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UNIVERSIDAD DE CALDAS
VICERRECTORÍA DE INVESTIGACIONES Y POSTGRADOS
CONTENIDO
1. Información general
Título del proyecto: Evaluación de marcadores SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) en progenitores de mora,
para generar una población filial F1.
Nombre de los Grupos de Investigación: (registre la información de los grupos que participan)
Grupo de Investigación en Biodiversidad y Biotecnología (Universidad Tecnológica de Pereira)
Nombre del Grupo: Grupo de Investigación en Biodiversidad y Biotecnología
(Universidad Tecnológica de Pereira)
Facultad/Departamento: Facultad de Ciencias Ambientales
Clasificación A____
Nombre del Grupo:
Facultad/Departamento:
Clasificación _SC____
Nombre:
Facultad/Departamento:
Clasificación _____
Nombre:
Facultad/Departamento:
Clasificación _____
Tipo de proyecto de I&D: Investigación Básica: Investigación Aplicada:
Creación: Innovación Tecnológica1:
Tipo de innovación:
Innovación tecnológica de producto Innovación tecnológica de proceso
Innovación organizacional
Área Estrátegica del Plan de Desarrollo
Biotecnología
Artes, Cultura y Humanidades Problemática Social
Salud
Ambiental
No corresponde a ninguna de las áreas
estratégicas
INTEGRANTES DEL EQUIPO DE INVESTIGACIÓN (indicar cuál es el investigador responsable)
NOMBRE/TIPO DE VINCULACIÓN EN LA
UNIVERSIDAD DE CALDAS
DEPARTAMENTO o PROGRAMA ÁREA DE CONOCIMIENTO
(según anexo 1)
1 Se refiere a aquellos proyectos que tienen como objetivo el desarrollo de nuevos productos o procesos,
así como las modificaciones tecnológicas importantes en productos o procesos
x
x
Facultad de Ciencias Agropecuarias Programa de Doctorado en Ciencias Agrarias
1
Ana María López Gutiérrez (Universidad
Tecnológica de Pereira) (Responsable)
Facultad de Ciencias
Ambientales
Agronomía, veterinaria y
afines
Carlos Felipe Barrera Sánchez (Director) Universidad de Caldas Agronomía, veterinaria y
afines
Lugar de Ejecución del Proyecto: (Municipio/Departamento)
Ciudad: Pereira Departamento: Risaralda
Presupuesto
Valor total del proyecto: $ 229.824.000
Fuentes de financiación: Sistema General de
Regalías. Departamento de Risaralda.
Valor solicitado en esta convocatoria: $
Duración total (meses): 30
2. Resumen ejecutivo
A pesar de su reconocida importancia en la generación de ingresos para pequeños productores
el cultivo de la mora ha tenido poco desarrollo tecnológico, la calidad y productividad presentan
alta variabilidad, debido principalmente a la falta de variedades reconocidas y a la falta de
material de siembra de calidad genética y fitosanitaria. Las investigaciones realizadas desde el
año 2000, en mora de castilla por parte del Grupo de investigación en Biodiversidad y
Biotecnología de la Universidad Tecnológica de Pereira, han profundizado en el área de
materiales de siembra con excelente calidad fitosanitaria y productiva mediante investigación
científica y participativa, las cuales promuevan la generación de conocimiento que le permitan
al agricultor vincularse a las cadenas productivas de manera más competitiva.
La siguiente propuesta hace parte de un conjunto de investigaciones llevadas a cabo por la
Universidad Tecnológica de Pereira, dentro del marco del programa “Mejoramiento de la calidad
del material de siembra para la competitividad de la cadena productiva de mora” realizadas en
torno a la formalización de materiales de siembra previamente caracterizados, en los cuales se
pretende, entre otros, mediante marcadores moleculares de última generación (SNP – Single
Nucleotide Polymorphisms) afinar los procesos de caracterización varietal en mora de castilla
(Rubus glaucus Benth) y relacionarlos con alguna característica morfológica. Y luego, obtener
por cruzamiento una población segregante, a partir de progenitores previamente
caracterizados.
3. Conformación y trayectoria del equipo de investigadores (máximo 500 palabras)
El Grupo de Investigaciones en Biodiversidad y Biotecnología (COL0000719), inició actividades
en 1993, como parte de la Facultad de Ciencias Ambientales de la Universidad Tecnológica de
Pereira, a través de proyectos de investigación y de postgrado en biotecnología, biología
molecular, agroecología y biodiversidad. Las líneas de investigación responden a la ubicación
geográfica y ecológica de la región, al compromiso social de la Universidad y a la búsqueda de
opciones agrícolas y de manejo de la vida silvestre que procuren combinar producción y
conservación, biodiversidad y necesidades humanas.
Facultad de Ciencias Agropecuarias Programa de Doctorado en Ciencias Agrarias
2
Líneas de Investigación:
Biología molecular
Cultivo de tejidos
Mejoramiento genético
Fitopatología
Bosques, agro ecosistemas y biodiversidad
Humedales naturales
En los últimos cinco años el grupo de investigación en Biodiversidad y Biotecnología ha centrado
su investigación en especies cultivadas y forestales de interés comercial, tales como nogal
cafetero (Cordia alliodora (Ruíz & Pavón), guayacán rosado (Tabebuia rosea (Bertol D.C), mora
de castilla (Rubus glaucus Benth) y algunas especies y cultivares del género Heliconia.
El grupo presenta una extensa producción académica, con la publicación de más de 60 artículos
en revistas indexadas nacionales e internacionales, libros y capítulos de libros. Además de dos
patentes de invención. Actualmente, el grupo se encuentra desarrollando junto con tres grupos
de investigación de la Universidad Tecnológica de Pereira y un Grupo de investigación de la
Universidad Libre el proyecto: “DESARROLLO DE CAPACIDADES CIENTÍFICAS Y TECNOLÓGICAS
EN BIOTECNOLOGÍA APLICADAS A LOS SECTORES DE LA SALUD Y LA AGROINDUSTRIA EN EL
DEPARTAMENTO DE RISARALDA”, financiado con recursos del Sistema General de Regalías,
vigencia 2014 – 2019.
4. Descripción del proyecto
4.1. Planteamiento de la pregunta o problema de investigación y su justificación
El género Rubus L. posee alrededor de 750 especies (Thompson, 1995; Gustafsson, 1942, 1943;
Hummer, 1996). Su importancia radica desde el punto de vista económico y ecológico en que es
comestible, ornamental, algunas especies son invasivas y de aparición temprana en procesos de
regeneración forestal (Thompson, 1995; Hummer, 1996). Las especies de Rubus comerciales
incluyen aquellas que poseen frutos rojos como “raspberries” (R. idaeus L.), y frutos de color
negro, “blackberries,” como la especie R. occidentalis L; las moras de los Andes (Rubus
Suramericanas) las cuales son consideradas “blackberries” o “Andean blackberries” (Thompson,
1997). Las variedades más cultivadas en el mundo provienen de las especies Rubus occidentalis
o de hibridaciones con Rubus ideaus. En Colombia, se cultiva principalmente la variedad
conocida como Mora de Castilla, con o sin espinas, Rubus glaucus Benth. Este cultivo está
distribuido en el país desde el Putumayo hasta el Magdalena Medio y se siembra entre los 1.600
y 2.400 msnm. Otras variedades cultivadas en el país son la mora negra, Rubus bogotensis HBK,
la mora de páramo, Rubus giganteus, la mora pequeña, R. megalococus y la mora grande Rubus
nubigenus.
