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UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRIDFACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

MECANISMOSDE LA DIVISION

DE CONTROLCELULAR EN

BIOLOGICOMICROALGAS

SONSOLESGONZALEZ GILOctubre 1994MADRID,

UNIVERSIDAD COMPLUTENSEDE MADRIDFACULTAD DECIENCIAS BIOLOGICAS

¡unu ni í~¡ ¡¡¡~¡íí ni ini u530953658X*UNIVERSIDAD COMPLUTENSE

TESIS DOCTORAL

“MECANISMOS DE CONTROLBIOLOGICODE LA DIVISION CELULAR EN MICROALGAS”

que presentala Licenciada enBiología SonsolesGonzálezGilpara optar al grado de Doctor

Madrid, Octubre 1994

Victoria López Rodas, Dra en Veterinaria y Eduardo Costas Costas, Dr enBiología, ambos Profesores Titulares de Universidad y adscritos alDepartamentode Producción Animal de la Facultad de Veterinaria de laUniversidad Complutensede Madrid,

CERTIHCAN: Que la Licenciadaen Biología D~SonsolesGonzález Gil ha realizadoBajonuestra dirección el trabajo titulado“Mecanismos de control biológico de ladivisión celular en microalgas”, y queel referido trabajo reúne lascondicionesnecesariaspara optar algrado de Doctor,

Madrid, a 25 de Octubre de mil novecientosnoventa y cuatro

Los codirectores,de la Tesis

Dra. Victoria López Rodas Dr, Eduardo CostasCostas

ILMO SR. DECANO DELA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

INDICE

1.-INTRODUCCION . 11 .1.- Proliferaciones masivas de organismos fitoplanctónicos 11 .2.- Factores ecológicos 21 .3.- Universalidad de los mecanismos biológicos que controlan

el ciclo de división celular1 .4.- Ciclo celular. Factor Promotor de la Mitosis y p34 cdo2,, 51.5.- Ciclinas 1 01 .6.- Regulación de la fase 02: activación del MPF y entrada en

mitosis 111 .7.- Desactivación del MPF: salida de la mitosis 1 41 .8.- Regulación de la fase Gí 1 71.9.- Regulación en organismos pluricelulares. Factores de

crecimiento 191.10.- Protooncogenes 241.11.- Inhibición por contacto 281.12.- Formas de resistencia 291.13.- ~Justificacion 341.14.- Objetivos 37

2.- MATERIAL Y METODOS 392.1.- Condiciones generales de los cultivos 40

2.1.1.- Aislamiento y fundación de clones 402.1.2.- Mantenimiento de los cultivos 412.1.3.- Tasas de reproducción 42

2.2.- Estimación del efecto de los Factores de Crecimiento sobreel Ciclo Celular de los diversos organismos 44

2.3.- Estimación del efecto de los Factores de Crecimiento sobrela germinación delos quistes de dinoflagelados 46

2.4.- Estimación del efecto de la inhibición por contacto sobrelos diversos organismos 48

2.5,- Análisis estadístico 52

3,- RESULTADOS 53a.i.- Resultados correspondientes al efecto de los Factores de

crecimiento sobre el ciclo celular de los organismos 543.2,-ResultadOs del efecto de los Factores de Crecimiento sobre

la germinación delos quistes de dinoflagelados 65

3.3.- Resultados correspondientes al efecto de la inhibición por

contacto sobre los diversos organismos 70

4.- DISCUSION 76

5.- CONCLUSIONES 92

6.- RESUMEN 95

7.- SUMMARY

8.-BIBLIOGRAFíA •. 100

1149.- APENDICE

INTRODUCCION

1.1-Proliferacionesmasivasde organismosfitoplanctónicos

Desde hace tiempo, las proliferacionesmasivas o blooms dedeterminadosorganismosfitoplanctónicoshan llamado la atenciónporsu aparienciaespectacular.En general,son producidaspor poblacionesmuy concentradasde determinadosorganismos,en las que predominanuna o pocasespecies,

De entre las proliferacionesmás conocidas,quizá las mareasrojasseanunasde las másestudiadas,no sólo por su importanciaeconómicasi no también por el problemasanitario que representan.Las mareasrojas son producidaspor poblacionesde determinadasespeciesdedinoflageladosmarinosque suelendar lugar a que el aguacambie a uncolor rojizo o pardo. Normalmenteestasmanchasde color se limitan a lacapasuperficial y desaparecenen pocosdías.

Aunque las mareasrojas no suelentenerotro efecto que el cambiode coloracióndel agua,en algunasocasionesresultantóxicasparaciertosorganismos marinos, y a través de ellos para el hombre, Losdinoflageladospuedenllegar a alcanzartalesconcentracionesen el mar(por ejemplo Prorocentrumminimun llegó a alcanzarconcentracionesde 1,7. iQ~ célulasí-~ en el fiordo de Oslo en 1979 en el transcursodeuna marearoja (Tangen, 1980)) que las consecuenciasecológicasde lasmareasrojas puedenllegar a ser catastróficas.Entre ellas, cabedestacarel descensobrutal en la concentraciónde oxígeno que se producecuando existen semejantesconcentracionesde organismos,lo que dalugar indirectamentea mortandadesde peces y de otras especiesmarinas. Del mismo modo, a veces se producenobturacionesde lasagallasde los pecesdebido a la acumulaciónde los dinoflagelados,lo quetambiénproducela muertedel animal por asfixia (Taylor, 1987).

Sin embargo, quizá el principal problema que causan losdinoflageladosseasu capacidadde producir toxinas, no solamentecuando se encuentranen grandesconcentracionessino incluso enconcentracionesaparentementenormales. Estas toxinas afectanpricipalmentea moluscosfiltradores, aunque,en algunospaises,también

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afectan a peces,e indirectamentellegan a afectar al hombre cuandoconsumedichos moluscos,El costeeconómicoque esto produce,tantoen la acuicultura, la pesca o incluso en el turismo, es tal que ennumerosospaises, incluido España,existen grandesprogramasdemonitoring cuyo fin es el de poderpredecircuandose va producir unamarearoja o cuandovan a producirseepisodiosde toxicidad (Andersenet al., 1993: Fyllingen & Martinussen, 1993; Mariño & Maneiro, 1993;Regueraet al,, 1993).

Sin embargo,no sólo los dinoflageladossufren estos incrementosmasivosen su proliferación celular, sino que otros grupos de organismosunicelulares también las sufren, Así, cabe destacarel caso de lascianofíceas entre aquellos organismos de aguas continentalesqUeproducenproliferacionesespectaculares.El grado de paralelismocon elcaso de los dinoflageladosy las mareasrojas es evidente,ya que lascianoficeas,ademásde colorearel aguaen tonosverde-azulados,tambiénprovocanepisodiosde toxicidad entrelos animalesy el hombre.Además,incrementanla cantidadde materiaorgánicaen las aguasprofundas,acabandocon el oxigeno disuelto y produciendouna considerablereducción de la biodiversídad con mortandadesmasivas de peces.Muchas especiesde cianofíceascomunican al agua un sabor y olordesagradablesimpidiendo su consumo, mientras que otras especiesproqucenpotentísímasficotoxinas (del grupode la saxitoxinaal igual quealcaloidesneurotóxicos)con efectosparalizantescapacesde matar alganadoy avesacuáticas(o incluso sereshumanos)que bebendichasaguas(Charmichaelet al., 1990; NRA, 1991).

Tradicionalmente, todos estos procesosen los que intervienencasosanómalos(pero no por ello infrecuentes)de grandesincrementosen las tasas de división de determinadosorganismos, se haninterpretadodesdeun punto de vista ecológico como fruto de complejasinteraccionesentremúltiples factores,

1.2- Factoresecológicos

Entre los factores ecológicosque puedenafectar a los blooms defitoplancton destacanlos factores físicos como la estratificaciónde la

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columnade agua,lasmareas,los vientos,la luz o la temperatura.Así porejemplo, una marearoja solamentese producirá si los dinoflageladosencuentranun turbulenciarelativamentebaja de la masade aguacongran estabilidaddel medio (Figueiras,1989) y temperaturasaltas (Perez-Camacho,1989).

Además, los factores nutricionalesson de gran importanciaya quesolamenteen el casode que existannutrientessuficientesen el medio,podránproliferar los organismos.Actualmente, dado el alto grado decontaminaciónque existe en el mundo, factores como la acuicultura,aguasresidualesurbanase industriales,la deforestación,la agriculturayla ganaderíacontribuyensignificativamentea la eutrofizaciónde las aguas(tanto marinas como continentales) incrementando, entre otroscontaminantes,el nivel de fosfato de océanos (Hallegraeff, 1993),acequias,ríos, lagosy embalses(Alvarez et al,, 1991). Es tan difícil esteproblema, que incluso especiesque normalmente no son tóxicas(Chrvsochromulina,Nitzschia punaenscf. multiserieso Prvmnesiumparvum)puedenllegar a producir toxicidad bajo regímenesanómalosdenutrientes como por ejemplo un deficiencia de fosfatos (Hallegraeff,1993),

1.3-UnIversalidadde los mecanismosbiológicos que controlan elciclo celular

En la actualidadse piensaque los factores biológicos, propios delorganismo tienen un papel determinanteen el control de su propiaproliferación.

En los últimos 4 años se han empezadoa elaboraruna serie dehipótesissobreel modo en que todos los organismos,de cualquiernivelevolutivo, controlan su ciclo celular, Esta regulaciónestábasadaen laexistenciade determinadosgenes,denominadosgenescdc (de ciclo dedivisión celular), que hastael momentose han encontradoen todos losorganismoseucariotasanalizados(Nurse, 1990; Cantley et al., 1991;North, 1991: Moreno, 1992; Norbury & Nurse, 1992; Murray, 1993), yque respondena la acción de factores de crecimiento (Goustin et al,,1986). Por estemotivo, la hipótesisque se ha desarrolladoes que existe

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un mecanismode control de la división celular en todos los organismosde todos los nivelesevolutivos, y que estemecanismoes un mecanismouniversal (Nurse, 1990).

Cuandose empezarona realizarestetipo de estudiosya se conocíacon bastantedetalle los controlesque regulanla división celular de lascélulas de mamífero.Un enfoquemultidisciplinar muestraque estetipode células, aparentementelas más evolucionadasdel reino animal,controlan su crecimientomediante4 leyesgenerales(Lewin, 1987):

1- Dependenciade anclaje: las célulasnecesitanunasuperficiesólidao firme a la cualsujetarse.2- Dependenciade suero:el sueroes necesarioporquesuministralos factoresde crecimientoesencialesparael crecimientode lacélula.3- Densidadde saturacióno inhibición por contacto:las célulascrecenunicamentehastauna densidaddeterminadaporqueelcrecimientose inhibe, quizá por procesosen los quemediancontactocélula-célula.4- Envejecimientocelular: aparentementelas célulasestánprogramadasparamorir despuésde un determinadonúmerodedivisiones,quevaria de un tipo celulara otro.

Mientras, un enfoque molecular aplicado a cada uno de estosprocesosha revelado la existenciade genesde ciclo celular cuyosproductosson capacesde hacer progresaréstea lo largo del tiempodependiendotanto de los nutrientescomo de las interaccionesque seproducenentre las células.

El registro fósil demuestraque haceunos3500 a 4000 millones deaños existieron seresprocariotas.que habitaronla Tierra duranteunos2000 millones de años,y que, evolucionandoy diversificándosedieronlugar a una enormevariedadde tipos diferentes.Se puedeafirmar queestos procariotas ‘inventaron” todas las formas posibles deaprovechamientode los recursospara su alimentación, o lo que es lomismo, que todas las rutas bioquímicas fundamentalesfueronestablecidasen eseperiodo. Los eucariotasmás primitivos aparecieron

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haceunos 1000 millones de añosderivados,en opinión de la mayoríadelos investigadores, de estos procariotas preexistentes medianteendosimbiosis(Shopf, 1978; Margulis, 1981; Margulis & Sagan, 1985;Knoll, 1992).

El hechode que se hayan aisladogenesdel ciclo de división celularen todo el reino eucariota,desdelas levadurashastael hombre,y el quehaya tal grado de homologíaentre todos estosgenes(Nurse, 1990), nohacemásqueapoyarestashipótesis.

Si todosestos organismoseucariotastienen mecanismosde controlde la división celular semejantes,¿seríaposible que, efectivamente,elcontrol fuese universaly abarcasepar tanto a microalgasque tuvieronimportanciaen el procesoevolutivo que dió lugar a la aparición de lasprimerascélulaseucariotas?Si estoes así, algastan primitivas como losdinoflagelados,las clorofíceaso las diatomeasse dividirían segúnlosmismosprincipios por los que se divide una célula de mamífero.

¿Cualesson estosprincipios que regulanel ciclo de división celular?

1.4- Ciclo celular. Factor Promotor de la Mitosis y p34cd02

El ciclo celular es el conjunto de reaccionesque se desarrollaneneseprocesoy constade 2 fasesbien diferenciadas:la fase5 de síntesisde DNA, en la que los cromosomasseduplican; la faseM, de mitosis, enla que los cromosomasduplicadosse segreganen los polos opuestosdela célula, y las fases Ql y 02 en las que las células preparanlamaquinariabioquímicanecesariapara el inicio de la fase de síntesisdeDNA (5) o de mitosis (MI, Al final de la faseM la célulase divide en dosmedianteel proceso de citocinesis.Así, un ciclo celular completo serepresentaríaesquematicamentede la siguiente forma: 01 5 02 M(Figura 1).

A pesarde la innumerablediversidadde organismosvivos existentesen el planeta, y de la cantidad de investigadoresque centran sus

‘-5-

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estudiosen la regulacióndel ciclo celular, no ha sido hastaprincipiosde1990cuandoseha puestode manifiestoque los mecanismosbásicosdecontrol del ciclo celularson practicamentecomunesa todaslas células,ya seande organismosprocariotaso de eucariotas,y que por tanto, sepuedehablarde un control universaldel ciclo celular (Nurse, 1990).

Tres de los organismosque más han contribuido al estudio delcontrol de la división celular de organismoseucariotas,han sido la ranaXenopus laevis, la levadurade fisión Schizosaccharomvcespombey lalevadurade gemaciónSaccharomycescerevisae

.

A principios de los años70, Masui y Markert (1971), manipulandooocitos de Xenonus, descubrieronque cuandoel citoplasmade unacélula en mitosis se microinyectabaen otra célula en cualquiermomentode la interfase(Gí, S o 02). éstaúltima entrabaen la faseM.Aparentemente,el citoplasmade la célula en Mitosis conteníaunasustanciacapazde inducir el procesodivisor en ovocitos inmaduros.Aesta sustancia se le denominó “Factor Promotorde la Mitosis” o MPFdel inglés ‘M-phase-promotingFactor”, Este factor, que no se logróaislarhastael año 1988 (Lohka et al., 1988), es de importanciauniversalpara las célulaseucariotasy ha sido altamenteconservadodurantelaevolución, encontrándoseen organismostan distintos como mamíferos,erizosde mar, pollos, almejas.levaduras,etc. Durantecadaciclo celular,la actividad del MPF fluctua, ya que siemprees detectadaen Mitosispero nuncaen Interfase.

Cuando se logró aislar y purificar este factor MPF, se vió queconstabaprincipalmentede dos subunidadesproteicas de 34 y 45kilodaltons, y que su oscilación en cuanto a actividad dependíafundamentalmentede la síntesis de otras proteínascitoplasmáticasconocidascomo ciclinas.

Paralelamentea estas investigacionesde Biología Celular, losgenetistasseguíanpor su cuentael estudiodel ciclo celular. La basedesustrabajoseran las levaduras,hongosunicelularesque se reproducencasi tan rapidamentecomo las bacteriasy cuyo genomapuedeser

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menor del 1/100 del de un mamífero, por lo que son muy útiles a lahora de procedera la identificación, clonaje y caracterizaciónde losgenesinvolucradosen el control del ciclo celular (Alberts et al., 1992).

Las dos especiesutilizadasmásfrecuentementeson la levaduradegemación Saccharomvces cerevisae y la levadura de fisiónSchizosaccharomvcespombe. Mientras que la primera se divideasimétricamenteproduciendouna pequeñayemaque va creciendoa lolargo del ciclo celular, la segundase divide simetricamentepor escisiónen dos células hijas bastantesimilares, Los linajes evolutivos quecondujerona las levadurasde fisión por un lado y a las de gemaciónporotro, divergieron hace muchos millones de años (Pringle & Hartwell,1981; Nurse, 1985), y a pesarde que existen diferenciasevidentesrespectoa su ciclo (5. pombe tiene fases01, 5, G2 y M bien definidasmientras que 5. cerevisaetiene fasesQl. 5 y M pero no una fase 02normal), ambasposeenciclos similares al de las células eucariotassuperiores,con fases 5 y M perfectamentecaracterizadas(Moreno,1992).

Gracias a estos dos organismosse empezarona aislar lo queactualmentese conocecomo genesdel ciclo celular o genescdc, genesque participan directamenteen el control de la división celular,codificando productos (receptoresmembranales,proteínas,etc) queson indispensablesen dicho control. Para la identificación de dichosgenes,fué necesarioel estudiode mutantesdel ciclo de división celular,cuyas mutacionesafectabanespecíficamentea los componentesquecontrolanel ciclo celular,y en función de unatemperaturadeterminada,se bloqueanen una parteespecíficadel mismo, Así, la célula no puedeprocedera los pasossiguientesdel ciclo.

De entretodos los mutantesanalizados,la cepacdc 2 de 5. nombedestacabaporquesebloqueabaen dospuntosdel ciclo celular, primeroen 01, antesdel inicio de la fase5 y luego en 02 antesdel inicio de lafase M, Por tanto, la proteínacodificadapor el gen cdc 2 era necesariaparaque los dos procesostuvieranlugar.Además,estaproteínateníaunpesomolecularde 34 Kd, Tiempo después,se la identificó como uno de

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los componentesdel MPF (Hartwell et al., 1974; Nurse & Bisset, 1981;Reedet al., 1985; Doreé, 1990; Lewin, 1990). siendollamada~34tdc2.

De la mismamanerase han encontradomuchosgenescdc, que sonhomólogos al cdc2 encontradoen 5. pombe.Así, en la levadura5

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cerevisaese ha encontradoel gen CDC 28 con un 63% de homologiarespectoal cdc 2 (Beachet al., 1982), mIentrasque en humanosse haencontradoel gen CDC 2 FIs que es capazde llevar a cabo todaslasfuncionesde cdc 2 o CDC 28 en los respectivosorganismosen ausenciade sus propios genes(Draetta et al., 1987; Lee & Nurse, 1987). Asímismo, se han encontradogeneshomólogosa cdc 2 funcionalesenDrosophila melano~aster(Moreno, 1992), en plantas superiores(Hirayamaet al., 1991), en algasrojas y pardas(Johnet al., 1989), enXenouuslaevis (Dunphyet al., 1988) y en estrellasde mar (Labbe et al.,1989). Hastaahora, en todos los organismoseucariotasanalizados,yaseananimaleso plantas. se ha encontradouna proteínaequivalenteacdc 2, lo que pareceindicar claramentela presenciauniversal de estaproteínaen todos los organismoseucariotas.

