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UNIVERSIDAD DEL SALVADOR
Carrera de Veterinaria
Trabajo final
Práctica Final Orientada: Producción Animal
Aislamiento de Escherichia Coli patógena en
cerdos a partir de una mortandad en un criadero
de la Provincia de La Rioja
Alumna: Fernandez Carolina C.
Profesor tutor: Méd. Vet. Jorge Miquet
AÑO 2016
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Índice
Resumen………………………………………………………………………. Pág. 3
1- Introducción……………………………………………………….............. Pag.3
1.1 Agente etiológico…………………………………………………………. Pág. 8
1.2 Diarrea por E. Coli y enfermedad de los edemas……………………. Pág. 8
1.2.1 Epidemiologia…………………………………………………………....Pág. 9
1.2.2 Patogenia……………………………………………………………….. Pág. 9
1.2.3 Signos clínicos………………………………………………………… Pág. 11
1.2.4 Lesiones………………………………………………………………. Pág. 12
1.2.5 Diagnostico……………………………………………………………. Pág. 12
1.2.6 Tratamiento……………………………………………………………. Pag. 13
1.2.7 Prevención y control………………………………………………….. Pag. 13
1.3 Contaminación ambiental y zoonosis…………………………………. Pág. 15
1.4 Objetivos…………………………………………………………………. Pág. 16
1.5 Hipótesis…………………………………………………………………. Pág. 16
2- Materiales y métodos…………………………………………………….. Pág. 17
2.2 Procedimientos………………………………………………………..... Pág. 17
3- Resultados………………………………………………………………... Pág. 24
4- Discusión…………………………………………………………………. Pág.24
5- Conclusión………………………………………………………………. Pág. 24
6- Bibliografía………………………………………………………………. Pág. 24
7- Anexos……………………………………………………………………. Pág. 27
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Resumen
Dos afecciones de gran importancia que se evidencian en los criaderos de cerdos son
diarrea en maternidad y post-destete y enfermedad de los edemas, producidas por
cepas patógenas de Escherichia coli, que provocan grandes pérdidas económicas.
El vertido de efluentes al medio ambiente, los cuales muchas veces no están tratados o
lo están de manera insuficiente, constituyen un potencial reservorio de agentes
patógenos contaminantes del agua y los alimentos.
En el presente trabajo, se pretende conocer la prevalencia de cepas patógenas de
Escherichia coli productoras de diarrea en maternidad y post-destete y enfermedad de
los edemas, como así también su sensibilidad antibiótica y la tipificación de cada cepa
en la búsqueda de genes de virulencia, como la cepa O157:H7. Se utilizó la técnica de
PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) en cepas aisladas de casos clínicos,
provenientes de un establecimiento de La Rioja de dos mil madres, cuya identidad se
mantiene en anonimato por pedido estricto de la entidad INTA MARCOS JUAREZ.
1-Introduccion
En los años 80 la producción de cerdos en Argentina era visualizada como una actividad
de enorme potencial de desarrollo y de gran futuro. Sin dudas esta aseveración basaba
su razonamiento al considerar las ventajas comparativas como disponibilidad de suelos,
agua dulce, clima benigno, mano de obra equilibrada, entre otros factores, para producir
cerdos de manera eficiente. No obstante, el sector porcino de nuestro país no ha podido
mostrar aún su gran potencialidad (Yaciuk y col., 2006).
Hasta 1990 la producción de cerdos era realizada como actividad secundaria dentro de
la explotación agropecuaria, principalmente por pequeños productores localizados en
zonas donde el cultivo de maíz (principal insumo) era preponderante. La actividad
adquiría distintos niveles de relevancia de acuerdo al comportamiento de la ecuación de
precios grano-carne. Los índices productivos alcanzados por la mayoría de los
productores porcinos se hallaban muy por debajo de los niveles de países con tradición
porcina. A la década de los ´90 podemos definirla, por un lado, como la década de la
incorporación tecnológica, de la mano de inversiones principalmente en granjas de alta
productividad y, por otro, como la de escasa o nula rentabilidad, afectada por un tipo de
cambio fijo y la fuerte competencia de carne porcina y subproductos provenientes desde
el exterior, principalmente de Brasil (Yaciuk y col., 2006).
La implementación por parte del gobierno nacional del llamado plan de convertibilidad y
con él la estabilidad inflacionaria, produjo una atenuación de los ciclos mencionados y
a la vez una difícil y traumática reconversión al pasar de producir en una economía
caracterizada por una alta inflación y cerrada a los mercados, a una economía
estabilizada y abierta, lo cual suponía manejar conceptos como eficiencia, calidad y
competitividad. La incorporación de genética de alto rendimiento, la formulación de
raciones equilibradas, la necesidad de intensificar los sistemas productivos, el lograr
índices de productividad acordes a los países más desarrollados en este tipo de
producción, pasaron a ser objetivos a alcanzar para la mayoría de los productores. La
presencia de granjas porcinas con alto nivel tecnológico, permitió compensar con mayor
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productividad la disminución experimentada por el stock. Por ello, los volúmenes de
producción nacional, no se vieron afectados de manera considerable (Yaciuk y
col.2006).
En lo que respecta al mercado, el 85% de la carne de cerdo en Argentina es destinada
a la elaboración de fiambres y chacinados, por lo que apenas el 15% restante se
consume como carne fresca. Este bajo nivel de consumo se percibe como una cuestión
atribuida mayormente a la falta de información y educación del consumidor sobre las
cualidades, calidades y usos culinarios de esta carne, como así también a la ausencia
de un canal comercial eficiente que permita integrar la res valorizando todos sus cortes
en el mercado del fresco. Esto último genera mayores costos en la cadena que son
trasladadas al precio final del producto, afectando su competitividad (Yaciuk y col.,
2006).
Hasta el año 2005 todo lo producido, tanto carne de cerdo como productos elaborados,
solo podía destinarse al mercado interno, provocando una alta dependencia de la
producción primaria respecto a la industria transformadora. A partir de mayo de ese año,
el reconocimiento de Argentina como país libre de Peste Porcina Clásica, se constituye
en una alternativa comercial muy atrayente y un desafío para toda la cadena, ante la
posibilidad de acceso a los mercados de exportación. La salida de la convertibilidad
monetaria en 2002 le abrió nuevas perspectivas al sector porcino de Argentina. El
encarecimiento de las importaciones se tradujo en un incremento del precio del cerdo
en el mercado interno, lo cual contribuyó a una mejora sustancial en la rentabilidad de
la actividad primaria (Yaciuk y col., 2006).