La mora de castilla (Rubus glaucus Benth) es uno de los productos con mayor potencial de
desarrollo en la zona andina colombiana. En el año 2008, tuvo una participación del 0.7% en
área cultivada y 0.4% en producción nacional de cultivos permanentes, su tasa de crecimiento
anual fue de 8.8% en producción y 7.8% en área (Agronet, 2008). Colombia produce
aproximadamente 100 mil T/año. Los departamentos de Cundinamarca, Santander, Huila y
Antioquia son los mayores productores, con cerca del 70% de la cosecha nacional. Los
Facultad de Ciencias Agropecuarias Programa de Doctorado en Ciencias Agrarias
3
rendimientos, varían ampliamente: de seis a dieciséis toneladas por hectárea, para un promedio
nacional de 11 toneladas por hectárea al año (AGRONET, 2008); en cultivos altamente
tecnificados se ha llegado a obtener rendimientos de 30 T/ha por año. Con poblaciones de 2500
plantas/ha y óptimo manejo agronómico, se pueden alcanzar producciones de 14 a 16 T/ha por
año productivo, después de los 18 meses de establecido el cultivo.
A pesar de su reconocida importancia en la generación de ingresos para pequeños productores,
este cultivo ha tenido poco desarrollo tecnológico, la calidad y productividad presentan alta
variabilidad, debido principalmente a la falta de variedades reconocidas y a la falta de material
de siembra de calidad genética y fitosanitaria. Hasta el momento la siembra de esta especie se
realiza a través del empleo de selecciones locales realizadas por los agricultores (Lobo et al.,
2002).
La Cadena Agroalimentaria de la Mora en Colombia está conformada por productores asociados,
comercializadores, centros de investigación, industrias, entidades de apoyo. En octubre de 2010
se creó el Consejo Nacional de la Cadena de la Mora, como órgano consultivo del Gobierno
Nacional en materia de política para la sostenibilidad y competitividad de la cadena. La cadena
de la Mora a través del Consejo, constituyó cuatro mesas temáticas: 1) Plan de Registro,
Zonificación, Censo y Certificación; 2) Investigación de la Producción y Transferencia
(Mejoramiento, Fisiología y Fitosanidad); 3) Mercado, Agro - industrialización y Fomento; 4)
Ambiental. A su vez, la mesa temática de investigación priorizó tres temas de investigación
básica de alta repercusión en la cadena. Preparando así, una agenda de investigaciones
destacando como objetivos:
Formalizar la oferta de materiales de siembra previamente caracterizados y sometidos
a evaluaciones de estabilidad y adaptabilidad.
Evaluación de materiales promisorios de mora frente al comportamiento de problemas
fitosanitarios.
Buscar materiales con mayor adaptabilidad y tolerancia a las fluctuaciones climáticas
que ocurren con mayor frecuencia en las zonas de cultivo.
Garantizar a mediano plazo la sostenibilidad del cultivo mediante la utilización de
plantas de mora mejor adaptadas a las diferentes zonas de cultivo.
La apuesta entonces, es incrementar los rendimientos mediante la evaluación del
comportamiento de materiales promisorios de mora frente a problemas fitosanitarios de alta
repercusión en la producción, realizar investigaciones en mora, de cara a problemas de cambio
climático y evaluar en pruebas de adaptabilidad y estabilidad materiales promisorios de mora,
debidamente caracterizados.
Las investigaciones realizadas desde el año 2000, en mora de castilla por parte del Grupo de
investigación en Biodiversidad y Biotecnología de la Universidad Tecnológica de Pereira, han
contribuido al fomento y desarrollo de actividades agrícolas alternativas en el cultivo de la mora,
especialmente en el área de materiales de siembra con excelente calidad fitosanitaria y
productiva mediante investigación científica y participativa, las cuales promueven la generación
de conocimiento que le permiten al agricultor vincularse a las cadenas productivas de manera
más competitiva.
La siguiente propuesta hace parte de un conjunto de investigaciones llevadas a cabo por la
Universidad Tecnológica de Pereira, dentro del marco del programa “Mejoramiento de la calidad
Facultad de Ciencias Agropecuarias Programa de Doctorado en Ciencias Agrarias
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del material de siembra para la competitividad de la cadena productiva de mora” realizadas en
torno a la formalización de materiales de siembra previamente caracterizados, en los cuales se
pretende, entre otros, mediante marcadores moleculares de última generación (SNP – Single
Nucleotide Polymorphisms) afinar los procesos de caracterización varietal en mora de castilla
(Rubus glaucus Benth) y relacionarlos con alguna característica morfológica. Además, obtener
por cruzamiento una población segregante, a partir de progenitores previamente
caracterizados.
4.2 Marco Teórico
La familia Rosacea comprende alrededor de 90 géneros y unas 3000 especies, dentro de las
cuales se incluyen: árboles frutales de importancia económica como manzanas (Malus pumila
Mill.) y peras (Pyrus spp.); frutos de hueso como duraznos (Prunus persica); numerosas especies
ornamentales como la rosa (Rosa spp.), y frutos blandos como la fresa, la frambuesa y las moras,
entre otros. Varias clasificaciones de la familia han sido propuestas basadas en la morfología,
mientras que Schulze-Menz (1964) proponen la categorización de la familia en subfamilias:
Maloideae, Amygdaloideae, Rosoideae y Spiraeoideae basados en el número de cromosomas y
el tipo de frutas (Longhi et al, 2014).
Los géneros de la subfamilia Rosoideae tienen muchas especies, por ejemplo, el género Fragaria
tiene 21 especies reconocidas y descritas, entre tanto, el género Rosa tiene unas 120 especies y
el género Rubus unas 750 especies (Eriksson et al, 1998). Las especies de la subfamilia Rosoideae
exhiben una alta variabilidad morfológica y diferentes niveles de ploidía, por lo tanto, la
determinación y clasificación filogenética de las especies de cada uno de los géneros ha sido
objeto de numerosos análisis con herramientas moleculares.
4.2.1. Marcadores moleculares para géneros de la subfamilia Rosoideae
En los géneros Fragaria, Rosa y Rubus, se han desarrollado y utilizado exitosamente marcadores
microsatélites (SSR) para identificar cultivares. En Fragaria, un grupo de 10 SSRs han sido
empleados para caracterizar los bancos de germoplasma de fresa (Govan et al, 2008), y más
recientemente Chambers et al. (2013) usó 16 SSRs con un gran número de repeticiones para
discriminar cultivares de una colección de 219 individuos. En Rosa, se han utilizado 24 SSRs para
caracterizar unos 70 híbridos (Esselink et al, 2003). En Rubus, por su parte, 21 SSRs se utilizaron
para discriminar entre 148 accesiones cultivadas y silvestres de moras (Bassil et al, 2012). Otros
marcadores moleculares, como los SNP (Single Nucleotide Polymorphism), han sido generados
a partir de genomas de la subfamilia Rosoideae empleando el método de secuenciación de
Sanger a partir de librerías de expresión (EST) o por secuenciación directa de productos PCR que
han amplificado regiones genómicas de interés (Vilanova, 2008).
Desde la aparición de tecnologías de secuenciación de segunda generación, se ha mejorado
ostensiblemente la capacidad para descubrir, probar y asociar SNPs en progenies y colecciones
de germoplasma. Las secuenciaciones de segunda generación tanto en ADN genómico como en
ARN mensajero (comúnmente denominada RNA seq) han sido utilizadas para identificar SNPs
en Fragaria, Rubus y Rosa (Celton et al, 2010; Ward et al; 2013; Cronn et al, 2012), seguidos de
numerosos análisis que han permitido, el descubrimiento de cientos de SNPs en un solo ensayo
de genotipificación.