1.5- Cidlinas

En 1989, trabajandocon embrionesde almejas se descubrieronunasproteínasque, a diferenciadel resto,se iban acumulandoa lo largode la interfase del ciclo celular paradestruirsetotalmente,al final decadamitosis (Hunt, 19891y que por estarazónsedenominaronciclinas.Estasproteínas,de un pesomolecularde 45 kd formabanpartedel MPFjunto con la ~34cdc2.Actualmente,los genesde las ciclinasya hansidodonadosen gran cantidad de organismostan disparescomo ranos,moscas,humanosy levaduras(gen cdc 13), por lo que su distribucióntambién pareceser universal (Nurse, 1990; Pines & Hunter, 1990).

Hastael momentose han identificadodos clasesde ciclinas, A y B,y, aunquesusfuncionesno han sido todavíaclaramentedefinidas,ambasseasociancon la p34 (Hunt, 1991), Sin embargo,al parecerla ciclina Bes la verdaderamenteresponsablede interaccionarcon la p34cdC2 en laMitosis, al menos en levaduras.La función de la ciclina A no estátotalmenteclara, pero seha sugeridoque tambiénforma complejoscon

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la p34CdC2 (Norbury & Nurse, 1991). Otro tipo de clasificaciónpermitiríaagrupara las ciclinas en dosgrupos,ciclinas 01 y ciclinas 02,en función de si son efectorespositivos de la transición01/5 o de latransición02/M del ciclo celularrespectivamente(Suranaet al., 1991),Por el momento,las ciclinas 01 sólo se han descrito en la levaduraS

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cerevisae,asociadascon la p34ODC28, mientrasque las ciclinas 02 sehan encontradopracticamenteen todos los organismosestudiados,Alparecer,5. cerevisaees el único organismoen el que las dos principalestransicionesdel ciclo celular (G1/S y G2/M) estánreguladaspor dosclasesdistintasde ciclinas (01 y 02 respectivamente)en asociaciónconla mismasubunidadcatalítica(Suranaet al,, 1991),

Sin embargo,la asociaciónde las ciclinas01 con la proteínap34 y laconsiguienteactivaciónde la actividad kinasa, es en muchosaspectosparalelaa la activaciónde la p34 por ciclinas mitóticas (02) (Ohlara etal,, 1991), y ocurre de la misma forma en todos los organismoseucariotasestudiados(Nurse, 1990),

1.6- Regulaciónde la fase02: Activación del MPF y entrada en laMitosis

Así, una molécula de ciclina se asociaa otramolécula de proteínapS4CdC2 para formar un dímero, La p34 (o su homólogaen su caso)es

una protein kinasa(pk) cuya actividadenzimáticaestáreguladapor lafosforilación del aminoácidotirosina 15: si la pk estáfosforilada endicho aminoácido,estefosfato impide la unión del ATP a esesitio por loque la proteínaes inactiva. Consecuentemente,la desfosforilaciónde lap34 hace que éstase active, mediantela estimulaciónde su actividadkinasa, permitiendoleentoncesfosforilar a distintos efectores(Figura2),

Hasta el momento, los organismosmejor estudiadoshan sido laslevaduras, en especial la de fisión 5, pombe. En ella, lafosforilación/desfosforílacióndel complejo formadopor p34cdC2/ciclinaviene reguladapor los productosde tres genes: el gen cdc 25 y losgeneswee 1 y mik 1 como activadore inhibidores respectivamentede

1

11

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Activación del complejo p34CdC2 ¡ ciclina B 1Figural.

-s

4

Pre MPFp34cd02 Kinasa ¡nactiva’ ~.—---“— p340d02 Kinasa activa —

MPF

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la actividad kinasa(Nurse, 1990; North, 1991; Labib & Nurse, 1993;Murray. 1993).

La proteínacdc 25 es unaproteínaque se va acumulandoa lo largodel ciclo celular hastaalcanzaruna concentracióntal que permitea lacélulapasardel punto de inicio o start de la mitosis, punto en el que lacélula entra irremediablementeen la fase M, independientementedelas condicionesexternas;de estaforma la proteínacdc 25 le comunicaal complejo cdc 2/ciclina que la duplicación de los cromosomas(delDNA) ha terminado,es decir que la fase S ha finalizado (Kumagal &Dunphy, 1991). Recientestrabajosdemuestranque la proteínacdc 25es una fosfatasa, que al aumentarsu concentración,promueveladesfosforilaciónde la proteínacdc 2 en la fase 02 del ciclo celular,,loque activa la actividadklnasade estaproteínay promuevea la celula aentraren la fase M (Moreno et at., 1990; Krek & Nigg, 1991; Labib &Nurse, 1993; Murray, 1993). El hecho de haberseencontradogeneshomólogosal cdc25 de S. nombeen S. cerevisae,Drosophilay Homosapiens (Russellet al.. 1989: Edgar & O’Farrell, 1989; Sadhu et al.,1990 respectivamente)parececonfirmar todavíamás la universalidadde un control de la entrada en Mitosis para todos los organismoseucaríiotas.

Por otro lado, los productosde los genesweel y mikl inhiben laentradaen mitosis de la célula al impedir la desfosforilaciónde lap340d02. El más estudiadode los dos es el gen weel, cuyaproteínaes

una protein kinasaque fosforila (es decir inactiva) a la p34 in vitro(Parker et al., 1992).

Con la activacióndel complejo cdc2/ciclinase sucedenunaserie decambioscaracterísticosde la Mitosis como resultadode la fosforilaciónde algunosde los sustratosde dicho complejo: así, la cdc2 fosforila a lasláminas A, B y C de la membrananuclear y a la vimentina, cuyosestadosfosforiladospermitenqueseproduzcala roturade la membrananuclear durante la Mitosis (Norbury & Nurse, 1992). Otro de lossustratosfosforiladoses la HistonaHl, quetienegranimportanciaen elproceso de condensaciónde los cromosomas (Nurse, 1990). Lafosforilación de otros sustratoscomo la p60SrC~la nucleolina,el antígeno

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T SV4O, la RNA polimerasaII y el factor de elongaciónEf-l’y son los

responsablesrespectivamentede la reorganizacióndel citoesqueleto,lareorganizacióndel nucleolo, la replícacióndel DNA y la inhibición de latranscripción, todos ellos procesosque se producenal inicio de lamitosis (Morgan et al,, 1989; Moreno, 1992; Norbury & Nurse, 1992).

1.7-Desactivacióndel MPF: salida de la Mitosis

Al final de la Mitosis, en la anafase,el complejo cdc2/ciclinaseinactiva por lo que los sustratos de este complejo tienen que serdesfosforilados,Hasta hace relativamantepoco tiempo no se sabíaexactamentecual era el procesopor el cual el complejop34~dc2/ciclinaera destruido,pero una de las condicionesnecesariasparaello pareceser la degradaciónde las ciclinas, con la consiguientedestruccióndelcomplejo y la inactivaciónde la p

34cdC2, que entrarádegradadaen lasiguiente interfase del próximo ciclo celular (Draetta et al., 1989;Murray & Kirschner, 1989).

En eucariotas,y particularmenteen la ranaXenopus laevis, ladegradaciónde las ciclinas se lleva a cabo mediante una “víadependientede ubiquitina”, de unamaneraanálogaa cómo se degradanmuchas de las proteínas celulares (Luca, 1993). En este proceso,muchascopias de una moléculaconocidacomo ubiquitina se unencovalentementea restos de lisina de la proteínadiana que va a serdestruida, de manera que sólo aquellas proteínas que esténmultiubiquitinizadasseránposteriormentedegradadaspor unaproteasa.Durante el ciclo de degradaciónde las ciclinas de Xenonus se hanobservadocomplejos multiubiquitinadOsde ciclinas, que siguen unacinética muy parecidaa la de las ciclinas, acumulándosea lo largo delciclo celularparadesapareceral final de la Mitosis.

Pero quizá lo másllamativo no seaestehecho,sino el que ciclinasprocedentesde muy diversosorganismosmuestrenuna degradacióndependientede ciclo celular en extractosde Xenotus (Glotzer et al..1991), lo que sugiereque debeexistir una ‘estructuramínimaesencial”que confiera a las ciclinas de todos los organismosla propiedadde serdegradadasvía ubiquitina.

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Cuandosecompararonlos últimos 90 aminoácidosdel extremoN-terminal de 13 ciclinas procedentesde 8 especiesdiferentesse observóque existíasolamenteun 10-20% de conservaciónde la secuencia.Sinembargo,en todaslas ciclinas analizadasseencontróunaregión de 9aminoácidosconocidacomo “destructionbox’ que era reconocidacomoseñal por el sistemaconjugadorde la ubiquitina, y que contenía 4aminoácidosaltamenteconservados.Además,existía otra región, nadaconservadaentre las ciclinas, que conteníauna alta proporción deLisinas (~ 17%) quesirve de sitio de unión a la ubiquitina.

* ** * *

En resumen,el control ejercido sobre el ciclo celular garantizaquetodos los procesosque se dan en él ocurrande una maneracorrectaypuntual. Por ejemplo, la Mitosis no puedecomenzarhastaque la célulaha crecido lo suficientey la replicaciónde su genomahayatenido lugar.Además,la división celular no puedeocurrir hastaque el huso mitóticohayadistribuido los cromosomasentrelas célulashijas. La ordenacióncorrectade todos estosprocesosse producea travésdel MPF que es elcomplejo formadopor la ~34cdc2y las ciclinas.

La activacióndel MPF al inicio de la Mitosis aparececomo resultadode una extensainteracción entre moléculasestimuladoras(como lapsOcdc2b) e inhibidoras (como pweel y pmikl), que ademásse debe

conjugar con los sistemascelulares que verifican que procesosbioquímicos como el crecimientocelular, la duplicacióndel centriolo yla replicación del DNA han tenido lugar correctay previamentea laentradaen Mitosis (Hartwell & Weinert, 1989). Una vez que el MPF (olo que eslo mismo, la p34cdc2) es activado,la célulaentraen Mitosis, loque conlíeva a una serie de procesoscomo la condensacióndecromosomas,la reorganización del citoesqueleto,la rotura de lamembrana nuclear y cambios en la morfología celular, que nonecesariamentese dan en todos los eucariotas (Nurse. 1990).Finalmente,el MPF activadohaceque se activen determinadosenzimasque provocanla unión de la ubiquitina a las moléculasde ciclina delMPF, lo que activa la degradaciónde las ciclinas y la consiguiente

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inactivación del MPF, induciendo a que el ciclo celular entre en lasiguienteinterfase,es decir que salgade la Mitosis (Figura3).

Al mismo tiempo, todosestoshechospromuevenque tengalugar lasegregaciónde los cromosomas,su descondensación,la formaciónde lamembrananucleary por último, la citocinesis,aunque,al igual queenlaMitosis, no todos ellos tienenlugar en todos los eucariotas.

1.8-Regulaciónde la faseQl

Los ritmos de crecimiento de organismossencillos de vida librecomo las levaduras,dependenprincipalmentedel apodede nutrientes.Bajo condicionesde privación nutricional, las célulashijas producidasen ciclos rápidos de división celular seríantremendamentepequeñas,debido a lo cual las célulasnecesitanun mecanismoque les permitacontrolar el ritmo del progresodel ciclo de división (especialmenteelcromosómico)de acuerdocon el ritmo de crecimientocelular. En laslevaduras,así como en la mayorpartede los organismoseucariotas,lasduracionesde las fases8 (síntesisde DNA) y M (mitosis) permanecenrelativamenteconstantes,independientementede que las condicionesexternasseanfavorableso no, En cambio,la fase01 sueleser la que seprolongacuando las células sufren condicionesadversas,por lo quedebeexistir un punto crítico en la fase 01 en el que la célula puedadetenersesi el ambienteno es favorable al crecimiento (Norbury &Nurse, 1992).

Estepunto seconocenormalmente como punto de restricciónR sinos referimos a células de mamífero,o punto de Inicio o Start si nosreferimos al resto de las células eucariotas.Se ha postulado.ypracticamente,aceptadola existenciade un factor promotorde la fasede síntesis, que actuaríaen el intervalo 01/5, concretamenteen elpunto de restricción (Norbury & Nurse, 1992), Tanto en levadurascomoen fibroblastos de mamífero, para que se puedapasardel punto derestricción esnecesariala presenciade la p340d02 (o su homóloga),perocual essu funciónexactapermanecetodavíasin describir.

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Una vez superadoestepunto de restricción, la célula continúaelresto de las fasesde su ciclo celular independientementedel ambienteexterno, Sin embargo,si la célula no ha podido pasardel punto Rpermaneceen estado quiescente” o en fase Go, como así se hadenominadoal estadode la fase 01 en el que las célulaspermanecenala esperade que su ambiente mejore. El tiempo que las célulaspermanecenen el estadoGo dependedel tipo celular de que se trate,pudiendovariar desdeminutos hastaincluso años.En el hombre, porejemplo, las neuronaso eritrocitos no se dividen nunca despuésdehaber alcanzadola madurez. Sin embargo,las células epitelialessedividen de forma continua y rápida a lo largo de toda la vida delorganismo,completandosu ciclo celularen 8 horas.

Sin embargo. las condicionesque se han de cumplir antesde queunacélula crezcay sedMda sonconsiderablementemáscomplejaspara

una célula animal que para una levadura.En OrganismOsunicelularescomo las levaduras, protozoosy bacterias,existe una fuerte presiónselectivasobre cada célula individual paraque crezcay se divida tanrapidamentecomo seaposible. De ello dependela supervivenciade la

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especieo de la cepa.Por estarazón, el ritmo de división celular de estetipo de organismossólo estálimitado por el ritmo con que la célulapuede tomar los nutrientes del medio y transformarlosen materialcelular,

Por el contrario, las células de un organismopluricelular formanpartede un complicadoconjunto celular, donde lo importanteno es lasupervivenciade unaspocascélulassino la de todo el organismo.Por lotanto existen complejos controles de la división celularconsiderablementemás complejosque los que actúanen un organismosimple como la levadura,aunquesusprincipios básicosseanlos mismos.

1.9-Regulaciónen organismospluricelulares: factores decrecimiento

El cultivo de células en el laboratorio nos ha permitido conocercómo se produce la división celular dentro de un orgnanismopluricelular. Así, si a unas células de vertebrado mantenidas en uncultivo artificial se les elimina completamenteel suero del medio, nopasarándel punto de restricción R y permaneceránen el estadoGo,aunquetenganen el medio todos los nutrientesnecesariospara sucrecimiento y división. Los componentesesencialesdel suero sonpequeñospéptidosllamadosfactoresde crecimiento, que estimulanladivisión celular mediante la activación de la transcripción dedeterminadosgenes.Así, cuandoa células en cultivo que permanecenen un estadoquiescenteGo se les añadeen el medio suero o algúnfactor de crecimiento especifico,la estimulaciónde la división celularhaceque estascélulas salgande la fase Go y terminenel resto de suciclo celular (Cross & Dexter, 1991).

Los factoresde crecimiento conocidoshastael momentotienentresmodosdistintosde actuación:

- Puedenactuarde forma autocrina,mecanismoen el que losfactoresde crecimientosintetizadospor unacélulaactúansobre la misma célula. Un ejemplo es el factor de crecimientotransformante(TOP’).

1

-19-

- Puedenactuarde forma paracrina,en la que los factoresdecrecimientosecretadospor unacélulaactúansobrecélulasvecinas.Como ejemplotenemosa los factorespeptidicos,como el epidérmico(EGF), y derivadode plaquetas(PDGF).- Puedenserendocrinos,actuandosobrecélulaslejanasyviajandohaciaellas mediantela corrientecirculante.Elejemplo máscaracteristicosonlas hormonas.

Las células que respondena la acción de factores de crecimientotienen en su membranareceptoresespecíficospara dichos factores; lagran variedad de estos factores y de sus receptores,junto con susinteraccionescon célulasy tejidos, proporcionanun equilibrio para quese verifique de forma coordinadala proliferación celular durante eldesarrollo.A menudo,la mayoríade los tipos celularesnecesitanvariosfactores de crecimiento para conseguir una respuestaproliferativamáxima, y no sólo uno en particular, debido sobre todo a que losestímulos mitogénicosactuan en diferentes estadiosdel ciclo celular(James, 1984). SIn embargo,un número bastantepequeñode factoresde crecimiento (aproximadamente30), en sus distintas combinaciones,es el que regula selectivamentela proliferación de cada uno de losmuchostipos celularesde un organismosuperior(Alberts et al., 1992),

El componentemayoritario del suero es el factor de crecimientoderivado de plaquetas(PDGF), llamado así por ser liberado por lasplaquetasen un procesode cicatrización, estimulandoa las célulasconjuntivasa dividirse y paliando así el daño producido. La unión delPDGF y en general de cualquierfactor de crecimiento a su receptorespecíficoen la célula diana, desencadenauna cascadade señalesatravés del citoplasma, que puede alcanzar el núcleo y alterar laexpresióngénica.

En particular, la unión del PDGF, el EGF, la insulina y algunaslinfoquinas a susreceptoresda lugara la activacióndel dominio tirosín-kinasa presente en la porción citoplasmática de sus receptoresrespectivos(Hunter & Cooper, 1985). En el casodel receptordel PDGF,uno de los sustratosque esfosforilado (y en consecuenciaactivado)porla actividadkinasa esotra protein kinasaque fosforila a un fosfolípido

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presenteen la membranade la célula diana: el fosfatídíl inositol (PI), Losfosfolipidos de inositol mas importantes de la membranason dosderivados(por fosforilacionessucesivas)del PI: el PI-fosfato (PIP) y elPI-bifosihto (PIP2), localizadosambosen la cara internade la membranaplasmática.Sin embargo,pareceque es la hidrólisis del HP2 la que esrealmente importante en el proceso de señalización(Alberts et al,,1992) (Figura 4).

La hidrólisis del PIP2 se producemediantela acción enziniáticade

una fosfodiesterasa,la FosfolipasaO. Los detalles del proceso deactivación no son bien conocidospero existen evidenciasde que unreceptorde membranaactivado activa a una proteínaO (denominadaGp). la cual a su vez activa a la fosfolipasaO (Cascales,1989; Alberts etal,, 1992). De estamanera,el PIP2 es escindidoen dos compuestos,el1,4,5 trifosfato inositol (IP3) y el diacilgilcerol (DAG), que actúancomo

segundosmens~jerosresponsablesde la transducciónde señalesquetendrálugar a continuacióndesdela superficiecelular hastael núcleo.

El IP3 esuna moléculahidrosolubleque se difunde en el citoplasma

y que moviliza los reservoriosintracelularesde calcio (como el retículoendoplasmatico),haciendo que se eleve la concentraciónde calciocitoplasmática. El calcio no sólo es un elementoimprescindiblepara laviabilidad celular, si no que la progresióna travésdel ciclo de divisióncelular (01 y Mitosis) es muy sensible a las concentracionesintracelularesde calcio, La calmodulina,el principal receptordel calcioen célulascucariotas(exceptoen las musculares),haceque seproduzcauna aceleracióndel ciclo celular (por acortamientode la fase 01) conuna simple elevación de su concentraciónintracelular. Además, encélulasde raton, seha comprobadoque ¡a concentraciónde calinodulinase duplica abruptamenteen el límite 01/5, lo que coincide con lainiciación dc la síntesis del DNA (Rasmunsen& Means, 1989). SInembargo,este aumento de calcio es transitorio, ya que el calcio esrapidamentebombeadohaciael exterior de la célula y porqueel 1P3 se

desfosforila(se inactiva) rapidamente.

