UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

FACULTAD DE PSICOLOGÍA Departamento de Psicobiología

TESIS DOCTORAL

Tratamientos farmacológicos en la coadministración de alcohol y

cocaína: efectos en la expresión de genes en el córtex prefrontal de la rata

MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR

PRESENTADA POR

Víctor Echeverry Alzate

Directores José Antonio López Moreno

Elena Giné Domínguez

Madrid, 2016

© Víctor Echeverry Alzate, 2016

TESIS DOCTORAL

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

FACULTAD DE PSICOLOGÍA

DEPARTAMENTO DE PSICOBIOLOGÍA

TRATAMIENTOS FARMACOLÓGICOS EN LA

COADMINISTRACIÓN DE ALCOHOL Y COCAÍNA:

EFECTOS EN LA EXPRESIÓN DE GENES EN EL

CÓRTEX PREFRONTAL DE LA RATA

VÍCTOR ECHEVERRY ALZATE

DIRECTORES

Dr. JOSÉ ANTONIO LÓPEZ MORENO

(Dpto. Psicobiología. UCM)

Dra. ELENA GINÉ DOMÍNGUEZ

(Dpto. Biología Celular. UCM)

Madrid, España. 2015

A mi madre y mis abuelos.

A ti GBC, por nosotros.

“Between stimulus and response there is a space.

In that space is our power to choose our response.

In our response lie our growth and our freedom.”

Viktor E. Frankl

AGRADECIMIENTOS

En primer lugar quiero dar las gracias a mis directores de tesis, el Dr. José Antonio

López Moreno y la Dra. Elena Giné Domínguez, por permitirme alcanzar este objetivo,

brindándome su apoyo, conocimiento y orientación durante estos años. A los miembros

del equipo (PBG LAB) Rubén, Dani, y Marta porque todos han aportado su granito de

arena (laboral o personal) en algún momento del proceso de elaboración de esta tesis, y

en especial a Kora y Javi, con quienes he pasado los mejores días de experimentos

interminables, charlas inagotables y risas, ¡así da gusto! También a Isa, María, y Alex,

por todo el tiempo que disfrutamos y trabajamos juntos, creciendo en lo profesional y en

lo personal, mano a mano.

Hago extensivo mi agradecimiento a las personas que han pasado por nuestro

laboratorio durante alguna temporada, Susanna Pietropaolo, Marta Celorrio, con

especial mención a mi valenciana Lucía Martí, y a los miembros de los equipos con

quienes compartimos laboratorio: Laura, María, Patxi, Toni, Noemí, y Mayte. Sin

olvidar a nuestra Anita, a quien agradezco toda su ayuda profesional y personal durante

estos años.

Quiero agradecer de forma especial a la Dra. Raquel Gómez, porque con ella empecé a

disfrutar de la investigación y ¡aquí estoy!, al Dr. Ángel Santos, a quien aprecio

enormemente, y porque los días de trabajo a su lado están repletos de nuevo

conocimiento. A la Dra. Rosario Moratalla por permitirme estar en su laboratorio

durante unos meses, aprender, y descubrir a todas “mis chicas” del B-01: Noe, Irene,

Lula, Sara, Marco, Emi, y especialmente a Isa, quien ya formaba parte de mi vida

previamente, brindándome su ternura, sonrisa, profesionalidad, e interesantes puntos de

vista en cada momento de los que seguimos compartiendo.

Fuera del ámbito laboral, quiero dar las gracias a todos mis amigos, que han estado a mi

lado y me han brindado su apoyo en todos estos años: Yulie, Merche, Jorge y Laura, los

de siempre. Rafi, Juanma, Manu, Jose y Oscar, de un “ambiente” especial, porque el

compartir estos 13 años hace que los considere mi familia. A mis compañeros de

carrera, y de máster, Carmen y Carlos, y a los integrantes del grupo “C. party”, gracias

por esos momentos.

Por último, agradezco enormemente a toda mi familia, Echeverry Alzate, Bermúdez de

Castro, Fernández de Valderrama, y en especial a mis hermanos, sus parejas, mis tías, y

Álvaro, porque sobran los motivos. ¡GRACIAS!

ÍNDICE

LISTA DE ABREVIATURAS 11

RESUMEN 17

SUMMARY 21

I. INTRODUCCIÓN 25

1. Neurobiología de la adicción 27

1.1. Adicción 27

1.2. Sistema cerebral de recompensa 30

2. Corteza prefrontal y adicción

2.1. Funciones de la corteza prefrontal y sus alteraciones en la adicción 35

2.2. Organización estructural de la corteza prefrontal en roedores 36

3. Alcohol

3.1. El alcohol como droga de abuso 38

3.2. Farmacología del alcohol 40

4. Cocaína

4.1. La cocaína como droga de abuso 48

4.2. Farmacología de la cocaína 50

5. Interacciones entre Alcohol y Cocaína

5.1. Farmacología de la interacción alcohol-cocaína: Cocaetileno 56

5.2. Efectos del consumo simultáneo de alcohol y cocaína 58

6. Tratamientos farmacológicos

6.1. Tratamientos farmacológicos en la adicción al alcohol 61

6.2. Tratamientos farmacológicos en la adicción a la cocaína 68

6.3. Tratamientos farmacológicos en la adicción al alcohol y a la cocaína 74

7. Regulación de la expresión génica y adicción

7.1. Genes de expresión temprana y adicción 77

7.2. Epigenética 80

II. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 95

III. 101

103

RESULTADOS

Artículo 1

Artículo 2 115

IV. 133

V.

DISCUSIÓN GENERAL

CONCLUSIONES FINALES 151

ÍNDICE

VI. BIBLIOGRAFÍA 155

ANEXO 1: ARTÍCULOS 187

ÍNDICE

LISTA DE ABREVIATURAS

11

Acetil-CoA Acetil-coenzima A

ADH Alcohol deshidrogenasa

ADN Ácido desoxirribonucleico

AEME Anhidroecgonina metil ester

ALDH Aldehído deshidrogenasa

AMPA α-amino-3-hidroxi-5-metilsoxasole-4-propiónico

ARN Ácido ribonucleico

ARNlnc ARNs largos no codificantes

ARNnc ARN no codificante

ATV Área tegmental ventral

BDNF Factor neurotrófico derivado del cerebro

BChE Butirilcolinesterasa

BE Benzoilecgonina

CCA Corteza cingulada anterior

c-Fos Proto-oncogen Fos

CIE-10: Clasificación internacional de enfermedades

CocE Esterasa de cocaína bacterina

CocH Hidrolasa de cocaína

Cox-2 Ciclooxigenasa 2

CPF Corteza prefrontal

CPG15 Neuritin; candidate plasticity gene 15; Nrn1

CRF Factor liberador de corticotropina

CRE del inglés Cyclic-AMP response-element

CREB del inglés Cyclic-AMP response-element-binding protein

CYP2E1 Citocromo P4502E1

DA Dopamina

DAT Transportador de dopamina

Drd1 Receptor de dopamina D1

Drd2 Receptor de dopamina D2

12

ABREVIATURAS

Dmap1 del inglés DNA methyltransferase 1-associated protein

DNMT ADN metiltransferasa

DSM-III-R Manual diagnóstico y estadístico de los trastornos mentales,

tercera edición revisada

DSM-IV Manual diagnóstico y estadístico de los trastornos mentales,

cuarta edición

DSM-V Manual diagnóstico y estadístico de los trastornos mentales,

quinta edición

EDADES Encuesta domiciliaria sobre alcohol y drogas en España

EMA Agencia europea de medicamentos

EME Ecgonina metil ester

FDA del inglés Food and drug administration

GABA Ácido gamma-aminobutírico

GABAA Ácido gamma-aminobutírico de tipo A

GIRKs Canales de potasio de rectificación interna acoplados a proteínas

G

Glu Glutamato

Grik1 del inglés kainate receptor gene containing the GluK1 subunit

HAT Histona acetiltransferasa

HDAC Histona desacetilasa

HDM Histona desmetilasa

HMT Histona metiltransferasa

IAD Corteza insular agranular dorsal

IAV Corteza insular agranular ventral

ICSS Autoestimulación intracraneal

IEGs Genes de expresión temprana (del inglés immediate early genes)

IL Corteza infralímbica

LTP Potenciación a largo plazo (del inglés long-term potentiation)

MeCP2 del ingles Methyl-CpG-binding protein 2

MEF2 Factor potenciador de miocito-2

MEOS Sistema microsomal de oxidación del etanol

13

ABREVIATURAS

5-mC 5-metilcitosina

miARN microARN

NAc Núcleo accumbens

nAChRs Receptores nicotínicos de acetilcolina

NAD+ Nicotinamida adenina dinucleótido

NAD+(P) Nicotinamida adenina dinucleótido (fosfato)

Narp del inglés Neuronal activity-regulated pentraxin

NE Norepinefrina o noradrenalina

NET Transportador de norepinefrina

NFκB Factor nuclear κB

NMDA N-metil-D-aspartato

NPY Neuropéptido Y

OEDT Observatorio español de drogas y toxicomanías

OL Corteza orbital lateral

OLV Corteza orbital lateral ventral

OM Corteza orbital medial

Oprm1 Receptor opioide, Mu 1

OV Corteza orbital ventral

POMC Proopiomelanocortina

PrC Corteza precentral

PrL Corteza prelímbica

SER Serotonina, o 5-hidroxitriptamina (5-HT)

SERT Transportador de serotonina

SNC Sistema nervioso central

Th Tirosina hidroxilasa

Trdmt1 del inglés tRNA aspartic acid methyltrasferase 1

UNODC Oficina de las naciones unidas contra la droga y el delito

18S ARN ribosómico 18S

14

ABREVIATURAS

15

16

RESUMEN

El consumo de sustancias psicoactivas, y en concreto el consumo simultáneo de alcohol

y cocaína, es una práctica frecuente en la población general. Así mismo, se ha visto que

el consumo de cocaína incrementa el riesgo de desarrollar dependencia de alcohol, y

viceversa. Actualmente existen 4 tratamientos farmacológicos aprobados para la

dependencia de alcohol, siendo el disulfiram el primer tratamiento aprobado,

posteriormente lo fueron la naltrexona y el acamprosato, y recientemente el nalmefeno.

Por otra parte, estudios clínicos recientes han señalado que el topiramato, un fármaco

aprobado para el tratamiento de la epilepsia y la prevención de la migraña, podría ser

efectivo para el tratamiento de la dependencia de alcohol o cocaína. Sin embargo, para

esta última no existe aún ninguna terapia farmacológica aprobada, y se conoce muy

poco acerca de la eficacia de estas farmacoterapias en la codependencia de alcohol y

cocaína.

Por lo tanto, en la presente tesis doctoral se abordan varias hipótesis sobre este campo

de estudio, que son:

1) El tratamiento farmacológico con naltrexona, acamprosato, y topiramato será

efectivo en la reducción del consumo de alcohol en ratas.

2) La exposición crónica a cocaína aumentará el consumo de alcohol y alterará la

actividad locomotora de los animales.

3) El tratamiento farmacológico con naltrexona y topiramato reducirá el

incremento del consumo de alcohol y la estimulación psicomotora inducidos por

cocaína.

4) La naltrexona y el topiramato alterarán la expresión de genes asociados con la

actividad neuronal y genes epigenéticos en la CPF.

Para verificar estas hipótesis se plantearon una serie de objetivos específicos llevados a

cabo en 2 estudios, en los cuales se utilizó un modelo de autoadministración operante de

alcohol con administración concomitante de cocaína (i.p) en ratas Wistar macho. Todos

los tratamientos farmacológicos fueron administrados por vía oral, y se analizó la

expresión génica en la CPF, debido a su implicación en la conducta adictiva y su

sensibilidad a los tratamientos farmacológicos objeto de estudio.