Facultad de Ciencias Agropecuarias Programa de Doctorado en Ciencias Agrarias
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Los estudios de caracterización molecular también han perseguido la búsqueda de marcadores
asociados a resistencia de enfermedades. Dentro de las que se destacan: Botrytis cinerea (moho
gris), Phytophthora fragariae y P. cactorum, Verticillium dahliae, y miembros del género
Colletotrichum, especialmente, C. acutatum (Antracnosis). Por ejemplo, el gen que controla la
pubescencia en el tallo, gen “H”, fue mapeado en una población de raspberry (Rubus idaeus), su
forma homocigota (HH) se encuentra difícilmente y está asociada a un gen letal, sin embargo, la
forma heterocigota (Hh), se ha asociado a resistencia a Botrytis, pero susceptibilidad al mildeo
polvoso (Sphaerotheca macularis) (Jennings at al, 1982; Jennings et al, 1989).
4.2.2. Aspectos biológicos y filogenéticos del género Rubus
Una de la revisiones taxonómicas más reciente identifica en el género Rubus unas 429 especies
agrupadas en 12 subgéneros: el más grande es el subgénero Idaeobatus (conocidas como
“raspberries”, 117 especies), el subgénero Malachobatus (115 especies provenientes de Asia), y
el subgénero Rubus (también conocido como Eubatus Focke; son llamadas comúnmente
“blackberries” con unas 132 especies aproximadamente) (Tabla 1). Solo tres de los nueve
subgéneros restantes tienen más de seis especies. Numerosas especies y taxa se consideran
infragenéricas pertenecen al subgénero Rubus y han sido reconocidas por Focke (Gustafsson,
1943; Weber, 1996).
Tabla 1. Subgéneros de Rubus y número de especies (Focke, 1894).
Subgéneros Número de especies
Anoplobatus (Focke) Focke 6
Chamaebatus (Focke) Focke 5
Chamaemoras (Hill) Focke 1
Comaropsis (Rich.) Focke 2
Cylactis (Raf.)Focke 14 (4 series)
Dalibarda (L.) Focke 5
Dalibardastrum Focke 4
Idaeobatus ( Focke ) Focke 117 (9 secciones)
Lampobatus Focke 10
Malachobatus (Focke) Focke 115 ( 7 secciones)
Orobatus (Focke) 19
Rubus L. (= Eubatus Focke) 132 ( 6 secciones)
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Las especies de Rubus comerciales incluyen aquellas que poseen frutos rojos como “raspberries”
(R. idaeus L.), y frutos de color negro, “blackberries” como la especie R. occidentalis L; las moras
de los Andes (Rubus Suramericanas) son consideradas “blackberries” o “Andean blackberries”
(Thompson, 1997).
La variabilidad genética del género Rubus es conocida en todo el mundo y ha sido ampliamente
estudiada desde muchos aspectos fenotípico, morfológico, cromosómico y molecular (Alice y
Campbell, 1999; Graham y McNicol, 1995; Graham et al., 1997a, 1997b). Uno de los aspectos
más interesantes del género es la variabilidad en el número de cromosomas, la poliplodía e
hibridización es prevalente en Rubus, solo los subgéneros Idaeobatus, Dalibarda, y Anoplobatus
son predominantemente diploides, mientras que Dalibardastrum, Malachobatus, y Orobatus
son exclusivamente poliploides (Thompson, 1995, 1997). La hibridización en Rubus se presenta
principalmente entre especies estrechamente relacionadas (Steele y Hodgdon, 1963, 1970;
Naruhashi, 1979, 1990; Kraft, Nybom y Werlemark, 1995) y en algunos casos entre subgéneros
(Gustafsson, 1942; Jennings, 1978; Weber, 1995; Alice, et al., 1997), incluso, varios híbridos
intersubgenéricos son de importancia comercial (Waught et al., 1990).
4.2.3. Marcadores moleculares para el género Rubus
La variabilidad genética del género Rubus es conocida en todo el mundo y ha sido ampliamente
estudiada desde muchos aspectos fenotípico, morfológico, cromosómico y molecular (Alice et
al, 1997; Graham y McNicol, 1995; Graham et al., 2002, 2004, 2006).
La especie Rubus glaucus, mora de los andes, está distribuida en las tres cordilleras de Colombia,
combina características del subgénero Idaeobatus, y del subgénero Rubus. Es un anfidiploide ó
alotetraploide fértil, que se originó por la fusión de los genomas de dos especies (Jennings,
1988). La mayoría de las especies del género Rubus son plantas perennes que emiten ramas o
cañas de tallo corto, formando una macolla hasta de cinco metros de diámetro. Las ramas y
hojas están provistas de espinas curvas, los tallos jóvenes y el reverso de las hojas están
cubiertos de una cera blancuzca que le da el color característico de la especie (León, 1987).
Delgado et al. (2010) encontraron para cultivares de la especie R. glaucus un número de 28
cromosomas, asumiendo como número básico del género Rubus n=7, Rubus glaucus con lo cual
se corroboraría que esta especie es tetraploide (4x).
En Colombia hay algunos esfuerzos en el estudio de la diversidad genética del género, Zamorano
et al. (2004) realizaron una caracterización molecular y morfológica de especies del género
Rubus utilizando microsatélites aleatorios RAMS. Colectaron 31 muestras en la zona sur del país
y cuatro muestras de la Universidad del Quindío procedentes de cultivo in vitro y un material
cultivado del Municipio de Miranda (Cauca), para un total de 36 materiales que se conservan en
una colección en Palmira. Las colectas se realizaron en los departamentos de Valle, Cauca y
Nariño, las especies colectadas y observadas, por el grupo de la Universidad Nacional sede
Palmira, fueron Rubus glaucus, R. urticifolius y R. robustus. También se observó la especie Rubus
idaeus que cohabita en algunos sitios del Valle con R. glaucus y R. urticifolius.
Zamorano et al. (2004) encontraron que las accesiones pertenecientes a Rubus glaucus se
encuentran a un nivel de similitud 0.60, lo que evidencia una alta variación entre individuos
dentro de las procedencias. Los anteriores resultados contrastan con los obtenidos por
Marulanda y Márquez (2001) quienes al evaluar materiales cultivados de mora (Rubus glaucus)
Facultad de Ciencias Agropecuarias Programa de Doctorado en Ciencias Agrarias
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encontraron valores de similitud del 85 y el 100% para los doce cebadores RAPDs utilizados,
sugiriendo así menor variación entre los materiales cultivados.
Marulanda et al, (2007) evaluaron la diversidad genética de especies cultivadas y silvestres del
género Rubus, entre ellas, R. robustus, R. urticifolius, R. glaucus y R. rosifolius mediante AFLP y
marcadores microsatélites desarrollados para la especie R. alceifolius. Este estudio arrojó
patrones de bandeo específicos para cada una de las especies, además los microsatélites
utilizados permitieron distinguir genotipos diploides de tetraploides. Se encontró además, que
ambas técnicas (AFLP y SSR) se complementaron para explicar las relaciones entre especies
cultivadas y silvestres del género Rubus en la zona andina colombiana.
Marulanda y López (2009) realizaron caracterizaciones tanto moleculares como
morfoagronómicas para especies cultivadas y silvestres de Rubus glaucus con y sin aguijones.