Por su parte, el DAG es una molécula hidrofóbica que permanecepor tanto cercade la membranaplasmática1Su función principal es la

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de activar a la protein kinasaO (pk O), que es dependientede calcio yque a la vez provocaráimportantescambiosen el citoplasmacelular: enprimer lugar, es la responsablede la modificación de la actividad devarias proteínasdiana,mediantela fosforilación de residuosde sermaotreoninaespecíficos.En segundolugar, la pk O activa por fosforilaciónalintercambiadormembranalde protonesNa+¡H+, que hará que subaelpH intracelular, lo que en muchascélulasya es una señalpor sí solainductorade proliferación (Pouysseguret al., 1986). Las pruebasmásconvincentessobreel efecto del incrementodel pH intracelular en ladivisión celular, son las producidasen fibroblastos mutantesde ratón,donde solamenteun incrementode 0,2 unidadesde pH sobre el pHnormal de la célula, lleva a una activaciónde la síntesisproteica (Bravo& Mc Donald-Bravo, 1986), En otros eucariotas como protozoos ylevadurastambiénse hanobservadocambiosde pH intracelularduranteel ciclo celular: durante el ciclo de Dictvostelium el pH oscila deacuerdocon el ciclo de replicación del DNA, en un rango de 0,1-0,3unidadesde pH debido a la salida de H~ a través del intercambiadorNa~/}-l4 (Cascales,1989). Y en tercery último lugar, la protein kiinasaOincrementa la transcripción de determinadosgenesconocidos comogenestardíos, entre los que se encuentranalgunos protooncogenescomo c-fos, que codifica para un factor de transcripción (Curran &Franza, 1988), c-myc, cuyo producto se requiereen la replicación delDNA (l-Ieikkle et al., 1987) y c-jun, cuyo producto es otro factor detranscripción(Disa et al,, 1989),

A partir de aquí se inicia una secuenciade acontecimientosqueculminaráen la síntesisde DNA y en la división celular.

Cuando las células crecen en un medio ambiente controlado, ladivisión celular puede acelerarse,retardarse o detenerse.Existenmuchos sistemas para acelerar la división celular e incluso para“mimetizar” algunode los procesosmolecularesque ocurrenen un ciclocelular, A este respecto,cada una de las dos ramas del proceso deseñalizaciónmediantefosfolípidos de membranapuedeser provocadopor agentesartificiales. Así, los efectosdel IP

3 pueden ser mimetizados

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utilizando un lonóforo de calcio o la lonomicina, los cualespermitenqueel calcio entreen el citoplasmacelular desdeel exterior de las células.Por su parte, los efectos del DAG se mimetizan bien por derivadosmonoaciladosdel DAG o bien por ésteresde forbol, productosvegetalesque entranen la celula por difusión y se unen a la protein kinasa Cactivandoladirectamente.Curiosamente,estos ésteresde forbol sonutilizados muy frecuentementeen estudios“in vitro” relacionados conla Biología del Cancer, al ser sustanciasconocidascomo promotorestumoralesque causancancercon una frecuenciabastantealta si se

aplican despuésde un tratamientocon carcinógenos(Lamph et al.,1988).

Sin embargo,y aunque nos liemos centrado en un solo tipo demecanismotransductorde señalesque compartenmuchos factores decrecimiento, existen muchas vías de señalización a través de lamembrana,Una de ellas es el sistemaJ3-adrenérgico,en el que laocupacióndel receptorpor el agonistaproducela activacióndel enzimade membranaAdenilato Ciclasa,lo queproducea su vez un incrementointracelularde AMPc.

El hechode que los distintos factoresde crecimientono actúenporel mismo mecanismosugiere que deben existir diferentes vías detransducciónde señalesa travésde la membrana,aunqueno todasellaslían sido por el momento clarificadas (Alberts et al,, 1992). Laimportancia de estasvías y sus mecanismosestá reforzadapor losrecientes hallazgos que hacen suponer que ciertos protooncogenescodifican proteínas que participan en la transducción de señales(Berridge, 1987),

1.10- Protooncogenes

En los procesos fisiológicos normales proliferativos como laernbriogénesís,la cicatrización, la regeneracióntisular o la respuestainmune, la división celular estáreguladapor factores de crecimientoypor genesy productos génícosque respondena dichos factores decrecimiento (Basergaet al,, 1986; Goustin et al,, 1986; Cantley et al.,1991; North, 1991). Así, toda alteración de la estructura de estas

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moléculas o de su concentraciónoriginará diferentes patologías.Porejemplo el enanismoy la diabetesson debidasrespectivamentea unafalta de hormonade crecimiento o de insulina. Lo mismo ocurre concualquier modificacióndel número,de la función o de la afinidad de losreceptoresmembranales:el pseudoparahipotiroidismo,enfermedadquese caracteriza por una caída del calcio plasmático que originaconvulsionesy tetanias es debida a un fallo de las proteínas O deacoplamiento.Lo mismo ocurre en enfermedadesautoinmunescomo lamyastheniagravis, parálisismuscularque se producepor la fabricaciónpor parte del enfermode anticuerposantireceptoresde la acetil colina,por lo que la contracciónmuscularestaráinhibida.

Una característicaprincipal de todos los eucariotassuperioreses laduración definida de la vida de cada organismo,una propiedadque seextiende a las células somáticas individuales, cuyo crecimiento ydivisión está altamenteregulado. Una excepción la constituyen lascélulascancerosasque se originan como variantesque han perdidosucontrol de división normal. Existennumerososagentesque conviertenlas célulasnormalesen célulastransformadasy seusan cornosistemasmodelo para el estudio de los procesosImplicados en el cáncer,Numerosos descubrimientos realizados en estos últimos añosproporcionanuna visión inesperadasobre la naturalezadel cáncer, ypermiten un mejor conocimiento del proceso. Durante años losinvestigadoresse han preguntadoqué es lo que hace que las célulascancerosasse diferenciende las normales:la respuestaa esteenigmaanivel molecular se ha podido obtener recientementea partir deresultados procedentesde campos biológicos muy diversos. Losprogresosrealizadosen todos los camposde la biología, desdelasmanipulacionesgenéticashastalos anticuerposmonoclonales,permitenabordarla exploraciónde como funcionanlos genesen unacélula de unorganismosuperior.

En general, se puede decir que la producción anormal de losfactores de crecimiento, de sus receptores celulares o de susmediadoresintracelularespuedeconducir a estados patológicosentrelos que se incluye el cancer, en los cuales los mecanismosquegobiernan la proliferación celular están alterados, De esta forma,

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cualquier gen que codifique para un factor de crecimiento, para unreceptor de membrana o para una proteína reguladora de latranscripción puede ser considerado un protooncogen (Egan &

Weinberg, 1993).

Así, las células transformadascarecende las restriccionesy loscontrolesque rigen el crecimientode las “células normales”, En estesentido,estascélulas crecenmás rapidamenteque las normalesal nodependerde suero ni de factores de crecimiento para crecer, hanperdido su capacidadde crecer en monocapasin necesidadde unasuperficie solida a la cual adherirse,e incluso no tienen fenómenosdeinhibición por contactocélula-célula.Además,las célulastransformadasson inmortales y no alcanzanla senescenciacuando estánen cultivo(Alberts et al., 1992).

Hastaahorase han identificadomás de 50 protooncogenesy todoslos estudiosapuntana que la mayoríade ellos son genesque participanen el control de la división celular de cualquier célula normal, Así, laindependenciade factores de crecimiento por parte de las célulascancerosaso su capacidadde crecimiento ilimitado obedeceríaaalteraciones en cualquiera de los componentesdel sistema deinternalízaciónde las señalestransmitidaspor factoresde crecimiento:el propio factor de crecimiento,su receptorespecíficoo su sistemadetransmisión intracelular hasta el lugar de acción, entre los que seincluyen proteínas0, protein kinasaso proteínasreguladorasde laactividadgénicalocalizadasen el núcleo,

Una característicasorprendentede estegrupo de geneses que hanconservadosu secuencíade nucleótidos practicamente invariabledurantemillones de años,y así por ejemplo el oncogenc-myc presentauna homología de más del 95% en varias de sus regionesentre laestrella de marAstería vukaris y el hombre(Walker et al., 1992), a lavez que se han detectadoproteínasanálogasa las del oncogenc-myc eneucariotasprimitivos y en praxlnophyceas(Costaset al,, in pressa).

Lo mismo ocurre con la proteínacodificada por el oncogenc-src,p6OSrc, que durantemuchosañosseconsiderócaracterísticade células

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de vertebrado,pero que recientementese ha encontradoen DrosoDhila(Hunter, 1984). La proteína p6OSrCes una protein kinasa de lamembranaplasmáticaquefosforila residuosde tirosina en grancantidadde proteínas diana, entre las que se incluye el receptor de lafibronectina,que cuandose encuentrafosforilado pierdela afinidadpordicha proteína dando lugar a un debilitamiento general de lasadhesionescelularesy haciendoque, en último término, la célula seredondee(Hirst et aL, 1986). Este hecho es una de las característicasque adquiere una célula cuando es transformada:no necesitaunasuperficie a la que adherirse,su forma es redondeaday ha perdidosudependenciade anclaje.

Otro ejemplo significativo de protooncogenesconservadosa lo largode la evolución es el de la familia de los genesras. Estosprotooncogenesestán relacionadoscon protoencogenesque codifican receptoresmembranalesproduciendoproteínasque se unen e hidrolizan GTP,indicando unaestrecharelación con las proteínasO que participanenmuchosde los procesostransductoresde señales(Cascales,1989). Así,los genesras mutantesestánasociadoscon grandesincrementosde IPay DAG, de maneraquehacena la célulahipersensiblea diversosfactoresde crecimiento como el PDGF. En un principio estos genes seidentificaronen mamíferoscomopartede unagran familia de genes(N-K- y H-ras) que codificabanproteínasde 21 Kd localizadasen la caracitoplasmáticade la membranacelular, pero recientementese hacaracterizadoen Xenopus un c-DNA de K-ras cuya secuenciaespracticamentehomólogaa su correspondientede mamífero (Andeol etal., 1992), mientrasque en la levadurade gemaciónS. cerevisaesehanencontradogeneshomólogosa ras que participanen el control del ciclode división celular de acuerdocon el aportede nutrientesen el medio(Barbacid, 1987), Así mismo, en la levadurade fisión 5. pombe existengenes homólogos a ras cuyos productos controlan la meiosis, laesporulacióny el tamañocelular (Egan & Weinberg, 1993), mientrasque en D. melanogasterlos genesras controlan el desarrollodel ojocompuesto(Perrimon, 1993),

En el DNA de levaduras,anfibios, gallinas, insectosy mamíferossehan encontradosecuenciassimilares a los protooncogenesque se

.1

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encuentranen humanos.Esto quiere decir que los antecesoresde losprotooncogeneshumanosdebíanhaberevolucionadoya haceunos 800millones de años, cuandovivía el antecesorcomún de sereshumanosylevaduras,ya que si los protooncogenesno desempeñasenun papel tanvital en la supervivenciacelular normal, no sehabríanconservadoen elgenoma(Knoll, 1992),

Quizá, la conclusiónmás generalque podemosextraerseaque latransformaciónde células normalesen cancerosasse efectúabajo ladirección de genescuya función normal escontribuir al crecimientoydivisión de las células. En realidad cualquier gen implicado directa oindirectamenteen el control del crecimientoy división celular puedeser consideradoun protooncogen.

El esclarecimientode todos los mecanismosque controlan laproliferación celular normal junto con la regulación de dichosmecanismosdurante procesos de diferenciación y desarrollo deorganismos superiores es uno de los mayores desafíos de lainvestigaciónbásicasobreel cáncer,Sin embargono es facil afrontar elproblemaen dichosorganismos,por lo que se hacenecesarioel empleode sistemas modelo que tengan las propiedades de las célulassuperiores pero cuyo manejo sea mas sencillo. Así, la detección1aislamiento y caracterización de los productos de los propiosprotooncogeneso de los genesdel ciclo de división celular en dichossistemasmodelo seaun objetivo prioritario. En este sentido es desuponerque cuantomás esencialseala función de estoscomponentescelularesmejor se habránconservadodurantela evolución. Por todosestos motivos, organismoscomo 5. cerevisae,Neurosuora crassa

,

Dictvostelium discoideumo D. melano~aterestán contribuyendoyaenormementeal entendimientode los secretos del cancer y de losmecanismosreguladoresde la división celular en los organismossuperiores.

1.11-InhibicIón por contacto

La inhibición por contacto es un fenómeno tradicionalmenteasociadoa células animalescomo un mecanismoque utilizarían para

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controlar su división celular, Este mecanismose observafacilmenteencélulas que están mantenidascon suero en placas de cultivo delaboratorio,Estascélulas,normalmentefibroblastoso célulasepiteliales,empiezana crecer hasta que entran en contacto unas con otras,momentoen el que han formado una monocapaen toda la placa. Eneste instante, las células paran su crecimiento, pero si se abre una“herida” en la monocapa,es decirse creaunazona libre de células,lascélulasque estánsituadasen los bordesde la heridaempiezana crecernuevamentehastaque las célulasvecinasse toquende nuevo unasconotras, Este tipo de fenómenose conocenormalmentecon el nombredeinhibición por contactoo inhibición de la división celular dependientede densidad,y estáafectadopor muchos factoresbiológicos entrelosque se incluyen la competenciapor factoresde crecimiento o cambiosen la forma relacionadoscon los contactosintercelulares(Figura 5)

(Alberts et al,, 1992),

El crecimiento de algunos eucariotas unicelulares como lasmicroalgassugiereun fenómenoparecidoy así, si se depositaun inóculode una microalgaen un medio de cultivo apropiadobajo condicionesambientalesidóneas, el inóculo crece de forma exponencialdurantevarios días hasta que alcanzala saturación (Brand et al., 1981),Tradicionalmente,se interpretaestasaturacióncomo consecuenciadelagotamientode los nutrientesdel cultivo o del acúmulode metabolitosde deshecho,

Sin embargo,es probableque dicho procesode saturaciónseaunprocesomás complejo de lo que aparentementerepresentaa simplevista, en el que ademásde estosfactores densodependientesinfluyanotros mecanismosde control biológico como la inhibición por contactoo la competenciapor factoresde crecimiento,

1.12-Formasde resistencia

Gran cantidad de microalgasproducen formas de resistenciaoquistes como un mecanismo de defensafrente a determinadascondicionesadversas,De estamanerapuedenaguantargrandesperíodos

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Inhibición por contacto ~

Capa confluente decélulas formada denuevo por división 1celular

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de tiempo en condicionesen las que la célula vegetativano podríasobrevivir. Cuando estas condiciones ambientalesmejoran y sonfavorables,los quistesde resistenciagerminandando de nuevo lugar acélulasvegetativas.

En el caso de los dinoflageladoslos quistesde resistenciapuedenpermaneceren el sedimentomarino por períodossuperioresa 15 años(Blanco, 1989) y conservarseen estadoperfectamenteviable,

El ciclo de vida de los dinoflageladosesun ciclo característicoen elque las fasesdiploides alternancon las haploides(Figura 6). En el casopanicularde los dinoflageladosplanctónicos,la fasevegetativa,de vidalibre, es haploidey se reproduceasexualmentepor unasimple división,Solamenteen determinadascondicionesambientalesla fasevegetativase reproduce sexualmentedando lugar a un zigoto diploide oplanozigoto.Estoszigotospuedencontinuarsu vida en el planctonhastaque sufrenunameiosisparavolver a dar célulashaploidesvegetativasyplanctónicas(Dale, 1983).

En algunas ocasiones,especialmentecuando las condicionesambientalesno son favorables,los zigotospuedenformar unacubiertaderesistenciadandolugar a lo que se conocecomo quistede resistenciaohipnozigoto. Este quiste es extraordinariamenteresistente acondicionesadversascomo la desecación,condicionesreductorasen elsedimentoo tratamientocon algunosácidos,y puedepermanecerviableaunquesin germinarduranteperiodossuperioresa 15 años (Blanco.1989), La posteriorgerminaciónde estosquistesdaríade nuevo lugar ala fasede vida libre,

Grannúmerode autoreshan postuladosobreel posiblepapelde losquistesde resistenciaen la vida de los dinoflagelados,En general yfundamentalmente,son un mecanismode supervivenciade las especiesque los producenfrente a épocasclaramentedesfavorables,De estaforma, los quistes que pasanal sedimentopuedenservir de inóculoapoblacionesque se desarrollenen añosposterioresen la misma zona,Además, en el casode que la población de célulasvegetativasde vida

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Ciclo de vida de los dinoflagelados .10

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Germinación

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libre desaparezca,sedauna“reservade células” que evitarlael problemade la desapariciónde dichaespecie(Blanco, 1989).

En segundo lugar, los quistes permiten ampliar el área dedistribución de la especiepor medio de su dispersión.El hechode quesean tan resistentespermite que puedan ser transportadosde unaforma viable de una zonaa otra en la que se puedadesarrollarla fasemóvil, De hecho, estahipótesisha sido sugeridarecientementecomouna de las posiblesexplicacionesa la apariciónde especiesproductorasde mareasrojasen zonasdondeno habíanaparecidonunca(Andersonetal., 1982; Ellegaardet al., 1993; Gosselinet al., 1993; Anderson,1994).La resistenciade estosquisteses tangrande,que Inclusose hallegadoasugerirque el transportede grandesmasasde aguapor el lastrede losbarcosmercantes,conteniendoquistesde dinoflageladostóxicos (hastamás de 300 millones de quistesen un sólo tanque),haría de inóculoinicial de una poblaciónen lugaresextraordinariamentealejadosde lazona original de dicha población (Anderson,1994),

En tercer lugar, los quistespuedenser un mecanismode defensacontra la predación(Dale, 1983) dadala resistencia que tienen susparedesy la tendenciade los quistesa depositarseen el sedimento,

Y en cuartoy último lugar, aunqueno por ello menosimportante,losquistes de resistenciay su posibilidad de actuar bajo condicionesfavorablescomoun inóculo inicial de la columnade agua,sonunade lashipótesissobrela formacióny el origen de las mareasrojas (Steidinger,1975; Anderson& Wall, 1978; Blanco, 1989; Estrada,1989; Rigby etal,, 1993).

