Universidad Complutense de Madrid Depto. Nutrición, Bromatología y Tecnología de AlimentosDepto. Nutrición, Bromatología y Tecnología de Alimentos

Los biofilms como reto para la industria alimentaria

C S J é S áCarmen San José Serránserran@vet.ucm.es

Zaragoza, 17 de noviembre de 2010

¿Qué es un biofilm?

• En sentido amplio: un conjunto de organismos vivos que crecen agregados, formando películas, láminas, tapices, alfombras, etc, como p.ej. los moluscos sobre el casco de los barcos.

• En sentido estricto: una comunidad de MICROORGANISMOS que crecen agregados en una INTERFASE. Los más estudiados son los presentes en interfases sólido/líquido y en las sólido/aire en ambiente húmedo.

• En el caso de la adhesión y crecimiento sobre interfases sólido/líquido o sólido/aire, se entiende que la superficie sólida es INERTE, o al menos no interacciona específicamente con los microorganismos. Según este criterio,interacciona específicamente con los microorganismos. Según este criterio, no se suele considerar como biofilm la flora intestinal, pero sí la placa dental, o los microorganismos adheridos a frutas y hortalizas mínimamente procesadas.

• Las células están embebidas en una MATRIZ gelatinosa y cohesiva. Está constituída por agua, polisacáridos, proteínas, ácidos nucléicos, lípidos e iones varios: la mayor parte son materiales extracelulares, pero hay también y p , p ycelulas muertas y materiales captados del entorno.

¿Qué microorganismos se adhieren y sobre qué?

• Arqueas, bacterias, levaduras, algas: todos los organismos unicelulares ensayados. Diversos protozoos pueden “pastar” sobre biofilms microbianos. La velocidad de formación de biofilms, sin embargo, depende del microorganismo, superficie, nutrientes, temperatura, y otras condiciones ambientales.

• Los biofilms naturales son habitualmente consorcios, con más de una especie. Algunos se comportan como colonizadores primarios de una superficie acogiendoAlgunos se comportan como colonizadores primarios de una superficie, acogiendo a otros.

• Cualquier superficie puede servir como soporte (mineral, cerámica, metálica,Cualquier superficie puede servir como soporte (mineral, cerámica, metálica, polimérica, etc) aunque algunas puedan ser más favorables que otras (por su microtopografía, hidrofobicidad, iones liberados, etc).

á• Se cree que en la naturaleza hay más microorganismos adheridos (o sea en biofilms) que planctónicos (esto es, en suspensión). Se tiende a un equilibrio entre la población adherida y la planctónica, con desplazamientos de células, en un sentido u otro, según las condiciones ambientales., , g

Melón

(Annous, 2009)

Perejil

(Annous, 2009)

Brotes de alfalfa

Biofilm natural sobre hipocotilo de brote de alfalfa. Bacterias no identificadas, incluyendo cocos y bacilos.

Microscopía de epifluorescencia directa. Bacterias retenidas en los arañazosde una superficie de acero inoxidable que ha sufrido abrasión (Verran 2002)

Células de Staphylococcus aureus adheridas sobre acero inoxidable, antes y después de un cepillado con agua ydespués de un cepillado con agua y detergente. Imágenes de microscopía de fuerza atómica (AFM). (Verran, 2008)

Microorganismos no identificados en un condensador industrial de acero blando, tras 8 semanas de exposición. El biofilm incluye productos de corrosión, partículas de arcilla, diversos tipos de bacteriasy diatomeas. SEM. Barra de escala = 10 µ

Ventajas para los microorganismos de la vida en biofilms

• Supervivencia en nichos favorables, sin ser arrastrados de allí por el flujo de líquidopor el flujo de líquido

• Condiciones ambientales más estables

• Mayor resistencia a la desecación

• Mayor resistencia a biocidas, anticuerpos y macrófagos

• Comensalismo o cooperación con organismos de aptitudes fisiológicas diferentes

• La proximidad favorece la transferencia horizontal de genes

Vivir en biofilms. Los atractivos de la vida sedentaria

Etapas en la formación de biofilm:• Acumulación de películas de acondicionamientop• Deposición o adsorción de células planctónicas• Producción de material extracelular adhesivo• Maduración del biofilm (aumento de espesor, establecimiento de

gradientes de oxígeno nutrientes pH etc)gradientes de oxígeno, nutrientes, pH, etc) • Atrapamiento y liberación de células

