1017 cm-3,

para temperaturas entre 1,2 y 1,4 eV. Esto se muestra en la Figura 4.3 y Figura 4.4, en donde se

superpone la relación de los registros experimentales, dejando establecido que esta relación se

ajusta a datos típicos de LIBS y por lo tanto se aseguran condiciones de plasma delgado en el

74

registro de líneas obtenidos.

Figura 4.3. Familia de curvas de relaciones teóricas (𝐼(𝑘𝑇,𝑛𝑒))

𝐴

(𝐼(𝑘𝑇,𝑛𝑒))𝐵

, para kT típicas entre 1,2 y 1,4 eV, para

diferente 𝑛𝑒 entre 5x1016 y 1x1017 cm-3. Se pude ver la superposición de la relación experimental en 𝐼𝐴𝑝𝑒𝑠𝑡

𝐼𝐵𝑝𝑒𝑠𝑡 en

este grupo de curvas.

Figura 4.4. Zoom de Figura 4.2 para enfatizar los datos.

75

4.2.5 Adquisición de datos LIBS

Obtener datos de alta calidad es esencial para la aplicación exitosa de los métodos quimiométricos.

Los criterios para un buen conjunto de datos de entrenamiento incluyen no solo una buena relación

señal/ruido, sino también la inclusión de una variedad apropiada de diferentes tipos de muestras,

que a su vez sean representativas y la obtención de un número suficiente de espectros recolectados

de cada una (Cremers, Radziemski, and Gottfried 2013).

Obtención del número óptimo de adquisiciones LIBS

Con el fin de evaluar el número óptimo de adquisiciones LIBS a partir del método descrito en la

sección 3.4, se tomaron suficiente cantidad de datos en función de las desviaciones estándar de las

mediciones, calculando incerteza final estadística por debajo de la experimental (ver Anexo 2).

Luego de realizar los cálculos correspondientes, se obtuvieron los valores que se observan en la

Figura 4.5.

Figura 4.5. Número óptimo de adquisiciones LIBS, por elemento, para cada plaguicida en cuestión.

De esta forma, y a partir de evaluar los resultados obtenidos, se trabajó con un número óptimo de

adquisiciones de datos LIBS de 40. Luego, se obtuvieron los registros de cada elemento en cada

muestra, y también, se obtuvieron fondos que son registros obtenidos en una zona espectral

76

cercana a la línea sin interferencia de otros elementos, con el fin de obtener una intensidad neta en

cada caso.

Un ejemplo de perfil de línea de emisión de P I (253,56 nm) tomado a presión atmosférica y la gráfica

obtenida del nuevo método de medición descrito en la sección 3.4 para la muestra de acelga

contaminada con clorpirifos pueden observarse en la Figura 4.6.

253,50 253,52 253,54 253,56 253,58 253,60 253,62

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025

0,030

0 10 20 30 400,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0,09

0,10

0,11

0,12

Inte

nsid

ad (

u.a

.)

Longitud de onda (nm)

P I (253,56 nm)

Inte

nsid

ad (

u.a

.)

Registro

P I (253,56 nm)

P I fondo (253 nm)

Figura 4.6. Perfil de línea de emisión de P I (253.56 nm) registrado con rendija de entrada y salida de 80 µm y

b) gráfica obtenida del nuevo método de medición descrito en la sección 3.4 para la muestra de acelga

contaminada con clorpirifos.

De esta forma, se midieron registros de señales de S, P, Cl y C en las muestras de acelga

contaminadas con los plaguicidas en cuestión, y también fueron medidos en la muestra control.

Como ya se mencionó en la sección 3.3.4, las diferencias entre las propiedades de los plaguicidas

causan discrepancias en los registro de líneas obtenidos muestra a muestra, esto implica la

necesidad de realizar un procesamiento de datos. Para este fin, los registros de líneas obtenidos se

normalizaron con respecto a un fondo medido.

Nuevamente, a modo de ejemplo, en la Figura 4.7, se observa el registro de señal adquirido con el

nuevo método de adquisición y con los registros de líneas normalizados para el Cl I, en todas las

muestras de estudio.

77

0 10 20 30 40

-0,05

0,00

0,05

0,10

0,15

Inte

nsid

ad (

u.a

.)

Registros

Dimetoato Imidacloprid Carbendazim

Cipermetrina Clorpirifos Acelga

Figura 4.7. Intensidades netas para la línea de emisión de Cl I obtenidos del nuevo método de registro de

línea, registradas para todas las muestras de estudio.

En la Figura 4.7 se visualiza como aquellos plaguicidas con Cl en sus moléculas poseen una intensidad

mayor, no obstante, es notoria la inestabilidad en la medición, observándose en algunos casos la

superposición de los registros. En este punto, la aplicación de métodos quimiométricos juega un

papel muy importante, debido a que ayuda a disminuir este problema de fluctuación en la medición.

Cálculo de relación señal-ruido

La relación señal-ruido (SNR, por sus siglas en inglés) es un parámetro utilizado para evaluar la

calidad de una medición física. Con el fin de determinar las SNR para todos los elementos en cada

plaguicida en estudio, se aplicó a los registros obtenidos la siguiente fórmula:

𝑆

𝑁=

µ

σ

(ec. 4.10)

Donde µ es la media de la señal o el valor esperado y σ es la desviación estándar del ruido (fondo,

en este caso) (Hahn and Omenetto 2012). Los resultados se presentan en la siguiente tabla (Tabla

4.4):

78

Tabla 4.4. Relaciones señal-ruido para cada elemento medido en los plaguicidas de estudio.

SNR Cl SNR C SNR S SNR P

Carbendazim 0,80 31,58 2,21 5,20

Dimetoato 1,36 26,09 7,08 15,55

Clorpirifos 12,65 18,10 5,53 13,01

Imidacloprid 3,86 46,75 2,34 7,57

Cipermetrina 2,51 54,09 1,10 7,28

Control 1,95 26,40 0,30 6,44

Como era de esperarse, las relaciones señal-ruido más elevadas fueron alcanzadas por aquellos

elementos que se encuentran presentes en el agente activo del plaguicida en cuestión.

A su vez, cabe destacar que la obtención de espectros con una óptima relación señal/ruido, depende

también de la optimización de los parámetros experimentales. De esta forma, la importancia de

establecer condiciones espectrales adecuadas conlleva a la obtención de espectros más

representativos para el conjunto de datos que se propone establecer (Lentjes, Dickmann, and Meijer

2007; Nunes et al. 2009).

Por último, se utilizó el conjunto de datos obtenido, para cada muestra en cuestión, para la

aplicación de métodos quimiométricos con el fin de caracterizar y clasificar plaguicidas, según las

variables de estudio, en muestras de acelga. De esta forma, los datos obtenidos se organizaron

convenientemente en un matriz de dimensiones nxp, donde n corresponde a 240 unidades de

análisis que representan 40 muestras de cada uno de los 5 plaguicidas y 40 muestras tomadas como

control. Para cada unidad de análisis se registró el valor de las 4 variables en estudio P, S, C y Cl.

CARACTERIZACIÓN DE PLAGUICIDAS

Se llevó a cabo un PCA para explicar la variación de los datos mediante una reducción de la

dimensión, como puede verse en la Figura 4.8. El análisis recuperó el 78,5% de la variación con sus

79

dos primeras componentes principales. La dirección de mayor variación es explicada por el P y el S,

y la segunda dirección por el Cl y el C. A partir del análisis se deduce que la muestra control fue

caracterizada por valores bajos de todas las variables medidas, como era de esperarse. El dimetoato

se caracterizó por valores altos de P y S y bajos de C y Cl (cercanos al promedio), con respecto al

imidacloprid, carbendazim y cipermetrina se observa que entre ellos hay baja separación y tienen

valores bajos de P y S y más variables respecto de C y Cl. Por último, el clorpirifos tiene valores

intermedios de S y P y altos de Cl y C. Estos resultados son coincidentes con la correlación de las

variables en los PC1 y PC2, que pueden visualizarse en la Tabla 4.5.

Figura 4.8. Biplot del análisis de componentes principales (PCA) para muestras contaminadas con diferentes

plaguicidas y la muestra control.

80

Tabla 4.5. Correlación de PC1 y PC2 con las variables originales.

PC1 PC2

P 0,92 0,16

S 0,92 0,02

C -0,29 0,75

Cl 0,06 0,83

De la Tabla 4.5 se observa que CP1 tiene su mayor correlación con las variables P y S, mientras que

PC2 tiene su mayor correlación con las variables C y Cl. Por lo tanto la CP1 separa aquellos

plaguicidas con presencia o ausencia de S y P en su molécula, y por otro lado, la CP2 separa aquellos

plaguicidas con presencia o ausencia de Cl y C en sus moléculas

La representación del PCA mostró que las muestras tendían a agruparse según el plaguicida, aunque

se observan algunas muestras superpuestas o cruzadas. Sin embargo esto lleva a pensar que es

factible agruparlas según el plaguicida o la muestra control y, a partir de esto se generaron seis

grupos.

Como se detalló anteriormente, para corroborar las agrupaciones y explicarlas mediante funciones

lineales canónicas, se aplicó una LDA. Al tratarse de una técnica supervisada requiere que se asignen

clases, u otros valores predictivos, para el conjunto de datos de entrenamiento. En particular para

este caso, cada unidad de análisis fue pre asignada al grupo control o al plaguicida que le fuera

agregado; las variables utilizadas para la clasificación fueron P, S, C y Cl.

Las muestras se proyectaron en el plano formado por las funciones canónicas, el mismo reconstruye

el 82,57 % de la información.

Las funciones discriminantes canónicas fueron estandarizadas por varianzas comunes, para que la

variabilidad propia de cada grupo no enmascare la separación entre grupos. Las funciones

discriminantes canónicas se construyen como la combinación lineal de las variables originales y los

coeficientes que se muestran en la Tabla 4.6. Los resultados de clasificación cruzada del LDA se

observan en la Tabla 4.7, y por último en la Figura 4.9 puede visualizarse la representación LDA a

partir de los grupos asignados.

81

Tabla 4.6 Funciones discriminantes - datos estandarizados con las varianzas comunes.

FDL1 FDL2

P 0,56 0,12

S 0,82 -0,21

C -0,20 -0,11

Cl 0,18 1,01

Tabla 4.7 Resultados de clasificación cruzada del análisis discriminante lineal (LDA).

Grupo Carbendazim Cipermetrina Clorpirifos Control Dimetoato Imidacloprid Total Error

(%)

Carbendazim 38 0 0 0 0 2 40 5,00

Cipermetrina 0 36 0 0 0 4 40 10,00

Clorpirifos 0 2 38 0 0 0 40 5,00

Control 2 1 0 34 0 3 40 15,00

Dimetoato 0 0 1 0 39 0 40 2,50

Imidacloprid 4 4 0 0 0 32 40 20,00

Total 44 43 39 34 39 41 240 9,58

82

Figura 4.9. Visualización de representación de análisis discriminante lineal (LDA) a partir de la preasignación

de grupos.

El porcentaje de error de la clasificación alcanzado con el LDA es del 9.5%. Se observa que el grupo

imidacloprid es el más variable, dado que 8 de las 40 muestras han quedado mal clasificadas. De la

Figura 4.9, se observa que las cruces, correspondientes a este grupo, se distribuyen en los

cuadrantes 1, 2 y 3. De la Tabla 4.7 se puede observar que algunas muestras a las que se les había

preasignado como pertenecientes al grupo imidacloprid se distribuyeron en el grupo

correspondiente a la cipermetrina, plaguicida que contiene una concentración similar de Cl en su

agente activo y al carbendazim, el cual presenta la forma molecular más simple, con elementos que

se encuentran presentes en todos los plaguicidas.

Por otro lado, el grupo control tiene un número de muestras discordantes (6 de 40, que se

distribuyen entre los cuadrantes 2 y 3), relativamente alto. Esto indica que el grupo control es muy

heterogéneo, luego del imidacloprid. Estos resultados también pueden verificarse en la Tabla 4.7.

Si bien el LDA encuentra las funciones que mejor separan los grupos, esta técnica no permite indicar

si esta separación es significativa, es decir si los centroides de grupo son estadísticamente

diferentes. Para ello es posible aplicar un MANOVA. La prueba de Hotelling detectó diferencias

Imidacloprid Dimetoato Control Clorpirifos Cipermetrina Carbendazim

-4,10 -0,51 3,08 6,67 10,26

Eje Canónico 1

-4,23

-1,96

0,31

2,58

4,85

Eje

Ca

nó

nic

o 2

Imidacloprid Dimetoato Control Clorpirifos Cipermetrina Carbendazim

83

significativas entre los grupos con un nivel de confianza del 95%. Los resultados de lo anteriormente

expuesto pueden observarse en la Tabla 4.8.

Tabla 4.8 Tabla resumen de análisis de varianza multivariante (MANOVA) que informa el resultado de

diferencias significativas entre los grupos de plaguicidas y la muestra control.

Plaguicida P C S Cl n

Control 0,02 0,33 0,02 0,01 40 A

Dimetoato 0,05 0,50 0,65 0,01 40 B

Imidacloprid 0,02 0,63 0,04 0,05 40 C

Carbendazim 0,02 0,68 0,01 0,01 40 D

Cipermetrina 0,03 0,66 0,15 0,07 40 E

Clorpirifos 0,04 0,54 0,32 0,09 40 F

Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)

Las medias observadas son significativamente diferentes con un p valor < 0,05, por lo tanto se puede

concluir que la separación es significativa y que es posible clasificar las muestras con plaguicidas

diferentes, incluso se la puede diferenciar de la muestra control.

DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES DE LA IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE PLAGUICIDAS

Se exploró la viabilidad de la técnica LIBS para la identificación de plaguicidas en matrices vegetales

de hojas verdes a través de la evaluación de los elementos que componen los agentes activos y su

posterior caracterización mediante el uso de técnicas quimiométricas. Los resultados de los

registros de señales LIBS fueron exitosos, pudiendo encontrar condiciones experimentales óptimas,

posibilitando la identificación de P, S, C y Cl en todas las muestras seleccionadas y en la muestra

utilizada para fines de control. Un nuevo método de adquisición de muestras también se aplicó, este

garantiza la obtención de varios registros de señal con una mínima destrucción de muestra y en

forma rápida y versátil, logrando de esta forma conseguir repetitividad en las mediciones y

aumentar la cantidad de datos obtenidos para la aplicación de métodos quimiométricos.

Por medio de un PCA, se pudo observar que las muestras tienden a agruparse de acuerdo con el

plaguicida que las compone y se diferencian de la muestra control. Luego, mediante la aplicación de

un LDA, se verificó que los plaguicidas se separaron, mediante una preasignación, con un bajo error

84

de clasificación del 9,5%. La corroboración de los resultados ya obtenidos fue así posible.

Finalmente, se aplicó un MANOVA y se encontró la existencia de diferencias significativas entre los

grupos con un nivel de confianza del 95%.

El análisis se propone como una herramienta potencial para un monitoreo rápido, simple, de bajo

costo y que no genera los desechos peligrosos producidos actualmente por los métodos

tradicionales (descritos en la sección 2.1.3).

Por otro lado, cabe destacar que esta caracterización funciona bien a altas concentraciones del

plaguicida en la muestra, lo que permite una buena clasificación y diferenciación. Debido a esto, el

análisis propuesto podría presentar ventajas en la detección de la composición molecular de una

sustancia activa, en el proceso de registro de plaguicidas, el cual es llevado a cabo por el SENASA

(Paz 2016), mediante la Ley N° 3489/58, Decreto 5769/59. Por el medio del mismo, se aprueba la

comercialización y el uso de un plaguicida luego de evaluar exhaustivamente una amplia

información científica, en la que se demuestra si el producto es efectivo para su uso y no presenta

riesgo inaceptable para la salud humana, animal o para el ambiente. A partir de la Resolución

SAGPyA 350/99 (Secretaría de Agricultura, Ganadería y Pesca), con la incorporación del registro de

agentes activos equivalentes, podría demostrarse mediante este método, la equivalencia respecto

de otros ya registrados en el país. De esta forma, se podría evaluar su posible uso alternativo o

complementario a los métodos analíticos tradicionales para control de calidad de agentes activos.

A su vez, puede plantearse como una herramienta útil para la evaluación de derrames de plaguicidas

en un huerto o matriz suelo. Los lineamientos a seguir en un derrame son determinados en un

manual de referencia emitido por la FAO (Boa 2016). En una primera instancia es importante la

identificación del plaguicida. En este contexto, esta herramienta permitiría detectar el plaguicida

correspondiente, mediante la medición de las líneas de P, S, C y Cl, utilizando los resultados de

clasificación como base de datos y, a su vez es posible determinar la extensión de la zona

contaminada. A partir de la identificación del plaguicida, puede establecerse si el mismo es

pertinente, es decir, que fue derramado en cantidades considerables y que presenta una baja

degradación. Mediante este análisis, se puede brindar información para la determinación de

evaluaciones de riesgos y las medidas a tomar en la zona contaminada.

85

5 CAPÍTULO V: CUANTIFICACIÓN DE PLAGUICIDAS

En la actualidad, las metodologías utilizadas para la detección de residuos de plaguicidas en

alimentos comprenden las cromatografías gaseosas y líquidas, espectrometrías de masas,

cromatografías de ultra alta precisión (HPLC), entre otras (Ferrer et al. 2005; Furlani et al. 2011;

Gómez Ramos 2013). Estas técnicas convencionales requieren de un alto tiempo de ejecución

sumado a la alta producción de desechos peligrosos. Es por esto que, últimamente se han estado

desarrollando tecnologías que superen los obstáculos presentados por las técnicas convencionales

y que sean aplicables en forma rápida. Con este fin, se han utilizado técnicas ópticas para el análisis

de productos agrícolas tales como estudio de residuos de plaguicidas en muestras de frutas, como

es el caso de la técnica Raman (Chen, Dong, and Ye 2018; Liu et al. 2013), sin embargo es necesario

mejorar tanto la sensibilidad como la capacidad cuantitativa del método.

Desde hace unos pocos años, se ha comenzado a estudiar la aplicación de la técnica LIBS como un

método rápido y confiable en la detección de residuos de plaguicidas, aprovechando las ventajas de

su utilización. Para este fin, se han aplicado análisis de calibración univariados, teniendo en cuenta

que a su vez, un pretratamiento espectral pueden mejorar efectivamente el rendimiento analítico,

es decir, los límites de detección (LoD), la precisión y repetibilidad de LIBS (Fu et al. 2018).

Con el objetivo de cuantificar residuos de plaguicidas en muestras de acelga, se propone en este

estudio la realización de muestras de referencia para el posterior armado de curvas de calibración,

evaluando la capacidad predictiva de los modelos mediante validaciones y estableciéndose los

límites de detección y cuantificación en cada caso.

METODOLOGÍA

Como ya se mencionó en la sección 3.3.2, se crearon dos conjuntos de muestras de referencia con

concentraciones conocidas y crecientes de dimetoato, con el fin de detectar y cuantificar P y S; y

clorpirifos, para la detección y cuantificación de C y Cl. De esta forma, se busca proponer métodos

de cuantificación de los plaguicidas a partir del análisis de los elementos que contienen en sus

moléculas. Se obtuvieron un total de seis muestras para cada plaguicida, en los rangos 0–80 mg/kg

para dimetoato y 0-250 mg/kg, para clorpirifos. En la Tabla 3.1 se pueden observar las equivalencias

en concentración para el P, S, C y Cl, calculadas a partir de la proporción de estos elementos en los

86

plaguicidas mencionados. Por otra parte, los registros LIBS fueron obtenidos mediante el arreglo

experimental 3, de alta resolución en condiciones de vacío, anteriormente mencionado (sección

3.1.3). En el caso del Cl, fue necesario cambiar y obtener una nueva configuración experimental,

como se detalla en el apartado específico.

5.1.1 Análisis cuantitativo

El procedimiento analítico más utilizado en análisis cuantitativo implica la construcción de una

“curva de calibración”. Una curva de calibración es la representación gráfica de una señal que se

mide en función de la concentración de un analito mediante una determinada técnica. La calibración

incluye la selección de un modelo para estimar los parámetros experimentales que permitan

determinar la linealidad de esa curva y, en consecuencia, la capacidad de un método analítico para

obtener resultados que sean directamente proporcionales a la concentración de un compuesto en

una muestra, dentro de un determinado intervalo de trabajo (María Antonia and Marcos 2008).

En una primera instancia es importante determinar el número mínimo de datos (valores de

concentración) para construir un modelo de calibración lineal robusto. Para este fin, existen varios

criterios y los mismos no están definidos de manera única por las organizaciones a cargo de la

estandarización y la trazabilidad de las mediciones químicas (Guezenoc, Gallet-Budynek, and

Bousquet 2019). Sin embargo, en base a referencias establecidas (Danzer and Currie 1998; Miller

and Miller 2002), el número mínimo de puntos para construir un modelo de calibración confiable

debe ser de alrededor de 5 o 6, considerando el blanco (valor de concentración cero). A su vez, los

mismos deberían están distribuidos en forma equidistantes en el rango de concentración elegido

para obtener el modelo de calibración más representativo relacionado al contexto analítico.

Por otro lado, para la aplicación de LIBS en la cuantificación de las variables de estudio, es

importante encontrar condiciones donde la emisión de líneas seleccionadas responda al modelo de

plasma delgado, dado por la ecuación 2.3, y de este modo se pueda aplicar una curva de calibración

lineal. En este caso, las intensidades de las líneas (integradas tanto en una línea λ0 como en un

determinado tiempo de registro o exposición) son proporcionales a la concentración de elementos

presente en el plasma, que a su vez son proporcionales a la correspondiente existente en la muestra.

Se tomaron 30 registros de perfiles de líneas espectralmente integrados con sus correspondientes

fondos (de acuerdo a lo observado en la Figura 4.4), obtenidos de una integración en una zona

87

espectral libre de cualquier emisión de elementos posiblemente presentes en las muestras.

Posteriormente, se realizó un análisis estadístico para cada una de las tandas de registros,

obteniéndose el promedio y la desviación estándar de cada una de ellas. Con el fin de aumentar la

representatividad de los registros de señales LIBS, se llevó a cabo un procesamiento de los datos. La

normalización de todos los datos de los distintos registros consistió en un normalizado con respecto

al fondo. A partir de estos datos, se realizó la diferencia entre el registro de línea y el fondo, el cual

permite obtener intensidades netas finales. Los espectros fueron procesados usando el software

Microcal Origin.

