Universidad de Buenos Aires - core.ac.uk · S. maltophilia es un bacilo Gram-negativo no fermentador de la glucosa, aerobio obligado, móvil debido a la presencia de varios flagelos

Universidad de Buenos Aires Facultad de Farmacia y Bioquímica

Cátedra de Microbiología

Papel del “quorum sensing” y del hierro en la formación de biofilms y en la producción de otros

potenciales factores de virulencia de

Stenotrophomonas maltophilia

Tesis presentada para optar al título de Doctor de la Universidad

de Buenos Aires en el área Microbiología

Bioq. y Farm. Carlos Adrián García

Directora: Dra. Mirta A. Franco

Directora Adjunta: Dra. Beatriz Passerini de Rossi

2014

i

Agradecimientos

A mi directora la Dra. Mirta Franco, gracias por la confianza ofrecida desde que comencé

a trabajar en este proyecto y por brindarme la oportunidad de realizar mi investigación

libremente.

A mi directora adjunta la Dra Beatriz Passerini de Rossi agradezco la paciencia y

dedicación que le dedicó a este trabajo. Gracias por acompañarme en todas las

dificultades que se plantearon en este periodo.

A la Dra Laura Friedman gracias por brindarme toda su ayuda en ei trabajo de

investigación y en la docencia.

A mis compañeros de la cátedra de Microbiología con quienes compartí tantos agradables

años de docencia

Agradezco al Dr Tomas Santa Coloma por su amabilidad e invaluable contribución a este

trabajo al enseñarme a utilizar el microscopio confocal, a la cátedra química analítica por

el gentil asesoramiento y por permitirme utilizar el equipo de IR.

Un agradecimiento general a todas y cada una de las personas que han compartido

conmigo todos estos años de trabajo, con sus altos y bajos. Desde los más profundo de

mi corazón, agradezco el haberme brindado apoyo, colaboración, ánimo y sobre todo

cariño y amistad.

Agradecimiento a mis padres que siempre alentaron mi formación.

Gracias a la educación pública y gratuita, que me formó como profesional y me brindó la

oportunidad de realizar esta tesis. A la Universidad de Buenos Aires y a la Facultad de

Farmacia y Bioquímica, por ser el lugar donde pude crecer académicamente

ii

Contenidos

Agradecimientos ................................................................................................................. i

Contenidos ......................................................................................................................... ii

Abreviaturas ..................................................................................................................... vii

Introducción ....................................................................................................................... 1

1. Stenotrophomonas maltophilia .................................................................................... 2

1.1. Taxonomia ........................................................................................................... 2

1.2. Características ecológicas y bioquímicas ............................................................ 2

1.3. Aspectos epidemiológicos ................................................................................... 3

1.4. Factores de virulencia .......................................................................................... 4

1.5. Modelos de virulencia .......................................................................................... 5

2. Biofilms bacterianos .................................................................................................... 5

2.1. Implicancia de la formación de biofilms ................................................................ 7

3. Sistemas de “Quorum sensing” ................................................................................... 9

3.1. El sistema rpf/DSF ............................................................................................. 10

3.1.1. El sistema de señalizacion rpf/DSF de S. maltophilia ..................................... 12

4. El hierro en la fisiología bacteriana ........................................................................... 13

4.1. Sistemas de captación de hierro ........................................................................ 14

4.2. Hierro y estrés oxidativo .................................................................................... 15

5. El hierro como señal: El sistema Fur ......................................................................... 16

Hipótesis y Objetivos ....................................................................................................... 18

1. Hipótesis ................................................................................................................... 19

2. Objetivo general........................................................................................................ 19

3. Objetivos parciales ................................................................................................... 19

Materiales y Métodos ....................................................................................................... 20

1. Cepas bacterianas .................................................................................................... 21

2. Tipificación molecular ............................................................................................... 21

2.1. ERIC-PCR ......................................................................................................... 21

2.2. REP-PCR .......................................................................................................... 22

3. Producción de potenciales factores de virulencia...................................................... 22

iii

3.1. Detección de la presencia de los genes narG y stmPr-1 en aislamientos locales de S. maltophilia ........................................................................................................... 22

3.2. Prueba de reducción de nitratos ........................................................................ 23

3.3. Proteasas .......................................................................................................... 24

3.4. Lipasa ................................................................................................................ 24

3.5. DNasa ............................................................................................................... 24

3.6. Resistencia al estrés oxidativo ........................................................................... 24

3.7. Producción de sideróforos ................................................................................. 25

3.8. Determinación de la naturaleza química de sideróforos ..................................... 26

3.8.1. Condiciones de cultivo ................................................................................... 26

3.8.2. Ensayo de Arnow ........................................................................................... 26

3.8.3. Ensayo de Csáky ........................................................................................... 26

4. Curvas de Crecimiento ............................................................................................. 27

5. Bioensayo para determinar la producción DSF ......................................................... 27

5.1. Extracción de DSF de sobrenadantes de cultivo ................................................ 27

5.2. Bioensayo .......................................................................................................... 27

6. Formación de biofilms ............................................................................................... 28

6.1. Estandarización del inoculo ............................................................................... 28

6.2. Ensayo en Tubos ............................................................................................... 28

6.3. Ensayo en microplacas ...................................................................................... 29

6.4. Microscopia óptica ............................................................................................. 29

7. Microscopia confocal laser de barrido. ...................................................................... 29

8. Movilidad asociada a superficies o “twitching” .......................................................... 30

9. Producción de sustancias poliméricas extracelulares (EPS) ..................................... 30

10. Espectroscopia de reflexión total atenuada infrarroja con transformada de Fourier (ATR-FTIR) ...................................................................................................................... 31

11. Aislamiento de mutantes Fur ................................................................................. 31

12. Ensayo de reducción del Azul de Nitrotetrazolio (NBT) ......................................... 32

13. Actividad de la enzima superoxido dismutasa (SOD) ............................................ 32

13.1. Obtención de extractos crudos ....................................................................... 32

13.2. Actividad en cultivos planctónicos .................................................................. 33

13.3. Actividad en el biofilm..................................................................................... 33

13.4. Geles nativos para SOD y determinación del tipo de isoenzima ..................... 33

14. Evaluación de la virulencia con el modelo de infección de Galleria mellonella ...... 34

iv

15. Preparación de fracciones enriquecidas en OMPs ................................................ 35

16. Electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) ......................................... 35

17. Digestión en gel e identificación de proteínas mediante espectrometría de masa . 35

18. Cromatografía en placa delgada (TLC) ................................................................. 36

19. Cromatografía de alta performance (HPLC) y detección UV con arreglos de diodos 37

19.1. Preparación de la muestra ............................................................................. 37

19.2. HPLC con arreglo de diodos .......................................................................... 37

20. Estadística ............................................................................................................ 37

Resultados y Discusión .................................................................................................... 38

Sección I .......................................................................................................................... 39

Tipificación de aislamientos locales de S. maltophilia recuperados de infecciones asociadas al uso de productos médicos........................................................................... 39

1. Identificación y fenotipificación .................................................................................. 40

2. Tipificación por métodos genotípicos ........................................................................ 42

2.1. ERIC-PCR ......................................................................................................... 43

2.2. REP-PCR .......................................................................................................... 45

3. Discusión .................................................................................................................. 46

Sección II ......................................................................................................................... 48

Producción de potenciales factores de virulencia en aislamientos locales de S. maltophilia ........................................................................................................................................ 48

1. Formación de biofilms de aislamientos locales ......................................................... 48

2. Presencia del gen codificante de la proteasa StmPr1, actividad de proteasa y lipasa50

3. Producción de sideróforos ........................................................................................ 50

4. Resistencia al estrés oxidativo .................................................................................. 52

5. Presencia del gen narG, codificante de una nitrato reductasa y su relación con la utilización nitrato .............................................................................................................. 52

6. Virulencia en el modelo de infección de Galleria mellonella ...................................... 54

7. Discusión .................................................................................................................. 56

Sección III ........................................................................................................................ 60

Sistema de captación de hierro de alta afinidad de S. maltophilia K279a y su posible regulación por el sistema Fur ....................................................................................... 60

1. Aislamiento de mutantes Fur .................................................................................... 60

2. Caracterización de proteínas de membrana externa reguladas por hierro en S. maltophilia K279a ............................................................................................................ 62

v

2.1. Análisis de los perfiles de OMPs ........................................................................ 62

2.2. Identificación de las OMPs reguladas por hierro mediante espectrometría de masa 63

3. Caracterización de los sideróforos producidos en S. maltophilia ............................... 65

3.1. Determinación de la naturaleza química de los sideróforos ............................... 65

3.2. Análisis mediante cromatografía en capa delgada (TLC) de extractos provenientes de sobrenadantes de cultivos de K279a .................................................. 66

3.3. Análisis mediante cromatografía líquida de alta performance (HPLC) de extractos provenientes de sobrenadantes de cultivos de K279a .................................................. 67

4. Discusión .................................................................................................................. 69

Sección IV ....................................................................................................................... 71

Función del sistema de señalización rpfF/DSF en la formación de biofilms y en la virulencia de S. maltophilia .............................................................................................. 71

1. Crecimiento planctónico ............................................................................................ 71

2. Papel del “quorum sensing” en la formación de biofilms ........................................... 72

2.1. Análisis de biofilms formados sobre superficies hidrofílicas e hidrofóbicas ........ 72

2.2. Análisis de biofilms formados en microplacas .................................................... 74

2.3. Análisis de biofilms por microscopía óptica ........................................................ 76

2.4. Análisis de biofilms por microscopia confocal laser de barrido (CLSM) .............. 77

3. Producción de sustancias poliméricas extracelulares (EPS) ..................................... 79

4. Motilidad tipo “twitching” ........................................................................................... 83

5. Hidrofobicidad de la superficie celular ....................................................................... 85

6. Resistencia al estrés oxidativo .................................................................................. 86

7. Producción de exoenzimas ....................................................................................... 87

8. Evaluación de la virulencia mediante el modelo de Galleria mellonella ..................... 88

9. Discusión .................................................................................................................. 89

Sección V ........................................................................................................................ 94

Función del hierro en la formación de biofilms y en la resistencia al estrés oxidativo de S. maltophilia ....................................................................................................................... 94

1. Efecto de la disponibilidad de hierro en la formación de biofilms y la producción de EPS ................................................................................................................................. 94

1.1. Análisis de biofilms formados en microplacas .................................................... 95

1.2. Análisis de biofilms por CLSM ........................................................................... 96

1.3. Producción de EPS ............................................................................................ 98

2. Efecto de la disponibilidad de hierro en la respuesta al estrés oxidativo ................. 101

vi

2.1. Determinación del tipo de isoenzima de superóxido dismutasa (SOD) ............ 101

2.2. Actividad de SOD en cultivos planctónicos y biofilms ...................................... 102

2.3. Niveles de especies reactivas del oxigeno (ERO) en el biofilm ........................ 104

3. Evaluación del efecto del hierro en la producción de DSF ...................................... 105

4. Evaluación de la virulencia en el modelo de infección de Galleria mellonella .......... 106

5. Discusión ................................................................................................................ 108

Conclusiones ................................................................................................................. 111

Resumen ....................................................................................................................... 117

Publicaciones ................................................................................................................ 121

Anexo I .......................................................................................................................... 125

Bibliografía ..................................................................................................................... 127

vii

Abreviaturas

ADN: Acido desoxirribonucleico ARN: ácido ribonucleico ATCC: American type culture colection CAS: Cromoasurol S CirA: receptor de colicina I NaCN: Cianuro de sidio CV: Cristal violeta °C: Grados centígrados DBHA: Acido dihidroxibenzóico BS: Borosilicato Dip: 2-2´ dipiridilo DMSO: Dimetil sulfóxido DO546 : Densidad óptica a 546 nm DSF: “Diffusible signal factor” EPS: Sustancias poliméricas extracelulares ERIC: Secuencias consenso repetitivas intragénicas de enterobacterias ERO: Especies reactivas del oxigeno Fe2+: Ion ferroso Fe3+: Ion férrico FepA: Receptor de membrana externa de enterobactina Fur: “Ferric uptake regulator” h: horas H2O2: Peróxido de hidrogeno HPLC: Cromatografía líquida de alta performance kDa: kilodalton LB: Luria Bertani LBA: Lavado bronquealveolar LB-glu 0,1%: Luria Bertani suplementado con 0,1% de glucosa MATH: “Microbial adherence to hydrocarbons” min: Minutos mm: Milímetros NBT: Azul de nitrotetrazolio nm: Nanómetros OMP: Proteína de membrana externa P: Nivel justo de significación pb: Pares de bases PBS: Buffer fosfato salino PCR: Reacción en cadena de la polimerasa PM: Peso molecular PP: Polipropileno PS: Poliestireno QS: “Quorum sensing” rpf: “regulation of pathogenicity factors” REP: Secuencias repetitivas palindrómicas extragénicas SAT: Salt aggregation test SDS-PAGE: Gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sodico SOD: Superóxido dismutasa SS: Stainer-Scholte medio químicamente definido

viii

SSC: Stainer-Scholte con Casamino ácidos 0,1 % (P/V) SSC-CAS: SSC con el agregado del reactivo CAS y agar SSC-CAS-Dip: SSC-CAS con el agregado de Dip 100 µM TLC: Cromatografía en capa delgada TSB: Caldo tripteina soya TSA: Agar tripteina soya UFC/ml: Unidades formadoras de colonias por mililitro UPGMA: “Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Averages” UV: Ultravioleta Xcc: Xanthomonas campestris pv campestris ZnSe: Seleniuro de zinc

Introducción

Introducción

2

1. Stenotrophomonas maltophilia

1.1. Taxonomia

El género Stenotrophomonas pertenece, junto con Xanthomonas, a la subclase γ-β

de las proteobacterias (6). Esta especie fue inicialmente denominada Pseudomonas

maltophilia (84), y posteriormente, en base a estudios de homología del ARN ribosomal

fue clasificada como Xanthomonas maltophilia, sin embargo esta clasificación no fue

universalmente aceptada. Finalmente, debido a estudios de hibridación de ADN con ARN

ribosomal, junto a diferencias fenotípicas entre aislamientos de esta especie y los del

genero Xanthomonas, se propuso en 1993 la creación de un nuevo género denominado

Stenotrophomonas (Stenos, del griego estrecho; trophos, del griego alimento; monas, del

griego única; malt, del inglés maltosa; philia, del griego amistad) (115) siendo S.

maltophilia la única especie (115). En 1997 S. maltophilia dejó de ser la única integrante

del género al describirse la especie S. africana que presentaba características

bioquímicas idénticas a S. maltophilia, excepto por su incapacidad para hidrolizar cis-

aconitato (49). Sin embargo, un estudio posterior demostró que S. africana es una cepa

de S. maltophilia (26). Actualmente existen nuevas especies dentro del género: S.

acidaminiphila (9), S. chelatiphaga (90), S. daejeonensis (95), S. ginsengisoli (91), S.

humi, S. terrae (77), S. koreensis (154), S. nitritireducens (61), S. pavanii (122) y S.

rhizophila (153).

S. maltophilia es la única especie descripta como patógeno humano oportunista

(3).

1.2. Características ecológicas y bioquímicas

S. maltophilia es un bacilo Gram-negativo no fermentador de la glucosa, aerobio

obligado, móvil debido a la presencia de varios flagelos polares. Su temperatura optima

de crecimiento es 35 °C, es oxidasa negativo aunque algunos aislamientos son oxidasa

positivo (22), catalasa positivo, indol negativo y lisina decarboxilasa positivo. Además

presenta la capacidad de hidrolizar esculina, gelatina y ADN (41).

Introducción

3

Es una especie ampliamente distribuida en el ambiente que se aísla de numerosas

fuentes como el agua, el suelo, la rizósfora e incluso fue aislada de suelos antárticos

(147).

1.3. Aspectos epidemiológicos

S. maltophilia es un patógeno nosocomial emergente multiresistente que se aisla

con frecuencia creciente. Esta especie ha llegado a considerarse el tercer bacilo Gram-

negativo más común de los aislamientos clínicos después de P. aeruginosa y

Acinetobacter spp. (68). Aunque es considerada como una bacteria de patogenicidad

limitada, causa infecciones en pacientes inmunocomprometidos o sometidos al uso de

productos médicos. Otro factor que predispone a la infección por S. maltophilia es la

terapia prolongada con antimicrobianos de amplio espectro, principalmente

carbapenemes, debido a su multirresistencia (41, 97, 131). Entre las infecciones que

produce se pueden mencionar neumonía asociada a respiración mecánica, bacteriemia

asociada a catéteres venosos o de diálisis, infecciones urinarias, y con menor frecuencia

puede producir meningitis y endocarditis (41, 45). Esta especie ha sido aislada con

frecuencia creciente en pacientes con fibrosis quística (42).

Una gran variedad de técnicas de tipificación se han utilizado para estudiar la

epidemiologia y las vías de transmisión de esta especie. Entre ellas, la tipificación basada

en la comparación de los antibiogramas (antibiotipificaión) resultó ser poco discriminativa

porque la especie presenta resistencia intrínseca a numerosos antimicrobianos (145). La

biotipificacion también resultó ser de limitada utilidad debido a su metabolismo

relativamente inerte (41). Por el contrario numerosas técnicas de tipificación molecular

demostraron ser útiles para tipificar aislamientos de esta especie, entre ellas la

electroforesis en campo pulsado (PFGE) presenta el mayor poder discriminatorio, pero es

una técnica laboriosa y costosa, lo que la hace poco practica. Por el contrario, las técnicas

basadas en la amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa son

accesibles, menos laboriosas y han demostrado tener un poder de discriminación

aceptable aunque menor al del PFGE (133). Otros autores desarrollaron un esquema de

tipificación por secuenciación de múltiples locus (MLST) que presenta buen poder

discriminatorio para el estudio de la estructura poblacional de la especie. En la actualidad

existe una base de datos (http://pubmlst.org/smaltophilia/) con genogrupos definidos para

realizar el análisis (89)

Introducción

4

Los estudios epidemiológicos realizados por numerosos grupos de trabajo, sobre

aislamientos clínicos, mostraron una gran diversidad genética en esta especie incluso

entre aislamientos recuperados dentro de un mismo hospital (23, 68, 144).

1.4. Factores de virulencia

A pesar del amplio espectro de síndromes clínicos asociados a S. maltophilia poco

se conoce acerca de sus factores de virulencia. Enzimas extracelulares tales como

DNasa, fibrinolisina, lipasas y proteasas, han sido relacionadas con la patogénesis de S.

maltophilia (18). La producción de proteasa juega un papel significativo en la patogénesis

bacteriana ya que participa en la invasión y el daño tisular. Windhorst et al. (150)

caracterizaron una serina proteasa alcalina denominada StmPr1 que degrada proteínas

del suero y tejido conectivo.

Otro factor de virulencia son los sideróforos, los cuales facilitan la adquisición de

hierro en el huésped. En S. maltophilia existen reportes controversiales ya que mientras

algunos autores detectaron sideróforos tipo hidroxamato (ornibactina), otros detectaron

catecoles como enterobactina (36, 126).

Un importante factor de virulencia es su capacidad de formar biofilms ya que los

mismos facilitan la persistencia en el huésped, la evasión de la respuesta inmune y la

supervivencia frente a altas concentraciones de antimicrobianos (38, 45, 119). Diferentes

estructuras de superficie y la presencia de ciertos genes han sido relacionados con la

formación de biofilms. De Oliveira-Garcia et al. (40) caracterizaron las fimbrias SMF-1,

relacionadas con la adherencia a células Hep-2, y con la formación de biofilms. El genoma

de la cepa K279a recientemente secuenciado (EMBL/GeneBank AM743169) contiene

genes que codifican pili tipo I y tipo IV, relacionados con la adhesión y la motilidad

asociada a superficies o “twitching” (32). McKay et al. (101) describieron el papel de la

fosfoglucomutasa (PGM) de S. maltophilia en la biosíntesis del lipopolisacárido (LPS), la

virulencia, y la resistencia a antibióticos. El gen xanA, también conocido como spgM,

presenta homología con algC responsable en P. aeruginosa de la producción de PGM

asociada con la biosíntesis del LPS y de alginato, exopolisacarido de la matriz del biofilm.

Por otra parte, en S. maltophilia K279a se ha descripto la presencia de una nitrato

reductasa unida a membrana codificada por el gen nar y de una formiato deshidrogenasa,

Introducción

5

codificada por el gen fdn, que soportarían el crecimiento en condiciones de

microoxigenación y así facilitarían la formación de biofilms (32).

1.5. Modelos de virulencia

Diferentes organismos hospedadores fueron utilizados como modelo para evaluar la

virulencia de esta especie y estudiar los mecanismos moleculares relacionados con su

patogenicidad. En este sentido Nicoletti et al (110) utilizaron el modelo de infección de

Galleria mellonella para estudiar la relevancia de las proteasas StmPr1 y StmPr2 y de

estearasas en la virulencia de aislamientos clínicos de S. maltophilia. De este modo

pudieron determinar que la expresión de proteasa StmPr1 es relevante para la virulencia

de este microorganismo. Además, McCarthy et al. utilizaron el modelo de G. mellonella y

determinaron que la proteína Ax21 de S. maltophilia K279a es una señal célula-célula que

regula la virulencia (100).

Fouhy et al (62) evaluaron el efecto de la mutación en el gen rpfF sobre la virulencia

de S. maltophilia con el modelo de Caenorhabditis elegans y encontraron que la cepa

K279a presenta una virulencia similar P. aeruginosa PA14 mientras que la mutante

presenta una disminución en la virulencia.

Por otra parte se utilizaron dos amebas Dictyostelium discoideum Ax2 y

Acanthamoeba castellanii ATTC 30234 que, a través de un ensayo de muerte en placa,

permitieron evaluar la virulencia de 59 aislamientos de S. maltophilia de origen clínico y

ambiental (1).

Por último, Ferrer-Navarro et al (59) utilizaron el modelo de infección del pez cebra

Danio rerio y encontraron que el mismo presenta una elevada capacidad para discriminar

la virulencia de aislamientos clínicos de S. maltophilia, además, se ha reportado que este

modelo correlaciona con el modelo de virulencia en ratones (101).

2. Biofilms bacterianos

Los biofilms son comunidades de microorganismos que crecen adheridos a una

superficie embebidos en una matriz extracelular que ellos mismos producen (38). En la

actualidad se acepta que la mayoría de los microorganismos persisten en la naturaleza

formando parte de un biofilm (66). Las bacterias en el biofilm presentan un fenotipo

Introducción

6

diferente al de sus contrapartes planctónicas caracterizado por una reducción en la

velocidad de crecimiento y una expresión diferencial de genes (46). Incluso dentro de un

mismo biofilm hay zonas con niveles metabólicos diferentes. En las zonas más profundas

hay poca o nula división celular y la tasa metabólica es baja, mientras que en las zonas

más cercanas a la superficie hay mayor disponibilidad de nutrientes lo que conlleva a una

mayor actividad metabólica y tasa de división celular (123).

La formación de biofilms es un proceso complejo, finamente regulado, que se inicia

con la adhesión de las bacterias a una superficie, que puede ser tanto biótica como

abiótica. La movilidad mediada por flagelos es importante para que la bacteria establezca

el contacto inicial con la superficie (111). La adhesión, que primero es reversible y luego

irreversible, depende de estructuras de la superficie bacteriana tales como pili y

adhesinas, y de su hidrofobicidad, y además, de propiedades del sustrato tales como la

hidrofobicidad y la rugosidad, y de las interacciones electrostáticas entre ambas

superficies (46).

La movilidad tipo “twitching”, mediada por el pili de tipo IV, es necesaria para la

migración de las células a lo largo de la superficie con la consecuente formación de

agregados celulares (111). El pili tipo IV estabiliza las interacciones con la superficie

abiótica y las interacciones entre células, necesarias para la formación de microcolonias.

Luego, se produce la expansión clonal de las bacterias y comienza la producción de

exopolisacarido que junto con proteínas y ácidos nucleicos forman la matriz del biofilm

(124). Posteriormente, como resultado de un proceso de maduración, se forman las

estructuras tridimensionales, características del biofilm, compuestas por microcolonias de

gran tamaño, matriz extracelular y canales de flujo de agua por los que se produce el

consecuente acceso a nutrientes para las células del biofilm (138). Finalmente ocurre la

dispersión, en la cual se liberan algunas células plantónicas o agregados de células que

eventualmente podrán adherirse en otros lugares que les resulten favorables (Figura 1).

Introducción

7

Figura 1. Etapas de formación de biofilm. Se distinguen 5 etapas discretas. 1) Adhesión

reversible; 2) Adhesión irreversible y síntesis de matriz, 3) formación de microcolonias; 4)

maduración y 5) dispersión. Imagen modificada de Monroe, D. 2007 (106)

2.1. Implicancia de la formación de biofilms

La formación de biofilms es relevante ya que muchas infecciones bacterianas

crónicas están ligadas a este fenómeno. Los productos médicos invasivos son propensos

a la colonización bacteriana y a la formación de biofilms, lo que genera un nicho de

microorganismos que provocan infecciones recurrentes. Los biofilms son difíciles de

erradicar porque son extremadamente resistentes frente a fuerzas de corte,

antimicrobianos y sustancias biocidas, que pueden eliminar células planctónicas pero no

biofilms, además las células en el biofilm evaden la respuesta inmune del hospedador (28,

29). Los esquemas terapéuticos de control de las infecciones agudas generalmente no

han sido exitosos en las infecciones causadas por biofilms, la susceptibilidad del biofilm

es hasta 1000 veces menor que la de su contraparte planctónica (28).

En nuestro grupo de trabajo hemos determinado la sensibilidad a fluoroquinolonas

de cultivos planctónicos (concentración inhibitoria mínima, CIM y concentración

bactericida mínima, CBM) y de biofilms (MBIC: minimal biofilm inhibition concentration y

MRC: minimal regrowth concentration) de S. maltophilia. De los 32 aislamientos locales

estudiados, 27 fueron sensibles a levofloxacina y 14 a ciprofloxacina. Los aislamientos

Introducción

8

sensibles a fluoroquinolonas de acuerdo a los valores de CIM fueron altamente

resistentes según los valores de MRC. La sensibilidad de los biofilms de S. maltophilia fue

entre 100 y 1000 veces menor que la de sus contrapartes planctónicas (119). Por lo tanto,

las concentraciones terapéuticas de fluoroquinolonas no pueden ser usadas como

monoterapia para la erradicación de biofilms, sin embargo, son candidatos para estudios

de sellado antibiótico (“lock solutions”).

La técnica de sellado antibiótico involucra la instilación de una solución

concentrada de un antimicrobiano en el catéter. Se comparó la actividad in vitro de

diferentes “lock solutions” (levofloxacina 2.5 mg/ml, EDTA 30 mg/ml, levofloxacina-EDTA,

etanol 25% y 40%, etanol 25%-EDTA) sobre biofilms preformados en catéteres de

silicona. Después de 24h de exposición, Levofloxacina logró erradicar el biofilm, mientras

que EDTA redujo su viabilidad a 1.0-5.0%. La combinación EDTA-Levofloxacina no

mostró sinergia. En cambio, etanol 40%, 25% o la asociación etanol-EDTA, erradicaron el

biofilm luego de 1h de tratamiento. Estos resultados, que dieron origen a una publicación

(118), sugieren que etanol en baja concentración, solo o en combinación con EDTA, sería

una alternativa útil en la prevención y el tratamiento, en combinación con ATB sistémicos,

de bacteriemias por S. maltophilia asociadas al uso de catéteres.