La producción de cerdos en la República Argentina comienza a transitar un camino de
oportunidades que la llevarán al desarrollo y a la consolidación, lo cual implica
indefectiblemente enfrentar desafíos y amenazas. Luego de la devaluación de la
moneda ocurrida en 2002, las condiciones macroeconómicas para la producción porcina
mejoraron considerablemente, especialmente por el encarecimiento del cerdo importado
y el mejoramiento de los precios internos en términos reales. Esto permitió que en los
últimos años se vislumbrara una clara recuperación de la actividad porcina: hoy se
estiman a nivel país 3.437.000 cabezas (Área Porcinos. Dirección de Ovinos, Porcinos,
Aves de Granja y Pequeños Rumiantes con datos de SENASA) y una cantidad de
madres en estrato comercial que alcanzan a 345.000 (Millares, 2012). En cuanto a la
distribución del stock nacional por provincia, existe una marcada concentración en las
de la Pampa Húmeda, donde Buenos Aires posee el 26.77 %, Córdoba el 24.45 % y
Santa Fe el 20.42 %. El resto del país tiene el 29 % del stock, destacándose por su
importancia Salta, Chaco, Entre Ríos, Formosa, La Pampa, Santiago del Estero y San
Luis.
En lo que hace a los indicadores de eficiencia productiva, se estima que un 39 % se
encuentran bajo sistemas de producción en confinamiento con una productividad
promedio por madre/año de 20 animales terminados. El 61 % restante de las madres se
encuentran bajo sistemas de producción a campo o mixtos (a campo con alguna etapa
intensificada) cuya productividad por madre/año se estima alrededor de 10 a 14
animales. Es precisamente en este estrato productivo donde se observa una gran
brecha productiva, ya que situaciones mejoradas (sistemas al aire libre o mixto con
manejo intensivo) alcanzan valores de 16 a18 capones por madre/año.
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En lo que hace a los sistemas de producción, el sector vivió en los últimos años un
proceso de transformación. Si bien los sistemas de producción de pequeña y mediana
escala productiva (10 a 200 madres) son los que prevalecen en el país, se ha producido
un importante aumento en el número de productores que a partir de estratos de 100
madres han confinado parte o talmente sus animales, convirtiéndose en empresa
tecnificadas de mayor eficiencia productiva.
La región centro de la Argentina concentra la mayor parte de los establecimientos
productores de cerdos, le siguen las regiones del NEA y el NOA. Dentro de la región
centro, la mayor parte se encuentran en la provincia de Córdoba, seguida por Buenos
Aires y Santa Fe.
El tamaño de los establecimientos porcinos se mide generalmente en función del
número de cerdas. En nuestro país el 80% de los establecimientos posee menos de
diez cerdas y sólo un 0,1% posee más de 500.El alimento tiene una alta incidencia sobre
los costos de la actividad (alrededor del 75%) y el maíz constituye uno de los principales
componentes del alimento (alrededor del 70%).
Argentina produce el 0,32 % de la carne de cerdo del mundo. Los principales países
que exportan carne de cerdo al mundo son EEUU con el 33,5 %, Unión Europea
(31,5%), Canadá (17,3 %) y Brasil (8,4 %). Argentina participa con el 0.09 % del volumen
de carne que se exporta a nivel mundial.
Los sistemas de producción, pueden caracterizarse en tres modalidades:
1.Tradicional a campo: Se trata de producción para autoconsumo con elaboración
casera de chacinados cortes en fresco, complementaria de otras producciones
agrícolas. Se comercializan lechones en forma particular o a acopiadores y capones por
medio de intermediarios. La infraestructura es generalmente precaria. La alimentación
es en base a maíz o algún otro producto o subproducto de bajo costo. Se logran entre
10 y 12 cerdos por madre al año y la mano de obra es familiar.
2. Tradicional mejorado: La producción se realiza a campo en todas las etapas, o bien,
con algún grado de confinamiento en alguna de ellas. Es de ciclo completo. Hay
incorporación de tecnología en forma parcial (alimentación balanceada, genética,
equipos modulares de parición y recría). La comercialización es por medio de
intermediarios o en forma directa al matadero o planta elaboradora. Se logran entre 12
y 14 cerdos por madre al año y la mano de obra es familiar o familiar con asalariados.
3. Empresarial: Son empresas tecnificadas que realizan su actividad en confinamiento.
Utilizan material genético, emplean raciones balanceadas, llevan un plan sanitario,
cuentan con asistencia técnica y disponen de una buena infraestructura. Tienen
personal en relación de dependencia afectado en forma directa y permanente a la
actividad. La comercialización la realizan directamente a matadero o planta elaboradora.
Se logran más de 20 cerdos por madre al año.
A su vez, otra clasificación que puede considerarse es en base al número de madres
que integran una unidad productiva:
1. Menos de 50 madres: producción de subsistencia, para autoconsumo, venta de cortes
frescos y producción casera de chacinados o complementaria de otras producciones
agrícolas y de granja.
2. Entre 61 y 200 madres: criadero comercial, en general extensivo salvo las etapas de
maternidad y terminación que genera utilidades moderadas.
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3.Establecimientos con más de 200 madres: empresas con personal en relación de
dependencia afectado en forma directa y permanente a la actividad, con producción
planificada e integradas verticalmente en la cadena productiva.
A continuación, en las Imágenes 1 y 2 se muestran dos modelos de criaderos de cerdos
en confinamiento.
Imagen N°1: criadero de cerdos en confinamiento.
Imagen N°2: criadero de cerdos en confinamiento.
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El sistema de producción confinada, permite la crianza de un mayor número de animales
en una menor superficie y facilita el control de los mismos, pero presenta como
desventajas altos costos de operación e inversión, y exige un control sanitario riguroso
(Padilla Pérez, 2007). Escherichia coli es un habitante intestinal normal de muchas
especies animales y el hombre, generalmente no patógenas, existiendo un grupo
minoritario de este tipo de bacterias potencialmente peligrosas para la salud de
humanos y animales. Entre ellas podemos encontrar las causantes de diarrea post
destete y enfermedad de los edemas en cerdos de edad temprana, afectando a los
animales durante la etapa más crítica, es decir cuando han sido separados de sus
madres, junto con el cambio de alimentación agravado durante las estaciones frías.