17

En el primer estudio se realizó una curva dosis-respuesta de naltrexona (1, 3, y 10

mg/kg) y acamprosato (35, 70, y 210 mg/kg) sobre el consumo de alcohol, siendo la

dosis más alta de naltrexona la única que mostró eficacia, sin deberse este efecto a

alteraciones motoras. La cocaína (2.5, 10, y 20 mg/kg) incrementó de manera dosis

dependiente el consumo de alcohol de los animales, y revirtió la eficacia de la

naltrexona. Por otra parte, el efecto de sensibilización motora inducido por la

administración crónica de cocaína no fue reducido por la naltrexona. Por último, el

análisis de los niveles de ARNm de varios genes de expresión temprana en la CPF,

reveló una reducción de la expresión del factor de transcripción C-fos, y un incremento

de la expresión de COX-2 y Homer1a, inducidos por el consumo crónico de alcohol.

En el segundo estudio se exploraron los efectos de dosis crecientes de topiramato (2.5-

40 mg/kg) sobre el consumo de alcohol y la coadministración de cocaína (20 mg/kg). El

topiramato no redujo el consumo de alcohol a ninguna de las dosis estudiadas, pero sí

fue eficaz en la prevención del incremento del consumo inducido por cocaína, sin causar

alteraciones motoras. Esta eficacia fue observada cuando el tratamiento con topiramato

tenía lugar antes de la sesión de autoadministración de alcohol, pero no cuando se

administraba antes de la inyección de cocaína. De forma similar, este tratamiento

farmacológico no alteró la sensibilización motora inducida por cocaína, ni el

metabolismo de la misma. Sin embargo, el tratamiento crónico con topiramato redujo

los niveles de alcohol en sangre, y afectó a la memoria de los animales en el test de

reconocimiento de objetos. Por último, se analizó la expresión génica de 3 grupos de

genes: a) relacionados con mecanismos de control epigenético, b) proteínas diana del

topiramato, e c) implicados en la neurotransmisión dopaminérgica y opioide. El alcohol

incrementó la expresión génica de Dnmt1, Dnmt3a, Dmap1, y Trdmt1, efecto que fue

revertido por el topiramato o la cocaína. Esta última provocó un aumento de la

expresión de Hdac2 y Grik1, y la coadministración de cocaína y topiramato produjo

este mismo efecto en Drd2, Th, y Oprm1.

Por lo tanto, estos datos nos permiten concluir que el tratamiento con naltrexona es el

único capaz de reducir el consumo de alcohol en las ratas, según nuestras condiciones

experimentales. Por otra parte, la coadministración crónica de alcohol y cocaína

produce un incremento del consumo de alcohol que solo se ve reducido por el

tratamiento con topiramato. La actividad locomotora no se ve afectada por los

tratamientos farmacológicos estudiados. Sin embargo, la exposición crónica a cocaína

18

RESUMEN

provoca un efecto de sensibilización motora en los animales, que no es bloqueado por la

naltrexona ni el topiramato. Además, el tratamiento crónico con topiramato en dosis

moderadas/altas puede perjudicar la memoria de tipo episódica.

Mientras que el metabolismo de la cocaína no se ve afectado por el tratamiento crónico

con topiramato, este último aumenta el metabolismo del alcohol, independientemente de

la presencia de cocaína. Respecto a la expresión génica en la CPF se puede concluir, por

una parte, que los cambios en la expresión de C-fos pueden ser un biomarcador útil en la

dependencia de alcohol, y por otra, que el alcohol podría estar alterando tanto el

mantenimiento de los patrones de metilación como la metilación de novo en la CPF, a

través del aumento de la expresión génica de Dnmt1 y Dnmt3a, un efecto que es

prevenido por la administración de topiramato y/o cocaína. Así mismo, el incremento de

la expresión de Hdac2, inducido por la cocaína, podría estar mediando un

silenciamiento génico asociado a esta droga.

Por último, los efectos conductuales de la coadministración de topiramato y cocaína se

ven acompañados por una alteración de la expresión de varios genes implicados en la

adicción (Drd2, Th, y Oprm1).

19

RESUMEN

20

SUMMARY

The use of psychoactive substances, in particular the simultaneous use of alcohol and

cocaine is a common practice in the general population. Likewise, it has been shown

that cocaine increases the risk of alcohol dependence and vice versa. Currently there are

4 approved pharmacological treatments for alcohol dependence, being the first approved

treatment disulfiram, subsequently naltrexone and acamprosate, and more recently

nalmefene. Moreover, recent clinical studies have indicated that topiramate, a

medication approved for the treatment of epilepsy and migraine prevention, may be

effective in the treatment of alcohol or cocaine dependence. However, for the latter,

there is still no approved drug therapy, and also there is very few knowledge about the

efficacy of these pharmacotherapies in the co-dependency of alcohol and cocaine.

Therefore, in this doctoral thesis several hypotheses about this field of study were

addressed, specifically:

1) The treatment with naltrexone, acamprosate, and topiramate is effective in reducing

alcohol consumption in rats.

2) Chronic exposure to cocaine will increase alcohol consumption and alter locomotor

activity in animals.

3) Pharmacological treatment with naltrexone and topiramate will reduce the cocaine-

induced increase in alcohol consumption and psychomotor stimulation.

4) Naltrexone and topiramate will alter the expression of genes associated with neural

activity and epigenetic genes in the PFC.

To verify this hypothesis a number of specific objectives have been stated and

performed in two studies, using a model of operant alcohol self-administration with

concomitant administration of cocaine (i.p.) in male Wistar rats. All drug treatments

were administered orally, and gene expression was analyzed in the PFC, due to its

involvement in the addictive behavior and sensitivity to the drug treatments under study.

In the first study a dose-response curve of naltrexone (1, 3, and 10 mg/kg) and

acamprosate (35, 70, and 210 mg/kg) on alcohol consumption was performed, showing

efficacy only the highest dose of naltrexone, which was not due to motor impairments.

Cocaine (2.5, 10, and 20 mg/kg) dose-dependently increased alcohol consumption of

21

animals and reversed the efficacy of naltrexone. The effect of motor sensitization

induced by chronic cocaine administration was not prevented by naltrexone. Finally,

analysis of the mRNA levels of several immediate early genes in the PFC, revealed that

chronic alcohol consumption reduced gene expression of the transcription factor C-fos,

and increased expression of COX-2 and Homer1a.

In the second study the effects of increasing doses of topiramate (2.5-40 mg/kg) on

alcohol consumption and the co-administration of cocaine (20 mg/kg) were explored.

Topiramate did not reduce the consumption of alcohol at any of the studied doses, but it

was effective in preventing the cocaine-induced increased consumption, without causing

motor impairment. This efficacy was observed when topiramate was administered

before the alcohol self-administration session, but not when it was administered before

the cocaine injection. Similarly, this pharmacological treatment did not alter cocaine-

induced motor sensitization, or cocaine metabolism. However, chronic treatment with

topiramate reduced blood alcohol levels, and showed a tendency to alter memory in the

object recognition test. Finally, the gene expression of three groups of genes was

analyzed: a) related to epigenetic control mechanisms, b) for topiramato targets, and c)

involved in dopaminergic and opioid neurotransmission. Alcohol increased gene

expression of Dnmt1, Dnmt3a, Dmap1, and Trdmt1. This effect was reversed by

topiramate or cocaine. The latter caused an increased expression of Hdac2 and Grik1,

and the co-administration of cocaine and topiramate produced the same effect in Drd2,

Th, and Oprm1.

Therefore, these data allow us to conclude that only the treatment with naltrexone is

able to reduce alcohol consumption in rats, according to our experimental conditions.

Furthermore, co-administration of chronic alcohol and cocaine produces an increase in

alcohol consumption which only is reduced by treatment with topiramate. Locomotor

activity is not affected by the pharmacological treatments studied. However, chronic

exposure to cocaine causes motor sensitization, which is not blocked neither by

naltrexone nor topiramate. In addition, chronic treatment with topiramate in

moderate/high doses may impair episodic-like memory.

While the metabolism of cocaine is not affected by chronic treatment with topiramate,

the latter increases the metabolism of alcohol regardless of the presence of cocaine.

Regarding the gene expression in the PFC it can be concluded, first, that changes in the

22

SUMMARY

expression of C-fos can be a useful biomarker for alcohol dependence, and secondly,

that alcohol could be altering both, the maintenance of methylation patterns as well as

de novo methylation in the PFC, by increasing gene expression of Dnmt3a and Dnmt1,

an effect which is prevented by the administration of topiramate and/or cocaine.

Likewise, cocaine-induced increase in Hdac2 expression could be mediating gene

silencing associated with this drug.

Finally, the behavioral effects of the co-administration of topiramate and cocaine are

accompanied by an alteration in the expression of several genes involved in addiction

(Drd2, Th, and Oprm1).

23

SUMMARY

24

I. INTRODUCCIÓN

25

26

1. NEUROBIOLOGÍA DE LA ADICCIÓN

1.1. Adicción

En la actualidad, se suelen distinguir tres formas diferentes de consumo de drogas: 1)

uso ocasional, controlado o social, 2) abuso de drogas o uso perjudicial, y 3)

drogadicción (Le Moal y Koob, 2007). La drogadicción, o dependencia de sustancias

(término utilizado en el Manual Diagnóstico y Estadístico de los Trastornos Mentales en

su cuarta edición, DSM-IV), es una enfermedad crónica y recidivante caracterizada por

la búsqueda y uso compulsivo de la droga, pérdida de control sobre el límite de

consumo de la misma, y la aparición de estados emocionales negativos (disforia,

ansiedad e irritabilidad) cuando no se tiene acceso a la sustancia (Koob y Le Moal,

1997).

Se han propuesto, en base a datos experimentales, dos enfoques teóricos principales

para explicar la transición a la adicción:

- Teorías centradas en la droga: según estas teorías, la adicción es principalmente

una consecuencia del consumo de drogas y es el resultado de los cambios

psicofarmacológicos producidos en el individuo debido al uso crónico de la

misma. Estas teorías se centran en cambios específicos inducidos por las drogas,

entre los que se incluyen procesos como la tolerancia (Roberts et al., 2002), la

sensibilización (Robinson y Berridge, 1993, 2008; Wise y Bozarth, 1987), la

abstinencia y alostasis (Koob y Le Moal, 2005, 2008), y los cambios en procesos

cognitivos (Bechara, 2001, 2005; Jentsch y Taylor, 1999; Robbins et al., 2008).

Estos cambios se ven apoyados por las importantes alteraciones neurobiológicas a

nivel molecular, celular, sináptico, y de vías, que se producen como consecuencia

del consumo crónico de drogas (Everitt y Wolf, 2002; Hyman et al., 2006; Kauer

y Malenka, 2007; Nestler, 1992, 1994, 2000; Wolf, 1998, 2002, 2010;).

- Teorías centradas en el individuo: de acuerdo con este enfoque teórico, las drogas

son una condición necesaria pero no suficiente para el desarrollo de la adicción.

Por tanto, la adicción sería el resultado de una respuesta patológica a la droga

generada en algunos individuos debido a que presentan un fenotipo biológico

vulnerable. Las principales diferencias entre los postulados de esta familia se

refieren al grado de relevancia etiológica otorgado a factores genéticos,

27

INTRODUCCIÓN

ambientales, su interacción, y a factores relacionados con la edad del individuo,

entre los que se incluyen factores perinatales, de la adolescencia, etc. (Bardo et al.,

2013; Barron et al., 2005; Caspi y Moffitt, 2006; Crabbe et al., 1999, 2010;

Doremus-Fitzwater et al., 2010; Ellembroek et al., 2005; Foroud et al., 2010;

Piazza et al., 1996; van der Kam et al., 2005).