Se han propuesto diferentes mecanismos para explicar la resistencia del biofilm

frente a sustancias biocidas, uno de ellos se basa en la existencia de una barrera para la

difusión de compuestos hacia el interior del biofilm debido a la presencia de la matriz

compuesta principalmente por exopolisacáridos. El impedimento en la difusión de

compuestos podría ser generado por adsorción de los mismos o por reacción con los

componentes de la matriz (99). En este sentido, se observó que la difusión de el cloro a

través de la matriz de un biofilm mixto de Klebsiella pneumoniae y P. aeruginosa es del 20

% o menor (39) y que la difusión de ciprofloxacina se encuentra impedida por la adsorción

a la matriz de biofilms de P. aeruginosa (139). Por otra parte, se reportó que el biofilm de

Staphylococcus epidermidis permite la difusión de rifampicina y vancomicina (53). Por lo

tanto, la matriz es una barrera para la difusión de algunas sustancias pero no explica la

mayor resistencia del biofilm frente a todos los biocidas. Otro mecanismo propuesto es la

baja velocidad de crecimiento de las células generada por la limitación de nutrientes. Por

otra parte la generación de una respuesta al estrés oxidativo provocada por la limitación

de nutrientes en el biofilm, genera cambios fisiológicos que protegen a las células. Por

Introducción

9

último, la existencia de un fenotipo especifico del biofilm asociado a la expresión de

mecanismos que contrarrestan los efectos de los biocidas (99).

3. Sistemas de “Quorum sensing”

El “quorum sensing” (QS) es un mecanismo de comunicación célula-célula mediante

el cual las bacterias regulan, en forma concertada, la expresión de ciertos genes en

respuesta a la densidad celular. Las bacterias sintetizan una molécula difusible llamada

autoinductor que les permite sensar la densidad poblacional activando un regulador

específico que modifica la expresión de genes. El sistema de QS regula una amplia

variedad de funciones fisiológicas como la esporulación, los mecanismos de conjugación,

movilidad, la formación de biofilms y la virulencia (104). En bacterias Gram-negativas los

autoinductores son moléculas de bajo peso molecular de diversa naturaleza química pero

los mas difundidos y estudiados son los acilos de homoseril lactona (acil-HSL), mientras

que en bacterias Gram-positivas los autioinductres son péptidos (116).

El sistema de QS de Vibrio fischeri fue el primero que se describió y es el modelo

prototipo en bacterias Gram-negativas (63). Consta de dos proteínas LuxI encargada de

sintetizar el autoinductor N-(3-oxohexanoil)-homoserinolactona y LuxR encargada de la

percepción de la señal. Cuando hay baja densidad celular se sintetizan pequeñas

cantidades del autoinductor, por lo tanto la producción de luz no es evidente. Cuando

aumenta la densidad celular, la concentración del autoinductor aumenta hasta alcanzar un

umbral a partir del cual se une a LuxR y el complejo se une a la región promotora del

operon luxCDABE e inducen la expresión de luciferasa. Además la expresión de luxI

también es controlada positivamente por este sistema, lo que ocasiona un rápido aumento

de la cantidad de autoinductor (Figura 2).

Introducción

10

Figura 2. Sistema de QS de Vibrio fischeri, LuxI sintetiza el autoinductor acil-HSL y LuxR sintetiza

el regulador de respuesta. A baja densidad celular se sintetizan pequeñas cantidades del

autoinductor, por lo tanto no hay producción de luz. Cuando aumenta la densidad celular, el

autoinductor alcanza un umbral, se une a LuxR y el complejo se une a la región promotora del

operon luxCDABE e inducen la expresión de luciferasa. Además la expresión de luxI también es

controlada por este sistema. Disponible en

http://www.cheme.caltech.edu/groups/fha/old_website_2010.6.25/quorum.html

3.1. El sistema rpf/DSF

En X. campestris el sistema de QS no está mediado por un autionductor del tipo

acil-HSL como en la mayoría de las bacterias Gram-negativas. En esta especie el

autoinductor es un derivado de un ácido graso conocido como DSF (diffusible signal

factor) que fue identificado como ácido cis-11-metil-2-dodecenoico (148). Esta molécula o

derivados estructurales han sido encontrados en otras especies bacterianas como

Xanthomonas spp., Xylella fastidiosa y Burkholderia cenocepacia (17, 27, 76).

Los genes involucrados en este sistema de QS pertenecen al operon rpf (regulation

of pathogenicity factors) (48). La síntesis de DSF depende en parte de la proteína RpfB,

una ligasa de ácidos grasos de cadena larga, y completamente de la proteína RpfF, cuya

Introducción

11

secuencia de aminoácidos comparte similitud con una enoil-CoA hidrolasa involucrada en

el metabolismo de los ácidos grasos (13, 31, 135).

La transducción de la señal es llevada a cabo a través de la proteína RpfC que tiene

un dominio histidina quinasa y otro histidina fosfotransferasa (135), y la proteína RpfG que

tiene un dominio c-terminal del tipo HD-GYP que hidroliza di-GMPc. El mecanismo

funciona de la siguiente manera: a baja densidad celular hay poco DSF, en este contexto,

RpfC interacciona con RpfF lo que conduce a la baja producción de DSF. Además la

proteína RpfG se encuentra desfosforilada, en consecuencia el dominio HD-GYP está

inactivo y los niveles de di-GMPc se mantienen elevados. La proteína Clp es un regulador

transcripcional que cuando se encuentra unida a di-GMPc presenta una conformación que

no le permite unirse al ADN para activar la transcripción de genes que codifican por ej.

enzimas extracelulares y EPS. Por el contrario, cuando hay alta densidad celular, RpfC

interactúa con DSF y se autofosforila, lo que produce la liberación de RpfF y el incremento

de la producción de DSF. Además RpfC fosforila a RpfG y activa su dominio HD-GYP lo

que conlleva a la disminución de los niveles de di-GMPc. En estas condiciones Clp activa

la transcripción de genes regulados por QS (Figura 3). Sin embargo, existen controversias

sobre el efecto en la formación o dispersión de biofilms (136).

Introducción

12

Figura 3. El sistema de QS de X. campestris pv. campestris modula los niveles de di-GMPc. La

señal DSF es sintetizada por RpfF y sensada por la histidina quinasa RpfC unida a la membrana

citoplasmática. a) baja densidad celular: La concentración de DSF es baja, RpfC interactúa con

RpfF,y disminuye su actividad catalítica. En esta condición, RpfG se encuentra defosforilada e

inactiva, por lo tanto, el nivel del di-GMPc es alto y une al activador transcripcional Clp impidiendo

su unión al ADN. b) alta densidad celular: La concentración de DSF aumenta, RpfC se une a DSF,

se autofosforila y activa la actividad fosfodiesterasa de RpfG, lo cual conduce a la disminución de

di-GMPc que se transforma en GMP. RpfF ya no está unido a RpfC y se produce más DSF. La

disminución de di-GMPc activa el regulador Clp que a su vez activa la transcripción de distintos

genes. Figura adaptada de Srivastava y waters, 2012 (136).

3.1.1. El sistema de señalizacion rpf/DSF de S. maltophilia

El genoma de S. maltophilia K279a codifica un sistema de QS estrechamente

relacionado al sistema basado en DSF descripto en Xanthomonas campestris pv.

campestris, (Figura 4) y se diferencia de este en que no presenta un gen homologo a rpfH

(62).

Introducción

13

Figure 4. Organización del grupo de genes rpf de Xanthomonas campestris pv. campestris y S.

maltophilia K279a, tomado de Fouhy et al. (62).

Se ha detectado actividad de DSF en varias cepas de S. maltophilia. Huang y Wong

(82) encontraron que la actividad de DSF en la cepa WR-C se debe a un grupo de ácidos

grasos relacionados estructuralmente, el acido cis-11-metill-2-dodecenoico (al igual que

en X. campestris) y siete derivados mas.

Fouhy et al. (62) demostraron que la disrupción del gen rpfF en S. maltophilia K279a

produce efectos pleiotrópicos. La mutante rpfF posee una severa disminución en la

motilidad tipo “swimming”, menor actividad de proteasa y un perfil alterado de LPS, y

además forma agregados cuando crece en el medio L. Además, no es virulenta en un

modelo de nematodo.

4. El hierro en la fisiología bacteriana

El hierro es un nutriente esencial para los microorganismos, es cofactor de

proteínas, enzimas, actúa como trasportador de electrones y regula la expresión génica

en muchas especies bacterianas. En su forma reducida, Fe2+, es relativamente soluble

(0,1 M a pH 7,0) pero en presencia de oxigeno es oxidado a Fe3+ y precipita en forma de

hidróxidos insolubles dificultando la incorporación de este nutriente (5, 109). Además, en

el organismo hospedador la biodisponibilidad del hierro es escasa ya que se encuentra

unido a la hemoglobina, almacenado intracelularmente en forma de ferritina o quelado por

la transferrina en el suero.

Introducción

14

4.1. Sistemas de captación de hierro

La baja biodisponibilidad de hierro dificulta el crecimiento de los microorganismos,

por lo tanto éstos han desarrollado diferentes estrategias para captarlo, una de ellas

consiste en disminuir el pH del medio para incrementar la solubilidad del ion férrico, otra

se basa en reducir el Fe3+ a Fe2+ que es mas soluble, y otra se basa en sintetizar y

secretar sideróforos, compuestos que quelan hierro con alta afinidad e interactúan con un

receptor que internaliza el complejo hierro-sideróforo formado (67).

4.1.1. Sistema captación de hierro basado en sideróforos de

bacterias Gram-negativas

Los sideróforos son compuestos de bajo peso molecular (<1000 Da) con grupos

funcionales que quelan hierro con elevada afinidad. La mayoría de los sideróforos

descriptos son compuestos de tipo hidroxamato, catecol o sideróforos mixtos (78).

En las bacterias Gram-negativas, receptores específicos localizados en la

membrana externa, denominados receptores dependientes de TonB (57), unen los

complejos Fe3+-sideróforo, los cuales son internalizados por el sistema TonB. El complejo

transmembrana TonB-ExbB-ExbD (20) conecta el potencial de membrane citoplasmática

con el transporte de los siderofóros a través de la membrana externa (57). Además, en el

transporte participa el sistema de trasporte tipo ABC (ATP Binding Cassette) a través del

cual el sideróforo pasa desde el periplasma al citoplasma (Figura 5). Los sistemas de

captación de hierro y otros genes son reprimidos por Fur en diferentes especies

bacterianas (30).

En E. coli el sistema de transporte de sideróforos de tipo catecol es llevado a cabo a

través de tres receptores de membrana externa FepA, que transporta principalmente

enterobactina, Fiu y CirA que transportan amonabactina y dihidroxibenzoil serina

(monómero de enterobactina), respectivamente (Hantke,1990; Rabsch y Winkelmann,

1991).

En S. maltophilia poco se conoce sobre la producción de sideróforos y sistemas de

captación.

Introducción

15

Figura 5. Representación esquemática del sistema de captación de hierro mediado por sideróforos

en bacterias Gram-negativas. El complejo Fe3+-sideróforo es reconocido por receptores específicos

de la membrana externa. El complejo TonB-ExbB-ExbD conecta el potencial de membrana

citoplasmática con el transporte del complejo Fe3+-sideróforo a través de la membrana externa. El

complejo es transportado hacia el periplasma donde se une a proteínas, y en su pasaje hacia el

citoplasma participa el sistema de trasporte tipo ABC. Adaptado de Andrews et al. (5).

4.2. Hierro y estrés oxidativo

A pesar de la importancia biológica del hierro, las bacterias deben mantener su

concentración libre dentro de la célula en niveles seguros. El hierro libre actúa como

catalizador en las reacciones de Fenton y Haber-Weiss (142) que generan especies

reactivas del oxigeno (ERO) tales como radical hidroxilo (OH•), anión superoxido (O2

-) y

peróxidos (RO2). Estas ERO pueden oxidar lípidos, proteínas y ADN, entre ellas, el radical

hidroxilo generado en la reacción de Fenton es el mas reactivo.

Introducción

16

Reducción del hiero O2-+ Fe3+ Fe2+ + O2

Reacción de Fenton Fe2+ + H2O2 Fe3+ + OH- + OH•

Reacción de Haber Weiss O2-+ H2O

Catalizado por Fe OH- + OH•+ O2

Las bacterias con metabolismo aeróbico poseen enzimas antioxidantes como

catalasa, superóxido dismutasa y peroxidadas que les permiten deshacerse de estas

sustancias nocivas. Estas enzimas cumplen la función de defensa frente al estrés

oxidativo generado por el oxigeno del ambiente y por la respuesta inmune innata.

5. El hierro como señal: El sistema Fur

La proteína Fur (Ferric Uptake Regulator) forma un homodímero al unirse con el ion

ferroso. El complejo Fe2+-Fur reconoce secuencias de ADN específicas ubicadas en la

región promotora de ciertos genes conocidas como cajas Fur. La unión del complejo Fe2+-

Fur a dichas secuencias produce la represión de la transcripción de los genes que se

encuentran rio abajo ya que se impide el acceso de la ARN polimerasa (5). El

funcionamiento del sistema Fur se esquematza en la figura 6.

La principal función del sistema Fur es reprimir la expresión de genes implicados en

la captación de hierro cuando hay abundancia del mismo, de esta forma se puede

mantener su correcta concentración intracelular. No obstante se han descripto otras

funciones fisiológicas, por ej. en E. coli el sistema Fur reprime la producción de toxinas,

enzimas antioxidantes (manganeso superoxido dismutasa) y otros factores de virulencia

(55)

Introducción

17

Figura 6. Regulación de la expresión génica mediante el sistema Fur. La proteína Fur forma un

homodímero al unirse al Fe2+. El complejo Fe2+-Fur se une a secuencias de ADN específicas

conocidas como cajas Fur y reprime la transcripción de los genes que se encuentran rio abajo al

impedir el acceso de la ARN polimerasa.

Hipótesis y Objetivos

Hipótesis y Objetivos

19

1. Hipótesis

En S. maltophilia los genes relacionados con la formación de biofilms y con la

producción de otros potenciales factores de virulencia estarían regulados positivamente

por “quorum sensing”, y negativamente por concentraciones no limitantes de hierro, a

través del sistema Fur (“ferric uptake regulator”).

2. Objetivo general

Estudiar la regulación, por “quorum sensing” (QS) y/o por hierro, de la expresión de

productos génicos relacionados con la formación de biofilms y de la producción de otros

potenciales factores de virulencia.

3. Objetivos parciales

1- Tipificar aislamientos locales de S. maltophilia recuperados de infecciones asociadas

al uso de productos médicos. Evaluar la producción de potenciales factores de

virulencia y determinar la distribución del gen narG, codificante de nitrato reductasa

asociada al crecimiento en microaerofilia, y del gen codificante de la exoproteasa

StmPr en aislamientos locales de S. maltophilia.

2- Obtener mutantes Fur espontáneas de S. maltophilia.

3- Estudiar el sistema de captación de hierro de alta afinidad de S. maltophilia K279a:

caracterizar los sideróforos sintetizados por S. maltophilia K279a e identificar las

OMPs reguladas por la concentración de hierro.

4- Estudiar la función de DSF, señal de QS de S. maltophilia, en: a) la formación y

arquitectura de biofilms y la expresión de caracteres fenotípicos asociados a su

desarrollo (hidrofobicidad, motilidad “twitching”, producción de EPS) y b) en la

virulencia (producción de enzimas extracelulares, sensibilidad al estrés oxidativo),

utilizando un modelo de Galleria mellonella.

5- Evaluar el efecto de la limitación de hierro en la producción de DSF.

6- Estudiar la influencia de la concentración de hierro en la formación y arquitectura de

biofilms y en la virulencia. Estudiar el efecto de la limitación de hierro en la respuesta

al estrés oxidativo de biofilms de S. maltophilia (actividad de SOD y niveles de las

especies reactivas del oxígeno).

Materiales y Métodos


21

1. Cepas bacterianas

Para este estudio se utilizaron 63 aislamientos locales de S. maltophilia recuperados

de infecciones nosocomiales asociadas al uso de productos médicos en la Sección

Bacteriología del Hospital de Clínicas José de San Martín, Buenos Aires, durante el

periodo 2004-2010.

La cepa de origen clínico, S. maltophilia K279a, cuyo genoma ha sido secuenciado y

la mutante K279a rpfF que no produce DSF (62) se utilizaron para estudios comparativos.

Xanthomonas campestris pv. campestris 8004, y la cepa biosensora Xcc 8523 (mutante

rpfF, DSF- ) se utilizaron en el bioensayo descripto por Barber et al. (13). Estas cepas

fueron gentilmente cedidas por el Dr. Maxwell Dow (BIOMERIT Resarch Centre,

University college Corck, Ireland).

Todos los aislamientos fueron conservados en glicerol 15 % a -20 ºC.

2. Tipificación molecular

2.1. ERIC-PCR

La genotipificación se realizó mediante la técnica ERIC-PCR (secuencias consenso

repetitivas intragénicas de enterobacterias) utilizando el oligonucleótido ERIC-2 (Tabla 1)

(85). El ADN genómico se obtuvo a partir de una colonia de cada aislamiento cultivado en

agar tripteina soya (TSA) que fue resuspendida en 200 µl de agua destilada estéril,

hervida durante 10 min y centrifugada a 12000 rpm 3 min (34). La reacción en cadena de

la polimerasa se realizó en un volumen final de 50 µl que contenía 10 µl de buffer GoTaq

(Promega) 5X, MgCl2 4 mM, dimetilsulfoxido al 10 %, 400 µM de cada nucleótido, 60

pmoles del oligonucleótido cebador ERIC-2, 2 U de GoTaq polimerasa (Promega) y 3 µl

de ADN genómico. La reacción de amplificación se realizó en un termociclador Biometra

TPersonal, el ciclo de amplificación utilizado consistió en un intervalo inicial de 2 min a 94

°C y 30 ciclos de 30 seg a 94 °C, 1 min a 50 °C, 4 min a 72 °C, seguido de una extensión

final de 7 min a 72 °C. En cada experimento se incluyó un control negativo al que se le

agregó agua en lugar de ADN molde. Los productos de amplificación se analizaron por

electroforesis en geles de agarosa al 1,5 % con un marcador de peso molecular de 1 kb.

Para la visualización se utilizó la tinción con bromuro de etidio y las imágenes fueron

capturadas utilizando el transiluminador Molecular Imager® Gel Doc™ XR (Bio-Rad). Los


22

patrones de bandas se analizaron visualmente y se consideraron idénticos cuando la

posición de las bandas coincide sin importar la intensidad. Se utilizó además el

dendograma basado en el algoritmo UPGMA obtenido mediante el programa TREECON

versión 1.3 b para Windows.

2.2. REP-PCR

Se utilizó la técnica REP-PCR (secuencias repetitivas palindrómicas extragénicas)

con los oligonucleótidos REP-1 y REP-2 (Tabla 1). El ADN genómico se obtuvo de la

misma forma que para ERIC-PCR. La reacción se realizó en un volumen final de 50 µl que

contenía 10 µl de buffer GoTaq (Promega) 5X, MgCl2 2,5 mM, dimetilsulfoxido al 10%, 400

µM de cada nucleótido 60 pmoles de cada oligonucleótido cebador, 2 U de GoTaq

polimerasa (Promega) y 3 µl de ADN genómico. La reacción de amplificación se realizó en

un termociclador Biometra TPersonal, el ciclo de amplificación utilizado consistió en un

intervalo inicial de 5 min a 95 °C y 35 ciclos de 1 min a 94 °C, 1 min a 45 °C, 6 min a 68

°C, seguido de una extensión final de 18 min a 68 °C. En cada experimento se incluyó un

control negativo. Los productos de amplificación se analizaron del mismo modo que ERIC-

PCR.

3. Producción de potenciales factores de virulencia

3.1. Detección de la presencia de los genes narG y stmPr-1 en

aislamientos locales de S. maltophilia

La detección de los genes narG y stmPr-1 se realizó mediante la reacción en

cadena de la polimerasa utilizando oligonucleótidos diseñados en base al genoma

publicado de K279a (Tabla 1). Los mismos fueron contrastados con otros genomas

publicados para que eventuales polimorfismos no influyan negativamente en la

amplificación. El ADN genómico se obtuvo como se describió en el punto 2.

Para el gen narG, la reacción en cadena de la polimerasa se realizó en un volumen

final de 25 µl que contenía 5 µl de buffer GoTaq (Promega) 5X, MgCl2 2,5 mM,

dimetilsulfoxido al 10 %, 400 µM de cada nucleótido 60 pmoles de cada oligonucleótido

cebador, 1 U de GoTaq polimerasa (Promega) y 4 µl de ADN genómico. La reacción de

amplificación se realizó en un termociclador Biometra TPersonal, el ciclo utilizado

consistió en un intervalo inicial de 5 min a 95 °C y 35 ciclos de 1 min a 95 °C, 30 seg a 50

°C, 1 min a 72 °C, seguido de una extensión final de 6 min a 72 °C.


23

Para el gen stmPr-1, la reacción se realizó en un volumen final de 25 µl y la mezcla

de reacción se preparó como se describió para el gen narG. El ciclo utilizado consistió en

5 min a 95 °C, 30 ciclos de 1 min a 95°C, 30 seg a 48 °C, 1 min a 72 °C, seguido de una

extensión final de 6 min a 72 °C.

En cada experimento se incluyó un control negativo al que se le agregó agua en

lugar de ADN molde. Los productos de amplificación se analizaron por electroforesis en

geles de agarosa al 1,5 % con un marcador de peso molecular de 1 kb. Para la

visualización se utilizó la tinción con bromuro de etidio.

Tabla 1. Oligonucleótidos utilizados en este estudio

Gen Secuencia Origen

ERIC-2 5’-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3’ Hulton et al. (85)

REP-1 5`-IIIGCGCCGICATCAGGC-3` Seral et al.

REP-2 5`-ACGTCTTATCAGGCCTAC-3`. (132)

narG F 5´-GGCTTGAGCACGATGCGGGT-3´

F 5´-GTGGGCAAGGAGCACGAGGC-3´

Este estudio

stmPr -1 F 5´-CGTGCCAGCTTCTCCAACTA-3´

F 5´-AGGACTGTTGATGGTGCAGG-3´

Este estudio

fur F 5´-GGCGGTTGGGGAAATCAAAC-3´

R 5´-CAACGAAAAACCCCGGGCA-3´

Este estudio

3.2. Prueba de reducción de nitratos

Con esta prueba se detecta la respiración anaeróbica que utiliza nitrato como

aceptor final de electrones. Los nitratos se reducen a nitritos y algunas bacterias reducen

los nitritos a nitrógeno gaseoso (N2) por la presencia de las enzimas nitrato y nitrito

reductasa, respectivamente. Con un cultivo fresco del microoganismo a ensayar, se


24

inoculó el Caldo nitrato (ver anexo I) y se incubó a 35 °C, 24 h. Para determinar si el

nitrato ha sido reducido a nitrito, después de la incubación, se añadieron al medio de

cultivo, 2 gotas de solución A, y luego 2 gotas de la solución B del reactivo de Griess (ver

anexo I). La aparición de una coloración rosada o roja indica que los nitratos han sido

reducidos a nitritos. Si la reacción es negativa, se añade una muy pequeña cantidad de

polvo de Zinc. La aparición de una coloración rosada o roja confirma la negatividad de la

reacción; en caso de que esto no suceda, significa que los nitratos han sido reducidos a

N2 gaseoso.

3.3. Proteasas

Se determinó la actividad proteolítica utilizando placas de agar nutritivo

suplementado con leche descremada 1,5 % (p/v) (83). El inoculo se preparó a partir de

cultivos en caldo TSB de 20 h de incubación. Las células fueron centrifugadas y

resuspendidas en el mismo medio hasta obtener aproximadamente 108 ufc/ml y se

sembraron 5 µl de esta suspensión en la placa con leche. Luego de 24 h de incubación a

30 °C, la actividad proteolítica fue determinada midiendo el halo de proteólisis alrededor

de la colonia.

3.4. Lipasa

Se determinó la actividad lipolítica utilizando placas con agar base tibutirina

suplementado con glicerol tributirato 1 % (Merck).Se realizó una estría de las cepas a

estudiar a partir de cultivos en TSA de 18 h de incubación y se incubaron a 35 °C durante

24 h (83).

3.5. DNasa

Se determinó la actividad de DNasa utilizando placas conteniendo agar nutritivo y

ácido desoxirribonucleico. Se realizó una estría de las cepas a estudiar a partir de cultivos

en TSA de 18 h de incubación. Después de la incubación de 24 h la placa se inunda con

ácido clorhídrico 1 %, que causa la precipitación del ADN polimerizado y hace al medio

opaco. Los organismos que degradan el ADN producen una zona transparente alrededor

de la estría (149).

3.6. Resistencia al estrés oxidativo

Ensayo de difusión en placa


25

La sensibilidad al peróxido de hidrogeno se determinó por el ensayo de difusión (73)

con algunas modificaciones. Cultivos de 24 h en TSB se estandarizaron a una DO546 de

0,300, una alícuota de 300 µl se utilizó para inocular 30 ml de TSB con 0,7 % de agar

termostatizado a 45 °C, 3 ml de esta suspensión fueron transferidos a una placa de Petri

que contenía 16 ml de TSA. Discos de papel de filtro (Whatman) estériles de 7 mm de

diámetro fueron impregnados con 3 µl de una solución de H2O2 12 % (Merck). La

sensibilidad al peróxido de hidrogeno fue determinada midiendo el halo de inhibición

alrededor del disco luego de la incubación durante 24 h a 37 °C. Los experimentos fueron

realizados por triplicado.

Ensayo de supervivencia frente a H2O2

Cultivos de 18 h incubados con agitación fueron diluidos con TSB hasta obtener una

densidad celular de aproximadamente 5x107 a 1x108 ufc/ml. Previo al tratamiento con

H2O2 de determinó el número inicial de ufc/ml (N0), para esto a una alícuota del cultivo se

le realizaron diluciones seriadas en solución fisiológica y se espatuló 100 µl de las

diluciones apropiadas en placas conteniendo TSA. Luego de la determinación del N0 los

cultivos fueron tratados con H2O2 20 mM (Merck) e incubados inmediatamente con

agitación a 35 °C. A los 15 y 30 min de incubación se tomaron alícuotas y se realizaron

recuentos de viables utilizando solución fisiológica con tiosulfato de sodio 0,2 % para

inactivar el H2O2. Las diluciones apropiadas fueron espatuladas en placas conteniendo

TSA e incubadas a 35 °C. Luego de la incubación se determino el número de ufc/ml y el

efecto del tratamiento con H2O2 se expresó como el porcentaje de sobrevivientes

relacionado al número inicial de microorganismos (54).

3.7. Producción de sideróforos

Como método de tamizaje se empleó el ensayo universal Cromoazurol S (CAS) en

placa descripto por Schwyn y Neilands (128), modificado por Armstrong et al. (8) que

utiliza como medio de cultivo Stainer-Scholte sin suplemento con agar al 1,5 %. A este

medio se le agregó Casamino ácidos 0,1 % (p/v) (SSC) para favorecer el crecimiento de

S. maltophilia. El método se basa en la incorporación del colorante cromoazurol S en el

medio agarizado para formar complejos estables con el hierro, generando un color verde-

azul. Cuando un quelante con mayor afinidad, como el sideróforo, remueve el hierro del

complejo, el medio se vuelve de color al naranja. Para preparar el medio de cultivo, un


26

volumen de 100 ml del reactivo CAS-HDTMA-Fe (ver anexo I) se agregó asepticamente a

900 ml del medio SSC con 1,5 % de agar-agar, pH 7,00 previamente esterilizado. Cuando

fue necesario generar condiciones de limitación de hierro se agregó el quelante de hierro

2,2’ dipiridilo (Dip) 100 µM. Cada placa contenía 20 ml de medio. Cultivos de 18 h en TSB

se estandarizaron a una DO546 de 0,300 y se utilizaron para inocular las placas de agar

CAS con escarbadientes estériles. Las placas inoculadas se incubaron a 35 °C por 48 h.

La producción de sideróforos se evidenció como un halo naranja alrededor de la colonia

3.8. Determinación de la naturaleza química de sideróforos

3.8.1. Condiciones de cultivo

Los aislamientos de S. maltophilia fueron cultivados en el medio SSC suplementado

con Dip 100 µM o con FeCl3 100 µM durante 48 h con agitación (200 rpm). Luego de la

incubación se llevaron a una DO546 de 1,00 y los respectivos sobrenadantes fueron

obtenidos por centrifugación a 10.000 rpm 5 min.