Como consecuencia se evidencian pérdidas económicas relacionadas con el número de
animales muertos y el tratamiento a los enfermos, así como la contaminación ambiental
generada. Los establecimientos productores de cerdos, en general, no cuentan con un
programa de tratamiento de efluentes eficiente, de modo que parte de éstos son vertidos
al medio ambiente en su estado crudo, constituyendo un importante contaminante del
agua y los alimentos.
Las cepas patógenas de Escherichia coli pueden ser viables en el medio ambiente
durante un tiempo considerable y se ha comprobado incluso su multiplicación en ciertas
condiciones favorables. Desde el punto de vista de las zoonosis, la categoría más
importante es la entero-hemorrágica, que también es la más severa (Acha y Szyfres,
2001). Aguas contaminadas con heces humanas o animales que no hayan recibido una
adecuada cloración (Pascual Anderson, 2005.), constituyen un importante foco
infeccioso, pudiendo provocar brotes de diarrea cuyo impacto dependerá de las
características del grupo afectado. E.coli O157:H7 se transmite al hombre
principalmente por el consumo de alimentos contaminados, como productos de carne
picada cruda o poco cocida y leche cruda. La contaminación fecal del agua y de otros
alimentos, así como la contaminación cruzada durante la preparación de estos (con
carne de vacuno y otros productos cárnicos, superficies y utensilios de cocina
contaminados), también es causa de infecciones.
Un número creciente de brotes se asocian al consumo de frutas y verduras (coles de
Bruselas, espinacas, lechuga, ensaladas de col y de otro tipo) contaminadas por el
contacto con las heces de animales domésticos o salvajes en algún momento durante
su cultivo o manipulación. También se ha aislado EHEC en masas de agua (estanques,
arroyos), pozos y abrevaderos y se ha observado que puede sobrevivir durante meses
en el estiércol y en los sedimentos de recipientes con agua. Se ha informado de casos
de transmisión por el agua, tanto por agua de bebida contaminada como por aguas de
recreo (OMS, 2011). Los contactos de persona a persona son una forma de transmisión
importante por vía oral-fecal. Se ha informado de un estado de portador asintomático,
en el que la persona no muestra signos clínicos de la enfermedad, pero puede infectar
a otros. La excreción de EHEC dura aproximadamente una semana en los adultos, pero
puede prolongarse más en los niños. Se ha observado que otro factor de riesgo
importante de infección por EHEC son las visitas a granjas y otros lugares donde el
público en general puede entrar en contacto directo con el ganado, como ferias o
exposiciones (OMS, 2011).
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1.1. Agente etiológico:
Las enfermedades diarreicas producidas en los animales de granja y en el hombre son
frecuentemente producidas por algunos de los biotipos de E.coli: E.coli enteropatógena
(EPEC), E. coli enterotoxigénica (ETEC), E. coli productora de toxina shiga (STEC), E.
coli enterohemorrágica(EHEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) y E. coli enteroinvasiva
(EIEC). De estos, ETEC es una causa importante y global de diarrea acuosa y severa
en algunas especies animales como terneros y lechones pre y post destete (Moredo,
2012).
El género Escherichia comprende cinco especies: Escherichia blattae, Escherichia coli,
Escherichia fergusonnii, Escherichia hermannii y Escherichia vulneris. La especie tipo
es E. coli. De las cinco especies solamente E. coli tiene significación clínica. No
obstante, E. hermannii y E. vulneris se han aislado raramente de infecciones
extraintestinales (especialmente de heridas) (Hawkes y col., 2006).
Escherichia coli es la bacteria más constantemente encontrada en las materias fecales
del hombre y de muchas especies animales. Su nicho ecológico natural es el intestino
delgado y grueso, forma parte de la flora nativa intestinal y se encuentra en calidad de
saprobio, sin causar daño. Por el contrario, muchas cepas de E. coli producen
sustancias que son útiles al portador, como las colicinas, que tienen efecto inhibitorio
sobre otras cepas potencialmente patógenas, por lo que la colonización del intestino es
benéfica para el hospedero (Straw y col., 2006).
Escherichia coli se caracteriza morfológicamente por ser un bacilo recto y cilíndrico de
1.1-1.5 por 2-6 µm que se presenta solo o de a pares. Es Gram negativo y móvil, debido
a la presencia de flagelos perítricos. Fisiológicamente E.coli es ubicuo y bien adaptado
a sus hábitats característicos. Aerobio y anaerobio facultativo, presenta ambos tipos de
metabolismo, respiratorio y fermentativo, es decir, que puede crecer tanto en presencia
como en ausencia de oxígeno (Moredo, 2012).
Para determinar el grupo patógeno al que pertenecen, Kauffman desarrolló un esquema
de serotipificación que continuamente varía y que actualmente tiene 176 antígenos
somáticos (O), 112 flagelares (H) y 60 capsulares (K). El antígeno “O” es el responsable
del serogrupo y la determinación del antígeno somático y flagelar (O: H) indica el
serotipo, el cual en ocasiones se asocia con un cuadro clínico en particular (Eslava y
col. 1994; OMS, 1998).
1.2. Diarrea por Escherichia coli post-destete y enfermedad de los edemas:
La diarrea post-destete y la enfermedad de los edemas generalmente se producen en
los mismos lotes de cerdos y la bacteria causal comparte ciertos factores de virulencia,
como así también el tratamiento y la prevención (Straw, 1999).
La DP es una diarrea transmisible mediada por enterotoxinas y observada en su mayoría
luego del destete, también se denomina colibacilosis entérica post-destete (Straw,
1999).
La enfermedad de los edemas (EE) es una enterotoxemia causada por cierta E. coli que
coloniza el intestino delgado y produce una proteína tóxica que entra en el torrente
sanguíneo y en los tejidos dañándolos (Acha y Szyfres, 2001). La EE también es
llamada edema intestinal (Straw, 1999).
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No es posible una distinción neta entre DP y EE debido a que ciertas cepas de E. coli
están presentes en ambas enfermedades. Por otro lado, la EE comparte ciertas
similitudes con la enfermedad humana causada por E. coli enterohemorrágica, la cual
produce una toxina relacionada pero no idéntica a la toxina Shiga (Tzpori y col., 1986).