Piazza y Deroche-Gamonet (2013) proponen una teoría general de transición a la

adicción, que ofrece un enfoque teórico unificador de las dos familias de teorías

anteriormente mencionadas. Para estos autores, la transición a la adicción es el resultado

de una interacción, en tres etapas, entre la vulnerabilidad del individuo y el

grado/cantidad de exposición a la droga. De forma resumida, en la primera etapa se da

el uso recreacional y esporádico de la droga, tratándose de un proceso de aprendizaje

mediado por la sobreactivación de los sustratos neurobiológicos de los refuerzos

naturales. En la segunda etapa, algunos individuos vulnerables consumen la droga de

manera intensificada, en escalada, y mantenida en el tiempo, lo que induciría una

sensibilización del incentivo y un estado alostático, provocando en el individuo una

fuerte necesidad de búsqueda y consumo de la droga. Por último, la tercera etapa está

caracterizada por la pérdida de control del consumo de la droga y la adicción completa,

y se debe a un segundo fenotipo vulnerable del sujeto.

Respecto a la terminología usada en el ámbito de la adicción, es de destacar que en la

última versión del DSM (DSM-V) se realizaron varias modificaciones en la

terminología diagnóstica: se ha sustituido el término “dependencia”, utilizado desde el

DSM-III-R, por el de “trastornos por consumo de sustancias”. Además, la palabra

“adicción” fue omitida de la terminología oficial del diagnóstico de consumo de

sustancias, debido a su definición incierta y su posible connotación negativa.

Por otra parte, la Organización Mundial de la Salud (OMS), en la Clasificación

Internacional de Enfermedades (CIE-10), no incorpora la adicción entre los términos

diagnósticos. Sin embargo, permite que el término “dependencia” sea utilizado en

referencia a todas las sustancias psicoactivas (farmacodependencia, drogodependencia,

dependencia de sustancias químicas, dependencia del consumo de sustancias) o en el

caso de una droga o clase de drogas concreta, por ejemplo dependencia del alcohol.

Además, debido a su ambigüedad, el término “abuso” no está recogido en la CIE-10,

excepto para las sustancias que no producen dependencia (OMS, 2008). En la Tabla 1 se

28

INTRODUCCIÓN

resumen los criterios diagnósticos actuales para los trastornos por consumo de

sustancias según el DSM-V.

Datos epidemiológicos

El uso de sustancias psicoactivas está muy extendido en nuestra sociedad. Según datos

del Informe Mundial sobre las Drogas, publicado por la Oficina de las Naciones Unidas

contra la Droga y el Delito (UNODC, 2014), en el año 2012 aproximadamente 183.000

muertes estaban relacionadas con las drogas, correspondiéndose este dato con una tasa

de mortalidad de alrededor de 40 muertes por millón, en la población comprendida entre

15 y 64 años. Según este informe, entre 162 y 324 millones de personas, en ese mismo

margen de edad, consumieron alguna sustancia ilegal al menos una vez a lo largo del

último año, tratándose principalmente de sustancias del grupo del cannabis, opioides,

Tabla 1. Criterios diagnósticos para los trastornos por consumo de sustancias. DSM-V

Cumplir dos o más de los siguientes criterios dentro de un periodo de doce meses.

Control deficitario sobre el consumo

1. Consumo de grandes cantidades de sustancia o durante un tiempo más prolongado

de lo previsto.

2. Expresar deseos insistentes de dejar o de regular el consumo, con múltiples

esfuerzos fallidos por disminuirlo o abandonarlo.

11. Síndrome de abstinencia.

Grupos de Criterios:

Trastorno Leve: dos o tres síntomas. Moderado: cuatro o cinco síntomas. Grave: seis o más.

Consumo de Riesgo de la Sustancia

8. Consumo recurrente de la sustancia incluso en situaciones en las que esta provoca

un riesgo físico.9. Consumo continuado a pesar de saber que se padece un problema físico o

psicológico recurrente o persistente que se puede originar o exacerbar por el consumo.

Criterios Farmacológicos

5. Incumplimiento de los deberes fundamentales (académicos, laborales o domésticos).

10. Síntomas de Tolerancia.

3. Invertir gran parte del tiempo intentando conseguir la sustancia, consumiéndola o

recuperándose de sus efectos.

6. Consumir a pesar de los problemas recurrentes o persistentes (sociales o

interpersonales) causados o exacerbados por los efectos del consumo.7. Reducir o abandonar actividades sociales, ocupacionales o recreativas debido al

consumo de sustancias.

4. Existe un deseo intenso de consumo.

Deterioro Social

29

INTRODUCCIÓN

cocaína, o estimulantes de tipo anfetamínico. Por otra parte, el número de personas con

consumo problemático (consumidores habituales y personas con trastornos de consumo

o dependencia) se sitúa entre los 16 y los 39 millones.

Si nos centramos en España, encontramos que en el año 2013 (Encuesta Domiciliaria

sobre Alcohol y Drogas en España, EDADES) las sustancias psicoactivas con mayor

prevalencia de consumo, en la población de entre 15 y 65 años, fueron en primer lugar

el alcohol (93.1%) seguido por el tabaco (73.1%). Respecto a las drogas de comercio

ilegal, el cánnabis y la cocaína tienen la mayor prevalencia de consumo de alguna vez

en la vida, siendo un 30.4% y un 10.2% respectivamente (Observatorio Español de

Drogas y Toxicomanías [OEDT], 2013). Por otra parte, es de destacar que, según datos

del año 2011, el consumo de tranquilizantes, realizado alguna vez en la vida, ha

aumentado sustancialmente hasta alcanzar un 17.1% de la población consultada (OEDT,

Informe anual 2012).

Además, la Encuesta sobre uso de Drogas en Enseñanzas Secundarias en España

(ESTUDES, datos del 2012) indica que el alcohol, el tabaco y el cánnabis son las

sustancias más consumidas por los estudiantes de entre 14 y 18 años. Este problema

adquiere mayor relevancia si tenemos en cuenta la temprana edad de inicio de consumo

de sustancias psicoactivas. El alcohol y el tabaco muestran un inicio de consumo antes

de cumplir los 14 años, mientras que el éxtasis, la cocaína, las anfetaminas o los

alucinógenos comienzan ya con 15 años cumplidos (OEDT, Informe Nacional, 2013).

Es importante señalar que, según datos del año 2013 (EDADES, OEDT) en la población

de entre 15 y 65 años, el policonsumo de dos o tres sustancias, en los últimos doce

meses, fue del 30.2% y 9.3% respectivamente. En concreto, el alcohol está asociado con

una mayor prevalencia de consumo de otras drogas, sobre todo si se trata de consumo

de alcohol de tipo intensivo, estando presente en el 90% de los policonsumos.

1.2. Sistema cerebral de recompensa

La drogadicción puede ser considerada como una enfermedad del sistema cerebral de

recompensa (Vetulani, 2001). Esta circuitería cerebral de recompensa fue descubierta

por Olds y Milner (1954), gracias a la autoestimulación intracraneal (ICSS, por sus

siglas en inglés). Estos investigadores querían estudiar si la estimulación de la sustancia

reticular podría facilitar el aprendizaje, pero debido a un error técnico el electrodo de

estimulación fue insertado en una región distinta del cerebro. Al observar que el animal

30

INTRODUCCIÓN

parecía disfrutar del paso de la corriente, Olds y Milner modificaron su experimento de

forma que la rata podía suministrarse por sí misma la corriente presionando una palanca.

Esta autoestimulación era particularmente pronunciada cuando se insertaban los

electrodos en determinadas regiones cerebrales (Vetulani, 2001). Mediante esta técnica

fue posible trazar un mapa cerebral con las vías implicadas en el refuerzo. El haz

prosencefálico medial, que conecta el área tegmental ventral (ATV) con el núcleo

accumbens (NAc), fue el primero en ser identificado en este sistema. Otras vías de

neurotransmisión que también han sido implicadas en el refuerzo incluyen proyecciones

desde el ATV y el NAc, que inervan otras áreas límbicas (como la amígdala) y

corticales, importantes en la expresión de las emociones, la reacción ante estímulos

condicionados, la planificación y el juicio. Aunque el haz prosencefálico medial está

formado por neuronas que contienen dopamina (DA), norepinefrina o noradrenalina

(NE), y serotonina (SER, o 5-hidroxitriptamina [5-HT]), es la proyección

dopaminérgica la que ha sido fuertemente implicada en el refuerzo (Figura 1). Tanto los

refuerzos naturales (la comida, el sexo, las interacciones sociales, entre otros) como los

artificiales (drogas de abuso) activan esta vía dopaminérgica (mesolímbica), provocando

un incremento en los niveles de dopamina en el NAc (Tomkins y Sellers, 2001).

Muchos datos indican, por tanto, que la vía ATV-NAc y otras regiones límbicas median

los efectos emocionales positivos agudos de los refuerzos naturales. Estas mismas

regiones han sido implicadas en lo que se conoce como “adicciones naturales”

(consumo compulsivo de refuerzos naturales), entre las que encontramos la adicción a la

comida, el juego patológico, y las adicciones sexuales (Nestler, 2005).

Todas las drogas de abuso activan el sistema dopaminérgico mesolímbico, pero hay

muchos datos que sugieren una recompensa independiente de la dopamina, que ocurre a

nivel del NAc (Koob, 1992; Nestler, 2005).

En la adicción, la conducta de consumo de drogas progresa desde la impulsividad a la

compulsividad en un ciclo de tres etapas, y ambas pueden coexistir en diferentes etapas

de este ciclo (Koob, 2011). A continuación se expondrán de forma resumida los

mecanismos neurobiológicos implicados en estas etapas del ciclo de la adicción (Figura

2).

31

INTRODUCCIÓN

Figura 1. Circuitos de recompensa importantes en los efectos de refuerzo de las drogas de

abuso, en el cerebro de la rata. Los sistemas dopaminérgicos mesocorticolímbicos con origen

en el ATV incluyen proyecciones desde los cuerpos neuronales del ATV al NAc, amígdala, y

corteza prefrontal (CPF); las proyecciones glutamatérgicas (Glu) desde la CPF al NAc y el

ATV; y proyecciones desde las neuronas gabaérgicas (GABA) del NAc a la CPF. Las

interneuronas opioides modulan la acción inhibitoria de las neuronas gabaérgicas en el ATV e

influyen en la activación de neuronas noradrenérgicas (NE) del locus coeruleus. Las

proyecciones serotoninérgicas (5-HT) desde el núcleo del rafe se extienden hasta el ATV y el

NAc. La figura muestra los sitios de acción propuestos para varias drogas en estos circuitos

(modificada de Camí y Farré, 2003).

Respecto a la etapa de binge o atracón / intoxicación, se piensa que la acción inicial del

refuerzo de las drogas dependería de la liberación de dopamina en el NAc (en el caso de

la cocaína, anfetamina y nicotina), la activación del receptor péptido opioide en el ATV

(vía activación dopaminérgica) y NAc (independiente de activación dopaminérgica)

para los opiáceos; y los sistemas GABAA (ácido gamma-aminobutírico de tipo A) en el

NAc y la amígdala para el alcohol. El NAc está situado estratégicamente para recibir

información límbica (desde la amígdala, la corteza frontal, y el hipocampo) que podría

ser convertida en acción motivacional mediante sus conexiones con el sistema motor

extrapiramidal (Koob, 2011; Koob y Volkow, 2010).

La amígdala extendida parece estar relacionada con el estado emocional negativo que

promueve los mecanismos de refuerzo negativo asociados con el desarrollo de la

adicción. La amígdala extendida está compuesta por el núcleo central de la amígdala, el

núcleo del lecho de la estría terminal, y una zona de transición en la región medial

32

INTRODUCCIÓN

(Shell) del NAc. Además, recibe numerosas aferencias desde estructuras límbicas tales

como la amígdala basolateral y el hipocampo, y envía eferencias a la parte medial del

pálido ventral y una larga proyección al hipotálamo lateral (Koob y Volkow, 2010).