3.8.2. Ensayo de Arnow

La presencia de compuestos tipo catecol en los sobrenadantes de cultivo se

determinó por el ensayo de Arnow (25). Para este ensayo a 1 ml de sobrenadante se

agregaron los siguientes reactivos en orden: 1 ml de HCl 0,5 N, 1 ml nitrito-molibdato

(cantidades de c/u) y 1 ml NaOH 1,0 N. Los compuestos de tipo catecol producen un

compuesto de color rosa.

3.8.3. Ensayo de Csáky

La presencia de compuestos tipo hidroxamato en los sobrenadantes se determinó

por el ensayo de Csáky (25). En este ensayo 1 ml de sobrenadante es hidrolizado con 1

ml de H2SO4 6 N a 130 °C por 30 min. Luego se agregan 3 ml de acetato de sodio, 1 ml

de ácido sulfanilico y 0,5 ml de iodo. Luego de 3-5 min el exceso de iodo es eliminado con

1 ml de arsenito de sodio. Finalmente se agrega 1 ml de α-naftillamina y luego de 20-30

min aparece un color rosa si hay presentes compuestos tipo hidroxamato. Bordetella

bronchiseptica 7865 y Acinetobacter baumannii ATCC19606 se emplearon como

controles de cepas productoras de sideróforos tipo hidroxamato y catecol

respectivamente.


27

4. Curvas de Crecimiento

Las curvas de crecimiento en medio líquido se realizaron en TSB y se incubaron a

35 °C en condiciones estáticas y con agitación (150 rpm). Para la preparación del inoculo

se partió de placas de TSA de 18 h de incubación y se realizó una suspensión en TSB de

DO540 de 0,300. Alícuotas de 100 µl se utilizaron para inocular tubos con 5 ml de TSB. El

crecimiento se siguió espectrofotométricamente a 450 nm (Metrolab 1700).

5. Bioensayo para determinar la producción DSF

Se utilizó una modificación del método desarrollado por Barber et al. (13) basado en

la recuperación de la actividad endoglucanasa, enzima regulada por “quorum sensing”, de

una mutante de Xanthomonas campestris pv. campestris rpfF (Xcc 8523).

5.1. Extracción de DSF de sobrenadantes de cultivo

Los compuestos presentes en el sobrenadante de cultivo fueron extraídos con las

columnas Oasis MAX 30 mg de soporte (Waters Oasis® Milford, USA) de extracción en

fase solida que se basan en el principio combinado de intercambio aniónico e interacción

hidrofóbica. Se realizaron cultivos en 20 ml del medio SSC y SSC suplementado con

FeCl3 100 µM y se incubaron a 35 °C por 48 h con agitación. Los cultivos fueron

centrifugados a 10000 rpm por 10 min, los sobrenadantes se acidificaron hasta pH 3,00

con ácido clorhídrico. Luego, se utilizaron 8 ml de cada sobrenadante para la extracción

en fase solida. Las columnas fueron acondicionadas haciendo pasar 2 ml de metanol y

luego 2 ml de agua destilada estéril. Luego se pasaron 8 ml del sobrenadante acidificado

y para el lavado se pasaron 3 ml de solución de acetato de sodio 50 mM:metanol (95:5).

La elución se realizó con 2 ml de metanol y luego con 2 ml de de solución de acido

acético al 2 % en metanol. El extracto obtenido se evaporó a sequedad y se resuspendió

en 500 µl de agua estéril para ser utilizado en el bioensayo.

5.2. Bioensayo

Las células de Xcc 8523 provenientes de cultivos de 18 h de incubación en el medio

NYGB fueron centrifugadas, lavadas y resuspendidas en el medio MMXC hasta una

concentración de aproximadamente 5x107 ufc/ml. El bioensayo se realizó en 1 ml de

MMXC al que se le agregó 100 µl de esta suspensión y 100 µl del extracto de

sobrenadante de cultivo del cual se quiere determinar la concentración de DSF. Las

mezclas fueron incubadas por 22 hs a 28 °C. Previa medición de la DO540, las células


28

fueron removidas por centrifugación. La actividad relativa de endoglucanasa fue

determinada sembrando alícuotas de 50 µl del sobrenadante en pocillos de 6 mm hechos

en placas con 20 ml de agar carboximetilcelulosa. Después de incubar a 37 °C por 20 h,

las placas fueron teñidas con rojo congo 0,1 % durante 30 min y reveladas con una

solución de NaCl 1M. Se midió el diámetro de los halos de cada condición, se cuantificó la

actividad mediante la utilización de una curva estándar realizada con diluciones de

concentración conocida de Celulasa I (SIGMA). Como control negativo se realizó el

ensayo en las mismas condiciones pero en lugar de agregar 100 µl del extracto se agregó

agua. Como control positivo se utilizó una suspensión estandarizada de la cepa salvaje

Xcc 8004 en lugar de utilizar la mutante Xcc 8523 y se realizó el ensayo en las mismas

condiciones utilizando agua en lugar del extracto.

6. Formación de biofilms

La formación de biofilms se estudió bajo las siguientes condiciones: se realizaron

cultivos en caldo TSB y TSB suplementado con DSF comercial 200 µM (Santa Cruz

Biotechnology Inc.) o con el quelante 2,2’ dipiridilo (Dip) 200 µM según se indique. La

incubación se realizó en condiciones estáticas a 35 ºC durante 48 h.

6.1. Estandarización del inoculo

Los inóculos se estandarizaron en base a la densidad óptica (DO540) equivalente a

1x108 ufc/ml aproximadamente (117). Las suspensiones estandarizadas fueron utilizadas

para inocular el medio de cultivo apropiado realizando una dilución 1/100. Todos los

ensayos se realizaron al menos tres veces.

6.2. Ensayo en Tubos

La formación de biofilms en tubos se realizó como describieron Passerini de Rosi et

al (117). Alícuotas de 2 ml de TSB inoculado como se describió en el punto anterior fueron

transferidas asépticamente a tubos de borosilicato (BS) y polipropileno (PP) e incubadas

con agitación durante 6, 24 y 48 h. Para cada condición, se utilizaron 8 tubos. Luego de la

incubación 2 tubos fueron utilizados para estimar el crecimiento midiendo la DO450nm

previa homogeneización. Los otros seis tubos fueron utilizados para estimar la biomasa

del biofilm formado. A dichos tubos se les aspiro el cultivo y las células adheridas fueron

lavadas con agua destilada y teñidas con 2 ml de CV (0,01 %) por 30 min. El biofilm


29

formado fue visualizado y posteriormente cuantificado espectrofotométricamente a 456

nm (Metrolab 1700) mediante la elución del CV adherido con 2 ml etanol.

6.3. Ensayo en microplacas

Los ensayos en microplacas de poliestireno de 96 pocillos (Greiner Bio-One) fueron

realizados como describieron O’Toole y Kolter (111) con algunas modificaciones (117).

Los pocillos de las microplacas se llenaron con 180 µl del medio de cultivo inoculado, que

fue preparado como se describió en el punto anterior. Luego de la incubación por 48 h a

35 °C, se determinó la DO546 del crecimiento y se eliminaron las células planctónicas. El

biofilm formado en los pocillos se lavó con PBS y se tiñó con cristal violeta (CV) 0,01 %.

La cuantificación de la biomasa (células adheridas y matriz extracelular) se realizó

mediante la elución del CV con 200 µl de etanol. La lectura de la DO546 se realizó en un

lector de ELISA (Metertech 960). Cada aislamiento se ensayó por octuplicado.

6.4. Microscopia óptica

Para la observación microscópica los biofilms fueron formaron en cubreobjetos de

borosilicato. Cubreobjetos estériles fueron transferidos asépticamente a placas de Petri

conteniendo TSB inoculado como se describió anteriormente y se incubaron durante 48 h

a 35 °C. Luego fueron lavados con agua destilada, teñidos con CV (0,1 %) durante 10 min y

lavados nuevamente. Los cubreobjetos montados sobre portaobjetos fuero visualizados

en el microscopio Olympus BX51 con magnificación de 400X. Las imágenes fueron

capturadas con la cámara digital Q color 3 y procesadas con Image-Pro plus 6.2 sofware

en la Cátedra de Inmunología.

7. Microscopia confocal laser de barrido.

La arquitectura del biofilm de S. maltophilia se estudió mediante microscopia

confocal laser de barrido. Para este propósito los biofilms se formaron en unas cámaras

de cultivo especiales con base de borosilicato de 100 µm de espesor (Lab-Tek Nunc; N°

155411). Las cámaras se llenaron con 400 µl del medio de cultivo inoculado que fue

preparado como se describió en el punto 6.1. Luego de la incubación por 48 h a 35 °C se

eliminaron las células planctónicas y se lavó el biofilm con solución fisiológica. La

visualización se realizó por tinción con colorante fluorescente Syto9® (Molecular probes)

2,5 µM disuelto en solución fisiológica. Luego de la inciubacion por 30 min con el

colorante, las cámaras se examinaron en un microscopio confocal Carl Zeiss LSM510-


30

Axiovert 100 M con objetivo de 40X de inmersión en agua. Para la excitación de la

muestra se utilizó el laser de argón de 488 nm y la emisión se midió entre 505-530 nm.

Todas las imágenes fueron tomadas escaneando secuencialmente cada 10 µM.

Las imágenes fueron analizadas con el programa ZEN 2009 Light Edition de Carl

Zeiss mientras que las reconstrucciones tridimensionales fueron realizadas con el

programa ImageJ. Las imágenes fueron tomadas en el servicio de micoscopia confocal

del Instituto de Investigaciones Biomédicas (BIOMED) Pontificia Universidad Católica

Argentina (UCA)-CONICET.

8. Movilidad asociada a superficies o “twitching”

La movilidad asociada a superficies se estudió en medio LB solidificado con agar-

agar 1 %. Se realizaron suspensiones de DO546 1,0 de las cepas a estudiar que se

utilizaron para inocular las placas de twitching por punción. Luego de la incubación se

removió el agar y se tiñeron las células adheridas con CV 0,1 % (130). Las zonas de

movilidad fueron medidas y, además, visualizadas microscópicamente a una

magnificación de 400X.

9. Producción de sustancias poliméricas extracelulares (EPS)

La producción de EPS fue determinada como describieron Boon et al (17) con

algunas modificaciones. A partir de cultivos en caldo LB de 24 h se realizaron

suspensiones de DO540 0,200, y alícuotas de 100 µl de éstas se utilizaron para inocular

erlenmeyers con 100 ml de caldo LB suplementado con glucosa 0,1 % (LB-glu 0,1 %). Los

cultivos fueron incubados a 35 °C en agitación (200 rpm) durante 48 h y se obtuvieron los

sobrenadantes por centrifugación a 14000 rpm durante 20 min mientras que la biomasa,

obtenida en el precipitado, fue secada a 56 °C. Luego de filtrar los sobrenadantes (0,45

µM) se precipitaron las EPS mediante el agregado de 2 volúmenes de etanol absoluto y

posterior incubación a -20 °C durante 24 h. Las EPS precipitadas se obtuvieron por

centrifugación a 10000 rpm durante 10 min. Finalmente el precipitado obtenido fue secado

a 56 °C hasta peso constante para luego determinar el peso seco en balanza analítica.

Los resultados fueron expresados como la cantidad de EPS (µg) relacionado al peso seco

de la biomasa (mg). El contenido de proteínas totales fue cuantificado con el reactivo de

Bradford (Sigma Aldrich) y utilizó seroalbumina bovina (Sigma Aldrich) como patrón. El


31

contenido de carbohidratos total fue cuantificado con el método de fenol y acido sulfúrico

utilizando glucosa como estándar (19, 50).

10. Espectroscopia de reflexión total atenuada infrarroja con

transformada de Fourier (ATR-FTIR)

El precipitado de EPS obtenido como se describió en el punto anterior fue

resuspendido con una relación de 20 µl de agua Milli-Q por cada mg de EPS y se

realizaron las diluciones necesarias hasta obtener una señal que no sature el sistema.

Alícuotas de 150 µl de las suspensiones fueron transferidos a celdas ópticas de ZnSe y

posteriormente secados hasta obtener una delgada película sobre la superficie.

El análisis por ATR-FTIR fue realizado empleando el espectrofotómetro Nicolet 380

FT-IR (Thermo Scientific Electron Corporation). Los espectros de absorción de las

muestras fueron adquiridos en el intervalo de lectura de 4000 a 650 cm-1 con una

velocidad de medición de 1 cm/seg realizándose 32 escaneos por espectro y empleando

una resolución de 4 cm-1. Estos parámetros fueron ajustados por medio del programa

OMNIC (Thermo Scientific Electron Corporation).

11. Aislamiento de mutantes Fur

Para aislar mutantes espontaneas Fur de S. maltophilia se utilizó la técnica de

selección por resistencia al manganeso descripta por Hantke con algunas modificaciones

(69). Cultivos de K279a en caldo LB de 18 h de incubación fueron espatulados en placas

que contenían MnSO4 20 mM y Dip 200 µM. Luego de 72 h de incubación las colonias

resistentes al manganeso que crecieron en el medio fueron cultivadas en placas de agar

CAS suplementadas con FeCl3 20 mM para detectar la mutantes Fur ya que éstas

producen sideróforos constitutivamente. La mutación en el gen fur fue confirmada por

secuenciación del gen completo junto a una región de 100 nucleótidos rio arriba del codón

de inicio. Los oligonucleótidos utilizados para tal fin fueron diseñados en base al genoma

publicado de K279a (Tabla 1). La secuenciación del ADN fue realizada en la Unidad de

Genómica del Instituto de Biotecnología, C.I.C.V.y A. Instituto Nacional de Tecnología

Agropecuaria (INTA), Castelar. Las secuencias fueron analizadas con los programas

BioEdit sequence ailgnmet editor y MEGA versión 5.


32

12. Ensayo de reducción del Azul de Nitrotetrazolio (NBT)

Este ensayo permite evaluar las especies reactivas del oxigeno (ERO) mediante la

utilización NBT oxidado (de color amarillo) que, en presencia de anión superoxido, es

reducido a azul de formazán, un compuesto de color azul, que pude ser evaluado por

espectrofotometría. Las ERO se determinaron en biofilms que se formaron en microplacas

de PS de 96 pocillos cultivaos en TSB en presencia o ausencia de Dip 200µM. Se

utilizaron 180 µl del medio de cultivo inoculado (preparado como se describió en el ensayo

de formación de biofilms) para llenar 12 pocillos de la microplaca por cada condición.

Luego de la incubación de 48 h a 35 °C, se determinó la DO546 del crecimiento y se

eliminaron las células planctónicas. El biofilm formado en los pocillos se lavó con PBS y 6

de ellos fueron teñidos con cristal violeta (CV) 0,1 % los restantes 6 pocillos se reservaron

para la reacción con NBT. La cuantificación de la biomasa (células adheridas y matriz

extracelular) se realizó mediante la elución del CV con 200 µl de etanol. La formación de

biofilms se evaluó con la relación DO546 del CV/ DO546 del cultivo (biomasa relativa del

biofilm). Por otra parte los biofilms formados en los restantes 6 pocillos se trataron con

200 µl de NBT 0,5 mg/ml, (Sigma Aldrich) y luego de la incubación durante 30 minutos a

37 °C en oscuridad, se frenó la reacción agregando 20 µl de HCl 0,1 N, finalmente se

agregaron 50 µl dimetilsulfóxido para extraer el NBT reducido. El producto de la reacción

se midió espectrofotométricamente a 546 nm. Los niveles de ERO se expresaron en

relación a la biomasa relativa del biofilm (2, 7).

13. Actividad de la enzima superoxido dismutasa (SOD)

La actividad de la enzima SOD se determinó con el sistema Riboflavina/metionina y

NBT (15). En presencia de luz, la riboflavina pierde un electrón y genera anión superoxido

(O2.-). Debido a que la enzima SOD actúa disminuyendo la concentración de O2

.-, a mayor

actividad SOD, menor es la reducción del NBT. Por lo tanto, se definió una unidad de

actividad SOD como la cantidad de enzima requerida para disminuir en un 50 % la

producción de NBT reducido.

13.1. Obtención de extractos crudos

Las células bacterianas provenientes de cultivos planctónicos de 25 ml fueron

obtenidas por centrifugación, lavadas y resuspendidas en 7 ml de PBS con el inhibidor de

porteasas PMSF 0,25 mM (Fluka Biochemika). Las suspensiones fueron sonicadas por 6


33

min en dos pulsos de 3 min (Vibra cell, Sonics & materials inc.) y centrifugadas a 10000

rpm durante 10 min a 4°C. La concentración de proteínas se determinó con el reactivo de

Bradford (Sigma Aldrich). Se utilizó seroalbumina bovina (Sigma Aldrich) como patrón

(19).

13.2. Actividad en cultivos planctónicos

Alícuotas de 100 µl de cada extracto crudo fueron tratadas con 300 µl de metionina

13 mM (Sigma Aldrich), 100 µl de NBT 1 mg/ml, 300 µl de EDTA 100 nM y 300 µl de

riboflavina (Sigma Aldrich) en presencia de luz. Luego de 15 min se determinó la DO560.

La actividad se expresó como unidades de SOD por mg de proteínas totales.

13.3. Actividad en el biofilm

Para este propósito los biofilms fueron formados en microplacas de 12 pocillos

(Greiner Bio-One) con 3 ml de cultivos estandarizados como se describió en el ítem 6.1.

Luego de la incubación a 35 °C por 48 h, se eliminó el medio de cultivo y los biofilms se

lavaron con PBS. A cada pocillo se le agregó 1 ml de PBS y para despegar las células

adheridas se raspó la superficie y las paredes con un cepillo. Así se obtuvo el material de

10 pocillos por cada tratamiento que luego fueron centrifugados y resuspendidos en 1 ml

de PBS con PMSF 0,25 mM. Las suspensiones fueron sonicadas con un microtip por 6

min en dos pulsos de 3 min (Branson Sonifier 250) y centrifugadas a 10000 rpm durante

10 min a 4 °C. La concentración de proteínas se determinó como se describió en el ítem

13.1

13.4. Geles nativos para SOD y determinación del tipo de isoenzima

Las proteínas presentes en extractos obtenidos como se describió en el ítem 13.1

fueron separadas en geles de poliacrilamida en condiciones no desnaturalizantes en

presencia de Tris 50 mM, glicina 300 mM y EDTA 1,8 mM a 120 voltios. En cada calle se

cargó 20 µg de proteínas totales y se utilizó como control Mn-SOD purificada de E. coli

(Sigma Aldrich). La actividad SOD fue visualizada por la tinción con NBT descripta por

Beauchamp y Fridovich (15). Luego de la electroforesis, los geles fueron lavados con

agua destilada e incubados durante 30 min en oscuridad y agitación con una solución de

PBS 50 mM, pH 7,80 que contenía NBT 500 µM, EDTA 1 mM, TEMED 20 mM (Invitrogen,

Carlsbad) y riboflavina 30 µM. Los geles fueron expuestos a la luz hasta la aparición de

bandas acromáticas en un fondo azul que indican actividad SOD. Para identificar el tipo

de isoenzima SOD, se utilizaron ensayos de inhibición. Los geles se trataron con NaCN


34

10 mM o H2O2 3,7 mM para inactivar la isoenzima Cu/Zn-SOD o Fe-SOD,

respectivamente (51). La resistencia a ambos tratamientos es característica de Mn-SOD.

Luego de incubar los geles con los inhibidores se tiñeron con NBT como se describió

anteriormente. Se utilizó como control Mn-SOD purificada de E. coli.

14. Evaluación de la virulencia con el modelo de infección de Galleria mellonella

Para evaluar la virulencia se utilizó el modelo de infección del lepidóptero Galleria

mellonella. Las larvas de G. mellonella fueron mantenidas en condiciones de temperatura

y humedad adecuada y alimentadas con una dieta artificial que consistió en salvado de

trigo 250 g, levadura seca 10 g, leche en polvo 25 g, miel 100 g, glicerina 50 g, nipagin 0,1

%, agua 100 ml esterilizada en autoclave. Se infectaron larvas de G. mellonella con

suspensiones bacterianas preparadas a partir de cultivos en TSA de 24 h. Algunas

colonias de cada cepa fueron resuspendidas en solución fisiológica estéril hasta una

DO540 de 0,300 equivalente a 108 ufc/ml. Esta suspensión y diluciones 1/10 y 1/100 se

utilizaron para inocular las dosis de 106, 105 y 104 ufc/larva respectivamente. Se

seleccionaron al azar grupos de 10 a 15 larvas en el estadío larval final de peso entre 0,25

y 0,35 g y se utilizó un grupo por cada condición. Se inyectaron alícuotas de 10 µl de las

suspensiones con una jeringa Hamilton dentro del hemocele de cada larva a través de la

última pata derecha, previa desinfección con alcohol. Todos los inoculos fueron

confirmados mediante recuentos de viables de cada suspensión estandarizada. Después

de la inyección las larvas fueron colocadas en placas de Petri e incubadas a 30°C en

oscuridad. Se contabilizó el número de larvas muertas cada 24 h por un periodo de 96 h.

En cada experimento se incluyó un grupo control de larvas inyectadas con 10 µl de

solución fisiológica para evaluar la muerte que se podría producir debido al trauma físico

generado por la inyección. Los experimentos con más de 1 larva muerta en el grupo

control se descartaron (129). Las curvas de supervivencia fueron graficadas con el

método de Kaplan-Meier y las diferencias significativas fueron analizadas con la prueba

Log-rank mediante el programa Graph Pad Prism versión 3.5”


35

15. Preparación de fracciones enriquecidas en OMPs

Cultivos bacterianos de 50 ml en TSB en presencia y ausencia de Dip fueron

centrifugaron a 10000 rpm a 4 °C y resuspendidos en HEPES 10 mM (pH 7,4). Los pellets

fueron lavados con HEPES 10 mM y aproximadamente 1,5 g (peso húmedo) de células

fueron resuspendidas en 7 ml del mismo buffer con PMSF (concentración final de 0,1

mM). Las fracciones enriquecidas en OMPs se obtuvieron utilizando la técnica de Leyh y

Griffith (96). Las suspensiones fueron sonicadas durante 10 min con pulsos de 1 min,

mientras se mantenían en un baño de hielo-agua. Las células enteras y los desechos se

separaron por centrifugación a 5.000 rpm durante 20 min y el sobrenadante se procesó

mediante ultracentrifugación a 100.000 rpm durante 60 min a 4 °C. El pellet, que

constituye la fracción de membranas totales, se resuspendió en Sarkosyl al 1,5 % (p/v)

disuelto en HEPES 10 mM con PMSF 0,1 mM y se incubó durante 30 min a temperatura

ambiente. La suspensión se centrifugó a 100000 rpm durante 60 min a 4 °C para obtener

el pellet que contiene el material insoluble en detergente donde se encuentra la fracción

enriquecida en proteínas de membrana externa. Finalmente el pellet se resuspendió en

agua desionizada.

16. Electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE)

Las fracciones enriquecidas en OMPs se solubilizaron en el buffer muestra de

Laemmli (94) y se calentaron a ebullición durante 5 min. La separación se realizó por

SDS-PAGE utilizando un gel discontinuo en gradiente y el sistema Tris/Tricina SDS-PAGE

(127). El gel se tiñó con azul de Coomassie G-250. Como sustancias de referencia se

emplearon marcadores de masa molecular (Mr) 205, 116, 97, 66, 45 y 29 (SDS-6H,

Sigma).

17. Digestión en gel e identificación de proteínas mediante

espectrometría de masa

Mediante la estrategia denominada huella de masas peptídicas, una proteína es

convertida en péptidos por la acción de una enzima. El conjunto de péptidos derivados de

la proteína es una característica propia de ésta y puede utilizarse para su identificación.

Así, la determinación de la masa de los péptidos de digestión de una proteína permite

hacer comparaciones con las masas teóricas del conjunto de péptidos esperados para las


36

secuencias almacenadas en una base de datos y sugerir aquellas que se ajustan más a

los datos experimentales.

Luego de la electroforesis se seleccionaron y cortaron las bandas de interés para

ser procesadas por esta técnica. Se realizó la digestión de dichas bandas con 20 µl de

una solución de tripsina de 25 ng/µl y el producto de digestión de cada una de las

muestras se analizó fue separado HPLC en fase reversa con la fase móvil en gradiente de

2-100 % de Solvente B a lo largo de 90 minutos (Solvente A: fluoruro de hidrógeno 0,1 %;

Solvente B: 80 % acetonitrilo en fluoruro de hidrógeno 0,1 %) y con una columna Vydac

RP-C18 (1,0 x 200 mm). Los péptidos separados se analizaron en el Espectrómetro de

Masa LCQ Duo ESI/TRAP (Thermo Fisher) acoplado al cromatografo. Como control

positivo se utilizó seroalbumina bovina (BSA, SIGMA) y como blanco, una zona del gel sin

muestra. Los datos se obtuvieron mediante el programa Triple Play y Data Dependent. Se

aplicó el programa Mascot MSMS (Matrix Science) del servidor público para el estudio de

los digeridos. La base de datos utilizada fue “nr”. Las muestras se analizaron en el

Laboratorio Nacional de Investigación y Servicios en Péptidos y Proteínas (LANAIS–PRO,

CONICET-UBA).

18. Cromatografía en placa delgada (TLC)

Se obtuvieron sobrenadantes de las cepas K279a y Fur60 a partir de 100 ml de

cultivos en SSC y SSC suplementado con FeCl3 100 µM, incubados durante 48 h,

mediante centrifugación a 10000 rpm. Como control se utilizaron sobrenadantes de

Escherichia coli K12 cultivada en los mismos medios con 18 h de incubación. Los

sobrenadantes fueron acidificados con HCl concentrado hasta pH 2,0 y extraídos dos

veces con 70 ml de acetato de etilo. Luego el extracto fue secado con sulfato de sodio

anhidro, evaporado a sequedad y el residuo fue resuspendido en 500 µl de acetato de

etilo. Los extractos se analizaron con placas de Silica gel 60 F254 (Merck) y como fase

móvil se utilizó una mezcla de cloroformo-metanol (2:1). Para revelar las placas

cromatográficas se atomizaron sobre la superficie los reactivos de la reacción de Arnow

para detectar compuestos de tipo catecol.


37

19. Cromatografía de alta performance (HPLC) y detección UV con arreglos de diodos

Extractos crudos obtenidos con acetato de etilo a partir de sobrenadantes de cultivo

en condiciones limitantes y no limitantes de hierro se analizaron mediante HPLC en fase

reversa.

19.1. Preparación de la muestra

Se obtuvieron sobrenadantes de cultivo a partir de 100 ml de cultivos incubados

durante 48 h en SSC y SSC suplementado con FeCl3 100 µM mediante centrifugación a

10000 rpm. El sobrenadante fue acidificado con HCl concentrado hasta pH 2,0 y extraído

dos veces con 70 ml de acetato de etilo. Luego el extracto se secó con sulfato de sodio

anhidro, el solvente se evaporó a sequedad y el residuo fue resuspendido en una mezcla

de acetonitrilo al 10 % en agua con ácido trifluoroacetico al 0,1 %.

19.2. HPLC con arreglo de diodos

Los compuestos presentes en el extracto crudo fueron separados mediante HPLC

en fase reversa con una columna C-18. Para la separación de los compuestos se aplicó

un gradiente de acetonitrilo (10-50 %) en agua con acido trifluoroacetico al 0,1 %, para

mantener el pH en 3,0, y un flujo de 1 ml min-1. Se inyectaron 20 µl de muestra. La

detección se realizó a 220 nm y a cada pico se le realizó un barrido espectral desde 210

hasta 360 nm (151).

20. Estadística

Todos los experimentos fueron realizados por triplicado y los datos son presentados

como la media con barras de error que representan el desvío estándar. Los datos fueron

analizados estadísticamente utilizando el test ANOVA de una vía y el test de comparación

a posteriori Student-Neuman-Keuls. Las diferencias en las medias fueron consideradas

estadísticamente significativas a partir de un P < 0,05.