Una vez obtenidas las intensidades procesadas de los registros para cada una de las muestras, se

construyeron curvas de calibración mediante la gráfica de la intensidad neta de líneas frente a las

diferentes concentraciones correspondientes a cada elemento. Se evaluó la sensibilidad de los

modelos obtenidos y se calcularon, en cada caso, los parámetros de regresión, R2 y r Pearson. A

partir de datos obtenidos del análisis lineal aplicado se calcularon los límites de detección (LoD) y

cuantificación (LoQ) en cada caso.

Por otro lado, con el fin de evaluar el rendimiento analítico del método cuantitativo LIBS, se

procedieron a realizar pruebas de validación internas cruzadas, sobre las correspondientes curvas

de calibración. Para este objetivo se realizaron validaciones cruzadas completas mediante la

aplicación de varios métodos, leave-one-out cross validation (LOOCV), k-fold y k-fold repetida. Se

utilizó el software Rstudio Core Team (2016) (Core Team) para la ejecución de los modelos y

adquisición del error cuadrático medio (RMSE, por sus siglas en inglés), el error absoluto medio

(MAE, por sus siglas en inglés) y el R2, en cada caso.

5.1.2 Figuras de mérito

Para evaluar el desempeño analítico de los modelos, es necesario calcular valores correctos para las

figuras de mérito. El coeficiente de determinación, R2, es la figura de mérito más utilizada para

evaluar la calidad de un modelo de calibración. Sin embargo, este indicador es confiable sólo cuando

los puntos están distribuidos equitativamente en el rango de concentración y cuando no hay un

punto extremo, muy lejos de los demás. Por el contrario, si no se cumple una de estas condiciones,

la decisión basada solo en el parámetro R2 podría no ser sólida.

88

Por otro lado, el coeficiente de correlación de Pearson (r Pearson) es una prueba que mide la

relación estadística entre dos variables continuas. Si la asociación entre los elementos no es lineal,

entonces el coeficiente no se encuentra representado adecuadamente.

El coeficiente de correlación puede tomar un rango de valores de +1 a -1. Un valor de 0 indica que

no hay asociación entre las dos variables. Un valor mayor que 0 indica una asociación positiva. Es

decir, a medida que aumenta el valor de una variable, también lo hace el valor de la otra. Un valor

menor que 0 indica una asociación negativa; es decir, a medida que aumenta el valor de una

variable, el valor de la otra disminuye.

Indicadores de capacidad de predicción: RMSE y MAE

Luego, se debe determinar la capacidad de predicción. El RMSE y el MAE son dos de las métricas

más comunes utilizadas para medir la precisión de las variables continuas (Sammut and Webb 2010;

Shekhar and Xiong 2008). El cálculo del RMSE es la raíz cuadrada del promedio de las diferencias

cuadráticas entre la predicción y la observación real resultante de los valores de concentración

pronosticados de una serie de muestras. Se espera que este indicador sea lo más bajo posible para

un modelo confiable, y se describe mediante la siguiente ecuación:

𝑅𝑀𝑆𝐸 = √∑ (𝐶𝑃 − 𝐶��)

2𝑁𝑝=1

𝑁

(ec. 5.1)

donde 𝐶𝑃 es el valor de concentración predicha, 𝐶�� el valor real de concentración de la muestra p,

y N el número de muestras tomadas en cuenta. Cabe destacar que esta figura de mérito debe

considerarse con atención. Cuando todas las muestras que pertenecen al conjunto de calibración

(C) se tienen en cuenta simultáneamente, el valor RMSE resultante se denomina RMSEC. Sin

embargo, el valor RMSE debe calcularse sobre la base de un proceso de validación cruzada (CV) y

denominarse RMSECV. Entre las diferentes técnicas de validación cruzada, el método Leave-One-

Out (LOOV) es el más común. En este caso, el RMSECV es el valor promedio de los N valores de

RMSEC calculados durante el proceso de validación cruzada. Se espera que RMSECV revele mejor

las limitaciones del modelo de calibración que RMSEC.

Por otro lado, el MAE de un modelo con respecto a un conjunto de prueba, es un promedio

aritmético de los errores absolutos. Cada error de predicción es la diferencia entre el valor predicho

y el valor real. Se representa mediante la siguiente ecuación:

89

𝑀𝐴𝐸 = 1

𝑁∑|𝐶𝑝 − 𝐶��|

𝑁

𝑝=1

(ec. 5.2)

Por último, los LoD y LoQ se calculan a partir de datos del modelo de regresión mediante las

ecuaciones 2.4 y 2.5 respectivamente.

Por lo tanto, el conjunto de calibración debe cumplir los requisitos básicos para obtener resultados

confiables para los valores de estos límites. Finalmente, las cifras de mérito R2, r Pearson, RMSE,

MAE, LoD y LoQ son adecuadas para evaluar el rendimiento analítico, mediante validación de los

modelos (Motto-Ros et al. 2018).

CUANTIFICACIÓN DE AZUFRE

Para la cuantificación de azufre se estudió la línea de emisión 416,26 nm, correspondiente al S II,

que como ya se mencionó en la sección 4.2.1, la misma fue medida en condiciones de baja presión

y con parámetros temporales bien establecidos.

A modo de ejemplo y con el fin de ubicar la posición exacta de la línea, se registró un perfil de S II,

con rendija de entrada y salida del monocromador de 100 µm, como puede observarse a

continuación (Figura 5.1). El perfil fue registrado en una muestra que contenía 80 mg/kg de

dimetoato, lo que equivale a 22,37 mg/kg de azufre.

90

415,80 415,95 416,10 416,25 416,40 416,55 416,700,000

0,058

0,116

0,174

0,232

0,290

0,348

Inte

nsid

ad (

u.a

.)

Longitud de onda (nm)

S II (416,26 nm)

Figura 5.1. Perfil de línea de emisión de S II (416,26 nm), en una muestra que contiene 80 mg/kg de

dimetoato (22,37 mg/kg de s) registrado con rendija de entrada y salida de 100 µm.

Luego, se midieron registros de señales de la línea de S II en estudio, tal y como se explicó en el

apartado 3.4, a partir de seis muestras de referencia que se observan en la tabla 3.1, en un rango

entre 0-80 mg/kg de dimetoato, lo que equivale a 0-23 mg/kg de S. En la Figura 5.2 se observa la

curva de calibración correspondiente.

91

0 5 10 15 20 25-0,1

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

S II (416,26 nm)

y= 0,0278x+0,01597

R2 = 0,95232

r Pearson = 0,98074

Inte

nsid

ad (

u.a

.)

Concentración S (mg/kg)

Figura 5.2. Curva de calibración de la línea de S II (416,26 nm), concentración agregada a partir de dimetoato

en muestras de hortalizas. Las barras de error vienen dadas por la incerteza del valor instrumental.

A partir del análisis de la curva de calibración se observa que se obtuvieron un R2 y r Pearson altos,

lo que indica que la curva ajustada es confiable, además de obtener una buena sensibilidad. Es decir,

la intensidad de los registros de señales obtenidos mediante la aplicación de la técnica LIBS posee

una buena relación lineal con la concentración en las muestras. Lo que permite deducir que es

posible detectar S en muestras de acelga mediante la utilización de la curva de calibración

construida.

A su vez, se realizaron validaciones cruzadas completas mediante la aplicación de los métodos

anteriormente mencionados, leave-one-out cross validation (LOOCV), k-fold y k-fold repetida, y se

calcularon las figuras de mérito correspondientes, RMSE, MAE y el R2, en cada caso. Estos resultados

pueden observarse en la Tabla 5.1.

92

Tabla 5.1. Figuras de mérito calculadas para evaluar el desempeño del modelo de regresión de la

concentración de S II, a partir de diferentes modelos de validación.

LOOCV k-fold k-fold cruzada

RMSECV 2.22889 2.127651 1.935504

MAE 1.962664 2.099097 1.87962

R2 0.9137595 1 1

Los valores R2 de calibración para S fueron cercanos a 1 en todos los casos, lo que significa una buena

correlación entre las concentraciones de referencia y las utilizadas con fines de validación en cada

caso en particular, a su vez, se encontraron valores bajos de RMSECV y MAE. Generalmente, son

deseables valores de errores bajos, como los obtenidos en este caso, aunque también es importante

asegurarse que la calibración realizada en función de la intensidad del elemento a medir exhiba una

buena sensibilidad a las variaciones de concentraciones de S en las muestras, de forma tal que pueda

asegurarse su uso como herramienta predictiva.

Por último, para explorar la capacidad de detección de LIBS se calcularon el LoD y el LoQ a partir de

las ec. 2.4 y ec. 2.5. La desviación estándar del fondo fue obtenida de la muestra que se preparó con

fines de control (0 mg/kg de dimetoato). Los resultados pueden observarse en la tabla a

continuación (Tabla 5.2), en donde se calculó tanto para el S, como para el dimetoato, considerando

la proporción del elemento en el componente activo del plaguicida.

Tabla 5.2. LoD y LoQ para el S y el dimetoato.

LoD (mg/kg) LoQ (mg/kg)

S 1,72 0,17 5,67 0,56

Dimetoato 6,15 0,60 20,30 2,00

CUANTIFICACIÓN DE FÓSFORO

Al registrarse señales en muy bajas concentraciones de fósforo, no fue posible encontrar

condiciones de plasma delgado (ec. 2.3) para la línea 253,56 nm, utilizada en la caracterización de

plaguicidas fosforados, en este caso, se eligió estudiar una nueva línea de emisión, y trabajar en

93

condiciones de baja presión (Arreglo experimental 3). Por lo tanto, en la implementación de una

curva de calibración para la cuantificación de P, se seleccionó la línea 460,21 nm correspondiente al

P una vez ionizado (P II). En la tabla a continuación (Tabla 5.3) se observa la línea elegida

conjuntamente con sus datos espectroscópicos (Kramida, Olsen, and Ralchenko 2019).

Tabla 5.3. Información espectroscópica de la línea de P II seleccionada para la cuantificación de dimetoato.

Elemento y

estado de

ionización

Longitud de

onda (nm)

Probabilidad

de transición

(s-1)

Ei (eV) Ek (eV) gk

P II 460,21 1,9 x108 12,853176 15,546519 9

Los tiempos de medición en este caso, fueron obtenidos de la misma forma que lo ya expuesto en

el apartado 4.2, mediante un estudio de la línea de emisión integrada en cuestión. En la figura a

continuación (Figura 5.3) se observa el registro neto, obtenido luego de realizar la diferencia entre

el promedio de tres mediciones en la línea de P II, y su fondo correspondiente.

0 200 400 600 800 1000 12000,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

Inte

nsid

ad (

u.a

.)

Tiempo postbreakdown (ns)

P II (460,21 nm)

Figura 5.3. Evolución de la intensidad en función del tiempo postbreakdown para la línea de P II (460,21 nm),

elegida para la cuantificación de fósforo, y por lo tanto de dimetoato.

94

A partir del análisis de la evolución temporal de la línea de P II a lo largo del tiempo, se pudo

determinar que el tiempo óptimo de medición para llevar a cabo los registros de señales fue de 300

ns, y el tiempo de integración elegido fue de 400 ns.

Por otra parte, con los datos espectroscópicos obtenidos, se registró un perfil de línea de P II, con

rendija de entrada y salida de 100 µm como puede observarse a continuación (Figura 5.4), de esta

forma se garantiza la posición exacta de la línea. El perfil fue registrado en una muestra que contenía

80 mg/kg de dimetoato, lo que equivale a 10,81 mg/kg de fósforo.

459,69 459,90 460,11 460,32 460,53 460,74

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0,09

P II (460,21 nm)

Inte

nsid

ad (

u.a

.)

Longitud de onda (nm)

Figura 5.4. Perfil de línea de emisión de P II (460,21 nm), en una muestra que contiene 80 mg/kg de

dimetoato (10,81 mg/kg de P) registrado con rendija de entrada y salida de 100 µm.

Luego, las curvas de calibración se construyeron a partir de graficar la intensidad neta frente a las

concentraciones crecientes, utilizando las muestras de referencia que se observan en la tabla 3.1,

en un rango entre 0-80 mg/kg de dimetoato, que equivale a 0-11 mg/kg de P. A su vez, también se

realizó el proceso de validación para evaluar la robustez y precisión de las curvas obtenidas.

A partir de la evaluación de la intensidad de P II en las muestras de referencia se procedió al armado

de la curva de calibración anteriormente mencionada, la misma se muestra en la Figura 5.5.

95

0 2 4 6 8 10 12

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

P II (460,21 nm)

y= 0,0577x+0,13807

R2 = 0,99742

r Pearson = 0,99897

Inte

nsid

ad (

u.a

.)

Concentración P (mg/kg)

Figura 5.5 Curva de calibración de concentración de P II (460,21 nm), concentración agregada a partir de

dimetoato en muestras de hortalizas. Las barras de error vienen dadas por la incerteza del valor

instrumental.

Se puede observar en la figura que el R2 es de 0,99, y el r Pearson de 0,99, lo cual representa una

muy alta correlación.

Luego, con el fin de evaluar el rendimiento analítico del método cuantitativo LIBS, se procedieron a

realizar pruebas de validación internas cruzadas y al cálculo de las figuras de mérito. Los resultados

se observan en la Tabla 5.4.

Tabla 5.4. Figuras de mérito calculadas para evaluar el desempeño del modelo de regresión de la concentración de P II, a partir de diferentes modelos de validación.

LOOCV k-fold k-fold cruzada

RMSECV 0,5339235 0,4684424 0,4975833

MAE 0,5058852 0,456559 0,4929772

R2 0,9718706 1 1

96

Los valores de R2, RMSE y MAE indican una alta precisión de los resultados. Se observa, además, el

valor de R2 muy cercano a 1 en todos los casos, lo que garantiza un buen ajuste y buena sensibilidad

de medición. Por lo tanto el modelo de calibración presentado mostró una buena calidad de

regresión y una alta precisión predictiva para la cuantificación de P en muestras de acelga.

Por último, se obtuvieron los LoD y LoQ, los mismos fueron calculados para el caso del P y del

dimetoato, considerando la proporción de este elemento en el componente activo del plaguicida.

Los resultados pueden observarse en la tabla a continuación (Tabla 5.5).

Tabla 5.5. LoD y LoQ para el P y el dimetoato.

LoD (mg/kg) LoQ (mg/kg)

P 0,79 0,08 2,60 0,26

Dimetoato 5,58 0,59 19,40 1,95

CUANTIFICACIÓN DE CARBONO

Con el objetivo de obtener una curva de calibración de carbono en muestras de acelga contaminadas

con concentraciones crecientes de plaguicidas, se estudió la línea de emisión ya propuesta para la

caracterización de los mismos, 415,37 nm correspondiente al C I, con los parámetros temporales ya

estudiados y establecidos.

A modo de ejemplo, en la Figura 5.6, se graficaron algunas intensidades netas frente a

concentraciones crecientes, a partir de las muestras de referencia que se observan en la tabla 3.1,

en un rango entre 0-250 mg/kg de clorpirifos, equivalentes a 0-77 mg/kg de C. Además, se agregó

una muestra de 2500 mg/kg de clorpirifos, lo que corresponde a una concentración de 770 mg/kg

de C.

97

0 50 100 725 750 775 8000,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

C I (415,37 nm)

Inte

nsid

ad (

u.a

.)

Concentración C (mg/kg)

Figura 5.6. Intensidad neta de C en función de la concentración agregada de clorpirifos a muestras de

hortalizas. Las barras de error vienen dadas por la incerteza del valor instrumental.

Puede observarse que la intensidad de emisión no varía en función de las diferentes

concentraciones agregadas, incluso la nueva muestra de mayor concentración tampoco presentó

cambios en comparación con las concentraciones más bajas. Lo que lleva a pensar que no es posible

cuantificar el carbono en muestras de plaguicidas a bajas concentraciones.

CUANTIFICACIÓN DE CLORO

En el caso del cloro, el registro de la línea elegida para la caracterización de plaguicidas (725,66 nm)

presentaba señales muy débiles, registradas a nivel ruido, para concentraciones aptas a ser

utilizadas en la cuantificación de plaguicidas bajo condiciones reales. Es por esto que se llevó a cabo

un estudio exhaustivo de las líneas de emisión de Cl, que permitiera llevar a cabo el proceso de

cuantificación de este elemento. La nueva línea seleccionada corresponde al Cl I y se encuentra en

837,59 nm.

En la tabla a continuación (Tabla 5.6) se observa la línea elegida conjuntamente con sus datos

espectroscópicos (Kramida, Olsen, and Ralchenko 2019).

98

Tabla 5.6. Información espectroscópica de la línea de Cl I seleccionada para la cuantificación.

Elemento y

estado de

ionización

Longitud de

onda (nm)

Probabilidad

de transición

(s-1)

Ei (eV) Ek (eV) gk

Cl I 837,59 2,8 x107 8,9217000 10,4015349 8

5.5.1 Arreglo experimental LIBS

Para adquirir registros de señal de la nueva línea seleccionada, fue necesario rearmar un nuevo

equipo de medición. Para esto, se utilizó el arreglo experimental 3, conjuntamente con el

monocromador del arreglo experimental 1 (Model VM-504, Acton Research Corporation, USA).

Luego, la luz dispersada se detectó mediante el fotomultiplicador Hamamatsu modelo R928 y la

señal eléctrica se discriminó en el tiempo y promedió mediante el Boxcar (Standford Research

System, módulos SR 250, SR 280). Esto permitió una discriminación temporal, y la selección de

tiempos postbreakdown y de integración adecuados.

Con el propósito de aumentar la señal de la línea en estudio, se optó por cambiar la configuración

espacial plasma-visión del monocromador, buscando el incremento de señal a partir de un aumento

en el registro de la columna de plasma (representado como L en la ecuación 2.3 de plasma delgado).

En este sentido, se reubicaron la celda de vacío y el monocromador de tal forma que la línea de

visión del monocromador estuviera prácticamente en el mismo eje del plasma; contrariamente a la

observación perpendicular implementada en las otras configuraciones. Para lo cual, los pulsos láser

(Continuum Surelite II) primero fueron reflectados por un espejo y luego enfocados sobre la

superficie de la muestra en condiciones de baja presión, mediante una lente (L1) de 100 mm de

longitud focal. La luz emitida por el plasma se colectó mediante una segunda lente de cuarzo (L2)

de 100 mm de longitud focal, que formaba imagen del plasma sobre la rendija de entrada (ancho

de 300 μm) del monocromador. Un esquema de la nueva configuración puede apreciarse en la figura

a continuación (Figura 5.7).

99

Figura 5.7. Arreglo experimental LIBS. Adquisición y cuantificación de Cl a baja presión.

5.5.2 Obtención de parámetros espectroscópicos

A partir del nuevo arreglo experimental, se registraron los tiempos de medición para la línea 837,59

nm de Cl I, mediante el estudio de la línea de emisión integrada. Para esto se utilizaron rendijas de

entrada y salida de 300 µm, que equivale una integración espectral de 0.63 nm, según la dispersión

lineal de este monocromador. En la figura a continuación (Figura 5.8) se observa el registro neto,

obtenido luego de realizar la diferencia entre el promedio de tres mediciones de la línea de Cl I, y su

respectivo fondo.

100

100 150 200 250 300 3500,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

Cl I (837,59 nm)

Inte

nsid

ad (

u.a

.)

Tiempo postbreakdown (ns)

Figura 5.8. Evolución de la intensidad en función del tiempo postbreakdown para la línea de Cl I (837,59 nm),

elegida para la cuantificación de cloro, y por lo tanto de clorpirifos.

Del análisis de la evolución temporal de la línea de Cl I a lo largo del tiempo, se pudo determinar

que el tiempo postbreakdown óptimo de medición para llevar a cabo los registros de señales fue de

250 ns, y un tiempo de integración de 60 ns. A partir de estos datos espectroscópicos se obtuvo un

perfil de línea de Cl I, con rendija de entrada y salida de 200 µm, como puede observarse a

continuación en la Figura 5.9, con el fin de asegurarse la ubicación y registro de la línea. El perfil fue

registrado en una muestra que contenía 100 mg/kg de clorpirifos, lo que equivale a 30,33 mg/kg de

cloro.

101

837,0 837,2 837,4 837,6 837,8 838,0 838,2

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

2,2

2,4

2,6

2,8

3,0

Inte

nsid

ad (

u.a

.)

Longitud de onda (nm)

Cl I (837,59 nm)

Figura 5.9. Perfil de línea de emisión de Cl I (837,59 nm), en una muestra que contiene 100 mg/kg de clorpirifos

(30,33 mg/kg de Cl) registrado con rendija de entrada y salida de 200 µm a partir de la configuración

experimental de la Figura 5.6.

Cabe destacar, que la línea de emisión de Cl I está muy próxima a una línea de Fe I (837,21 nm) y es

imposible que quede fuera de la integración con los parámetros que se están tomando. En un

trabajo recientemente publicado sobre análisis de Cl en concreto aplicando LIBS (W. Zhang et al.

2019), se demostró que esta cercanía provocaba que las líneas se superpusieran. Como

consecuencia, la intensidad de la línea de Cl I presentaba interferencias por la presencia de Fe en el

cemento, que complicaba el proceso de calibración.

En nuestro caso, con el fin de evaluar si en los tiempos de medición elegidos el Fe provocaba

interferencias, se tomaron registros de señal de la línea 838,78 nm correspondiente también a Fe I.

La elección de registrar esta línea, radica en que presenta mucho mayor intensidad que la ubicada

en 837,21 nm (aproximadamente 90 veces mayor), contando con una probabilidad de transición de

6,09x105 1/s (Kramida, Olsen, and Ralchenko 2019). Por lo tanto, si el registro de señal de esta línea

es bajo en los tiempos de medición elegidos, se garantiza que la línea 837,21 nm no provocaría

interferencias en la determinación de Cl. Los registros de señales obtenidos de la medición de Cl I

(837.59 nm) y la línea de Fe I (838,78 nm) en una muestra de 50 mg/kg de clorpirifos (15,61 mg/kg

de Cl), pueden observarse en la Figura 5.10. Los tiempos de medición fueron los obtenidos en el

102

registro temporal, 250 ns de tiempo postbreakdown, con un tiempo de integración de 60 ns y

rendijas de 300 µm.