En la etapa de la abstinencia / afecto negativo (Figura 2) tienen lugar distintos tipos de

cambios. Por una parte, está asociada a cambios intrasistema reflejados en una

disminución de la actividad dopaminérgica en la vía mesolímbica y, por otra, con un

reclutamiento entre sistemas de neurotransmisión implicados en efectos de estrés y

ansiedad tales como el factor liberador de corticotropina (CRF) y la dinorfina. Otros

sistemas de neurotransmisión implicados en la desregulación emocional de los efectos

motivacionales de la abstinencia a las drogas incluyen norepinefrina, sustancia P,

vasopresina, neuropéptido Y (NPY), endocannabinoides, y nociceptina (Koob, 2008).

Figura 2. Componentes principales del ciclo de la adicción.

El concepto de sistema de anti-recompensa, o estrés, ha sido formulado para acomodar

los cambios significativos en los sistemas emocionales cerebrales asociados con el

desarrollo de la dependencia. Se trata de un sistema originalmente encargado de

contrarrestar los efectos recompensantes de las drogas y que después pasaría a dominar

el balance motivacional del organismo. El reclutamiento de los procesos de anti-

recompensa promueve una cascada de reforzamiento negativo que contribuiría al

incremento del craving. Este concepto se deriva de la hipótesis de las neuroadaptaciones

entre sistemas para la activación del sistema de recompensa a nivel de neurocircuitería.

Esta neuroadaptación entre sistemas haría referencia a la activación del circuito de anti-

recompensa llevada a cabo por el circuito de recompensa (Koob, 2011).

33

INTRODUCCIÓN

La etapa de preocupación / anticipación, o craving, del ciclo de la adicción (Figura 2)

parece ser un elemento clave de la recaída en humanos. Los modelos animales de

craving pueden ser divididos en: (a) búsqueda de la droga inducida por la droga o

estímulos asociados con el consumo de la droga, y (b) búsqueda de la droga inducida

por un estresor agudo o un estado emocional negativo residual, a menudo un estado de

estrés, llamado abstinencia prolongada (Koob y Volkow, 2010). La etapa de craving

implica importantes proyecciones aferentes al NAc y la amígdala, específicamente el

córtex prefrontal (para el restablecimiento inducido por drogas) y la amígdala

basolateral (para el restablecimiento inducido por clave). Se ha planteado que la

conducta de búsqueda compulsiva de la droga podría ser mantenida por bucles a nivel

estriatal ventral-palidal ventral-talámico-cortical (Koob, 2011).

34

INTRODUCCIÓN

2. CORTEZA PREFRONTAL Y ADICCIÓN

2.1. Funciones de la corteza prefrontal y sus alteraciones en la adicción

La corteza prefrontal está implicada en el control ejecutivo, la toma de decisiones, el

aprendizaje por refuerzos y la valoración (Kravitz et al., 2015), un punto de vista que

comparten los estudios realizados en humanos, monos y ratas. También, desde una

visión más general, se considera que la CPF es fundamental para el mantenimiento “on-

line” de las representaciones de la memoria (Dalley et al., 2004).

La actividad entre las regiones de la CPF está altamente integrada y es flexible, de

forma que cualquier región está implicada en múltiples funciones. Sin embargo, y como

se comentará más adelante, algunas regiones específicas de la CPF han sido

predominantemente implicadas en funciones más concretas (Goldstein y Volkow,

2011). En la Tabla 2 se recogen los principales procesos asociados con la CPF, sus

posibles alteraciones en la adicción, así como las regiones específicas de la CPF que

estarían implicadas.

En esta misma línea, además, los estudios optogenéticos de la CPF han demostrado que

existen circuitos específicos en esta estructura que tienen diferentes roles en la

modulación de conductas asociadas con el trastorno por uso de sustancias (Kravitz et

al., 2015).

Por otra parte, la corteza prelímbica, que se corresponde con la CPF dorsomedial en

humanos, es indispensable para el aprendizaje instrumental y la conducta dirigida a

objetivos, y está implicada en la búsqueda de la droga y el restablecimiento del

consumo inducidos por la droga o por una señal. Los datos muestran también que la

corteza infralímbica (CPF ventromedial en humanos) está involucrada en el aprendizaje

estímulo-respuesta y en los hábitos comportamentales (Capriles et al., 2003; Di Ciano et

al., 2007; Killcross y Coutureau, 2003; Ostlund y Balleine, 2005).

Los estudios de neuroimagen han puesto de manifiesto un patrón emergente de

disfunción generalizada de la CPF en individuos adictos a las drogas, que está asociado

con resultados más negativos en cuanto al consumo de drogas, la ejecución de tareas

relacionadas con la CPF, y la probabilidad de recaída. En estos sujetos adictos, la

activación generalizada de la CPF después de consumir cocaína u otras drogas, y tras la

presentación de señales relacionadas con las drogas, se ve reemplazada por una

35

INTRODUCCIÓN

hipoactividad generalizada de la CPF durante la exposición a pruebas de alto nivel

emocional y cognitivo, y/o durante la abstinencia prolongada (Goldstein y Volkow,

2011).

2.2. Organización estructural de la corteza prefrontal en roedores

La CPF muestra una gran variación entre las distintas especies en términos de criterios

anatómicos, como es el caso de su citoarquitectura y conectividad. Sin embargo,

teniendo en cuenta la definición que hacen Rose y Woolsey de la CPF, como el área

cortical que recibe conexiones recíprocas desde el núcleo medial dorsal del tálamo

(Rose y Woolsey, 1948), así como otros criterios que incluyen, además, características

funcionales (Uylings et al., 2003; Uylings y van Eden, 1990), se pueden identificar

Aprendizaje y memoria: apredizaje asociativo de

estímulo-respuesta, aprendizaje de inversión,

extinción, devaluación de la recompensa,

inhibición latente (supresión de información) y

memoria a largo plazo.

Conciencia e interocepción: sentir el propio

cuerpo y el estado subjetivo, "insight".

Tabla 2. Procesos asociados con la CPF que son alterados en la adicción

Modificada de Goldstein y Volkow, 2011

COFl, COFm, CPFvm y

CPFdl

COFm y CPFvm

CPF: corteza prefrontal, CPFdl: CPF dorsolateral, CPFvl: CPF ventrolateral, CPFm: CPF medial, CPFvm: CPF ventromedial. CCA: corteza

cingulada anterior, CCAd: CCA dorsal, CCAr: CCA rostral. COF: corteza orbitofrontal, COFm: COF medial, COFl: COF lateral. GFI: giro

frontal inferior.

Procesos Posibles alteraciones en la adicción Región probable de la CPF

COF, CCA, CPFvm y CPFdl

CCAr y CCAd, CPFm, COF y

CPFvl

CPFdl, CCA, GFI y CPFvl

CPFdl

CPFdl, COF y CCA

CPFdl, CCAd, GFI y CPFvl

COFm, CPFvm y CCA

subgenual

Atención y flexibilidad: formación y

mantenimiento de un set atencional frente al

cambio (set-shifting), y cambio de tarea.

Toma de decisiones: valoración (codificación de

refuerzos) frente a la elección, resultado

esperado, estimación de probabilidad,

planificación y formación del objetivo.

Atribución de saliencia: valoración del valor

afectivo, saliencia del incentivo y utilidad

subjetiva (resultados alternativos).

Impulsividad, compulsividad, asunción de riesgos y

deterioro del autocontrol (habitual, automático,

guiado por el estímulo y patrones conductuales

inflexibles).

Reactividad al estrés aumentada e incapacidad

para suprimir la intensidad emocional.

Motivación aumentada para conseguir las drogas,

pero disminuida para otros objetivos, e

intencionalidad y esfuerzo comprometidas.

Saciedad reducida, negación de enfermedad o

necesidad de tratamiento, y pensamiento

orientado externamente.

Sesgo de atención hacia los estímulos relacionados

con las drogas y lejos de otros estímulos y

refuerzos, e inflexibilidad en objetivos para

conseguir la droga.

Formación de memoria sesgada hacia estímulos

relacionados con las drogas y lejos de alternativas.

condicionamiento a la droga y capacidad alterada

para actualizar el valor de la recompensa de

refuerzos no relacionados con la droga.

Anticipación realcionada con la droga, elección de

recompensas inmediatas sobre gratificación

retardada, descuento de consecuencias futuras, y

predicciones o planificación de la acción inexactas.

Las drogas y las señales de drogas tienen un valor

sensibilizado, los refuerzos no relacionados con la

droga son devaluados y los gradientes no son

percibidos, y error de predicción negativo

(experiencia actual peor que la esperada).

Memoria de trabajo: memoria a corto plazo que

permite la construcción de representaciones y la

guía de la acción.

Autocontrol y supervisión del comportamiento:

inhibición de la respuesta, coordinación

conductual, predicción, detección y resolución de

conflicto y error.

Regulación de las emociones: supresión cognitiva

y afectiva de las emociones.

Motivación: impulso o "drive", iniciativa,

persistencia y esfuerzo hacia la consecución de

objetivos.

36

INTRODUCCIÓN

varias regiones distintas en la CPF de la rata. Se podrían distinguir tres zonas generales

(ver Figura 3):

- Medial: puede ser subdividida en una región dorsal, que incluye la corteza

cingulada anterior (CCA) y la corteza precentral (PrC), y una parte ventral que

incluye las cortezas prelímbica (PrL), infralímbica (IL) y orbital medial (OM).

- Lateral: incluye las cortezas insular agranular dorsal (IAD), ventral (IAV), y

orbital lateral (OL).

- Ventral: engloba las cortezas orbital ventral (OV) y orbital lateral ventral (OLV).

La CPF recibe proyecciones talamo-corticales, cortico-coticales, y desde estructuras

subcorticales tales como la sustancia negra, ATV, amígdala, hipotálamo lateral, e

hipocampo. Además, hay conexiones recíprocas desde la CPF a estas estructuras, y

proyecciones directas al septum lateral, mesencéfalo, y regiones autonómicas del tronco

del encéfalo (Groenewegen et al., 1997; Kolb y Tees, 1990).

Figura 3. Diagramas de la CPF de la rata. A) Sección sagital, 0.9 mm desde la línea media.

B) Sección coronal unilateral, aproximadamente 3.5 mm rostral a bregma (representado por la

flecha vertical). Los diferentes sombreados muestran las tres subdivisiones principales de la

CPF (medial, ventral, y lateral). IAD e IAV, corteza insular agranular dorsal y ventral; OAM y

OAV, núcleo olfatorio anterior medial y ventral; cc, cuerpo calloso; CCA, corteza cingulada

anterior; gcc, genu del cuerpo calloso; OM, OL, OLV, y OV, corteza orbital medial, lateral,

lateral ventral, y ventral; M1, área motora primaria; PrC y PrL, cortezas precentral y prelímbica;

BO, bulbo olfatorio; IL, corteza infralímbica (modificada de Dalley et al., 2004).

37

INTRODUCCIÓN

3. ALCOHOL

3.1. El alcohol como droga de abuso

El consumo excesivo de alcohol, antes considerado como una conducta pecaminosa,

empezó a conceptualizarse como “trastorno” gracias a pioneros como Thomas Trotter y

Benjamin Rush, además de Magnus Huss, quien introdujo el término “alcoholismo” en

el año 1849 (Tabakoff y Hoffman, 2013).

En la actualidad, según la OMS, el consumo nocivo de alcohol representa una gran

carga para las sociedades, tanto en el ámbito de la salud como a nivel económico y

social. Además de estar asociado a más de 200 enfermedades y lesiones, principalmente

a la dependencia de alcohol, cirrosis hepática y cáncer (Tabla 3), también se sugiere, a

partir de distintas investigaciones, una relación causal entre el consumo perjudicial de

alcohol y enfermedades infecciosas como la tuberculosis y el VIH / SIDA.

En este sentido, es importante señalar que en el año 2010 el consumo mundial fue de

6.2 litros de alcohol puro, en personas de 15 años o mayores, lo que se traduce en 13.5

gramos de alcohol puro por día. Por otra parte, en el año 2012, aproximadamente 3.3

millones de muertes fueron atribuibles al consumo de alcohol (WHO, 2014).