Resultados y Discusión


39

Sección I

Tipificación de aislamientos locales de S. maltophilia recuperados de infecciones asociadas al uso de productos médicos

S. maltophilia es un microorganismo multirresistente, ampliamente distribuido en el

ambiente. Diferentes factores, tales como hospitalización por periodos prolongados,

terapia con antimicrobianos de amplio espectro y utilización de productos médicos han

sido asociados con un mayor riesgo de infección por esta especie.

Debido a que S. maltophilia posee un metabolismo relativamente inerte y a su

resistencia a múltiples antimicrobianos, las técnicas fenotípicas utilizadas en los estudios

epidemiológicos tales como el perfil bioquímico y de sensibilidad a antimicrobianos, han

resultado ser poco efectivas (41). Diferentes técnicas de tipificación molecular como

ribotipificación, electroforesis en campo pulsado (PFGE), amplificación al azar de

secuencias palindrómicas del ADN (RAPD) y amplificación de secuencias consenso

repetitivas intragénicas de enterobacterias (ERIC) entre otras, se utilizaron para estudiar

la epidemiología de esta especie. Numerosos autores encontraron una gran diversidad

genética entre aislamientos de S. maltophilia, esto condujo a pensar que dichos

aislamientos son adquiridos de forma independiente a partir de fuentes ambientales en

lugar de ser transmitidos persona a persona. Sin embargo existen algunos reportes de

pequeños brotes por transmisión cruzada (65, 144).

El objetivo de esta sección fue tipificar aislamientos locales de S. maltophilia

recuperados de infecciones nosocomiales asociadas al uso de productos médicos en la

Sección Bacteriología del Hospital de Clínicas José de San Martin, en el periodo 2004-

2012. Se estudiaron 63 aislamientos locales provenientes de 60 pacientes y se utilizó la

cepa K279a como cepa de referencia.


40

1. Identificación y fenotipificación

Se estudiaron 63 aislamientos recuperados de diferentes fuentes, la mayoría de

origen respiratorio (73 %) dentro de los cuales el 19 % provenían de muestras de lavado

bronqueo-alveolar y 54 % de aspirados traqueales. Los restantes aislamientos fueron

recuperados de muestras de sangre (21 %), orina (3 %), biopsia renal (1,5 %) y fluido

peritoneal (1,5 %). Las manifestaciones clínicas fueron infección urinaria asociada a

catéter, neumonía asociada a ventilación mecánica, y bacteriemia, asociada a catéter o a

infecciones relacionadas con hemodiálisis (Tabla 2).

Tabla 2. Origen de los aislamientos de S. maltophilia

Aislamiento de S. maltophilia Fuente de aislamiento (1)

Sm9 Sm11 Orina (2)

Sm13 Sm17 Sm18 Sm30 Sm33 Sm34 Sm44 Sm58 Sm61

Sm63 Sm68 Sm74 Sm76 Sangre (3)

Sm14 Biopsia Renal (4)

Sm15 Fluido peritoneal (5)

Sm19 Sm20 Sm26 Sm27 Sm28 Sm36 Sm38 Sm39 Sm40

Sm45 Sm47 Sm60bis LBA (6)

Sm10 Sm29 Sm31 Sm32 Sm35 Sm37



Sm57 Sm55 Sm59bis Sm60 Sm59 Sm64


Sm72 Sm70 Sm75 Sm73

Aspirado traqueal (6)


41

(1) Infecciones nosocomiales asociadas al uso de productos médicos: (2) catéter urinario, (3) catéter

vascular, (4) hemodiálisis, (5) diálisis peritoneal y (6) ventilación mecánica (LBA: lavado bronqueo-

alveolar).

La identificación de los aislamientos fue realizada en el servicio de Bacteriología del

Hospital de Clínicas mediante pruebas bioquímicas convencionales y fue confirmada en

nuestro laboratorio mediante el sistema API20NE, una galería conformada por 20 pruebas

bioquímicas que combina 8 pruebas convencionales y 12 pruebas de asimilación de

diferentes sustratos. Esta galería permitió agrupar a los aislamientos en 3 biocódigos, en

base a la capacidad de reducir nitratos y utilizar citrato como única fuente de carbono. El

biocódigo I, que se caracteriza por reducir el nitrato y utilizar citrato, fue el más frecuente e

incluyó al 52 % (33/64) de los aislamientos, en este grupo se encuentra la cepa de

referencia K279a. El biocódigo II, caracterizado por no reducir nitrato y utilizar citrato,

incluyó al 42 % (27/64) de los aislamientos. El biocódigo III, caracterizado por reducir

nitrato y no utilizar citrato, fue el grupo minoritario, compuesto por el 6 % (4/64) de los

aislamientos (Tabla 3 y Figura 7).

Figura 7. Porcentajes de distribución de los aislamientos de S. maltophilia según el biocódigo de

API20NE al que pertenecen.

52% 42%

6%

Biocódigo I

Biocódigo II

Biocódigo III


42

Tabla 3. Distribución de los aislamientos de S. maltophilia según el biocódigo de API20NE

Biocódigo API20NE Aislamiento de S. maltophilia

Biocodigo I

Reducción de nitrato y utilización de citrato

positivas

K279a, Sm9, Sm13, Sm14, Sm15, Sm17,

Sm18, Sm26, Sm27, Sm29, Sm31, Sm32,

Sm33, Sm39, Sm41, Sm44, Sm45, Sm47,

Sm48, Sm49, Sm50, Sm53, Sm55, Sm56,

Sm57, Sm58, Sm62, Sm64, Sm66, Sm67,

Sm69, Sm70, Sm74.

Biocodigo II

Reducción de nitrato negativa y utilización de

citrato positiva

Sm10, Sm11, Sm20, Sm28, Sm30, Sm34,

Sm35, Sm36, Sm37, Sm38, Sm42, Sm43,

Sm46, Sm51, Sm52, Sm59, Sm59bis,

Sm60, Sm60bis, Sm61, Sm63, Sm65,

Sm68, Sm71, Sm72, Sm75, Sm76

Biocodigo III

Reducción de nitrato positiva y utilización de

citrato negativa

Sm19, Sm40, Sm54, Sm73

2. Tipificación por métodos genotípicos

La genotipificación se realizó mediante dos técnicas basadas en la reacción en

cadena de la polimerasa (PCR), conocidas como Rep. Estas técnicas utilizan

oligonucleótidos cebadores que hibridan con secuencias del ADN repetitivas (secuencias

Rep) que se encuentran distribuidas en el cromosoma bacteriano. Por su elevado poder

discriminatorio y su simplicidad, permiten trabajar con un gran número de muestras (114).

Las técnicas Rep-PCR que se utilizaron en este estudio fueron ERIC-PCR (secuencias

consenso repetitivas intragénicas de enterobacterias) y REP-PCR (secuencias repetitivas

palindrómicas extragénicas) (58).


43

2.1. ERIC-PCR

Con la técnica de tipificación molecular ERIC-PCR se obtuvieron patrones de

bandas heterogéneos que presentaron entre 6 y 12 bandas, en su mayoría, menores de 2

Kb. Para comparar la relación entre los patrones de bandas obtenidos se realizó un

análisis de “clusters” mediante la utilización del algoritmo UPGMA (Unweighted Pair

Group Method with Arithmetic Averages). En el dendograma obtenido se pudo observar

que la mayoría de los aislamientos mostraron patrones de bandas únicos (Figura 8),

acorde con la gran diversidad intraespecie descripta por numerosos grupos de

investigaciçon (23, 68). Sin embargo, se obtuvieron algunos patrones idénticos a partir de

pacientes con infecciones respiratorias, en los cuales la posición de todas las bandas

coincide, sin importar la intensidad. Entre ellos, los de los aislamientos Sm41 y Sm45

procedentes de diferentes pacientes que estuvieron internados en la misma cama del

Hospital de Clínicas José de San Martin, con un mes de diferencia en el año 2008.

También se observaron patrones idénticos entre los aislamientos Sm56 y Sm57

recuperados de una paciente de 2 meses, aislados con 9 días de diferencia en octubre de

2009. Por último, 4 aislamientos recuperados en el periodo de una semana en noviembre

de 2009 presentaron perfiles de bandas idénticos por esta técnica (Figura 9). Dichos

aislamientos fueron: Sm59 y Sm59bis, recuperados de un paciente masculino de 92 años

con 4 días de diferencia, y los aislamientos Sm60 y Sm60bis, provenientes de un paciente

de sexo femenino de 72, recuperados con 2 días de diferencia.


44

Figura 8. Dendograma de similitud de los perfiles de bandas obtenidos por ERIC-PCR de algunos

aislamientos locales de S. maltophilia


45

Figura 9. Dendograma de similitud de los perfiles de bandas obtenidos por ERIC-PCR de los

aislamientos locales de S. maltophilia no diferenciables.

2.2. REP-PCR

Los productos de amplificación obtenidos mediante REP-PCR también originaron

patrones de bandas heterogéneos para la mayoría de los aislamientos analizados.

Nuevamente, se observaron patrones idénticos entre los aislamientos Sm41 y Sm45,

entre los aislamientos Sm56 y Sm 57 y entre los aislamientos Sm59, Sm59bis, Sm60 y

Sm60bis. Estos aislamientos, que habían mostrado perfiles idénticos por ERIC-PCR

tampoco pudieron ser diferenciados por esta técnica (Figura 10).


46

Figura 10. Dendograma de similitud de los perfiles de bandas obtenidos por REP-PCR de los

aislamientos locales de S. maltophilia no diferenciables.

3. Discusión

El sistema API20NE resultó de utilidad para confirmar la identificación de los

aislamientos de S. maltophilia. A pesar de estar conformado por 20 pruebas bioquímicas

fue de escasa utilidad para la tipificación de los mismos ya que solo permitió agruparlos

en 3 biocódigos, esto concuerda con la característica de esta especie de poseer un

metabolismo relativamente inerte (41).

Para la elección de un método de tipificación molecular hay que tener en cuenta el

poder discriminatorio del mismo, la reproducibilidad, la complejidad y el costo. El método

con mayor poder discriminatorio y reproducibilidad es PFGE, sin embargo, su complejidad

y el alto costo del equipamiento necesario, lo transforman en un método poco accesible.

Por el contario, los métodos de PCR son relativamente fáciles de implementar, arrojan los

resultados en el mismo día y presentan alta reproducibilidad (133). Silbert et al (133),

evaluaron comparativamente las técnicas PFGE, ribotipificación y ERIC-PCR para tipificar

20 aislamientos de S. maltophilia. En este estudio, PFGE y ERIC-PCR mostraron un

poder discriminatorio elevado (D = 0,90) mientras que la ribotipificación presentó un poder

discriminatorio menor (D = 0,82).

En este estudio la tipificación molecular se realizó con dos técnicas de PCR: ERIC y

REP. Dichas técnicas revelaron una gran heterogeneidad genética entre los aislamientos

locales de S. maltophilia, sugiriendo que la mayoría de los episodios nosocomiales fueron

independientes. La gran diversidad de perfiles observados concuerda con estudios

previos (23, 68). Se ha sugerido que dicha diversidad se debe a que los aislamientos

provienen de la microbiota habitual del paciente y se seleccionan por una terapia con

antimicrobianos (23).

Los aislamientos Sm41 y Sm45 presentaron perfiles que no pudieron ser

diferenciados con las técnicas utilizadas. Del análisis de los datos epidemiológicos surgió

que los mismos fueron recuperados de diferentes pacientes que habían sido internados

en la misma cama con un mes de diferencia. Este hallazgo estaría en concordancia con el


47

estudio de Garcia de Viedma et al. (65) donde encontraron aislamientos provenientes de

neonatos con perfiles que presentaban una alta homología. Los resultados obtenidos por

ERIC-PCR fueron confirmados mediante PFGE, y basados en datos epidemiológicos los

autores atribuyeron la generación del brote a una transmisión horizontal. Por otra parte,

Caylan et al (23) detectaron tres pequeños brotes en un hospital universitario. En dicho

estudio los autores detectaron el mismo clon por periodos de 10-12 meses, lo que

atribuyeron a una posible capacidad de S. maltophilia de sobrevivir en el ambiente

hospitalario por periodos prolongados, y sugirieron que los brotes pudieron haber sido

generados por transmisión cruzada.

También se observaron patrones de bandas idénticos entre los aislamientos Sm56 y

Sm57 recuperados con 9 días de diferencia de un paciente de sexo femenino de 2 meses,

lo que significaría una infección no resuelta. Se ha reportado que el hallazgo de patrones

idénticos en esta especie se encuentra principalmente relacionado con aislamientos

sucesivos de un mismo paciente (65).

Los aislamientos Sm59 y Sm59bis de un paciente, y Sm60 y Sm60bis de otro

paciente fueron recuperados en el periodo de una semana y presentaron perfiles

idénticos. Sin embargo, por el carácter retrospectivo del estudio, no contamos con

mayores datos que los relacionen ya que no fueron pacientes de una misma sala ni existe

evidencia de transmisión por parte del personal de salud.

Las técnicas de ERIC-PCR y REP-PCR que son rápidas y sencillas, generaron

perfiles reproducibles y altamente discriminatorios. Estas técnicas, junto con la

información epidemiológica, serían útiles para la tipificación de aislamientos de S.

maltophilia (68). Sin embargo, en casos de aislamientos con perfiles indistinguibles se

debería utilizar la técnica de PFGE, que posee un mayor poder discriminatorio.


48

Sección II

Producción de potenciales factores de virulencia en aislamientos

locales de S. maltophilia

En S. maltophilia se conoce poco acerca de sus factores de virulencia. La dificultad

de diferenciar entre colonización e infección ha llevado a considerar a esta especie como

poco patogénica (41). Enzimas extracelulares tales como DNasa, fibrinolisina, lipasas y

proteasas, han sido relacionadas con su patogenicidad (18). Windhorst et al. (150)

caracterizaron una serina proteasa alcalina denominada StmPr1 que degrada proteínas

del suero y tejido conectivo.

Un factor de virulencia que contribuye a la patogenicidad bacteriana es la capacidad

de formar biofilms, debido a que las bacterias que crecen formando biofilms son más

resistentes a la acción de sustancias antibacterianas y al ataque por células fagocíticas.

Se ha descripto que S. maltophilia es capaz de formar biofilms en superficies bióticas y

abióticas (97).

El objetivo de esta sección fue detectar la presencia de los potenciales factores de

virulencia de S. maltophilia en aislamientos locales recuperados de infecciones asociadas

al uso de productos médicos.

1. Formación de biofilms de aislamientos locales

Para evaluar la capacidad de formar biofilms de los aislamientos locales, se utilizó el

ensayo cuantitativo en microplacas de poliestireno (PS). Los cultivos en caldo TSB se

incubaron en las microplacas a 35 °C sin agitación durante 48 h. El crecimiento se evaluó

mediante la determinación de la DO546 del cultivo, los aislamientos presentan lecturas de

DO546 entre 0,79 y 1,38 (Figura 11 a). La biomasa del biofilm (células adheridas y matriz)

se cuantificó mediante la tinción con cristal violeta (CV) y elución con etanol. Los biofilms

fueron clasificados en base al criterio de Stepanovic et al (137) que considera un valor de

corte (DOc) correspondiente al promedio de las DO546 de CV del control sin inocular más


49

3 desvíos estándar, y divide a los aislamientos en grupos: no productores de biofilms

(DO546 < DOc), productores de biofilms débiles (DOc < DO546 ≤ 2 DOc), moderados (2

DOc <DO546≤ 4 DOc) y fuertes (DO546 > 4 DOc).

La mayoría de los aislamientos locales y K279a produjeron biofilms fuertes, con

valores de DO546 de CV entre 0,80 y 1,80. En cambio, el aislamiento Sm61 se consideró

no productor de biofilms, siendo el único de nuestra colección que presentó esta

característica (Figura 11 b, Tabla 4).

K279a

Sm13Sm61

Sm54Sm10

Sm55Sm

58

Sm72Sm9

Sm41

Sm20Sm46

0.0

0.5

1.0

1.5

Cre

cim

ient

o (D

O54

6)

K279a

Sm13Sm61

Sm54

Sm10Sm55

Sm58

Sm72Sm9

Sm41Sm20

Sm460.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Bio

mas

a (D

O54

6de

CV

)

a

b

Figura 11. Crecimiento y formación de biofilms en microplacas de PS de aislamientos de S.

maltophilia cultivados en TSB durante 48 h. a) crecimiento del cultivo b) Biomasa del biofilm

evaluada por tinción con CV. Los resultados corresponden a algunos aislamientos de la colección


50

con diferentes capacidades de formar biofilms y representan la media ± la desviación estándar

correspondientes a un experimento representativo.

2. Presencia del gen codificante de la proteasa StmPr1, actividad de

proteasa y lipasa

La presencia del gen de la proteasa StmPr1 se estudió mediante la reacción en

cadena de la polimerasa con oligonucleótidos que amplifican un fragmento interno de 570

pb. Los mismos se diseñaron en este estudio en base al genoma de la cepa K279a y de

otros genomas de S. maltophilia publicados (D457, JV3, R551-3) a fin de disminuir la

posibilidad de que eventuales polimorfismos influyan negativamente en la amplificación. El

producto de reacción esperado fue detectado en 52/63 aislamientos locales (82,53 %) y

en la cepa K279a (Tabla 4). En 11 aislamientos, entre los que se encuentran Sm10 y

Sm61, no se detectó producto de amplificación. No obstante, todos los aislamientos

fueron proteolíticos, independientemente de la ausencia del producto de amplificación.

Los valores de los halos de proteólisis producidos fueron de entre 14 y 21 mm. En base al

tamaño del halo los aislamientos se clasificaron como: (+) baja actividad, con halos de 14-

16 mm; (++) actividad intermedia, con halos de > 16 -18 mm, y (+++) alta actividad

proteolítica, con halos de > 18-21 mm. La cepa K279a y 33/63 aislamientos locales (52.38

%) presentaron alta actividad proteolítica (Tabla 4).

Por otra parte, el análisis de la actividad de lipasa reveló que dicha enzima está

presente en todos los aislamientos de S. maltophilia estudiados (Tabla 4).

3. Producción de sideróforos

La producción de sideróforos fue estudiada mediante el ensayo cromo azurol S

(CAS) en placa (8, 128). La técnica de CAS se basa en que el colorante cromo azurol S

incorporado en el medio agarizado forma complejos estables con el hierro, produciendo

un color azul-verde. Cuando un quelante de hierro, como el sideróforo, está presente

remueve el hierro del complejo, el medio cambia de color y se produce un halo naranja.

La utilización de esta técnica requirió su previa optimización. Primero, en lugar de

utilizar el método descripto por Schwyn y Neilands (128) se utilizó el método modificado

por Armstrong et al. (8), que utiliza el medio mínimo Stainer-Scholte (SS) ya que S.


51

maltophilia no desarrolla en el medio originalmente propuesto. Aun así los aislamientos

presentaron un crecimiento pobre que fue promovido por el agregado de Casamino ácidos

0,1 % (P/V) (SSC).

Se estudiaron un total de 63 aislamientos locales y la cepa de referencia K279a en

placas conteniendo el medio de cultivo SSC con el agregado del reactivo CAS y agar

(SSC-CAS). En estas condiciones solo 10 aislamientos locales fueron débilmente

positivos, con halos naranja alrededor de la colonia menor a 4,0 mm, mientras que la cepa

control Acinetobacter baumannii ATCC19606, produjo un halo de 11.0 mm (Figura 12 a,

Tabla 4). Como el componente Casamino ácidos agregado es una fuente de hierro, esos

resultados negativos podrían reflejar la presencia de niveles de hierro suficientes para

inhibir la síntesis de sideróforos. Por este motivo se agregó 2,2'-dipiridilo (Dip) al medio

para alcanzar la condición de limitación de hierro y estimular la producción de sideróforos.

En el medio SSC-CAS con el agregado de Dip 100 µM (SSC-CAS-Dip) los 63

aislamientos clínicos y la cepa de referencia K279a produjeron sideróforos (Figura 12 b).

Los aislamientos fueron divididos en tres grupos en base al diámetro del halo, lo que

indica diferencias en la producción de sideróforos (Tabla 4). La cepa K279a y 10/63

aislamientos locales (15,87 %) fueron fuertes productores de sideróforos. Por otra parte,

ninguno de los aislamientos produjo sideróforos cuando se agregó FeCl3 100 µM al medio

SSC-CAS (Figura. 12 c)

Figura 12. Producción de sideróforos mediante el ensayo agar CAS en diferentes medios de

cultivo a) SSC-CAS, b) SSC-CAS suplementado con Dip 100 µM, y c) SSC-CAS suplementado con


52

FeCl3 100 µM. 1: Acinetobacter baumannii ATCC19606; 2: Sm13; 3: Sm11; 4: Sm64; 5: Sm30; 6:

Sm29; 7: Sm40; 8: K279a; 9: Sm9.

4. Resistencia al estrés oxidativo

La sensibilidad al peróxido de hidrogeno de los aislamientos locales de S.

maltophilia y de K279a se determinó mediante el ensayo de difusión en placa. Todos los

aislamientos estudiados presentaron halos de inhibición de 14 a 22 mm. En base al

tamaño del halo de inhibición los aislamientos se clasificaron como: (+++) de alta

resistencia, con halos de 14-16 mm; (++) de resistencia intermedia, con halos > 16-18

mm, y (+) de baja resistencia, con halos > 18 mm (Tabla 4). La cepa K279a y 33/63

aislamientos locales (52,38 %) presentaron alta resistencia al estrés oxidativo (Tabla 4).

5. Presencia del gen narG, codificante de una nitrato reductasa y su relación con la utilización nitrato

La presencia del gen narG codificante de una nitrato reductasa asociada al

crecimiento en microaerofilia, se estudió mediante PCR con oligonucleótidos que

amplifican un fragmento interno de 623 pb, diseñados en este estudio siguiendo la misma

estrategia que se describió en el ítem 2. El producto de la PCR esperado fue detectado en

38/63 de los aislamientos locales (60,31 %) y en la cepa K279a.

Por otra parte, se estudió la capacidad de reducir el nitrato a nitrito y se observó

correlación con la presencia del gen narG en la mayoría de los aislamientos. Sin embargo,

en los aislamientos Sm10 y Sm11 se obtuvo el producto de amplificación del gen narG

pero los mismos no presentaron la capacidad de reducir el nitrato a nitrito.

Resulta interesante remarcar que Sm61 que no posee la capacidad de reducir

nitrato y no presentó producto de amplificación en la reacción en cadena de la polimerasa,

tampoco forma biofilms


53

Tabla 4. Producción de potenciales factores de virulencia de S. maltophilia

Amplificación por PCR 3

Aislamiento Actividad Lipolítica 1

Actividad Proteolítica 2 gen stmPr1 gen

narG Reducción de Nitrato 4

Formación de

Biofilm 5

Resistencia al estrés

oxidativo 6

Producción de

Sideróforos 7

K279a + +++ + + + +++ +++ +++ Sm9 + ++ + + + +++ ++ ++ Sm10 + + - + - +++ + + Sm11 + + + + - +++ + + Sm13 + +++ + + + +++ +++ +++ Sm14 + +++ + + + +++ ++ ++ Sm15 + + + + + +++ ++ + Sm17 + ++ - + + +++ ++ ++ Sm18 + ++ - + + +++ ++ + Sm19 + +++ + + + +++ ++ + Sm20 + ++ - - - +++ +++ ++ Sm26 + +++ + + + +++ ++ ++ Sm27 + + + + + +++ +++ +++ Sm28 + + + - - +++ + ++ Sm29 + +++ + + + +++ + ++ Sm30 + +++ + - - +++ +++ +++ Sm31 + +++ + + + +++ + ++ Sm32 + +++ + + + +++ + ++ Sm33 + +++ + + + +++ ++ ++ Sm34 + +++ + - - +++ ++ + Sm35 + ++ + - - +++ ++ + Sm36 + ++ + - - +++ ++ ++ Sm37 + + + - - +++ +++ ++ Sm38 + +++ + - - +++ +++ ++ Sm39 + +++ + + + +++ +++ ++ Sm40 + ++ + + + +++ +++ +++ Sm41 + ++ + + + +++ ++ +++ Sm42 + ++ + - - +++ ++ ++ Sm43 + ++ - - - +++ ++ ++ Sm44 + +++ + + + +++ ++ + Sm45 + ++ + + + +++ ++ ++ Sm46 + +++ + - - +++ ++ + Sm47 + + - + + +++ +++ + Sm48 + ++ + + + +++ +++ + Sm49 + ++ - + + +++ +++ ++ Sm50 + +++ + + + +++ + ++ Sm51 + +++ + - - +++ ++ ++ Sm52 + ++ + - - +++ ++ + Sm53 + +++ + + + +++ ++ ++ Sm54 + +++ + + + +++ + ++ Sm55 + ++ + + + +++ ++ + Sm56 + +++ + + + +++ +++ ++ Sm57 + +++ + + + +++ ++ ++ Sm58 + +++ + + + +++ + ++ Sm59 + +++ + - - +++ ++ ++

Sm59bis + ++ + - - +++ ++ ++ Sm60 + ++ + - - +++ ++ ++

Sm60bis + ++ + - - +++ ++ ++ Sm61 + +++ - - - - +++ +++ Sm62 + +++ + + + +++ ++ +++ Sm63 + ++ + - - +++ ++ +++ Sm64 + ++ + + + +++ ++ +++ Sm65 + ++ + - - +++ ++ ++ Sm66 + +++ + + + +++ + ++ Sm67 + +++ + + + +++ ++ + Sm68 + +++ + - - +++ ++ ++ Sm69 + +++ + + + +++ +++ ++ Sm70 + +++ + + + +++ +++ + Sm71 + +++ - - - +++ ++ + Sm72 + +++ - - - +++ ++ + Sm73 + +++ + + + +++ ++ + Sm74 + ++ - + + +++ + ++ Sm75 + ++ + - - +++ ++ ++ Sm76 + ++ + - - +++ +++ +


54

1 Evaluada en placas con agar base tibutirina suplementado con glicerol tributirato 1 %.

2 Evaluada en placas de agar nutritivo suplementado con leche descremada: (+) baja actividad, con

halos de 14-16 mm; (++) actividad intermedia, con halos de > 16 -18 mm, y (+++) alta actividad

proteolítica, con halos de > 18-21 mm.

3 (+) amplificación por PCR del fragmento esperado del gen correspondiente (-) ausencia de

amplificación.

4 Evaluado en caldo nitrato y revelado con el reactivo de Griess.

5 Ensayo en microplacas de PS. La biomasa del biofilm se cuantificó mediante la tinción con CV.

Los biofilms fueron clasificados en base al criterio de Stepanovic et al (137) que divide a los

aislamientos en grupos: (-) no productores de biofilms, (+) productores de biofilms débiles, (++)

moderados, y (+++) fuertes.

6 Evaluada mediante la determinación de los halos de inhibición generados por peróxido de

hidrogeno en el ensayo de difusión en placa (73). Los aislamientos se clasificaron como: (+++) de

alta resistencia, con halos de 14-16 mm; (++) de resistencia intermedia, con halos > 16-18 mm, y

(+) de baja resistencia, con halos > 18 mm.

7 Evaluada en placas de agar SSC-CAS suplementadas con Dip 100 µM. Los aislamientos se

clasificaron como: (+) productores débiles, con halos de 4,0-5,9 mm; (++) moderados, con halos de

6,0-8,9 mm, y (+++) productores fuertes de sideróforos, con halos > 9 mm.

6. Virulencia en el modelo de infección de Galleria mellonella

Con el objetivo de evaluar la virulencia de algunos aislamientos de nuestra colección

se utilizó el modelo de infección del lepidóptero Galleria mellonella, cuyo sistema inmune

comparte homología estructural y funcional con el de los mamíferos, mediada por

péptidos con actividad antimicrobiana y células fagocíticas (80). Este modelo presenta la

ventaja de poder utilizar un gran número de individuos por experimento que además son

fáciles de manipular.