0 5 10 15 20 25 30

1,38

1,84

2,30

2,76

3,22

3,68

Cl I (837,59 nm)

Fondo (840 nm)

Fe I (838,78 nm)

Inte

nsid

ad (

u.a

.)

Registro

Figura 5.10. Registros de señales obtenidos de la medición de la línea de Cl I (837,59 nm) en una muestra de

acelga con 50 mg/kg de clorpirifos (15,61 mg/kg de Cl), con su fondo correspondiente y la línea de Fe I

(838,78 nm), con el fin de demostrar la no interferencia en la medición.

De este modo se concluye que la línea de Fe I 838,78 nm presenta una intensidad baja, si bien,

puede observarse un registro de señal debido a que la acelga contiene Fe, esto evidencia que la

línea más cercana al Cl I no provoca interferencias. En resumen, se asegura que el registro de línea

medida en los tiempos obtenidos, corresponde únicamente a la emisión de la línea de Cl I.

5.5.3 Curva de calibración

Una vez elegida y evaluada la línea de Cl I, se construyó la curva de calibración a partir de graficar la

intensidad neta frente a las concentraciones crecientes, utilizando las muestras de referencia

contaminadas con clorpirifos, que se observan en la tabla 3.1, en un rango entre 0-250 mg/kg,

equivalentes a 0-75,82 mg/kg de Cl (Figura 5.11). Por último, también se realizó el proceso de

validación para evaluar la robustez y precisión de la curva obtenida.

103

-10 0 10 20 30 40 50 60 70 80

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

2,2

2,4

Cl I (837,59 nm)

y= 0,04626x + 0,50557

R2 = 0,99298

r Pearson = 0,99736

SRichards1

R2 = 0,98853

Inte

nsid

ad (

u.a

.)

Concentración Cl (mg/kg)

Figura 5.11. Curva de calibración de concentración de Cl I (837,59 nm), concentración agregada a partir de

clorpirifos en muestras de hortalizas. Las barras de error vienen dadas por la incerteza del valor

instrumental.

Puede observarse en la Figura 5.11 calibraciones de ajuste lineal y no lineal, con R2 y r Pearson por

encima de 0.98, lo que indica una alta precisión del modelo de calibración. Sin embargo, cuando la

concentración de Cl supera los 30 mg/kg, la curva de crecimiento lineal presenta una inclinación

hacia abajo, lo que llevó a ajustarla con una curva Sigmoidal de Richards, indicando la presencia de

autoabsorción, por lo tanto, condiciones de plasma no homogéneo. Debido a este análisis, se

concluye que la concentración máxima de Cl que permite trabajar con el modelo de plasma delgado

anteriormente mencionado (ec. 2.3) es de 30 mg/kg.

Por otro lado, se evaluó la performance analítica y precisión del método a partir de las validaciones

ya mencionadas. Para esto, se utilizaron aquellos puntos que pudieron ser ajustados con la función

lineal correspondiente, los resultados arrojados se observan en la Tabla 5.7.

104

Tabla 5.7. Figuras de mérito calculadas para evaluar el desempeño del modelo de regresión de la concentración de Cl I, a partir de diferentes modelos de validación.

LOOCV k-fold k-fold cruzada

RMSECV 1,104025 0,8220312 0,8412274

MAE 0,8631841 0,8081051 0,8091646

R2 0,9904494 1 1

Los resultados demostraron que el uso de análisis LIBS para detección y cuantificación de Cl

presentaron una alta sensibilidad. Los valores de R2, RMSE y MAE indican una alta precisión de los

resultados.

Los LoD y LoQ también fueron calculados, utilizando la desviación estándar obtenida de la muestra

control. Los resultados pueden observarse a continuación en la Tabla 5.8.

Tabla 5.8. LoD y LoQ para el Cl I y el clorpirifos.

LoD (mg/kg) LoQ (mg/kg)

Cl 6,97 0,49 28,3 1,32

Clorpirifos 22,98 1,61 75,84 5,31

DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES DE LA CUANTIFICACIÓN DE PLAGUICIDAS

A modo de síntesis, se presentan a continuación los LoD y los LoQ de los cuatro elementos

medidos (Tabla 5.9) con el fin de analizar y evaluar los límites encontrados.

Tabla 5.9. LoD y LoQ para el C, S, P y Cl obtenidos a partir de la calibración con la técnica LIBS.

Elemento LoD (mg/kg) LoQ (mg/kg)

C - -

S 1,72 0,17 5,67 0,56

P 0,79 0,08 2,06 0,26

Cl 6,97 0,49 28,3 1,32

105

Comenzando con el carbono, este elemento no permitió realizar una curva de calibración a bajas

concentraciones, y por ende no presentó LoD y LoQ, es por esto que se concluye que la

cuantificación de este elemento para la determinación de plaguicidas mediante la técnica LIBS no

es factible. Si bien, era una de las variables medidas en el análisis multivariado del Capítulo IV para

la caracterización de plaguicidas, a bajas concentraciones no puede ser utilizado. Por lo tanto, el

carbendazim (C9H9N3O2) el cual presenta una fórmula molecular más simple, con elementos que se

encuentran presentes en hortalizas y vegetales en general, no puede ser detectado y cuantificado a

bajas concentraciones con el método propuesto. Esto ocurre debido a que la concentración de

carbono en los vegetales es demasiado alta, lo que provoca que al agregarle bajas concentraciones

del mismo, como es en este caso, no es suficiente para observar un cambio de intensidad mediante

la aplicación de la técnica LIBS y así poder realizar una curva de calibración con un crecimiento lineal.

A su vez, considerando que el contenido de carbono en hortalizas de hojas verdes es

aproximadamente un 35 % p/p (peso seco), los resultados obtenidos están dentro de la lógica (Mota

et al. 2011).

Por otro lado, para el caso del azufre, los LoD y LoQ arrojados por el análisis univariado lineal,

presentaron valores bajos, aplicando conversión de unidades a fines comparativos, el límite de

detección de S en acelga está en el orden de 0,00017 % p/p (peso seco). En uno de los último trabajos

publicados aplicando la técnica LIBS, combinada con dispersión Raman de resonancia (LIBS-RRS) (W.

Zhang et al. 2020), los autores detectaron azufre en muestras de polvos, con un LoD de 13,09 % p/p

estudiando la línea 921, 28 nm y un LoD de 0,118 % p/p, mediante la aplicación de LIBS-RRS, valores

muy por encima que el obtenido en este trabajo. No se encontraron en la bibliografía cuantificación

de S en muestras vegetales, por lo que sería uno de los primeros indicios de detección y

cuantificación de este elemento a bajas concentraciones.

En cuanto al fósforo, fue el elemento que presentó los LoD y LoQ más bajos en este estudio,

obteniéndose un valor de 0,79 mg/kg. En comparación con trabajos encontrados en la literatura,

Marangoni et al. (Marangoni et al. 2016) desarrollaron un método cuantitativo para determinar

fósforo en fertilizantes, encontrando un LoD de 0,5%, el cual está muy por encima del LoD

encontrado en este trabajo. Por otro lado, hay estudios donde se midió la línea de P proveniente

del clorpirifos aplicado sobre diferentes alimentos. El primer estudio llevado a cabo por Ma and

Dong 2014 describieron la detección de residuos de clorpirifos en la superficie de manzanas

mediante la técnica LIBS. Lograron distinguir concentraciones altas a partir del estudio de una línea

106

de P a presión atmosférica, sin embargo no pudieron distinguir muestras con concentraciones más

bajas (1: 100 y 1: 1000). Este estudio continuó (Du et al. 2015) y en esta ocasión, exploraron la

influencia del argón en el registro de intensidad de las señales LIBS provenientes de clorpirifos.

Purgando con argón, observaron el pico característico de P en el espectro LIBS de una solución de

clorpirifos de dilución 1: 1000, y obtuvieron curvas de calibración con LoD entre 4,3 y 6.9 mg/kg. En

su último trabajo (Zhao et al. 2019), lograron bajar los límites de detección utilizando LIBS mejorado

con nanopartículas de plata (NELIBS) sobre la superficie de manzanas, alcanzando límites de

detección entre 0,009 y 0,029 mg/kg, obteniendo así los límites más bajos encontrados en la

literatura. Esta técnica prometedora y aún en estudio, aplicada al límite encontrado en nuestro

estudio, podría bajar aún más el LoD. Sin embargo, existen algunos problemas y controversias en

esta tecnología al añadir nanopartículas metálicas no comestibles a las muestras analizadas que

pueden ser tóxicas, lo que provocaría contaminación. Por lo tanto, requiere mayor muestreo y

procesamiento, y además, no puede ser utilizada in situ.

A su vez, es conocido que el P es un nutriente esencial de los vegetales, por lo tanto en la medición

de este elemento pueden existir interferencias entre la concentración proveniente de la hortaliza,

y el P del plaguicida. En estos casos, sería pertinente contar con un blanco o control (hortaliza no

contaminada), con el fin de establecer la concentración basal del nutriente.

Si bien, para el caso de plaguicidas los LoD y LoQ del S y P están por encima de los límites máximos

permisibles (LMRP), existen evidencias que en nuestro país estos límites se superan ampliamente,

encontrándose residuos de plaguicidas en alimentos, en concentraciones mayores a las establecidas

(Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria 2012). Para el caso de la acelga, se han

encontrados residuos de plaguicidas no autorizados, como es el caso del dimetoato, en

concentraciones que superan los 6 mg/kg. Por lo tanto, los LoD y LoQ obtenidos para el S y el P

demuestran que LIBS tiene una buena capacidad de predicción y es una herramienta confiable y

sensible para el análisis de residuos de plaguicidas a partir de estos elementos.

Los LoD y LoQ de Cl indican que este elemento puede ser medido en muestras de acelga

contaminadas con diferentes concentraciones crecientes de clorpirifos. Por otro lado, es importante

destacar que el Cl es un micronutriente típico, es decir, es necesario para un crecimiento vegetal

óptimo (Minerals and Agriculture GmbH 2019). Debido a que generalmente se suministra a las

plantas como cloruro de diversas fuentes (reservas de suelo, agua de riego, lluvia, fertilizantes,

contaminación del aire), escasa vez se encuentra deficiencia de cloro en el suelo. Por el contrario,

107

existe mucha más preocupación por la toxicidad del cloro, sin embargo, las especies de plantas

varían mucho en su susceptibilidad a las altas concentraciones de cloruro en la solución del suelo. A

partir de esto, se pueden distinguir cuatro grupos principales: i) cultivos amantes del cloruro, ii)

cultivos tolerantes al cloruro, iii) cultivos parcialmente tolerantes al cloruro, iv) cultivos sensibles al

cloruro. Dentro del primer grupo, se encuentra la acelga, hortaliza utilizada en la cuantificación de

este elemento, es por esto que, puede apreciarse una concentración inicial de Cl en estas muestras.

A partir de los datos obtenidos de la curva de calibración de la Figura 5.11, se calculó una

concentración inicial de Cl de 11 1 mg/kg, que debe ser tenida en cuenta si se desea encontrar la

concentración de Cl proveniente de un plaguicida (L. Martino 2015). En este caso, aunque es poco

conveniente para los fines prácticos, es recomendable contar con un blanco que proporcione la

concentración basal de este micronutriente en la acelga, para evitar interferencias. Sin embargo,

dentro del grupo de cultivos sensibles al cloruro, se encuentran la lechuga y la mayoría de las

hortalizas tempranas. Lo que implica que, en este caso, es factible detectar la concentración de cloro

en hortalizas provenientes de plaguicidas.

En cuanto a los trabajos encontrados en la literatura, Zhao et al. 2019, aplicaron clorpirifos en

manzanas y cebollas de verdeo, pudieron detectar un registro de línea de Cl sólo en muestras de

cebollas y mediante la aplicación de NELIBS, a su vez, no realizaron curva de calibración, por ende

no obtuvieron LoD y LoQ. Por otra parte, varios autores han intentado cuantificar el Cl para la

determinación de este elemento con fines industriales. En el trabajo más recientemente publicado

Wakil and Alwahabi 2019 cuantificaron cloro, a través de la emisión molecular de CaCl, utilizando

LIBS asistido por microondas (MW-LIBS), alcanzando un LoD de 47 mg/kg.

En definitiva, el LoD y LoQ del Cl, están por encima de los límites máximos permisibles para

plaguicidas (LMRP) (Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria 2020). Sin embargo,

para el caso de plaguicidas clorados, también se han encontrado residuos que superan estos límites.

En el caso específico de la acelga, se han encontrados residuos de imidacloprid en el orden de los 3

mg/kg, y a su vez, se han detectados residuos no autorizados, como clorpirifos a concentraciones

de 1,6 mg/kg y cipermetrina, con una concentración de 6,09 mg/kg (Servicio Nacional de Sanidad y

Calidad Agroalimentaria 2012). Si bien, el LoD encontrado supera estos valores, se ha alcanzado un

LoD relativamente aceptable en comparación con los últimos trabajos publicados, aunque factible

a mejoras, considerando que es el primer estudio donde se pudo detectar y cuantificar el Cl en

muestras vegetales.

108

Para concluir, mediante la aplicación de la técnica LIBS fue posible determinar residuos de

plaguicidas a partir de la medición de Cl, P y S, sin la necesidad de utilización de productos químicos

nocivos e inversión de un gran tiempo de preparación de muestras. Los modelos de calibración

planteados pueden ser utilizados de manera complementaria a los métodos analíticos

tradicionalmente utilizados en la detección de plaguicida. De esta forma, se propone su uso cómo

una técnica preliminar de detección y en aquellos alimentos en donde se encuentren residuos muy

por encima de los límites, luego pueden ser medidos mediante análisis convencional. Otra aplicación

podría darse en la realización de ensayos de laboratorios para pruebas de plaguicidas, y establecer

la eficacia o períodos de protección sobre cultivos con diferentes tratamientos y un tratamiento

control (testigo), al cual no debe aplicarse sustancia activa ni agua. También puede ser útil para

evaluar derrames de plaguicidas sobre huertos, y mediante su cuantificación, proceder a establecer

índices de ingesta máxima admisibles de los alimentos.

Si bien pueden desarrollarse modelos de predicción con mayor cantidad de muestras para evaluar

con mayor precisión la robustez del método y aplicar métodos de calibración multivariados, esta

investigación permite fomentar la realización de nuevos estudios e incorporar una nueva técnica a

la determinación de residuos en productos alimenticios en el futuro.

109

6 CAPÍTULO VI: DIAGNÓSTICA DEL PLASMA

Para optimizar la capacidad analítica de la técnica LIBS es fundamental realizar una diagnóstica del

plasma. El objetivo de esto es contar con todos los parámetros que caracterizan al mismo y de esta

manera, asegurar una reproducibilidad de las aplicaciones analíticas en determinadas condiciones

experimentales, como las utilizadas en esta Tesis.

Partiendo de la ecuación de plasma delgado (ec. 2.3), se puede observar que la intensidad no solo

depende de la concentración de emisores (elemento atómico con su grado de ionización), sino

también de la temperatura y de la densidad electrónica. La temperatura establece las poblaciones

de los niveles de energía a partir de la distribución de Boltzmann; y junto a la densidad electrónica,

permiten estudiar las concentraciones de un elemento en sus diferentes estados de ionización en

un mismo plasma. Por otro lado, todo esto se debe establecer bajo condiciones de Equilibrio

Termodinámico, y en LIBS es suficiente la aproximación al Equilibrio Termodinámico Local (LTE, por

sus siglas en inglés). En la literatura pueden encontrarse varios trabajos sobre este tema (Bulajic et

al. 2002; Cristoforetti et al. 2010; Gornushkin et al. 2001).

Existen métodos conocidos para el cálculo de la temperatura, por ejemplo, el plot de Boltzmann y

el diagrama de Saha-Boltzmann. Pero ambos métodos comparten ciertas limitaciones: la

observación de un cierto número de líneas con datos espectroscópicos bien estudiados, la hipótesis

del plasma en el LTE, la homogeneidad y la baja autoabsorción (bajo espesor óptico) para aplicar el

modelo de plasma delgado (Corney 1977a; Lochte - Holtgreven 1968)

Si bien, la parametrización de plasmas parecería algo muy estudiado, no lo es tanto cuando se

quieren estudiar plasmas en condiciones de inhomogeneidad, alta absorción (plasma grueso), falta

de datos, tiempos postbreakdwon no típicos, etc. Como ejemplo de esto, hay trabajos recientes de

propuestas de cuantificación de plasma grueso (C. A. D’Angelo et al. 2015) y de estudio de

diagnóstica en plasmas inhomogéneos (Cristian A. D’Angelo et al. 2008). Por otro lado, y mucho más

cercanos a los objetivos de esta Tesis, hay trabajos recientemente publicados sobre la

determinación de elementos atómicos difíciles de observar en forma tradicional (como el caso de

los halógenos), a partir del registro de la emisión molecular de moléculas diatómicas que lo

contienen, registrados en tiempos convenientes de recombinación (Alvarez-Llamas, Pisonero, and

Bordel 2016; Gaft et al. 2014). Estos tiempos no son típicos en análisis LIBS, y paralelamente a esta

Tesis, haciendo un entrenamiento de diagnóstica, se avanzó en una propuesta de caracterización

110

de plasmas en “tiempos tardíos”, para ser utilizada por ejemplo, en aplicaciones analíticas por

estudio de emisión molecular, en donde los tiempos postbreakdown son del orden de varias

decenas de microsegundos y los datos de líneas de emisión atómicas son muy pocos y no se pueden

establecer estudios tradicionales (L. J. Martino and D’Angelo 2020).

A continuación, se detallan las metodologías y estimaciones de los parámetros de temperatura y

densidad electrónica, junto con la confirmación de LTE para los plasmas producidos en esta Tesis en

muestras de hortalizas de hojas verdes.

METODOLOGÍA

6.1.1 Temperatura

El plot de Boltzmann es un método tradicional de cálculo de temperatura que comienza con la

aplicación de la ecuación de distribución de Boltzmann (G. Traving 1968). Para esto, se debe suponer

que el plasma debe ser ópticamente delgado y que está en equilibrio termodinámico local (LTE)

(Corney 1977; W. Lochte - Holtgreven 1968). Desde este enfoque, la expresión de la intensidad (ec.

2.3) se considera en función de la longitud de onda y, parámetros espectroscópicos y

experimentales, agrupando convenientemente es posible obtener la ecuación:

𝑙𝑛 (𝑗𝑖

3 𝐼𝑗𝑖

𝐴𝑗𝑖 𝑔𝑗) = −

1

𝑘𝑇𝐸𝑗 + 𝑙𝑛 (

ℎ𝑐2𝐿

2 Q𝑘(T) 𝑁𝑘)

(ec. 6.1)

Luego, para cada línea registrada, 𝑙𝑛 (𝑗𝑖

3 𝐼𝑗𝑖

𝐴𝑗𝑖 𝑔𝑗) se grafica en función de las energías de los niveles

superiores 𝐸𝑗 de la transición involucrada para cada línea. A partir de esto, es posible estimar la

temperatura del plasma utilizando una regresión lineal de los puntos registrados, donde el ajuste

tiene el valor − 1

𝑘𝑇 como pendiente.

6.1.2 Densidad electrónica

La forma de línea registrada a la salida de un monocromador o espectrómetro está dada por un

perfil de distribución algo complejo, conformado por múltiples funciones de distribución. En

particular, un perfil registrado en espectroscopia de plasmas LIBS responde a una función Voigt, que

es la convolución entre una función gaussiana y una lorentziana.

111

La contribución gaussiana se debe principalmente a la función instrumental, despreciando otros

tipos de fenómenos presentes en el plasma, como el efecto Doppler. Este último, es causado por el

movimiento de los átomos (o iones) emisores respecto del observador, cuyo ancho estimado en la

función de Gauss para las líneas de este trabajo es insignificante en comparación al ancho

instrumental (G. Traving 1968; L. J. Martino and D’Angelo 2020). Para el caso de la función

instrumental, un monocromador tiene una función de transferencia establecida a partir de los

anchos de sus rendijas de entrada y de salida, y para una determinada longitud de onda. Para

rendijas de aperturas iguales, se tiene una distribución gaussiana con un ancho posible de calcular,

con lo dicho anteriormente, a partir de lo establecido por el fabricante.

Por otro lado, la contribución lorentziana principalmente está dada por el mecanismo del efecto

Stark. Este es debido al proceso de colisiones de electrones con átomos e iones, y es de primordial

importancia en espectroscopia de plasmas astrofísicos y de laboratorio, y está directamente

relacionado con la densidad electrónica (Griem 1997). También, existe el ensanchamiento natural

de línea dado por el principio de incertidumbre de Heisenberg, cuyo ancho son varios órdenes de

magnitud menor respecto al Stark, y es imposible de resolver en los monocromadores y

espectrómetros convencionales.

En resumen, la estimación de la densidad electrónica se realiza a partir del FWHM (Full Width Half

Maximum) de la función Lorentziana (𝑤𝐿) dado por el efecto Stark, y que contribuye al perfil de

Voigt de las líneas registradas.

Con todo esto y para los fines prácticos de este trabajo, se tiene que para una línea y temperatura

determinada, se estima una relación directa entre el ancho lorentziano y la densidad electrónica. En

consecuencia, la expresión utilizada para estimar el valor de la densidad electrónica 𝑛𝑒(𝑘𝑇), está

dado por:

𝑛𝑒(𝑘𝑇) = 𝑛𝑒′

𝑤𝐿′ (𝑘𝑇)

𝑤𝐿(𝑘𝑇)

(ec. 6.2)

Donde los valores de 𝑤𝐿 ′(𝑘𝑇) son estimados por una función de ajuste a partir de datos tabulados

de anchos lorentzianos con temperaturas determinadas y correspondiente a un 𝑛𝑒 ′, dado para cada

línea en particular (Griem 1997; Sahal-Bréchot, S., Dimitrijević, M. S. Moreau 2020).