Una vez que las condicionesambientalesmejoran, estosquistesderesistenciapuedengerminarparadarde nuevo lugara la fasevegetativahaploide. La germinación de los quistes de dinoflageladoses unfenómenoque ha sido ampliamenteestudiado,y que, tradicionalmentese aceptacomo el resultadode unacomplejainteracciónentrediversosfactoresambientalescomo la duracióndel día, la intensidadde la luz, latemperaturay la cantidad de nutrientesy oxígeno (Anderson, 1980).Pero la regulaciónde la germinacióntodavíaes un problemaque no se

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ha llegadoa resolver,ya quedespuésde su formación los quistesentranen un periodo de “quiescencia”en el cual, aunquelas condicionesambientalesseanidóneas,no se produce la germinación(Pfiester &Anderson, 1988). Se ha propuestoque, en una alternativa a losmecanismosambientales,existenmecanismosbiológicosque regularíanestagerminacióny asíse han sugeridodiversosmecanismosbasadosenla existencia de relojes endógenos(Anderson & Keafer, 1987; Costas&Varela, 1989).

1.13- Justificación

Tradicionalmentese asume que todos estos mecanismossoncaracterísticosde los organismospluricelulares.Sin embargo,trabajosrecienteshacensuponerque los mecanismosde control de la divisióncelulary los fenómenosde inhibición por contactoy de envejecimientopuedenser universales,quizácomo consecuenciade su origen evolutivoen una fecha muy temprana,y que afectaríanpor tanto a todo tipo decélulaseucariotas(Nurse, 1990; North, 1991).

La comprensiónde los procesosimplicados en el control de ladivisión celular en los organismospluricelularesresulta más dificildebido a la complejidad que en ellos alcanzarondichas vías, Sinembargo,estauniversalidadde los mecanismosde control del ciclo dedivisión celular puede abordarseutilizando determinadosphyla deorganismos unicelulares, que, aparentemente.jugaron un papeldestacadoen la aparición y diversificación de las células eucariotas.Estudiardichosprocesosen eucariotasmássencillos debidoa su mayorsimplicidad, puede permitir una visión global e integradora delfenómenode la división celular y de los controlesejercidossobreella,así como una mejor comprensiónde los procesosindividuales quetoman parte en ella. Además, si se enfocan con una perspectivaevolutiva, podrían proporcionar una valiosa información paracomprender cómo se originaron estos mecanismos,y cómo sediversificaronhastaalcanzarla complejidadque tienen en los eucariotassuperioresde hoy en día,

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A pesarde que los estudiosrelativosa la regulacióndel ciclo celularsehan realizadoen unagranvariedadde organismos,que abarcandesdeeucariotasmuy primitivos como levadurashastalos más evolucionadoscomo el hombre, estetipo de estudiosno se harealizadoen microalgas,que sin embargotuvieron gran importanciaen el procesoevolutivo quedió lugara la apariciónde las primerascélulaseucariotas,

Así, intentaremosestudiar todos estos controles de la divisióncelular, aparentementecaracterísticosde células evolucionadas”,enorganismosprimitivos que tuvieron cierta importanciaen la apariciónydiversificaciónde las célulaseucaríotas.

En primer lugar dedicaremos un especial interés a losdinoflageladospor suspeculiarescaracterísticas.Los dinoflageladoshansido consideradoscomo los organismosde transiciónentreprocariotasy eucariotas,acuñándoseparaellos el término de mesocariotas(Dodge,1965), También han sido consideradoscomo los eucariotasmásprimitivos (Bujak & Williams, 1981). Más recientementehan sidoconsideradoscomo una línea hermanade los actuales eucariotas,filogenéticarnenteparalelosa ellos, pero no susantecesoresevolutivos(Loeblich, 1976; Bujak & Williams, 1981; Herzog et al,, 1984). Losdinoflageladossurgieron hace unos 800 millones de años. En estetrabajo utilizaremos dinoflageladosprimitivos como los prorocentralesProrocentrum lima (Ehrenberg)Dodge y ProrocentrumtriestinumSchíller, así como dinocontasmás evolucionadoscomo Alexandriumtamarense(Halim) y & anriu xcay~ta Balech.

Estudiaremosademásrepresentantesde dos grupos de verdaderoseucariotas,supuestamenteprimitivos: el gamofito Sniro~vra insWnis(Hasalí) Kutz y la praxinoficeaTetraselmis suecica Stein, Además,trabajaremoscon uno de los gruposeucariotasde recienteaparición:labacillaroficeaPhaeodactvlumtricornutum(Bohlin).

-35-

Los gamofitos son algas verdes, de células simétricas y concloroplastosalineadosnormalmentea lo largo del eje longitudinal de lacélula, Todos ellos son de aguadulce, encontrándosehabitualmenteenaguasde estanques,lagos y ríos, Tradicionalmente,los gamofitos seclasificabandentro del grupo de los clorófitos, siendoconsideradosunode los antecesoresevolutivos de las plantas superiores,pero en la :1actualidad se les agrupa aparte (Margulis & Schwartz, 1985).Aparecieronhace300 millones de años.

1’sí

Por su parte, las praxinofíceasse consideranpartede los clorófitos,que constituyenuno de los principalescomponentesdel fitoplancton,estimándoseque fijan másde 1000 millones de toneladasde carbonoalaño en los oceanosy maresde agua continental,Aparecieronhaceaproximadamente1000 millones de años,siendoconsideradaslas algasverdesmásprimitivas (Margulis & Schwartz, 1985). £

En tercer lugar, las diatomeas se encuentranampliamentedistribuidas en las zonasiluminadasde los ecosistemasacuáticosdetodo el mundo, constituyendouno de los grupos basede las cadenastróficas de los oceanosy de las aguascontinentales.Actualmentesepiensaque existenunas 10 000 especiesvivas, pero estosorganismosaparecieronen el Cretácico(desdehace 138 a 66 millones de años)de 1forma que existen cientos de especiesfósiles (Margulis & Schwartz,1985). Ñ

‘1U‘Ji

11-36-

1.14- Objetivos

En estetrabajonos planteamosqueestosmecanismosde control dela proliferacióncelularpodríanhaberaparecidoen unaépocatempranade la evolución, asociadosa la aparición de las célulaseucariotas.Porello nos proponemoslos siguientesobjetivos:

1) Estudiardesdeun punto evolutivo, si microalgas representantesde grupos filogenéticosque tuvieron relativa importanciaen el procesoque dió lugar a organismospluricelulares,respondena determinadosmitógenoscomo lo haríacualquiercélula de mamíferou otro organismoeucariotamás evolucionado.Durante los últimos cuatro años estoscontroleshan sido estudiadosen algunosde los organismoseucariotasmás primitivos (las levaduras)y en muchosorganismosde una granvariedad de phyla llegando hastael hombre, y siendo consideradosuniversalesa todos ellos. Sin embargo, las microalgas han sidoescasamenteestudiadasa pesarde tenergran importanciaen la escalaevolutiva, especialmenteen la aparicición y diversificación de losprimerosorganismospluricelulares.

2) Estudiaremosel crecimiento de los organismosen mediossuplementadoscon diversos factores de crecimiento, analizando elposible papel ecológico que podríantenerdichos mitógenosen mediosnaturales.Tradicionalmente,la proliferación de las microalgases unfenómenoque en el laboratorio ha sido achacadoa la presenciaoausenciade determinadosfactoresnutricionalesen el medio de cultivo,mientras que en los estudios ecológicos de campo, el cese delcrecimiento o los blooms proliferativos de microalgas se achacanprincipalmentea factores ecológicoscomo la ausenciao presenciadenutrientes específicos,determinadascondicionesluminosaso inclusocondicionesde estabilidaden la columna de agua. Sin embargo, lasúltimas hipótesis al respecto apuntan hacia un control de laproliferación celular, que no sólo se basaen factores ecológicossinotambién en factores biológicos, como puedenser la presenciaen elmedio de factoresde crecimiento o el envejecimientocelular.

-36-

3) Analizaremos si los factores de crecimiento pueden ser unmecanismobiológico de control de la germinaciónde determinadosquistesde dinoflagelados.Si la regulacióndel ciclo de división celular esun mecanismouniversal,y los factoresde crecimientoson capacesdeinducir la división celular en zigotos o en células quiescentesdemamíferoquizá seantambién capacesde regularla germinaciónde losquistesde dinoflagelados,

4) Por último analizaremossi la Inhibición por contacto es otromecanismode regulaciónde la división celular presenteen organismosprimitivos. Hasta ahora este tipo de fenómenohabía sido descritosolamente en organismospluricelulares, y más concretamenteencélulasevolucionadasde mamífero,Perosi el mecanismode regulaciónde la división celular es universala todas las célulaseucariotas,y lainhibición por contacto forma parte de este control, las algasunicelularestambiénpodríantenerlo.

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MATERIAL Y MIETODOS

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MATERIAL Y METODOS

2.1- Condicionesgeneralesde los cultivos

2.1.1-Aislamientoy fundaciónde clones

Parala realizaciónde los experimentosse trabajó con organismospertenecientesa niveles evolutivosmuy distintos entresí: mesocariotas(dinoflagelados)y verdaderoseucariotas(protistas como gamophyceae,pradnophyceaey bacillartophyceae).

Los dinoflageladostuvieron una procedenciadiversa: los tres clonesde ProrocentrumtriestinumSchiller (Pt-a. Pt-b, Pt*) fueron aisladosapartir de la marearoja que tuvo lugar en Septiembrede 1983 en lascostas gallegas (Costas & Varela, 1987). Prorocentrum lima(Ehrenberg)Dodge y Alexandrium excavataBalech procedíande lacolección de dinoflageladosdel Instituto Español de OceanografiadeVigo y fueron aisladosen la Ría de Vigo en 1989. Por último setrabajócon dos tipos celularesdistintos de Alexandrlum tamarense(Halim)Balech: quistesrecogidosen un sedimentoarenosode la Bahía de LaCoruña en Marzo de 1991, y célulasvegetativasprocedentesde dosclones(At-a. At-b) aisladasen la Bahíade La Coruñaen Mayo de 1985.

Los protistaseucariotasTetraselmissuecicaStein (praxinophyceae),Phaeodactilumtricornutum (Bohlin) (bacillariophyceae)y Snirogvrainsignis (Hasalí) Kutz (gamophyceae),Las dos primeras especiesseaislaron en la Ría de Vigo en 1989 y procedíande la colección delInstituto Español de Oceanografíade Vigo, mientras que 5. insWnisseobtuvoen 1989 apartir de una muestrade aguadel Pantanode Argandadel Rey.

Todos los clonesde cadaespeciese obtuvierona partir de unaúnicacélula vegetativa haploide de la muestra inicial mediante unamicropipeta.Dicha celula fué depositadaen una placa de Petrí, De estaforma es posible obtenercultivos clónicos a partir de esaúnica célulaque, dividiéndoseasexualmente,darla lugar a una poblaciónen la quetodos los individuos seriangenéticamenteidénticos.

-40-

En el casode la gamophyceaeS. insWnis el procedimientoseguidofué distinto por ser un alga filamentosa:sealsló un solo filamento de lamuestrainicial mediantepinzasy se depositóen una placa de Petrí,Todas las célulasdel filamento serángeneticamenteidenticas ya queproceden de una única célula inicial; en el caso de producirsereproducciónsexual (conjugación)el zigoto diploide resultante daríalugar mediantemeiosisa dos célulasidénticasa susantecesores.

2.1.2- Mantenimientode los cultivos

Todaslas especiesmarinas(P. lima, P. triestinum, A. tamarense,A

.

excavata,T. suecica,P. tricornutuml se cultivaron en placasde Petrí con20 ml de agua de mar natural procedentede la Bahía de La Coruñaenriquecidacon medio f/2 de Guillard sin silicatos (Sigma).

La especiede aguadulce, Sniro~yra insianis, creció en placasdePetrí con 20 ml de agua dulce procedentedel Pantanode Arganda,enriquecidatambiéncon medio f/2.

El medio f/2 es un medio de enriquecimientoideal para muchasespecies de microalgas, ya que les proporciona los nutrientes yvitaminas necesariaspara su crecimiento (Guillard, 1975; Navarro,1990). Su composiciónquedareflejadaen la Tabla 1 del Apéndice.

Todos los cultivos se conservaronen cámarasde cultivo coniluminación continua de 50 ~.tEinm2 s-1 de intensidad y a unatemperaturaconstantede 20±10C.

Paramantenerlos cultivos en el tiempo se realizarontransferenciasseriadascada 15 días o cadames dependiendodel organismo,de uninóculo a medio fresco, siempreen condicionesrigurosamenteaxénicas.

Además,y paraevitar posiblescontaminaciones,siemprese trabajóen cámara de flujo con medios filtrados (0,22 ~.t millipore) yesterilizadospreviamente.Como medidade seguridad,se tratarontodos

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los cultivos con 150 mg E1 de Penicilinay 100 mg E’ de Estreptomicinaen un pulso de dos horas.

Previamentea la realización de los distintos experimentossecomprobóla inexistenciade bacteriasen el cultivo medianteel uso detécnicasde epifluorescencia.Paraello se tiñe la muestrade aguaconuna solución de 0,1 mg mV1 de Naranja de Acridina, paraposteriormentepasar la muestra por un filtro negro de 0~22k(Millipore). Si a continuaciónse coloca el filtro sobre un porta y seobservaal microscopiode fluorescencia,es posiblecomprobarsi existeno no bacteriasen la muestra,

2.1.3- Tasasde reproducción

Para cuantificar el crecimiento de los cultivos, se utilizó elprocedimientohabitual de medir las tasasde reproducciónmáximasaclimatadasen divisiones díw1 segúnla fórmula de Crow y Kimura(1970):

div dia1= 1/Ln2 Ln(Nt/No)/t

siendo: Nt= númerode célulasen el tiempo tNo= númerode célulasen el tiempo Ot= tiempo

Además,en el casodel experimentocon factoresde crecimiento,semidió el crecimiento celular en densidadescelulares, contando elnúmero de células mL1 durante los días en que se efectuó laexperiencia.

Tanto los dinoflagelados.como la gamophyta S. insWnis y lapraxinophytaT. suecica, se contarondirectamenteen un microscopioinvertido ZeissAxiovert.

Cuandose realizauna transferenciade algasa medio nuevo,éstascrecende una forma exponencial,hastaun momentoen el que la falta

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de nutrientes o fenómenosdensodependienteslimitan su crecimiento(Alberts et al,, 1992; Costas et al,, 1993). Entonces,las algas seempiezana dividir sexualmenteformandozigotos o quistesdiploides ydisminuyendode estamanerala poblacion, pudiendoincluso llegar adesaparecer.Es por ello por lo que el contaje de células se realizósiempre durante los 10 primeros días despuésde la transferencia,tiempo estimadoen el que el cultivo creceexponencialmente(Brand etal,, 1981),

El númerode contajesa realizaren cadacasose estimómediantelaTécnica de las Medias Progresivasde Williams (1977). obteniéndoseunerror inferior al 5% en todos los casos.

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2.2- Estimación del efectode los factores de crecimiento sobre elciclo celular de los distintos organismos.

Para cuantificar el efecto que producían distintos factores decrecimiento así como un mitógeno artificial (ester de forbol), sobre elcrecimiento de diversasmicroalgasunicelularespertenecientescadauna de ellas a un nivel evolutivo diferente, Así, se analizaronlassiguientesespecies:P. lima, 5, insi~nis, Iu~ka y P. tricornutum

,

Tres replicadosde cada especiecrecieron en placasde Petrí con20 ml de medio artificial ASPM en el casode ser organismosmarinosoen aguadestiladaen el casode ser dulceacuicolas.Ambos mediossesuplementaroncon un enriquecimientof/2 (Sigma) sin silicatos, ElASPM es un medio artificial empleadohabitualmentecomo sustitutodelagua.de mar. Dado que se conocentodossuscomponentes,esun medioideal parapoderdiscernir de una maneraprecisael efecto de cualquiercompuestoque se añadaal medio sobrelos organismospresentesen él,Estono seríaposible si se empleaseaguade mar natural,ya que podría

poseersustancias(factoresde crecimiento,metabolitosde excrecióndeotros organismos, sustanciastóxicas, etc) que interferirían en elcrecimiento de las microalgas, La composición del ASPM quedareflejadaen la Tabla 2 del Apéndice.

De la mismamanera,el aguadestiladaes un medio frecuentementeutilizado con organismosde aguadulcecomo sustitutadel aguadulcedeprocedencianatural,

Paraestimar el efecto producidopor los factoresde crecimiento,elmedio de cultivo fué suplementadocon diversosfactoresde crecimientoy mitógenos artificiales en las concentracionesque se indican acontinuación:

1- Un control en ASPM f/2 o en aguadestiladaf/2 paraorganismosmarinosy dulceacuicolasrespectivamente(A),

2- A + 10 ng/ml de Factorde CrecimientoDerivado de PlaquetasPDGF (SIGMA).

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3- A + 10 ng/ml del ester de forbol Monoacetato 12 de Forbol(PMA) (SIGMA).

4- A + 10% de SueroBovino Fetal (FBS) (FLUKA).

Los organismosasí cultivadossemantuvieronen cámarasde cultivocon una temperaturaconstantede 20±10C,un régimen de iluminaciónde 12:12 br Luz-Oscuridady una intensidadluminosa de 50 kxEin nr2si,

Finalmente, se hallaron las tasas de reproducción máximasaclimatadasen divisiones dia-1 mediantela fórmula de Crow y Klmuraanteriormentemencionada.

En una segundaprueba, se trataronvarios dinoflageladoscon los

mismosfactores de crecimiento,El grupo de los dinoflageladoses unode los grupos filogenéticos más controvertido, siendo consideradosorganismosintermediariosentreprocariotasy eucariotas(Dodge, 1965)o antecesoresevolutivos de los eucariotasactuales(Bujak & Williams,1981). Por ello, un mayor estudiode su ciclo de vida así como de lasrutas que controlan su ciclo de división celular podría aportarinteresantesavancesen su posición filogenética.

De este modo, trabajamoscon dos especiesde dinoflagelados:elprorocentralP. triestinumy el dinocontaA. tamarense.Tres replicadosde cada clon (Pt-a, Pt-b, Pt-t At-a, At-b) crecieron en las mismascondicionesexperimentalesque se mencionaronanteriormentey conlos mismos factoresde crecimiento, así como en aguade mar naturalprocedentede la Bahíade La Coruña,y enriquecidacon f/2.

En este caso, el crecimiento de los organismosfué estimadomediante el método habitual de medir las tasasde reproducciónendivisionesdía-1, así como midiendolas densidadescelularesen célulasmí-1, como un métodomás eficaz paraevaluarcorrectamenteel procesoseguidopor el cultivo día a día durantetodo el experimento.

ti

-45-

2.3- EstImacióndel efectode los factoresde crecimientosobrelagerminación de los quistesde dinoflagelados.

Para estimar el efecto de los factores de crecimiento sobre lagerminaciónde los quistesdel dinoflageladoAlexandrium tamarense,seempleó un sedimentode arena superficial recogido a 1 metro deprofundidaden la Bahíade La Coruñaen Marzo de 1991, con el aguaaunatemperaturade 13,5 0C.

Dado que las bacteriasson capacesde sintetizary excretarfactoresde crecimiento al medio (Morotomí et al., 1990), su presenciaen elsedimentoarenosopodríasuponeruna alteraciónde los resultados.Porestarazón, los sedimentosque se iban a utilizar en el experimentosetrataron previamentecon antibióticos para eliminar las bacteriasquepudieranestarpresentesen el medio, Así, varias alícuotasde 1 ml desedimento se lavaron tres veces con medio artificial ASPM mediantecentrifugación, y se trataron posteriormentecon 150 mg 1-1 d epenicilina y 100 mg 1-1 de estreptomicinaduranteun periodo de 2horas,A continuación,las muestrasse volvieron a lavar paraeliminar lapresenciade los antibióticos.