1.2.1. Epidemiología:
En cerdos se pueden clasificar tres grupos principales: diarrea neonatal (de 0 a 4 días
de nacimiento), diarrea de los lechones (desde la primera semana de vida hasta finalizar
la lactancia) y diarrea post-destete. E. coli es la principal causa de diarrea neonatal y
post-destete (Moredo, 2012).
A menudo la diarrea post-destete por E.coli (DP) y la enfermedad de los edemas (EE)
se presentan en un mismo grupo productivo de animales y su manifestación depende
de la edad en la cual fueron destetados. Habitualmente se presenta dentro de los 14
días posteriores al destete, aunque también se puede observar cuando los animales son
transferidos a los corrales de recría (Bertschinger y Fairbrother, 1999; Fairbrother y col.,
2005).
El ambiente de las unidades de destete parece ser la fuente más probable de cepas
patógenas de E. coli. Los cerdos no destetados pueden contraer la infección en la
paridera, se presume que de la misma fuente, y pueden llevarla a la unidad de recría.
La limpieza y desinfección rutinaria por lo general son insuficientes para cortar el ciclo
de infección (Hampson y col, 1987).
Se cree que la difusión de la E. coli se produce mediante aerosoles, alimento, vehículos
mecánicos, cerdos y quizás otros animales (Straw, 1999).
1.2.2. Patogenia:
Cuando se brindan las condiciones ambientales predisponentes junto a la
susceptibilidad del huésped, E.coli patógena prolifera en el intestino y produce la
enfermedad mediante factores de virulencia específicos.
Imagen N°3: esquema de la producción de diarrea post-destete
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Como otros patógenos localizados en mucosas, E. coli debe seguir una secuencia de
procesos infecciosos: colonización de la mucosa, evasión de los mecanismos de
defensa del hospedador, multiplicación y daño en el hospedador. Una de las
características más conservadas de las E. coli es su habilidad para colonizar la mucosa
de la superficie intestinal a pesar del peristaltismo y la competencia nutricional con la
flora nativa del intestino, incluyendo otras cepas de E. coli. (Nataro y Kaper, 1998).
Imagen N°4: modelo esquemático de Enfermedad de los edemas.
1.2.2.1. Colonización del intestino:
La colonización requiere de la proliferación del microorganismo y de la capacidad
adherencia a la mucosa. El grado de colonización determina si se produce la
enfermedad o no luego de la infección (Straw, 1999).
1.2.2.2. Diarrea:
• E. coli enterotoxigénica:
La mayoría de las E. coli patógenas producen una o más adhesinas fímbricas que
median su fijación a receptores específicos en las células epiteliales mucosas en la capa
mucosa adyacente. Estas fimbrias, también llamadas pili, se extienden desde la célula
bacteriana y consisten en subunidades de proteínas estructurales, que en la mayoría de
los casos actúan como un soporte para una proteína adhesiva separada encontrada en
la punta de las fimbrias. Las cuatro adhesinas fímbricas de la ECET porcina son: F4, F5,
F6 y F41, muchas cepas producen más de una adhesina fímbrica y las combinaciones
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más comunes son: F5 y F6, F5 y F41 y F4 y F6. Las fimbrias se adhieren a receptores
específicos en la membrana de las células epiteliales del intestino y a receptores
específicos e inespecíficos en el moco que cubre el epitelio.
Las ECET que se adhieren a la mucosa intestinal producen enterotoxinas que cambian
el flujo del agua y electrolitos del intestino delgado, lo que puede llevar a diarrea si el
exceso de líquido del intestino delgado no es absorbido en el intestino grueso. Las dos
clases principales de enterotoxinas son: la toxina termoestable (ST), que es resistente
al tratamiento térmico a 100 °C durante 15 minutos y la termolábil (LT), que es inactivada
a 60 °C durante 15 minutos. La ST fue dividida en STa y STb basada en la solubilidad
en metanol y la actividad biológica (Straw, 1999).
• E. coli de fijación y destrucción:
La E. coli de fijación y destrucción (también llamada adherencia y esfacelación) se fija a
la mucosa del intestino y produce lesiones similares a las observadas para la E.
colienteropatógena, aislada en diarrea infantil humana. Estas se fijan a la membrana
celular del epitelio intestinal por medio de una proteína en la membrana externa de la
bacteria llamada “intimina” o “factor de fijación y destrucción ECEP (fdE)”, destruye las
microvellosidades e invade las células epiteliales. Casi todas las E. coli involucradas en
casos fatales de DP producen LT (Straw, 1999).
1.2.2.3. Enterotoxemia:
El transporte de la toxina dentro de la circulación no es totalmente conocida. Se puede
detectar la toxina en células endoteliales de los vasos sanguíneos pequeños del
intestino y de las micro-vellosidades de las membranas de los enterocitos en la base de
las vellosidades con el uso de métodos inmunológicos. La necrosis epitelial secundaria
a la necrosis de las pequeñas arterias y arteriolas puede ser responsable de la
hemorragia luminal. (Straw, 1999).
1.2.3. Signos clínicos:
Las primeras manifestaciones de la diarrea post-destete (DP) es la disminución del
consumo de alimento, diarrea acuosa, deshidratación, pérdida de peso y en algunos
casos, ocasiona la muerte de los animales enfermos (Moredo, 2012). La muerte súbita
puede ocurrir a los dos días después del destete. Otras características que pueden
presentar los cerdos enfermos es un temblor característico en la cola, depresión,
descoloración cianótica de la punta de la nariz, las orejas y el abdomen. Los cerdos
gravemente afectados pueden moverse con bamboleos e incoordinación (Straw, 1999).
En la enfermedad de los edemas (EE) los cerdos producen un sonido muy agudo o
chirriante, edema de párpados y cianosis en pabellones auriculares, abdomen y
mandíbula, hinchazón de orejas, tejidos subcutáneos de los huesos frontales, nariz y
labios. Entre los síntomas, se encuentran:
- Nerviosos: sintomatología nerviosa de gravedad, movimientos circulares, nistagmo,
inclinación de la cabeza o debilidad progresiva y muerte súbita.
- Intestinales: síntomas de constipación y diarrea acuosa con coágulos de sangre. En
algunos animales se desarrolla la colitis hemorrágica. Ocurre normalmente durante la
semana posterior al destete, pudiendo llegar a afectar al 30% de animales. La mortalidad
puede llegar a ser del 100%.