Las enfermedades relacionadas con el alcohol, especialmente el alcoholismo, son el

resultado de las respuestas acumuladas de la exposición al alcohol, la dotación genética

de un individuo, y el ambiente al que se encuentra expuesto a lo largo del tiempo. Esta

compleja interacción implica una amplia heterogeneidad entre los pacientes

dependientes de alcohol, tanto en las dimensiones de los síntomas como en la severidad

del trastorno (Spanagel, 2009).

En cuanto al daño cerebral relacionado con el alcohol, está bien establecido que incluso

los alcohólicos sin complicaciones, es decir aquellos que no tienen problemas

neurológicos o hepáticos específicos, muestran signos de daño cerebral regional y

disfunción cognitiva. Algunos de estos cambios son permanentes, mientras que otros

son reversibles (Harper, 2009). Los patrones de daño parecen relacionarse con la

duración del consumo de alcohol a lo largo de la vida del sujeto, siendo esto último

trascendental, además, para las complicaciones médicas asociadas, como es el caso del

síndrome de Wernicke-Korsakoff (Harper y Matsumoto, 2005; Zahr et al., 2011).

38

INTRODUCCIÓN

Los deterioros en la función neurológica que se observan con más frecuencia en la

dependencia de alcohol, incluyen déficits en resolución de problemas abstractos,

aprendizaje visoespacial y verbal, memoria, habilidades motoras perceptivas, e incluso

en la función motora. En este sentido, el patrón de déficits cognitivos se ha considerado

principalmente de naturaleza “frontal”, aunque también se ha planteado la posibilidad

de la contribución de los sistemas pontocerebelar y cerebelo-tálamo-cortical en el

deterioro cognitivo y motor (Harper y Matsumoto, 2005; Moselhy et al., 2001).

El consumo de alcohol también afecta al peso del cerebro, así los sujetos alcohólicos

presentan un menor peso de su cerebro en comparación con los no alcohólicos,

correlacionándose el grado de atrofia cerebral con la tasa y la cantidad de alcohol

consumido durante toda la vida. Esta reducción de peso y de volumen del cerebro puede

ser debida a la reducción en el volumen de materia blanca, como apuntan algunos

estudios, aunque otros encuentran, además, una disminución significativa de la materia

gris cortical (Harper, 2009; Pfefferbaum et al., 1995).

Se ha descrito una pérdida neuronal relacionada con el alcohol en regiones específicas

de la corteza cerebral (corteza asociativa frontal superior), hipotálamo, y cerebelo,

aunque no se han encontrado cambios ni en los ganglios basales, ni en los núcleos del

Enfermedades cardiovasculares

Modificada de Sarasa-Renedo et al., 2014

Enfermedades gastrointestinales

Trastornos maternos y perinatales

Lesiones no intencionadas

Lesiones intencionadas

Cirrosis, pancreatitis, gastritis.

Síndrome alcohólico fetal, prematuridad, bajo peso al nacer,

embarazo no deseado.

Accidentes de tráfico, laborales, domésticos, caídas, golpes,

quemaduras, entre otros.

Lesiones autoinflingidas (suicidio), agresiones violentas.

Tabla 3. Principales problemas de salud relacionados con el consumo de alcohol

Infección por VIH, infecciones de transmisión sexual,

tuberculosis, neumonía adquirida en la comunidad.

Cavidad oral, faringe, esófago, colon y recto, hígado, laringe,

mama.

Diabetes mellitus tipo 2.

Trastorno por consumo de alcohol (abuso, uso nocivo,

dependencia), intoxicación aguda, psicosis (depresión).

Convulsiones, neuropatías.

Hipertensión, arritmias, cardiomiopatía, ictus hemorrágico.

Enfermedades infecciosas

Cáncer

Enfermedades metabólicas

Trastornos mentales

Enfermedades neurológicas

39

INTRODUCCIÓN

rafe serotoninérgicos (Harper, 1998). Por otra parte, se han observado cambios

dendríticos y sinápticos en individuos alcohólicos, lo que podría explicar, junto con los

cambios en receptores y transmisores, los cambios funcionales y déficits cognitivos que

preceden a los cambios estructurales más severos (Harper y Matsumoto, 2005).

3.2. Farmacología del alcohol

El alcohol etílico o etanol (CH3-CH2-OH) es un líquido claro, incoloro, volátil, e

inflamable. El aporte energético de un gramo de alcohol al organismo es de 7.1 Kcal,

que no se ve acompañado por un aporte nutritivo, como minerales, proteínas o

vitaminas. El alcohol se obtiene fundamentalmente de la fermentación anaeróbica de los

hidratos de carbono, mediante la fermentación alcohólica (Álvarez-González y Del Río

Gracia, 2003). La flora gastrointestinal de los mamíferos produce pequeñas cantidades

de etanol, y también ocurre de forma natural en algunos alimentos. Sin embargo, la

principal fuente de alcohol en la dieta es la derivada de las bebidas procesadas mediante

fermentación alcohólica, tales como cerveza, licores destilados, y vino (Ferreira y

Willoughby, 2008). El etanol es una sustancia adictiva poco potente, dado que sus

efectos farmacológicos se observan tras la ingesta de gramos de etanol, mientras que en

otras sustancias adictivas estos efectos se observan a dosis de miligramos/peso corporal.

La estructura química del etanol le permite interaccionar con grupos polares y no

polares de componentes de la membrana plasmática, lo que explica su elevada

solubilidad tanto en entornos acuosos como en lipídicos. Además, su estructura química

explicaría, en parte, la complejidad y multitud de efectos inducidos por dicha sustancia

(Guerri, 2000).

Aunque el responsable principal de las acciones es el alcohol, la presencia de otros

compuestos en las bebidas alcohólicas puede contribuir al daño cuando se consume en

exceso. Entre estos compuestos se encuentran alcoholes de bajo peso molecular

(metanol, butanol), aldehídos, ésteres, histamina, fenoles, taninos, hierro, plomo y

cobalto (Álvarez-González y Del Río Gracia, 2003).

3.2.1. Farmacocinética

Absorción y Distribución

El alcohol es una molécula pequeña que, como ya se ha dicho, presenta características

tanto hidrofílicas como lipofílicas. Es rápidamente absorbido en el estómago (20%) e

40

INTRODUCCIÓN

intestinos (80%) mediante difusión simple (Marek y Kraft, 2014; Norberg et al., 2003).

La absorción del alcohol desde el duodeno y el yeyuno es más rápida que desde el

estómago, por lo que la tasa de vaciado gástrico es un determinante importante en la

tasa de absorción del alcohol administrado oralmente.

Entre los factores que afectan a la absorción del alcohol se encuentran: 1) La

concentración: a mayor concentración de alcohol, mayor es el gradiente de

concentración resultante, y por tanto más rápida la absorción por difusión pasiva. 2)

Flujo de sangre en el lugar de absorción: la rápida eliminación de esta sustancia del

lugar de absorción mediante un eficiente flujo sanguíneo ayudará al mantenimiento del

gradiente de concentración, promoviendo así la absorción. 3) Las propiedades irritantes:

altas concentraciones de alcohol pueden causar erosiones superficiales, hemorragias y

parálisis de la musculatura lisa del estómago, que reducirían su absorción. 4) Tasa de

consumo: el pico de los niveles de alcohol en sangre es más alto si este se ingiere en una

única dosis en lugar de en varias dosis más pequeñas. 5) Tipo de bebida: en general, hay

poca diferencia en la tasa de absorción de la misma dosis de alcohol administrada en

forma de distintos tipos de bebidas alcohólicas. 6) Alimentos: la presencia de comida en

el estómago retrasa el vaciado gástrico y por tanto reducirá la absorción de alcohol. Los

alimentos con alto contenido en grasas, carbohidratos, o proteínas son igual de eficaces

en el retraso del vaciado gástrico (Cederbaum, 2012).

Tras la absorción, el alcohol se distribuye fácilmente a los tejidos y fluidos corporales,

sin mostrar ninguna unión a proteínas. El volumen de distribución del mismo está

determinado principalmente por el contenido de agua corporal, el cual es parcialmente

responsable de las diferencias en parámetros farmacocinéticos relacionadas con la edad

y el sexo. Factores como el tamaño del sujeto y el porcentaje de grasa corporal

(relacionado con la obesidad, el sexo y la edad), también determinan la velocidad de

distribución (Norberg et al., 2003). El alcohol atraviesa las barreras hematoencefálica y

placentaria, presentando una cinética de dos compartimentos, en la que la tasa de

distribución depende de elementos que regulan la circulación periférica, incluyendo

vasoconstricción, cambios hormonales, actividad muscular, temperatura, y deficiencias

en el sistema circulatorio (Marek y Kraft, 2014; Norberg et al., 2003).

41

INTRODUCCIÓN

Metabolismo y Eliminación

La mayor parte del alcohol ingerido es metabolizado a acetaldehído en el hígado

mediante uno de los siguientes sistemas: 1) Alcohol Deshidrogenasa (ADH), 2) Sistema

Microsomal de Oxidación del Etanol (MEOS), o 3) Catalasa de los peroxisomas.

Posteriormente, el acetaldehído es oxidado a acetato gracias a la Aldehído

Deshidrogenasa (ALDH). El acetato abandona el hígado y es convertido a acetil-

coenzima A (Acetil-CoA), la cual es metabolizada en la mitocondria produciendo

finalmente dióxido de carbono y agua (ver Figura 4). Una pequeña fracción del alcohol

es eliminada mediante vías no oxidativas, e implican la conjugación del etanol a

sustratos endógenos tales como ácidos grasos, fosfolípidos, sulfato, o ácido glucurónico.

Menos del 10% del alcohol es eliminado por la respiración, el sudor, y la orina

(Cederbaum, 2012; Marek y Kraft, 2014; Sanchis Fortea et al., 1999). Una persona de

70 kg de peso puede metabolizar, aproximadamente, entre 170 y 240 gramos de alcohol

en un día (Cederbaum, 2012).

La ADH representa la mayor parte del metabolismo oxidativo del alcohol. Se trata de

una enzima con una amplia especificidad de sustrato, oxidando muchos alcoholes

primarios y secundarios. La ADH está localizada en la fracción citosólica de la célula, y

se encuentra en grandes cantidades en el hígado, seguido por el tracto gastrointestinal,

riñones, mucosa nasal, testículos y útero (Cederbaum, 2012). Los humanos tienen 5

clases principales de enzimas ADH (Clase I-V), con diferentes afinidades por el alcohol.

La Clase I se encuentra principalmente en el hígado y es la que más contribuye al

metabolismo del alcohol. La ADH Clase II también está localizada en el hígado y

contribuye al metabolismo de altas concentraciones de alcohol. La Clase III está

distribuida por todo el cuerpo, mientras que la Clase IV se encuentra localizada en el

tracto digestivo y estómago. La ADH Clase V solamente ha sido reconocida a nivel de

ARNm en el hígado y en el estómago (Cederbaum, 2012; Crabb et al., 2004; Marek y

Kraft, 2014).

En la Figura 4 se muestran las principales rutas de la oxidación del alcohol. Como se

puede observar, tanto la ADH como la ALDH transfieren el hidrógeno a un aceptor

Nicotinamida Adenina Dinucleótido (NAD+), que se convierte en la forma reducida

(NADH).

42

INTRODUCCIÓN

Figura 4. Vías metabólicas de oxidación del etanol (modificada de Sanchis Fortea et al.,

1999; Zakhari, 2013).

El MEOS es un sistema dependiente de citocromo P450, que implica los citocromos

P4502E1 (CYP2E1), P4501A2 (CYP1A2), y P4503A4 (CYP3A4) (Lieber, 1999). Este

sistema representa ˂10% de la oxidación hepática del alcohol, teniendo CYP2E1 el

papel principal en este metabolismo, y siendo particularmente importante a altas

concentraciones de alcohol (Lieber, 1999; Matsumoto y Fukui, 2002). CYP2E1 ha sido

vinculado a la hepatotoxicidad inducida por alcohol. Además, la administración crónica

de alcohol incrementa los niveles de este citocromo (Matsumoto y Fukui, 2002;

Tsutsumi et al., 1989).