Como primer paso se determinó la dosis infectiva que permitiera comparar la

virulencia de diferentes aislamientos de S. maltophilia. Para este propósito se utilizó la

cepa K279a y se infectaron grupos de 11 individuos con 104, 105 y 106 ufc/larva. Al utilizar

la dosis de 104 ufc/larva no se observó efecto letal en ninguna de las larvas a las 96 h,

mientras que la dosis de 106 ufc/larva resultó altamente letal y produjo la muerte del 90 %

de las larvas dentro de las primeras 24 h post infección (Figura 13). En cambio, con dosis


55

de 105 ufc/larva, K279a produjo la muerte del 20 % de las larvas a las 48 h, y del 40 % a

las 96h. En consecuencia, se eligió esta dosis para realizar los ensayos de virulencia.

0 20 40 60 80 1000

20

40

60

80

100K279a 104ufc/larvaK279a 105ufc/larvaK279a 106ufc/larva

Tiempo (h)

Sup

ervi

venc

ia (

%)

Figura 13. Ensayo de infección en larvas de G. mellonella. Luego de la inyección de 11 larvas por

grupo con una dosis cada uno se registró diariamente el número de individuos sobrevivientes y se

graficaron las curvas de Kaplan-Mayer. El grupo control de larvas inyectadas con solución

fisiológica no presentó individuos muertos (datos no graficados). Los datos corresponden a un

experimento representativo.

Los estudios realizados con los aislamientos locales Sm10, Sm13 y Sm61, con

dosis de 105 ufc/larva, evidenciaron tres niveles de virulencia significativamente diferentes

(P < 0,01). Sm10 no mostró efecto letal ya que a las 96 h todas las larvas inoculadas

continuaron con vida. Sm13 resultó letal para un 10 % de la población a las 24 h,

porcentaje que aumentó al 50 % a las 96 h. En cambio, Sm61 fue significativamente (P <

0,01) más virulenta ya que produjo un 30 % de muerte a las 24 h y alcanzó el 70% de

letalidad a las 96 h (figura 14).


56

0 20 40 60 80 10020

40

60

80

100Sm10Sm13K279aSm61

Tiempo (h)

Sup

ervi

venc

ia (

%)

Figura 14. Ensayo de infección en larvas de G mellonella. Luego de la inyección de 10 a 13 larvas

por cepa con la dosis de 105 ufc/larva se registró diariamente el número de individuos

sobrevivientes y se graficaron las curvas de Kaplan-Mayer. El grupo control de larvas inyectadas

con solución fisiológica no presentó individuos muertos (datos no graficados). Los datos

corresponden a un experimento representativo. El análisis estadístico se realizó con el método de

Log-rank.

7. Discusión

El uso cada vez más frecuente de productos médicos ha llevado a un significativo

aumento de las infecciones asociadas a los mismos. En esta sección se investigó la

diversidad de los aislamientos locales de S. maltophilia recuperados de infecciones

asociadas a asistencia respiratoria, catéteres venosos, para diálisis y urinarios, con

respecto a la producción de potenciales factores de virulencia.

La capacidad de formar biofilms sobre superficies abióticas es un factor que

favorece la colonización de productos médicos (Denton & Kerr, 1998). Dicha capacidad es

además un importante factor de virulencia bacteriano ya que facilita la persistencia en el

huésped, la evasión de la respuesta inmune y la sobrevivencia bacteriana frente a altas

concentraciones de antimicrobianos. Todos de los aislamientos locales de S. maltophilia,

salvo Sm61 que no forma biofilms, produjeron biofilms fuertes, al igual que la cepa K279a,

en el ensayo en microplacas de PS. En cambio, Pompilio et al. detectaron biofilms fuertes

y débiles en 47 aislamientos clínicos de S. maltophilia no provenientes de enfermos

fibroquísticos, mientras que los aislamientos de pacientes fibroquísticos produjeron en


57

general biofilms moderados (121). Cabe destacar que en un trabajo anterior de nuestro

grupo se determinó que el aislamiento Sm13 posee la capacidad de formar biofilms en

catéteres uretrales de goma, silicona y PVC (117).

La producción de proteasa juega un papel significativo en la patogénesis bacteriana

ya que participa en la invasión y el daño tisular. Nicoletti et al. (110) determinaron la

presencia de los genes stmPr1 y stmPr2, que codifican la principal proteasa de S.

maltophilia y otra proteasa menor, respectivamente, en 43 aislamientos clínicos

provenientes de pacientes con fibrosis quística. Además, diseñaron cebadores para

detectar 2 alelos de stmPr1, unos en base al genoma de K279a y otros, en base al gen

descripto por Windhorst et al. (150) . La mayoría de los aislamientos presentó el alelo

correspondiente a K279a, mientras que en 6 aislamientos no detectaron ninguno de los

alelos. Por otra parte, detectaron la presencia de stmPr2 en todos los aislamientos (110).

Mediante la utilización del modelo de virulencia de G. mellonella estos autores

encontraron que la proteasa StmPr1 es un factor de virulencia relevante en los

aislamientos clínicos analizados.

Los resultados presentados muestran que utilizando los cebadores diseñados en

este estudio se detectó la presencia del gen stmPr1 en el 82,53 % de los aislamientos

locales, sin embargo, todos los aislamientos presentaron actividad proteolítica. Dicha

actividad, podría deberse a la presencia de 1 alelo de stmPr1 no detectado o a la

presencia de la proteasa StmPr2. Estos resultados están en concordancia con los de

Nicoletti et al. y difieren con lo observado en 11 aislamientos provenientes de pacientes

fibroquísticos por Di Bonaventura et al. quienes solo detectaron el gen stmPr1 en 2

aislamientos y sugirieron que el mismo no está ampliamente distribuido en esta especie

(44).

Por otra parte, la producción de lipasa podría contribuir a la virulencia de S.

maltophilia mediante la degradación de tejidos ricos en lípidos como los presentes en

pulmón, o desencadenando una intensa respuesta inflamatoria (143). Todos los

aislamientos locales y K279a presentaron actividad lipolítica.

Otro factor de virulencia son los sideróforos, los cuales facilitan la adquisición de

hierro en el huésped. El ensayo universal en placa CAS agar es un método ampliamente

utilizado para detectar la producción de sideróforos. Sin embargo, en S. maltophilia

algunos autores no detectaron sideróforos por este ensayo mientras que otros


58

describieron halos muy pequeños (3-5 mm) (52, 105). Con el objetivo de estudiar la

producción de sideróforos en los aislamientos locales se optimizó su detección mediante

modificaciones en la composición del medio. Los resultados muestran que la producción

de sideróforos de S. maltophilia requiere el agregado de casamino ácidos y Dip. La

necesidad del agregado de quelantes fue también descripta por Chatterjee y Sonti

quienes reportaron que Xanthomonas oryzae pv. oryzae no produce sideróforos en el

medio peptona-sucrosa agar-CAS pero el agregado de Dip al medio permite su detección

(35).

La resistencia al estrés oxidativo es una característica importante para la

patogénesis bacteriana ya que durante el proceso de infección las bacterias se enfrentan

a especies reactivas del oxigeno producidas por las células fagocíticas. Nuestros

aislamientos mostraron diferentes niveles de resistencia al estrés oxidativo in vitro. La

cepa K279a y el 52,38 % de los aislamientos locales, entre los que figuran Sm13 y Sm61,

presentaron alta resistencia al estrés oxidativo, mientras, que Sm10 fue uno de los menos

resistente (Tabla 4).

La presencia del gen narG codificante de una nitrato reductasa asociada al

crecimiento en microaerofilia, fue detectada en el 60,31 % de los aislamientos estudiados

y mostró correlación con la capacidad de reducir el nitrato a nitrito. Sin embargo, en los

aislamientos Sm10 y Sm11 se obtuvo el producto de amplificación del gen narG pero los

mismos no presentaron la capacidad de reducir el nitrato, lo que sugiere la presencia de

una variante no funcional del gen. La presencia del gen narG y la capacidad de reducir

nitrato, relacionadas con el crecimiento en microaerofilia, detectadas en la mayoría de los

aislamientos de S. maltophilia facilitaría el crecimiento en biofilms, y de esta forma

incrementaría la patogenicidad. Por ejemplo, Sm61 no presentó estas características y no

formó biofilms en el ensayo en microplacas. Sin embargo, 24 aislamientos, en los que no

se obtuvo el producto de amplificación del gen narG ni presentaron la capacidad de

reducir el nitrato, formaron biofilms fuertes en microplacas. Esto podría deberse a la

multiplicidad de factores involucrados en dicha formación.

Por último, se puso a punto el modelo de infección de G. mellonella que permitió

comparar la virulencia de algunos aislamientos locales y K279a. Se seleccionaron los

aislamientos Sm13, Sm10 y Sm61 en función de sus potenciales factores de virulencia.

Sm13, al igual que Sm39, Sm56, Sm69 y Sm70, presentó junto con K279a la capacidad


59

de formar biofilms, alta actividad proteolítica, capacidad de reducir nitratos y alta

resistencia al estrés oxidativo, además de haberse detectado la presencia de los genes

stmPr1 y narG. El aislamiento Sm10 formó biofilms, pero presentó baja actividad

proteolítica, baja resistencia al estrés oxidativo, no presentó la capacidad de reducir el

nitrato, y no se detectó la presencia de los genes stmPr1 y narG. Por último, Sm61 es el

único aislamiento que no formó biofilms, además, no presentó la capacidad de reducir el

nitrato, y no se detectó la presencia de los genes stmPr1 y narG, sin embargo, presentó

alta actividad proteolítica y alta resistencia al estrés oxidativo.

Sm13 y la cepa K279a fueron virulentas en el modelo de infección de G. mellonella,

en concordancia con la detección de los potenciales factores de virulencia mencionados.

En cambio, Sm10 no mostró efecto letal, lo cual podría estar relacionado a su baja

actividad proteolítica y baja resistencia al estrés oxidativo. Por último, Sm61 presentó el

mayor efecto letal a pesar de no formar biofilms y no haberse detectado el gen stmPr1,

gen relacionado con la virulencia en este modelo (110). Esto podría deberse su alta

resistencia al estrés oxidativo, lo cual podría ser importante en este modelo debido a que

G. mellonella tiene un sistema inmune, mediado por células fagocíticas.


60

Sección III

Sistema de captación de hierro de alta afinidad de S. maltophilia

K279a y su posible regulación por el sistema Fur

El hierro es un nutriente esencial para los microorganismos pero, a pesar de ser un

compuesto abundante en la naturaleza, su biodisponibilidad es limitada. En presencia de

oxigeno es oxidado a Fe3+ y precipita en forma de hidróxidos insolubles (142). La baja

disponibilidad de hierro libre dificulta el crecimiento de los microorganismos, por lo tanto

éstos han desarrollado diferentes estrategias para captarlo del medio. Una de ellas es el

sistema que se basa en sintetizar y secretar sideróforos, compuestos de bajo peso

molecular, que quelan hierro con alta afinidad. Una vez formado el complejo hierro-

sideróforo es reconocido por un receptor específico y es transportado al interior celular

(5).

El hierro libre actúa como catalizador en las reacciones de Fenton y Haber-Weiss

(142) que generan especies reactivas del oxigeno (ERO) tales como radicales hidroxilo

(OH•), aniones superoxido (O2

-) y peróxidos (RO2). Dichos compuestos causan daños a

los componentes celulares, por eso la homeostasis del hierro debe ser finamente

controlada. La producción de sideróforos y la expresión de los componentes involucrados

en la captación del complejo hierro-sideróforo están reguladas negativamente a través del

sistema Fur (ferric uptake regulator) en muchas especies bacterianas (5). En S.

maltophilia no hay estudios sobre el sistema Fur ni sobre los genes que regula.

El objetivo de esta sección fue obtener mutantes Fur de S. maltophilia, caracterizar

las OMPs reguladas por la concentración de hierro, y determinar la naturaleza química de

los sideróforos sintetizados por esta especie bacteriana.

1. Aislamiento de mutantes Fur

Como paso inicial se analizó el genoma de S. maltophilia K279a (32) y se encontró

un gen fur putativo (Smlt1986), que codifica una proteína de 135 aminoácidos. El

alineamiento múltiple de la secuencia de nucleótidos del gen fur de K279a reveló que


61

presenta un 86 % de identidad con el de Xanthomonas campestris pv campestris ATCC

33913 (XCC1470) (37) y un 76% de identidad con el de Pseudomonas aeruginosa PAO1

(PA4764) (152).

Las mutantes espontáneas Fur fueron asiladas mediante la técnica de selección con

manganeso (69). Se seleccionaron un total de 51 clones independientes de K279a luego

de 72 h de incubación en el medio agar LB suplementado con manganeso. Dichos clones

resistentes al manganeso fueron cultivados en el medio agar CAS suplementado con

hierro para identificar mutantes Fur, debido a que dichas mutantes producen sideróforos

constitutivamente. En estas condiciones 2 clones, denominados Fur42 y Fur60, mostraron

el halo naranja alrededor de la colonia indicativo de la producción de sideróforos. Por el

contrario la cepa salvaje K279a no presentó dicho halo en presencia de hierro (Figura 15).

Para confirmar la presencia de mutaciones, el gen fur completo y un fragmento de

100 pb de la región rio arriba del codón de inicio de la transcripción fueron amplificados

por PCR utilizando los cebadores diseñados en base al genoma de K279a (Tabla 1) y

posteriormente secuenciados. Tanto el clon Fur42 como el Fur60 presentaron una

mutación puntual. Fur42 presentó una mutación que causa la sustitución de un único

aminoácido (Asp�Gly en la posición 5) y Fur60 presentó una mutación en la secuencia -

10 de la región promotora putativa (T�C).

Figura 15. El ensayo universal agar CAS a) SSC-CAS suplementado con FeCl3 20 µM y b) SSC-

CAS suplementado con Dip 100 µM. El halo naranja es indicativo de la producción de sideróforos.


62

La ausencia de un gen fur funcional causa la producción constitutiva de sideróforos, mientras que

la cepa salvaje solo produce sideróforos bajo condiciones de limitación de hierro.

2. Caracterización de proteínas de membrana externa reguladas por

hierro en S. maltophilia K279a

2.1. Análisis de los perfiles de OMPs

Se estudiaron los perfiles de fracciones enriquecidas en proteínas de membrana

externa de la cepa K279a y de su mutante Fur60 en presencia y ausencia del quelante de

hierro 2-2´ dipiridilo (Dip) mediante SDS-PAGE. Los perfiles de OMPs de K279a

presentaron una variación en el patrón de bandas en la región de 70-90 kDa cuando las

bacterias crecieron en condiciones limitantes de hierro. Se observó un aumento de la

expresión de la denominada Banda 1 (de mayor peso molecular) y la aparición de la

Banda 2. Este perfil fue similar al de la mutante Fur60 cultivada tanto en TSB como en

TSB-Dip (Figura 16).

Figura 16. Perfiles de fracciones enriquecidas en OMPs. 1: K279a cultivada en TSB; 2: K279a

cultivada en TSB-Dip; 3: Fur60 cultivada en TSB; 4: Fur60 cultivada en TSB-Dip y 5: patrón de

peso molecular. Las flechas negras indican la posición de la Banda 1 (de mayor PM) y de la Banda

2, reguladas por hierro.


63

2.2. Identificación de las OMPs reguladas por hierro mediante

espectrometría de masa

Para la identificación de las OMPs reguladas por hierro se utilizó la estrategia

denominada huella de masas peptídicas. Mediante esta técnica una proteína es

convertida en péptidos por la acción de una enzima. El conjunto de péptidos derivados de

la proteína es una característica propia de ésta y puede utilizarse para su identificación.

Así, la determinación de la masa de los péptidos de digestión de la proteína permite hacer

comparaciones con las masas teóricas del conjunto de péptidos esperados para las

secuencias almacenadas en una base de datos y sugerir aquellas que se ajustan más a

los datos experimentales.

El análisis por espectrometría de masa reveló que la Banda 1 presenta homología

con FepA (gi|190573428), un potencial receptor de membrana externa de enterobactina

en S. maltophilia K279a de 80,7 kDa, con un score de 283 y un 57 % de cobertura de la

secuencia de la proteína (Figura 17 a). La Banda 2 presenta homología con CirA

(gi|190575965), un potencial receptor de colicina I de S. maltophilia K279a de 77,3 kDa,

con un score de 419 y un 60 % de cobertura de la secuencia (Figura 17 b). Dichos

potenciales receptores de K279a fueron propuestos por comparación de la secuencia del

genoma de K279a depositada por Crossman et al. (32) con las secuencias codificantes de

proteínas ya caracterizadas experimentalmente en otras especies bacterianas.


64

Figura 17. Secuencia de aminoácidos de las proteínas de K279a identificadas por espectrometría

de masa: a) receptor de membrana externa de enterobactina FepA, (gi|190573428) y b) receptor

de colicina I CirA, (gi|190575965). En rojo y negrita se encuentran resaltados los péptidos

detectados experimentalmente.

Con el objetivo de profundizar el estudio de FepA y CirA se realizó un análisis in

silico con el algoritmo BPROM (Softberry, Inc.) de las regiones que comprenden 200

nucleótidos río arriba de los respectivos codones de inicio de la transcripción. Este

análisis permitió localizar las regiones promotoras de fepA y cirA (Figura 18 a).

Para detectar potenciales cajas Fur en el genoma de K279a (número de acceso

AM743169), se utilizó el programa MAST (11) y 112 secuencias de cajas Fur

caracterizadas en otras especies bacterianas (155) Se obtuvieron 41 secuencias de

K279a con potenciales cajas Fur. La correspondiente a fepA, 5`-

GCATTTGAGAATCACTCGC-3`, entre las posiciones -144 y -125 respecto al codón de

inicio, se encuentra solapada con la región -35 del presunto promotor. La potencial caja

Fur de cirA, 5`-CGCAACGGTTATCATTTCA-3`, localizada entre las posiciones -82 y -63,

se encuentra solapada con la región -10 del presunto promotor (Figura 18 a). Finalmente,

las secuencias de S. maltophilia obtenidas se analizaron con el programa MEME, una

herramienta que permite encontrar motivos repetidos en un grupo de secuencias (10). De

esta forma se obtuvo una secuencia consenso de la caja Fur putativa de K279a (Figura 18

b).


65

Figura 18. a) Análisis in silico de fepA y cirA: las secuencias conservadas -10 y -35 de los

respectivos promotores se muestran recuadradas y las cajas Fur putativas se muestran resaltadas

en amarillo. b) Logo de la secuencia consenso que representaría la caja Fur putativa de K279a.

3. Caracterización de los sideróforos producidos en S. maltophilia

3.1. Determinación de la naturaleza química de los sideróforos

La mayoría de los sideróforos producidos por los microorganismos son compuestos

de tipo catecol o hidroxamatos. Para determinar la naturaleza química de los sideróforos

producidos por S. maltophilia se emplearon las técnicas de Csáky y Arnow que detectan

compuestos tipo hidroxamato y catecol, respectivamente. Para ello se utilizaron

sobrenadantes de cultivo en medio SSC con el agregado de Dip 100 µM o de FeCl3 100

µM. Bordetella bronchiseptica 7865 y Acinetobacter baumannii ATCC19606 se emplearon

como controles de cepas productoras de sideróforos tipo hidroxamato y catecol,

respectivamente. El ensayo de Arnow reveló que todos los aislamientos locales y K279a


66

producen sideróforos de tipo catecol en presencia de Dip y no los producen en presencia

de hierro. Ninguno de los aislamientos estudiados produjo sideróforos de tipo

hidroxamato.

3.2. Análisis mediante cromatografía en capa delgada (TLC) de

extractos provenientes de sobrenadantes de cultivos de K279a

Los sideróforos presentes en el sobrenadante de cultivo se extrajeron, previa

acidificación, con acetato de etilo y los compuestos presentes en el extracto se separaron

por cromatografía en capa delgada en placas de silica gel 60 F254. Las placas fueron

reveladas mediante la atomización de los reactivos de la reacción de Arnow, lo que

permitió visualizar las manchas correspondientes a compuestos de tipo catecol.

Los extractos de K279a obtenidos en condiciones de limitación de hierro y de la

mutante Fur60, tanto en condiciones limitantes como no limitantes de hierro, mostraron

tres manchas correspondientes a compuestos de tipo catecol con Rf de 0,72, 0,36 y 0,2, y

una mancha que quedó en el punto de siembra. Dichos compuestos no se encontraron en

los extractos de K279a obtenidos en condiciones no limitantes de hierro (Figura 19). Se

utilizaron como control extractos de E. coli K12, que solo produce el sideróforo

enterobactina, obtenidos a partir de cultivos con concentraciones limitantes de hierro (5).

El perfil de compuestos de tipo catecol del control presentó los mismos Rf que los

observados en extractos de las cepas de S. maltophilia en estudio.


67

Figura 19. TLC en placas de silica gel 60 F254 fase móvil cloroformo-metanol (2:1). revelada

mediante la atomización con los reactivos de Arnow. Las flechas señalan las manchas

correspondientes a compuestos tipo catecol

3.3. Análisis mediante cromatografía líquida de alta performance

(HPLC) de extractos provenientes de sobrenadantes de cultivos de

K279a

Los compuestos presentes en los extractos de los sobrenadantes de cultivo se

separaron mediante HPLC en fase reversa y se detectaron mediante espectroscopia UV

con arreglos de diodos. En el cromatograma obtenido de los extractos de los

sobrenadantes de cultivo en condiciones de limitación de hierro se observó la aparición de

cuatro picos (Figura 20 b) que no estuvieron presentes en los extractos obtenidos en

presencia de concentraciones no limitantes del mismo (Figura 20 a). El primer pico tuvo

un tiempo de retención de 12,754 min y presentó un espectro UV con tres bandas de

absorción a 210 nm, 247 nm y 307 nm, respectivamente, similares a las del espectro de

enterobactina (60). Además, se observaron otros dos picos, uno con tiempo de retención

de 18,043 min, que presentó un espectro UV con tres bandas similares a las antes

mencionadas, y otro con tiempo de retención de retención de 15,453 min cuyo espectro

UV comparte las primeras 2 bandas de absorción. Por último, se observó la presencia de

un pico con tiempo de retención de 14,754 min que presentó un espectro UV cuyas

bandas difirieron de las de los picos anteriores (217,5 y 277,9 nm) (Figura 20 b y c)


68


69

Figura 20. Cromatograma de HPLC de los extractos de a) cultivos en condiciones no limitantes de

hierro y b) cultivos en condiciones de limitación de hiero. c) Espectros UV-DAD de los picos

presentes en condiciones de limitación de hierro: en rojo (tiempo de retención 12,7min), verde

(15,4 min), azul (14,7 min) y violeta (18,04 min).

4. Discusión

Durante el desarrollo de esta tesis se obtuvieron, por primera vez, mutantes Fur de

S. maltophilia. Para ello se utilizó la técnica de selección por manganeso que permite

obtener mutantes puntuales en el gen fur. Esta técnica fue ampliamente utilizada para

aislar mutantes Fur en numerosas especies tales como P. aeruginosa (74) y

Xanthomonas campestris pv campestris (86) donde no se han podido aislar mutantes

completamente “knock out” probablemente debido a la gran variedad de funciones

esenciales que controla esta proteína (14). Las mutantes Fur de S. maltophilia produjeron

sideróforos en forma constitutiva, lo que sugiere la falta de regulación por el sistema Fur-

Fe2+. La secuenciación del gen fur permitió poner en evidencia que Fur42 presenta una

mutación que causa la sustitución de un único aminoácido (Asp�Gly en la posición 5) y

Fur60, una mutación en la secuencia -10 de la región promotora putativa (T�C). La

mutante Fur60 se utilizó en los estudios presentados en la Sección V sobre la función del

hierro en la formación de biofilms y en la resistencia al estrés oxidativo de S. maltophilia.

El análisis de las fracciones enrriquecidas en OMPs mediante SDS-PAGE mostró

que en condiciones limitantes de hierro los perfiles de K279a presentan un aumento de la

expresión de la denominada Banda 1 y la aparición de la Banda 2, similar a lo observado

en los perfiles de OMPs de Fur60 cultivada tanto en condiciones limitantes como no

limitantes de hierro. Este comportamiento, sugiere que la expresión de ambas proteínas

está regulada por el complejo Fur-Fe2+. El análisis por espectrometría de masa reveló que

la Banda 1 presenta homología con FepA, un potencial receptor de enterobactina, y la

Banda 2, con CirA, un potencial receptor de colicina I de K279a. En E. coli K-12 FepA es

el receptor del complejo hierro-enterobactina mientras que CirA es el receptor de los

productos de degradación lineales de dicho complejo y actúa como una vía alternativa

para incorporar hierro (103). Mediante análisis in silico se determinaron las potenciales

cajas Fur de fepA y cirA. La correspondiente a fepA, 5`-GCATTTGAGAATCACTCGC-3`,

entre las posiciones -144 y -125 respecto al codón de inicio, se encuentra solapada con la


70

región -35 del presunto promotor. La potencial caja Fur de cirA, 5`-

CGCAACGGTTATCATTTCA-3`, localizada entre las posiciones -82 y -63, se encuentra

solapada con la región -10 del presunto promotor (Figura 18 a). Finalmente, se obtuvo

una secuencia consenso de la caja Fur putativa de K279a (Figura 18 b).

Por otra parte, se determinó la naturaleza química de los sideróforos de S.

maltophilia. Todos los aislamientos locales y la cepa K279a produjeron sideróforos de tipo

catecol en condiciones limitantes de hierro. Estos resultados no concuerdan con los

obtenidos por Chhibber et al quienes reportaron la producción de ornibactina por S.

maltophilia (36). Sin embargo, Ryan et al. reportaron que S. maltophilia K279a y R551-3

producen el sideróforo de tipo catecol enterobactina, basados en la informacion de los

genomas recientemente secuenciados (126). El genoma de S. maltophilia K279a

(Smlt2817, Smlt2818 y Smlt2822) codifica los potenciales componentes A, F y C de

enterobactina sintasa, lo que sugiere la producción de enterobactina en esta especie

(http://www.sanger.ac.uk/Projects/S_maltophilia/).

El análisis por TLC de los extractos obtenidos a partir de los sobrenadantes de

cultivos de K279a, en condiciones limitantes de hierro y de F60, en presencia o ausencia

de Dip, permitió revelar la presencia de varios compuestos de tipo catecol. Dichos

compuestos presentaron los mismos valores de Rf que los presentes en el extracto de E.

coli K12, que solo produce enterobactina. Como lo describieron Furrer et al. (64) dichos

compuestos podrían corresponder al monómero, dímero y trímero de enterobactina, y el

compuesto con mayor Rf a enterobactina. La separación mediante HPLC se realizó

siguiendo las condiciones utilizadas por Winkelmann el al. (151) para separar

enterobactina y sus derivados lineales quienes identificaron los picos separados mediante

espectrometría de masa y determinaron que un pico con tiempo de retención de 18,3 min

correspondía a enterobactina, otros con 16,2 min y 14,5 correspondian al trímero y

dimero, respectivamente. La similitud de los picos detectados en K279a, junto con el

espectro UV obtenido, sugiere que dichos compuestos podrían ser enterobactina y sus

derivados.


71

Sección IV

Función del sistema de señalización rpfF/DSF en la formación de biofilms y en la virulencia de S. maltophilia

En Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) la producción de enzimas

extracelulares está regulada de forma positiva por el operon rpf (“regulation of

pathogenicity factors”). Los genes rpfB y rpfF son los responsables de la síntesis del

autoinductor DSF (“diffusible signal factor”). La disrupción del gen rpfF conlleva a la

ausencia de producción del autoinductor, lo que ocasiona importantes cambios

fenotípicos. El sistema de QS está implicado en la regulación de factores de virulencia y

en la formación de biofilms en Xcc (13, 47, 135).

En S. maltophilia la señalización por QS también está mediada a través de la

molécula DSF. La mutante K279arpfF presenta una severa disminución en la motilidad

tipo “swimming”, en la producción de proteasa, en la tolerancia frente a anitibioticos y

metales pesados, presenta una alteración en el perfil de lipopolisacáridos y además,

forma agregados en el medio L. Por otra parte, en un medio artificial de esputo, que

simula el ambiente en el pulmón de un paciente fibroquístico, la cepa K279a forma

microcolonias mientras que su mutante rpfF no las forma. (62).