Las caracterizaciones moleculares fueron realizadas con SSR desarrollados para otras especies
del género Rubus, los cuales fueron transferibles a la especie Rubus glaucus. Las evaluaciones
tanto morfológicas como moleculares permitieron diferenciar materiales cultivados y no
cultivados de R. glaucus.
Duarte et al (2011), evaluaron la huella genómica y las relaciones genéticas de genotipos élite
de Rubus glaucus colombianas, mediante el análisis de marcadores AFLP generados con el uso
de tres combinaciones de cebadores. De un total de 179 loci amplificados por las tres
combinaciones, 20% resultaron polimórficos, con un alto porcentaje de similitud entre los
genotipos evaluados.
Finalmente, Marulanda y López (2012), desarrollaron marcadores microsatélites específicos
para la especie R. glaucus, con el fin de obtener mayores poderes de discriminación,
encontrando, que el número de marcadores microsatélites necesarios para una identificación
de ciertos cultivares es de 12 SSR, aunque se concluyó la necesidad de desarrollar marcadores
moleculares más discriminatorios y posiblemente asociados a características morfológicas de
interés.
4.2.4. Biología reproductiva en Rubus glaucus
En mora de castilla (R. glaucus) se presentan dos tipos de propagación natural, por semilla y
vegetativamente. En uno de los primeros reportes sobre esta especie, se resalta la semejanza
de las plantas desde Guatemala hasta Ecuador y se sugirió la posibilidad de que sea una especie
apomíctica (Darrow, 1952), donde la producción de semilla se da tanto por recombinación
genética entre los genomas parentales, como semilla con información genética idéntica a la
planta madre. Un estudio preliminar sobre la biología floral de R. glaucus, señala en primer lugar
que el número de pistilos es mayor al número de estambres por fruto, en una proporción de 2:1.
Y con respecto al método de polinización que permite un mejor cuajado de fruto, se encontró
que la polinización cruzada muestra un número mayor de drupeolas formadas, que el método
de autopolinización, así como una mejor calidad en la distribución y tamaño de las drupeolas. El
estudio concluye que la mora es una especie de polinización cruzada, que permite un 20% de
autopolinización y que puede presentar incompatibilidad parcial (Santana y Echeverri, 2000).
4.2.5. Cruzamientos en especies del género Rubus con fines de mejoramiento
Facultad de Ciencias Agropecuarias Programa de Doctorado en Ciencias Agrarias
8
La mayoría de los cultivares de red raspberry se han originado a partir de dos subespecies: las
raspberries europeas, R. idaeus, plantas diploides caracterizadas por sus inflorescencias sin
vainas y frutos en forma de dedal; y la raspberry norteamericana, R. strigosus, otra especie
diploide de frutos redondeados. Los híbridos entre estas dos especies han sido exitosos. Cinco
cultivares parentales dominan los ancestros de raspberry (Dale et al., 1993). Los cuales incluyen
‘Lloyd George’ y ‘Pyne’s Royal’ derivados de R. idaeus, ‘Newburgh’ derivado de R. strigosus, y
‘Preussen’ y ‘Cuthbert’ derivados de cruzamientos entre R. idaeus y R. strigosus. Los
mejoradores han utilizado recientemente otras especies del subgénero Idaeobatus, como R.
occidentalis, R. cockburnianus Hemsl., R.biflorus Buch., R. kuntzeanus Hemsl., R. parvifolius
Hemsl., and R. pungens oldhamii [Mig]. Maxim), y una del subgénero Anoplobatus (R. odoratus
L.) para desarrollar nuevos cultivares (Daubeny, 1996).
Por su parte, las blackberries fueron domesticadas en Europa en el siglo XVII y en Norte América
en el siglo XIX (Jennings, 1988). A medida que se presentaba el desplazamiento de los colonos a
nuevas áreas, se promocionó la siembra de especies nativas de blackberries en donde se
permitió el cruzamiento natural. Estas selecciones silvestres incluyeron los cultivares
‘Aughinbaugh’, ‘Dorchester’, ‘Lawton’, ‘Eldorado’, y ‘Lucretia’, los cuales fueron liberados en la
década de 1850 (Jennings, 1988). La superioridad de estos cultivares contribuyeron
enormemente al aumento en los cultivos en Norte América.
La mayoría de las blackberries cultivadas en Europa están relacionadas, o se han derivado, de R.
ulmifolius, R. nitidioides y R. thrysiger (Hall, 1990). Los mejoradores de blackberries todavía no
han aprovechado un vasto reservorio de especies e híbridos que se presentan en muchas partes
del mundo (Hall, 1990).
Para el caso de Rubus glaucus, solo se presentan dos reportes de cruzamientos, uno realizado
por la Universidad de Maryland (Estados Unidos), donde se cruzaron muestras de R. glaucus
colectadas en Venezuela, sin resultados positivos y el otro realizado por el Departamento de
Agricultura de los Estados (USDA) y la Universidad de Oregon, a partir de R. glaucus
ecuatorianas, con resultados experimentales positivos en el origen de progenies, pero no se
reportan otros resultados relacionados con el cruzamiento (Postman, 2001).
4.3 Objetivos
Objetivo general
Caracterizar materiales promisorios de mora de castilla (Rubus glaucus Benth) diferenciales en
características de interés agronómico, mediante marcadores moleculares, con el fin de
seleccionar parentales para procesos de cruzamiento.
Objetivos específicos
1. Caracterizar cultivares promisorios de mora de castilla contrastantes para una
característica morfológica, mediante marcadores SNP (Single Nucleotide
Polymorphisms) obtenidos previamente, a partir de la evaluación del transcriptoma.
2. Obtener por cruzamiento una población segregante de mora de castilla,
correspondiente a la primera generación filial, a partir de progenitores previamente
caracterizados y diferentes en al menos una característica de interés morfoagronómico.
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4.4 Metodología propuesta
A continuación se describe la metodología para alcanzar cada uno de los objetivos:
Para el Objetivo específico 1. Caracterizar cultivares promisorios de mora de castilla
contrastantes para una característica morfológica, mediante marcadores SNP (Single Nucleotide
Polymorphisms) obtenidos previamente, a partir de la evaluación del transcriptoma.
Antecedentes
Para la obtención de marcadores SNP, el Grupo de Investigación en Biodiversidad y
Biotecnología realizó durante los años 2012- 2014, la identificación de genes involucrados en la
tolerancia de cultivares de mora de castilla al ataque de antracnosis (Colletotrichum
gloeosporioides) mediante el análisis del transcriptoma (RNA - seq). Las nuevas metodologías de
pirosecuenciación recientemente desarrolladas, han facilitado el estudio de los transcriptomas
en plantas conocidas como modelos biológicos. La metodología de RNA – seq, consiste en la
obtención de un conjunto de ARN (total o fraccionado, tal como cadenas de poly (A) +), la
posterior obtención de ADNc con la enzima transcriptasa inversa lo que finalmente permite
tener una librería de cDNA con adaptadores que son dispuestos en uno o ambos extremos de
los fragmentos. Cada molécula, con o sin amplificación es secuenciada de forma tal, que se
obtienen secuencias cortas. Estas lecturas pueden tener un tamaño que oscila entre 30 – 400
pb, dependiendo de la tecnología de secuenciación. Luego de la secuenciación, los resultados
de las lecturas son alineados a uno o varios genomas de referencia o transcritos de referencia,
o son ensamblados de novo sin la secuencia genómica que produzca una transcripción (Wang et
al., 2008).