La catalasa, una enzima antioxidante, degrada el peróxido de hidrógeno en agua y

oxigeno (Figura 4). Utilizando el peróxido de hidrógeno, esta enzima puede oxidar una

amplia variedad de compuestos, incluyendo el alcohol. La vía de la catalasa supone,

aproximadamente, un 2% del metabolismo del alcohol, y juega un importante papel en

la producción de acetaldehído en el cerebro (Cederbaum, 2012; Hunt, 1996; Zimatkin et

al., 2006).

43

INTRODUCCIÓN

Las enzimas ALDH oxidan irreversiblemente el acetaldehído en acetato, de una manera

dependiente de NAD+(P) (nicotinamida adenina dinucleótido [fosfato]). Han sido

identificadas 19 isoenzimas ALDH humanas, siendo la ALDH1A1 citosólica y la

ALDH2 mitocondrial las más importantes para el metabolismo del acetaldehído. Estas

dos isoenzimas están distribuidas por el cuerpo, incluyendo el hígado, riñón y cerebro

(Marchitti et al., 2008).

El acetato resultante de estas reacciones es metabolizado en otros tejidos, y en el hígado,

a Acetil-CoA, que seguirá sus propias rutas metabólicas (Sanchis Fortea et al., 1999).

3.2.2. Farmacodinamia

En los últimos años ha tenido lugar un cambio relacionado con las teorías postuladas

para explicar cómo el alcohol afecta al sistema nervioso central (SNC). Inicialmente se

defendía que las principales dianas del alcohol son los lípidos de membrana (teoría de

los lípidos), y posteriormente la atención se centró en las proteínas de membrana (teoría

de las proteínas), especialmente en los receptores. Aunque ambas teorías difieren en el

sitio principal de acción, las dos postulan que los efectos del alcohol sobre el SNC son,

en última instancia, resultado de alteraciones en la función de las proteínas (Peoples et

al., 1996; Spanagel, 2009). Varios estudios demuestran las limitaciones de la hipótesis

de lípidos, considerándose, actualmente, que la participación de este mecanismo sería a

través de la interacción del alcohol a bajas concentraciones con microdominios

específicos de la membrana, modificando y modulando ciertas interacciones proteína-

membrana y proteína-ligando (Guerri, 2000; Peoples et al., 1996). La principal razón

para un cambio hacia la teoría de las proteínas está en los hallazgos que mostraron que

el alcohol, a concentraciones en el rango 10-20 mM, interfiere directamente con la

función de varios canales iónicos y receptores (Spanagel, 2009).

A pesar de la opinión generalizada de que el alcohol es un agente farmacológico

inespecífico, estudios recientes demuestran que el alcohol tiene pocas dianas

principales, estas incluyen los receptores NMDA (N-metil-D-aspartato), GABAA, 5-HT3

(5-hidroxitriptamina de tipo 3), y nAChRs (receptores nicotínicos de acetilcolina), así

como los canales de Ca2+

de tipo L y canales GIRKs (canales de potasio de rectificación

interna acoplados a proteínas G). Concentraciones de alcohol tan bajas como 1 mM

producen alteraciones en la función de estos receptores y canales iónicos (Spanagel,

2009; Vengeliene et al., 2008).

44

INTRODUCCIÓN

El alcohol lleva a cabo la mayor parte de sus acciones interactuando con los receptores

GABAA y NMDA. De forma que potencia la acción del GABA (neurotransmisor

inhibidor por excelencia del SNC) y antagoniza la acción del glutamato

(neurotransmisor excitador por excelencia del SNC, junto con el aspartato), lo que hace

que las acciones del alcohol sean propiamente las de un depresor del SNC (Ayesta,

2002).

El receptor GABAA, también denominado complejo receptor GABAA-ionóforo Cl-, es

una proteína formada por cinco subunidades (de las familias α, β, γ, δ, y ρ) ensambladas

de manera que dejan un canal en su interior, atravesando la membrana neuronal. Tras la

activación del receptor, se produce la apertura del canal, permitiendo la entrada de

moléculas cargadas negativamente y de pequeño tamaño (especialmente Cl-). De esta

forma se hiperpolariza la membrana, lo que supone una disminución de la excitabilidad

de la neurona y de su actividad funcional. El receptor GABAA posee sitios de fijación

específicos, como por ejemplo los sitios para el GABA, las benzodiacepinas, y los

barbitúricos. El etanol no actúa directamente en estos mismos sitios de unión, pero

potencia las acciones de los compuestos que actúan en cualquiera de ellos.

Paralelamente, los antagonistas de estos compuestos tienden a antagonizar la acción del

etanol. Además, al igual que ocurre con los barbitúricos, a dosis fisiológicas, el alcohol

no actúa directamente sobre el canal, pero sí lo hace a dosis altas (˃250 mg/dl) (Ayesta,

2002; Diamond y Gordon, 1997).

El receptor NMDA es uno de los principales receptores del glutamato, y se encuentra

acoplado a un canal catiónico. Su activación produce un aumento en la permeabilidad

de Na+, K

+ y Ca

2+, lo que conlleva una despolarización de la membrana neuronal. La

acción aguda del alcohol en este receptor produce una disminución del flujo de Ca2+

a

través del canal (Ayesta, 2002; Wirkner et al., 1999). Diversas enzimas celulares se

activan gracias al incremento de Ca2+

intracelular, ocasionando cambios prolongados en

la función neuronal, especialmente en la función sináptica. De esta forma, por ejemplo,

el receptor NMDA es responsable de los fenómenos de potenciación a largo plazo

(long-term potentiation, LTP), participando en los procesos de aprendizaje y memoria.

Además, se sabe que un flujo intracelular excesivo de calcio es neurotóxico (Ayesta,

2002). Por otra parte, la función del NMDA es inhibida por el alcohol de una manera

dependiente de la concentración, en el rango de 5 a 50 mM, y la potencia de varios

alcoholes para la inhibición de la corriente activada por NMDA está linealmente

45

INTRODUCCIÓN

relacionada con su potencia de intoxicación. Esta inhibición puede contribuir a las

alteraciones neurales y cognitivas asociadas con la intoxicación (Lovinger et al., 1989).

El alcohol afecta directamente, también, a los receptores de glicina, de forma que actúa

sobre residuos específicos en los dominios transmembrana, así como en el dominio

extracelular de los receptores. El efecto neto sobre la función del receptor sería la suma

de los efectos moduladores, positivos y negativos, del alcohol sobre los diferentes sitios

de unión sensibles al mismo (Crawford et al., 2007). Además, el alcohol potencia la

función de los receptores neuronales nACh y 5-HT3 (Spanagel, 2009).

Las acciones del alcohol sobre estos canales iónicos y receptores dependen de distintas

variables, especialmente de la concentración de alcohol y las subunidades que

componen al receptor o canal. Por ejemplo, los datos sugieren que los receptores

GABAA extrasinápticos que contienen la subunidad δ son dianas primarias del alcohol,

incluso a muy bajas concentraciones (1-3 mM), mientras que los receptores compuestos

por otras subunidades responden sólo a altas concentraciones de alcohol (˃60 mM). Por

otra parte, los receptores de glicina que contienen α1 parecen ser más sensibles a bajas

concentraciones de alcohol, con respecto a los que contienen α2. En el caso de los

nAChRs, los subtipos α2β4, α4β4, α2β2, y α4β2 son potenciados por concentraciones

de alcohol más bajas que 100 mM, mientras que los subtipos α3β2 y α3β4 no se ven

afectados a estas concentraciones y la función del receptor α7 es inhibida. Altas

concentraciones de alcohol potencian casi todos los nAChRs. Por otra parte, los

receptores NMDA compuestos por las combinaciones NR1/NR2A y, sobre todo,

NR1/NR2B son más sensibles a la inhibición por alcohol (Spanagel, 2009; Vengeliene

et al., 2008).

La exposición crónica al alcohol produce alteraciones en el funcionamiento cerebral

debidas a la desregulación de distintos mecanismos moleculares. Por ejemplo, se da una

disminución en la densidad y la función del receptor GABAA cerebral, además de un

incremento o disminución en la expresión genética de las subunidades α y β,

dependiendo de la región cerebral (Ayesta, 2002; Golovko et al., 2002). El consumo

crónico de alcohol también da lugar a un aumento en el número de receptores NMDA,

su afinidad y su función (Ayesta, 2002; Faingold et al., 1998). Por otra parte, se observa

un incremento en el número de canales de calcio, sobre todo de tipo L, resultando en un

mayor flujo intracelular de calcio voltaje-dependiente, efecto que parece estar mediado

por proteín-kinasa C (Ayesta, 2002).

46

INTRODUCCIÓN

Seguidamente a la acción del alcohol sobre sus dianas principales, tiene lugar una

segunda oleada de efectos indirectos sobre una variedad de sistemas

neurotransmisor/neuropéptido, donde se ven implicados, principalmente, monoaminas,

opioides, y endocannabinoides. Lo que se piensa que es crucial para el inicio del

refuerzo y la recompensa producidos por el alcohol (Spanagel, 2009).

El alcohol, al igual que otras drogas, produce un aumento de la actividad dopaminérgica

mesolímbica, especialmente en el shell del NAc (Di Chiara e Imperato, 1988; Pontieri et

al., 1995). El alcohol parece actuar en el ATV, atenuando el tono inhibitorio que ejercen

las interneuronas GABAérgicas, lo que incrementaría de forma indirecta la frecuencia

de descarga de las neuronas dopaminérgicas. Además, el sistema opioide parece

modular la liberación de DA inducida por el alcohol, de manera que la estimulación de

los receptores opioides en el ATV aumentaría la frecuencia de descarga de las neuronas

dopaminérgicas. El alcohol podría aumentar la trasmisión dopaminérgica mediante la

estimulación del sistema opioide endógeno. Estos y otros datos apoyan la hipótesis de la

participación del sistema opioide en las propiedades de refuerzo del alcohol (Guerri,

2000). La vía mesolímbica dopaminérgica también es controlada por la actividad

glutamatérgica, y a su vez, el alcohol a dosis bajas puede elevar los niveles

extracelulares de glutamato en el NAc, mientras que a dosis altas reduciría la liberación

de este neurotransmisor (Gass y Olive, 2008; Moghaddam y Bolinao, 1994).

Por otra parte, los receptores neuronales nACh y los receptores de glicina también son

dianas principales del alcohol y modulan la liberación de DA. Además, hay otros

sistemas que modulan la actividad dopaminérgica mesolímbica, entre los que se

encuentran el sistema 5-HT del núcleo dorsal del rafe y el sistema endocannabinoide,

pudiendo influir, de esta forma, en las propiedades de recompensa del alcohol

(Maldonado et al., 2006; Spanagel, 2009).

47

INTRODUCCIÓN

4. COCAÍNA

4.1. La cocaína como droga de abuso

La cocaína es una sustancia natural que se encuentra en la planta Erythroxylum coca,

siendo sus hojas las que producen las mayores cantidades de cocaína, aproximadamente

el 1% en peso (Goldstein et al., 2009). El uso de la cocaína para la gratificación

personal data del año 600 d.C. Los indígenas peruanos han masticado las hojas de coca

durante siglos, debido a las propiedades euforizantes de la cocaína y a su capacidad para

reducir la fatiga, el hambre, y aumentar la resistencia física (Boghdadi and Henning,

1997).

La cocaína es un agente anestésico local vasoconstrictor, propiedades que son

beneficiosas en la cirugía de oído, nariz y garganta. El uso medicinal de la cocaína ha

disminuido desde su apogeo (1880-1900), cuando el incremento en la producción de

cocaína refinada condujo a un aumento en los informes médicos de toxicidad y

mortalidad asociadas a dicha sustancia. La cocaína resurgió como droga de abuso en las

décadas de 1970 y 1980, lo que resultó, de nuevo, en un incremento de la incidencia de

patologías relacionadas con la cocaína, que fue exacerbado por la introducción del crack

de cocaína (White y Lambe, 2003). En la Tabla 4 aparece un resumen con los

principales efectos fisiopatológicos relacionados con el abuso de cocaína, incluyendo la

patología relacionada con el estilo de vida durante el abuso de la droga, la producida por

la intoxicación con la droga (pero no debida directamente a ella), la relacionada con la

administración de la cocaína, y la patología resultante de la acción farmacológica de la

misma.