Heterogeneidad de situaciones tróficas dentro de un biofilmg

Cambios fenotípicos en las células del biofilm

• Adaptación a mayor densidad celularp y• Pérdida de motilidad• Producción de polisacáridos adhesivos• Adaptación a diversos grados de anaerobiosis (multiples vías• Adaptación a diversos grados de anaerobiosis (multiples vías

metabólicas)• Mayor resistencia a biocidas (distintos mecanismos)• Distintas modalidades de relaciones ecológicas

• De la mayor parte de los genes con expresión diferente enDe la mayor parte de los genes con expresión diferente en biofilms no se conoce aun la función

Regulación de la formación de biofilms. Sensores de densidad celular. Quorum Sensing (QS) y sus señales difusibles de comunicación célula-célula, los autoinductores. En este caso, acil-homoserin lactonas (HSL) en azul, que son producidas por enzimas LuxI , ( ) , q p py (a determinada concentración) captadas por receptores LuxR que, a su vez, activan determinados genes, regulando la formación de biofilms y otros mecanismos. a) Baja concentración de autoinductor HSL. b) Alta concentración.

Hay autoinductores específicos (de especie o género) y no específicos.

Regulación de la formación de biofilms en bacterias. El c-diGMP. El ácido diguanílico cíclico (c-di-GMP) es un segundo mensajero que regula la transición entre el modo de vida libre y fijo. La actividad de las diguanilato ciclasas (DGC) reside en un dominio GGDEF y la de las fosfodiesterasas (PDE) en un dominio EAL. (Tomado de Jenal, 2006)

Diferencia en susceptibilidad a antibióticosentre células planctónicas y en biofilms de bacterias Gram+entre células planctónicas y en biofilms de bacterias Gram+

Concentraciones en µg/mL.

(Tomado de Olson y col. 2002)

Idem para Gram -

(Olson y col. 2002)

Resistencia aumentada de biofilms a biocidas. Compuestos de amonio cuaternario. pBacillus

Peng et al. 2002

Resistencia aumentada de biofilms a biocidas Hipoclorito sódico BacillusResistencia aumentada de biofilms a biocidas. Hipoclorito sódico. Bacillus

Peng et al., 2002

Resistencia aumentada a biocidas. Hipoclorito sódico. E. coli

Time (min)

Comparación del efecto bactericida. A la izquierda, células planctónicas; a la derecha, biofilms de 3 cepas de E. coli. En ordenadas, log10 CFU/cupón.

MENOR SUSCEPTIBILIDAD A BIOCIDAS DE CÉLULAS EN BIOFILMS. Hipoclorito sódico. Listeria monocytogenesHipoclorito sódico. Listeria monocytogenes

Reducción logarítmica de células planctónicas (○), células individuales adheridas (∆) y microcolonias adheridas (●) de Listeria monocytogenes poradheridas (●) de Listeria monocytogenes por exposición a 100, 400 y 800 ppm de cloruro de benzalconio.

(tomado de Koffi y Frank 1990 J Food Protection 53 550-554)(tomado de Koffi y Frank 1990, J. Food Protection 53, 550 554)

Relevancia de los biofilms en la industria alimentaria

• Recurso biotecnológico: forma natural de inmovilización de células microbianas (utilizables para obtención de ingredientes y aditivos, tratamiento de aguas residuales, bioremediación, etc)., g , , )

• Problemas tecnológicos: Alteración de propiedades de superficies (fricción, transferencia p p p ( ,de calor, etc) Obturación de conductos, orificios, filtros, válvulasEnsuciamiento de dispositivos instalados para medida y muestreop p yFacilitación de la corrosión

• Problemas sanitarios y pérdidas en calidad y vida útil del• Problemas sanitarios y pérdidas en calidad y vida útil del producto: microorganismos procedentes de materias primas, agua, aire, operarios, etc se instalan como biofilms en planta, desde donde actúan como reservorios que, por deficiente manipulación o limpieza, pueden recontaminar el alimento procesado.