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1.2.4. Lesiones:
1.2.4.1. Diarrea post-destete:
• Lesiones macroscópicas:
Los cerdos que mueren por diarrea suelen estar en buenas condiciones, pero con una
gran deshidratación, ojos hundidos y algo de cianosis. Los pulmones se ven pálidos y
secos (Svendsen y col, 1974), el estómago suele estar distendido por alimento seco, el
intestino delgado está dilatado, algo edematoso e hiperémico y el contenido varía de
acuoso a mucoide con un olor característico. El contenido del intestino grueso por lo
general tiene un color gris brillante o amarillento y es de aspecto mucoide o acuoso. Las
heces son amarillas o pastosas (Straw, 1999).
• Lesiones microscópicas:
Pueden observarse bacterias que se adhieren al íleon y de manera menos consistente
a la superficie yeyunal. Las capas de bacterias están restringidas a las vellosidades y
se ven manchas (Sarmiento y col, 1988; Casey y col, 1992; Faubert y Drolet, 1992). En
los cerdos con la llamada gastroenteritis hemorrágica, la congestión grave de la mucosa
del estómago y el intestino delgado suele asociarse con trombos fibrinosos
microvasculares (Straw, 1999).
1.2.4.2. Enfermedad de los edemas:
• Lesiones macroscópicas:
- Sistémicas: edema generalizado y cavidades corporales llenas de líquido.
- Aparato digestivo: estómago lleno de pienso; edema de pared gástrica, intestinos,
laringe, encéfalo y nódulos linfáticos. También se puede observar la congestión del
fundus y, en ocasiones, úlceras.
• Lesiones microscópicas:
En casos sub-agudos y crónicos se observa angiopatía degenerativa en pequeñas
arterias y arteriolas y encefalomalacia focal en el tronco cerebral.
1.2.5. Diagnóstico:
1.2.5.1. Diarrea por E.coli posdestete:
La aparición de la diarrea poco después del destete, deshidratación marcada y por lo
menos alguna mortalidad son características en el campo que permiten el diagnóstico
preliminar de la ECET, quienes se excretan en un alto número, la hemólisis no es un
criterio válido para la detección de ETEC. La identificación de ECET debería realizarse
por lo menos usando serotipificación de cultivos vivos con antisuero –O contra los
serotipos prevalentes en dicha región (Straw, 1999).
1.2.5.2. Enfermedad de los edemas:
El diagnóstico de EE se basa en la aparición repentina y en los signos clínicos de la
enfermedad neurológica en cerdos desarrollados a las 1-2 semanas luego del destete.
En el cerdo vivo el signo más importante y constante es una ataxia parcial o marcha
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tambaleante, como así también el edema subcutáneo en el párpado y sobre los huesos
frontales. En la necropsia las lesiones características de edema, cuando están
presentes, son de ayuda para confirmar el diagnóstico, pero pueden estar ausentes en
un número significativo de casos, en especial cuando la diarrea grave precedió la EE.
El diagnóstico de EE en cerdos adultos puede requerir además histopatología y examen
post-mortem de más de un cerdo. En el examen bacteriológico del intestino delgado y
el colon debería encontrarse mayormente E. coli hemolítica siendo la identificación
serológica de los serotipos es esencial (Straw, 1999).
1.2.6. Tratamiento:
1.2.6.1. Terapia antimicrobiana:
El control quimioterápico de la proliferación bacteriana es desde el punto de vista
terapéutico mucho más efectivo en la DP que en la EE ya que, en la última, la producción
de toxina en el intestino es alta cuando los signos clínicos se hacen visibles. Los cerdos
enfermos deben ser tratados por vía parenteral, ya comen y beben muy poco. Deben
seleccionarse las sustancias que alcancen la luz intestinal, como amoxicilina / ácido
clavulánico, fluoroquinolonas, cefalosporinas o trimetoprima. La prueba de la resistencia
bacteriana es indispensable si hay un problema en la piara (Straw, 1999).
1.2.6.2. Terapia de sostén:
En la DP tiene que contemplarse la deshidratación y acidosis, deben administrarse
líquidos que incluyan glucosa, glicina, ácido cítrico y potasio dihidrógeno fosfato en una
solución isotónica; éstos pueden ser ingeridos espontáneamente o inyectados por vía
intra-peritoneal si el cerdo está anoréxico. La reposición debe ser igual a la pérdida, por
ejemplo, en relación con el peso corporal. En el caso de EE, no hay gran oportunidad
de salvar la vida de los cerdos con signos avanzados de enfermedad como edema
subcutáneo grave, dificultad respiratoria o imposibilidad para levantarse (Straw, 1999).
1.2.7. Prevención y control:
La cría de cerdos resistentes sería el enfoque preventivo más económico y efectivo a
largo plazo, aunque la selección de este tipo de planteles de cría no es aún factible pues
no se puede predecir la aparición de cepas cuyas variantes de receptores fimbriales
todavía se desconocen. Debido al carácter transmisible de ambas enfermedades, es
fundamental el estricto manejo sanitario y la desinfección de las instalaciones. La
inmunidad adquirida brinda perfecta protección contra la colonización intestinal y / o los
efectos de las toxinas. El manejo de los cerdos destetados debe minimizar el estrés
ambiental o de otras causas como el manejo de las camadas así como los cuidados
ante los cambios de temperatura, el transporte y la asignación a nuevos corrales. (Straw,
1999).
Separar inmediatamente los animales sanos de los enfermos, iniciar el tratamiento
inmediatamente y realizar una desinfección profunda (Figueroa, 1984).
pág. 14
Imagen N°4: decaimiento generalizado por diarrea post-destete.
Imagen N°5: lechón muerto por diarrea post-destete.
Imagen N°6: sintomatología de Enfermedad de los edemas.
pág. 15
Imagen N°7: edema en párpado
Imagen N°8: lechón muerto por Enfermedad de los edemas.
1.3. Contaminación ambiental y riesgo de zoonosis:
Además de las pérdidas económicas ocasionadas por el tratamiento de la enfermedad
y muerte la de los lechones, otro problema de gran relevancia es el impacto ambiental
y el potencial riesgo de zoonosis.