En cuanto a los datos epidemiológicos, el consumo de cocaína a nivel mundial se

mantuvo estable durante el año 2012 (entre 14 y 21 millones de consumidores),

permaneciendo alto en América del Norte y del Sur (con una tasa de prevalencia anual

del 1.8% y 1.2%, respectivamente), Oceanía (1.5%) y Europa Occidental y Central

(1%) (World Drug Report, UNODC, 2014). En Europa, se trata de la droga estimulante

ilegal más consumida, con una estimación de consumo, en el año 2013, de unos 2.2

millones de adultos, de entre 15 y 34 años (Informe Europeo sobre Drogas, OEDT,

2014).

Según el informe nacional en España, en el año 2012, el 3.6% de los estudiantes

consultados admitieron haber consumido cocaína (polvo o base), al menos alguna vez

48

INTRODUCCIÓN

en su vida. En este mismo año, la diferencia entre sexos aumentó, con respecto al año

2010, debido al descenso en el consumo por parte de las mujeres. La edad media de

inicio, también respecto a 2010, ha pasado de 14.9 años a 15.5. La forma más prevalente

de consumo de esta sustancia continúa siendo la cocaína en polvo (Informe Nacional,

OEDT, 2013).

Tabla 4. Efectos fisiopatológicos relacionados con el abuso de la cocaína

Modificado de White y Lambe, 2003.

Cardiovasculares

Inhalada

Intravenosa

Respiratorios

Gastrointestinales

Cerebrovasculares

Neurológicas

Psicológicas

Renales

Maternales

Fetales

Antes del Arresto

Durante el Arresto

Después del ArrestoDelirio agitado, Problemas con el consentimiento, Intoxicación/

Abstinencia, Estado físico/entrevista/defensa, Muerte bajo custodia

Mala alimentación Abuso de drogas intravenoso Criminalidad

Muerte accidental Homicidio Suicidio

Delirio agitado Síndrome de Body packer

Euforia, Adicción y Abstinencia, Depresión + Fatiga (a largo plazo),

Psicosis, Esquizofrenia

Aborto, Desprendimiento de placenta, Prematuridad,

Paro cardiaco perinatal/Convulsiones

Rabdomiolisis/Mioglobinuria, Insuficiencia renal aguda, Infarto renal

Gastritis/Colitis isquémica, Ulceración, Infarto, Hepatotoxicidad

Hemorragia intracerebral, Infarto intracerebral, Vasculitis

Suicidio/homicidio, Muerte súbita, Robo, Prostitución, Violencia

Agresión, Delirio agitado

Estilo de vida

Intoxicación

Efectos idiosincrásicos

Asociaciones médico-legales

Vía de administración

Incremento de presión sanguínea y tasa cardiaca,

Isquemia miocárdica/Infarto, Dolor en el pecho, Trombosis coronaria,

Disritmia, Miocarditis, Disección aórtica

Neumotórax, Neumomediastino, Infiltrados alveolares/intersticiales,

Edema pulmonar, Infarto pulmonar, Hemorragia pulmonar

Efectos farmacológicos

Quemaduras térmicas/químicas, Pérdida del tabique nasal

Endocarditis infecciosa, VIH, Hepatitis, Sobredosis aguda

Restricción del crecimiento intrauterino, Muerte intrauterina,

Microcefalia, Déficit neuroconductual

Hipertermia, Convulsiones

49

INTRODUCCIÓN

4.2. Farmacología de la cocaína

La cocaína, o benzoilmetilecgonina, es un alcaloide extraído del arbusto E. coca. Para

extraer la cocaína de la planta, las hojas cosechadas se empapan con disolventes como

el queroseno para obtener la “pasta de cocaína”. Esta pasta contiene entre un 40-80% de

cocaína, y es tratada con ácido clorhídrico para formar el clorhidrato de cocaína (o

“cocaína en polvo”), que es la sal de la cocaína (Goldstein et al., 2009). Esta sal es

soluble en agua, pero se descompone al calentarla, con un punto de fusión de 195ºC. Al

ser soluble en agua, la droga puede ser absorbida a través de la mucosa nasal o

inyectada por vía intravenosa. Sin embargo, el alcaloide de cocaína, llamado también

cocaína base o crack, es una sustancia cristalina, incolora e inodora, insoluble en agua,

pero soluble en alcohol, acetona, o éter. Calentando la cocaína base se convierte en un

vapor estable que puede ser inhalado (Boghdadi y Henning, 1997).

Aunque la cocaína base y el crack comparten la misma forma química, se diferencian

por sus características físicas y técnicas de preparación. Para obtener cocaína base, el

polvo del clorhidrato de cocaína es disuelto en agua y se le añade una base, como el

amoniaco, y posteriormente el éter como disolvente. La base de cocaína es extraída de

la solución éter mediante evaporación. Después de la extracción, éter altamente volátil

puede permanecer con la cocaína, lo que puede conllevar un mayor riesgo de

quemaduras por éter (principalmente faciales y traqueales) en las personas que fuman la

cocaína base. En la actualidad, el uso de la base de cocaína ha disminuido debido a la

popularidad del crack. Este último se obtiene disolviendo el clorhidrato de cocaína en

agua, mezclando con bicarbonato de sodio y calentando. La cocaína base precipita en

una masa blanda que se endurece al secarse. El crack puede ser fumando, pero sin el

riesgo inflamable del éter (Boghdadi y Henning, 1997; Goldstein et al., 2009).

4.2.1. Farmacocinética

Absorción y Distribución

La cocaína, de forma general, es rápidamente absorbida por todas las rutas de

administración, con excepción de la ingesta oral y aplicación tópica. En estas últimas se

produce un retraso en el pico de concentración plasmática debido a la vasoconstricción

que genera la vía tópica, y al tiempo necesario para alcanzar el estómago o duodeno en

el caso de la oral. La biodisponibilidad de la cocaína varía dependiendo de la ruta de

administración, de forma que por vía intravenosa y fumada puede ser mayor al 90%,

50

INTRODUCCIÓN

mientras que la droga insuflada es biodisponible en un 80% aproximadamente

(Goldstein et al., 2009). En la Tabla 5 se muestra el inicio, el pico, y la duración de la

acción de la cocaína dependiendo de la vía de administración (Leikin y Paloucek, 2008).

La cocaína se distribuye rápidamente después de la absorción, siendo su unión a

proteínas aproximadamente del 90%, y su volumen de distribución 1.96-2.7 L/kg

(Leikin y Paloucek, 2008).

Metabolismo y Eliminación

La cocaína es metabolizada a través de distintas vías enzimáticas. Las tres vías

principales aparecen en la Figura 5, y son las siguientes:

- La mitad de la dosis absorbida, aproximadamente, es hidrolizada mediante

carboxilesterasa, en el hígado humano, para formar benzoilecgonina (BE), el

principal metabolito siguiendo todas las vías de administración. La BE puede ser

cuantificada en orina después de 1-4 horas, pudiendo mantenerse hasta 144

horas. Su vida media es de 5-6 horas, aproximadamente. Este metabolito tiene

propiedades vasoconstrictoras, y no parece atravesar la barrera hematoencefálica

con facilidad.

- La N-desmetilación hepática de la cocaína forma norcocaína, lo que no

representa más del 5% de la droga absorbida. Este metabolito cruza la barrera

hematoencefálica y puede producir efectos clínicos similares al compuesto de

origen. La norcocaína puede ser metabolizada a N-hidroxinorcocaína y

norcocaína nitróxido.

- Las colinesterasas plasmáticas (butirilcolinesterasas) reaccionan con la cocaína

para formar ecgonina metil ester (EME). Entre un 30% y un 50% de la cocaína

es metabolizada a EME, siendo su vida media de unas 5-6 horas. Este metabolito

Tabla 5.

VíaInicio

(minutos, segundos)

Pico

(minutos)

Duración

(minutos)

Tópica Dentro de los 5 min - -

Intranasal Dentro de los 5 min 15-20 60-90

Intravenosa 10-60 s 3-5 20-60

Inhalatoria 3-5 s 1-3 5-15

51

INTRODUCCIÓN

cruza de manera deficiente la barrera hematoencefálica, y parece poseer poca

actividad farmacológica.

Se han identificado otros metabolitos menores de la cocaína, entre los que se encuentran

la p-hidroxicocaína, m-hidroxicocaína, p-hidroxibenzoilecgonina, m-

hidroxibenzoilecgonina, y norbenzoilecgonina. Cuando la cocaína es fumada, se piroliza

a varios compuestos químicos dependiendo de la temperatura. El principal metabolito es

la anhidroecgonina metil ester (AEME), llamada también metil ecgonidina (Goldstein et

al., 2009; Lizasoain et al., 2002).

Figura 5. Vías para el metabolismo de la cocaína (modificada de Cascales et al., 1997;

Schindler y Goldberg, 2012).

El aclaramiento de la cocaína varía entre 20 y 30 mL/min/kg, y su semivida plasmática

es de 1 a 1.5 horas (Lizasoain et al., 2002). Menos del 10% de la cocaína es eliminada

en la orina sin metabolizar (Leikin y Paloucek, 2008), y puede ser detectada en orina

hasta unas 24-36 horas después de su consumo. Los dos metabolitos principales de la

cocaína excretados en orina son la BE y la EME. Estos dos metabolitos, que serán

metabolizados a ecgonina, representan el 80-90% de los metabolitos urinarios en

humanos. Del 1% al 3% de los metabolitos urinarios son la ecgonina,

52

INTRODUCCIÓN

norbenzoilecgonina, y norecgonina, que son productos de la N-desmetilación. La

excreción fecal representa una ruta menor de eliminación de la cocaína y sus

metabolitos (Goldstein et al., 2009).

4.2.2. Farmacodinamia

Las propiedades farmacodinámicas de la cocaína son complejas. Esta sustancia bloquea

la actividad de los trasportadores de DA, NE, y SER (ver Figura 6), dando como

resultado final el aumento de los niveles extracelulares de estos neurotransmisores

(Pierce y Kumaresan, 2006).

El transportador de DA (DAT) es el encargado de la recaptura y reciclaje de la DA. La

unión de la cocaína al DAT se realiza en un sitio distinto a la DA, inhibiendo la unión y

el transporte de esta última, y de sodio, al interior del citosol (Povlock y Schenk, 1997;

Seiden et al., 1993). La cocaína se une a los transportadores de SER (SERTs) con una

potencia cinco veces más elevada, aproximadamente, que a los DATs, y se une a los

transportadores de NE (NETs) con una afinidad unas tres veces más baja que a los

DATs. Esta diferente afinidad relativa de la cocaína por los transportadores, podría dar

lugar a los distintos aspectos de las respuestas conductuales observadas después de su

administración, tanto aguda como crónica (White y Kalivas, 1998).

En los últimos años se ha relacionado al DAT tanto con las acciones conductuales como

con las acciones bioquímicas de la cocaína (Lizasoain et al., 2002), lo que incluiría sus

acciones reforzantes. Sin embargo, los ratones carentes del DAT (ratones Knockout) son

capaces de autoadministrarse cocaína, lo que se atribuye a la incrementada transmisión

dopaminérgica en el NAc que produce la cocaína en estos ratones. Aunque queda por

determinar cuáles son las adaptaciones neuronales que permiten este incremento de DA,

existen varias hipótesis convincentes que implican, por ejemplo, a los NETs y los

SERTs (para revisión ver Gainetdinov y Caron, 2003; Pierce y Kumaresan, 2006). Los

datos sugieren, por tanto, que este aumento en la transmisión dopaminérgica contribuye

de forma significativa a los efectos reforzantes de los psicoestimulantes. De manera

similar, se ha observado el papel crítico que juegan las familias de receptores

dopaminérgicos, D1-like (D1 y D5) y D2-like (D2, D3 y D4), en estos efectos

reforzantes (Pierce y Kumaresan, 2006).