112

6.1.3 Equilibrio Termodinámico Local

Para que el plasma se encuentre en estado de equilibrio termodinámico, las colisiones tienen que

dominar sobre los procesos radiativos, esta condición se satisface si la densidad electrónica es

suficientemente grande. Un criterio propuesto por McWhirter (Leonard and Huddlestone 1965) se

basa en la existencia de una densidad electrónica crítica para la cual la tasa de colisiones es al menos

diez veces la tasa de procesos radiativos. El criterio para que exista LTE es:

𝑛𝑒 ≥ 𝑇𝑒 1/2

(𝐸𝑗 − 𝐸𝑖)3

. 1012 𝑒𝑉−3𝐾−1/2𝑐𝑚−3 (ec. 6.3)

Donde, 𝑇𝑒 es la temperatura electrónica (expresada en K), considerando condiciones de LTE, esta

es igual a la temperatura iónica. 𝐸𝑗 − 𝐸𝑖 es la diferencia de energía entre el nivel superior j y el nivel

inferior i (expresada en eV). Los valores típicos de esta densidad electrónica umbral, a partir de la

cual el plasma se halla en equilibrio termodinámico, oscilan en el rango 1x1015 - 1x1016 cm-3.

ESTIMACIÓN DE PARÁMETROS EXPERIMENTALES

6.2.1 Estimación de temperatura

Para la aplicación del plot de Boltzmann, se analizaron los registros de línea de Fe I, entre 300 y 500

nm, con un tiempo postbreakdown y de integración determinados, siguiendo los parámetros

utilizados en la cuantificación detallada en el Capítulo V. Como un ejemplo de lo dicho

anteriormente puede observarse el esquema a continuación (Figura 6.1).

113

Figura 6.1. Evolución esquemática de los tiempos postbreakdown y de integración para el Cl, P y S, usados

para cálculos de temperatura y densidad electrónica.

De esta forma, utilizando un tiempo postbreakdown de 300 ns y un tiempo de integración 400 ns se

asegura representar las condiciones del plasma en los tres elementos que fueron cuantificados en

el Capítulo V.

Las rendijas de entrada y salida del monocromador se fijaron en 300/300 µm y se registraron un

total de 15 datos por línea de Fe medida, utilizando los lineamientos de la sección 3.4.1. Los datos

espectroscópicos de las líneas seleccionadas, junto con las intensidades de las áreas registradas

experimentalmente se muestran en la Tabla 6.1.

114

Tabla 6.1. Datos espectroscópicos de líneas de emisión de Fe I seleccionadas para aplicación de plot de

Boltzmann.

𝑗𝑖 (nm) 𝐴𝑗𝑖 (𝑠−1) 𝐴𝑗𝑖

precisión*

𝑔𝑗 𝐸𝑗 (eV) 𝐼𝑘 (u.a.)

370,56 3,21E6 A 7 3,39651 0,191 ± 0.030

374,33 2,6E7 A 3 4,30128 0,094± 0.030

379,85 3,23E6 A 11 4,1777 0,059 ± 0.030

393,02 1,99E6 B+ 7 3,24097 0,583 ± 0.030

432,57 5,16E7 B+ 7 4,4732 0,373 ± 0.030

487,13 2,44E7 B+ 5 5,4098 0,159 ± 0.030

489,14 3,08E7 B+ 7 5,3852 0,053 ± 0.030

*Las precisiones estimadas para las probabilidades de transición son: AA: ≤ 1%, A+: ≤ 2%, A: ≤ 3%, B+: ≤ 7%, B: ≤ 10%, C+: ≤ 18%, C: ≤

25%, D+: ≤ 40%, D: ≤ 50%, E: > 50% (Kramida, Olsen, and Ralchenko 2019).

Cada valor de intensidad viene dado por la intensidad neta obtenida mediante la diferencia del

registro de líneas con un fondo medido.

El plot de Boltzmann basado en los datos experimentales se puede ver en la Figura 6.2. Las barras

de error fueron calculadas a partir de la estimación de la incertidumbre (Ver Anexo 4). Con este

análisis, se estimó una temperatura de kT= (0,83 0,10) eV.

115

3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,53,0

3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

y = -1,2125x + 9,8149

R2 = 0,92603

R Pearson = -0,96996

ln (

ji

ji/(A

ji g

j)) k

(u.

a.)

Ej (eV)

Figura 6.2. Plot de Boltzmann basado en los datos experimentales de la Tabla 6.1, con perfiles registrados en

300 ns. La temperatura estimada fue de kT = (0,83 ± 0,10) eV. Las barras de error fueron calculadas

mediante el cálculo de propagación de incertidumbre de Iji y de Aji para cada caso en particular.

6.2.2 Estimación de densidad electrónica

Para la estimación de la densidad electrónica, se optó por analizar la línea 280,27 nm de Mg II. La

elección de esta línea se justificó a partir de un trabajo ya publicado, donde se estudió la relación

de intensidades integradas del doblete 279.55/280.27 nm (transición 2p6 3p2 P0 - 2p6 3s 2S) y esta

línea representa la mejor aproximación del modelo de plasma delgado (C. A. D’Angelo et al. 2015).

En la Figura 6.3 se puede observar el perfil registrado conjuntamente con el correspondiente ajuste

Voigt, y los datos resultantes de anchos lorentziano y gaussiano.

116

280,22 280,24 280,26 280,28 280,30 280,32

0,096

0,192

0,288

0,384

0,480

0,576

Inte

nsid

ad

(u

. a

.)

Longitud de onda (nm)

Mg II (280.27nm)

Ajuste Voigt

WG=0,01288 nm

WL=0,0110 ( 0,0018) nm±

Figura 6.3. Perfil de la línea de emisión de Mg II (280,27 nm) con su perfil Voigt, para un tiempo

postbreakdown de 300 ns y de integración de 400 ns.

El ancho gaussiano 𝑤𝐺 del ajuste de Voigt se fijó en 𝑤𝐺 = 0,012878 𝑛𝑚 . Este valor se estableció a

partir de la función instrumental correspondiente al monocromador utilizado, calculado en función

de los anchos de rendijas y para la longitud de onda de 280,2 nm (ver Anexo 5). Luego, a partir de

la aplicación del ajuste Voigt sobre el registro de perfil de línea, se logró establecer un ancho

lorentziano de 𝑤𝐿 = 0,0110 ± 0.0018 𝑛𝑚.

Por otro lado, se obtuvo la función 𝑤𝐿 ′(𝑘𝑇) y se calculó su valor para kT=0.83 eV, siguiendo la

propuesta de la expresión (ec. 6.2). Esta se determinó a partir del ajuste de datos tabulados para la

línea en cuestión y con 𝑛𝑒 ′ = 1017 𝑐𝑚−3 (Stark-B 2007), esto puede verse en la Figura 6.4.

117

Figura 6.4. Ajuste exponencial para anchos Stark tabulados en función de KT para la línea de Mg II (280, 27

nm), con una 𝑛𝑒′ = 1017 𝑐𝑚−3, según datos de tabla publicados (referencia en texto).

El mejor ajuste para estos datos es una función exponencial expresada como:

𝑤𝐿′ (𝑘𝑇) = 𝐴1 ∗ 𝑒𝑥𝑝(−𝑘𝑇/𝑡1) + 𝑦0 (ec. 6.4)

Donde los valores de 𝐴1, 𝑡1y 𝑦0 equivalen a 0,02562, 0,7553 y 0,01208 respectivamente, para

temperaturas en el rango de 0,4 a 4,3 eV. A partir de la cual, y con la temperatura ya calculada se

pudo establecer que 𝑤𝐿′ (0.83 ± 0.10)𝑒𝑉 = 0.02028 ± 0.001 𝑛𝑚 (Estimación de incerteza

detallado en Anexo 4).

Finalmente, se estimó la densidad electrónica 𝑛𝑒 mediante la expresión (ec. 6.2), dando un valor de

estimado de (Estimación de incerteza en Anexo 4):

𝑛𝑒(0.83 𝑒𝑉) = (5,42 ± 0,93) × 1016 𝑐𝑚−3.

6.2.3 Verificación de Equilibrio Termodinámico Local

En la estimación de kT y 𝑛𝑒 es importante verificar que se cumple la condición LTE. Para lo cual, se

aplicó el criterio de McWhirter dado por la condición descrita en la ec. 6.3.

118

Con base en esta condición, se eligió la línea de menor longitud de onda (diferencia de niveles

mayor) de todas las estudiadas en esta tesis. De este modo es posible ampliar la validez de esta

desigualdad y confirmar la condición de LTE para todo el trabajo. La línea seleccionada fue la

correspondiente al Mg II, luego, en la Tabla 6.2 se muestran los resultados obtenidos.

Tabla 6.2. Obtención del criterio de McWhriter para verificación de LTE, a partir de la línea de Mg II.

Parámetros estimados Criterio McWhriter

𝒌𝑻 (eV) 𝒏𝒆 (cm-3) Límite LTE (cm-3) Condición LTE

0,83 0,10 (5,42 0,93) x1016 (8,487 0,005 )x1015 CUMPLIDA

A partir de este análisis es posible ver que la densidad electrónica excede el límite de LTE en casi un

orden de magnitud y los plasmas producidos satisfacen la condición de LTE en todos los casos.

Por último, se puede concluir que los valores encontrados en la parametrización del plasma

corresponden a valores típicos de plasmas LIBS en el vacío (Effenberger and Scott 2010). En estos

casos, los valores de temperatura y densidad electrónica son algo más bajos que en condiciones

atmosféricas.

119

7 CAPÍTULO VII: CONCLUSIONES GENERALES Y PERSPECTIVAS

El principal objetivo de la incorporación de plaguicidas a los sistemas productivos es el control de

malezas y plagas. Sin embargo, en la sociedad actual es un tema preocupante el uso de los mismos

debido a aplicaciones directas en los cultivos agrícolas, lavado inadecuado de tanques

contenedores, filtraciones en los depósitos de almacenamiento y derrames accidentales.

Considerando a su vez, que existe evidencia de la presencia de residuos de plaguicidas en los

alimentos, que representan una amenaza importante para los consumidores debido a su toxicidad.

Conocidos los efectos que produce el uso y abuso de plaguicidas y con los indicios que se superan

los límites máximos permisibles en varios casos, es necesario contar con métodos de detección y

cuantificación rápidos que permitan analizar y evaluar la presencia de los mismos, siendo el primer

paso para determinar si se superan los LMR con la consecuente identificación de los riesgos y toma

de decisiones.

A partir de los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral se pretendió desarrollar una potencial

herramienta para la detección, clasificación y cuantificación de algunos plaguicidas sobre muestras

de hortalizas de hojas verdes, a través de analizar la factibilidad de la técnica Laser Induced

Breakdown Spectroscopy conjuntamente con técnicas quimiométricas y modelos de calibración. El

principal objetivo fue aportar una técnica analítica complementaria a las ya existentes y

tradicionales, que permita una identificación rápida y simple, de bajo costo, sin producción de

desechos y que pueda ser aplicada en hortalizas y a su vez, extender su uso para la aplicación en

suelos y alimentos en general.

De acuerdo con los objetivos iniciales planteados, los resultados obtenidos y las conclusiones

individuales presentadas en cada capítulo de esta tesis, se pudieron obtener las siguientes

conclusiones generales:

El procedimiento utilizado para el preparado de muestras, tanto representativas como de

calibración, posibilitó aplicar la técnica LIBS y obtener conjuntos de datos en forma rápida y

sencilla. A su vez, el uso de tamices para homogeneizar el tamaño de grano permitió conseguir

una muestra más compacta y evitar así la destrucción por los sucesivos disparos del láser.

120

El nuevo método de adquisición de registros LIBS cumplió con el objetivo planteado,

permitiendo la obtención de una mayor cantidad de datos, en forma rápida, con una mínima

destrucción de muestra, y logrando una alta repetitividad en las mediciones.

La optimización de los esquemas experimentales LIBS utilizados permitió la detección y

cuantificación de elementos de difícil determinación, que históricamente se daba tanto en esta

técnica como en aquellas de usos tradicionales y homologadas. La implementación de una celda

de vacío permitió obtener las condiciones necesarias para el registro de las señales, siendo ésta

una herramienta muy importante en la configuración experimental. Por otro lado, pudieron

encontrarse las condiciones experimentales adecuadas mediante el estudio de parámetros

espectroscópicos, para la obtención de registros de datos representativos.

La identificación de moléculas de los agentes activos de plaguicidas en forma indirecta a partir

de la detección de átomos mediante la combinación de registros LIBS y técnicas quimiométricas,

cumplió con el objetivo planteado. Los resultados obtenidos a partir del análisis de

componentes principales y el análisis discriminante lineal permitieron la clasificación y

caracterización de plaguicidas en muestras de hortalizas de hojas verdes. También fue posible

demostrar la diferencia entre la muestra de control y el resto de muestras contaminadas con

diferentes plaguicidas. Aunque las concentraciones utilizadas en este caso fueron más elevadas

que las recomendadas por los lineamientos de la Legislación sobre LMRP, se presentó un

resultado interesante que también puede ser utilizado en diversas aplicaciones.

Los resultados obtenidos de los protocolos de calibración de las variables en estudio

presentaron resultados óptimos, logrando una buena sensibilidad y precisión de la técnica

analítica para la cuantificación de residuos de plaguicidas en muestras de hortalizas. Las

configuraciones utilizadas fueron relativamente sencillas y además se tiene un costo

relativamente bajo como la principal ventaja. Con todo esto, se logró encontrar los límites de

detección y cuantificación para tres de las cuatros variables planteadas.

Fueron estimadas la temperatura del plasma y la densidad electrónica y los valores obtenidos

coinciden con los típicos encontrados en plasmas LIBS. De esta forma se garantiza la

121

homogeneidad y reproducibilidad de la aplicación de la técnica en plasmas de características

similares.

Mediante este trabajo se ha demostrado que la técnica LIBS puede utilizarse como una herramienta

complementaria en aplicaciones agrícolas y de evaluación en estudios multidisciplinarios, pudiendo

a su vez, aplicarse a otras matrices además de la presentada en este trabajo. A partir de nuevas

configuraciones experimentales simples, con tiempos de ejecución cortos, sin producción de

desechos tóxicos y bajos costos de aplicación, esta técnica se ha ido abriendo camino entre las

técnicas convencionales. Esto se logró mediante la reducción de las limitaciones inherentes,

aumentando la sensibilidad, disminuyendo los límites de detección y cuantificación, logrando

obtener repetitividad en las mediciones y pudiendo ser aplicadas en varias matrices, incluso en

diferentes estados de agregación.

La conjunción de la técnica LIBS con el análisis quimiométrico permite obtener una herramienta

prometedora tanto para análisis cualitativos como cuantitativos. La quimiometría, por su parte,

presenta estabilidad y confiabilidad en el procesamiento de una amplia cantidad de datos, como los

obtenidos mediante la técnica LIBS. De esta forma se pueden adquirir resultados más precisos,

eliminando el ruido existente en los registros y logrando una representación conjunta de datos. A

su vez, nuevas técnicas de análisis quimiométricos pueden ser aplicadas a los datos obtenidos por

la técnica LIBS, y obtener otro tipo de resultados en reconocimiento de patrones, clasificación y

cuantificación. Por otro lado, la combinación de ambos métodos está en pleno desarrollo y son

pocos los autores que utilizan métodos multivariados avanzados para mejorar el rendimiento de la

técnica LIBS, tanto en reconocimiento de patrones, como en clasificación de muestras. Por lo tanto,

los resultados obtenidos en esta tesis han demostrado la fiabilidad de su aplicación.

Esta Tesis Doctoral me ha dado los conocimientos y experticias necesarias para realizar estudios

espectroscópicos mediante la aplicación de la técnica LIBS, tanto en condiciones de presión

atmosférica, como también a baja presión. A su vez, me permitió obtener conocimientos en el

análisis de los datos mediante métodos quimiométricos. Esto me facilitó aplicar y obtener nuevos

conocimientos en el estudio y análisis de plaguicidas, pudiendo extrapolar estos resultados a otras

áreas de interés en la agricultura. A su vez, los resultados obtenidos pueden aplicarse para la

detección y cuantificación en otras ramas de análisis ambientales, que revistan importancia por su

122

contaminación o estudio en particular. Por otro lado, los modelos de calibración encontrados

pueden ser aplicados al estudio de micro y macro nutrientes, tanto en vegetales, como en alimentos

o suelos, pudiendo aportar resultados interesantes en la producción agrícola y de calidad

alimentaria.

Por último, como trabajos a futuro, sería interesante realizar el análisis quimiométrico sumando

como nueva variable al nitrógeno, luego de un estudio exhaustivo para establecer las condiciones

experimentales que permitan su registro, siendo una posibilidad la utilización de un gas buffer

dentro de la celda de vacío. Por otro lado, también sería pertinente realizar un estudio más

exhaustivo para lograr bajar los límites de detección y cuantificación a niveles establecidos por los

LMRP.

Se concluye que los objetivos tanto académicos como personales fueron alcanzados. Dado que la

presencia de plaguicidas en concentraciones elevadas, en alimentos y en el ambiente en general, es

un tema preocupante tanto a nivel medioambiental como de salud pública, se espera que los

resultados de esta investigación contribuyan a aportar valiosa información y permitan el desarrollo

de futuras investigaciones.

123

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1 ANEXOS

Los Anexos fueron organizados según orden de aparición en el texto.

CARACTERÍSTICAS DE UN ESPECTRÓMETRO/MONOCROMADOR.

La mayoría de los monocromadores y analizadores de espectro en general, descomponen la señal

de entrada a analizar por medio del fenómeno de difracción. En muchos equipos de laboratorio,

como los de esta tesis (equipos con configuración Czerny Turner) utilizan redes de difracción

holográficas de reflexión, con una determinada cantidad de líneas por mm, tal como se describen

en los respectivos párrafos experimentales (Hecht 1998).

Para hacer una breve descripción sobre el funcionamiento y de esta forma interpretar ciertos

parámetros característicos de cada equipo, se debe partir de la descripción del fenómeno de

dispersión mediante una red de difracción. Como se muestra en la Figura Anexo 1, es posible

describir los ángulos de entrada y salida de un haz de luz que difracta en una red en función de la

longitud de onda (Anon 1972).

Figura Anexo 1. Esquema de haz incidente (inciden light) y difractado (diffracted light) sobre una red de

difracción de reflexión.

En este caso hay que considerar que:

- Los ángulos son positivos en sentido antihorario.

138

- Un haz paralelo (onda plana) de luz monocromática de longitud de onda .

- Sea un ángulo de este haz con respecto a lo normal.

- Sea la dirección en la que se observa el fenómeno de difracción.

- Se tiene espacio libre entre surcos (líneas de red).

La diferencia de camino a lo largo de dos rayos de luz, difractado por sucesivas superficies

reflectantes viene dado por:

∆= 𝐼2𝐻 + 𝐼2𝐾 = 𝑎(𝑠𝑒𝑛 𝛼 + 𝑠𝑒𝑛 𝛽) (ec. A1.1)

El fenómeno de interferencia constructiva se observará en las direcciones que se tengan en cuenta

cuando,

∆= 𝑘𝜆 (ec. A1.2)

Siendo k un entero positivo o negativo.

Entonces la fórmula,

∆= 𝑎(𝑠𝑒𝑛 𝛼 + 𝑠𝑒𝑛 𝛽) = 𝑘𝜆 (ec. A1.3)

Se cumple para cada , todos los posibles valores de donde se encuentra un máximo de

intensidad para la longitud de onda (un máximo para cada valor de k).

Partiendo entonces de,

(𝑠𝑒𝑛 𝛼 + 𝑠𝑒𝑛 𝛽) =𝑘𝜆

𝑎

(ec. A1.4)

Que es la ecuación de la red de difracción, entonces es posible escribir,

(𝑠𝑒𝑛 𝛼 + 𝑠𝑒𝑛 𝛽) = 𝑘𝜆 𝑛 (ec. A1.5)

139

Donde

𝑛 =1

𝑎

(ec. A1.6)

Que es el número de líneas por unidad de longitud.

Esta fórmula muestra que depende de y, como consecuencia, la luz es dispersada por la red.

Para cada posible valor de k es posible obtener un espectro.

Para k = 0, obtenemos todas las longitudes de onda en la misma dirección, en consecuencia no hay

dispersión en orden 0.

Se dice que una red se usa en la configuración de Littrow cuando = (es decir, si observamos en

la dirección de la iluminación). En este caso, la fórmula de la red se convierte en,

2𝑠𝑒𝑛 𝛽 =𝑘𝜆

𝑎

(ec. A1.7)

En el caso de utilizar red de transmisión, la fórmula de la red (con la misma convención de signos)

estará dada por:

(𝑠𝑒𝑛 𝛼 − 𝑠𝑒𝑛 𝛽) =𝑘𝜆

𝑎

(ec. A1.8)

Rango de espectro libre (Free spectral range)

Para el mismo ángulo y el en el mismo ángulo de observación se pueden superponer distintas

longitudes de onda. Estas son todas las longitudes de onda para el cual,

𝑘𝜆 𝑛 = 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒 (ec. A1.9)

O bien,

140

𝑘𝜆 = 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒 (ec. A1.10)

La relación (𝑠𝑒𝑛 𝛼 + 𝑠𝑒𝑛 𝛽) = 𝑘𝜆 𝑛, puede ser escrita como

𝜎 =1

𝜆=

𝑘 𝑛

(𝑠𝑒𝑛 𝛼 + 𝑠𝑒𝑛 𝛽)

(ec. A1.11)

Y se puede expresar como,

𝜎 = |𝑘|𝜎1 (ec. A1.12)

Con

𝜎1 = 𝑛

(𝑠𝑒𝑛 𝛼 + 𝑠𝑒𝑛 𝛽) (ec. A1.13)

Las radiaciones superpuestas en el ángulo tienen números de onda en una progresión aritmética:

1, 21, 31, …

Si se quiere evitar la superposición de los espectros, es necesario que la radiación incidente esté

compuesta de vibraciones de números de onda contenidos en un intervalo máximo .

es llamado el rango de espectro libre.

Es posible ver que el free spectral range, no es exactamente una característica de una red de

difracción porque depende de las condiciones angulares de trabajo, pero cuanto más fino es el

espaciado de la red (mayor n), más grande es el rango espectral libre (Anon 1972; Zaidel,

Ostrovskaya, and Ostrovski 1979).

Resolución (poder resolvente).