El objetivo de esta sección fue estudiar la función de DSF en el crecimiento

planctónico, la formación y la arquitectura de biofilms, la expresión de caracteres

fenotípicos asociados a su desarrollo, y la virulencia de S. maltophilia. Para este propósito

se realizaron estudios comparativos entre la cepa salvaje K279a y su mutante K279arpfF.

1. Crecimiento planctónico

Se evaluó el posible efecto de la señalización por QS en el crecimiento planctónico

de S. maltophilia en condiciones estáticas y con agitación (150 rpm). El crecimiento de las

cepas K279a y su mutante K279arpfF cultivadas en TSB a 35 °C fue determinado

espectrofotométricamente a 540nm a diferentes tiempos de incubación.

Los resultados presentados en la figura 21 muestran que en ambas condiciones la

cosecha máxima alcanzada por la mutante rpfF fue inferior a la correspondiente a la cepa

salvaje. Cabe resaltar que en condiciones estáticas esta diferencia fue marcadamente


72

mayor (DO540 K279a 1,120 y DO540 K279arpfF 0,391) que con agitación (DO540 K279a

1,758 y DO540 K279arpfF 1,239). Asimismo, en ambas condiciones la mutante rpfF

presentó menor velocidad de crecimiento que la cepa salvaje, especialmente en

condiciones estáticas.

b

0 20 40 600.0

0.5

1.0

1.5

2.0K279a

K279arpfF

Tiempo (h)

DO

540

a

0 20 40 600.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Tiempo (h)

DO

540

Figura 21. Curvas de crecimiento de S. maltophilia K279a y de su mutante rpfF en: a) condiciones

estáticas y b) con agitación. Las bacterias fueron cultivadas en TSB a 35 °C, el crecimiento fue

determinado espectrofotométricamente a 540nm. Los resultados se expresan como la media ± la

desviación estándar de un experimento representativo.

2. Papel del “quorum sensing” en la formación de biofilms

Para evaluar la capacidad de formar biofilms de la cepa salvaje y de su mutante rpfF

sobre diferentes superficies abióticas se utilizaron el ensayo en tubos de borosilicato (BS)

y de polipropileno (PP), y el ensayo en microplacas de poliestireno (PS). Además, se

analizaron los biofilms formados sobre BS mediante microscopia óptica y microscopia

confocal laser de barrido (CLSM).

2.1. Análisis de biofilms formados sobre superficies hidrofílicas e

hidrofóbicas

Se evaluó la formación de biofilms sobre superficies hidrofílicas (BS) e hidrofóbicas

(PP) utilizando el ensayo en tubos. Los cultivos en TSB se incubaron con agitación (150


73

rpm) durante 6, 24 y 48 h. Luego, se cuantificó espectrofotométricamente la biomasa de

los biofilms teñidos con CV.

S. maltophilia K279a presentó una marcada adherencia en BS a las 6 h de

incubación, la biomasa alcanzó su máximo nivel a las 24 h y disminuyó ligeramente a las

48 h (Figura 22 a). En cambio, no se observó adherencia en PP a las 6 h de incubación, y

los valores de DO546 del CV obtenidos a las 24 h fueron menores que los

correspondientes a las 6 h en BS (P < 0,01). Finalmente, a las 48 h de incubación K279a

presentó una adherencia en PP semejante a la alcanzada a las 6 h en BS (Figura 22 b).

La mutante mostró una adherencia significativamente menor (P < 0,001) que la de la cepa

salvaje en ambas superficies durante todo el periodo estudiado (Figura 22 a y b).

En la figura 22 c y d se presenta las imágenes de biofilms formados sobre tubos de

BS y PP, respectivamente, teñidos con CV. La inspección visual de los biofilms formados

en tubos ha sido ampliamente utilizada como tamizaje para determinar la capacidad de

formar biofilms de aislamientos bacterianos (112). En las imágenes se puede observar

que K279a se adhiere a la interfase aire-medio de cultivo y tapiza el fondo y las paredes

de BS a partir de las 6 h mientras que solo se visualizan imágenes similares en PP a las

48 h de incubación. Por su parte, la mutante formó anillos incompletos en la interfase aire-

medio de cultivo en ambas superficies.


74

Figura 22. Formación de biofilms de S. maltophilia K279a y su mutante rpfF en superficies

hidrofílicas e hidrofóbicas. Los cultivos en TSB se incubaron a 35 ºC durante 6, 24 y 48 h. a) y b)

biomasa del biofilm formado sobre tubos de BS y PP, respectivamente, cuantificada por tinción con

CV. Los resultados se expresan como la media ± desviación estándar de un experimento

representativo.*representa diferencias estadísticamente significativas. c) y d) Imagen de biofilms

formados sobre tubos de BS y PP, respectivamente, teñidos con CV.

2.2. Análisis de biofilms formados en microplacas

En el ensayo cuantitativo en microplacas de PS el crecimiento fue evaluado

mediante la determinación de la DO546 del cultivo, y la biomasa (células adheridas y matriz

extracelular) de los biofilms teñidos con CV fue evaluada espectrofotométricamente. Los

resultados obtenidos en condiciones estáticas, a diferentes tiempos de incubación, se

presentan en la figura 23 a y b, respectivamente.

La cepa salvaje presentó una marcada adherencia a las 6 h de cultivo, a pesar de

su escaso crecimiento y alcanzó el máximo nivel de adherencia a las 24 h (Figura 23 b),

comportamiento similar al observado en BS. En concordancia con los resultados del

crecimiento planctónico en condiciones estáticas descripto en el punto 1 (Figura 23a), el

crecimiento de la mutante en la microplaca se vio severamente reducido, respecto al de la

cepa salvaje. La mutante mostró una adherencia significativamente menor (P < 0,001) que

la de la cepa salvaje en todo el periodo estudiado (Figura 23 b).


75

a

6 24

48

0.0

0.4

0.8

1.2

1.6

K279aK279arpfF*

* *

Tiempo (h)

Cre

cim

ient

o (D

O54

6)

b

6 24

48

0.0

0.4

0.8

1.2

1.6

2.0

2.4

2.8

*

** *

Tiempo (h)

Bio

mas

a (D

O54

6de

CV

)

Figura 23. Crecimiento y formación de biofilms de S. maltophilia K279a y su mutante rpfF en

microplacas de PS cultivadas en TSB a 35ºC. a) crecimiento, y b) biomasa del biofilm cuantificada

por tinción con CV. Los resultados se expresan como la media ± desviación estándar de un

experimento representativo. *representa diferencias estadísticamente significativas.

Además la adición de DSF comercial 200 µM al medio de cultivo produjo un

incremento significativo (P < 0,05) de la biomasa del biofilm de la mutante evaluada a las

48 h de incubación (figura 24).


76

K279a rpfF rpfF+ DSF200µM 0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5*

*B

iom

asa

(DO

546

de C

V)

Figura 24. Formación de biofilms de S. maltophilia K279a y su mutante rpfF en microplacas de PS

cultivadas a 35 ºC, durante 48 h en TSB y TSB suplementado con DSF comercial 200 µM. Biomasa

del biofilm cuantificada por tinción con CV. Los resultados se expresan como la media ± desviación

estándar de un experimento representativo. *representa diferencias estadísticamente significativas.

2.3. Análisis de biofilms por microscopía óptica

Las características de los biofilms de K279a y de la mutante rpfF desarrollados

sobre cubreobjetos de BS, a partir de cultivos en TSB incubados 48 h, fueron analizadas

por microscopia óptica previa tinción con CV (Figura 25). El biofilm de K279a presentó

una monocapa de células adheridas con extensas áreas de la superficie cubiertas por

microcolonias. Por el contrario, el patrón de adherencia de la mutante rpfF se caracterizó

por presentar bacterias aisladas y agregados celulares.


77

Figura 25 . Biofilms de S. maltophilia desarrollados sobre cubreobjetos de BS. Los biofilms

desarrollados por K279a y su mutante rpfF a partir de cultivos en TSB incubados 48 h fueron

teñidos con CV y examinados por microscopia de campo claro con una magnificación de 400x.

2.4. Análisis de biofilms por microscopia confocal laser de barrido

(CLSM)

Se estudió la arquitectura de los biofilms formados por ambas cepas mediante

CLSM que permite la visualización de muestras totalmente hidratadas y, de esta forma,

revela la elaborada estructura tridimensional del biofilm. Los biofilms se formaron en las

cámaras especiales de cultivo Lab.Tek, Nunc® con base de borosilicato (BS). Los cultivos

en TSB y TSB suplementado con DSF comercial se incubaron durante 48 h en

condiciones estáticas. El biofilm formado en la base de la cámara se visualizó con el

colorante fluorescente Syto9®, un agente que atraviesa fácilmente las membranas, se

une a los ácidos nucleicos y tiñe de color verde las bacterias. Como se observa en la

imagen de un plano x-y (Figura 26) el biofilm de K279a en TSB presentó una monocapa

con microcolonias distribuidas por toda la superficie. La reconstrucción tridimensional

realizada a partir de la serie de imágenes tomadas en los planos x-y a través del eje z

permitió evidenciar la arquitectura del biofilm, compuesta por picos de hasta 30 µm

intercalados por canales acuosos (Figura 27). La mutante rpfF no mostró un crecimiento

confluente sino que formó un gran número de agregados celulares dispersos y su

estructura tridimensional mostró solo algunos picos de apenas 10 µm (Figura 26 y Figura

27). Por otra parte, los biofilms de la mutante formados en TSB suplementado con DSF


78

presentaron un crecimiento casi confluente con más cantidad de microcolonias y picos de

20 µm (Figura 26 y Figura 27).

Figura 26. Imágenes de biofilms de S. maltophilia obtenidas mediante CLSM. Se realizaron

cultivos en las cámaras Lab.Tek de K279a y su mutante rpfF en TSB y TSB suplementado con

DSF. Luego de 48 h de incubación los biofilms fueron teñidos con Syto9®. Cada imagen central

corresponde a un plano x-y, mientras que las imágenes de la parte superior y de la derecha de

cada plano x-y representan la proyección en el eje z de la serie de imágenes obtenidas a partir de

los cortes en profundidad. La barra representa 20 µm.


79

Figura 27. Reconstrucción tridimensional de la serie de imágenes obtenidas mediante CLSM en

los planos x-y a través del eje z de biofilms de S. maltophilia. Las reconstrucciones fueron

realizadas con el programa ImageJ.

3. Producción de sustancias poliméricas extracelulares (EPS)

Se evaluó la producción de EPS mediante la técnica de precipitación con etanol y

determinación del peso seco. Para ello, se utilizaron sobrenadantes de cultivos


80

planctónicos en LB-glu 0,1 % de S. maltophilia incubados con agitación durante 48 h a 35

ºC. La figura 28 muestra que la cepa K279a produce cantidades significativamente

menores de EPS que la mutante rpfF. El análisis de los componentes químicos de los

precipitados realizado mediante la cuantificación de hidratos de carbono con glucosa

como estándar (50) y de proteínas (19) demostró que la cepa K279a presenta mayor

cantidad de exopolisacáridos por mg de EPS (0,27 ± 0,02) que la mutante (0,12 ± 0,05).

Por el contrario, la mutante produjo cantidades mucho mayores de proteínas por mg de

EPS (0,85 ± 0,04) que la cepa salvaje (0,56 ± 0,07) (Tabla 5). Por lo tanto, relación

hidratos de carbono/proteínas en la EPS es mucho mayor para la cepa salvaje (0,48) que

para la mutante (0,14).

K279a K279arpfF0

100

200

300

400 *

EP

S( µµ µµ

g)/B

iom

asa(

mg)

Figura 28. Producción de EPS de S. maltophilia K279a y su mutante K279arpfF cultivadas durante

48 h, a 35 ºC con agitación. Los resultados se expresan como la media ± desviación estándar de la

relación entre el peso seco de las EPS (µg) y el peso seco de la biomasa del cultivo (mg), de un

experimento representativo.*representa diferencias estadísticamente significativas.


81

Tabla 5. Composición de las EPS de cepas de S. maltophilia

Cepas de S.

maltophilia

EPS

(µg de EPS/mg de

biomasa)

Análisis químico de EPS

Hidratos de

carbono

(mg de glucosa/mg de

peso seco de EPS)

Proteínas

(mg de proteínas/mg

de peso seco de EPS)

Relación Hidratos de

carbono/Proteínas


proteínas)

K279a 77,4 ±12,2 0,27 ± 0,02 0,56 ± 0,07 0,48

K279arpfF 301,4 ± 20,3 0,12 ± 0,05 0,85± 0,04 0,14

Para profundizar el estudio de la composición molecular de las EPS se utilizó

espectroscopia de reflexión total atenuada infrarroja con transformada de Fourier (ATR-

FTIR). Como primer paso, se determinó la cantidad de EPS adecuada a ser empleada

para la adquisición de espectros IR. Con este propósito, el precipitado de EPS obtenido

con etanol a partir del sobrenadante de K279a fue resuspendido en una relación de 20 µl

de agua Milli-Q por cada mg de EPS (peso seco) y diluido 1/4, 1/10 y 1/20. Alícuotas de

150 µl de las suspensiones fueron transferidas al cristal del modulo ATR y se les evaporó

el agua para formar una película sobre el mismo. Luego se obtuvieron los

correspondientes espectros de cada dilución. Los valores de absorbancia de los picos

amida I y amida II se utilizaron para evaluar la saturación de la señal por ser los más

intensos. La dilución 1/20 demostró ser adecuada para la adquisición de espectros (datos

no mostrados).

El espectro de ATR-FTIR obtenido con la suspensión de los precipitados es el

resultado de la superposición de las huellas digitales de cinco biomoléculas. El agua está

representada por el estiramiento simétrico y asimétrico del grupo OH en el rango de 3800-

3000 cm-1 y el balanceo a 1640 cm-1. Las proteínas están representadas principalmente

por estiramiento y vibraciones del grupo N-H de la unión peptídica entre 1700-1500 cm-1.

La banda amida I corresponde al estiramiento del grupo C=O de las amidas y la banda

amida II corresponde a la combinación fuera de fase del balanceo en un plano del grupo


82

N-H y el estiramiento C-N. Los lípidos presentan bandas entre 3100 a 2800 cm-1

correspondientes a vibraciones debidas a estiramientos y balanceos de C-H en los grupos

funcionales CH3 y CH2. Los picos de la región 1200-900 cm-1 son debidos principalmente

a un fuerte acoplamiento de los estiramientos C-C y C-O y de las deformaciones C-O-C y

C-O-H correspondientes a oligo y polisacáridos. Asimismo en esta ventana se encuentra

el estiramiento simétrico del grupo PO2- perteneciente a ácidos nucléicos (1080 cm-1). Por

último la zona entre 1300 y 1500 cm-1 es la denominada zona mixta, ya que involucra

absorciones de grupos funcionales presentes en lípidos, proteínas, carbohidratos y ácidos

nucléicos (21).

El espectro de ATR-FTIR de las EPS de la mutante mostró mayor intensidad de

absorción en los picos de amida I (1643,08 cm-1) y amida II (1550,31 cm-1) que el de la

cepa salvaje. Por el contrario el pico de 1053,40 cm-1 de polisacáridos presentó una

intensidad ligeramente mayor en la cepa K279a que en su mutante (Figura 29). Ambos

resultados están en concordancia con la relación hidratos de carbono/proteínas de las

EPS determinada por métodos químicos, la cual es mucho mayor para la cepa salvaje

que para la mutante (Tabla 5). En la zona de los grupos funcionales CH3 y CH2 de los

lípidos (3100 a 2800 cm-1) no se observó diferencia entre ambas cepas.


83

Figura 29. Espectros ATR-FTIR de EPS de K279a (azul) y de la mutante rpfF (rojo). En los

espectros se indican los picos de absorción correspondientes a los grupos funcionales asociados a

lípidos (3100 a 2800 cm-1), proteínas (1700-1500 cm-1) y polisacáridos (1200-900 cm-1).

4. Motilidad tipo “twitching”

Se estudió el impacto de la disrupción del gen rpfF de K279a en la motilidad tipo

“twitching”. La misma es una forma de traslocación en superficie solida, dependiente de la

presencia de pili tipo IV, que ha sido asociada a la formación de microcolonias en el

biofilm. La motilidad tipo “twitching” fue visualizada por tinción con CV y evaluada

mediante la determinación del diámetro de los halos.

Solo la cepa salvaje produjo halos de “haze” alrededor de la colonia en la interface

entre el medio de cultivo agarizado y la placa de Petri. Luego de la remoción del medio de

cultivo y tinción con CV se observó que la cepa salvaje produjo halos de alrededor de 14

mm mientras que la mutante rpfF produjo halos significativamente menores (P < 0,05) de

aproximadamente 3 mm (Figura. 30 a superior). La observación de los halos teñidos con


84

CV en la placa de Petri de poliestireno mostró importantes diferencias en el patrón de

adherencia. La cepa K279a presentó una zona de adherencia expansiva mientras que la

mutante permaneció adherida cerca del sitio de inoculación (Figura. 30 a inferior). El

análisis microscópico de los halos de K279a reveló un borde externo compuesto por

grupos bacterias que se alejan de una monocapa de células, y más cerca del punto de

inoculación, una monocapa con microcolonias típica de los biofilms. La mutante, por el

contrario, no presentó un patrón definido de adherencia (Figura 30 b).

Figura 30. Motilidad “twitching” de S. maltophilia K279a y su mutante rpfF. Las cepas fueron

inoculadas por punción en LB agar 1% e incubadas a 35 ºC por 48 h. a) Diámetros de los halos de

“twitching” teñidos con CV e imagen de los mismos. Los resultados muestran la media ± la

desviación estándar de un experimento representativo. Las diferencias son estadísticamente

significativas a un valor de P < 0,05 (*). b) Imagen de microscopía de campo claro de los halos

teñidos con CV (magnificación de 400X).


85

5. Hidrofobicidad de la superficie celular

Se evaluó la hidrofobicidad de la superficie celular de S. maltophilia mediante: 1- el

ensayo de agregación bacteriana en presencia de sulfato de amonio (SAT, salt

aggregation test), 2- la afinidad al n-hexadecano (MATH, microbial adherence to

hydrocarbons) y 3- la afinidad por superficies de poliestireno (PS) a través del ensayo de

réplica (125) (Tabla 6). La cepa K279a fue clasificada como moderadamente hidrofóbica

en base a los valores de SAT (1,00) y MATH (21 %). Por el contrario K279a rpfF se

comportó como no hidrofóbica según el valor de SAT (4,00) y no presentó adherencia al

n-hexadecano.

En concordancia con estos resultados, el método de réplica, en el cual la

hidrofobicidad de la superficie celular correlaciona con la adherencia bacteriana al PS,

mostró que solo la cepa salvaje se adhiere a esa superficie (Figura 31).

Tabla 6. Hidrofobicidad de la superficie celular de cepas de S.maltophilia

Cepas de S. maltophilia MATH SAT Método de replica

K279a 21 % 1,00 ++

K279arpfF - 4,00 -

MATH (microbial adherence to hydrocarbons): < 20 % no hidrofóbica, ≥ 20 % < 50 %,

moderadamente hidrofóbica, y ≥ 50 %, fuertemente hidrofóbica (93). SAT (salt aggregation test): <

1 M, fuerte; 1 M, moderada; o 2 M, débil hidrofobicidad; y ≥ 4 M, no hidrofóbica (93). Método de

replica: adherencia al PS, - negativa, (+) reducida, + positiva, o ++ positiva fuerte (125)


86

Figura 31. Hidrofobicidad celular de S. maltophilia evaluada mediante el método de replica: a)

colonias de K279a (mitad superior) y de su mutante rpfF (mitad inferior) en el medio TSA y b)

replica de dichas colonias sobre PS, teñida con CV.

6. Resistencia al estrés oxidativo

Se evaluó la resistencia al estrés oxidativo en S. maltophilia K279a y de su mutante

rpfF. Cultivos en fase exponencial de ambas cepas fueron expuestos a una concentración

de H2O2 20 mM por diferentes períodos de tiempo. Se calculó el porcentaje de células

sobrevivientes como el número de ufc/ml luego del tratamiento relativo al número de

ufc/ml inicial.

Luego de 15 y 30 min de exposición la cepa salvaje presentó un porcentaje de

sobrevida de 2,96 ± 0,89 y 1,71 ± 0,78, respectivamente, mientras que la supervivencia de

la mutante rpfF fue significativamente menor (P < 0,01) que la de K279a (0,10 ± 0,04 y

0,03 ± 0,01 % de sobrevida a los 15 o 30 min de exposición) (Figura 32).


87

0 10 20 300.01

0.1

1

10

100K279aK279arpfF

Tiempo (min)

Sup

ervi

venc

ia (

%)

Figura 32. Resistencia al estrés oxidativo de S. maltophilia. Cultivos en fase exponencial de K279a

y su mutante rpfF fueron tratados por 15 y 30 min con H2O2 20 mM y se determinó el porcentaje de

células sobrevivientes. Los resultados corresponden a la media ± el desvío estándar de tres

experimentos independientes.

7. Producción de exoenzimas

Se estudió el impacto de la disrupción del gen rpfF de K279a en la en la expresión

fenotípica de las enzimas extracelulares lipasa, utilizando placas con agar Tributirina, y

DNasa, en placas de agar DNasa. La figura 33 muestra que la actividad de ambas

enzimas está presente en K279a mientras que está ausente en la mutante.


88

Figura 33. Actividad de las exoenzimas lipasa (agar Tributirina) y DNasa (agar DNasa, revelado

con HCl) en S. maltophilia. Las placas sembradas en estría con cultivos de K279a y su mutante

rpfF se incubaron durante 48 h a 35°C.

8. Evaluación de la virulencia mediante el modelo de Galleria

mellonella

Con el objetivo de evaluar el efecto de la mutación en el gen rpfF sobre la virulencia

de S. maltophilia se utilizó el modelo de infección del lepidóptero G. mellonella con la

dosis infectiva de 105 ufc/larva que demostró ser adecuada para estudios comparativos

(sección II).

Se observó una diferencia significativa (P < 0,0174) de la virulencia entre ambas

cepas, K279a resultó letal para un 20 % y 40 % de la población a las 48 h y 96 h,

respectivamente, mientras que la mutante rpfF no mostró efecto letal y el porcentaje de

supervivencia fue similar al del grupo control inyectado con solución fisiológica (Figura 34,

datos del grupo control no presentados).


89

0 20 40 60 80 10040

60

80

100K279a

K279arpfF

Tiempo (h)

Sup

ervi

venc

ia (

%)

Figura 34. Ensayo de infección de larvas de Galleria mellonella con cepas de S. maltophilia. Luego

de la inyección de 10 a 13 larvas por cepa con la dosis de 105 ufc/larva se registró diariamente el

número de individuos sobrevivientes y se graficaron las curvas de Kaplan-Mayer. El grupo control

de larvas inyectadas con solución fisiológica no presentó individuos muertos (datos no graficados).

El análisis estadístico se realizó con el método de Log-rank. Los datos corresponden a un

experimento representativo.

9. Discusión

La mutación en el gen rpfF produjo efectos pleiotrópicos, entre ellos, una marcada

disminución de la cosecha máxima y de la velocidad de crecimiento de K279arpfF,

fundamentalmente en condiciones estáticas con baja tensión de oxígeno (Figura 21 a). Se

ha propuesto que la capacidad de crecer en microaerofilia de K279a está relacionada con

la formación de biofilms (32).

La disrupción del gen rpfF produjo además una disminución de la movilidad tipo

“twitching” y una alteración de la hidrofobicidad superficial. Previamente Fouhy et al (62)

observaron que la mutante K279arpfF presenta alterada la movilidad mediada por flagelos

(“swimming”). Todas estas características influyen en la formación de biofilms. Dicha

formación requiere de la movilidad mediada por flagelos que permite a la bacteria

establecer el contacto inicial con la superficie (111). Por otra parte, la adhesión depende

de estructuras de la superficie bacteriana tales como pili y adhesinas, y de su

hidrofobicidad, y además, de propiedades de la superficie biótica o abiótica tales como la


90

hidrofobicidad y la rugosidad, y de las interacciones electrostáticas entre ambas

superficies (46).

Nuestros resultados muestran que la cepa K279a es moderadamente hidrofóbica en

base a los valores de SAT y MATH mientras que la mutante se comportó como no

hidrofóbica (Tabla 6). Además, en el método de réplica, solo la cepa salvaje se adhiere al

PS (Figura 31). En consecuencia, la disrupción del gen rpfF en S. maltophilia conduce a

cambios en la hidrofobicidad superficial. En un trabajo anterior de nuestro grupo de

investigación hemos descripto una pobre correlación entre la hidrofobicidad de la

superficie bacteriana y la formación de biofilms, sin embargo, en algunos aislamientos

clínicos de S. maltophilia se observó correlación entre una moderada hidrofobicidad y la

formación de biofilms fuertes (117). Por su parte Pompilio et al. concluyeron que la

hidrofobicidad es un factor importante en la adhesión y formación de biofilms, sin

embargo, observaron que algunos aislamientos con diferente hidrofobicidad poseían

similares capacidades de formar biofilms (120). Esto podría deberse a la multiplicidad de

factores que influyen en el proceso y la redundancia en la función de algunos de ellos.

Con respecto a la hidrofobicidad de las superficies abióticas, los resultados

presentados muestran que la cepa K279a se adhiere rápidamente (6 h) al BS, una

superficie hidrofílica. Esta capacidad estaría relacionada con las cargas positivas de la

superficie de S. maltophilia, proporcionadas por proteínas localizadas en la membrana

externa (88). En cambio, K279a presentó una pobre adhesión a superficies hidróbicas

como los tubos de PP (Figura 22 b). Por su parte, la mutante mostró una adherencia

significativamente menor que la de la cepa salvaje en ambas superficies (Figura 22 a y b).

Estos resultados, sumados a los discutidos respecto a la hidrofobicidad bacteriana,

sugieren que los efectos pleiotrópicos de la mutación del gen rpfF incluyen la modificación

de la superficie bacteriana que conlleva a una menor adhesión.

La mutación en el gen rpfF produjo profundos cambios en la capacidad de formar

biofilms de S. maltophilia evaluada en microplacas. El comportamiento de K279a fue

similar al observado en BS (Figura 22), se observó una marcada adherencia a las 6 h de

incubación y un máximo nivel de adherencia a las 24 h (Figura 23 b). La mutante mostró

una adherencia significativamente menor en todo el periodo estudiado (Figura 23 b).

Además, la adición de DSF comercial produjo un incremento significativo de la biomasa

del biofilm de K279arpfF.


91

En las etapas de formación del biofilm, una vez que las bacterias se han adherido

comienzan a dividirse y la migración de las células a lo largo de la superficie lleva a la

formación de agregados conocidos como microcolonias. La movilidad tipo “twitching”,

mediada por el pili de tipo IV, participa en este proceso (111). La mutante rpfF produjo

halos de “twitching” significativamente menores que los de la cepa salvaje (Figura. 30 a

superior) y a diferencia de ésta, no presentó un patrón definido de adherencia (Figura 30

b). En P. aeruginosa, ha sido demostrado que la formación de microcolonias depende de

la movilidad tipo “twitching” regulada por QS (43). Nuestros resultados sugieren que en S.

maltophilia el sistema de QS, mediado por DSF, sería responsable de este tipo de

movilidad asociada a superficies. Además, el análisis por microscopía óptica de biofilms

de K279a demostró la presencia de abundantes microcolonias mientras que en los de la

mutante se observaron agregados celulares sin un patrón definido.

Pompilio et al. estudiaron 40 aislamientos clinicos de S. maltophilia y no encontraron

correlación entre la movilidad tipo “twitching” y la formación de biofilms (120). Sin

embargo, en otro estudio, la movilidad tipo “twitching ha sido correlacionada positivamente

con la formación de biofilms en S. maltophilia (81). En este sentido, en un trabajo anterior

de nuestro grupo hemos reportado que la motilidad asociada a superficies presentó buena

correlación con la adhesión a BS, PP y PS de aislamientos locales de S. maltophilia (117).