Sin embargo, al desconocerel efecto que pudieran tener losantibióticos sobre la germinaciónde los quistes,se realizó una pruebapreviaque consistióen que 4 alícuotasde 1. ml de sedimentocadaunase dejaroncrecersimplementeen 3 ml de medio ASPM f/2, mientrasque otras 4 se trataronpreviamentecon 150 mg V1 de penicilina y 100mg ~ 1 de estreptomicina durante un periodo de 2 horas.Posteriormente,se contó el númerode célulasvegetativasen cadacasoy se comprobó la inexistenciade diferenciassignificativas entre lagerminaciónde unosquistesy otros,

A continuación, 4 alícuotas ya axénicasde 1 ml cada una sedepositaronen placasmultiensayocon 3 ml de los siguientesmedios:

1- Un control en aguaartificial ASPM con enriquecimientof/2,2- Un control en ASPM f/2 suplementadocon un 10% de medIo

RPM! (DIFCO).

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3- ASPM f/2 suplementadocon 10 ng mV’ de PDGF (SIGMA).4- ASPM f/2 suplementadocon un 10% de FBS (FLUKA),

El RPM! es un medio standardutilizado habitualmenteen loscultivos de célulasde mamíferoque proporcionanutrientesperoningúnfactor de crecimiento.

Todos los cultivos se mantuvieronen cámarasde cultivo con unailuminación de 50 gEin m2 s’•~ y un periodode 12:12 horas de luz-oscuridada 200C. Paraevitar diferenciasen el grado de Iluminaciónrecibida, todaslas placasmultiensayose cambiabanaleatoriamentedesitio unavez al día,

Pararealizarel contajede las célulasgerminadas,todos los días seretiraba el medio líquido de cada pocillo con una jeringuilla estéril,evitandohacerturbulenciasen el sedimentoarenoso.A continuación,sefijaba la muestralíquida con formaldehídoal 4% y se contabanen unmicroscopioinvertido las célulasvegetativasde A. tamarensequehabíangerminado.Una vez efectuadoel contajede las células, se procedíaalllenado de los pocillos con otros 3 ml de cadamedio respectivo.

Este procedimientose realizó todos los días, a la misma hora yduranteun periodode 7 días,que fué el tiempo en el que seobservaroncélulasvegetativas,

Al mismo tiempo, se fijaron muestrasdel sedimentooriginal paracontar el número de quistes mí-1 de sedimentoen cada pocillo alprincipio del experimento.Así se pudo estimar posteriormenteelporcentajede germinaciónparacadatratamientocomo el númerototalde células germinadas/númerototal de quistes en el sedimento alprincipio del experimento.

-47-

2.4- Estimación del efecto de la inhibición por contacto en distintosorganismos

En un intento de comprobarsi la inhibición por contacto es unmecanismode control de la proliferación celular que fué desarrolladoantesde la apariciónde los organismospluricelulares,sometimosa losdinoflagelados Alexandrium excavata,Prorocentrum lima yProrocentrumtriestinum, a la gamophyceaeSniro~vra insignis, a lapraxinophyceaeTetraselmissp. y a la bacillariophyceaePhaeodactilumtricornutum a 3 tipos de experimentos.

Los cultivos de las distintas especiesse cultivaron tal y como sedescribeen los puntos2.1,1 y 2.1,2, mediantetransferenciasseriadasde inóculosde 500±30célulasa medionuevo unavez cadadía. De estaforma, los cultivos crecieronexponencialmenteduranteunos 20-30 díasy despuésempezarona mostrar evidenciasde una clara inhibición delcrecimientodebido, aparentemente,a una alta densidadcelular o a unafalta de nutrientes.El método usadopara detectarcuando un cultivoalcanzabala saturación,fué el de medir diariamente las tasas dereproduccióny la densidadcelular (en célulasmí-1); así, cuandola tasase aproximabaa cero (es decir, no existía practicamentecrecimiento)yla densidadcelular alcanzabasu máximovalor, el cultivo se considerabasaturado,

Tres díasmástardede considerarseel cultivo saturado,se procedióa realizarlos 3 experimentossiguientes,que quedanesquematizadosenla Figura7.

Experimento 1- Cinco replicados de cadaespeciese centrifugarondurante20 minutos a 1000rpm y seresuspendieronen la mismacantidadde medio nuevo,Es decir, obtendremosun cultivo conmedio nuevoperocon una densidadcelulara saturación.Semidieron entonces,durante5 días las tasasde reproduccióny lasdensidadescelulares.

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Figura 7- Esquema de los procedimientos a los que fueron sometidos losdiferentes cultivos celulares.

CULTIVO SATURADO

Experimento 1 Exper¡mento 3

*Centrifugación

Experimento 2

+Centrifugación

*Centrifugación

Eliminar elsobrenadante t Eliminar el

precipitado

Resuspender enmedio nuevo

Filtrar el medio00,22U

Eliminar mecánicamentela mitad del cultivo

Tendremos un cultivocon medio nuevo y

densidad celular elevada

4Añadir ináculo nuevo

con células en crecimientoexponencial

4Tendremos un cultivo conmedio saturado y densidad

celular baja

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Exoerimento2- CInco replicadosde cadaespeciese centrifugarondurante20 minutos a 1000 rpm, A diferenciadel casoanterior,despuésde la centrifugaciónel medio saturadose filtré a travésdeun filtro de 0,22 ~x,obteniendoseasí un medio saturadolibre decélulasy axénico,A continuaciónun inóculo de cadaespeciecon lascélulas en crecimiento exponencialse dejó crecer en este medio.

Es decir, obtendremosun cultivo con un mediosaturadoperocon unadensidadcelularbaja.

Con estos dos experimentoses posible discernir si las célulasveninhibido su crecimiento por un proceso de inhibición por contacto(elevadadensidadcelular) o bien por fenómenostales como la falta denutrienteso la acumulaciónde metabolitosde deshecho,de una maneramutuamenteexcluyente. Así, si las células presentanfenómenosdeinhibición por contacto,seráncapacesde crecer en el experimento2(densidadcelular baja) perono en el experimento1 (densidadcelular asaturación).Por el contrario, si la proliferacióncelularseve inhibida porfalta de nutrienteso acúmulode catabolitos,lascélulasno seráncapacesde creceren un medio saturadopero sí en un medio nuevo con aportede nutrientes:es decir, no creceránen el experimento2 pero sí en el1.

Exuerimento 3- Asimismo, se realizó otro tipo de experimentoenaquellasespeciescapacesde creceren monocapa:S. insianisy li.lima. Cinco replicadosde cadaespeciecrecieronen placasde Petríhastaalcanzarla saturación.Unavezque los cultivos alcanzaronlasaturación,se procedióa la eliminación mecánicade las célulasdeunade lasmitadesde la placade Petri, tal y como sehacehabitualmenteen los estudioscon fibroblastos de mamífero,En estecaso, si las células de la mitad de la placa que no han sido

eliminadas continúan creciendo,significaría que su crecimiento sevió inhibido por un fenómeno de inhibición por contacto (aldisminuir la densidadcelular puedenseguircreciendo),

Para valorar los 3 experimentos, se midieron las tasas dereproduccióny las densidadescelularesdurantelos 5 días siguientesalinicio de los mismos, en cada uno de los cinco replicados de cada

-50-

especie.Las densidadescelularesse estimaron como el número decélulasmL1 (o por cm2 en el caso del experimento 3 en el cual semidieron las célulaspor unidad de área),Las tasasde reproducciónsemidieron en divisiones día-’ (Crow & Kimura, 1970). Así mismo, secalculó el porcentajede incrementode densidadcelular (¾A) en las 24horassiguientesde realizadoel experimento,

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2.5- Análisis estadístico

Las comparacionesestadísticasse realizaron, en todos los casos,mediantelas pruebasno paramétricasde la U de Mann Whitney para lacomparación de dos medias, y la 1-1 de Kruskal Wallis para lacomparaciónde tres o más muestras (Siegel, 1956). Elegimos laestadísticano paramétricadebido a que no se puede asumir lanormalidaden la distribuciónde todos los resultadosobtenidos,

El test de U de Mann Whitney es la alternativano paramétricamáseficaz a la pruebaparamétricat de Studentparala comparaciónde lasmediasde dos grupos independientes.Su relación potencia-eficienciaes de un 95,5%.

Por su parte, el test H de Kruskal Wallis tiene también unarelaciónpotencia-eficacia del 95,5% frente a la pruebaparamétricaF, siendopor tanto la alternativano paramétrica más eficaz para la comparaciónde tres o másmuestras,

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RESULTADOS

-53

2

RESULTADOS

3.1- Resultadoscorrespondientesal efectode los factoresdecrecimiento sobreel ciclo celular de los organismos

En la Tabla 1 se representanen divisiones día-’ las tasas dereproducciónmáximasaclimatadasde todos los organismosen los 5mediosensayados:control en ASPM o en aguadestiladaenriquecidoconf/2 y sin ningún aporte de factores de crecimiento, medio “control’suplementadocon Factorde CrecimientoDerivado de Plaquetas(PDGF),medio “control” suplementadocon Monoacetato 12 de Forbol (PMA),medio ‘control” suplementadocon Suero Bovino Fetal (FBS) y medionatural(agua de mar o dulce) enriquecidocon f/2, Del mismo modo, lasFiguras 1-5 del Apéndicerepresentanel crecimiento de cadaorganismoen dichosmedios.

Aunque se trata de organismosfilogeneticamentemuy diferentesentresí, todos ellos muestranun aumentode su tasa de reproduccióncon la adición de factores de crecimiento,Así, todos los organismostienen una tasa de reproducciónmínima en el control sin factores decrecimiento, y tanto el PDGF, el FBS o el PMA producen grandesdiferencias(pcto,Ol) en su proliferación.

En todos los casos,exceptoen el dinoflageladoProrocentrumlima

,

el valor máximo de proliferación es alcanzadoen presenciade FBS, queproduceincrementosde hasta8.71 y 9.66vecesel valor alcanzadoen elexperimentocontrol en los casosde los eucariotasTetraselmissuecicaySpiro~Tra insianis respectivamente.

Por otro lado, tanto el PDGF como el PMA, provocanunastasasdereproducción muy similares en todos los organismos, no existiendodiferenciassignificativas (p>O,OS) entrelos valoresalcanzados.

Entre todos los organismos ensayados, los que sufren unaproliferación mayor en presenciade factores de crecimientoy del PMAsonlas eucariotas,particularmentela gaimophyta5. insignis, cuyatasadereproducción “control” se incrementaun promedio de 9.33 veces en

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Tabla 1- Tasasde reproducciónen divisiones/díade los distintos organismosen los mediosensayados.Con una * se indica la inexistenciade diferenciassignificativas(pcco,01) entrelas tasasde reproduccióndel medio control y lastasasen mediossuplementadoscon factoresde crecimiento,y con ** seindicala existenciade diferenciassignificativas(p>O,0S).

PDGF= Factorde crecimientoderivadode plaquetasPMA= Monoacetato12 deforbolFBS= Suerobovino fetalAguanatural=Aguade mar o dulce, segúnlos organismos

Medios P.lima T.suectca Sinsignis P.tricornutum

ASPM f/2 (A) 0,13±0,04 0,14±0,02 0,12±0,07 0,12±0,02

A+PDGF O,61±O,03** 1 ,02±0,02** 1,11±0,02** 0,73±0,02**

A+PMA 0,58±0,08** 0,94±0,04** í,o9±o,o4** o,62±o,o2**

A+FBS 0,53±0,02** 1 ,22±0,04** 1,16±0,04~ 0,83±0,03**

Aguanatural 0,31±0,08** 0,74±0,01** 0,36±0,02** 0,51±0,04**

ti

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presenciade factores de crecimiento,mientras que el dinoflageladoL

ilma seencuentraen una posición intermediaal ver Incrementadasu

tasade reproducciónunamediade 3.90 vecesrespectoal control.

Un hecho a destacares el crecimiento que se produce en losorganismoscuandoson cultivadosen un medio natural (aguade mar odulce, en cada caso). Todos los organismosalcanzanunas tasas dedivisión, que si bien son superioresestadisticamente(pc0,01) a lasobtenidasen un medioartificial, son menores(pc0,01) a los valoresquese alcanzanen un medio suplementadocon factoresde crecimiento,Asípor ejemplo, T, suecicamultiplica una media de 7,5 vecessu tasadedivisión control con factores de crecimiento,mientras que solo lo hace5,28 veces en agua natural: lo mismo les ocurre al resto de losorganismos: tanto P. lima, como S. insignis o P. tricornutum venincrementadassu tasa de división en presencia de factores decrecimiento un promediode 4.40, 9.33 y 6.05 veces respectivamente,mientrasque en un medio naturalsolo lo hacen2.38, 3.00y 4.25 veces,

En cuanto a la respuestaparticular de los dinof?lagelados,quedareflejada en la Tabla 2, Todos ellos (excepto el clon Pt* de Ltríestínuml respondende una manerasemejante:en presenciadefactores de crecimiento y mitógenos artificiales incrementansignificativamentesu crecimiento (pc0,001) respecto a los controlescarentesde factores de crecimiento, Además,tanto el PDGF como elPMA provocan incrementos similares de proliferación en cadaorganismo no encontrandosediferencias significativas entre ellos(p>0,0S). Así, los dos clones de Alexandrium tamarense,At-a y At-b,incrementan su tasa de reproducción una media de 398,33% y318,18%en presenciade factoresde crecimiento,mientrasque los dosclones de Prorocentrum triestinum, Pt-a y Pt-b, lo hacen en un423,33% y un 287,33% respectivamente.Las Figuras 6-10 delApéndice representanel crecimiento de cada organismo en losdistintos medios,

-56-

Tabla 2- Tasasde reproducción en divisiones/díade los distintos dinoflageladosen los medios ensayados.Con una * se indica la inexistenciade diferenciassignificativas(p>0,05)entrelas tasasdereproduccióndel medio controly las delos mediossuplementadoscon factoresde crecimiento,mientrasque con ** seindica la existenciade diferenciassignificativas(pc0,001).

PDGF= Factordecrecimientoderivadode plaquetasPMA= Monoacetato12 de forbolFBS= Suerobovino fetal

M ed los A. tamarense-a A. tarnarense-b 1’. tríesUnum-a , trtestinum-b P tFíeSUTLWJÚ

ASPM f/2 0,20±0,02 0,11±0,03 0,10±0,04 0,21±0,03 0,89±0,02

A+PDGF 0,97±0,06** 0,48±0,06** 0.54±0,09** 0,79±0,06** 0,92±0,03*

A+PMA 0,99±0,OSM0,45±0,04** 0,53±0,06** 0,81±0,03~<0,89±0,01*

A+FBS 1,03±0,07** 0,45±0,03** O,50±0,02** 0,84±0,04** 1,02±0.03*

Aguade mar 0,81±0.04** 0,33±0,05** 0,33±0,03** 0,63±0,O5*~l~ 0,90±0,03*

-57-

De todos los dinoflageladosensayados,el clon Pt* de P. triestinumes el que muestrauna respuestamás anómala:su crecimiento espracticamenteel mismo en todos los casos,no existiendo diferenciassignificativas (p>0,0S) en las tasas de reproducción alcanzadasenmedios carentesde factoresde crecimientoy en mediossuplementadoscon ellos, Incrementandosu tasade división apenasen un 5,99% sobrela tasaobtenidaen el medio control carentede factoresde crecimiento,

Por último, comentarque cuandolos dinoflageladosson cultivadosen un medio marino natural, sustasasde reproducción,aunquesuperanlas obtenidasen un medio control, no llegan a alcanzarlos valoresquese obtienenen mediossuplementadoscon factoresde crecimiento,Estageneralizaciónno sehaceextensivaal clon Pt~ de P, triestlnum, dondeno existen diferenciassignificativas entre el crecimiento en un medionatural (0,90±0,01divisonesdia-’), el crecimientoen un medio control(0,89±0,02 div día-’) e incluso el crecimiento en un mediosuplementadocon FBS (1,02±0,03div día”1) (p>O.O5).

El hecho de que Pt~ creciera igualmente en todos los mediosensayados,hizo que se plantearaun experimentoadicional, en unintento de comprobarsi este clon podía excretar algo al medio quepudieradespuésvolver a reutilizarlo, haciendoasí que no fuera capazdecrecer más en medios a los que se les había añadido factores decre¿imiento.Así, se tomó un cultivo de Pt* en crecimientoexponencialy se filtró todo el medio, deshechandoa continuación las células.Teoricarnente,en esemedio, condicionadopor Pt~, existen todos losnutrientescaracterísticosdel medio (ASPM f/2) más todo lo que hayapodido excretarPt*, Sobreesemedio condicionadocultivamosotro clonde Prorocentrum,Pt-v, cuyascaracterísticasnuclearesy citoplasmáticaseran“normales’ (Costas& Goyanes,1989).

La Tabla 3 indica las tasas de reproducciónobtenidas en losdistintos mediosensayadospara Pt-v y Pt*, El medio condicionadoporPU” incrementasignificativamente(pcO,Ol) la tasade reproduccióndelclon Pt-v, alcanzandoseun incrementomayor al 100% con respectoalcontrol en ASPM f/2. Por el contrario, si se realiza el experimentoInverso, es decir se cultivabaPt* sobre el medio condicionadopor Pt-v,

-58-

Tabla 3- Tasas de reproducción en divisiones/díade los dosProrocentrumtriestinwn, Pt-v y Pt~ en los mediosensayados.Con *no existenciade diferencias significativas(p>O,0S) y con ** ladiferenciassignificativas(pccO,Oi).

PDGF=Factorde crecimientoderivadode plaquetasPMA= Monoacetato12 de forbo]FBS= Suerobovinofetalc~Pt*= Medio condicionadopor¡4*c-Pt-v=Medio condicionadoporPt-v

ASPM f/2 A+PDGF A+PMA A+FBS c~Pt* c-Pt-v

PV” 0,89±0,021 0,92±0,03* 0,89±0,01* 1,02±0,02* - 0,86±0,03*

Pt-v 0,20±0,02 0,78±0,02*~ 0,51±0,03**0,82±o,01**0,48±0,03** -

-59-

clones dese indica la

existenciade

no se producíaninguna variación en la tasa de reproducciónde PU”(p>0.O5). La Figura 11 del apéndicerepresentagráficamente estadiferenciaen el crecimientode los dos clones.