141

L

La resolución de un instrumento óptico mide su capacidad para separar dos líneas adyacentes de

un espectro. Un esquema puede observarse en la figura a continuación (Figura Anexo 2).

Figura Anexo 2. Esquema utilizado para explicar la resolución o poder resolvente de una red de difracción.

Generalmente se define por,

𝑅 =𝜆

Δ𝜆

(ec. A1.14)

Donde,

es la diferencia en longitud de onda entre dos líneas espectrales de igual intensidad, que pueden

ser bien separadas.

Dos picos se consideran resueltos si la distancia entre ellos es, al menos, tal que el máximo de uno

cae en el primer mínimo del otro.

142

Figura Anexo 3. Esquema final que permite ver la capacidad de un equipo espectroscópico de separar dos líneas diferentes que se encuentren separadas una determinada distancia.

La capacidad de resolución de registrar dos líneas diferentes separadas una determinada distancia

se llama criterio de Rayleigh (Anon 1972; Zaidel, Ostrovskaya, and Ostrovski 1979).

Análisis de la resolución (Anon 1972)

El ancho angular de la imagen de difracción es d,

𝑑𝜃 =𝜆

𝐿=

𝜆

𝑤 cos 𝛽

(ec. A1.15)

De la ecuación de máximos de difracción se tenía (ec. A1.4),

(𝑠𝑒𝑛 𝛼 + 𝑠𝑒𝑛 𝛽) =𝑘𝜆

𝑎

Por diferenciación (aplicando derivada) se puede obtener,

𝑐𝑜𝑠 𝛽 𝑑𝛽 =𝑘

𝑎 𝑑𝜆

(ec. A1.16)

Entonces, dos longitudes de onda se pueden separar si

𝑑𝛽 = 𝑑𝜃 (ec. A1.17)

143

𝜆

𝑤 𝑐𝑜𝑠 𝛽=

𝑘 𝑑𝜆

𝑎 cos 𝛽

(ec. A1.18)

Esto da,

𝜆

𝑑𝜆 =

𝑘 𝑤

𝑎= 𝑘 𝑁

(ec. A1.19)

Siendo N el número total de líneas en la red de difracción,

𝑅 = 𝑘 𝑁 (ec. A1.20)

Esta relación debe usarse con mucha prudencia. Por ejemplo, considerando que se tiene el ancho

de la red ya fijado de antemano, se podría pensar en aumentar N para aumentar la resolución,

(cambiar la red por una más “fina”, con mayor cantidad de líneas por longitud). Pero hay que tener

en cuenta que al hacer esto, ciertos órdenes desaparecen y el máximo valor posible para k

disminuye.

La resolución también se podría expresar como,

𝑅 =𝑎

𝜆 (𝑠𝑒𝑛 𝛼 + 𝑠𝑒𝑛 𝛽) 𝑁 (ec. A1.21)

𝑅 =𝑤

𝜆 (𝑠𝑒𝑛 𝛼 + 𝑠𝑒𝑛 𝛽) (ec. A1.22)

Esta es una fórmula idéntica a la anterior, aunque no fácil de implementar debido a los parámetros

involucrados.

Se observa que la resolución depende del ancho de la red, en las condiciones de ángulo de trabajo,

y sobre la longitud de onda. Otra posible expresión de resolución se obtiene expresando kN con la

ayuda de la primera de todas las ecuaciones de difracción mostrada

𝑅 =𝑎

𝜆 (𝑠𝑒𝑛 𝛼 + 𝑠𝑒𝑛 𝛽) 𝑁 =

𝑁Δ

𝜆=

Δtotal

𝜆

(ec. A1.23)

144

𝑅 =Δtotal

𝜆

(ec. A1.24)

total es la diferencia del camino óptico entre los rayos extremos de la red.

Los resultados anteriores suponían que la onda difractaba por la red era una onda plana perfecta.

Si la onda se aparta de una onda plana por más de /4, el ancho angular de la imagen de difracción

aumentará y la resolución disminuirá bruscamente.

La resolución también puede medirse realmente obteniendo un registro de una línea espectral

compleja bien conocida (por ejemplo la línea de mercurio de 546 nm) y luego hacer los análisis

necesarios.

El monocromador que se utilizó para la mayoría de las mediciones (Jobin Yvon THR 1500), es un

equipo de alta resolución, con un R=300000 (Instrument SA - Divison Jobin-Yvon).

Dispersión angular

La dispersión angular es la separación angular d obtenida para dos radiaciones (fuentes de emisión)

diferentes separadas por d. A partir de la diferenciación de la ecuación inicial de difracción,

considerando al ángulo constante, se obtiene,

𝑐𝑜𝑠 𝛽 𝑑𝛽 =𝑘

𝑎𝑑𝜆

(ec. A1.25)

Y se puede llegar a,

𝑑𝛽

𝑑𝜆=

𝑘

𝑎 𝑐𝑜𝑠 𝛽=

𝑘 𝑛

𝑐𝑜𝑠 𝛽

(ec. A1.26)

Como se tuvo en cuenta antes, debe señalarse que en esta ecuación hay que tener cuidado en su

implementación dado que k y n no son variables independientes.

La dispersión angular también podría escribirse

𝑑𝛽

𝑑𝜆=

1

𝜆

(𝑠𝑒𝑛 𝛼 + 𝑠𝑒𝑛 𝛽)

𝑐𝑜𝑠 𝛽

(ec. A1.27)

145

Esta fórmula muestra claramente que dada una longitud de onda, la dispersión depende de las

condiciones angulares de trabajo.

Se obtienen altas dispersiones para ángulos de difracción grandes y estos están asociados con

grandes ángulos de blaze (“resplandor”). Para un orden dado y una determinada la longitud de onda,

esto conduce a redes muy “finas”, con muchas líneas por unidad de longitud. Con esto hay que tener

en cuenta que si el espacio de análisis no es el suficiente, es posible que la longitud de onda a

estudiar puede desaparecer en el orden considerado (Anon 1972; Zaidel, Ostrovskaya, and Ostrovski

1979).

Dispersión lineal (Anon 1972)

La dispersión lineal de un sistema con red de difracción es recíproca al producto de la dispersión

angular por la longitud focal efectiva. Mide la cantidad de nanómetros (d) que serán encontrados

en la unidad de longitud física del espectro (dx, en mm).

𝑑𝜆

𝑑𝑥=

𝑎 𝑐𝑜𝑠 𝛽

𝑘 𝐹

(ec. A1.28)

O bien

𝑑𝜆

𝑑𝑥[𝑛𝑚/𝑚𝑚] =

106 𝑐𝑜𝑠 𝛽

𝑘 𝑛 𝐹

(ec. A1.29)

Como tener en cuenta: un instrumento con una dispersión lineal de 0.4 nm/mm tiene una mejor

dispersión lineal que un instrumento con dispersión lineal de 0.6 nm/mm.

En resumen, la capacidad de un monocromador para separar longitudes de onda depende de su

dispersión. La dispersión lineal mide la porción espectral (dλ en 𝑛𝑚) que será encontrada en la

unidad de longitud física lineal (dx, en mm), en el plano de salida del dispositivo. La dispersión lineal

del monocromador utilizado esta descripta en su correspondiente manual, con valores específicos

para determinadas longitudes de onda. Este parámetro es diferente según la región del espectro en

la que se estén realizando las mediciones. A su vez, es importante destacar que la capacidad de

resolución de un monocromador mejora a medida que la dispersión lineal disminuye. Entonces, si

el número (en nm/mm) que mide la dispersión lineal disminuye, la dispersión lineal mejora.

146

Dispersión lineal en monocromador utilizado Jobin-Yvon THR

En la configuración experimental del equipo utilizado en esta tesis (red de 2000 líneas/mm), se

tienen los datos de dispersión lineal en el plano de la rendija de salida expresado en la Tabla Anexo

1 (Instrument SA - Divison Jobin-Yvon).

Tabla Anexo 1. Dispersión lineal de Jobin Yvon THR (muy alta resolución) con red de difracción de 2000

líneas/mm.

Longitud de onda analizada

(nm)

Dispersión lineal (nm/mm)

Simple pasaje Doble pasaje

200

300

600

700

800

0,325

0,320

0,260

0,236

0,200

0,163

0,160

0,130

0,118

0,100

A partir de implementar un esquema de medición en el cual se integraba ópticamente una línea en

particular en la rendija de salida, fue muy importante tener en cuenta la dispersión lineal descrita

anteriormente en función de la rendija de salida.

Referencias

Anon. 1972. Handbook of Diffraction Gratings Ruled and Holographic. ed. Edison. Longjumeau: Jobin Yvon Optical Systems.

Hecht, Eugene. 1998. Optics. Third Edit. ed. Addison-Wesley.

Instrument SA - Divison Jobin-Yvon. “Holographic Grating Monochromator Type THR 1500.”

JCGM. 2008. 79 Evaluación de Datos de Medición. Guía Para La Expresión de La Incertidumbre de Medida. ed. Centro Español de Metrología.

Smith, George, and David Atchison. 2010. The Eye and Visual Optical Instruments. ed. Prensa de la Universidad de Cambridge.

Zaidel, A. N., G. V. Ostrovskaya, and Yu I Ostrovski. 1979. Técnica y Práctica de Espectroscopia. ed. MIR. Moscú.

147

COMPARACIÓN DE MEDIAS PARA APLICACIÓN DE MÉTODOS QUIMIOMÉTRICOS

Análisis de la varianza: ANOVA

Se aplicó un análisis de la varianza para establecer diferencias significativas entre las medias de las

variables que conforman los plaguicidas. Se verificaron los supuestos de normalidad y

homocedasticidad, a través del análisis de los residuos. Se encontró que el S no presenta una

distribución normal, por lo tanto en este caso, se aplicó un Análisis de la Varianza no Paramétrico

de Kruskal Wallis y se graficaron las medias con un intervalo de confianza del 95 % (Figura Anexo 4).

Las pruebas a posteriori con fines comparativos, se llevaron a cabo mediante el test de LSD Fisher y

test de Kruskal de comparaciones múltiples, según corresponda. Los resultados se presentan a

continuación.

Fósforo

Variable N R² R² Aj CV

P 240 0,71 0,70 21,69

Cuadro de Análisis de la Varianza (SC tipo III)

F.V. SC gl CM F p-valor

Modelo 0,03 5 0,01 114,04 <0,0001

Plaguicida 0,03 5 0,01 114,04 <0,0001

Error 0,01 234 4,9E-05

Total 0,04 239

Test:LSD Fisher Alfa=0,05 DMS=0,00308

Error: 0,0000 gl: 234

Plaguicida Medias n E.E.

Carbendazim 0,02 40 1,1E-03 A

Control 0,02 40 1,1E-03 A

Imidacloprid 0,02 40 1,1E-03 A

Cipermetrina 0,03 40 1,1E-03 B

Clorpirifos 0,04 40 1,1E-03 C

Dimetoato 0,05 40 1,1E-03 D

Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)

Carbono

Variable N R² R² Aj CV

C 240 0,71 0,71 14,03

Cuadro de Análisis de la Varianza (SC tipo III)

F.V. SC gl CM F p-valor

148

Modelo 3,52 5 0,70 115,87 <0,0001

Plaguicida 3,52 5 0,70 115,87 <0,0001

Error 1,42 234 0,01

Total 4,95 239

Test:LSD Fisher Alfa=0,05 DMS=0,03435

Error: 0,0061 gl: 234

Plaguicida Medias n E.E.

Control 0,33 40 0,01 A

Dimetoato 0,50 40 0,01 B

Clorpirifos 0,54 40 0,01 C

Imidacloprid 0,63 40 0,01 D

Cipermetrina 0,66 40 0,01 D E

Carbendazim 0,68 40 0,01 E

Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)

Cloro

Variable N R² R² Aj CV

Cl 240 0,73 0,73 52,54

Cuadro de Análisis de la Varianza (SC tipo III)

F.V. SC gl CM F p-valor

Modelo 0,28 5 0,06 129,67 <0,0001

Plaguicida 0,28 5 0,06 129,67 <0,0001

Error 0,10 234 4,3E-04

Total 0,38 239

Test:LSD Fisher Alfa=0,05 DMS=0,00917

Error: 0,0004 gl: 234

Plaguicida Medias n E.E.

Control 0,01 40 3,3E-03 A

Carbendazim 0,01 40 3,3E-03 A

Dimetoato 0,01 40 3,3E-03 A

Imidacloprid 0,05 40 3,3E-03 B

Cipermetrina 0,07 40 3,3E-03 C

Clorpirifos 0,09 40 3,3E-03 D

Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)

Azufre

Prueba de Kruskal Wallis

Variable Plaguicida N Medias D.E. Medianas H p

S Carbendazim 40 0,01 1,8E-03 0,01 196,91 <0,0001

S Cipermetrina 40 0,15 0,09 0,17

S Clorpirifos 40 0,32 0,07 0,33

S Control 40 0,02 0,05 0,02

S Dimetoato 40 0,65 0,20 0,67

S Imidacloprid 40 0,04 0,02 0,05

149

Trat. Ranks

Carbendazim 43,43 A

Control 58,15 A

Imidacloprid 94,93 B

Cipermetrina 127,68 C

Clorpirifos 180,18 D

Dimetoato 218,65 E

Rangos promedios con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)

Figura Anexo 4. Gráfico de medias para el azufre, con intervalos de confianza del 95 %.

Análisis de supuestos

▫ Normalidad

Shapiro-Wilks (modificado)

Variable n Media D.E. W* p(Unilateral D)

RE Cl 240 0,00 1,00 0,99 0,5198

RE P 240 0,00 1,00 0,99 0,4616

RE C 240 0,00 1,00 0,99 0,3618

RE S 240 0,00 1,00 0,89 <0,0001

150

▫ Homocedasticidad

RE Cl

Variable N R² R² Aj CV

RE Cl 240 0,00 0,00 781881023352246000,00

Cuadro de Análisis de la Varianza (SC tipo III)

F.V. SC gl CM F p-valor

Modelo 0,00 5 0,00 0,00 >0,9999

Plaguicida 0,00 5 0,00 0,00 >0,9999

Error 240,00 234 1,03

Total 240,00 239

RE P

Variable N R² R² Aj CV

RE P 240 0,00 0,00 1,30313503892041E18

Cuadro de Análisis de la Varianza (SC tipo III)

F.V. SC gl CM F p-valor

Modelo 0,00 5 0,00 0,00 >0,9999

Plaguicida 0,00 5 0,00 0,00 >0,9999

Error 240,00 234 1,03

Total 240,00 239

RE C

Variable N R² R² Aj CV

RE C 240 0,00 0,00 544593747608529000,00

Cuadro de Análisis de la Varianza (SC tipo III)

F.V. SC gl CM F p-valor

Modelo 0,00 5 0,00 0,00 >0,9999

Plaguicida 0,00 5 0,00 0,00 >0,9999

Error 240,00 234 1,03

Total 240,00 239

RE S

Variable N R² R² Aj CV

RE S 240 0,00 0,00 601446941040189000,00

151

Cuadro de Análisis de la Varianza (SC tipo III)

F.V. SC gl CM F p-valor

Modelo 0,00 5 0,00 0,00 >0,9999

Plaguicida 0,00 5 0,00 0,00 >0,9999

Error 240,00 234 1,03

Total 240,00 239

Figura Anexo 5. Gráfico de residuos vs. predichos para verificación de homocedasticidad. a) P, b) S, c) Cl, d) C.

152

NÚMERO ÓPTIMO DE MEDICIONES (JCGM 2008)

Evaluación tipo A de la incertidumbre típica

En la mayor parte de los casos, la mejor estimación disponible de la esperanza matemática 𝜇𝑞 de

una magnitud q que varía al azar (es decir, de una variable aleatoria), de la que se han obtenido n

observaciones independientes 𝑞𝑘 en las mismas condiciones de medida, es la media aritmética ��

de las n observaciones:

�� = 1

𝑛∑ 𝑞𝑘

𝑛

𝑘=1

(ec. A3.1)

Las estimaciones de entrada no calculadas mediante observaciones repetidas deben obtenerse por

otros métodos, (por ejemplo, magnitudes cuyos valores e incertidumbres se introducen en las

mediciones procedentes de fuentes externas, tales como magnitudes asociadas a patrones,

certificados, valores de referencias tomados de publicaciones, etc).

Los valores de las observaciones individuales 𝑞𝑘 difieren en razón de las variaciones aleatorias de

las magnitudes de influencia o de efectos aleatorios. La varianza experimental de las observaciones,

que estima la varianza 𝜎2 de la distribución de probabilidad de q, viene dada por:

𝑠2(𝑞𝑘) = 1

𝑛 − 1 ∑(𝑞𝑗 − ��)

2𝑛

𝑗=1

(ec. A3.2)

Esta estimación de la varianza y su raíz cuadrada positiva 𝑠(𝑞𝑘), denominada desviación típica

experimental, representan la variabilidad de los valores observados 𝑞𝑘, o más específicamente, su

dispersión alrededor de su media ��.

La mejor estimación de 𝜎2(��) es:

𝜎2(��) = 𝜎2

𝑛

(ec. A3.3)

Que sería la varianza de la media y vendrá dada por:

153

𝑠2(��) = 𝑠2(𝑞𝑘)

𝑛

(ec. A3.4)

La varianza experimental de la media 𝑠2(��) y la desviación típica experimental de la media 𝑠(��),

igual a la raíz cuadrada positiva de 𝑠2(��), determinan la bondad con que �� estima la esperanza

matemática 𝜇𝑞 de q, y una u otra pueden ser utilizadas como medida de la incertidumbre de ��.

De este modo, para una magnitud de entrada 𝑋𝑖 (que puede llegar a ser parte de una magnitud

combinada con magnitudes i) obtenida a partir de n observaciones repetidas e independientes 𝑋𝑖,𝑘,

la incertidumbre típica 𝑢(𝑥𝑖) de su estimación 𝑥𝑖 = 𝑋�� es 𝑢(𝑥𝑖) = 𝑠(𝑋��), con 𝑠2(𝑋��) calculada según

la ecuación (ec. A2.4). Por comodidad, 𝑢2(𝑥𝑖) = 𝑠2(𝑋��), y 𝑢(𝑥𝑖) = 𝑠(𝑋��), son a veces llamadas

varianza Tipo A e incertidumbre típica tipo A, respectivamente.

En una medición bien diseñada y bajo control estadístico, puede existir una estimación de la varianza

𝑠𝑝2, combinada o procedente de un conjunto previo de resultados (o la desviación típica

experimental correspondiente 𝑠𝑝) que la caracterice. En tal caso, cuando se determina el valor de

un mensurando q a partir de n observaciones independientes, la varianza experimental de la media

aritmética �� de las observaciones resulta mejor estimada por 𝑠𝑝2/𝑛 que por 𝑠2(𝑞𝑘)/𝑛 y la

incertidumbre típica es,

𝑢𝑝 = 𝑠𝑝/√𝑛. (ec. A3.5)

La discusión sobre la evaluación Tipo A de la incertidumbre típica realizada hasta el momento no

pretende ser exhaustiva; existen numerosas situaciones, algunas relativamente complejas, que

pueden tratarse por métodos estadísticos. Un ejemplo importante se refiere a la utilización de

modelos de calibración, a menudo basados en el método de mínimos cuadrados, para evaluar las

incertidumbres procedentes de variaciones aleatorias, tanto a corto como a largo plazo, de los

resultados de comparaciones de patrones materializados de valor desconocido, tales como bloques

patrón o patrones de masa, con patrones de referencia de valor conocido. En tales situaciones de

medida, relativamente sencillas, las componentes de la incertidumbre pueden evaluarse

frecuentemente mediante análisis estadístico de los datos obtenidos a partir de diseños

experimentales, consistentes en secuencias anidadas de mediciones del mensurando, para

154

diferentes valores de las magnitudes de las que depende, esta técnica se denomina análisis de la

varianza, ANOVA.

Número óptimo de mediciones: implementación en LIBS.

A partir de la expresión (ec. A3.5) se puede ver que al determinar la incertidumbre tipo A, 𝑢𝑝, podría

ser tan pequeña como se quiera con tan solo aumentar el tamaño n del experimento. Sin embargo,

no tiene sentido reducir 𝑢𝑝 más allá de la incertidumbre de origen instrumental 𝑢𝑒𝑥𝑝. Es decir, hay

que considerar que,

𝑢𝑒𝑥𝑝 ≥ 𝑢𝑝

(ec. A3.6)

𝑢𝑒𝑥𝑝 ≥ 𝑠𝑝/√𝑛

(ec. A3.7)

Por lo tanto,

𝑛 ≥ (𝑠𝑝/𝑢𝑒𝑥𝑝) 2 (ec. A3.8)

En nuestro caso, se tiene que la intensidad neta de un elemento vendrá dada por la diferencia entre

la intensidad de línea y la intensidad de fondo:

𝐼𝑛 = 𝐼𝑙 − 𝐼𝑓

(ec. A3.9)

Por lo que la incerteza de esta intensidad neta (calculada a partir de la desviación típica experimental

de la media) es:

𝑢𝑛 = 𝑢𝑙 + 𝑢𝑓 (ec. A3.10)

En el tipo A:

𝑢𝑛 =(𝑠𝑙 + 𝑠𝑓)

√𝑛

(ec. A3.11)

Particularmente, volviendo a la expresión del n óptimo:

155

𝑛 ≥ ((𝑠𝑙 + 𝑠𝑓)/𝑢𝑒𝑥𝑝) 2

(ec. A3.12)

En forma práctica se consideró una expresión más versátil como ser:

𝑛 ≥ 𝑖𝑛𝑡 [((𝑠𝑙 + 𝑠𝑓)/𝑢𝑒𝑥𝑝) 2 + 1]

(ec. A3.13)

En donde int[] es “parte entera de”, el (+1) se agregó para justificar aquellas estimaciones que dieran

un número menor que 1.

En este trabajo, los valores de incertidumbre experimental (𝑢𝑒𝑥𝑝) fueron dados por,

𝑢𝑒𝑥𝑝 = 0,03, para registros de líneas de emisión de Cl, S y C.

𝑢𝑒𝑥𝑝 = 0,002, para registros de líneas de emisión P.

- Referencias

JCGM. 2008. 79 Evaluación de Datos de Medición. Guía Para La Expresión de La Incertidumbre de

Medida. ed. Centro Español de Metrología.