Estos resultados presentados demuestran que la ausencia de DSF generada por la

mutación del gen rpfF impacta negativamente en la formación de biofilms sobre diferentes

superficies desde la adhesión inicial.

Para profundizar el análisis sobre la arquitectura de biofilms maduros se utilizó la

microscopía confocal. El análisis por CLSM reveló que la cepa salvaje, luego de 48 h de

incubación, forma estructuras tridimensionales características de un biofilm maduro, con

canales de agua entre ellas. Los canales de agua son parte integral de la estructura del

biofilm ya que proveen de una vía de circulación de nutrientes y de intercambio de

productos metabólicos con el medio (28). La mutante rpfF no mostró un crecimiento

confluente sino que formó un gran número de agregados celulares dispersos y no

desarrolló una estructura tridimensional. Sin embargo, en presencia de DSF comercial la

mutante contrarrestó parcialmente dicha deficiencia.

La función del QS en la formación de biofilms de Xcc ha sido analizada por

diferentes autores. Dow et al (47) reportaron que una mutante rpfF de Xcc crece formando


92

agregados cuando es cultivada en el medio L y la adición de DSF produce la dispersión

de los mismos. Además, como la cepa salvaje no crece formando agregados llegaron a la

conclusión que la función del DSF es la dispersión del biofilm en esta especie. Sin

embargo, Torres et al (141) encontraron que la formación de biofilms de Xcc en medio

mínimo requiere un preciso control de la cantidad de DSF ya que la ausencia o la

sobreproducción del mismo afectan negativamente la formación de biofilms estructurados.

Además observaron que la virulencia de Xcc también requiere un preciso control de la

producción de DSF.

En concordancia con los resultados de Torres et al en Xcc, Alavi et al encontraron

que una mutación en el gen rpfF impacta negativamente en la formación de biofilms de S

maltophilia R551-3, una cepa asociada a plantas (4). Estos resultados concuerdan con los

presentados en esta tesis, los cuales demuestran la importancia de DSF en la formación

de biofilms de la cepa clínica K279a.

Una parte fundamental del biofilm es su matriz de EPS que le otorga resistencia

frente a distintos biocidas. En Xcc la mutación en rpfF genera una disminución de la

producción de EPS (13), sin embargo, los resultados presentados muestran que la cepa

K279a produce cantidades significativamente menores de EPS que su mutante rpfF. Esto

nos llevó a estudiar en profundidad la composición química de las EPS de ambas cepas

mediante la cuantificación de hidratos de carbono y de proteínas, y el análisis por

espectroscopia ATR-FTIR. La cepa K279a produjo mayor cantidad de exopolisacáridos

por mg de EPS que la mutante (Tabla 5). Por el contrario, la mutante produjo cantidades

mayores de proteínas por mg de EPS que la cepa salvaje (Tabla 5). Por lo tanto, la

relación hidratos de carbono/proteínas en la EPS es mucho mayor para la cepa salvaje

(0,48) que para la mutante (0,14). En concordancia, el espectro de ATR-FTIR de las EPS

de la mutante mostró mayor intensidad de absorción en los picos de amida I y amida II

que el de la cepa salvaje. Además, el pico de polisacáridos presentó una intensidad

ligeramente mayor en la cepa K279a que en su mutante. En la zona de los grupos

funcionales CH3 y CH2 de los lípidos no se observó diferencia entre ambas cepas (Figura

29). Por lo tanto, la mutación en el gen rpfF produce un cambio en la composición relativa

de los compuestos presentes en las EPS. El exopolisacarido de S. maltophilia presenta

una estructura novedosa respecto al de otras bacterias, consiste en una unidad repetitiva

de cuatro azucares compuesta por tres residuos de ácido urónico y un residuo D-lactato

que aporta otra carga negativa. Además presenta dos grupos o-acetilo por subunidad. La


93

abundancia de cargas negativas que posee es una característica compartida con el

alginato de P. aeruginosa y con el exopolisacarido de Inquilinus limosus, y se ha sugerido

que podría resultar en una ventaja para la persistencia en el pulmón de estos dos

organismos de relevancia en infecciones de pacientes fibroquisticos (24).

Por último, se investigó el rol del QS en la virulencia de S. maltophilia. La disrupción

del gen rpfF impactó negativamente en la actividad de DNasa y lipasa. Previamente,

Fouhy et al (62) demostraron que la mutación en el gen rpfF producía una disminución de

la actividad de proteasa. Estas tres enzimas han sido asociadas a la virulencia de S.

maltophilia (18).

La resistencia al estrés oxidativo es otra característica importante para la

patogénesis bacteriana ya que durante el proceso de infección las bacterias se enfrentan

a especies reactivas del oxigeno producidas por las células fagocíticas. La mutante rpfF

mostró una marcada disminución en la resistencia al peróxido de hidrogeno, lo que

sugiere la participación del sistema de QS en la regulación de enzimas antioxidantes. En

P. aeruginosa el QS participa en la resistencia al peróxido de hidrogeno y al anión

superóxido a través de la regulación de la expresión de las enzimas antioxidantes SOD y

catalasa (72).

Para profundizar los estudios sobre el rol biológico del QS en la virulencia de S.

maltophilia se utilizó el modelo de G. mellonella, cuyo sistema inmune comparte

homología estructural y funcional con el sistema inmune innato de mamíferos (80). Este

modelo fue utilizado anteriormente para evaluar la virulencia en esta especie (100, 110).

Solo la cepa salvaje presentó efecto letal en este modelo, sugiriendo el rol del QS en la

regulación de factores de virulencia. La ausencia de efecto letal en la mutante

correlaciona con su menor capacidad de formar biofilms, con la ausencia de actividad de

las exoenzimas lipasa y DNasa, y con su menor resistencia al estrés oxidativo.

En conclusión, el sistema rpfF/DSF juega un papel importante en la formación de biofilms

y en la virulencia de S. maltophilia.


94

Sección V

Función del hierro en la formación de biofilms y en la resistencia al estrés oxidativo de S. maltophilia

La formación de biofilms y la resistencia al estrés oxidativo son factores de

virulencia de gran relevancia en la patogenia bacteriana. El crecimiento en biofilms facilita

la persistencia en el huésped, la evasión de la respuesta inmune y la supervivencia frente

a altas concentraciones de antimicrobianos (38, 45, 119). Diferentes señales ambientales

regulan la formación de biofilms y la resistencia al estrés oxidativo, entre ellas, el hierro ha

sido ampliamente estudiado en numerosas especies bacterianas, sin embargo, su papel

es complejo. En P aeruginosa se demostró que el transporte activo de hierro y la

presencia de niveles intracelulares adecuados del mismo son necesarios para la

formación de biofilms (12), además, la limitación de hierro generada por la lactoferrina

lleva a la producción de biofilms con poco espesor (134). Por el contrario, en

Acinetobacter baumannii la formación de biofilms se incrementa en condiciones limitantes

de hierro (140). Hasta el momento no hay publicaciones que describan el efecto del hierro

en la formación de biofilms de S. maltophilia.

Por otra parte, el metabolismo en organismos aeróbicos genera especies reactivas

del oxigeno (ERO), también las células fagocíticas del sistema inmune innato generan

grandes cantidades de ERO, sin embargo, los microorganismos han desarrollado

estrategias para contrarrestar el efecto tóxico que éstas producen. Una estrategia consiste

en sintetizar enzimas antioxidantes cuya regulación está sujeta a señales ambientales.

Con el propósito de estudiar el papel del hierro y la participación del sistema Fur en

la formación de biofilms y la resistencia al estrés oxidativo se realizaron estudios

comparativos entre la cepa K279a y su mutante Fur obtenida por primera vez en S.

maltophilia durante el desarrollo de esta tesis.

1. Efecto de la disponibilidad de hierro en la formación de biofilms y la producción de EPS

El efecto del hierro en la formación de biofilms de S. maltophilia fue evaluado

utilizando el ensayo cuantitativo en microplacas de PS y por microscopía confocal. Para

esto se realizaron cultivos de K279a y su mutante Fur60 en TSB (condición no limitante


95

de hierro) y en TSB suplementado con dipiridilo (Dip 200 µM) para lograr la condición de

limitación de hierro.

1.1. Análisis de biofilms formados en microplacas

Para investigar la participación del sistema Fur en la regulación por hierro de la

formación de biofilms, se utilizó la mutante Fur60 derivada de K279a. Si el sistema Fur

estuviese implicado en la regulación de la formación de biofilms se esperaría que la

mutante Fur, independientemente de la presencia del quelante de hierro en el medio,

forme biofilms con características similares al de la cepa salvaje en condiciones limitantes

de hierro.

La figura 35 muestra la producción de biofilms de 48 h evaluada como la relación

entre la biomasa (tinción con cristal violeta) y la DO546 del crecimiento (DO546 de CV/DO546

del cultivo), que permite independizarse de posibles efectos en el crecimiento generados

por la adición del quelante. La producción de biofilms de K279a en condiciones limitantes

de hierro fue significativamente mayor que la producida en condiciones no limitantes del

mismo (P < 0,05). En medio TSB la producción de biofilm fue mayor en la mutante Fur

que en la cepa salvaje en la misma condición (P < 0,01), además, la producción de biofilm

de Fur60 no fue afectada por el agregado del quelante.

TSB TSB-Dip 200µµµµM0

1

2

3K279aFur60

**

DO

546

de C

V/D

O54

6de

l cul

tivo

Figura 35. Formación de biofilms de S. maltophilia K279a y su mutante Fur60 en microplacas. Los

cultivos en TSB y TSB suplementado con Dip 200 µM se incubaron a 35 ºC por 48 h. La biomasa


96

del biofilm fue cuantificada por tinción con CV. Los resultados se expresan como la media ±

desviación estándar de la relación entre la DO del CV y del crecimiento (DO546 de CV/DO546 del

cultivo) de un experimento representativo.*representa diferencias estadísticamente significativas.

1.2. Análisis de biofilms por CLSM

Para profundizar el análisis del efecto del hierro en la arquitectura de los biofilms

formados sobre superficies abióticas se utilizó CLSM. La misma permite visualizar

muestras totalmente hidratadas y determinar el espesor del biofilm que proporciona una

medida de la extensión espacial del mismo. Para estos estudios se realizaron cultivos en

condiciones limitantes y no limitantes de hierro en las cámaras Lab Tek, Nunc® y los

biofilms formados en la base de dichas cámaras se visualizaron mediante tinción con

Syto9 (Molecular Probes®).

Como se observa en la imagen de un plano x-y (Figura 36) la cepa salvaje K279a

cultivada en condiciones no limitantes de hierro desarrolló una monocapa de células con

microcolonias distribuidas por toda la superficie, mientras que en condiciones limitantes

de hierro formó un biofilm más denso y estructurado. Por otra parte, la mutante Fur, tanto

en presencia como en ausencia del quelante, formó un biofilm más denso y con

microcolonias de mayor tamaño que la cepa salvaje en ausencia de Dip. La proyección en

el eje z de la serie de imágenes obtenidas a partir de los cortes en profundidad permite

analizar el espesor del biofilm. El espesor promedio del biofilm de la cepa salvaje en

condiciones no limitantes de hierro fue de 30 µm mientras que en condiciones limitantes

del mismo fue de 50 µm. Por otra parte, el biofilm de la mutante Fur60 tanto en

condiciones limitantes como no limitantes de hierro presentó mayor espesor (70 µm) que

la cepa salvaje (Figura 36). La reconstrucción tridimensional realizada con el programa

ImageJ permitió revelar la arquitectura del biofilm. En K279a estaba compuesta por

estructuras con forma de picos separados entre sí por canales por los que podría circular

medio de cultivo con el consiguiente intercambio de nutrientes. Se observó que K279a en

presencia de Dip y la mutante Fur en presencia y ausencia del mismo presentaron no solo

picos más altos sino también mayor densidad de los mismos (Figura 37).


97

Figura 36. Imágenes de biofilms de S. maltophilia obtenidas mediante CLSM. Se realizaron

cultivos en las cámaras Lab Tek (de BS) de K279a y su mutante Fur60 en TSB y TSB

suplementado con Dip 200 µM. Luego de 48 h de incubación los biofilms fueron teñidos con

Syto9®. Cada imagen central corresponde a un plano x-y, mientras que las imágenes de la parte

superior y de la derecha de cada plano x-y representan la proyección en el eje z de la serie de

imágenes obtenidas a partir de los cortes en profundidad. La barra representa 20 µm.


98

Figura 37. Reconstrucción tridimensional de la serie de imágenes obtenidas mediante CLSM en

los planos x-y a través del eje z de biofilms de S. maltophilia. Las reconstrucciones fueron

realizadas con el programa ImageJ.

1.3. Producción de EPS

Se evaluó la producción de EPS mediante la técnica de precipitación con etanol y

determinación del peso seco. Para ello, se utilizaron sobrenadantes de cultivos

planctónicos en LB-glu 0,1 % y LB-glu 0,1 % suplementado con Dip 200 µM incubados

con agitación durante 48 h a 35 ºC. La figura 38 muestra que la cepa K279a en

condiciones limitantes de hierro produjo mayor cantidad de EPS (246,3 ± 20,5) que en

condiciones no limitantes del mismo (64,9 ± 3,3). La mutante Fur60 tanto en condiciones

limitantes como no limitantes de hierro produjo mayor cantidad de EPS (225,9 ± 11,5 y

201,1 ± 38,0, respectivamente) que la cepa salvaje en ausencia de Dip.


99

LB-glu 0,1% LB-glu 0,1% Dip 200µµµµM0

100

200

300

K279aFur60

**

EP

S (

µµ µµg)/

biom

asa

(mg)

Figura 38. Producción de EPS de S. maltophilia K279a y su mutante Fur60 cultivadas durante 48

h, a 35 ºC con agitación. Los resultados se expresan como la media ± desviación estándar de la

relación entre el peso seco de las EPS (µg) y el peso seco de la biomasa del cultivo (mg), de un

experimento representativo.*representa diferencias estadísticamente significativas.

El análisis de los componentes químicos de los precipitados obtenidos a partir de

cultivos de K279a y Fur60 en LB-glu 0,1 % realizado mediante la cuantificación de

hidratos de carbono con glucosa como estándar (50) y de proteínas (19) demostró que la

cepa K279a produjo cantidades similares de exopolisacaridos (0,25 ± 0,02) y de proteínas

(0,49 ± 0,03) por mg de peso seco de EPS que la mutante que la mutante (0,26 ± 0,05 y

0,52 ± 0,05, respectivamente) (Tabla 7). Por lo tanto, la relación hidratos de

carbono/proteínas en la EPS es similar para ambas cepas (0,51 y 0,50, respectivamente)


100

Tabla 7. Composición de las EPS de cepas de S. maltophilia

Cepas de

S.

maltophilia

EPS

(µg de EPS/mg

de biomasa)

Análisis químico de EPS

Hidratos de carbono


peso seco de EPS)

Proteínas

(mg de proteínas/mg

de peso seco de EPS)

Relación Hidratos de

carbono/ Proteínas


proteínas)

K279a 64,9 ±3,3 0,25 ± 0,02 0,49 ± 0,03 0,51

Fur60 201,1 ± 38,0 0,26 ± 0,05 0,52 ± 0,05 0,50

Para profundizar el estudio de la composición molecular de las EPS se utilizó

espectroscopia ATR-FTIR en las condiciones descriptas en la Sección IV, ítem 3.

En los espectros de ATR-FTIR de las EPS de K279a y su mutante Fur60 se puede

observar que la intensidad de absorción de todos los picos es similar para ambas cepas,

en concordancia con los resultados del análisis químico de los componentes de los

precipitados (Figura 39). Por lo tanto, la mutante produce mayor cantidad de EPS pero de

la misma composición química que la cepa salvaje.


101

Figura 39. Espectros ATR-FTIR de EPS de K279a (azul) y la mutante Fur60 (rojo). En los

espectros se indican los picos de absorción correspondientes a los grupos funcionales asociados a

lípidos (3100 a 2800 cm-1), proteínas (1700-1500 cm-1) y polisacáridos (1200-900 cm-1).

2. Efecto de la disponibilidad de hierro en la respuesta al estrés oxidativo

2.1. Determinación del tipo de isoenzima de superóxido dismutasa

(SOD)

En muchas especies bacterianas las isoenzimas de SOD están reguladas por la

concentración de hierro en el medio y la tensión de oxigeno (56, 75). Teniendo en cuenta

estos factores, se estudió la presencia de esta enzima mediante electroforesis en geles de

poliacrilamida en condiciones no desnaturalizantes y tinción con NBT. Se utilizaron

extractos de la cepa K279a y su mutante Fur60 cultivadas en TSB suplementado con

diferentes concentraciones de Dip (0, 100 y 200 µM Figura 40 a), Además, en la cepa

salvaje, se evaluó el efecto de la agitación y del tiempo de incubación de los cultivos (12,

24, 48 h Figura 40 b).

En condiciones limitantes y no limitantes de hierro se observó una única banda con

actividad de SOD tanto en la cepa salvaje como en la mutante Fur (figura 40). Los


102

experimentos de inhibición mostraron que la única banda detectada corresponde a la

isoenzima Mn-SOD ya que la actividad enzimática no fue inhibida por H2O2 ni por NaCN,

al igual que el control de Mn-SOD purificada de E. coli (datos no mostrados). Sin

embargo, la movilidad electroforética de la Mn-SOD de K279a fue diferente a la que

presentó la Mn-SOD de E. coli, lo que podría representar diferencias estructurales entre

ambas enzimas.

En la figura 40 b se observa una banda con actividad de SOD en los extractos de

K279a obtenidos a partir de cultivos de 12 h con agitación pero no en los provenientes de

cultivos estáticos. En estos últimos, se observan bandas con actividad SOD a las 24 y 48

h de incubación y las mismas son más tenues que las correspondientes a los cultivos con

agitación. Nuevamente, los experimentos de inhibición mostraron que la única banda

detectada corresponde a la isoenzima Mn-SOD.

Figura 40. Actividad de SOD en geles nativos revelados con NBT. a) Extractos de K279a y Fur60

obtenidos de cultivos en TSB y TSB suplementado con Dip100 y 200 µM. b) Extractos de K279a

obtenidos de cultivos estáticos (Es) y con agitación (Ag) en TSB, de 12, 24 y 48 h de incubación. P:

Mn-SOD purificada de E. coli.

2.2. Actividad de SOD en cultivos planctónicos y biofilms

Se realizaron estudios comparativos de la actividad de SOD en extractos

provenientes de células de cultivos planctónicos y biofilms de K279a y de Fur60 en

condiciones limitantes y no limitantes de hierro. Los biofilms se formaron en placas de


103

cultivo celular de 12 pocillos, ya que las microplacas de 96 pocillos no permiten recuperar

las cantidades de biomasa necesaria para los estudios de actividad enzimática. Se utilizó

la técnica de Beauchamp y Fridovich (15) con las modificaciones descriptas en materiales

y métodos. La actividad de SOD se expresa en unidades de SOD/mg de proteínas totales

(Figura 41).

Los extractos provenientes del biofilm de la cepa salvaje cultivada en condiciones no

limitantes de hierro presentaron la menor actividad de SOD observada (12,06 ± 0,5), la

limitación de hierro generada por el agregado de Dip produjo un incremento significativo

de la misma (19,6 ± 1,4) (P < 0,05). Por otra parte, la mutante Fur60 en condiciones

limitantes y no limitantes de hierro presentó una actividad de SOD (22,06 ± 0,7 y 18,20 ±

0,5, respectivamente) mayor que la de K279a cultivada en ausencia de Dip (P < 0,01).

En los extractos provenientes de células obtenidas de cultivos planctónicos se

observó el mismo perfil de actividad, K279a cultivada en condiciones no limitantes de

hierro presentó la menor actividad de SOD (16,4 ± 2,0), la cual se incrementó

notoriamente en presencia de Dip (32 ± 1,4). En ambas condiciones la mutante Fur60

presentó valores de actividad de SOD mayores que los de K279a en TSB (27,7 ± 3,08 y

26,9 ± 0,41, respectivamente).

En ambas condiciones de cultivo evaluadas la actividad SOD en extractos

provenientes de biofilms fue menor que en los de su contraparte planctónica.

K279a K279a Dip Fur60 Fur60 Dip0

10

20

30

40BiofilmPlanctónico

*

**

** **

*

U S

OD

/mg

prot

eina

s to

tale

s


104

Figura 41. Actividad de SOD de extractos crudos obtenidos a partir de células provenientes de

cultivos planctónicos y biofilms de S. maltophilia. Los cultivos fueron realizados en TSB y TSB

suplementado con Dip 200 µM e incubados durante 48 h a 35 °C. Los resultados se expresan

como la media ± desviación estándar de la relación entre las U de SOD y las proteínas totales, de

un experimento representativo.*representa diferencias estadísticamente significativas.

2.3. Niveles de especies reactivas del oxigeno (ERO) en el biofilm

Los niveles de ERO en biofilms de S. maltophilia se evaluaron mediante el ensayo de

NBT en biofilms formados en microplacas de PS (2, 7). En presencia de anión superóxido

la reducción del NBT a azul de formazán es proporcional a los niveles del mismo en el

medio (15).

El biofilm de K279a formado en condiciones no limitantes de hierro presentó niveles

de ERO 2,5 veces mayores que en presencia de Dip, estos últimos fueron similares a los

de los biofilm de Fur60 formado en condiciones limitantes y no limitantes de hierro (P <

0,01) (Figura 42). Estos resultados concuerdan con la actividad de SOD evaluada

anteriormente.

TSB TSB-Dip 200µµµµM0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5K279a

Fur60*

*

DO

546

de N

BT/

Bio

mas

a(C

V/D

O)

Figura 42. Determinación de las ERO de biofilms de S. maltophilia. Los cultivos en TSB y TSB

suplementado con Dip 200 µM fueron incubados durante 48 h a 35 °C en condiciones estáticas.

Los resultados se expresan como la media ± desviación estándar de la relación entre la DO546 de


105

NBT y la biomasa del biofilm evaluada como la relación entre la DO546 de CV y la DO546 del

crecimiento, de un experimento representativo.*representa diferencias estadísticamente

significativas.

3. Evaluación del efecto del hierro en la producción de DSF

Los resultados presentados indican que en S. maltophilia K279a el QS y el hierro, a

través del sistema Fur, están implicados en la formación de biofilms y en la resistencia al

estrés oxidativo. La expresión de dichas propiedades podría ser la resultante de la

interacción de ambas señales regulatorias. Para investigar la eventual relación entre

ambas señales, se evaluó el efecto del hierro en la producción de DSF. Para este

propósito se utilizó el bioensayo descripto por Barber et al (13) que detecta la molécula de

DSF presente en extractos de sobrenadantes de cultivo por la restauración de la

producción de endoglucanasa, una enzima regulada por QS, en una mutante rpfF de Xcc.

Los resultados se expresan como la relación entre las U de endoglucanasa y el

crecimiento bacteriano.

Se realizaron cultivos en el medio SSC y SSC suplementado con FeCl3 100 µM que

representan la condición limitante y no limitante de hierro, respecivamente. En estos

experimentos no se puede utilizar Dip porque en el proceso de extracción también se

extrae el quelante, que actúa como inhibidor del crecimiento de la cepa reportera.

En condiciones de limitación de hierro se produjo un aumento estadísticamente

significativo (P < 0,05) de la producción de la molécula señal en la cepa K279a (18,7 ±

0,6) respecto a cuando crece en condiciones no limitantes de hierro (16,2 ± 0,4). Por su

parte, la mutante Fur60, en ambas condiciones, produjo cantidades de DSF

significativamente mayores (17,9 ± 0,5 y 18,1 ± 0,5, respectivamente. Figura 43.) que la

cepa salvaje en condiciones no limitantes de hierro (P < 0,05).


106

K279aSSC+Fe3+ K279a SSC F60SSC+Fe3+ F60 SSC14

16

18

20 **

U d

e en

dogl

ucan

asa/

DO

540

Figura 43. Evaluación de la producción de DSF por S. maltophilia mediante el ensayo de Barber et

al (13). Se obtuvieron extractos a partir de cultivos estáticos incubados a 35 °C por 48 h de K279a

y Fur60 en condiciones limitantes (SSC) y no limitantes de hierro (SSC FeCl3 100 µM). Los

resultados se expresan como la media ± desviación estándar de la relación entre las U de

endoglucanasa y el crecimiento bacteriano de un experimento representativo.*representa

diferencias estadísticamente significativas.

4. Evaluación de la virulencia en el modelo de infección de Galleria

mellonella

Con el objetivo de evaluar el efecto que produce la mutación del gen fur sobre la

virulencia de S. maltophilia se utilizó el modelo de infección del lepidóptero G. mellonella.

Se utilizó la dosis de 105 ufc/larva para estudios comparativos entre la cepa K279a y su

mutante Fur60. La cepa K279a resultó letal para un 20 % de la población a las 48 h y para

el 40 % a las 96 h. La mutante Fur60 fue significativamente (P < 0,006) más virulenta ya

que produjo la muerte del 60 % de de la población a las 48 h y alcanzó el 80 % de

letalidad a las 96 h (Figura 44 y 45).


107

0 20 40 60 80 1000

20

40

60

80

100K279aFur60

Tiempo (h)

Sup

ervi

venc

ia (

%)

Figura 44. Ensayo de infección en larvas de Galleria mellonella. Luego de la inyección de 10 a 13

larvas por cepa con la dosis de 105 ufc/larva se registró diariamente el número de individuos

sobrevivientes y se graficaron las curvas de Kaplan-Mayer. El grupo control de larvas inyectadas

con solución fisiológica no presentó individuos muertos (datos no graficados). Los datos

corresponden a un experimento representativo. El análisis estadístico se realizó con el método de

Log-rank. Los datos corresponden a un experimento representativo.


108

Figura 45 . Larvas de G. mellonella a) inmediatamente después de ser inyectadas y b) luego de 96

h de haber sido inyectadas con la dosis 105 ufc/larva de una suspensión de Fur60. Durante la

infección las larvas desarrollan una progresiva melanización hasta morir.

5. Discusión

El hierro es una señal que regula la formación de biofilms en muchas especies

bacterianas, sin embargo, su papel es controversial. Mientras que en Legionella

pneumophila y en Staphylococcus aureus la limitación de hierro actúa induciendo la

formación de biofilms (79, 87) en otras especies, tales como Vibrio cholerae actúa

inhibiéndola (102). Más aún, la regulación por hierro es compleja incluso dentro de la

misma especie. En P. aeruginosa, la limitación de hierro bloquea las etapas tempranas de

la formación de microcolonias, y la actividad quelante de la lactoferrina humana disminuye

la formación de biofilms (12). Sin embargo, altas concentraciones de hierro también

inhiben la formación de biofilms y causan la dispersión de los ya formados (107). En

consecuencia, la formación de biofilms en P. aeruginosa ocurre dentro de un rango

limitado de concentraciones de hierro (1–100 µM) (108).

Los resultados presentados muestran que la limitación de hierro incrementa la

formación de biofilms de S. maltophilia. Dicha limitación produjo además, profundos

cambios en la estructura tridimensional del biofilm de K279a analizada por CLSM, la cual

se caracterizó por una mayor densidad celular y mayor organización espacial con picos de

mayor altura (Figura 36 y 37). Por su parte, la mutante Fur60 en condiciones limitantes y

no limitantes de hierro produjo mayor biomasa de biofilms, con mayor cantidad de picos

de mayor altura que los de la cepa salvaje en condiciones no limitantes de hierro. Por

tanto, el sistema Fur participa, al menos en parte, en la regulación de la formación de

biofilms de S. maltophilia.

En P. aeruginosa el sistema Fur regula numerosos genes involucrados en la

formación de biofilms y la virulencia (16, 71). La limitación de hierro produce un aumento

de la transcripción de genes que codifican alginato (EPS), autoinductores y factores de

virulencia tales como proteasas, sideróforos y superóxido dismutasa (Mn-SOD) (16, 146).