La tecnificación del sector y la intensificación de las producciones generan nuevas e
interesantes oportunidades económicas, pero nos exponen a riesgos ambientales de
alto impacto, relacionados con los residuos generados durante los procesos
productivos. Por cada cerdo se estima una producción total de efluentes de 25 a 30 litros
por día, el cual por su concentración en sólido y su composición es considerado de alto
impacto ambiental, por ello, este cambio productivo no puede concebirse si no se tiene
un plan de gestión y bio-transformación de los residuos de la producción (Acha y
Szyfres, 2001). Existe una alta probabilidad de contaminación de agua, incluso aquellas
no expuestas directamente a criaderos, con lo que aumenta el riesgo del ingreso de
contaminantes biológicos (entre otros) a la cadena trófica, acarreando peligros para
manipuladores y consumidores de alimentos, los cuales en caso de no cumplir con las
buenas prácticas de manufactura y correctos procedimientos de saneamiento, pueden
culminar en una enfermedad transmitida por alimentos.
pág. 16
Actualmente existen numerosos métodos de tratamientos de excretas basados en
principios mecánicos y biológicos o en la combinación de ambos. La mayoría de los
residuos animales y/o vegetales, cuando no son aprovechados como alimento animal o
desde el punto de vista energético, pasan a ser un problema para el hombre y su
entorno, ya que se constituyen en criaderos de roedores, insectos y microorganismos
patógenos, además de la generación de olores desagradables y vertidos líquidos que
poseen alta potencialidad como agentes contaminantes del suelo, del aire y de las
fuentes naturales de agua (Braun, 2012).
1.4. Objetivos:
Objetivo general:
Determinar la prevalencia de Escherichia coli patógena aislada de casos clínicos en
cerdos provenientes de la provincia de La Rioja de Argentina, de la región de Chepes.
Se trata de un criadero comercial de tres sitios, con dos mil madres, en el cual se
presentaron 60 animales afectados en la categoría post-destete/recría, con 30 animales
muertos. El problema surgió en conjunto con un cambio de concentrado en la ración
(pasaron de una marca comercial a otra). Los síntomas observados fueron muerte
súbita, diarrea y decaimiento. Estos signos continuaron por un periodo de cuatro
semanas. Se tomaron muestras de diez animales que en ese momento presentaban
síntomas (sobre todo diarrea) y se realizaron las pruebas bacteriológicas y bioquímicas
correspondientes, con el objetivo de encarar un plan de prevención y tratamiento para
controlar el brote, y a su vez, aportar conocimientos del rol que cumplen estos animales
como reservorio del agente aislado y su implicancia en el desarrollo de la actividad en
cuanto a salud pública y pérdidas económicas del sector.
Objetivos específicos:
Colección de un número significativo de aislamientos de Escherichia coli a partir
de los casos clínicos presentados.
Montaje de la técnica reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la
amplificación de genes de virulencia de E.coli.
Identificación de los distintos genes que codifican los diferentes biotipos de
E.coli, a través de PCR.
Análisis estadístico sobre la prevalencia de los distintos biotipos de E. coli.
Determinar la susceptibilidad antimicrobiana de los diferentes aislados de E. coli.
1.5. Hipótesis:
La producción de cerdos es un importante reservorio de grupos patógenos de
Escherichia coli, basando esto en los signos clínicos y el historial de la granja, se
sospecha de este patógeno como agente causal de las 30 muertes y de los 60 animales
afectados, constituyendo además un potencial riesgo de zoonosis para las zonas
aledañas.
pág. 17
2. Materiales y métodos:
2.1. Muestra:
• Cepas de Escherichia coli liofilizadas aisladas de casos clínicos de enfermedad de los
edemas y diarrea post destete en cerdos, provenientes del cepario del Laboratorio de
Bacteriología del Grupo Sanidad Animal, EEA INTA Marcos Juárez.
• Cepas de Escherichia coli aisladas de casos clínicos ocurridos durante la realización
de la tesina.
2.2. Procedimientos:
Los procedimientos se desarrollaron en dos etapas. En primer lugar se trabajó en el
laboratorio de bacteriología, en el cual se reactivaron las cepas liofilizadas de E.coli, se
aislaron cepas de los casos clínicos y se realizaron pruebas bioquímicas para la
correspondiente identificación. En la segunda etapa, se trabajó en el laboratorio de
biotecnología, donde se realizó la extracción de ADN y la búsqueda de genes de
virulencia por medio de técnicas de biología molecular.
El trabajo se desarrolló de la siguiente manera:
1. Procesamiento de la muestra y aislamiento de Escherichia coli.
2. Identificación del microorganismo mediante pruebas bioquímicas.
3. Extracción de ADN.
4. Identificación de los genes de virulencia mediante PCR Múltiplex.
5. Revelado y tipificación.
6. Susceptibilidad antimicrobiana.
1-Procesamiento de la muestra y aislamiento de Escherichia coli:
El laboratorio cuenta con un cepario de Escherichia coli aisladas a través de casos
clínicos, las cuales se conservan liofilizadas. Estás se reactivaron, mediante una
solución tampón de PBS estéril (tampón fosfato salino) en condiciones de esterilidad,
se sembraron en un medio sólido de Agar Mc Conkey (Britania) y otro de Agar Sangre
(medio base Britania más 5 % de sangre de equino), con una incubación de 24 hs a
37°C.
Luego de la incubación se realizó tinción de Gram para verificar la morfología del
microorganismo, para esto se procedió de la siguiente manera:
• Extender una suspensión de colonias bacterianas con el asa hasta conseguir una capa
fina.
• Secar la preparación acercándola a la llama del mechero, evitando que se caliente
demasiado, para no afectar a la estructura y forma normal de los microorganismos (se
comprueba con el dorso de la mano que no está demasiado caliente).
Instrucciones para la tinción de GRAM:
pág. 18
Cubrir la preparación con violeta de genciana y mantener durante 1 minuto.
Escurrir el colorante, enjuagar con agua destilada y cubrir con lugol. Dejar actuar
durante 1minuto. Lavar con agua destilada.
Decolorar con alcohol-acetona durante 10 segundos. Lavar con agua destilada.
Cubrir con el colorante de contraste (safranina). Dejar actuar durante 30
segundos. Lavar con agua destilada y secar la preparación.
Observar al microscopio (objetivo de 100X utilizando aceite de inmersión).
2. Identificación del microorganismo mediante pruebas bioquímicas:
Luego de la observación al microscopio y de la identificación morfológica, se realizó la
marcha bioquímica que consistió de las siguientes: SIM (prueba de indol, producción de
sulfhídrico y movilidad) (Oxoid), RM-VP: rojo de metilo y Voges Proskauer (Britania),
Citrato de sodio, prueba de decarboxilación de aminoácidos (arginina, lisina y ornitina)
(medio base Britania), oxidasa, catalasa, TSI (hierro triple azúcar) (Oxoid). Estos se
incubaron a 37° C por 24 - 96 horas para luego pasar a la interpretación, la cual está
detallada en la siguiente tabla:
Tabla 2. Bioquímica característica de E. coli.