156

ESTIMACIÓN DE INCERTIDUMBRES

Estimación de incertidumbre en Plot de Boltzmann

Para la gráfica del plot de Boltzmann, en definitiva, se aplica la ecuación (ec. 6.1). En donde,

𝑗𝑖 equivale a 0 y viene dado por las longitudes de onda de Fe I medidas para la construcción del

mismo.

En este caso, la incertidumbre típica combinada 𝑢𝑐(𝑦) es la raíz cuadrada positiva de la varianza

combinada de 𝑢𝑐2(𝑦) dada por (JCGM 2008):

𝑢𝑐2(𝑦) = ∑ [

𝜕𝑓

𝜕𝑥𝑖]

2𝑁

𝑖=1

𝑢2(𝑥𝑖) (ec. A4.1)

Aplicado a este caso en particular:

𝑢𝑐2(𝑦) = [

𝜕

𝜕𝜆(𝑙𝑛 (

𝜆03 𝐼(𝜆, 𝐿)

𝑔𝑗 𝐴𝑗𝑖

))]

2

𝑢2(𝜆0) + [𝜕

𝜕𝐼(𝑙𝑛 (

𝜆03 𝐼(𝜆, 𝐿)

𝑔𝑗 𝐴𝑗𝑖

))]

2

𝑢2(𝐼)

+ [𝜕

𝜕𝐴𝑗𝑖

(𝑙𝑛 (𝜆0

3 𝐼(𝜆, 𝐿)

𝑔𝑗 𝐴𝑗𝑖

))]

2

𝑢2(𝐴𝑗𝑖)

(ec. A4.2)

Realizando los cálculos correspondientes:

𝑢𝑐2(𝑦) = (

𝑔𝑗 𝐴𝑗𝑖

𝜆03 𝐼(𝜆, 𝐿)

3 𝜆02 𝐼(𝜆, 𝐿)

𝑔𝑗 𝐴𝑗𝑖

)

2

𝑢2(𝜆0) + ( 𝑔𝑗 𝐴𝑗𝑖

𝜆03 𝐼(𝜆, 𝐿)

𝜆03

𝑔𝑗 𝐴𝑗𝑖

)

2

𝑢2(𝐼)

+ (− 𝑔𝑗 𝐴𝑗𝑖

𝜆03 𝐼(𝜆, 𝐿)

𝜆03 𝐼(𝜆, 𝐿)

𝑔𝑗 𝐴𝑗𝑖2 )

2

𝑢2(𝐴𝑗𝑖)

(ec. A4.3)

Reacomodando, se obtiene:

𝑢𝑐2(𝑦) = (

3

𝜆0 )

2

𝑢2(𝜆0) + (1

𝐼(𝜆, 𝐿))

2

𝑢2(𝐼) + (−1

𝐴𝑗𝑖)

2

𝑢2(𝐴𝑗𝑖)

(ec. A4.4)

157

Estimación de incertidumbre de 𝑤𝐿′ (kT)

Partiendo de la (ec. 6.4):

𝑤𝐿′ (kT) = 𝐴1 ∗ 𝑒𝑥𝑝(−𝑘𝑇/𝑡1) + 𝑦0

Considerando que la incerteza que más peso tiene, en este caso, es la del cálculo de kT, es posible

deducir que:

𝑢(𝑤𝐿′ (kT)) = 𝐴1 ∗ 𝑒𝑥𝑝 (−

𝑘𝑇

𝑡1) . 𝑢(𝑘𝑇)/𝑡1 (ec. A4.5)

En donde:

𝑢(𝑤𝐿′ (kT)): es la incerteza estimada de 𝑤𝐿

′ (kT)

𝑢(𝑘𝑇): es la incerteza estimada de 𝑘𝑇 (estimada a partir del plot de Boltzmann)

Estimación de incertidumbre de 𝑛𝑒 (𝑘𝑇)

Partiendo de la expresión (ec. 6.2) para la estimación de 𝑛𝑒(𝑘𝑇)

𝑛𝑒(𝑘𝑇) = 𝑛𝑒′

𝑤𝐿′ (𝑘𝑇)

𝑤𝐿(𝑘𝑇)

A partir de la ecuación (ec. 15)

En donde:

𝑢(𝑤𝐿′ (kT)): es la incerteza estimada de 𝑤𝐿

′ (𝑘𝑇)

𝑢(𝑤𝐿(𝑘𝑇)): es la incerteza estimada de 𝑤𝐿(𝑘𝑇)

𝑢2(𝑛𝑒(𝑘𝑇)) = ((−1)𝑛𝑒′ (𝑤𝐿

′ (𝑘𝑇))−2

𝑤𝐿(𝑘𝑇))2

𝑢2(𝑤𝐿′ (𝑘𝑇))

+ (𝑛𝑒′

𝑤𝐿′(𝑘𝑇)

)

2

𝑢2(𝑤𝐿(𝑘𝑇))

(ec. A4.6)

158

FUNCIÓN TRANSFERENCIA

Tanto en los casos en donde se integraron líneas en forma óptica como para los casos en que se

tienen registros de perfiles de línea, fue muy importante tener en cuenta la función instrumento o

transferencia. Sobre esto, se presentó un caso en particular en el Capítulo VI para el caso del perfil

de línea registrado de Mg II (280.27 nm). En cuanto al monocromador utilizado, en el manual se

destaca que para rendijas de entrada y salida iguales, y además mayores de 50 m se considera que

la línea registrada es una convolución entre la función de línea original y una función triangular. Sin

embargo, para simplificar el esquema de cálculos finales, habitualmente se aproxima la función

triangular con una gaussiana, de forma tal que se puede implementar el ajuste por perfil Voigt

(convolución entre función lorentziana y gaussiana). Por otro lado, cabe destacar que la FWHM (Full

Width Half Maximum) de la función instrumental coincide con la porción espectral que permite

registrar la rendija de salida, esto es el producto entre la dispersión lineal del monocromador y el

ancho de rendija de salida expresado en nm, para la correspondiente longitud de onda de la línea

que se está analizando (Tabla Anexo 2).

El ancho gaussiano 𝑤𝐺 del ajuste de Voigt se estimó para la función instrumental correspondiente,

calculada a partir de los anchos de rendijas y especificaciones del monocromador utilizado (Jobin

Yvon THR 1500, configuración Czerny - Turner, longitud focal 1.5 m).

Tabla Anexo 2. Función instrumental para el monocromador Jobin Yvon THR 1500, para diferentes rendijas

(r) entrada/salida expresado en m.

Longitud de onda r 70

(nm)

r 80

(nm)

r 100

(nm)

r 200

(nm)

r 300

(nm)

200 0,0114 0,01303 0,01629 0,03258 0,04886

300 0,01121 0,01281 0,01601 0,03202 0,04804

600 0,00916 0,01047 0,01308 0,02617 0,03925

700 0,00814 0,00931 0,01163 0,02326 0,0349

800 0,00706 0,00807 0,01009 0,02017 0,03026

159

2 LISTA DE PUBLICACIONES DECLARADA

Anales AFA Vol. 31 Nro. 4 (Enero 2021 - Abril 2021) 135-138

APLICACIÓN DE LA TÉCNICA LASER INDUCED BREAKDOWN SPECTROSCOPY ALA DETECCIÓN DE Cl EN ACELGA PARA INFERIR LA PRESENCIA DE

PLAGUICIDAS

APPLICATION OF THE LASER INDUCED BREAKDOWN SPECTROSCOPYTECHNIQUE TO THE DETECTION OF Cl IN CHARD TO INFER THE PRESENCE OF

PESTICIDES

L. J. Martino*1 y C. A. D’Angelo1

1Centro de Investigaciones en Física e Ingeniería del Centro de la Provincia de Buenos Aires (CICPBA - CONICET - UNCPBA),Tandil, Argentina.

Recibido: 02/07/2020 ; Aceptado: 22/07/2020

Los residuos de plaguicidas en alimentos son una amenaza para su consumo. Sin embargo detectar los residuos enforma rápida y directamente sobre la muestra es un trabajo complejo. En este trabajo, se explora la aplicación poten-cial de la técnica Laser Induced Breakdown Spectroscopy (LIBS) para la medición rápida de residuos de plaguicidas(imidacloprid, cipermetrina y clorpirifos) en hojas de acelga mediante el registro de la línea de emisión de Cl I (725.66nm). Pueden observarse diferencias significativas con respecto a la muestra control, evidenciando la aplicabilidad deesta técnica como una potencial herramienta para el estudio de residuos de plaguicidas en matrices de alimentos.

Palabras clave: Laser Induced Breakdown Spectroscopy, cloro.

Pesticide residues in food are a threat to consumption. However, detecting residues quickly and directly on the sampleis a complex job. In this work, the potential application of the Laser Induced Breakdown Spectroscopy (LIBS) techni-que for the rapid measurement of pesticide residues (imidacloprid, cypermethrin and chlorpyrifos) in chard leaves isexplored by registering the chlorine emission line (725.66 nm). Significant differences can be observed with respect tothe control sample, evidencing the applicability of this technique as a potential tool for the study of pesticide residuesin food matrices.

Keywords: Laser Induced Breakdown Spectroscopy, chlorine.

https://doi.org/10.31527/analesafa.2020.31.4.135 ISSN 1850-1168 (online)

I. INTRODUCCIÓN

La técnica LIBS (Laser Induced Breakdown Spectros-copy) es una técnica de diagnóstico sencilla. Se trata de en-focar radiación láser dentro o en la superficie del medio enestudio, provocando una ruptura dieléctrica originada por elfuerte campo eléctrico del pulso láser, que da informaciónrespecto de los componentes del medio en cuestión [1-3].En el microplasma formado se alcanzan temperaturas de al-gunos eV y se obtienen densidades electrónicas altas, delorden de 1017 electrones/cm3. En esas condiciones el ma-terial se separa en sus componentes atómicos con alto gra-do de ionización produciendo emisión intensa de luz, quepuede ser analizada espectralmente para la detección de laslíneas de emisión características de los elementos que cons-tituyen la muestra analizada.

El análisis de las líneas espectrales de emisión, propias decada elemento, proporciona información cualitativa y cuan-titativa sobre las especies presentes en el plasma (iones, áto-mos neutros y moléculas simples). La técnica LIBS posee lacapacidad de realizar mediciones rápidas, in-situ y de varioselementos simultáneamente, requiriendo muy poca o nin-guna preparación previa de las muestras a analizar. Sin em-bargo, existen ciertos elementos cuya detección a presión

* lumartino91@gmail.com

atmosférica es compleja, como es el caso de los halógenos.Esta dificultad, es debida a las altas energías de los nive-les electrónicos excitados. Para la detección de halógenosse utilizan algunas técnicas, tales como la espectroscopíade absorción atómica (AAS), la espectroscopía de emisiónatómica de plasma acoplado inductivamente (ICP-OES), lafluorescencia de rayos X (XFR), no obstante estas técnicassuelen consumir una gran cantidad de tiempo, y la detecciónde Cl resulta compleja.

La detección de residuos de pesticidas en las superficiesde alimentos mediante la técnica LIBS es un nuevo método.Debido a que los plaguicidas poseen algunos elementos es-pecíficos, sus residuos pueden medirse por inferencia de loselementos presentes. En este trabajo, se estudia un métodode detección de plaguicidas en la superficie de acelgas, cu-yo elemento utilizado para su detección es el registro de lalínea de emisión de Cl I (725.66 nm). La detección se reali-za bajo condiciones de baja presión, en una celda realizadapara tal fin.

II. MATERIALES Y MÉTODOS

ReactivosLos plaguicidas en los cuales se va a detectar la presen-

cia de Cl son: clorpirifos (C9H11Cl3NO3PS), imidacloprid(C9H10ClN5O2) y cipermetrina (C22H19Cl2NO3), los mis-

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mos son utilizados como insecticidas en la producción decultivos.

Preparado de muestrasPara este estudio se seleccionaron muestras de acelga

(Beta vulgaris var. Cicla) obtenidas de una huerta donde selleva a cabo una producción orgánica, sin la aplicación deplaguicidas o fertilizantes que pudieran provocar interferen-cias en las mediciones.

Para preparar las muestras contaminadas con los diferen-tes plaguicidas, las acelgas frescas se sometieron a un lava-do bajo agua de red con el fin de eliminar restos de suciedady microorganismos que pudieran quedar sobre la superficie.Luego se procedió a un lavado con agua destilada, y se se-caron en un horno a 60◦C hasta peso constante. Una vezobtenida una muestra seca, ésta fue pulverizada y tamizadabajo un tamiz de 60 mesh (250 µm) para obtener tamañosde partículas homogéneos. Luego, 2.5 g de acelga pulveri-zada fue mezclado y homogeneizado con 0.75 mL de cadaplaguicida y se dejaron secar a temperatura ambiente. Seprepararon pellets mediante un compactador a 100 MPa por1 min, con un tamaño aproximadamente de 3 cm de diáme-tro y 0.2 cm de espesor. Mediante este proceso también sepreparó una muestra de acelga con agua destilada con finesde control.

Experimental LIBSEn la Fig. 1 se presenta un esquema del equipo expe-

rimental utilizado. Está constituido por un láser Nd: YAGQ-switched pulsado (Continuum Surelite II), que emite enla longitud de onda fundamental de 1064 nm, ancho de pul-so ≈ 7 ns, con una tasa de repetición de 2 pulsos/s, y unaenergía 100 mJ/pulso.

FIG. 1: Esquema experimental LIBS.

Los pulsos láser fueron enfocados sobre la superficie delas muestras a baja presión y en dirección normal, con unalente (L1) de 100 mm de longitud focal.

Las muestras a ser analizadas, se ubicaron en un soporterotativo para evitar cráteres por ablación dentro de una celdapara generar plasma a baja presión.

La luz emitida por el plasma es colectada mediante unasegunda lente (L2) de 200 mm de longitud focal, que formala imagen del plasma sobre la rendija de entradade un mo-nocromador (JobinYvon THR 1500, configuración Czerny-Turner, resolución de R = 300000 en doble pasaje a λ = 300nm, longitud focal 1.5 m). La dispersión se produce median-te una red de difracción holográfica de 2000 líneas/mm. Porotro lado, también se tiene una imagen del plasma formadapor una lente L3 sobre una pantalla para lograr un ajuste dealineación del plasma en forma visual.

La luz es detectada por un fotomultiplicador, (Hama-matsu modelo R928) colocado en la rendija de salida delmonocromador. La señal eléctrica del fotomultiplicador esdiscriminada en el tiempo y promediada por un promedia-dor Boxcar (Standford Research System, módulos SR 250,SR 280). La señal registrada por el fototubo es resueltatemporalmente con determinados tiempos de retardo post-breakdown (coordinada con una señal trigger provenientedel láser) y tiempos de ventana adecuados. Luego es pro-mediada (promedio por cada tres muestras), enviada a unconvertidor analógico-digital, y finalmente es registrada poruna PC.

La señal final registrada está dada por la intensidad de luzmedida en la ventana temporal seleccionada. Para analizaruna porción del espectro se hace un barrido de una deter-minada zona espectral, mediante la rotación de la red dedifracción del monocromador con una velocidad adecuada.Esto permite hacer registros espectrales con una resoluciónóptima en función de la cantidad de disparos láser.

Esta configuración experimental es muy eficaz para aná-lisis muy detallados, especialmente para el análisis de lí-neas muy débiles o difíciles de observar. Por otro lado, estearreglo permite el estudio de la física de plasmas específica-mente cuando es necesario el estudio de perfiles de líneas.

Obtención de señales LIBSEn los trabajos encontrados en la literatura [4-6], demos-

traron que la detección de Cl en muestras se realiza median-te el estudio de la línea de emisión 837.6 nm, sin embargoen este trabajo se eligió estudiar la línea 725.66 nm debi-do a especificaciones del monocromador utilizado, el cualno permite la visualización de líneas por encima de los 800nm.

En la Tabla 1, se puede observar la línea de emisión selec-cionada de Cl I conjuntamente con sus datos espectroscópi-cos más importantes en la aplicación de la cuantificaciónpor plasmas delgados [7].

TABLA 1: Información espectroscópica de la línea seleccionadapara identificación de Cl en plaguicidas.

Elemento yestado deionización

Línea[nm]

Probabilidadde

transición[s−1]

Ei[eV]

Ek[eV]

gk

Cl I 725.66 1.5×107 8.92 10.63 4

El cloro al ser un halógeno es un elemento químico decompleja detección a presión atmosférica debido a las al-tas energías de los niveles electrónicos excitados. Estudiosprevios [6, 8], determinan que para su detección es necesa-

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rio contar con un dispositivo de baja presión, de esta formase produce un aumento de la intensidad de emisión y de larelación señal/ruido. La mejora observada se debe princi-palmente a la reducción de la protección del plasma, lo queresulta en una mayor ablación y un ensanchamiento Starkmenor debido al aumento del camino libre medio. Para es-to se trabajó con una celda creada para tal fin que permi-te llegar a estas condiciones experimentales utilizando unabomba mecánica que alcanzaba una presión del orden delos 6-7 ×10−2 mbar. En la Fig. 2 puede observarse clara-mente la diferencia obtenida en el registro de línea de Cl I,en condiciones de presión atmosférica y baja presión, parauna muestra de acelga con clorpirifos.

FIG. 2: Perfil de línea de emisión de Cl I (725.66 nm) registra-do con rendija de entrada y salida de 80 µm, en condiciones depresión atmosférica y en baja presión.

Los tiempos óptimos post-breakdown para el registro dela línea de Cl I fueron obtenidos mediante un estudio de lalínea de emisión integrada a lo largo del tiempo. De estaforma, se registraron señales para un tiempo de integracióndeterminado, y se estudiaron las variaciones de intensida-des a lo largo del tiempo para encontrar condiciones expe-rimentales donde el registro de línea sea más intenso, así laintensidad es proporcional a la concentración del elementoen la muestra. Para la línea seleccionada se eligió un rangode tiempo entre 50 ns a 1000 ns, con un tiempo de integra-ción de 60 ns y un ancho de rendija de entrada y salida delmonocromador de 300 µm en ambos casos, para asegurarintegración espectral completa de un perfil de línea. En laFig. 3 se observa el registro neto, obtenido luego de realizarla diferencia entre el promedio de tres mediciones, y un fon-do donde se aseguró que fuera obtenido en zonas donde noexista presencia de otros elementos posiblemente presentesen las muestras.

Puede observarse de la Fig. 3 que la mayor diferencia seobtuvo alrededor de 150 ns, donde la intensidad neta alcan-za su mayor valor. Este tiempo de medición fue el elegidopara realizar los cálculos de registro de señal de Cl I en lasmuestras en cuestión, con un tiempo de integración de perfil(gate time) de 4 µs.

III. RESULTADOS

Para la adquisición de los registros de señales LIBS seimplementó un nuevo método de medición, a fin de mejo-

FIG. 3: Registro de señal temporal de la intensidad neta de lalínea de Cl I (725.66 nm).

rar y simplificar mediciones del tipo analíticas. Este métodoconsistió en emplear el monocromador de alta resolucióncomo un espectrógrafo de integración por línea completa,de manera que es posible integrar todo el perfil de una líneaen cada plasma producido, sin detalles de la misma, peroobteniendo la intensidad total. Para que la línea sea total-mente registrada por el fotomultiplicador, se seleccionó unancho de la rendija de salida acorde a la dispersión linealdel monocromador en el plano de la misma. En este caso,un ancho de rendija de 300 µm equivale a unos 0.034 nmpara la longitud de onda de la línea elegida. Este es un valoradecuado tanto para la integración de la línea, como paraminimizar la componente del continuo fuera de ella. Estopermitió una análisis rápido, con mínima destrucción de lamuestra (menos disparos de láser), pero al mismo tiempocon mayor adquisición de datos de intensidades de línea, pa-ra realizar una buena estadística y mejorar la limitación derepetitividad de LIBS. De esta forma pudieron adquirirse 40registros de señal de cada elemento en cada muestra y tam-bién se obtuvieron fondos, con el fin de obtener un registrode señal neta de cada elemento. Debido a las diferencias dematriz por propiedades diferentes entre los plaguicidas, fuenecesario realizar un procesamiento de los datos. Para esto,se llevó a cabo una normalización de los registros de líneaobtenidos, con la función de obtener los datos en la mismaescala, se normalizaron los datos con respecto a un fondomedido. Lo descrito anteriormente puede observarse en laFig. 4.

De la Fig. 4 pueden evidenciarse diferencias entre las lí-neas netas registradas a través de la medición de la técni-ca LIBS en los plaguicidas en estudio, y a su vez tambiénpuede observarse la diferencia con respecto a una muestracontrol que solamente estaba formada por acelga y no poseeCl. En el caso del clorpirifos, que posee un total de 30.33%de Cl en su molécula, a diferencia de la cipermetrina y elimidacloprid que sólo poseen un 17.03% y 13.86% de es-te elemento, se observa la mayor intensidad y diferencia enrelación a la muestra control.

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FIG. 4: Registros de líneas de emisión de la línea Cl I (725.66 nm)en muestras de acelga contaminadas con plaguicidas y la muestracontrol.

IV. CONCLUSIÓNEn este trabajo se pudieron estudiar registros de líneas de

emisión de Cl I (725.66 nm) en muestras de acelga contami-nadas con clorpirifos, imidaclorpid y cipermetrina. A partirde un análisis previo y la utilización de un esquema expe-rimental adecuado para el registro de líneas complejas, seobtuvo el tiempo post-breakdown más óptimo, en funciónde un análisis temporal del perfil de línea seleccionada. Elmétodo no requiere preparado de muestras mediante largastécnicas con producción de desechos peligrosos. A partir deeste estudio es posible inferir la presencia de plaguicidas enmuestras preparadas con acelga a partir de la comparacióncon una muestra control. Siendo esto, un primer indicio dela detección de plaguicidas en muestras vegetales mediantela técnica LIBS.

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[3] D. A. Cremers y L. J. Radziemsky. Handbook of Laser -Induced Breakdown Spectroscopy (Jhon Wiley & Sons, Ltd,2006).

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[5] X. Du, D. Dong, X. Zhao, L. Jiao, P. Hana e Y. Langa. De-tection of pesticide residues on fruit surfaces using laser in-duced breakdown spectroscopy. RSC Adv. 5, 79956-79963(2015).