El análisis de expresión diferencial mediante RNAseq, de cultivares de mora de castilla
susceptibles y tolerantes, cuando fueron infectados con Colletotrichum gloeosporioides,
permitieron seleccionar mediante los programas Bowtie2 v2.2.4 (Langmead and Salzberg 2012)
y Samtools v0.1.19 (Li et al., 2009) 200 genes donde se encontraron marcadores SNPs. A partir
de estos genes, se diseñaron 100 primers para genotipificación por medio de PCR. Para este
diseño se utilizó el software BatchPrimer3,
(http://probes.pw.usda.gov/batchprimer3/index.html).
Los marcadores SNPs previamente descritos serán validados para ser utilizados en evaluación
de cultivares de mora de castilla previamente caracterizados por el grupo de Investigación.
Para la caracterización con los marcadores SNP se utilizarán los siguientes elementos:
Material vegetal
Para la evaluación de SNPs se seleccionarán un mínimo de 10 materiales de interés de Rubus
glaucus, pertenecientes a la colección de trabajo de Rubus glaucus del Grupo de Investigaciones
en Biodiversidad y Biotecnología y los cuales son contrastantes en una característica morfológica
(Sin aguijones – Con aguijones), y/o en su respuesta diferencial ante el ataque de C.
gloeosporioides (Tolerancia – Susceptibilidad), y/u otra característica morfoagrónómica de
interés. Estos cultivares se encuentran en la Universidad Tecnológica de Pereira, y sus
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caracterizaciones moleculares con marcadores microsatélites y/o evaluaciones de campo se
reportaron previamente (López et al, 2013; Marulanda et al, 2012).
Extracción de ADN
Para la extracción de ADN se utilizará tejido foliar sano y el kit comercial Plant DNeasy Mini Kit
(QIAGEN) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Las reacciones de amplificación se llevarán a cabo mediante condiciones descritas por
Marulanda et al. (2007, 2009), y un perfil de amplificación “touchdown”. Los primers para
detectar posibles diferencias SNP, se referencian en el anexo 1. Las reacciones de amplificación
se llevarán a cabo en un volumen final de 12,5 µl con 0.3 µM de cada uno de los primers, 15 µM
de cada DNTP, 1 X de buffer de reacción (10mM de Tris HCl, 50mM de KCl, 1,5mM de MgCl2),
1U de Taq polimerasa, 2 mM de MgCl2 y 10 ng/µL de ADN. Se realizará un programa de
amplificación, de 32 ciclos con desnaturalización a 95°C por 60 sefundos; apareamiento por 60
segundos, con disminución de temperatura de 1°C, cada dos ciclos desde 64°C a 59°C, 10 ciclos
a 58°C, y 10 ciclos a 57°C; extensión a 72°C por 60 segundos; y una extensión final a 72°C por 5
min. La separación de los productos amplificados se realizará mediante electroforesis en geles
desnaturalizantes de poliacrilamida al 6%, los cuales serán corridos en cámara vertical Sequi-
Gen Sequencing Cell de BioRad, a 110 W durante una hora a una temperatura de 50°C. Los geles
serán teñidos con nitrato de plata siguiendo el protocolo de Benbouza et al. (2006).
Finalmente, los productos amplificados serán secuenciados, y las secuencias obtenidas serán
verificadas mediante un análisis BLAST (Basic Local Alignment Search Tool – NCBI),
posteriormente, se alinearán mediante un análisis Clustal Omega (EMBL –EBI), con el fin de
encontrar la posible diferencia nucleotídica en las muestra analizadas.
Análisis de los resultados de amplificación
Se realizará una correlación entre los polimorfismos generados en la amplificación de los SNP, y
los cultivares evaluados con características diferenciales (Presencia - Ausencia de aguijones,
respuesta diferencial ante el ataque de C. gloeosporioides), generando los siguientes grupos:
Perfiles SNP iguales y cultivares con aguijones.
Perfiles SNP iguales y cultivares sin aguijones.
Perfiles SNP iguales y cultivares tolerantes a C. gloeosporioides
Perfiles SNP iguales y cultivares susceptibles a C. gloeosporioides
Para el objetivo específico 2. Obtener por cruzamiento una población segregante de mora de
castilla, correspondiente a la primera generación filial, a partir de progenitores previamente
caracterizados y diferentes en al menos una característica de interés morfoagronómico.
A continuación se describen los materiales y métodos para el desarrollo de este objetivo:
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11
Progenitores:
Se utilizarán como progenitores los materiales de mora previamente caracterizados morfológica
y molecularmente (López et al, 2013; Marulanda et al, 2012), y diferentes en al menos una
característica de interés. A continuación se detallan los progenitores:
UTP 1: Cultivar de alta producción (17 Ton /ha /año), sin aguijones, con sobreexpresión de genes
ante el ataque de C. gloeosporioides.
UTP 7: Cultivar de alta producción (17 Ton /ha /año), sin aguijones, con sobreexpresión de genes
ante el ataque de C. gloeosporioides.
UTP 4: Cultivar de alta producción (15 Ton / ha/ año), con aguijones, susceptible al ataque de C.
gloeosporioides y tamaño de fruta superior.
Los progenitores se dispondrán en potes individuales, manteniendo las condiciones de nutrición
y fitosanidad para asegurar su floración.
Cruzamientos y Diseño experimental
Se realizará una polinización cruzada controlada, con tres progenitores. El modelo de
cruzamiento será dialélico recíproco 3 x 3 (sin considerar autofecundaciones), para un total de
6 cruzamientos. Las flores receptoras de polen sufrirán un proceso de emasculación con el fin
de evitar la autopolinización, cuando se encuentren en el paso de botón floral a flor abierta, y
recibir el polen de los cultivares masculinos. Después de realizada la polinización manual, las
flores serán embolsadas para evitar la posterior recepción de polen, y se permitirá la formación
de los frutos, los cuales corresponderán a una drupa.
Tanto los cuatro progenitores, como sus seis cruzamientos simples resultantes (F1), se
establecerán bajo un diseño experimental completamente aleatorizado en condiciones de
vivero. El manejo del experimento en general, se hará de acuerdo a las recomendaciones
técnicas, derivadas a partir de visitas semanales.
Obtención y siembra de semillas
La semilla se obtendrá a partir de cada drupa de los frutos que hayan resultado de la polinización
controlada, cuando hayan alcanzado el grado de madurez 6, según la Norma Técnica Colombiana
para la mora de Castilla 4106 (NTC 4106) del ICONTEC (ICONTEC, 1997). Los frutos se depositarán
en un recipiente plástico, en el que se adicionará agua; luego, se macerarán manualmente y se
dejarán en reposo durante 72 h, para que se dé el proceso de fermentación, el cual facilitará la
separación de la pulpa y la semilla. Posteriormente, las simientes se colocarán en un cedazo y
se lavarán con agua corriente para terminar su limpieza. Para asegurar los procesos de
germinación las semillas sufrirán un proceso de escarificación sumergiéndolas en ácido sulfúrico
al 75% (%V /V) durante 60 minutos (Bonilla, 2013). Posteriormente, las semillas se sembrarán
en arena estéril, con el fin de evitar la afección por hongos causantes del “mal de tallito”.
Cuando las plántulas hayan alcanzado una altura mínima de 15 cm y dos hojas verdaderas serán
trasplantadas en materos individuales para sus evaluaciones morfológicas. Para esta primera
etapa experimental se evaluará la presencia o ausencia de aguijones en las progenies.