Además, en el casode los dinoflagelados,se midió el crecimientode los cultivos en función de la densidadcelular, es decir contandoelnúmero de células/ml día a día durantetodo el tiempo que duró elexperimento.Al tratarsede contajesrealizadosdía a día se representóel crecimientoen rectasajustadasa una ecuaciónexponenial,Como esde esperar,los resultados,que quedanreflejadosen las Figuras8-11 secorrespondencon los obtenidosmidiendo las tasasde reproducciónendivisiones día-1. Todos los clones ensayados(At-a, At-b, Pt-a, Pt-b)crecenespectacularmenteen presenciade factores de crecimientoyadesdelos primerosdías, mientras que en un medio carentede ellos(como el ASPM) el crecimientoes muchomenory mucho máslento, Asípor ejemplo, el caso más evidente es el del clon At-a de A. tamarensedonde la tasa de reproducciónse ve incrementadaun promedio de36,22 vecesen un medio suplementadocon factores de crecimiento,mientras que en el medio control ASPM sólo se incrementa2,68 veces,todo ello al final de los 7 díasque durael experimento.En la Tabla 3 delApéndice se observanlos datosrelativosa la densidadcelular de estosclones,

El aguade marnaturalproduceun crecimientomayorqueun mediocontrol, aunque nuncase llegan a alcanzarlos valores de un mediosuplementadocon factores de crecimiento;en el caso anteriormentemencionado,el clon At-a incrementasu tasade reproducciónunas 16,5vecesaproximadamente.

-60-

Figura 8- Densidadcelularencélulas/mldel clon At-a deAlexandriumtamarenseen los distintosmediosensayados.

PDGF=Factorde crecimientoderivadodeplaquetasFBS=Suerobovino fetalPMA= Monoactato12 de ForbolAguanatural=Aguade mar

10000

8000-

6000-

4000-

2000-

OE+0’OE+0 2 4 6 8

días

a1 ASPM

m A+PDGF

n A+PMA

s A+FBS

t Aguanatural

-61-

FIgura9- Densidadcelularen células/mldel clon At-b deAlexandriumtamarenseen los distintosmediosensayados.

PDGF=Factorde crecimientoderivadode plaquetasFBS= SuerobovinofetalPMA= Monoacetato12 de forbolAguanatural=Aguade mar

O

2 4 6 8

días

3000

OIE+0OE+0

-62-

Figura 10- Densidadcelular encélulas/mldel clon Pt-adeProrocentrumtriestinumen los distintosmediosensayados.

FtJGF=Factorde crecimientoderivadodeplaquetasFBS= Suerobovino fetalPMA= Monoacetato12 de ForbolAguanatural=Aguade mar

rs

‘IVO

días

OE+0 2 4 6 8

3000

1 ASPM

m A+PDGF

n A+PMA

S A+FBS

t Aguanatural

-63-

Figura 11- Densidadcelularen células/mldel clon Pt-b deProrocentrumtriestinum en los distintosmediosensayados.

PDOF=Factorde crecimientoderivadodeplaquetasFES=Suerobovino fetalPMA= Monoacetato12 de ForbolAguanatural=Aguade mar

‘IV0

8

días

10000

OE+0OE+0 2 4 6

-64-

3.2- Resultadosdel efectode los factores de crecimiento sobrelagennlnaciónde los quistesde dinoflagelados

Los datosque reflejan el efecto que tienen los antibióticossobre lagerminaciónde los quistesde Alexandriumtamarensesemuestranen laTabla 4. Como sepuedeobservarno existen diferenciassignificativas(p>~O,OS) entre la germinación que se produce en un medio tratado

previamentecon antibióticos y en otro que no ha sido tratadocon ellos,tanto si se comparadía a día la germinacióncomo si se consideraelperíodototal de 7 días.Así, es posiblela realizacióndel tratamientoconfactores de crecimiento sin que interfiera en él la presenciadebacteriaso el efecto de antibióticos.

En la Tabla 5 y la Figura 12 del Apéndice quedanreflejadaselnúmero de células germinadas(media±desviacióntípica) a lo largo delos 7 días que duró el experimento y en los distintos mediossuplementadoscon factoresde crecimientoy en los medios control,

El hechomásimportantea destacares la casitotal dependenciapor

parte de los quistesde factores de crecimientopara germinar.Así, enlos medioscarentesde factoresde crecimiento (ASPM f/2 y ASPM f/2 +

RPMI) no se produjo practicamentegerminación,alcanzandoseunamediaaproximadade 0,70 célulasgerminadasen amboscasosa lo largode todo el experimento.Por el contrario, la adición al medio de factoresde crecimiento específicos(PDGF) o inespecíficos(FBS), incrementabasignificativamente (p.cO,Ol) la germinación, alcanzandosevalores de3,16 vecesel valor alcanzadoen el medio control ASPM f/2 en el caso

de FBS y de 3,01 el controlen el casodel PDGF.

Tanto el ASPM f/2 como el RPMI son medios nutritivos utilizadoshabitualmenteen el cultivo de líneas celularesde algas y mamíferosrespectivamente;los dos aportan gran cantidad de nutrientes perocarecen de factores de crecimiento, produciendo además unagerminaciónmediasimilar entrelos quistesde A. tamarense(0,71±0,52en ASPM f/2 y 0,68 ±0,48en ASPM±RPMI),no existiendo diferenciassignificativasentreellos (p>0,05).

-65-

Tabla4- Efectodel tratamientocon antibióticossobrela germinacióndelos quistes de Alexandrlwn tarnarense. Se representael número decélulasgerminadaspor día y por ml de sedimento(m±sdde los cuatroreplicados).La germinaciónno seprodujo despuésdel día 7Q~ Con una*se indica la no existencia de diferencias significativas (p>0,05).

Días Control Antibiótico

1 1,0±0,7 1,8±0,7

2 0.5±0,5 0,0±0,0

3 1,0±0,0 1,0±0,7

4 0,5±0,5 0,8±0,5

5 0,8±0,8 0,3±0,4

6 1,0±0,7 1,0±0,0

7 0,3±0,4 0,0±0,0

Total célulasgerminadaspormídurante 7 días

5,1* 4,9*

-66-

Tabla 5- Número de célulasgerminadasde .Alexanclriumtamarense(m±sd)alo largo de los 7 díasque duróel experimento,enlos distintosmediosensayados.

PDGF= Factorde crecimientoderivadodeplaquetasFBS= SuerobovinofetalRPMI= Medio standardde mamifero

Días ASPM f/2 (A) A+RPMI A+FBS A+PDGF

1 1,00±0,70 1,25±1,03 3,75±0,83 4,25±1,22

2 0,50±0,50 1,00±0,70 4,75±1,09 4,50±1,09

3 1,00±0,00 0,50±0,05 5,00±1,22 4,25±0,50

4 0,50±0,50 0,75±0,43 1,75±1.09 2,00±0,50

5 0,75±0,83 1,00±0,70 0,50±0,50 0,00±0,00

6 1,00±0,70 0,25±0,43 0,00±0,00 0,00±0,00

7 0,25±0,43 0,00±0,00 0,00±0,00 0,00±0,00

-67-

Por otro lado, tampoco existieron diferencias entre los efectosproducidospor el PDGFy el FBS (p>O,O5), que producían,como media,respectivamente2,14 ±0,47y 2,25±0,53célulasgerminadas a lo largode toda la experiencia.

Un hecho a destacar es que la germinación sc produjoprincipalmente durante los cuatro primeros días del experimento en el

caso de estar el medio suplementadocon factores de crecimiento; sin

embargo, en ambos controles (ASPM f/2 y ASPM ± RPMI) la

germinaciónocurrió de forma relativamenteuniforme a lo largo de los 7díasen que se observógerminación.

Finalmente, en la Tabla 6 quedan reflejados los datoscorrespondientesa los porcentajes de germinación para cadatratamiento. En los medios no suplementadoscon factores decrecimiento (ASPM f/2 y ASPM+RPMI) el porcentaje de quistesgerminados es alrededor del 27%, mientras que en los mediossuplementadoscon factores de crecimiento este porcentaje llega aalcanzar un 90%, Es decir, la adición al medio de factores decrecimiento incrementade maneraespectacularla germinaciónde losquistes.

-68-

Tabla 6- Porcentajesdegerminaciónde los quistesdetamareaseparacadatratamiento.

% germinaclón=N0 total de célulasgermrnadas/N~principio del experimento

quistesal

PDGF= Factorde crecimientoderivadode plaquetasFBS= SuerobovinofetalRPMI= Medio standardde mamifero

MediosN9 total de células

germinadasporml de sedimento

N0 total de quistesml de sedimentoal principio delexperimento

%germinacíón

ASPMf/2 15 52 29

ASPM+RPMI 13 52 25

ASPM+FBS 47 52 92

ASPM+PDG 45 52 88

-69-

Alexandrlum

3.3- Resultadoscorrespondientesal efectodela inhibición porcontacto en los distintos organismos

En las Tablas7 y 8 sereflejan las característicasde cadaorganismo

ensayadoasí como las tasasde reproduccióny el porcentaje(en %) deincremento de densidad celular (% A) en los dos experimentosrealizados:en un medio nuevocon densidadcelularalta (experimento1)y en un medio saturadocon baja densidadcelular (experimento2)~ asímismo, se indican las tasasde reproducciónde los cultivos en fase

exponencialy de los cultivos saturados,

Quizá el resultado más evidente sea el del dinoflageladoProrocentrum lima, cuyo crecimiento pareceser inhibido claramentepor fenómenos dependientesde densidad celular, alcanzandoIncrementosde un 47% en mediossaturadoscon baja densidadcelular(experimento2) y creciendosolamenteun 2% en aquellosmedios,que,aunquenuevos, presentanuna alta densidadcelular (experimento 1),Tanto las tasas de crecimiento y la densidad celular sonsignificativamentediferentes (p~cO,Ol) en ambosexperimentos.

CuandoEúirna se cultiva en placasde Petri y unavez alcanzadala

saturacióncelular se quitan mecanicamentelas células de una de lasmitadesde la placa(Tabla9), solamentevuelven a crecerlas célulasqueestánen contacto con la zona libre (Figura 12), lo que indica queinicíalmente su crecimiento fué inhibido por un fenómeno denso-dependiente.Estainhibición se produjo, además,cuandoel 69 ±2% dela superficie de la placaestuvollena de células,Todo ello pareceindicar

que ~jjg~, es un organismoque claramenteve inhibido su crecimiento

cuandoel cultivo alcanzaaltasdensidadescelulares,

Por el contrario, hay dos organismoscuyo crecimiento no se ve

afectado por una inhibición por contacto: tanto la praxinophyceaeTetraselmissp. como la bacillariophyceaePhaeodactilum tricornutum

,

no son capacesde crecerpracticanixente(% de incrementocelular de1% y 3% respectivamente)en un medio cuya densidadcelular esbaja(experimento2) y sin embargo crecenperfectamenteen mediosque

-70-

Tabla7- Característicasde las especiesutilizadas

Característica

Prorocentrumlima

Prorocentrumtriestinum

Alexandrium tamarense

Tetraselmissp~

Phaeodactllum

Dinophyceae

Dinophyceae

Dinophyceae

Praxlnophyceae

Bacillarophyceae

Béntico, unicelular

Nadador,unicelular

Nadador,unicelular

Nadador,unicelular

Béntico, unicelulartricornutum

SuirogvrainsWnis Conjugatophyceae Béntico,Filamnentosocenobial

Especie Gnipo

-71-

Tabla 8- Tasas de reproducción y porcentaje de incremento de ladensidadcelular, Experimento 1: medios nuevoscon densidadcelularalta. Experimento 2: medios saturadoscon densidad celular baja. Seindican con ** las diferencias significativas (pc 0,01) entreexperimentosy con * las diferenciasno significativas (p>’0,05).

r expz tasasde reproducciónde los cultivosexponencialesr satur=tasasde reproducciónde los cultivos saturadosr= tasasde reproducción%A= porcentajede incrementode la densidadcelular

los dos

ExperImento 1

r

Experimento 2

r

Prorocentrumhna

Prorocentrurntriestlnum

Alexandrium~arense

0,38±0030.01±0,01

0.91±0,050.01±0,01

0,43±0,03-0,03±0,02

0,03±0,02*4 2±1

0,29±0,02**

0, 12±0,O5~

33±1

0,39±0,074*

0,07±0,024*

12±5 0,07±0,02~

Tetraselmissp. 0,96±0.05-0,04±0,01 0,87±0,074* 138±6 0,01±0,01*4

incomutum

Snirouivrainsi~nis

0,88±0,04 0,02±0,01

0,94±0,05 0,03±0,02

0.52±0,014*

0i8±0,05~~

68±2

19±4

-0,03±0,02~~

0,68±0,05*4

Especie r exp. r satur,

47±2

7±2

7±1

1±1

-2±3

97±6

-72-

Tabla 9- Tasas de reproducción de Prorocentrum lima y ~iragy¿zainsianís en las placas de Petrí cuya mitad había sido mecánicamenteeliminada.

‘Borde’ en dondesehan Zonacuyascélulasnoeliminadolas células hansido eliminadas

Prorocentumlima

Spirogyrainsignis

0,31±0,07

0,47±0,03

0,01±0,0 1

0,03±0,02

-73-

tienen una alta densidadcelular y un medio nuevo (experimento1),alcanzando en este caso unos porcentajes de crecimientoestadisticamente diferentes (p<0,Ol) a los alcanzados en elexperimento2 (138% y 68% respectivamente).Por ello, no parecequeestos organismosdejen de crecerpor unainhibición por contacto.

Por último, hay tres organismos,5. insWnis, P. triestlnum y A

.

tamarense,que crecen en ambosexperimentos(1 y 2), por lo quetienen una respuestacompleja en cuanto a la interpretaciónde losresultados.

Quizá el más complicado de todos ellos sea el dinoflageladoA

.

tamarense,ya que estadisticamenteno existendiferencias(p>O,O5) en

los crecimientosalcanzadosen ambosexperimentos,y practicamenteno es capaz de crecer en ninguno de los dos (12% de %A en el

experimento1 y 7% en el experimento2).

Por su parte, 5. insipnis, que creceun 97% en mediossaturados ycon densidadbajay solamenteun 19% en aquellosmediosnuevosconalta densidadcelular, el fenómenoque predominaes el de la inhibicióndel crecimientopor fenómenosdependientesde densidad,es decir porInhibición por contacto, Cuandoademás,5, insianisse cultiva en placade Petri (Figura 12), los filamentosde célulasvuelven a creceruna vezque sehan eliminado los de una mitad de la placa, lo que indica que,efectivamente,la inhibición por contacto,al menos,es importanteen elcesede crecimientode 5, insWnis

,

Sin embargo,en el dinoflageladoP. triestinum predominaunainhibición del crecimientodebida,no a unaalta densidadcelular, sino aotro tipo de fenómenos,ya que esteorganismocrecesignificativamentemás (p>O,Ol) en medios en los quela densidadcelular esalta, mientrasque practicamenteno sufre incrementoalguno en su crecimientoen

aquellosmedioscuyadensidadcelulares baja,

-74-

Figura 12- Crecimientode Prorocentrumlima y Suiro~vraInsianiscuandolas células fueron eliminadas mecánicamentede una de las mitades deuna plac de Petri. Las flechasrepresentanla línea a partir de la cual seprodujo de nuevo el crecimiento.

a) Cultivo saturadode Prorocentrumlima enel momentoenque seeliminaronlas células.

b) Cultivo de Prorocentnimlima 72 horasdespués,cuandoya empiezanaproliferar de

nuevolas células en lapairtelibrede la placa.

e) Cultivo saturadode Snfro~vrainsl~nIsen elmomentoenqueeliminaronlas células,

d) Cultivo deSniroxvrainsignis72 horasdespués,cuandoya empiezana proliferar denuevo

las célulasen la partelibre de la placa.

4 ++ 41

+ 4. ¡

4. .4.+a4.

DISCUSION

-76

DISCUSION

Todos los organismosanalizadosmuestranuna clara dependenciapor los factores de crecimiento, al igual que ocurre con las células de

mamífero, En todos los casosel suplementarel medio con factores decrecimientoproduceun fuerte incrementoen la proliferación de todoslos organismos:así, las tasasde reproducciónsonmínimasen el controlsin factores de crecimiento, pero tanto el factor de crecimiento

derivado de plaquetas, el suero bovino fetal o el ester de forbol,incrementan significativamente las tasas de reproducción de losdistintos organismos.

Este aumento del crecimiento se debe, aparentemente,al efectomitógeno especifico del factor de crecimiento derivado de plaquetas,monoacetato12 de forbol o suerobovino fetal y no a una deficiencia denutrientes del medio de cultivo corregidacon la adición de factores de

crecimiento. Los factoresde crecimientoson péptidos pequeñosque seunen a receptoresespecíficosde membranadesencadenandounacascadade segundosmensajerosque provocanla división celular.

El factor de crecimiento derivado de plaquetas es un mitógenoespecífico,codificadopor el oncogenc-sis y que actúapor la vía de los

fosfatidil-inositoles induciendo síntesis de DNA y división celular(Ooustinet al., 1986; Cantleyet al., 1991). En estesentido, el efectodelmonoacetato12 de forbol sobre la tasade reproduccióncorroboralaexistenciade la vía del fosfatidil inositol en estosorganismos.Este esterde forbol es un análogo de síntesis artificial del diacilgílcerol, quepenetrapor difusión en la célula y. que actuandodirectamentesobre laprotein kinasa C, induce la división célular de la misma forma que lohace el factor de crecimiento derivado de plaquetasde una manera

natural. Esto explicaría el por qué mediante la suplementación delmedio con monoacetato12 de forbol se obtienentasasde reproducción

en todos los organismosmuy similaresa las que se obtienencon factorde crecimientoderivado de plaquetas.

En presenciade suero bovino fetal, los organismostambién crecen

significativamentemás que en los controles, y en algunos casos es

-77-

cuando se produce una mayor proliferación; esto es lógico si seconsideraque el suerobovino fetal es una fuente inespecíficade factoresde crecimiento, en donde el factor de crecimiento derivado deplaquetases el factor de crecimiento predominante.

Sin embargo,el posiblepapelcorrectorque se puedeachacara losfactores de crecimiento de algunahipotética deficienciade nutrientesdel preparado con agua artificial ASPM f/2 es aparentementedespreciable:el factor de crecimientoderivadode plaquetases tan soloun pequeñopéptido del que se añadeal medio una cantidadínfima (10ng mí-1) y el monoacetato12 de forbol es molecularmenteun ester defabricaciónsintética, del que seañadentambiénapenas trazasy que nose descomponemetabólicamentepor la célula para utilizarlo comofuentede carbonoo energética,sino que solo participa específicamenteen la activaciónde la proteinkinasaC (Kraft & Wayne, 1983).

Todo estoparececonfirmar quelos organismosensayadosnecesitanfactores de crecimiento específicospara proliferar, tal y como ocurrecon otras líneascelulareseucariotas,Su únicadiferenciacon las célulasde mamífero es que son capacesde proliferar con un solo factor decrecimiento, mientras que la mayoría de las líneas celulares demamífero precisan varios factores de crecimiento a la vez (James,1984). Esta es una de las razonesde haberutilizado el suero bovino

fetal, que contienediferentesfactoresde crecimiento. -

Todo ello sugiereque la principal ruta metabólicamediantela cual

todoslos organismosanalizadosregulansu ciclo de división celular, eslaruta de los fosfatidil Inositoles.