Pruebas SIM RM-VP Citrato Arg Lys Orn Oxidasa Catalasa TSI
Resultados -/+/+ +/- - - + + - + +/+
Positivo (+): corresponde a una reacción positiva (ej.: capacidad de motilidad en SIM).
Negativo (-): corresponde a una reacción negativa (ej.: incapacidad de utilizar citrato
como fuente de carbono).
Para la identificación de E. coli, generalmente se utilizan las llamadas pruebas IMViC
(indol, rojo de metilo, Voges Proskauer y citrato), considerándose suficientes, pero hay
que mencionar que existen ciertas excepciones en donde pueden observarse cepas sin
movilidad, indol y ornitina negativo entre otras particularidades.
Imagen N°9: placa de Petri con medio sólido Mc Conkey.
No fermenta lactosa
Fermentador de lactosa
pág. 19
Imagen N°10: pruebas bioquímicas TSI y Catalasa.
Catalasa (+)
Fermentador de GLU
Fermentador de Lac y Sac
Producción de gas
Imagen N°11: prueba bioquímica SIM.
Indol(+)
Indol (-)
Movilidad
Producción de gas
pág. 20
Imagen N°12: prueba bioquímica AA descarboxilasas
Arg (-)
Orn(+)
Lys (+) Control (+)
En todos los casos se prepararon los medios de cultivo e identificación siguiendo las
indicaciones del fabricante, los medios deshidratados, fueron reconstituidos con agua
destilada, se controló el pH y finalmente se esterilizaron. Una vez estériles se incubaron
durante 24 horas para control de esterilidad y luego se conservaron en heladera hasta
su uso.
Concluidas las pruebas, se realizó un nuevo cultivo en Agar Mc Conkey (Britania), el
que posteriormente se utilizó para liofilizar las cepas nuevamente, cuyo proceso fue:
-Preparar una solución de leche descremada al 10%, fraccionar en tubos de ensayo a
razón de 10 ml cada uno y autoclavar.
-Separar entre 1 y 1.5 ml de leche estéril en tubos también estériles.
-Preparar un homogeneizado saturado de colonias y trasvasar 1 ml (o menos,
dependiendo de la ampolla que usemos) a una ampolla para liofilizar (todo esto en
condiciones estrictas de asepsia).
-Rotular identificando: nombre de la cepa, características hemolíticas, número de veces
que se ha realizado este proceso con la misma cepa y fecha.
-Colocar en freezer hasta que se hayan congelado (a - 20°C).
-Conservar en nitrógeno líquido a -196°C.
-Liofilizar (en liofilizador LABCONCO)
-Conservar en heladera (entre 5 – 8 °C).
Por la recepción de nuevos casos clínicos de diarrea post destete o enfermedad de los
edemas se observó la presencia de lesiones compatibles con la enfermedad, se
procedió a la toma de muestra en condiciones de esterilidad (yeyuno íleon, ganglio
mesentérico e hígado), luego se incubaron 24 - 48 horas a 37° C.
pág. 21
3. Extracción de ADN:
A continuación, se realizó el repique de una colonia proveniente de un cultivo puro de
E. coli en medio líquido Luria Bertani (LB) para aumentar la concentración bacteriana;
éste se incubó entre 18 – 24 horas a 37 ° C. Se procedió a la extracción de ADN.
La extracción de ADN se realizó a partir de cultivos bacterianos en medios líquidos, para
este procedimiento se utilizó el kit Genomic DNA Purification (Fermentas). A
continuación, se detalla el protocolo de purificación:
1.Mezclar 200 µl de muestra con 400 µl de solución de lisis. Incubar 5 minutos a 65 ° C.
2.Añadir 600 µl de cloroformo, invertir 3 – 5 veces. Centrifugar por 2 minutos.
3.Transferir la fase acuosa superior que contiene ADN a un nuevo tubo, añadir 800 µl
de solución de precipitación diluida y mezclar por 1 o 2 minutos. Centrifugar por 2
minutos. Desechar el sobrenadante.
4.Disolver el pellet de ADN en 100 µl de NaCl (asegurarse de que el sedimento se
disolvió por completo). Añadir 300 µl de etanol al 100 % frío, dejar que el ADN precipite
(10 minutos a – 20 ° C). Centrifugar por 4 minutos y descartar sobrenadante. Lavar el
pellet una vez con etanol al 70 % frío.
5.Disolver el ADN en 100 µl de buffer T.E (ver ANEXOS).
6.Conservar a – 20 ° C.
4. Identificación de los genes de virulencia mediante PCR Múltiplex:
La reacción de la cadena polimerasa múltiplex, es una reacción en la cual pueden
amplificarse más de un gen, cuyos primers son seleccionados considerando su peso
molecular y temperatura de annealing.
Para la detección de cepas de E. coli patógenas, se realizó la búsqueda de los siguientes
genes de virulencia mediante la técnica de PCR múltiple: Sta (So, 1980), Stb (Lortie,
1991), LT (Furrer, 1990), F4 (K88) (tesis moredo), F18 (tesis Moredo), VT1 (Stx1)
(Woodward, 1992), VT2 (Stx2) (Woodward, 1992), Eae (Beaudry, 1996), East I
(Savarino, 1993), AIDA (Benz, 1992) yRfb O157.
Tabla 3. Secuencia de los cebadores utilizados.