Porqué existen y persisten los biofilms en las plantas de procesado de alimentos

• Se forman preferentemente en lugares donde se limpia poco, nada, mal o muy de tarde en tarde: allí tienen tiempo para crecer e incluso madurar.

L t i d l bi fil l h i fi difí il d d d• La matriz del biofilm es un gel cohesivo, a veces firme, difícil de desprender.

• Las células están protegidas por la matriz frente a los agentes antimicrobianos y además, al multiplicarse más lentamente que las células planctónicas, son y p q pmenos vulnerables a ellos.

• Los fragmentos de biofilm con células viables, al desprenderse pueden dispersarse en líquidos y aerosoles.dispersarse en líquidos y aerosoles.

• Las gotículas de los aerosoles pueden mantenerse en suspensión incluso horas; pueden depositarse sobre superficies en contacto con alimentos, o sobre alimentos ya procesadossobre alimentos ya procesados.

• Aunque las células sean destruídas por los desinfectantes, la matriz puede permanecer intacta o dejar residuos.

• Los restos de matriz facilitan la fijación de nuevas células y el desarrollo de nuevos biofilms.

Recursos básicos contra biofilms en la industria alimentaria

1. Diseño de equipos e instalación global fácilmente accesibles para la limpieza.

2. Mantener las superficies pulidas; evitar abrasión, corrosión, empalmes con holgura, p p ; , , p g ,

huecos o resquicios, perforaciones o soldaduras poco alisadas.

3. Reponer frecuentemente piezas de materiales agrietables o fácilmente dañados.

4. Minimizar durante la producción las salpicaduras, manchas, charcos, superficies

humedecidas con condensados y restos de líquidos en codos de conducciones.

5. Identificar en la planta los sitios mas favorables para el desarrollo de biofims. p p

6. Desmontar para limpiar lo que tenga resquicios no accesibles.

7. Evitar películas de acondicionamiento por limpieza insuficiente.

8. Eliminar mecánica- o químicamente la matriz de los biofilms.

9. Controlar durante la limpieza los aerosoles, que transportan restos de biofilm.

10 Adoptar frecuencias de limpieza que eviten llegar a tener biofilms maduros10. Adoptar frecuencias de limpieza que eviten llegar a tener biofilms maduros.

Tendencias en la lucha contra biofilms en la industria alimentaria

Fisiología microbiana:Fisiología microbiana:Identificar las condiciones ambientales que estimulan la formación y el desprendimiento de biofilms.Caracterizar el funcionamiento de sus sistemas de regulación, en particular los de QSIdentificar los autoinductores operativos en cada caso, junto con precursores y antagonistas, así como

i l d d d l f t d t d ll li t l tenzimas que los producen y degradan y las fuentes de todos ellos, en alimentos o el entorno.Estudiar el fundamento de los “persistores”.

Ecología microbiana:Identificar los microorganismos dominantes en cada entorno alimentario y la base de su asociación.Identificar posibles microorganismos antagonistas para diseñar sistemas de exclusión mutua.Probar fagos.

Microbiología alimentaria:Nuevos métodos físicos de inhibición o destrucción microbianaNuevos principios antimicrobianos o antibiofilms (p.ej. contra autoinductores)Comprobar el posible desarrollo de resistencias (simples o cruzadas)Comprobar el posible desarrollo de resistencias (simples o cruzadas)Probar sinergias de productos y/o procesos

Sostenibilidad:“Cerrar” los procesos (por ejemplo procurar no producir y sobre todo diseminar resistencias)Cerrar los procesos (por ejemplo, procurar no producir y sobre todo, diseminar, resistencias)Usar agentes biodegradables o naturales. Ahorrar agua y energía.

Gracias por su atención

Carmen San José Serrán

Departamento de Nutrición, Bromatología y Tecnología de AlimentosFacultad de VeterinariaFacultad de Veterinaria

Universidad Complutense de Madrid

serran@vet.ucm.es