Al ser organismos pertenecientesa grupos filogenétícamentealejados, cabe pensar que la regulación del ciclo de división celularmediantefactoresde crecimientopuedeser un mecanismouniversal, loque estaría de acuerdo con la hipótesis de Nurse (1990) que elmecanismode disparode la mitosis es un mecanismocomún a todos losseresvivos, altamenteconservadodurantela evolucióny ya desarrollado

por el antecesorcomún de los primeroseucariotas,

-78-

De la mismamanera,es probableque los primeros receptoresdefactores de crecimiento en los eucariotas primitivos fuesenrelativamente inespecíficosrespondiendoa conjuntos de factores decrecimientode estructurasemejante,y quizá sigasiendo así en muchosde ellos, El que ya estoseucariotashubiesendesarrolladoreceptoresdefactores de crecimiento diferentes pudo ser un hecho de la máximarelevanciaevolutiva, al permitir que los primeros eucariotasya tuvieran

diferentes tipos de factoresde crecimiento,estandoasí preadaptadosalos mecanismosde control de la división celular que se dan en los

organismospluricelulares,dondecadatipo celular respondea un factorde crecimiento determinado,Este hecho sugiere que a lo largo de laevolución los mecanismosde control del ciclo de división celulardependientesde factores de crecimiento alcanzaron una mayordiversidaden los organismospluricelularespara asípodercontrolar elcrecimientode susdistintos tejidos diferenciados,Y quizá esto explíqueel poco tiempo transcurridoentrela aparición de célulaseucariotasy laradiación adaptativa de los organismospluricelulares. Según estahipótesis, el control de la división celular en base a factores decrecimientoprobablementefue alcanzadoya por los procariotasmuchoantes del origen de los primeros eucariotasy se trataría de unaverdaderahomologíaevolutiva,

Evolutivamente,la transición de procariotasa eucariotas,que tuvolugar hace aproximadamente1500 millones de años, fué quizá la másimportante,Se ha sugerido,y es una hipótesisbastanteaceptada,quetanto las mitocondriascomo los cloroplastosde las células eucariotastendríanque ser “derivados evolucionados”de microorganismosque enuna épocamuy tempranade la evolución fueron organismosde vidalibre. Por ejemplo, los cloroplastos aparentementefueron antiguascianofíceasque fueron englobadaspor otra célula y que más tardeestablecieronunarelaciónsimbiótica con ella,

En apoyo de esta teoríaendosimbiótica(Margulis, 1981), algunos yestudiosproponen que tanto las mitocondrias como los cloroplastos

contienenpequeñosfragmentosde DNA cuya organizaciónes similar ala del DNA que contienen los procariotas (Loeblich, 1976; Bujak &Williaims, 1981), mientras que otros más recienteshan encontrado

-79-

bacterias endosimbióticas dentro del mismo núcleo de algunosdinoflagelados(Costas& López-Rodas,1990).

Hoy en día conocemoscon bastante detalle alguno de losmecanismosgeneralesque produjeron esta asociaciónendosimbiotica

(Mai-gulis, 1981: Margulis & Sagan, 1985), si bien nos falta elucidaralgunosde susprocesosfuncionales,Entre ellos, la regulacióndel ciclode división celular debió ser uno de los principales problemasa los quese enfrentaron los primeros eucariotas,que además tuvieron queconseguir una cierta armonía en la división de sus organelas. Elmecanismomediante el cual resolvieron este problema, así como su

origen evolutivo, planteanuno de los principalesproblemasa la biologíaactual. Pero si todos los procariotasque participaronen la asociaciónendosimbióticaque dió origen a las célulascucariotastenían el mismomecanismode control de la división celular en base a factores decrecimiento, entonces resulta más fácil comprender cómo pudoconseguirseuna división coordinadade todo el conjunto y cómo elprocariotaenglobantepudo llegar a hacersecon el control de la divisióncelular de sus endosimbiontes,

Un hecho a destacaren el experimentorealizado con factores decrecimiento, es el diferente crecimiento que se produce cuando losorganismoscrecen en un medio completamenteartificial como es elASPM f/2 o cuandocrecen en agua de procedencianatural (ya seamarinao dulce) enriquecidaasí mismo con f/2. Las tasasde crecimientoasí obtenidas son en todos los casos, excepto en el clon Pt* deProrocentrum triestinum, significativamentemayores en aquellosmediosquefueronpreparadosa partir de aguade procedencianatural,

Estasdiferenciaspuedeque se debana la carenciade factores decrecimiento de los medios artificiales, sugiriendo entoncesque en losmedios naturales existen factores de crecimiento de forma libre quepuedenser utilizadospor las microalgas.El origen de estosfactoresdecrecimiento es desconocidoen la actualidad, pero basándoseen elcaracterparacrino de los factores de crecimiento (Cascales, 1989), se

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han postuladovarias teoríasindicandoqueestosfactoresde crecimientoson liberados al medio por otros organismos,Así por ejemplo, el algaChlorella es capaz de excretar factores de crecimiento al mediosintetizadospreviamentepor ella (Soong, 1980), mientras que másrecientementese ha comprobadoque ciertas bacterias fecales soncapacesde producir y excretaral medio diacilgílcerol (Morotomí et al.,1990). Así mismo, la presenciamasiva de bacterias y de materiaorgánicaparecenser factoresdeterminantespara la producciónmasivade microalgasen el mar (Arzul & Gentien, 1990), de la mismamaneraque los ácidos húmicos provocan incremento del crecimiento decultivos de dinoflagelados (Gedziorowska& Plinski, 1990) y que elnúmerode bacteriassimbiontesafectaa las tasasde crecimiento(Silva& Franca, 1985; Costas& Lopez-Rodas,1990).

Los factoresde crecimientoque se han añadidoen los experimentosrealizadosno puedenpresentarun efectonutricional (Costas & López-Rodas,1991a):el hecho de que una pequeñamoléculaorgánicacomoelPMA, que no puede ser utilizada como fuente de nitratos, induzca un

incremento tan elevado en la tasa de reproducción(incrementosdehasta9,08 vecesel control en el casode 5, insignis), confirma el efecto

mitogénico de los factores de crecimiento,al menosen P, lima, dosclones de P, triestinum (PU-a y Pt-b), A. tamarense,T. suecica,%insignis y P. tricornutum

.

Así, todos estos organismospodrían producir de forma endógenasuspropios factoresde crecimiento,al igual que lo hacenotras líneascelulares cucariotas. Esta producción autocrina de factores decrecimiento explicaría el por qué algunos de ellos son capacesdecrecer en medios artificiales en total ausenciade factores decrecimiento,

Un caso completamentediferente es el que presentael clon Pt~ de

P,triestinum, que es capazde crecerexactamenteigual en un medioconstituidocon aguanatural queen otro con aguadestilada(como es el

caso del ASPM) ajustandola osmolaridad,Tampoco influyen sobre suproliferación los factores de crecimiento con que se suplementaelmedio. Así, tanto con el PMA, el PDGF, el FBS, el control en ASPM o en

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agua natural, se obtienen tasas de crecimiento que no difierensignificativamente entre sí, no incrementándoseen ningún caso laproliferación de estedinoflagelado.

Además,un hechorelevanteson los resultadosque se obtienenenlos medios condicionados,Estos resultadossugierenque el clon Pt~< es

capazde producir suspropios factoresde crecimiento,autoestimulandosu división y que también es capaz de excretarlosal medio, como lodemuestraque el clon Pt-v incrementesu prolíferación en un 100% enun medio condicionadopor Pt*. AparentementePt-v utiliza los factores

de crecimiento existentes en el medio y que fueron previamenteexcretadospor PV”.

Curiosamente,estudiosanterioressobre esteclon demostraronquePV” presentabauna serie de anomalíasrespectoa otros clones de lamisma especie. Entre ellos destacabael que tenía un mayor númerodecromosomasy bastantemáscantidad de DNA que otros clones y que

ademástenía un número anormalmenteelevado de mitocondrias, así

comoun ciclo celular anómalo(Costas& Goyanes,1988, 1989; Costasetal., 1988),

La independencia de factores de crecimiento es una de las

característicasde las células que han sufrido una transformación(Lewin, 1987). De alguna manera,estascélulas transformadaspuedenproducir factores de crecimiento de forma autocrina (Kaplan et al.,1982; Ishikawa et al., 1990). De hecho, tanto los receptores demembrana como los factores de crecimiento están codificados por

protooncogenes(Cantley et al., 1991). Así mismo, se ha descrito laexistencia de líneas celulares tumorales que son capacesde producir

factores de crecimiento de forma autocrina (Kaplan et al., 1982;Ishikawaet al,, 1990).Así proponemosque al igual que algunascélulasde mamífero sufren transformacionesoncógenasque las vuelvenindependientesde estos factores, análogamentealgunos de estosprotistaspodríansufrir el equivalentea una transformaciónoncógena,perdiendola dependenciapor factoresde crecimiento.

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Así, estefenómenopodríateneruna antigúedadmuchomayor de laque se ha supuesto,y en su origenser consecuenciadel mecanismodecontrol de la división celular fijado ya en unaépocamuy tempranade lahistoria de la vida.

En principio, la idea de una producciónautocrinade factores decrecimiento y su excreción al medio por parte de los dinoflageladospuederesultarextraña,y el queya organismostan ‘primitivos” como losdinoflagelados puedan sufrir transformacionesoncógenas, puederesultarlo todavía más. Pero si, como se ha visto anteriormente,organismoscomo bacteriasfecaleso cloroficeascomo Chlorella puedenhacerlo¿por qué no los dinoflagelados?Además,si asumimosque estosorganismosson capacesde liberar ectocrinamenteinhibidores del

crecimiento de otras algas, especialmentede diatomeas,que compitencon ellos (Gentien& Arzul, 1990), la liberaciónautocrinade factoresdecrecimientopodría seguirunadinámicaparecida,

Así mismo, la universalidadde los mecanismosde controlpropuestaen 1990por Nursey corroboraday aceptadaya por numerososautores,implica que los mecanimosreguladoresde la división celular son

basicamentelos mismos en todos los organismoseucariotas,La basegenéticade estosmecanismosde control son los protooncogenesy losgenescdc del ciclo de división celular (Cantleyet al,, 1991), habiéndoseencontradogeneshomólogosa los protooncogenesde vertebradosenuna granvariedadde organismosque van desdeprotistashastacélulasde mamífero(Walker el al., 1992; Costaset aL, en prensaa), Además,algunosdinoflageladosdel género Prorocentrumproducen un polieterderivado de un ácido graso de 38 carbonos: el ácido okadaico, Esteácido okadaicose revelacomoun poderosomitógenoque actúa,como side un factor de crecimientose tratase,sobre los propios Prorocentrum(Costas et al,, en prensab). Pero también actúa como un potentemitógeno en célulasde mamífero, resultandoun promotor de tumores,con múltiples efectos sobre las proteinfosfatasas,e induciendo unaactivaciónde la Mitosis (Murray, 1993).

En estesentido se podria interpretarque algunasmareasrojas, quebasicamenteson espectacularesincrementosdemográficosde ciertas

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especies(principalmentede dinoflagelados),pudieranser en realidad elresultado de una alteración de los mecanismos moleculares quecontrolanel ciclo celular de estasespecies,que pudieronhabersufridoel análogoaunatransformación.

Aparentemente,los factoresde crecimientoson capacesde inducirla división celular en célulasquiescentesde mamífero (Cantleyet al.,1991), de la misma forma a como lo hacen en los quistes deldinoflageladoAlexandriumtamarensequeseha utilizado en estetrabajo.En nuestro caso, los quistes germinan perfectamenteen aquellosmedios que fueron suplementadoscon factoresde crecimiento (PDGFyFBS) mientrasque en los medioscontrol (ASPM f/2 y ASPM f/2+RPMI)apenasson capacesde germinar.Así, en los mediossin suplementarconfactores de crecimientosolamenteel 30% de los quistesson capacesdegerminar, pero la adición de factores de crecimiento hace que esteporcentajese incrementehastaalcanzarun 90% de germinación.

Este incremento en la germinación de los quistes se debeaparentementeal efecto mitogénico de los factores de crecimientoañadidosal medio y no a una deficienciade nutrientes,La importanciadel PDGF como nutrientees mínimay ademássolamentese añadeunínfima cantidad (10 ng mí-1). Por su parte el RPMI es un medio decultivo que se utiliza frecuentementeen cultivos de célulasde mamíferoy que principalmente contiene una gran variedad de nutrientes,incluyendo pequeños péptidos, pero no contiene factores decrecimiento. En dicho medio se produce aproximadamenteel mismocrecimientoque en el medio artificial ASPM f/2 tradicionalmenteusadocomo control para microalgas (aproximadamenteun 14% degerminación en ambos casos), lo que indica que no es la falta denutrienteslo que producetan pocagerminación.

Probablementeen la superficiede los quistesexistanreceptoresdemembrana,que al unirsecon los factoresde crecimiento,estimulenladivisión celular mediantela activación de los genesimplicados en elprocesode germinación,de una maneraanálogaa como ocurre en los

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zigotos (Hartwell & Weinert, 1989) y en las células vegetativasdemuchosotrosorganismos(Canfley et al., 1991), apoyandola teoríade unmecanismouniversalde control de la división celular (Nurse, 1990).

Podemosconsiderar que los quistes de los dinoflageladosson

análogos a las células de mamífero que permanecenen estadoquiescentea la espera de que las condiciones ambientales seanfavorables.Si el control de la división celular es universal,ambostiposcelularesseencontraríanen el estadoGo de la fase Gí del ciclo celular,El tiempo que las célulaspermanecenen esteestadoes muy variable, ypuede durar incluso años, como ocurre en algunos quistes dedinoflagelados donde han llegado a encontrarsequistes fósiles,perfectamenteviables, que datandel Eoceno,es decir de haceunos 50millones de años (Hallegraeff& Maclean, 1989). Solamentecuandoen

el medio encuentrancondicionesfavorablesal crecimiento,que no sonsólo nutrientessino factoresde crecimiento(Oross & Dexter, 1991), lascélulasque permanecenen Go salende esteestadoy completanel resto

de su ciclo celular,

Además, si los factores de crecimiento Inducen tanto lagerminaciónde los quistes como la de las células vegetativasde los

dinoflagelados,entonceslos factoresde crecimientotienen quejugar unpapel muy importanteen el origen de los bloomsde los dinoflagelados.A este respecto, es importante la posible presenciade factores decrecimientoen el medio natural, comoya indicábamosanteriormente,

Dado el caracter paracrino de los factores de crecimiento, ladensidad de los quistes en el sedimentomarino puede afectardirectamentea su germinación,y a lo mejor es necesariauna mínimadensidadcelular para incrementarestagerminación.Estos factoresdecrecimiento puedenser producidospor bacterias libres en el medio(Morotomí et al,, 1990) o incluso por las numerosasbacteriasquetienen muchos organismosepífitos en su superficie (Silva & Franca,1985), Recientementese ha comprobadoque muchas especiesdemacroalgasy de organismosmarinos son capacesde sintetizaryexcretar al medio determinadasglicoproteinasllamadaslectinas que

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tienen capacidadmitógenasobremuchasespeciesde microalgas.Así,por ejemplo, moluscos como ADlvsia denilenso Tridacnea crocea

,

esponjas como Aantos papillata, algasverdescomo Ulva lectura oCodium fraaile, algas rojas como Ptilota plumosa, corales comoErvthrina crista~alli e incluso el lubriganteHomarus americanus,soncapacesde producir lectinas, que influyen directamentesobre laproliferación celular de muchasmicroalgas (Slifkin & Doyle, 1990),aparentementemediantela activación de vías de segundosmensajerossimilares a las activadaspor factores de crecimiento (Aguilera et al,,1993),

En la actualidad quedantodavía muchascuestionespor resolver

respectoal papel que desempeñanlos mecanismosde control biológicoen generaly los factoresde crecimientoen particularsobre el origenydesarrollode las floracionesde dinoflagelados.Pero no cabeduda quelos factoresbiológicosjueganun papelal menostan importantecomo elde los factores fisicos en las proliferacionesde fitoplancton.

Hasta el momentosehan descrito fenómenosque se consideraban

exclusivosde organismospluricelulareseucariotas,como la germinaciónde célulasquiescentes(o quistesen su caso),la dependenciade factores

de crecimientoy la presenciade posibles transformacionesoncógenasen organismosunicelulares, apoyandola teoría de un mecanismosuniversal de control de la división celular basadaen factores de

crecimiento, en genesy en productosgénicosque respondena dichosfactoresde crecimiento(Goustinet al., 1986: Cantleyet al., 1991).

Entre los mecanismosbiológicosque controlanla división celularencélulasde mamífero,apartede los anteriormentecitados,se encuentranel envejecimientocelular y la inhibición por contacto (Alberts et al,,1992). Respecto al primero, la mayor parte de las células están

programadasgenéticamentepara degenerary morir despuésde un

determinadonumero de divisionescelulares(Hartman, 1985).

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ar

Las células sufren cambiosmorfológicos, se paran de dividir ymueren,Aunque el mecanismode envejecimientocelularno es del todoconocido, parecen existir ciertos genes que controlarían elenvejecimiento de las células de mamífero (Hartman, 1985).Aparentemente,el mecanismoreguladorde estos geneses capazdecontar generacioneso de medir tiempo. Este mecanismo deenvejecimiento también se encuentrapresente en algunas algasunicelularescomo S. insi~nis (Costas& López-Rodas,1991b).

Respectoa la inhibición por contacto, los resultadosobtenidosparecenprometedores.La inhibición del crecimiento de los cultivossaturadosde algasunicelulareses un procesocomplejo en el que estánimplicadosfenómenostales como la falta de nutrientes,el acúmulo demetabolitosde deshecho,efectosde sombrade unascélulassobreotrasy, probablementela Inhibición por contacto. Dado que todos estosfactoresno actúanindependientemente,el diseñarun experimentoquepueda discernir, por independiente,la importancia de cada uno de

estos factores puede ser importante. En este sentido, el diseñoexperimentalque presentamosaquí solamentenos permite discernir sila inhibición por contacto toma o no parte en la inhibición delcrecimiento.

De todos los organismosensayados,es P. lima el que presentaunarespuestamás evidente,al estar su crecimientodirectamenteinfluidopor fenómenosdel tipo de la inhibición por contacto.Así, tanto las tasasde reproduccióncomo las densidadescelularesque se obtienenen elexperimento1 y en el 2 son claramentediferentes:P. lima no es capázde crecer en medios nuevos que se encuentrancon alta densidadcelular pero si lo hace en medios saturadosque tienen una bajadensidadcelular, Lo mismo ocurrió cuandoP. lima se cultivó en placasde Petrí hastaque alcanzóla saturacióny posteriormentese eliminaronmecánicamentelascélulasde unade las mitadesde la placa: a pesardehaber parado de crecer, las célulasempezarona hacerlo de nuevo apartir de la línea divisoria y hacia la zonalibre de célulasde la placa, loque indica que el crecimiento de P. lima se habríavisto inhibidoclaramentepor un fenómenodensodependiente.