Primer Secuencia Tm Longitud
STa for 5´TCCCCTCTTTTAGTCAGTCAACTG
rev 5´GCACAGGCAGGATTACAACAAAGT
60° 163
pág. 22
STb for 5´ GCAATAAGGTTGAGGTGAT
rev 5´ GCCTGCAGTGAGAAATGGAC
60° 368
LT for 5´ TTA CGG CGT TAC TAT CCT CTC TA
rev 5´ GGT CTC GGT CAG ATA TGT GAT TC
60° 275
F4
(K88)
for 5´ ATC GGT GGT AGT ATC ACT GC
rev 5´ AAC CTG CGA CGT CAA CAA GA
60° 601
F18
for 5´ GTG AAA AGA CTA GTG TTT ATT TC
rev 5´CTT GTA AGT AAC CGC GTA AGC
60° 510
VT1
(Stx1)
for 5´ TTA GAC TTC TCG ACT GCA AAG
rev 5´ TGT TGT ACG AAA TCC CCT CTG
60° 530
VT2
(Stx2)
for 5´ CTA TAT CTG CGC CGG GTC TG
rev 5´ AGA CGA AGA TGG TCA AAA CG
60° 327
Eae for 5´ CAT TAT GGA ACG GCA GAG GT
rev 5´ ATC TTC TGC GTA CTG CGT TCA
60° 790
East I for 5´ TCG GAT GCC ATC AAC ACA GT
rev 5´ GTC GCG AGT GAC GGC TTT GTA G
55° 125
AIDA for 5´ ACA GTA TCA TAT GGA GCC A
rev 5´ TGT GCG CCA GAA CTA TTA
55° 585
Rfb
O157
for 5´ CGG ACA TCC ATG TGA TAT GG
rev 5´ TTG CTA TGT ACA GCT AAT CC
55º 259
Estos genes codifican distintos factores de virulencia los cuales son responsables de
desencadenar los cuadros diarreicos y de enfermedad de los edemas en animales
susceptibles.
La técnica de PCR Múltiplex se desarrolló mediante una mezcla maestra que consta de
un volumen final de 25 µl, conteniendo 50 ng de ADN molde, 50 µM de cada cebador
(Fagos), 100 µM dNTPs (Promega), 1.5 µM de MgCl, 1 X buffer (Buffer 5X)
(GoTaqPromega) y 0.5 unidades de Taq ADN (Promega).
pág. 23
El programa de Ciclado consta de:
a. Desnaturalización inicial: 5 minutos a 94 ° C.
b. Desnaturalización: 30 segundos a 94 °C.
c. Pegado de cebadores: 30 segundos a 58 ° C.
d. Extensión: 30 segundos a 72 ° C.
e. Extensión final: 2 minutos a 72 ° C.
f. Tomar una fotografía y elaborar un archivo.
Para la interpretación de resultados se tuvo en cuenta que las moléculas de ADN
grandes viajan despacio a través del gel, mientras que las moléculas pequeñas viajan
más rápido. El gel está orientado de modo que las bandas más lentas, es decir, las más
grandes, estén arriba, éstas se comparan con un patrón que es el marcador cuyo peso
de cada banda es conocido al igual que el peso de los fragmentos buscados, de esta
manera vemos si está presente o ausente en la muestra.
5.Susceptibilidad antimicrobiana:
Esta fue determinada mediante el método de microdilución (concentración inhibitoria
mínima) utilizando un panel de 12 antibióticos en distintas diluciones fijados a una matriz
plástica de 96 pocillos (CMP1ELRL, Sensitre, TrekDiagnosticsSystems Inc. England).
Los antibióticos y el rango de dilución fueron:
- Enrofloxacina (ENR) 0.003-4 μg/ml
- Ceftiofur (CEF) 0.06-8 μg/ml
- Ampicilina (AMP) 0.25-32 μg/ml
- Tilmicosina (TIM) 0.25-32 μg/ml
- Tilosina (TIL) 0.5-64 μg/ml
- Eritromicina (ERY) 0.12-16 μg/ml
- Lincomicina (LIN) 0.25-32 μg/ml
- Espectinomicina (SPC) 1-128 μg/ml
- Florfenicol (FFN) 0.12-16 μg/ml
- Gentamicina (GEN) 0.5-32 μg/ml
La evaluación de la CIM fue determinad siguiendo las recomendaciones de
NationalCommiteeforClinicalLaboratoryStandards (NCCLS), 2002.
La CIM de un determinado antimicrobiano para un determinado aislamiento fue definida
como la primera dilución en la cual no se detectaba crecimiento bacteriano.
pág. 24
3. Resultados:
Las pruebas bacteriológicas realizadas a los hisopados tomados de 10 animales que
presentaban signos de la enfermedad, resultaron positivos a E.Coli beta hemolítica.
Los biotipos presentes hallados por PCR fueron: Sta, Lh y Stx2, demostrando asi ser
una cepa de E.coli verotoxigenica.
En el antibiograma por halo de inhibición en placa se determinó E.coli beta hemolítica
(toxígenica) sensible a TRIMETROPRIM- SULFAMETOXAZOL (TMS), medianamente
sensible a GENTAMICINA- NORFLOXACINA, y resistente a OXITETRACICLINA,
FOSFOMICINA, PENICILINA.
4. Discusión:
Las cepas de Escherichia coli aisladas de los casos clínicos de diarrea post destete y
enfermedad de los edemas en la región de La Rioja en la República Argentina son
portadores de factores de virulencia característicos de cepas patógenas.
Teniendo en cuenta que los cerdos clínicamente sanos son reservorios de cepas
patógenas de Escherichia coli, contribuyen una potencial fuente de infección y
propagación de la enfermedad. Además, los efluentes provenientes de los criaderos de
cerdos son un riesgo potencial de contaminación ambiental y zoonosis, por lo que el
tratamiento de los mismos es fundamental antes de su vertido al medio ambiente.
5. Conclusiones:
Se recomendó al criadero suministrar FOSFOMICINA en la ración, considerando una
dosis de 160 mg/kg de peso vivo de FOSBAC PLUS (40 mg/kg de peso vivo, del principio
activo).
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7. Anexos:
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*Hipra. Enfermedad de los Edemas. Dirección web:
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http://www.veterinariargentina.com/revista/2011/12/laboratorio-de-referencia-de-e-coli-
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*Senasa. Dirección web:
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http://www.senasa.gov.ar/contenido.php?to=n&in=1171&io=4548. Fecha de consulta:
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http://www.solbio.com/Soluciones.asp?seccion=Cerdos. Fecha de consulta: junio 2013.
*Todo Argentina. Dirección web:
http://www.todo-argentina.net/Geografia/provincias/San_Luis/economia.htm
Fecha de consulta: julio 2013.
*Universo porcino. El portal del cerdo. Dirección/es web:
http://www.aacporcinos.com.ar/sanidad_porcina/infecciones_por_escherichia_coli_en_
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http://www.aacporcinos.com.ar/organismos_oficiales/oncca/informe_cadena_porcina.p
df
*INTA sitio web
http://inta.gob.ar/documentos/produccion-de-cerdos-en-argentina-situacion-
oportunidades-desafios