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12
Comprobación de la efectividad de los cruzamientos
Para comprobar la efectividad de los cruzamientos (segregación), serán evaluadas las progenies
y sus progenitores mediante el uso de dos marcadores SSR previamente reportados por
Marulanda et al. (2012), que tengan un alto contenido polimórfico.
Análisis genético
Se empleará el método III de Griffing (1956), para el análisis del cruzamiento dialélico, en el cual
se estudiarán los seis cruzamientos directos (Cruz et al., 2004). El modelo permitirá realizar un
análisis de la Aptitud Combinatoria General (APG) y de la Aptitud Combinatoria Específica (ACE)
para la presencia / ausencia del aguijón. El análisis se realizará bajo el siguiente modelo genético
estadístico (1):
𝑌𝑖𝑗𝑘 = 𝜇 + 𝐺𝑖 + 𝑆𝑖𝑗 + 𝑟𝑖𝑗 + 𝜀𝑖𝑗𝑘 (1)
Donde:
𝑌𝑖𝑗𝑘: Observación 𝑖𝑗𝑘 ésima.
𝜇: Media de la población.
𝐺𝑖: Efecto de la aptitud combinatoria general del 𝑖 - ésimo y 𝑗 - ésimo padre.
𝑆𝑖𝑗: Efecto de la aptitud combinatoria específica entre el 𝑖 - ésimo y 𝑗 - ésimo padre.
𝑟𝑖𝑗: Efecto recíproco que mide las diferencias proporcionadas por el progenitor 𝑖, o 𝑗, cuando
es utilizado como progenitor masculino o femenino en el cruzamiento 𝑖𝑗.
𝜀𝑖𝑗𝑘: Error experimental.
La ACG servirá para definir el comportamiento promedio de una línea en combinaciones
híbridas.
La ACE identificará las mejores combinaciones híbridas donde se designarán aquellos casos en
los cuales ciertas combinaciones lo hacen relativamente mejor o peor de lo que podría
esperarse.
Estrategias de divulgación
Los resultados de este proyecto esperan ser socializadas a través de publicaciones científicas en
revistas indexadas y mediante ponencias en eventos científicos de carácter nacional.
4.5 Resultados esperados2
A continuación se relacionan los resultados a obtener por cada uno de los objetivos específicos:
Objetivo específico Resultado Tipo de resultado
Caracterizar cultivares promisorios de
mora de castilla contrastantes para
una característica morfológica,
Patrones de amplificación
de al menos 10 cultivares
promisorios de mora con
Generación de nuevo
conocimiento.
2 Serán reportados en los informes técnicos de avance (anual) o final, de acuerdo al formato para tal fin, disponible en la página web de la Universidad en el link de investigaciones
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13
mediante marcadores SNP (Single
Nucleotide Polymorphisms)
obtenidos previamente, a partir de la
evaluación del transcriptoma.
los marcadores SNP
previamente desarrollados.
Caracterizar cultivares promisorios de
mora de castilla contrastantes para
una característica morfológica,
mediante marcadores SNP (Single
Nucleotide Polymorphisms)
obtenidos previamente, a partir de la
evaluación del transcriptoma.
Asociación entre los datos
morfoagronómicos
previamente obtenidos con
posibles polimorfismos
derivados de las
caracterizaciones
moleculares.
Generación de nuevo
conocimiento.
Obtener por cruzamiento una
población segregante de mora de
castilla, correspondiente a la primera
generación filial, a partir de
progenitores previamente
caracterizados y diferentes en al
menos una característica de interés
morfoagronómico.
Obtención de al menos una
población segregante de
mora de castilla a partir de
progenitores previamente
caracterizados.
Generación de nuevo
conocimiento.
Obtener por cruzamiento una
población segregante de mora de
castilla, correspondiente a la primera
generación filial, a partir de
progenitores previamente
caracterizados y diferentes en al
menos una característica de interés
morfoagronómico.
Determinación de la
Aptitud Combinatoria
Específica (APE) y la Aptitud
Combinatoria General
(APG)
Generación de nuevo
conocimiento.
Todos Formación de un doctorado
en Ciencias Agrarias
Fortalecimiento de la
comunidad científica
colombiana
Todos Sometimiento a
publicación de al menos un
artículo científico en revista
indexada nacional o
internacional
Apropiación
social/pública del
conocimiento
Todos Participación como
ponente, en al menos un
evento científico de
carácter nacional
Apropiación
social/pública del
conocimiento
4.6 Impactos esperados a partir del uso de los resultados (máximo 1 página)
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14
Impactos durante la ejecución del proyecto:
Los procesos de laboratorio serán desarrollados en laboratorios especializados, con protocolos
de manejo de residuos peligrosos estandarizados, con el fin de minimizar los efectos negativos
sobre el ambiente y la salud humana, que puedan tener la ejecución de actividades propias del
desarrollo del proyecto.
Impactos a largo plazo sobre la cadena productiva:
Se espera que en los próximos 10 años, mediante la aplicación de marcadores tipo SNPs,
resultados de ésta investigación, se fortalezca la competitividad de la cadena mediante la
selección temprana de materiales promisorios para siembra para mora de castilla (Rubus
glaucus Benth).
4.7 Cronograma de actividades:
A continuación se discriminan las actividades a desarrollar para un periodo de 2.5 años (30
meses), descritas por TRIMESTRE:
Actividad 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Selección de cultivares promisorios de R.
glaucus
X
Extracción de ADN para evaluación de
marcadores SNP previamente
desarrollados
X
Estandarización y amplificación con
marcadores SNP previamente
desarrollados
X X
Validación de marcadores que presenten
polimorfismos con características
morfoagronómicas previamente
evaluadas
X X X
Disposición de progenitores en
condiciones de vivero
X
Cruzamientos entre progenitores X X
Obtención de semillas X
Siembra de semillas X
Evaluaciones morfológicas en la F1 X
Análisis de resultados X
Elaboración de artículos e informe final X X X
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15
5. Compromisos
Al finalizar la ejecución del proyecto doctoral se espera:
Someter a publicación al menos un artículo científico en revista indexada nacional o
internacional.