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[7] A. Corney. Atomic and Laser Spectroscopy (ClarendonPress, 1977).

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Available online 1 December 20200584-8547/© 2020 Elsevier B.V. All rights reserved.

Identification and detection of pesticide in chard samples by laser-induced breakdown spectroscopy using chemometric methods

Lucila J. Martino a,*, Cristian A. D’Angelo a, Claudia Marinelli b, Rosana Cepeda b

a UNCPBA, FCE / Centro de Investigaciones en Física e Ingeniería del Centro de la Provincia de Buenos Aires (CIFICEN), Tandil, Argentina b UNCPBA, FCE/ Instituto Multidisciplinario sobre Ecosistemas y Desarrollo Sustentable (CICPBA-UNCPBA), Tandil, Argentina

A R T I C L E I N F O

Keywords: Laser-Induced Breakdown Spectroscopy Pesticide Principal components analysis (PCA) Linear discriminant analysis (LDA) Vegetable

A B S T R A C T

Pesticide residues in food represent a significant threat to consumers. However, the fast detection of traces directly in samples involves a complex task. In this work, we explore the potential application of the Laser- Induced Breakdown Spectroscopy (LIBS) technique for the rapid measurement of pesticide residues in chard leaves by identifying them from the signal recording of the emission lines of P, S, C and Cl. They are subsequently jointly described through a principal components analysis (PCA) and grouping of the samples according to their pesticide was corroborated by means of a linear discriminant analysis (LDA), with an error rate of less than 9.5%. Moreover, differences can be observed in the classification of groups with a 95% confidence level. There is thus, clear evidence of the applicability of this technique as a potential tool for the study of pesticide residues in food matrices.

1. Introduction

The technological evolution of pesticide manufacturing, among other innovations in agriculture, has contributed to enhancing agricul-tural production in keeping pace with the unprecedented increase in the demand for food. However, not only has this development failed to eradicate world hunger, but it has also been achieved at the expense of human health and the environment [1].

In light of the increasing knowledge about the potential dangers associated with the use of pesticides, and the availability of data evidencing their presence in the environment, the need to introduce controls on pesticide residues has become a matter of central concern for society. Against this background, global environmental legislation fixes Maximum Residue Levels (MRLs), which are increasingly stringent regulations for pesticide residues in water and food [2]. These limits are consistently exceeded as a result of the unreasonable application of pesticides, though. Non-compliance with MRLs result in the presence of excessive amounts of pesticide residues in crop products, leading to the accumulation of pesticide traces in the environment, the resurgence and outbreak of resistant pests, and adverse health outcomes due to contaminated food consumption. However, the techniques used for the detection and quantification of these residues require a long procedure, use highly hazardous reagents, and offer no possibility of re-measuring

the same sample [3–6]. The Laser-Induced Breakdown Spectroscopy (LIBS) technique has

made its way as a simple diagnostic technique that allows rapid detec-tion of interest elements in samples, regardless of their aggregation status. It consists in focusing a high-power pulsed laser on the sample surface to generate a plasma of high temperature and electronic density around 1017 cm− 3, hence providing information about the elements that it is composed of at the atomic level. This technique has been applied to various samples in numerous works [7–11]. Some studies have utilized it into the detection of toxic elements present in food [12], and others have especially concentrated on their use for the detection of pesticides and nutrients in samples of fruit and vegetables. Kim et al., 2011 [13], detected nutrient elements and chlorpyrifos (chlorinated pesticide) in rice and spinach, and they also managed to distinguish pesticide contaminated samples from non-contaminated samples by applying multivariate analysis. Multari et al., 2013 [14], studied the application of the LIBS technique to differentiate samples contaminated with different pesticides (hexane, aldrin, chlorpyrifos, dieldrin and HPCDD) in complex matrices (tissue fats and fatty oils). Du Xiaofan et al., 2015 [15], detected chlorpyrifos residues on apple surfaces, but failed to find satisfactory results in samples with low concentrations (1: 100 and 1: 1000). In their last published work [16], they managed to reduce the detection limits using Nanoparticle-enhanced Laser-Induced Breakdown

* Corresponding author at: Pinto 399, (B7000GHG) Tandil, Buenos Aires, Argentina. E-mail address: lucilajmartino@gmail.com (L.J. Martino).

Contents lists available at ScienceDirect

Spectrochimica Acta Part B: Atomic Spectroscopy

journal homepage: www.elsevier.com/locate/sab

https://doi.org/10.1016/j.sab.2020.106031 Received 18 May 2020; Received in revised form 9 October 2020; Accepted 25 November 2020

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spectroscopy. At present, the LIBS technique coupled with multivariate chemo-

metric methods and data analysis is being used as a new tool in the classification of samples. Chemometric techniques such as principal component analysis (PCA) and linear discriminant analysis (LDA) are multivariate statistical methods applied to: reduction of dimensional problems (number of variables), avoiding therefore the loss of essential information; pattern recognition; and characterization of two or more sample groups [17–19]. Although multivariate chemometric analysis techniques are widely applied, specially to food classification [20–23], no studies that implement LIBS in conjunction with chemometric tech-niques for the classification of pesticides in vegetables are currently reported.

The present study evaluated the applicability of the LIBS technique combined with chemometric methods for the rapid detection and dif-ferentiation of pesticides, including herbicides and fungicides, in chard samples. Thus, it studied the feasibility of the LIBS technique for its application as a simple and economical technique in the detection of pesticides in plant matrices. The objectives proposed in this work were: i) to identify the pesticides in contaminated chard samples based on the analysis of the elements that make up the active agents, and ii) to characterize and classify the pesticides by chemometric methods.

2. Materials and methods

2.1. Reagents

The pesticides selected were chlorpyrifos (C9H11Cl3NO3PS), car-bendazim (C9H9N3O2), dimethoate (C5H12NO3PS2), imidacloprid (C9H10ClN5O2) and cypermethrin (C22H19Cl2NO3), obtained from local agronomies. Chlorpyrifos, imidacloprid and cypermethrin are in-secticides, dimethoate is an acaricide, and carbendazim is a fungicide. The active ingredients have a concentration of 250 g/L, 75 g/L, 500 g/L, 200 g/L and 125 g/L, respectively.

These five pesticides are among the ten most present in food in Argentina [24], and the risks that they pose to both white and non-white organisms are known [25–28]. In the European Union, progress has been made in setting Maximum Residue Levels (MRL) of pesticide on foods, following the Codex Alimentarius guidelines [29]. Therefore, depending on the pesticide, most foods contain an MRL value between 0.01 mg/kg to 10 mg/kg. However, these values are rarely reached in consumer foods, in some cases being values up to three orders of magnitude higher [24,30].

2.2. Sample preparation

Chard (Beta vulgaris var. cicla) samples, obtained from a farm where organic produce is grown, were selected for this study without further application of pesticides or fertilizers that could cause interference in measurement.

In order to prepare the samples contaminated with the different pesticides, fresh chard leaves were washed with tap water to remove dirt and microorganisms from their surface. They were then washed with distilled water and dried in an oven at 60 ◦C until constant weight. Once a dry sample was obtained, it was pulverized and sieved through a 60 mesh sieve (250 μm) to secure homogeneous particle sizes, as it is re-ported that particle size distribution critically affects the performance of microanalytical methods [31]. A 2.5 g portion of powdered chard was subsequently mixed and homogenized with 0.75 mL of each pesticide and allowed to air-dry at room temperature. For control purposes, a chard sample was also prepared through the same process, except that it was mixed and homogenized with 0.75 mL of distilled water. Pellets of approximately 30 mm in diameter and 2 mm in thickness were prepared by a compactor at 140 MPa for 1 min. Hence, a more uniform sample surface was achieved to obtain more stable LIBS emissions [32], and the representation of the sample composition in the analytical results was

therefore guaranteed.

2.3. Experimental LIBS

As the experimental setup has been used previously, only a brief description is given here [33,34]. Plasmas were produced in air at at-mospheric and low pressure by focusing a Nd:YAG laser (Continuum Surelite II, λ = 1064 nm, 7 ns pulse FWHM, 100 mJ/pulse, 2 Hz repe-tition rate) at right angles on the surface of the sample, and using a 100 mm focal length lens. The pellets were rotated during measurement to avoid the formation of deeper craters by the ablation process, thus improving reproducibility. The light emitted by the plasma on its brightest region was collected at right angles in the direction of the laser beam using a 100 mm focal length quartz lens, for lines in the UV spectrum, while 200 mm focal length BK7 lenses were used for lines in the visible spectrum, and then focused into the entrance slit of a spec-trograph (Jobin Yvon THR 1500, Czerny-Turner configuration, resolu-tion of R = 300,000 in double passage at λ = 300 nm, 1.5 m focal length, 2000 lines/mm holographic grating). A certain opening of the entrance slit of the spectrograph allows the registration of a corresponding cross section of the plasma, which guarantees the total integration of the line in our acquisition method. Where, the section of the observed plasmas refers to the signal recording of a given portion (a volume) of the whole plasma. The diffracted light was detected with a photomultiplier (Hamamatsu R928) and its signal was time-resolved and averaged with a Boxcar (Princeton Research Systems Inc. modules SR 280, SR 250, SR 200 and SR 245) that opened up the possibility to set post-breakdown time and gate time.

Low-pressure conditions were achieved through a vacuum chamber with a mechanical pump that reached a pressure of the order of 0.45–0.75 Torr. A diagram of the vacuum chamber used is shown in Fig. 1. Performing LIBS on a surface at low pressure results in enhanced spectra and improved ablation [35]. Specifically, this enhancement in-volves an increase in spectral intensity, spectra signal-to-noise (S/N), spectral resolution, increased ablation, and increased uniformity of the density and temperature within the plasma.

2.4. Acquisition of LIBS data

A method of optimal integration was implemented for the acquisition of the LIBS signal recorded, in order to improve and simplify analytical measurement. This method consisted of exploiting the photomultiplier’s high sensitivity and the temporal resolution for the analysis of the signal allowed by the boxcar and the high resolution of the monochromator. It was used as a full-line integration spectrograph so that it was possible to integrate the entire profile of a line into each plasma produced, and though it did not show any detail about them, it did reveal the total intensity. For each element, the portion of the spectrum that contains only the chosen line was selected and fully registered by the photo-multiplier. In addition, the width of the output slit was defined ac-cording to the linear dispersion of the monochromator on its plane. This was done to avoid that the photomultiplier registered a line or signal different to that of the element being studied. This permitted a quick analysis, minimal destruction of the sample (fewer laser shots), as well as a greater acquisition of data about line intensities to perform a good

Fig. 1. Vacuum chamber used for recording low-pressure elements.

L.J. Martino et al.

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statistic and improve the repetitiveness limitation of LIBS. Concurrently, preliminary tests were conducted to determine the

optimal values for the following parameters: choice of emission lines, post-breakdown time and gate time, number of plasma records, sections of the plasma to be observed (discrimination in the plasma image on the plane of the entrance slit), and spectral portion to be integrated (depending on the width of the exit slit and the linear dispersion of the monochromator, corresponding to the wavelength of the recorded lines).

Differences between pesticide properties cause differences between matrices, making data processing necessary. To this end, the line records obtained were normalized with respect to a measured background to acquire data on the same scale [36,37]. The recorded spectra were processed in a computer using Microcal Origin software.

2.5. Data statistical analysis

PCA was used with the variables P, S, C and Cl in order to analyze the co-variation structure and to reduce the information dimension

LDA was applied to seek linear relationships between our continuous variables that best discriminate the groups to which the sample units were pre-assigned. This procedure generates homogeneous groups ac-cording to the function that classifies them. The assignments of the discriminant function may or may not coincide with the pre-assignment, from which a cross-classification table can be constructed between the assignment made by the method and the one made by the researcher.

Finally, a multivariate analysis of variance (MANOVA) was per-formed by using the Hotelling test to detect significant differences be-tween the groups, considering a 95% confidence.

R Core Team (2016) [38] and InfoStat (2018) were used as softwares for statistical analysis.

3. Results and discussion

3.1. Pesticide identification from LIBS signals

In order to perform the differentiation of the pesticides, the emission lines of the elements P, S, C and Cl were recorded. Hence, it was possible to indirectly detect the pesticides by measuring these elements that may be present in different proportions in the pesticides used for this study (Section 2.1). In the first instance, it was necessary to carry out a study on the emission lines of the selected atomics elements. For this, a search was made in the atomic spectra database of the National Institute of Standards and Technology [39]. In Table 1 the selected lines can be seen with their spectroscopic data

As can be seen in Table 1, the excitation energies corresponding to the transitions of the selected lines are very high. This means great difficulty when observing the corresponding emissions of these elements present in the samples with low concentration. Moreover, the most intense lines of the Cl and S are found in the vacuum ultraviolet spectral

region (VUV), impossible to record with an experimental setup that contemplates some versatility.

There are recent works that have already observed this limitation and chose to overcome them in different ways. Zhang et al. [40] com-pares measurements with traditional LIBS and the possibility of incor-porating LIBS combined with resonance Raman scattering (LIBS-RRS) in the quantification of S I, achieving a very acceptable improvement in element detection. For this they implemented an experimental LIBS scheme at atmospheric pressure and irradiated the plasma with an OPO laser (optical parametric oscillator (OPO) wavelength-tunable laser) to record Raman emission. Timur et al. [41] quantitatively determined concentrations of Cl, S and C in concrete structure, taking into account the importance of these elements in corrosion. For this they had to apply the LIBS technique with double pulse, observing lines in the visible, UV and IR spectrum. In a very recent work, Fernandez et al. [42] they temporarily studied the molecular emission of CaF together with the atomic emission of Ca in different plasma regions, achieving a new method for the quantitative analysis of F.

On the other hand, the experimental conditions and the measure-ment times were chosen for each element after an exhaustive study that enabled us to find the best experimental conditions for this work, so that maximum intensity was guaranteed, and the lines were found in relative isolation and free from interference with lines of other elements likely to be present in the samples (Table 2).

The measurement times for each element were obtained through a study of the integrated emission line over time. Signals were recorded for a given gate time, and the variations in intensities over time were studied to find experimental conditions where it is possible to achieve optically thin plasma conditions [37]. As a result, the intensity was proportional to the concentration of the element in the sample, due to low concentration of emitters, and relatively high excited energy levels for the recorded emission lines.

Hydrogen, nitrogen and oxygen were not measured on account of the experimental conditions.

For the case of Cl and S, their determination is hindered at atmo-spheric pressure due to the high energies of the excited electronic levels [39]. Therefore, the experimental conditions were operated at low pressure according to the diagram that was already described in Fig. 1. In the works found in the literature [15,16,43], it has been demonstrated that the detection of Cl in samples is achieved by studying the emission line 837.6 nm. However, in this work we decided to study the 725.6 nm line because of the specifications of the monochromator used, which does not allow observation of lines longer than 800 nm (spectral range 200–800 nm). C was also chosen to be measured at low pressure to reach a better observation of the 415.3 nm line, instead of the 247.8 nm line observable at atmospheric pressure. In the case of P, the 253.6 nm line and atmospheric pressure were selected for measurement because of the limitations of observing lines below 300 nm with the vacuum cell: it is made of BK7 glass, which totally attenuates the signal below such wavelength. Furthermore, this line showed satisfactory records for

Table 1 Spectroscopic data of the selected lines.

P I S II C I Cl I

Selected lines (nm)

253.60 416.26 415.33 725.66

Transition probability (s− 1)

9.5e+07 2.3e+08 – 1.5e+07

Ej (eV) 7.2127021 18.921905 7.94627039 10.6297964 Ei (eV) 2.324457 15.944264 10.930438 8.9216999 gj 4 10 7 4 gj 4 8 5 6 Upper level 3s23p2(3P)4

s - 2P 3s23p2(3P) 4d- 4F

2s22p7 - 3D 3s23p4(3P)4p - 4S◦Conf-terms

Lower level 3s23p3 - 2P◦ 3s23p2(3P)4p - 4D◦

2s2p3 - 3D◦ 3s23p4(3P)4 s - 4P Conf-terms

Table 2 Spectroscopic parameters for the detection of elements in the study samples using the LIBS technique. Spectral integration was estimated from the integrated portion of the spectrum in the exit slit from spectrograph.

P I S II C I Cl I

Selected lines 253.60 nm 416.26 nm 415.33 nm 725.66 nm Experimental

condition Atmospheric pressure

Low pressure

Low pressure

Low pressure

Post-breakdown time

8 μs 300 ns 400 ns 250 ns

Gate time 15 μs 4 μs 4 μs 4 μs Entrance/exit slit

width 300/300 μm 300/300

μm 300/300 μm

300/300 μm

Spectral integration

0.049 nm 0.046 nm 0.046 nm 0.034 nm

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detection. A significant amount of data based on the standard deviation of the

measurements compared to the instrumental uncertainty of the equip-ment, was collected in order to reach the optimal number (final statis-tical uncertainty below the experimental one). 40 signal records of each element in each sample were acquired, as well as backgrounds which are records made in a spectral area near the line without interference from other lines to obtain a net signal record of each element. This was the optimal number of data records to provide good data repeatability. Fig. 2 presents an example of the P I emission line profile taken at at-mospheric pressure and the graph obtained from the new measurement method described in Section 2.4 for the chard sample contaminated with chlorpyrifos.

Signals of P, S, C and Cl were measured both in the chard samples contaminated with the selected pesticides and in the control sample. The data set obtained was subsequently used in the application of chemo-metric analysis for the characterization and classification of pesticides according to the study variables.

3.2. Pesticide characterization

A PCA was performed to explain the variation of the data by reducing

the dimension (Fig. 3). The first two principal components recover 77% of the variation. The direction of greatest variation is explained by P and S, and the second direction by Cl and C, the analysis revealed that the control samples were characterized by low values of all the measured variables, as expected. Dimethoate samples were characterized by high

Fig. 2. a) P I emission line profile (253.6 nm) recorded with 80 μm entrance/exit slit width and b) graph obtained from the new measurement method described in Section 2.4 for the chard sample contaminated with chlorpyrifos.

Fig. 3. Biplot of the principal component analysis (PCA) for samples contam-inated with different pesticides and the control sample.

Fig. 4. Linear discriminant analysis (LDA) representation display by pesticide.

Table 3 Correlation of PC1 and PC2 with the original variables.

PC1 PC2

P 0.92 0.16 S 0.92 0.02 C − 0.29 0.75 Cl 0.06 0.83

Table 4 Discriminant functions - standardized data with common variances.

LDF1 LDF2

P 0.56 0.12 S 0.82 − 0.21 C − 0.20 − 0.11 Cl 0.18 1.01

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values of P and S and low values of C and Cl (close to average). As for imidacloprid, carbendazim and cypermethrin, it was observed that there was a narrow separation between them, that they presented low values of P and S, and that those samples were variables regarding C and Cl. Finally, chlorpyrifos showed intermediate values of S and P, and high values of Cl and C, these descriptions are consistent with the correlation between these variables PC1 and PC2, and samples coordinates (Table 3).

The samples were grouped according to pesticide or control, and thus seven groups were generated.

To corroborate the grouping, and explain them by mean of canonical linear functions, an LDA (Fig. 4) was applied. For this case particularly, each unit of analysis was pre-assigned to the control group or to the pesticide that was added; the variables used for classification were P, S, C and Cl.

The samples were projected onto the canonical plane, which re-constructs 82.57% of the information.

Canonical discriminant functions were standardized by common variances so that no variability group masked the separation between them. Canonical discriminant functions are constructed as a linear combination of the original variables and the scalar coefficients are shown in Table 4. The percentage error of the classification achieved with LDA is 9.5%. It was observed that the imidacloprid group was the most variable: 8 out of the 40 samples were poorly classified (in Fig. 4, it is observed that the crosses, corresponding to this group, are distributed in quadrants 1, 2 and 3). Moreover, the control had a number of discordant samples: 6 out of 40, distributed between quadrants 2 and 3, which is relatively high. This indicates that the group of chard without pesticide is very heterogeneous, even more than imidacloprid (Table 5).

To analyze significant differences between group centroids, MAN-OVA was applied. Hotelling test detected significant differences between groups with a 95% confidence level (Table 6).

4. Conclusions

In conclusion, the feasibility of the LIBS technique for the identifi-cation of pesticides in green leafy vegetable matrices was explored in this work through the evaluation of the elements that make up the active agents, and the subsequent classification through the use of chemo-metric techniques. The results of LIBS signal records were successful, permitting the identification of P, S, C and Cl in all the selected samples and in the sample used for control purposes, after a detailed study of the emission lines. LDA verifies that pesticides are separated with a low percentage of classification error (9.5%). The corroboration of the

results already obtained was thus possible. Finally, a MANOVA was applied and it was found that there were significant differences between groups with a 95% confidence level.

In view of the limitations in the detection of pesticide residues in plant samples, the analysis is proposed as a potential tool for rapid, simple monitoring that does not generate the hazardous waste currently produced by traditional methods. Although the limit of detection and quantification are high, work is being done to achieve limits according to the established range for pesticides and the results will be presented in future publications. This work is an exploration of the detection of ele-ments of difficult determination by LIBS technique as a potential tool for the study of pesticide residues in food matrices.

Funding sources

This work received funding support from Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnicas (CONICET) and Comision de Investigaciones Científicas de la Provincia de Buenos Aires (CICPBA).

Declaration of Competing Interest

The authors have declared no conflict of interest.

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Table 6 Multivariate analysis of variance (MANOVA) summary table reporting the result of significant differences between groups of pesticides and control.

Pesticide P C S Cl n

Control 0.02 0.33 0.02 0.01 40 A Dimethoate 0.05 0.50 0.65 0.01 40 B Imidacloprid 0.02 0.63 0.04 0.05 40 C Carbendazim 0.02 0.68 0.01 0.01 40 D Cypermethrin 0.03 0.66 0.15 0.07 40 E Chlorpyrifos 0.04 0.54 0.32 0.09 40 F

Means with a common letter are not significantly different (p > 0.05).

Table 5 Cross- classification results from Linear discriminant analysis (LDA).