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Por el contrario, ni P. tricornutum ni Tetraselmissp. presentaninhibición por contactoal no poder creceren mediossaturadosperoque tienenunadensidadcelularbaja.Sin embargo,dichosorganismossicrecenen aquellosmediosquepresentanunadensidadcelular alta perocuyo medio de cultivo ha sido reemplazadopor uno nuevo (es decirmedio “fresco”), lo que indica que , en estecaso, el crecimientose havisto afectado por otro tipo de fenómenos como el acúmulo demetabolitosde deshechoo la falta de nutrientesen el medio,

Por último, tres de los organismos,5. insignis, P. triestinumyA.tamarense,crecenen ambos experimentosaunqueno de la mismaforma. Así, A. tamarensecreceprácticamenteen la mismaproporciónen medios de cultivo que estánsaturadosy con densidadcelular bajay

en aquellos medios nuevoscon densidadcelular alta. Al parecerlainhibición por contacto toma parte en la inhibición del crecimientode

A. tamarense,pero otros mecanismos(acúmulode deshechoso falta denutrientes)son,al menos,tan importantes.

Los otros dos organismos,P, triestinum y 5. insi~nis tambiéncrecenen los dos experimentospero de una forma diferente,Mientrasque en P. triestinumpredominanlos fenómenostales como la falta denutrientes o el acúmulo de metabolitos de deshecho,en 5. insWnisocurre lo contrario y su crecimiento se inhibe por fenómenosdensodependientes.Al cultivarseen placasde Petri, 5. insWnis tiene elmismo patrónde crecimientodescritoparaLMrna: unavez eliminadoslos filamentos de una de las mitades de la placa, el resto de losfilamentos empiezaa crecerde nuevo, colonizandola partevacía de laplaca, En el caso de 5. insignis pareceque la inhibición por contactojuegaalgún papel importanteen el control de ciclo celular,

A la vista de los resultadosobtenidos, dos de las tres especiesbénticas que se analizaron aquí (P. lima y 5. insWnis) muestraninhibición por contacto,lo que sugiereque dicho fenómenopodríaserun mecanismoadaptativoen las especiesde algasbénticas.

La inhibición por contactoha sido tradicionalmenteun mecanismoconsideradoexclusivamentede las células animales,cuya función sería

limitar su proliferación celular cuando las células alcanzan una

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determinadadensidad en el medio, Los resultados obtenidos aquísugieren una visión alternativa, al trabajar con organismosfilogenéticarnentemásprimitivos que las actualescélulasde mamífero.En este sentido, los dinoflageladosson el grupo más interesantedeestoscinco organismosensayados,ya que han sido consideradoscomouno de los grupos más controvertidos en cuanto a su posiciónfilogenética.Al haberdesarrolladomecanismostalescomo la inhibiciónpor contacto,se puedesugerir que estemecanismofué desarrolladoyapor los organismosunicelularesprimitivos en una épocamuy tempranade la evolución, probablementecomo un mecanismopara autocontrolarsus poblacionesnaturales, Sin embargo, este tipo de mecanismostambién fueron desarrolladospor otras algas (por ejemplo lasConjugatophyceaes)alejadasfilogenéticamentede los dinoflagelados.loque sugiere además que dicho mecanismo fué desarrolladoIndependientementeen diferentesgruposde organismosunicelulares.

En definitiva, se han descrito fenómenos que hasta ahora seconsiderabanexclusivosde organismospluricelulareseucariotas,comola inhibición por contacto, la salida de la fase 01 de las célulasquiescentesde mamífero o la actividad protein kinasa en diversosorganismosunicelularesy eucariotasprimitivos, que parecenhabersidomuy bien conservadosen el cursode la evolución,

Una de las característicasmássorprendentesdel procesoevolutivo,es que todos los phyla de organismospluricelulares aparecieronmuyrapidamentesobre la Tierra tras un largo periodoen el que las célulaseucariotassolo alcanzaronun nivel de organizaciónprotista (unicelular).Asumiendolos principios de simplicidady economíatan característicosde los procesos biológicos, cabe pensar que probablemente, lasprimeras células eucariotas, hace unos 1.500 millones de añosdesarrollaron casi todos los mecanismosnecesarios para producirorganismospluricelulares duranteeseaparenteperiodo de estasisde

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casi 1000 millones de añosque precedióa la apariciónbruscade todoslos tipos de animalesy plantasconocidasen un periodomenor, quizá de20 millones de años.

Y entre esos mecanismos destacan muy especialmentelosmecanismosde control de la proliferacióncelular,

En estatesis se recogecomo las células eucariotasmás primitivasque existenen la actualidad,las microalgasde diversosphyla implicadosen el origen y diversificación del resto de todos los organismos, yacontrolabansu ciclo de división celular por mecanismosdependientesde factores de crecimiento,analogamentea como lo hacemosnosotroshoy en día, hastael punto de responderal factor de crecimientoderivadode plaquetas,

También descubrieronlos mecanismosde inhibición por contacto,tan importantes para la organizaciónen tejidos y órganos de losanimalesy plantas,

En base a estos hechos nos atrevemos a sugerir que estosmecanismos de control de la proliferación celular pudierondesarrollarsecomo mecanismosnetamenteecológicosde autocontrolde la densidad de las poblaciónes naturales, mientras que elenvejecimientocelular les permitíapredecirla variaciónestacional,

Estosorganismosdescubrieronademáslos factores de crecimientocomo telemediadorespara comunicarsecon sus vecinos. Tambiéndescubrieronla inhibición por contacto como un mecanismopararegular su densidadcelular. E incluso descubrieronel envejecimientocelular como un mecanismoparaadaptarsea las periodicidades de unambientefluctuantealrededorde las variacionescircanuales.

Creemosque la evoluciónha sido siempreconservadoray que pudo

utilizar estosmecanismosprimitivos de control de la proliferación parala formación de los organismospluricelulares.Aunqueesto no ha sidoprobado,nospareceunaatractivahipótesisde trabajo.

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CONCLUSIONES

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CONCLUSIONES

1) Todaslas microalgasestudiadasrespondende formapositiva a losfactoresde crecimiento,que provocanun aumentosignificativo tanto desu tasa de reproduccióncomo, consecuentementede su densidadcelular, Esto se debe,aparentemente,a que el control de la divisióncelular en estos organismosse realizaa travésde la vía de los fosfatidilinositoles.

2) El crecimiento de los organismosen medios naturales,es decirsin ningún aporte artificial de factores de crecimiento, essignificativamente mayor que en los controles, pero es a su vezsignificativamentemenorque en los mediossuplementadoscon factoresde crecimiento, Este hecho sugiere que en el agua de procedencianatural existen determinadosfactores de crecimiento de forma libre,que actuarían sobrelos organismos.

3) La germinaciónde los quistesdel dinoflageladoAlexandriumtamarensese incrementasignificativamentecuandoen el medio existenfactoresde crecimiento,De algún modo, estosfactoresactivaríanvías desegundos mensajerosresponsablesde la división celular, lo queprovocaríasu germinación.

4) La inhibición por contactoes un mecanismode control biológicoque utilizan algunas especies de microalgas para controlar suproliferación. Este fenómenotiene lugar principalmenteen dos de lasespecies bentónicas, el dinoflagelado Prorocentrum lima y laconjugatophyceaeSpiro~rra insianis. Este mecanismode control de ladivisión celular al parecer fué desarrollado ya por organismosunicleularesprimitivos, antesde que surgieranlos primerosorganismospluricelulares.

5) Uno de los clones, el clon Pt* del dinoflageladoProrocentrumtriestinum, respondede forma anómalaa la adición de factores decrecimientoal medio: ningunode los factoresde crecimiento añadidosincrementade forma significativasu tasade reproducción.Estosugiereque esteclon ha perdidolos controles queregulansu división celular y

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célulaaparentemente,se comporta de manera semejantea unatransformada.

6) El control de la división celular parece ser un mecanismouniversal, existe en todos los organismoseucariotasincluyendo phylacte microalgascomolos dinoflagelados.

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RESUMEN

II

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RESUMEN

Numerososestudiossobrelíneas de mamíferosy levadurasindicanque las célulaseucariotascontrolansu ciclo de división celular medianteuna serie de genesy productosgénicosespecíficosparala regulacióndesu ciclo celular. Tradicionalmentese asumequetodos estosmecanismosson característicosde organismospluricelulares, mientras que losorganismosunicelularesde vida libre proliferan tan sólo limitados porlas condiciones ambientales.Sin embargo, trabajos recienteshacensuponerquetanto los mecanismosde controlde la división celular comolos procesos de dependenciade factores de crecimiento y deenvejecimientocelular podríanseruniversales,afectandoa todo tipo decélulas eucariotas y haciéndoseextensivo incluso a organismosunicelulares,

Así, se analizaronlos efectos de algunosfactores de crecimiento(Suero Bovino Fetal, Factor de Crecimiento Derivado de PlaquetasyMonoacetato12 de Forbol) sobrela proliferacionde diversosorganismosunicelulares elegidos por su posible implicación en el origen ydiversificación de las célulaseucariotas:los mesocariotas<Prorocentrumlima dinophyceae,Prorocentrumtriestinumdinophyceaey Alexandriumtamarense dinophyceae),el eucariota primitivo Tetraselmis sp~praxinophyceaey los eucariotas más recientes Phaeodactilumtricornutumbacillariophyceaey Spiro~yrainsi~nis conjugatophyceae),

Del mismo modo se analizó el efecto de determinadosfactores decrecimiento sobre la germinación de quistes del dinoflageladoAlexandrium tamarense,Y por último se estudió si la inhibición porcontactopudieraser un mecanismode control de la división celular enestetipo de organismos de una maneraanálogaa cómo ocurre en lascélulasde mamífero.

Todos los organismos ensayadosresponden a factores decrecimientotal y como hacenlas células de mamífero. Los factores decrecimiento, debido a su efecto mitogénico especifico, incrementaronsignificativamente la densidad celular así como las tasas de

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reproducción.Del mismo modo, son capacesde inducir la germinaciónde los quistes de dinoflageladosen fase de latencia, Finalmente,lainhibición por contactoforma parte de los mecanismosque controlanlaproliferación celular, en algunosde los organismosensayados.

Todo ello sugiere que el control de la división celular es unmecanismoaltamenteconservadodurantela evolución, y que ya fuédesarrolladopor algunosde los primeros organismosunicelulares,antesde la aparición de los organismospluricelulares,y que podría tenerconsecuenciassobre la cinética de la proliferación de microalgasencondicionesnaturales,

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SUMMARY

A lot of works related to celí lines of both mammalsand yeastssuggestthat their celí division cycle is controlled by a specific set ofgenesand geneproducts.It was traditionally assumedthat thesekind ofcontrols belong to pluricellular organisms, while the control of theunicellular ones is only limited by the environmentalconditions.However, recentworks suggestthat the control mechanismsas well asthe dependenceof growth factors and the ageing processescould beuniversalfor ah te eukaryoticcelís, including unicellularorganisms.

Thus, the effect of different growth factors and mitogenes(fetalbovine serum, platelet derived growth factor and phorbol 12monoacetate)were analyzedon the proliferation of severalunicellularorganisms.These organismswere selectedby its importancein theevolutive origin and diversification of the eukaryotic celís: ThemesokayotesProrocentrumlima dinophyceae,Prorocentrumtriestinumdinophyceaeand Alexandrium tamarensedlnophyceae,the earlyeukaryote Tetraselmis sp. praxinophyceaeand the more recenteukaryotesPhaeodactilumtricornutum bacillariophycea.eand Spiro~vrainsignis conjugatophyceae.

In the same way, the effect of different growth factors on theexcystmentof the Alexandrium tamarensedinophyceaecysts wereanalyzed.Finally, it wasstudiedwhetherthe contactinhibition of growthtakes place in the control of celí proliferation in these kind oforganisifls.

Celí yield and acclimatedgrowth rates of alí the clones testedincreasedsignificantly due to the specific mitogenic effect of growthfactors FurthermOre,growth factorsare able to inducethe excystmentin dinoflagellatecysts, and contact inhibition hasits importanceas acontrol mechanisin in the cellular proliferation of sorne of theseorganisms.

Apparently. this la thoughtto be dueto te existenceof a universalmechanismcontrolling te celí division cycle in ahí eukaryotic celis, in a

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similar way as mammalianand yeastcelís do, This control mechanismwere developpedby some unicellular algae, sorne time before thepluricellular organismsappear.

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APENDICE

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TABLA 1- Composicióndel medio de enriquecimientof/2.

1) NaNO3 75mg

5 mg2) Na H2P04H20

3) Metales traza

Na2 EDTA 4.360 mg

FeClg6H20 3,150 mg

CuSO45H20 3.150 ‘mg

ZnSO47H20 0,022 mg

CoCl2 6H20 0,010 mg

MnCl2 4H20 0,180 mg0.006 mgNa2 MoO4 2H20

4) Vitaminas

Tiamina HClBiotina

15-30 mg5) Na2 51039H20

6) H20 (de mar o dulce)

Datos de Guillard (1975)

0.10.50.5

mg

4

1 litro

-115-

TABLA 2- Composicióndel medio artificial ASPM.

Sustancia

NaCí

KCl

MgSO4.7H20

MgCl2.6H20

CaClr=

NaHCO3

HgBO3

* Cantidada añadirpor litro de aguadestilada.

Datos procedentesde Guillard (1975).

t

¡¡

r

Gramo?’

23,38

0,75

4,93

4,07

1,11

0,17

0,025

-116-

u~ioPucdcdU)4)U)O

4)ci‘3

PS‘u

U)

olo4)‘e

~‘2

u)o

-%1~4)

+vio

c&~

Cf)

u>

U)o

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‘-4

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Q3

cd‘U

u>;~

4)“-4

0~

‘E?S

(4ui

~2

acd

u,o

—6

+o

-11

7-

Figura2- Tasasde reproducciónde Prorocentrumlima

PDGF= Factorde crectmlentoderivadodeplaquetasPMA= Monacetato12 de ForbolFES= Suerobovino fetalAguanatural=Agua demar

1,5

1Puu)4)orfl

s o,s

OE+0ASPM f/2 A+PDGF A+PMA At-FBS Agua natural

-118-

Figura3- Tasasde reproduccióndeTetraselmissuecica

FDGF= Factorde crecimientoderivadodeplaquetasPMA= Monoacetato12 dcForbolFBS=SueroBovino FetalAguanatural=Aguade mar

15

py,,,,’

ASPM f/2 A+PDGF A+PMA

‘4

A+FBS Aguanatural

rS)

4>

oU)

1

0,5

OE+0

-119-

Figura4-Tasasde reproducciónde Spiro~vrainsignis

PDGF=Factorde crecimientoderivadode plaquetasPMA= Monoacetato12 de ForbolFBS= SueroBovino FetalAguanatural=Aguadulce

1,5

aguadest.fI2

A+PDGF A+PMA A+FBS Agua natural

1cd‘Een‘2>o

—4Co

‘E

rr-r05-

OIE+0

-120-

Figura5- Tasasde reproducciónde Phaeodactilumtricomutum

PDGF=Factorde crecimientoderivadodeplaquetasPMA= Monoacetato12 de ForbolFBS=SueroBovino FetalAgua natural=Agua demar

1,5

ASPM + f/2 A+ PDGF¡ ¡

A+PMA A+FBS Aguanatural

1

0,5

en4)

o‘-4

$‘E

OE+0

-121-

Figura6- Tasasde reproduccióndel clon At-adeAlexandriumtamarense

PDGF=Factorde erecinilentoderivadode plaquetasPMA= Monoacetato12 de ForbolFBS=Suerobovino fetalAguanatural=Aguademar

15

1—

U)4)

o‘-4U)

~‘E0,5

OE+O

ASPM f/2 A+PDGF A-I-PMA A+FBS Aguanatural

-122-

Figura7- Tasasde reproduccióndelclon At-b deAlexandriumtamarense

PDOF=Factorde crecimientoderivadoPMA= Monoacetato12 de ForbolFBS=Suerobovino fetalAgua natural=Agua de mar

15

de plaquetas

1

0,5

OE+0

ASPM f/2

I___A+PDGF A+PMA A+FBS Agua natural

cd

4-.,

CF)4)

o“-4CF)

¿E

-123-

Figura8- Tasasde reproduccióndelclon Pt-ade Prorocentrumtriestinum

PDGF=Factorde crecimientoderivadode plaquetasPMA= Monoacetato12 de ForbolFBS= Suerobovino fetalAgua natural=Aguade mar

1,5

1-

0,5-

OE+0

ASPM f/2 A+PDGF A~4-PMA A+FBS Aguanatural

r r

-124-

Figura9- Tasasde reproduccióndel clon Pt-b de Prorocentrumtriestinum

PDGF=Factorde crecimientoderivadode plaquetasPMA= Monoacetato12 de ForbolFBS= SuerobovinofetalAguanatural=Aguademar

A+PDGF A+PMA A+FBS Agua natural

1~5

cd

CO4)eo

“-4

Co$¿E

1—

0,5-

OE+0

ASPM f12

r

-125-

Figura10- Tasasde reproduccióndel clon Pt~ de Prorocentrumtriestinun

FDGF=Factorde crecimientoderivadoPMA= Monoacetato12 de ForbolFBS= Suerobovino fetalAgua natural Aguademar

15

OE+0

de plaquetas

cd‘ECF)4)oU)$

1

0,5

ASPM f/2 A+PDGF A-f-PMA A+FBS Agua natural

-126-

Figura 11- Tasasde reproducciónde los clonesPt-vy Pt* de Prorocentrumtrlestinurr

PDGF Factorde crecimktentoderivadode plaquetasPMA= Monoacetato12 de ForbolFBS= Suerobovino fetalc-Pt-v= Medio condicionadoporPt-vc~Pt*= Medio condicionadoporPt

1,5

cd

‘Evi4)oCo

~6

1

0,5

OE+0

P. triestinum-v

~ P. triestinum*

c-Pt-vASPM f/2 A+PDGF A+PMA A+FBS c~Pt*

-127-

Días ASPM PDGF PMA FES Mar

0 250 250 250 250 250

1 276 462 454 486 370

2 321 872 903 931 541

3 372 1641 1788 1891 882

4 433 3411 3572 3711 1290

5 504 5940 6096 6341 2012

6 582 8082 8114 8230 3007

7 670 9024 9132 9011 4132

Pt-a

Días ASPM PDGF PMA FES Mar

0, 250 250 250 250 250

1 258 323 318 311 370

2 262 458 446 432 541

3 297 656 632 628 882

4 316 970 961 941 1290

5 351 1380 1300 1282 2012

6 370 2006 1971 1808 30077 392 2894 2751 2694 4132

Tabla 3- Densidad celular en células/mlde los dos clonesdeAtexandriwntamarense (At-a y At-b) asícomo delos dos clonesdeProrocentrumtriestinum (Pt-ay Pt-b).

At-a At-b

Días ASPM PDGF PMA FES Mar

0 250 250 250 250 250

1 261 319 316 318 310

2 278 414 404 411 392

3 301 570 556 581 483

4 327 781 742 751 607

5 359 1119 1030 1009 782

6 391 1487 1391 1370 968

7 411 1892 1792 1780 1194

Pt-b

Días ASPM PDGF PMA FES Mar

0 250 250 250 250 250

1 279 427 431 411 373

2 318 727 746 763 555

3 368 1249 1288 1379

4 426 2114 2236 2492

5 497 3534 3872 4032

6 576 5428 6550 6840

-128-

7 668 7760 8181 8201

871

1284

1992

2950

4106

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