Participar como ponente, en al menos un evento científico de carácter nacional
6. Bibliografía
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19
7. Presupuesto
PRESUPUESTO
RUBROS*
FUENTES
TOTAL UNIVERSIDAD FINANCIACIÓN EXTERNA
RECURRENTE3 V.I.P. RECURRENTE RECURSOS FRESCOS
1. SERVICIOS PERSONALES
1.1 Investigadores $ 48.600.000
$ 48.600.000
1.2 Auxiliares $ 7.200.000 $ 7.200.000
1.3 Consultores
1.4 Asesores $ 36.000.000
$ 36.000.000
2. GASTOS GENERALES
2.1 Servicios técnicos
2.1.1 Exámenes
2.1.2 Pruebas $ 30.000.000
$ 30.000.000
2.2 Materiales e insumos
2.2.1 De campo
2.2.2 De oficina (papel, tinta, fotocopias)
$ 500.000 $ 500.000
2.2.3 De laboratorio $ 10.000.000
$ 10.000.000
2.3 Apoyo económico para gastos de viaje y transporte
2.3.1 Tiquetes aéreos
2.3.2 Pasaje terrestres $ 1.440.000 $ 1.440.000
2.3.3 Gastos de viaje (Gasolina y Peaje)
2.3.4 Auxilio para viaje
2.3.5 Apoyo económico para alojamiento y alimentación4
$ 1.500.000 $ 1.500.000
2.5 Equipos
2.5.1 Alquiler
3. INVERSIÓN
3.1 Equipo requerido
3.1.1 Para comprar $ 66.584.000 $ 66.584.000
3.1.2 Propio $ 28.000.000 $ 28.000.000
3 Costos recurrentes son los rubros existentes en cada institución o empresa 4 Se recomienda que este valor esté por debajo de la liquidación de viáticos estipulada en el
Acuerdo No. 04 del Consejo Superior del 15 de febrero de 2005
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RUBROS*
FUENTES
TOTAL UNIVERSIDAD FINANCIACIÓN EXTERNA
RECURRENTE3 V.I.P. RECURRENTE RECURSOS FRESCOS
3.2 Planta física
3.2.1 Adecuación
3.2.2 Alquiler
3.4 Material bibliográfico
3.4.1 Para comprar
3.5 Software
3.5.1 Para comprar
3.5.2 Propio
1. ADMINISTRACIÓN
20%
TOTAL $ 64.000.000 $ 165.824.000 $ 229.824.000
PORCENTAJE DE FUENTES
27.8 % 72.2 % 100 %
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21
TABLAS DE ANEXO AL PRESUPUESTO Descripción de los gastos de personal
Nombre del Investigador / Experto/
Auxiliar/estudiante
Formación Académica
Función dentro en del
proyecto
Institución o Empresa
Tipo de vinculación
DEDICACIÓN Horas/semana
Fuentes
Total Recursos de esta convocatoria
Especie
Carlos Felipe Barrera Ingeniero agrónomo Ph.D
Asesorar actividades científicas conducentes al logro de los objetivos del proyecto
Universidad de Caldas
Docente ocasional 5 $ 36.000.000 $ 36.000.000
Ana María López Gutiérrrez Ingeniera agrónoma M.Sc
Coordinar y ejecutar actividades científicas conducentes al logro de los objetivos del proyecto
UTP Contrato 20 $ 48.600.000 $ 48.600.000
Paola Andrea López Mora Bióloga Apoyar la realización de pruebas de laboratorio
UTP Contrato 10 $ 7.200.000 $ 7.200.000
Totales $ 91.800.000
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22
Descripción de equipos a adquirir
Equipos Justificación Fuentes Otras fuentes
Total Recursos de esta convocatoria
Sistema de documentación y análisis de geles GELDOC XR
Documentación de geles con colorantes fluorescentes y visibles
$ 36.540.000 $ 36.540.000
Termociclador c1000 Touch Biorad con bloque de 96 pozos.
Se requiere para los protocolos de extracción de ADN
$ 27.492.000 $ 27.492.000
MacBook Pro 13" Análisis bioinformático que requiere análisis computacional de alto rendimiento
$ 2.552.000 $ 2.552.000
Totales $ 66.584.000
Descripción de software a adquirir
Software Justificación Fuentes Otras fuentes
Total Recursos de esta convocatoria
Descripción y justificación de viajes
Lugar /No. de viajes Justificación Pasajes ($) Estadía ($) Total días Total
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Universidad de Caldas (Manizales)
Asesoría en análisis de información y afinamiento de procesos de laboratorio y / o campo.
$ 20.000 $ 20.000 72 $ 2.880.000
Totales $ 2.880.000
Valoración de salidas de campo (complete un cuadro por salida o pondere el total de las salidas)
Lugar de la Salida :
Justificación:
Concepto $ / día No. de Días TOTAL
Alimentación
Alojamiento
Transporte
TOTAL
Material Bibliográfico (en miles de $)
Ítem Justificación Valor
TOTAL
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Anexo 1. Primers para detectar secuencias SNP (Secuencias NO PUBLICADAS, pertenecientes al Grupo de Investigación en Biodiversidad y Biotecnología)
Primer Secuencia 5’ – 3’
Unigene11151 F TATGTGGGGGTGAAGAAAGC
Unigene11151 R ACAGGACCCAATCATCCAAC
Unigene11157 F CCAAGGAAACTTGCTCCAAC
Unigene11157 R AGCCTTAAACTTGCCAGCAC
Unigene11255 F TGATGGCGCAGATAAGAAGA
Unigene11255 R AGACTCAACAGCGCCAACTT
Unigene11861 F TGTTGCAGTGGGGTTTGATA
Unigene11861 R AAGAACCAAGCCTCTCACCA
Unigene12343 F TGGATCCAGATGAGTCCAGA
Unigene12343 R CGGACGTTTTCCCAAATCTA
Unigene12346 F CCTGTATGGCCAAAGGATTC
Unigene12346 R CAGGATCTTTCCGAGGATCA
Unigene12652 F GGGATCGTTAAATCCCGAGT
Unigene12652 R TCTGTTTTGCATGCTCCTCTT
Unigene12924 F GGACCAATTCCTTGTGTGCT
Unigene12924 R TGCCGTGACTGTATCCTTGA
Unigene13090 F GGCTCAGAACTGTGGGGTTA
Unigene13090 R CACATTGTAGGCATCCCAGA
Unigene13465 F CATTGCGCTTGTTAGTGAGG
Unigene13465 R ACATGCTGCCTCGGTACTTC
Unigene1465 F TCGTCTGTTTTGGCTCTTGA
Unigene1465 R TACTCCCCTTGCTTGAGTCG
Unigene14681 F ATCAGGAATGGGCTGAGCTA
Unigene14681 R AGCAGCCTTCAAACTCTCCA
Unigene14822 F TACTGGATCGCTCAGCTCCT