En S. maltophilia, la producción de EPS también se vio afectada por la

disponibilidad de hierro. En presencia de Dip la cepa K279a, al igual que la mutante Fur

en ambas condiciones de cultivo, produjo mayor cantidad de EPS que en condiciones no


109

limitantes de hierro (Figura 38). Además, a diferencia de lo observado en la mutante

K279arpfF (seción IV ítem 3), la composición relativa de proteínas y polisacáridos de las

EPS de la mutante Fur fue similar a la de las EPS de la cepa salvaje (Tabla 7) y los

espectros de ATR-FTIR corroboraron dicha similitud (Figura 39). Estos resultados

sugieren que el hierro a través del sistema Fur participa en la producción de EPS, un

importante componente estructural de la matriz de los biofilms. Esto concuerda con lo

reportado en P. aeruginosa donde se demostró que mutantes Fur producen niveles de

alginato mayores que la cepa salvaje (71).

Para comenzar a estudiar la influencia del hierro en la resistencia al estrés

oxidativo, se investigó la presencia de isoenzimas de SOD en S. maltophilia. Los

experimentos de inhibición, en diferentes condiciones de cultivo, mostraron que la cepa

K279a posee solo la isoenzima Mn-SOD. Al analizar el genoma de K279a se encontraron

varios genes que codificarían para SOD, 2 genes sodA (Smlt2828 y Smlt3238)

codificantes de Mn-SOD, el gen sodB (Smlt1616b) que codificaría para la isoenzima Fe-

SOD, el gen sodC (Smlt0161) que codificaría para una Cu/Zn-SOD. Sin embargo, los

productos de los genes sodB y sodC no fueron detectados en las condiciones

experimentales utilizadas. Los resultados presentados sugieren que solo el o los genes

sodA se expresan en K279a, en concordancia con un estudio previo que demostró que la

cepa S. maltophilia WZ2 produce solo Mn-SOD (98). De esta forma, al ser la isoenzima

Mn-SOD la única presente en K279a, se puede evaluar la regulación por hierro de SOD

mediante la actividad de la enzima en extractos crudos.

Los estudios comparativos realizados entre la cepa K279a y Fur60 en presencia y

ausencia de Dip mostraron que la limitación de hierro produjo un incremento

estadísticamente significativo en la actividad SOD de la cepa salvaje tanto en cultivos

planctónicos como en biofilms (Figura 41). En consecuencia, el sistema Fur en presencia

de hierro regularía negativamente la transcripción del gen sodA de S. maltophilia. Estos

resultados concuerdan con los de Hassett et al., quienes demostraron que mutantes Fur

de P. aeruginosa presentan un incremento en la actividad de Mn-SOD y catalasa pero una

reducción en la actividad de SOD total (74). También en E. coli la limitación de hierro

incrementa la expresión de Mn-SOD (70).

En todas las condiciones de cultivo evaluadas la actividad SOD en células

provenientes del biofilm fue menor que en las de su contraparte planctónica (Figura 41).


110

La menor expresión de la enzima en el biofilm podría ser la resultante de una menor

actividad metabólica. La limitación de hierro condujo a una mayor actividad de SOD y

consecuentemente, los niveles de ERO del biofilm fueron menores (Figura 42). En

conclusión, la limitación de hierro protege al biofilm del estrés oxidativo, probablemente al

favorecer la expresión de la isoenzima Mn-SOD.

Para investigar la eventual regulación por hierro de la señal de QS se evaluó la

producción de DSF en cultivos planctónicos de K279a y de su mutante Fur en condiciones

limitantes y no limitantes de hierro. Los resultados demuestran que el hierro, a través del

sistema Fur, es una señal que regula negativamente la síntesis de DSF.

Se han descripto diferentes interacciones entre el hierro, a través del sistema Fur, y el

QS en varias especies bacterianas. En Pseudomonas syringae una mutación en la

proteína Fur redujo la producción del autoinductor, una acil homoserino lactona (33). En

Vibrio vulnificus se demostró que el complejo hierro-Fur regula negativamente la

expresión del gen smcR que codifica un regulador de respuesta de QS similar a LuxR de

V. harveyi (92) y de esta forma coordinan la expresión de factores de virulencia. En P.

aeruginosa la limitación de hierro produce un aumento de la producción del autoinducor

de uno de sus sistemas de QS denominado pseudomonas quinolona (PQS), el cual regula

positivamente la expresión de enzimas extracelulares, metabolitos secundarios y factores

de virulencia. (113).

La mayor virulencia de la mutante Fur en el modelo de G. mellonella correlaciona con

su mayor capacidad de formar biofilms y con su mayor resistencia al estrés oxidativo.

Los resultados presentados en la Sección IV y V indican que en S. maltophilia K279a

los genes relacionados con la formación de biofilms y con la producción de otros

potenciales factores de virulencia están regulados positivamente por QS, y negativamente

por concentraciones no limitantes de hierro, a través del sistema Fur. Además, en esta

tesis se comprobó por primera vez la relación entre el sistema Fur-hierro y el sistema de

QS mediado por DSF en S. maltophilia.

Conclusiones

Conclusiones

112

El análisis de los resultados obtenidos durante el desarrollo de esta Tesis permitió

elaborar las siguientes conclusiones:

Tipificación de aislamientos locales de S. maltophilia recuperados de infecciones

asociadas al uso de productos médicos

� El sistema API20NE resultó de utilidad para confirmar la identificación de los

aislamientos de S. maltophilia pero fue de escasa utilidad para la tipificación de los

mismos ya que solo permitió agruparlos en 3 biocódigos

� Las técnicas de tipificación molecular ERIC-PCR y REP-PCR generaron perfiles

reproducibles y altamente discriminatorios. Las mismas revelaron una gran

heterogeneidad genética entre los aislamientos locales de S. maltophilia,

sugiriendo que la mayoría de los episodios nosocomiales fueron independientes.

Estas técnicas, junto con la información epidemiológica, son útiles para la

tipificación de aislamientos de esta especie, aunque aquellos con perfiles

indistinguibles deben ser analizados con la técnica de PFGE, que posee un mayor

poder discriminatorio.

Producción de potenciales factores de virulencia en aislamientos locales de S.

maltophilia

� La capacidad de formar biofilms es un importante factor de virulencia bacteriano.

Todos los aislamientos locales, salvo Sm61 que no forma biofilms, produjeron

biofilms fuertes.

� Los 63 aislamientos estudiados fueron lipolíticos y proteolíticos, aunque solo en el

82,53 % se detectó el gen stmPr1 que codifica la principal proteasa.

� La producción de sideróforos se detectó en todos los aislamientos clínicos gracias

a las modificaciones realizadas al medio empleado en la técnica en placa CAS

agar. Las modificaciones consistieron en reemplazar el medio M9 por SS con el

agregado de casamino ácidos y Dip (SSC-CAS-Dip).

Conclusiones

113

� El gen narG, codificante de una nitrato reductasa, se detectó en el 60,31 % de los

aislamientos. La presencia del gen narG y la capacidad de reducir nitrato (57,1 %),

relacionadas con el crecimiento en microaerofilia, detectadas en los aislamientos

de S. maltophilia facilitaría el crecimiento en biofilms, y de esta forma

incrementaría la patogenicidad.

� Los aislamientos mostraron diferentes niveles de resistencia al estrés oxidativo, el

52,38 % presentó alta resistencia al estrés oxidativo.

� El modelo de infección de Galleria mellonella permitió comparar la virulencia de

algunos aislamientos locales de S. maltophilia, seleccionados en función de sus

potenciales factores de virulencia, y de K279a. En este modelo se evidenciaron

tres niveles de virulencia y el efecto letal mostró correlación con la resistencia al

estrés oxidativo.

Sistema de captación de hierro de alta afinidad de S. maltophilia K279a y su

regulación por el sistema Fur

� Se obtuvieron por primera vez en S. maltophilia mutantes espontaneas Fur de

K279a. Los clones Fur42 y Fur60 presentaron una mutación puntual. Fur42

presentó una mutación que causa la sustitución de un único aminoácido (Asp�Gly

en la posición 5) y Fur60 presentó una mutación en la secuencia -10 de la región

promotora putativa (T�C). Las mutantes Fur produjeron sideróforos en forma

constitutiva, lo que sugiere la falta de regulación por el sistema Fur-Fe2+.

� Se detectaron dos OMPs de K279a cuya expresión está regulada por el sistema

Fur-Fe2+. Estas OMPs fueron identificadas por espectrometría de masa como

FepA, un potencial receptor de enterobactina, y CirA, un potencial receptor de

colicina I de K279a. Estos receptores permitirian la captación del complejo hierro-

enterobactina y de los productos de degradación lineales de dicho complejo

respectivamente. CirA actuaría como una vía alternativa para incorporar hierro.

Mediante análisis in silico se determinaron las potenciales cajas Fur de fepA y cirA.

Finalmente, se obtuvo una secuencia consenso de la caja Fur putativa de K279a.

� Todos los aislamientos locales de S. maltophilia y la cepa K279a produjeron

sideróforos de tipo catecol en condiciones limitantes de hierro y no produjeron

sideroforos de tipo hidroxamato.

Conclusiones

114

� El análisis por TLC y la separación mediante HPLC sugieren que el sideróforo

producido por S. maltophilia es enterobactina. Se profundizará el estudio mediante

espectrometría de masa y resonancia magnética nuclear para confirmar la

identificación del sideróforo.

Función del sistema de señalización rpfF /DSF en la formación de biofilms y en la

virulencia de S. maltophilia

� La mutación en el gen rpfF de la cepa K279a produjo efectos pleiotrópicos que

afectaron características que participan en diferentes etapas de la formación de

biofilms. Entre estos efectos, la mutación produjo una marcada disminución de la

cosecha máxima y de la velocidad de crecimiento, fundamentalmente en

condiciones estáticas con baja tensión de oxígeno, y produjo la disminución de la

movilidad tipo “twitching” y de la hidrofobicidad superficial.

� La mutación en el gen rpfF impacta negativamente en la capacidad de formar

biofilms sobre diferentes superficies desde la adhesión inicial. El análisis por

CLSM reveló que la cepa salvaje, luego de 48 h de incubación, forma estructuras

tridimensionales características de un biofilm maduro, con canales de agua entre

ellas. La mutante K279arpfF no mostró un crecimiento confluente sino que formó

un gran número de agregados celulares dispersos y no desarrolló una estructura

tridimensional. Sin embargo, la presencia de DSF comercial restauró parcialmente

la capacidad de formar biofilms de la mutante.

� Una parte fundamental del biofilm es su matriz de EPS que le otorga resistencia

frente a distintos biocidas. La cuantificación de hidratos de carbono y de proteínas,

y el análisis por espectroscopia ATR-FTIR revelaron que la mutación en el gen

rpfF produce un cambio en la composición relativa de los compuestos presentes

en las EPS. La cepa K279a produjo mayor cantidad de exopolisacáridos por mg de

EPS que la mutante, mientras que la mutante produjo cantidades mayores de

proteínas.

� La disrupción del gen rpfF también afectó la producción de otros potenciales

factores de virulencia. La misma produjo la pérdida de la actividad de DNasa y

lipasa y una marcada disminución en la resistencia al peróxido de hidrogeno.

Previamente, Fouhy et al (62) demostraron que la mutación en el gen rpfF produce

una disminución de la actividad de proteasa.

Conclusiones

115

� La mutante rpfF, a diferencia de la cepa salvaje, no mostró efecto letal en el

modelo de virulencia de G. mellonella, lo cual correlaciona con su menor

capacidad de formar biofilms, con la ausencia de actividad de las exoenzimas

proteasa, lipasa y DNasa, y con su menor resistencia al estrés oxidativo.

Función del hierro en la formación de biofilms y en la resistencia al estrés oxidativo de S. maltophilia

� El hierro es una señal que regula negativamente la producción de EPS y la

formación de biofilms de K279a. La limitación de hierro incrementó no solo la

biomasa del biofilm sino también su estructura tridimensional determinada por

CLSM. La utilización de la mutante Fur60 reveló que dicho efecto depende del

sistema Fur.

� En la cepa K279a solo se detectó la isoenzima Mn-SOD aunque su genoma posee

también los genes sodB y sodC. La limitación de hierro condujo a una mayor

actividad de la isoenzima Mn-SOD en cultivos planctónicos y biofilms. Además, en

dicha condición, los niveles de ERO del biofilm también fueron menores. El

sistema Fur en presencia de hierro regularía negativamente la transcripción del

gen sodA de S. maltophilia. En conclusión, la limitación de hierro protegería al

biofilm del estrés oxidativo, al favorecer la expresión de la isoenzima Mn-SOD.

� El hierro, a través del sistema Fur, es una señal que regula negativamente la

síntesis de DSF.

� La mutación en el gen fur aumentó la virulencia de K279a en el modelo de G.

mellonella. La mayor virulencia de la mutante Fur60 correlaciona con su mayor

capacidad de formar biofilms y con su mayor resistencia al estrés oxidativo.

Conclusión final

En S. maltophilia K279a la formación de biofilms y la producción de otros

potenciales factores de virulencia están reguladas positivamente por el sistema de

señalización rpfF/DSF, y negativamente por concentraciones no limitantes de hierro, a

través del sistema Fur. Además, en esta tesis se comprobó por primera vez la relación

entre el sistema Fur-Fe2+ y el sistema de QS mediado por DSF en S. maltophilia.

La importancia del hierro como señal nos condujo a estudiar el sistema de

captación del mismo en S. maltophilia. El mismo está compuesto por los receptores de

Conclusiones

116

membrana externa FepA y CirA, regulados por el sistema Fur-hierro, responsables de

internalizar el sideróforo de S. maltophilia.

Resumen

Resumen

118

Stenotrophomonas maltophilia es un patógeno nosocomial emergente

multiresistente. El gen rpfF es responsable de la síntesis de DSF, su señal de quorum

sensing (QS). Para estudiar el papel del QS y del hierro en la formación de biofilms y la

producción de otros potenciales factores de virulencia, se utilizaron las cepas K279a y su

mutante K279arpfF y mutantes Fur (“ferric uptake regulator”) espontáneas obtenidas por

primera vez en S. maltophilia por nuestro grupo de trabajo. Además, se estudiaron 63

aislamientos locales provenientes de infecciones asociadas al uso de productos médicos.

Las técnicas de tipificación molecular ERIC-PCR y REP-PCR generaron perfiles

reproducibles y altamente discriminatorios. Las mismas revelaron una gran

heterogeneidad genética entre los aislamientos locales de S. maltophilia.

Se estudió la producción de potenciales factores de virulencia en los aislamientos

locales de S. maltophilia. La capacidad de formar biofilms es un importante factor de

virulencia bacteriano. La producción de sideróforos se detectó en todos los aislamientos

clínicos gracias a las modificaciones realizadas en la técnica en placa CAS agar. Se

detectó la presencia del gen narG codificante de una nitrato reductasa en el 60,31% de

los aislamientos, y del gen stmPr1, que codifica la principal proteasa, en el 82,53%,

mientras que el 52,38% presentó alta resistencia al estrés oxidativo. En el modelo de

virulencia de Galleria mellonella el efecto letal mostró correlación con la resistencia al

estrés oxidativo.

Se profundizó el estudio sobre los sideróforos y el sistema de captación de hierro de

alta afinidad de S. maltophilia, y su regulación por el sistema Fur. Todos los aislamientos

locales y K279a produjeron sideróforos de tipo catecol. El análisis por TLC y la separación

mediante HPLC sugieren que el sideróforo producido por S. maltophilia es enterobactina.

Para estudiar la posible regulación por el sistema Fur-Fe2+ se obtuvieron por primera

vez en S. maltophilia mutantes espontaneas Fur de K279a que produjeron sideróforos en

forma constitutiva, lo que sugiere la falta de regulación por el sistema Fur-Fe2+. Se

detectaron dos OMPs de K279a cuya expresión está regulada por el sistema Fur-Fe2+.

Estas OMPs fueron identificadas por espectrometría de masa como FepA, un potencial

receptor de enterobactina, y CirA, un potencial receptor de colicina I de K279a. Estos

receptores permitirían la captación del complejo hierro-enterobactina y de los productos

de degradación lineales de dicho complejo respectivamente. CirA actuaría como una vía

Resumen

119

alternativa para incorporar hierroOtros de los objetivos fue estudiar la función del sistema

de señalización rpfF/DSF en la formación de biofilms y en la virulencia de S. maltophilia.

La mutación en el gen rpfF de K279a produjo efectos pleiotrópicos que afectaron

características que participan en diferentes etapas de la formación de biofilms. Entre estos

efectos, produjo la disminución de la movilidad tipo “twitching” y de la hidrofobicidad

superficial.

La mutación en el gen rpfF impactó negativamente en la capacidad de formar

biofilms sobre diferentes superficies desde la adhesión inicial. El análisis por CLSM reveló

que la cepa salvaje forma estructuras tridimensionales características de un biofilm

maduro, con canales de agua entre ellas. La mutante K279arpfF no mostró un crecimiento

confluente ni desarrolló una estructura tridimensional. Sin embargo, la presencia de DSF

comercial restauró parcialmente la capacidad de formar biofilms de la mutante.

Una parte fundamental del biofilm es su matriz de EPS que le otorga resistencia

frente a distintos biocidas. El análisis por espectroscopia ATR-FTIR revelaron que la

mutación en el gen rpfF produce un cambio en la composición relativa de los compuestos

presentes en las EPS. La cepa K279a produjo mayor cantidad de exopolisacáridos por mg

de EPS que la mutante, mientras que la mutante produjo cantidades mayores de

proteínas.

La disrupción del gen rpfF también produjo la pérdida de la actividad de DNasa y

lipasa y una marcada disminución en la resistencia al peróxido de hidrogeno. En

consecuencia, K279arpfF, a diferencia de la cepa salvaje, no mostró efecto letal en el

modelo de virulencia de G. mellonella.

Por último se estudió la función del hierro en la formación de biofilms y en la

resistencia al estrés oxidativo de S. maltophilia. El hierro es una señal que regula

negativamente la producción de EPS y la formación de biofilms de K279a. La limitación de

hierro incrementó no solo la biomasa del biofilm sino también su estructura tridimensional

determinada por CLSM. La utilización de la mutante Fur60 reveló que dicho efecto

depende del sistema Fur.

En K279a solo se detectó la isoenzima Mn-SOD y la limitación de hierro condujo a

una mayor actividad de Mn-SOD en cultivos planctónicos y biofilms. Dicha limitación

protegería al biofilm del estrés oxidativo, al favorecer la expresión de la isoenzima Mn-

SOD.

Resumen

120

La mutación en el gen fur aumentó la virulencia de K279a en el modelo de G.

mellonella. La mayor virulencia de la mutante Fur60 correlaciona con su mayor capacidad

de formar biofilms y con su mayor resistencia al estrés oxidativo.

Los resultados presentados muestran que el hierro, a través del sistema Fur, es una

señal que regula negativamente la síntesis de DSF.

En conclusión, en S. maltophilia la formación de biofilms y la producción de otros

potenciales factores de virulencia están reguladas positivamente por el sistema de

señalización rpfF/DSF, y negativamente por concentraciones no limitantes de hierro, a

través del sistema Fur. Además, en esta tesis se comprobó por primera vez la relación

entre el sistema Fur-hierro y el sistema de QS mediado por DSF en S. maltophilia.

Publicaciones

Publicaciones

122

Publicaciones con referato

Los resultados obtenidos durante el desarrollo de esta Tesis dieron lugar a la siguiente publicación:

García C, Passerini de Rossi B, Alcaraz E, Vay C, Franco M. 2012. “Siderophores of Stenotrophomonas maltophilia : detection and determination of their chemical nature”. Rev Argent Microbiol 44: 150-154. ISSN 0325-7541.

Recientemente hemos recibido una invitación del editor Dr. José Martinez para participar del tópico de investigación "A multidisciplinary look at Stenotrophomonas maltophilia: an emerging multi-drug-resistant global opportunistic pathogen.”,a publicarse en Frontiers in Microbiology, El resumen “Iron is a signal for Stenotrophomonas maltophilia biofilm formation, oxidative stress response, OMPs expression and virulence” ha sido aceptado y próximamente enviaremos el manuscrito para su evaluación.

Parte de los resultados de esta tesis permitieron desarrollar otras líneas de trabajo en las que se investigaron la actividad de antimicrobianos sobre biofilms y el papel de DSF como señal inter especie. Estos estudios dieron lugar a las siguientes publicaciones:

Passerini de Rossi B., García C., Calenda M., Vay C., Franco M. 2009. “Activity of levofloxacin and ciprofloxacin on biofilms and plan ktonic cells of Stenotrophomonas maltophilia isolates from patients with device-associated infections” . Int. J. Antimicrob. Agents 34: 260-264. ISSN 0924-8579.

Passerini de Rossi B., García C., Alcaraz E., Franco M. 2014. “ Stenotrophomonas maltophilia interferes via the DSF-mediated quorum sensing syst em with Candida albicans filamentation and with its planktonic and biofilm modes of growth”. Rev Argent Microbiol. Aceptado para su publicación el 29/10/2014.

Presentaciones en Congresos

� XI Congreso Argentino de Microbiología. Organizador: Asociación Argentina de Microbiología. Córdoba, Argentina, 10-12 de Octubre de 2007. “Tipificacion molecular de aislamientos de Stenotrophomonas maltophilia proveniente de un hospital universitario por ERIC-PCR” . Passerini de Rossi B, Garcia C, Vay C, Franco M. Revista Argentina de Microbiología, Vol. 39, Suplem ento Nº1 Año 2007.

Publicaciones

123

� XIII Jornadas Argentinas de Microbiología. Organizador: Asociación Argentina de Microbiología. Rosario, Argentina, 9-11 de Octubre de 2008. “Efectos pleiotrópicos de una mutación en el gen que codific a la señal de quorum sensing en Stenotrophomonas maltophilia ”. Passerini de Rossi B; Garcia C; Calenda M; Durán L; Feldman L; Franco M.

� XII Congreso Argentino de Microbiología. Organizador: Asociación Argentina de Microbiología. Buenos Aires, Argentina, 17-20 de Octubre de 2010. “ Stenotrophomonas maltophilia interfiere en la formación del tubo germinal y el crecimiento de Candida albicans a través de su señal de quorum sensing” Passerini de Rossi B, Feldman L, Saliba Pineda M, Garcia C, Franco M. Revista Argentina de Microbiología, Vol. 42, Suplemento Nº1 Año 2010.

� XII Congreso Argentino de Microbiología. Organizador: Asociación Argentina de Microbiología. Buenos Aires, Argentina, 17-20 de Octubre de 2010. “Estudio de la producción de sideróforos en aislamientos clínicos de Stenotrophomonas maltophilia ” Garcia C, Passerini de Rossi B, Feldman L, Saliba Pineda M, Vay C, Franco M. Revista Argentina de Microbiología, Vol. 42, Suplem ento Nº1 Año 2010.

� VII Congreso Argentino de Microbiología General. SAMIGE del Bicentenario. San Miguel de Tucumán, Tucumán, Argentina, 18-20 de Mayo de 2011. “Role of iron on biofilm formation of wild type and fur mutants of Stenotrophomonas maltophilia” García C, Passerini de Rossi B, Alcaraz E, Pradelli C, Vay C, Franco M.

� XIV Jornadas Argentinas de Microbiología, III Jornada de Microbiología e Infectología del NEA. Organizador: Asociación Argentina de Microbiología, Filial NEA, Resistencia, Chaco, Argentina 29 de septiembre al 1 de octubre de 2011. “Influencia del hierro en la respuesta al estrés ox idativo de cultivos planctónicos y biofilms de Stenotrophomonas maltophilia ” . C. García, B. Passerini de Rossi, E. Alcaraz, C. Pradelli, M. Franco.

� XIV Jornadas Argentinas de Microbiología, III Jornada de Microbiología e Infectología del NEA. Organizador: Asociación Argentina de Microbiología, Filial NEA, Resistencia, Chaco, Argentina 29 de septiembre al 1 de octubre de 2011. “La señal de quorum sensing de Stenotrophomonas maltophilia interfiere con la transición morfológica de Candida albicans y con la viabilidad de la forma miceliar.” B. Passerini de Rossi, L. Feldman, M. Saliba Pineda, C. García, M. Franco.

� VIII Congreso de Microbiología General. SAMIGE. Mar del Plata, Pcia. de Buenos Aires, Argentina, 4-6 de Julio de 2012. “Influence of oxygen availability and growth phase on the activity of superoxide dismutas e in Stenotrophomonas maltophilia.” C. García, B. Ferraris Rostock, B. Passerini de Rossi, M. Franco

� VIII Congreso de Microbiología General. SAMIGE. Mar del Plata, Pcia. de Buenos Aires, Argentina, 4-6 de Julio de 2012. “Quorum sensing cross-kingdom interactions: Stenotrophomonas maltophilia and Candida albicans biofilms”. B. Passerini de Rossi, C. Pradelli, E. Alcaraz, C. Garcia, M. Franco. Comunicación oral.

� XIII Congreso Argentino de Microbiología. Organizador: Asociación Argentina de Microbiología. Buenos Aires, Argentina, 23-26 de Septiembre de 2013. “Caracterización de proteínas de membrana externa r eguladas por hierro en

Publicaciones

124

Stenotrophomonas maltophilia ” Garcia C, Passerini de Rossi B, Dassoy L, Franco M. Comunicación oral. Revista Argentina de Microbiología, Vol. 45, Suplemento Nº1 Año 2013.

� X Congreso de Microbiología General. SAMIGE. Mar del Plata, Pcia. de Buenos Aires, Argentina, 2-4 de Julio de 2014. “Impact of quorum sensing and iron signals on biofilm architecture and virulence of Stenotrophomonas maltophilia”. C. García, E. Alcaraz, Y. Figueroa, R. Romero, B. Passerini de Rossi, M. Franco. Comunicación oral.

125

Anexo I

Medios de cultivo

Stainer-Scholte suplementado con casamino ácidos 0, 1% (SSC)

� L-glutamato 10 g/l

� L prolina 0,24 g/l

� NaCl 2,5 g/l

� PO4H2K 0,5 g/l

� KCl 0,2 g/l

� MgCl2.6 H2O 0,1 g/l

� Tris 12,6 mM

� CaCl2 0,03 g/l

� Casamino Acidos (Difco) 0,1%

CAS-HDTMA-Fe que se agrega al medio SSC

� 605 mg Cromo azurol S (Sigma Aldrich) disuelto en 500 ml de agua

� 100 ml 1mM FeCl3.6 H2O (Sigma Aldrich) en 10 mM HCl

� 729 mg Hexadeciltrimetilamonio bromuro (HDTMA) (Fluka) en 400 ml de agua

MMXC:

� K2HPO4 10,5g/l

� KH2PO4 4,5g/l

� (NH4)2SO4 1g/l

� Hidrolizado de caseína 1,5g/l

� MgSO4 1mM

� Citrato de sodio 0,5g/l

CMC agar

� CMC 0,125%

� Buffer KH2PO4/K2HPO4, 50 mM pH 6,0

� Agar-agar 1,5%

NYGB: Medio liquido rico para Xanthomonas campestris

� Difco peptona 5g/l

� Extracto de levadura 3g/l

� Glicerol 20g/l

�

126

NYGA

� Difco peptona 5g/l

� Extracto de levadura 3g/l

� Glicerol 20g/l

� Agar-agar 1,5%

LB

• Triptona 10 g/l

• Extracto de levadura 5 g/l

• NaCl 5 g/l

LB Glucosa

� Triptona 10 g/l

� Extracto de levadura 5 g/l

� NaCl 5 g/l

� Glucosa 1 g/l

Caldo nitrato

� Extracto de carne 3 g/l

� Peptona 5 g/l

� Nitrato de potasio 1 g/l

� pH:7,00

Reactivo de Griess:

� Solucion A: Acido sulfanilico 8 g/l

� Solucion B: α naftilamina 5 g en 1 l de ácido acético 5N

Bibliografía

Bibliografía

128

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Universidad de Buenos Aires - core.ac.uk · S. maltophilia es un bacilo Gram-negativo no fermentador de la glucosa, aerobio obligado, móvil debido a la presencia de varios flagelos