Group Carbendazim Cypermethrin Chlorpyrifos Control Dimethoate Imidacloprid Total Error (%)

Carbendazim 38 0 0 0 0 2 40 5.00 Cypermethrin 0 36 0 0 0 4 40 10.00 Chlorpyrifos 0 2 38 0 0 0 40 5.00 Control 2 1 0 34 0 3 40 15.00 Dimethoate 0 0 1 0 39 0 40 2.50 Imidacloprid 4 4 0 0 0 32 40 20.00 Total 44 43 39 34 39 41 240 9.58

L.J. Martino et al.

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L.J. Martino et al.

Diagnostics of laser induced plasmas at late delaytimes

L. J. Martino * and C. A. D'Angelo

The study of the diagnostics of plasmas produced by a laser is not always possible without enough data;

usually a precise record of several lines meeting certain spectroscopic conditions is needed. In this work,

a method for diagnosing plasmas was implemented at sufficiently late postbreakdown times, where it is

no longer possible to apply known methods (e.g. Boltzmann plot for the estimation of kT), through an

iterative algorithm that uses the parameters obtained by traditional methods at early times (LIBS typical

delay time) and a minimum number of lines visible at the late times. Using the late times that are typical

to the plasma's final life stage, evolution of the temperature and electronic density of the plasma is

studied. The LTE condition was also verified by McWhirter's criterion.

1. Introduction

Laser-induced breakdown spectroscopy is a useful and simpleanalytical diagnostic technique for the qualitative and quanti-tative determination of the chemical composition of liquid,solid and gaseous samples.1–3 In this technique, records ofatomic emission lines from a plasma created by a high powerpulsed laser focused in or on the surface of a sample are madeand analyzed. A detailed description of the LIBS technique hasalready been reported in the extensive literature.4–7

To optimize the analytical capacity of this technique it isnecessary to characterize the LIBS plasmas. This diagnosticprocess includes the evaluation of characteristic parameters inplasma physics such as the estimation of temperature andelectronic density. There are several studies on this subject inthe literature.8–10

Temperature plays a fundamental role in physical charac-terization of the plasma. This parameter is needed to describeseveral characteristics such as relative population of energylevels, particle velocity distribution, electronic density andpopulation densities of elements in their different ionizationstates.

There are known methods for temperature calculation, forexample, the Boltzmann plot and Saha–Boltzmann plot. Butboth methods share certain limitations when implementing thethin plasma model, such as: the observation of a certainnumber of lines with well-studied spectroscopic data, thehypothesis of plasma in Local Thermodynamic Equilibrium

(LTE) and homogeneity and low self-absorption (under thickoptics).11,12

In the detection of certain elements, as in the case of halo-gens, the recording of lines by LIBS is very complex. There areelements that have a few recordable emission lines in the visibleregion, while a few observables are outside this region (usuallyin UV spectra). This is mainly due to the fact that certain levelsof the transition lines are excited, and therefore the lines areonly observable in very special experimental situations. Thesesituations include complex experimental arrangements witha high vacuum, low self-absorption and thin plasma conditionsand very specic temperatures to achieve high densities of theemitters with the required populations of energy levels.

Based on these conditions and limitations, this paperproposes a plasma diagnostic technique for relatively advancedpostbreakdown times, where the intensities of atomic linesnecessary to make an estimation by more known methods areweak and/or impossible to observe.

For the estimation of these parameters, a simple calculationscheme was implemented, using data recorded at a time suchthat the observed lines allow making a diagnosis by traditionalmethods, and then the data were applied to the times of interestwith a minimum number of observable lines. In this way it ispossible to analyze the evolution of the main parameters ofdiagnosis.

2. Materials and methods2.1 Description of the proposed method and theoreticalcalculation

(i) First stage: estimation of parameters at early times bytraditional methods. The Boltzmann plot is a traditionalapproach for temperature calculation that starts with theapplication of the Boltzmann distribution equation. For this, it

Centro de Investigaciones en Fısica e Ingenierıa del Centro de la Provincia de Buenos

Aires (CIFICEN), CONICET, CICPBA, Fac. Cs. Exactas UNCPBA, Campus Universitario,

Pinto 399, B7000GHG, Tandil, Buenos Aires, Argentina. E-mail: lucilajmartino@

gmail.com; Tel: +54-249-4439660; +54-249-4439661

Cite this: J. Anal. At. Spectrom., 2020,35, 1003

Received 20th December 2019Accepted 9th April 2020

DOI: 10.1039/c9ja00439d

rsc.li/jaas

This journal is © The Royal Society of Chemistry 2020 J. Anal. At. Spectrom., 2020, 35, 1003–1010 | 1003

JAAS

PAPER

must be assumed that the plasma is optically thin and that it isin local thermodynamic equilibrium (LTE).12,13 From thisapproach, the expression of the intensity is considered asa function of wavelength,6 and by grouping conveniently it ispossible to reach eqn (1),

ln

lji

3 It

Aji gj

!¼ � 1

kTt

Ej þ ln

hc2L

2 QkðTtÞ Nkt

!(1)

where, It is the emission intensity for a postbreakdown time t, ljiis the wavelength of the transition line ij, Ej is the energy of theupper level j, Aji is the probability of spontaneous transition, gjis the statistical weight of the upper level, T is the temperatureof the plasma, k is the Boltzmann constant, h is the Planckconstant, c is the speed of light, L is the thickness of the plasmain the direction of observation, Nkt is the density of the emittersin the plasma for a postbreakdown time t and Qk(Tt) is thepartition function of the element involved in a certain ioniza-tion state for a postbreakdown time t.

Then, for each recorded line, ln

lji

3 IlAji gj

!is plotted as

a function of the energies of the upper levels Ej of the transitioninvolved in the emission. From this process, it is possible toestimate the temperature of the plasma using a linear regres-sion of the points recorded, where the line has a slope value of

� 1kTt

.

An estimation of the electronic density is made from theFWHM (Full Width at Half Maximum) of the Lorentzian function(wL) which contributes to the Voigt prole of the recorded lines.This broadening is fundamentally caused by the Stark effect, andis directly related to electronic density.14 On the other hand, theGaussian broadening contribution to the prole of recorded linesis mainly due to the instrumental function, neglecting othertypes of phenomena present in the plasma such as the Dopplereffect, whose estimated width for the lines of this work arenegligible compared to the instrumental width.15

In this way, for a given line and given temperature, a directrelationship between the Lorentzian width and the electronicdensity was estimated. Consequently, the expression used toestimate the electronic density value for a postbreakdown time twill be given by:

netðkTtÞ ¼ n0e

w0LðkTÞwLt

(2)

where the values of w0LðkTÞ are given by an adjustment function

tabulated from the data of Lorentzian widths with temperatureand correspond to a given n

0e for each particular line.14,16

(ii) Second stage: estimation of parameters at late times. Inthe second stage, the calculation procedure involves parametersthat will be estimated by traditional methods (i) and applied tothe time records under study (relatively advanced postbreak-down times), where the plasma is cooler.

In this case, both the temperature and the electronic densityare estimated from a calculation process as described below.

Having rst identied a ne line in the rst stage and whichcan also be observed over long periods, it is proposed to

establish a relationship between the optically thin plasmaequations for both times, eqn (3),

Ia

Ib¼ e�ðEj=kTaÞ

QðTaÞQðTbÞ

e�ðEj=kTbÞNkaðkTa; neaÞNkbðkTb; nebÞ (3)

In this case, the subscript t (postbreakdown time) in eqn (1)and (2) was replaced by the subscripts a and b, which indicatethat the parameters are related to the early time delay (refer-ence) and the study time (late), respectively.

In eqn (3), the densities of the emitters Nka,b are related to thetemperature and electronic density, which in turn depend onthe time in the evolution of the plasma. In this case, we mustconsider the following expressions with certainapproximations:

- The expression that involves the total concentration ofa certain element as a function of the different concentrationsof the ionization states,

Nka,b¼ (Nmolec + NI + NII + NIII)ka,b (4)

The subscripts I, II and III indicate the neutral, once andtwice ionized species of the element and Nmolec is the density ofneutral atoms that are part of the possible molecules. Given thetypical temperatures considered in these plasmas, Nmolec isnegligible.

- The relationships between densities of ionization states,

S12 ¼ NII

NI

ne (5)

and

S23 ¼ NIII

NII

ne (6)

The last two equations refer to ratios between the concen-trations of different consecutive ionization degrees and arerelated to Saha's formula,6,14 given by:

neNz

Nz�1

¼ Sz�1 ¼ QZðTÞQz�1ðTÞ

ð2pmokTÞ32

h3e�ðcz�1=kTÞ (7)

In this notation, z is the number of electronic charges whichthe radiating electron “sees”. Therefore, the z�1 index indicatesthat the net charge of an atom or ion cz�1 is the ionizationenergy of the atom or ion in question.

The expression for density Nka,b is calculated by solvingequations eqn (4)–(6). In the case of a line of an element onceionized (as it was in this work), the density NIka,b will beexpressed by,

NIka;b ¼�

N ne2

ne2 þ ne S12 þ S12S23

�ka;b

(8)

From this expression, and taking into account that the totaldensity of the elementN remains constant over time, it is possibleto rewrite the equation eqn (3) in the following way:

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Ia

Ib¼ e�ðEj=kTaÞ

QðTaÞQðTbÞ

e�ðEj=kTbÞ�ne

2

ne2 þ ne S12 þ S12S23

�a

�ne

2 þ ne S12 þ S12S23

ne2

�b

(9)

The electronic density is determined in the same way as inthe rst stage. In this stage, the calculations should be madeconsidering a line with Stark broadening data and observable inthe time record b.

Finally, to estimate the parameters of kT and ne, the systemof equations given by eqn (2) and (9) should be solved, using theLorentzian widthswL and the intensities of the reference lines Iaand Ib as experimental data.

In turn, the nal results of temperature and electronicdensity were veried by the McWhirter criterion,17 using:

ne $ T1/2e (Ej � Ei)

3 � 1012 eV�3 K�1/2 cm�3 (10)

where Ej � Ei is the energy difference between the upper level jand the lower level i.

Several studies used the McWhirter criterion to verify if theplasmas were in LTE.18–21

2.2 Experimental

To estimate the parameters of the plasma an experimentalconguration consisting of a monochromator with goodspectral resolution was used, which allows detailed

measurement of the individual line proles. This diagram canbe seen in Fig. 1. The plasmas are produced at atmosphericpressure when focusing a Nd:YAG laser (Continuum SureliteII, l¼ 1064 nm, 7 ns pulse FWHM, 100 mJ per pulse, repetitionrate 2 Hz) at right angles to the surface of the sample usinga 100 mm focal length lens (L1 in Fig. 1). The light emitted bythe plasma at its brightest region was collected at right anglesto the direction of the laser beam using a 200 mm focal lengthlens (L2 in Fig. 1) in the input slit of a spectrograph (JobinYvon THR 1500, Czerny–Turner conguration, resolution0.01 nm in double step at l ¼ 300 nm, focal length 1.5 m,holographic network of 2400 lines per mm). The detector wasa photomultiplier (Hamamatzu 1P28) whose signal was solvedin time with a boxcar averager (Boxcar Averager PrincetonResearch Systems Inc. modules SR 280, SR 250, SR 200, and SR245), with the possibility of choice of postbreakdown time(delay time) and window (gate time).

In the rst stage of calculations a single postbreakdown timewas considered (time delay), while in the second phase differentdelay times were taken (with a xed gate time) in order toanalyze the evolution of the parameters that dene the plasma.In all cases the gate time was 200 ns.

Each line prole was recorded from 180 laser shots, scan-ning a fraction of the 0.1 nm spectrum. The error values of theintensity settings of each line come from the standard deviationdata with the proposed adjustment functions.

Also, for the two types of measurements, different sets ofinputs and outputs of the monochromator were considered. In

Fig. 1 LIBS experimental scheme used in the work.

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both cases, the corresponding instrumental proles werecalculated for use in the nal calculations.

A sample of 13.5 g of dry soil sieved with #20 840 mm meshwith 2 ml of distilled water was used to obtain the line records.The mixture was pressed at a pressure of 138 MPa to forma pellet. The sample was obtained from soil in the Pampasregion (Argentina).

3. Calculation

First, it is necessary to have precise parameters obtained bytraditional methods. In our case, it was possible to make a gooddiagnosis at “early” times (in the order of microseconds),applying a determination of parameters by typical methods ofplasma spectroscopy as explained in Section 2.1.

3.1 Obtaining of previous parameters by traditionaldiagnostics at early times

In this case, for the application of the Boltzmann plot, line recordsof Fe I were analyzed, between 300 and 500 nm, with a post-breakdown time of 8 ms and gate time of 200 ns. The spectroscopicdata of the selected lines,22 together with the intensities of theexperimentally recorded areas, are shown in Table 1.

Each intensity value is given by the average of the calculatedareas of three prole records of the selected lines. The error barscorrespond to the standard deviation of these areas.

The Boltzmann plot for the experimental data can be seen inFig. 2. With this analysis, a temperature of kT ¼ 0.98 � 0.12 eVwas estimated.

For the calculation of the electronic density at this time theline 280.27 nm of Mg II was analyzed. In Fig. 3 the averagerecorded prole is shown and in Table 2 the result is shown. Thechoice of this line was justied by a previous study, where therelationship of integrated intensities of the doublet (279.55/280.27) nm (transition 2p6 3p2 P0–2p6 3s2 S) was studied andrepresents the best approximation of the model of thin plasma.23

The Gaussian width wG of the Voigt setting was estimated forthe corresponding instrumental function, calculated from thewidths of slits and specications of the monochromator used,and for a wavelength of the order of 280 nm.

The expression of w0LðkTÞ within the equation eqn (2), was

possible to determine from the tabulated data tting functionfor the line in question and with n

0e ¼ 1016 cm�3:16 The best t is

a potential function expressed as:

w0LðkTÞ ¼ a1kT

a2 (11)

where the values of a1 and a2 are 0.01877 and 0.4175, respec-tively, for temperatures in the range of 0.4 to 1.7 eV. With thetemperature calculated above, it was possible to estimate anelectron density of approximately ne ¼ (4 � 1) � 1017 cm�3.

3.2 Diagnostics at late times

In this stage, to estimate the temperature by the methoddescribed in theory, the line 432.57 nm was considered, which

Table 1 Fe I emission line measurements and their experimental data

lji (nm) Aji (s�1) gj Ej (eV) Ik (u.a.)

374.826 9.15 � 106 5 3.41 695 0.13 546 � 0.001393.029 1.99 � 106 7 3.24 097 0.04 768 � 0.001432.57 5.16 � 107 7 4.4732 0.1386 � 0.001489.07 2.25 � 107 5 5.4098 0.01 391 � 0.001489.14 3.08 � 107 7 5.3852 0.01 885 � 0.001495.75 4.22 � 107 11 5.3084 0.05 933 � 0.001

Fig. 2 Boltzmann plot based on the experimental data of Table 1, withprofiles recorded in 8 ms. The estimated temperature was kT ¼ 0.98 �0.12 eV. The error bars correspond to the standard deviation of theareas recorded.

Fig. 3 Profile of the emission line of Mg II (280.27 nm) with its Voigtprofile, for a time of 8 ms.

Table 2 Data from the adjustment by the Voigt profile for calculationof electronic density at 8 ms. Line 280.27 nm of Mg II

Parameter Values (nm)

xc 280.27 (Mg II)wG 0.0049 � 0.0010wL 0.015 � 0.010

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is one of the most intense in the Fe I spectrum, already used forthe analysis of the Boltzmann plot, at td ¼ 8 ms. On the otherhand, for the estimation of the electronic density by Starkbroadening, the analysis of the line 324.75 nm of Cu I wasconsidered.

For this last calculation it was not possible to implement the280.2 nm line of Mg II (used for the rst time), since it waspractically impossible to record it aer td ¼ 90 ms. It is alsoworth noting that it was not possible to use the line 324.7 nm ofCu I in td ¼ 8 ms because it was noticeably widened byabsorption.

The experimentally recorded lines were adjusted by Voigtproles, in this case a Gaussian contribution with a width of0.0095 nm was considered, corresponding to the instrumentalprole for a wavelength of the order of 325 nm and the widths ofslits used in these records.

For the function w0L ¼ w

0Lðn

0e; kTÞ , the broadening estima-

tion was implemented according to Griem's calculations forcollision processes, reaching an expression similar to the eqn(11), with a1 and a2 equal to 0.0085 and �0.5, respectively,for n

0e ¼ 1016 cm�3:

For the nal calculations of kT and ne explained above, weproceeded to create an algorithm for this purpose that was

Table 3 Summary of methods used and lines chosen for the calculation of temperature and electronic density at early and late delay times

Time delay kT ne

8 ms Boltzmann plot, Fe I: 374.82 nm, 393.02 nm, 432.57 nm, 489.07 nm, 489.14 nm, 495.75 nm Stark broadening, Mg II: 280.25 nm40–120 ms Algorithm application, resolution of eqn (2) and (9), Fe I: 432.57 nm. Cu I: 324.75 nm

Fig. 4 (a) Fe I emission line profile (432.5 nm), with its Voigt profile, for three different postbreakdown times. (b) Intensities as a function of time.The error bars correspond to the standard deviation of these areas.

Fig. 5 (a) Examples of profiles of the line Cu I 324.7 nm, with its Voigt profile, recorded at different postbreakdown times. (b) Results of Lorentzianwidths calculated from the line profiles with Voigt settings for the different postbreakdown times. Error bars have been estimated fromcalculations described in the text.

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executed with the Microcal Origin® platform. It allows solvingthe system of equations, eqn (2) and (9), cited in Section 2.1 andobtaining the desired results in an iterative way.

To summarize, Table 3 shows the methods used and lines ofelements chosen for calculating the estimates of temperature

and electronic density at the stipulated delay times. It should benoted that for late times the applied algorithm ran the datausing the set of equations eqn (2) and (9).

4. Results and discussion

In Fig. 4a and b, for example, records the line proles fordifferent times and intensities post breakdown of the line Fe I432.5 nm can be observed. Each intensity value is given by theaverage of the calculated areas of three prole records of theselected lines. The error bars corresponded to the standarddeviation of these areas.

In Fig. 5a some of the line proles at different postbreak-down times of the line Cu I 324.7 nm used for estimate calcu-lations over last times are shown. Fig. 5b shows Lorentzianwidths calculated from Voigt postbreakdown proles fordifferent times. For the uncertainty calculations of wL, therelationship between the widths in the convolution of the Voigtprole24 and the propagation of errors were taken into account.

4.1 Application of the proposed model

In order to corroborate the proposed calculation procedure, eqn(2) and (9) are used for the calculation of the electronic densityand temperature estimation by calculating parameters assummarized in Table 3. The Gaussian width wG was estimatedfrom the instrumental prole, calculated from the widths ofslits and specications of the monochromator used for thisrecord, corresponding to a wavelength of 280 nm and 325 nm(0.092 nm for the wG).

From the previous records and the data of line intensitiesand widths it was possible to estimate the temperatures andelectronic densities as a function of time. All the results aresummarized in Fig. 6a and b.

At 120 ms it was possible to estimate an extremely lowtemperature of 0.32 � 0.02 eV.

4.2 LTE verication

In the estimation of kT and ne it is important to verify that theLTE condition is met in each case, for which the McWhirtercriterion given by the condition described in eqn (10) wasapplied.

Fig. 6 (a) Evolution of electronic density at non-usual times used inLIBS. Error bars correspond to the uncertainties propagated. (b)Evolution of the temperature at non-usual times used in LIBS. Errorbars correspond to the uncertainties propagated.

Table 4 McWhirter's criterion obtained for validating LTE conditions

tdelay (ms)

Estimated parameters McWhirter limit condition and LTE verication

ne (cm�3) (�1017) kT (eV) Cu I 324.7 nm (�1015) LTE Cu Fe I 432.5 nm (�1015) LTE Fe

40 2.70 � 0.17 0.54 � 0.02 4.41 � 0.31 3 1.86 � 0.18 3

50 2.38 � 0.23 0.52 � 0.02 4.32 � 0.30 3 1.82 � 0.17 3

60 1.81 � 0.18 0.50 � 0.02 4.24 � 0.31 3 1.79 � 0.16 3

70 1.79 � 0.38 0.47 � 0.02 4.12 � 0.26 3 1.74 � 0.18 3

80 1.34 � 0.23 0.46 � 0.02 4.06 � 0.25 3 1.72 � 0.18 3

90 1.15 � 0.15 0.41 � 0.02 3.83 � 0.23 3 1.62 � 0.16 3

100 0.32 � 0.02 0.39 � 0.02 3.74 � 0.20 3 1.58 � 0.15 3

120 0.09 � 0.03 0.31 � 0.02 3.36 � 0.23 3 1.42 � 0.14 3

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Based on this condition, calculations were established forthe Cu and Fe lines involved in non-usual time parameterestimates. Table 4 shows the results calculated for the post-breakdown times dened in this work.

From this analysis it is possible to see that the electronicdensity at all delay times exceeds the LTE limit by approximatelytwo orders of magnitude. The plasmas produced satisfy thecondition of LTE in all cases. Therefore, the self-absorption ofatomic emission lines is signicantly negligible and the plasmais homogeneous.

5. Conclusions

It was possible to apply a LIBS plasma diagnostic calculationmethod at relatively advanced postbreakdown times. By takinginto account all the possible functional parameters in thebehavior of the plasma it was possible to make a diagnosis of itsevolution, and it was mainly possible to estimate the tempera-ture and electronic density by a non-traditional method, esti-mating values of the parameters that are not usual in LIBSplasmas, such as between 40 ms and 120 ms.

The method used parameters calculated at early and usualLIBS postbreakdown times, such as 8 ms, and then a methodbased on recording and analysis of observable lines at the timesof interest was applied. This method used the thin plasmaapproximation and line broadening by the Stark effect.

Through the application of an iterative algorithm it waspossible to study the time evolution of the estimated data withpostbreakdown times between 40 ms and 120 ms.

At such a late postbreakdown time such as 120 ms it waspossible to estimate a low temperature of 0.32 eV. In turn, theestimated kt and ne values were veried using the McWhirtercriterion for compliance with the LTE.

Conflicts of interest

There are no conicts to declare.

Acknowledgements

This work was supported by the National Council of Scienticand Technical Research (CONICET) and the Commission ofScientic Investigations of the Province of Buenos Aires(CICPBA).

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