Unigene14822 R TGTGTACACCAACCCGAATG
Unigene14951 F ATGGCAGTACCCAAATCAGC
Unigene14951 R TGGGTAATTGATGGTGGTGA
Unigene15095 F TTCCTGCTGATGAATGCAGA
Unigene15095 R GAACCTGTCCTTGGAGCTTG
Unigene15115 F CCATTCATGGGGTAATTTGC
Facultad de Ciencias Agropecuarias Programa de Doctorado en Ciencias Agrarias
25
Unigene15115 R AAGCTTTCCCAATTGCCTCT
Unigene15294 F GCCAGGAGTTTGCTGAGTTC
Unigene15294 R ATGGGCAAGTAGCTCTCCAA
Unigene15456 F ACAAGCTTCTGGTGGAAGGA
Unigene15456 R AAGAAGAGCCCCGTCAAACT
Unigene15499 F TGCACCAACAGACCATAAGC
Unigene15499 R ATAATTCCCACAGGCTGTCC
Unigene15574 F CCTGCTGAGGTGGAATCAGT
Unigene15574 R CGATCCAACAAACATGCCTA
Unigene16239 F AGAGGGAGGATCAAGGAGGA
Unigene16239 R GGGCATTGTATCATGTACGG
Unigene16323 F AAAGACGGTGGAGAGGAACC
Unigene16323 R TTTATGTAGGAGGCCGCAAG
Unigene16368 F GGTTGCCAAGATCAAAGAGG
Unigene16368 R CCGGTGTGCTTAGTTCCTTG
Unigene16415 F GCGGGTGCAGATAAGAAAAG
Unigene16415 R TTCTTCTTGCGCTCCATAGC
Unigene16433 F AGCAGGAGAGGAAACTCCAA
Unigene16433 R TGGCATAAAGCTCAAGATGC
Unigene16551 F CTTGTTTCCCCTTCATCCAA
Unigene16551 R TTGCAGCATTTCCCTCTCTT
Unigene16658_F TATCCTTATCCCCACGAGCA
Unigene16658_ R AACCCAGCAAACAGGCATAC
Unigene16701 F TTATGGAGCTTCGCACACTG
Unigene16701 R TGCTTGGTTTACCACATCCA
Unigene17423 F AGAGGGTCGTCGTACGTGAA
Unigene17423 R CGACGCTCTTCCCTTGATAG
Unigene1754 F TGTCGAATTAATGGCCAAGAC
Unigene1754 R CCCGAAATCTGATTGTGCTT
Unigene1903 F AGTCGACCCCTCAAACAATG
Unigene1903 R TCTAGGATGCTGCTGCTGTG
Unigene1968 F GTTGACCCATTGCAACACTG
Unigene1968 R TCATATGCTGTGAGCCTGGA
Unigene2064 F AGTACACGGATGCCTTGCTT
Unigene2064 R GAGGCGCTACAGGGATGTTA
Facultad de Ciencias Agropecuarias Programa de Doctorado en Ciencias Agrarias
26
Unigene2247 F GTGTCCGGAGATCAAGCAAC
Unigene2247 R CTTTGATAGCCTGCCCAATC
Unigene2361 F AGCAGTTGCTGCACTTTCAA
Unigene2361 R AACGCCTGTTCACTTTTTGC
Unigene2373 F TGGCCTCACCAACACTTGTA
Unigene2373 R GAGTCGCCACAGCGATAGAT
Unigene2387 F GACACCATCGGAGACCTGAA
Unigene2387 R GTAGAGCTCGAGACCCATGC
Unigene242 F GGAGAAGAAGCTGCTGGAGA
Unigene242 R TCGCTCTTGACCCTCTCAAT
Unigene2512 F AAGTGGCAGCGAACAAGAAA
Unigene2512 R GAATCTCCCCACAAACAGGA
Unigene31842 F CTGGCCAGAAGAAGGATTGA
Unigene31842 R TCTCCAAGAAGAATGTTTGAAGG
Unigene33255 F TGATGGCTTGAAGCTTTTGA
Unigene33255 R AGCGCTTGAAACAAATTTCC
Unigene33871 F CAACGTGGGGAGGTATTTGA
Unigene33871 R GCTCAACGTGATTTGCATGT
Unigene34846 F GTCAGGACCTCAGTGCTGCT
Unigene34846 R GGTGGGTGAGTACCAAATATGTC
Unigene34996 F ATCAGTGCTGGGGTGAATG
Unigene34996 R CTCCCCTGATGCGATCTTAG
Unigene351 F TTGCTGATGACACGAATGGT
Unigene351 R TTGTTGGCAAATGTCCGATA
Unigene3573 F GCACCAACATCATCAAATGC
Unigene3573 R TTCGTTGTACGCCTCAATGT
Unigene36231 F AAGGGAGATGTGGTGTTGGA
Unigene36231 R TAAAACCAACACCCCCAAGA
Unigene3673 F GGGCTGCACCTCTTTGTATC
Unigene3673 R ACATGCTCCCACAAACGAAT
Unigene37334 F GTCCACAAGGCTTCCTTCAG
Unigene37334 R GATTCTGTTGCCCTTGCACT
Unigene3877 F ATCGGAAGTGGCTATGGTGA
Unigene3877 R GCCTGAGCACTGCTATACCC
Unigene42870 F TAGAGGGCTCGAAGAAGGTG
Facultad de Ciencias Agropecuarias Programa de Doctorado en Ciencias Agrarias
27
Unigene42870 R AGGTCCATCTTGCTGGGTAG
Unigene44108 F GGGCAGCAAGCAAAATAGAG
Unigene44108 R TTCTTGCTGCGTTGTATTGC
Unigene44250 F AGCAAGAGAGCCAGGAAGTG
Unigene44250 R CAGACAGGCCAAAACTACGC
Unigene44376 F AGAATGAGGGCGCTGATAAA
Unigene44376 R AAGCTTCCGGACCTTTTCTG
Unigene4592 F TGGGGATATGGAAAAATTGAA
Unigene4592 R TTTTTGAAACCCATCCAGGT
Unigene47613 F TTGTTTCTGGGATTGCCATT
Unigene47613 R CTCCACACTCTGCACACTCC
Unigene47941 F GAAGGAGAGAAGAAAGGCAGTG
Unigene47941 R TGACTGAAGTTGGTGGGTCA
Unigene49539 F ACTGTGGAGAAGGCTGCTTG
Unigene49539 R TGTGATTCAACCTCCCACAA
Unigene49785 F AATTGGTGAAGCTGGTGGAG
Unigene49785 R AAACCTTTTGCCTCCTTGCT
Unigene49943 F GCTCCCATGCCAAGTTTCTA
Unigene49943 R AAGACATGTCCCACCACCTT
Unigene5064 F AAAGGTCGTCCTCCCACCT
Unigene5064 R TTTGCAAGAGAGCACTCCAA
Unigene5209 F TCAGTTCAATCGGAGCACAC
Unigene5209 R ATGCAGCCCATGACTGATAA
Unigene5601 F ATCTTCGAGAAGCTCGCTCA
Unigene5601 R TGACAGCCTTAGTCCCCTCA
Unigene6238 F GGCTCTGGACTCGAACAATC
Unigene6238 R AGCCTCCTCCTTGAAGAACA
Unigene6936 F GCACGAGAGGATGATGACAG
Unigene6936 R TCCACTATCAGGCTGTGCTG
Unigene7103 F CAAAGGTCCCAAATCCTGAA
Unigene7103 R TTTTCTACCCGGAACAAAGG
Unigene7104 F AGCATTCGACTCATCACCAA
Unigene7104 R GGTGGAGGGTAGAGGATTGA
Unigene7201 F TGAGCATATCACTCCCATGC
Unigene7201 R TGACACATGGTTTGGGTTTG
Facultad de Ciencias Agropecuarias Programa de Doctorado en Ciencias Agrarias
28
Unigene7352 F GTACAGAGCCACCCAAAGGA
Unigene7352 R GAGCTGATGGCTCGACTTTC
Unigene743 F ATGGCCTTCCAGGAGAAACT
Unigene743 R GTATGATCTCGCGCTCTCG
Unigene7441 F ATGGGTCAACAACAGGCATT
Unigene7441 R CGCAGTCATCCTCATTTTCA
Unigene7535 F AAACCATTTGCCTGAGAAGC
Unigene7535 R CCTGGCTTTCCACTCTCAAG
Unigene8092 F GATCAGAGACCCGTGGAAGA
Unigene8092 R GAGGGAGAGATCTGCTCTGG
Unigene8275 F TTTCGAATGTCCGTGTTGAA
Unigene8275 R GACTCTGGCCCAACAAAATC
Unigene8299 F TTTGCAAGGCACTGAGTGAG
Unigene8299 R CCAAGAGCTCCACATCATCA
Unigene8320 F GCCTTCCTTGATTTTCAGCA
Unigene8320 R TTGGACAGCATCCAGGTTCT
Unigene9045 F CGCAAATCCCTCACTACCAT
Unigene9045 R CACAACATCCCCAGAGTCAC
Unigene9227 F AGCCTTGGTGTGGTTTATGG
Unigene9227 R CAGCAAGGGCATCAGTGTAA
Unigene9370 F TGCTTACCATCAACCTGGTG
Unigene9370 R GTGGCACCGATCAGCTACTT