El exceso de actividad dopaminérgica podría ser el causante de la mayoría de los

síntomas del SNC, tanto de los efectos “deseados” como de los tóxicos. Estos síntomas

53

INTRODUCCIÓN

incluyen euforia, aumento de la autoconfianza y del estado de alerta a dosis bajas, y

agresividad, desorientación, y alucinaciones a dosis altas (Goldstein et al., 2009). El

consumo crónico de cocaína también produce cambios en la disponibilidad de DA, de

forma que la disminución de las reservas de este neurotransmisor puede producir un

craving intenso y lo que se conoce como síndrome “washed-out” (letargo, anhedonia, y

dificultades con los movimientos musculares) (Goldstein et al., 2009; Lizasoain et al.,

2002).

Figura 6. Mecanismo de acción de la cocaína (modificada de Lizasoain et al., 2002; Volkow,

2010).

El incremento de NE producido por la cocaína (Figura 6), es el responsable de la

mayoría de los efectos farmacológicos y de las complicaciones agudas de la cocaína,

tales como la dilatación pupilar, la sudoración, el aumento de la presión arterial, y el

temblor (Lizasoain et al., 2002). Por otra parte, Spealman (1995) sugiere, a partir de su

estudio con cocaína en monos, que podría haber una influencia noradrenérgica

facilitadora sobre la actividad dopaminérgica mesocorticolímbica. Sin embargo, la NE

54

INTRODUCCIÓN

no contribuye de forma significativa a los efectos reforzantes de esta droga (Mello et al.,

1990; Woolverton, 1987).

En cuanto a la SER, los datos parecen indicar que el incremento de su transmisión en el

ATV influye en el refuerzo de la cocaína, teniendo efectos opuestos los receptores 5-

HT1B y 5-HT2C, que son los receptores de SER mejor caracterizados en términos de su

interacción con el sistema dopaminérgico. El incremento de la transmisión de SER

produciría sus efectos sobre el refuerzo de la cocaína a través de la modulación de la

transmisión dopaminérgica. Esto último supone más apoyo a la hipótesis de la DA en el

refuerzo de los psicoestimulantes (Pierce y Kumaresan, 2006).

Por otra parte, los efectos de la cocaína sobre aminoácidos excitatorios/sistema

glutamatérgico y muscarínico, y receptores sigma, se cree que también contribuyen a la

toxicidad en el SNC. Además, hay varios mecanismos y mediadores responsables de la

vasoconstricción inducida por la cocaína, entre los que se encuentran el incremento de

NE, un efecto directo de la BE sobre los vasos sanguíneos (posiblemente mediado por

calcio), los niveles incrementados de endotelina-1 (vasoconstrictor), y la producción

mermada de óxido nítrico (vasodilatador) (Goldstein et al., 2009).

Respecto al efecto anestésico local producido por la cocaína, al que se ha hecho

referencia previamente, este se consigue mediante la inhibición competitiva de los

canales rápidos de sodio en las neuronas, bloqueando por tanto la conducción nerviosa

(White y Lambe, 2003).

55

INTRODUCCIÓN

5. INTERACCIONES ENTRE ALCOHOL Y COCAÍNA

El consumo simultáneo de alcohol y cocaína es una práctica frecuente en la población

general (Hearn et al., 1991). Esta combinación es popular entre los consumidores de

drogas, y está bien documentada en ambos sexos (Graziani et al., 2014; Pennings et al.,

2002). En un estudio reciente acerca de la prevalencia del consumo de cocaína en

adolescentes europeos, un 70% de los sujetos informaron que su primer consumo de

cocaína fue bajo los efectos del alcohol (Apantaku-Olajide et al., 2013).

Según muestran algunos datos, un 60-85% de las personas que abusan de la cocaína

abusan simultáneamente del alcohol (Brookoff et al., 1996; Grant y Harford, 1990). La

existencia de alcoholismo comórbido en personas con abuso de cocaína tiene una

prevalencia puntual estimada del 29%, y una prevalencia de tiempo de vida (alguna vez

en la vida) del 62% (Rounsaville et al., 1991). Además, hay distintos estudios que cifran

el consumo de alcohol por parte de los cocainómanos hasta en un 99%, las ingestas

simultáneas (simultáneamente o en la misma ocasión) en un 77%, y las ingestas de

alcohol al menos en cada episodio de consumo de cocaína hasta en un 30% (Dean et al.,

1997). Por otra parte, Rubio et al. (2008) revelaron que el consumo de cocaína en

bebedores fuertes (heavy drinkers) incrementó 3.8 veces el riesgo de desarrollar

dependencia de alcohol. También se ha encontrado que el consumo fuerte y crónico de

alcohol incrementa unas 3 veces el riesgo de consumo de cocaína (Kulaga et al., 2010).

En esta misma línea, se han descrito efectos significativos de la vía de administración de

cocaína sobre el consumo de alcohol, de manera que los consumidores de polvo de

cocaína informan de una mayor frecuencia de consumos fuertes de alcohol, en

comparación con los consumidores de crack (Gossop et al., 2006a). Además, parece que

existen diferentes patrones de consumo de la combinación cocaína-alcohol. Por

ejemplo, los consumidores de cocaína en polvo informaron de un aumento del consumo

de ambas sustancias cuando las consumían en combinación, mientras que los

consumidores de crack, durante los episodios en los que consumían dosis altas, tendían

a beber menores cantidades de alcohol de lo habitual, y con tendencia a consumirlo al

final de la sesión de consumo de crack (Gossop et al., 2006b).

5.1. Farmacología de la interacción alcohol-cocaína: Cocaetileno

Cuando el alcohol y la cocaína se consumen de manera simultánea, se produce un nuevo

metabolito, el cocaetileno (benzoilecgonina etil éster, etilcocaína) (Dean et al., 1992;

56

INTRODUCCIÓN

Hearn et al., 1991). Su formación es el resultado de la actividad de carboxilesterasas que

catalizan la transesterificación del éster 2-carboximetílico de la cocaína en su derivado

2-carboxietílico. Esta conversión a cocaetileno ha sido demostrada en rata, en ratón, y

en humanos (Cascales et al., 1997; Dean et al., 1991; Dean et al., 1992).

En apartados anteriores de esta tesis, se han descrito las principales vías metabólicas del

alcohol, y de la cocaína en ausencia de alcohol. Aquí, se hará referencia al metabolismo

de la cocaína en presencia de alcohol. En este caso, ocurren tres clases de reacciones:

hidrólisis, transesterificación y N-desmetilación (ver Figura 7). Una carboxilesterasa

inespecífica presente en el hígado humano es la encargada de catalizar la hidrólisis de la

cocaína y el cocaetileno a BE, un metabolito sin actividad estimulante psicomotora

(Dean et al., 1991). La norcocaína y el norcocaetileno también son sustratos de esta

enzima, y pueden originar benzoilnorecgonina. El alcohol inhibe esta actividad esterasa,

de forma que suprime la inactivación enzimática de la cocaína a BE, y simultáneamente

cataliza la transesterificación etílica de la cocaína formando el metabolito

farmacológicamente activo, cocaetileno. Esta transesterificación de la cocaína está

catalizada por la misma enzima carboxilesterasa que cataliza la hidrólisis de la cocaína a

BE (Dean et al., 1992). El alcohol también puede inducir la transesterificación etílica de

la norcocaína a norcocaetileno. La N-desmetilación de la cocaína a norcocaína es

catalizada por una enzima dependiente del citocromo P-450, bien directamente, o

después de la oxidación de la cocaína a su derivado N-óxido, por una FAD

monooxigenasa (Kloss et al., 1983).

Continuando con la farmacocinética, los estudios de Pan y Hedaya (1999a) indican que

el alcohol altera significativamente la absorción, distribución, y eliminación de la

cocaína, lo que da como resultado una concentración plasmática de cocaína más alta y

prolongada. Sin embargo, las concentraciones de alcohol en sangre no se ven alteradas,

independientemente de si la cocaína es administrada antes o después del mismo (Perez-

Reyes, 1994; Perez-Reyes y Jeffcoat, 1992). Además, la coadministración de alcohol

potencia la respuesta neuroquímica a la administración de cocaína (Pan y Hedaya,

1999a). Por otra parte, tanto el pretratamiento con alcohol como con cocaína, así como

la coadministración aguda de alcohol, conducen a alteraciones significativas en la

farmacodinamia de la cocaína, que son debidas, al menos en parte, a los cambios en la

farmacocinética de la cocaína (Pan y Hedaya, 1999b). Se ha encontrado que las

disposiciones farmacocinéticas de la cocaína y el cocaetileno son parecidas, con valores

57

INTRODUCCIÓN

de aclaramiento y volúmenes de distribución similares. Este aclaramiento, tanto de la

cocaína como del cocaetileno, se vio disminuido en un 20%, aproximadamente, cuando

se administraron con alcohol (Laizure et al., 2003).

Figura 7. Metabolismo de la cocaína en presencia de etanol. (1) carboxilesterasa hepática

inhibida por el etanol. (2) transesterificación inducida por el etanol. (3) N-desmetilación

catalizada por una enzima dependiente del citocromo P-450. (Modificado de Cascales et al.,

1997; Dean et al., 1992).

Parker y Laizure (2010) llevaron a cabo un estudio en perros en el que la

coadministración de alcohol y cocaína resulto en una disminución del 23% en el

aclaramiento de la cocaína intravenosa, y en un incremento del 300% en la

biodisponibilidad de la cocaína por vía oral. Además, los autores infieren que el alcohol

podría inhibir la hidrólisis de otros compuestos farmacológicos sujetos a hidrólisis por

carboxilesterasas.

5.2. Efectos del consumo simultáneo de alcohol y cocaína

Los cambios en la farmacocinética y el perfil metabólico de la cocaína, entre los que se

encuentran los mencionados en el apartado anterior, han sido implicados en los efectos

farmacológicos, más intensos y de mayor duración, de la cocaína observados después

58

INTRODUCCIÓN

del co-abuso de alcohol y cocaína (Hearn et al., 1991). Además, en humanos, se ha

mostrado que el orden de administración de estas drogas influye en los efectos de

interacción entre las mismas (Perez-Reyes, 1994). En la Tabla 6 se resumen los

principales resultados de estudios prospectivos y retrospectivos, en relación a los

efectos psicológicos y somáticos, y las consecuencias del consumo combinado de

alcohol y cocaína en humanos.

Los consumidores de cocaína ingieren alcohol debido a que la combinación de estas

drogas produce efectos eufóricos más intensos y duraderos (ver Tabla 6), y disminuye

efectos secundarios indeseables inducidos por la cocaína, tales como cefaleas y

migrañas (Dean et al., 1997; Masur et al., 1989), que son aparentemente causados por la

actividad vasoconstrictora de la cocaína o sus metabolitos (Satel y Gawin, 1989).

Por otra parte, el incremento en la actividad motora observado tras la coadministración

de alcohol y cocaína en ratones, permite sugerir que el alcohol produce una

* Basados en estudios prospectivos Modificado de Pennings et al., 2002

Mayor riesgo que el aditivo (una referencia)

Efectos aditivos sobre la conducta y el crimen;

aumento del riesgo de pensamientos y planes

homicidas

Aumento del riesgo de cometer actos violentos

Respiración deteriorada No se han encontrado referencias

Aumento del riesgo de defectos de nacimiento

Tasa cardiaca significativamente incrementada Tendencia a un incremento mayor que el aditivo

Efectos variables sobre la función cognitiva y motora Deterioro

Efectos del consumo combinado: basados en estudios retrospectivos

(Efectos dosis-dependientes)

Niveles de cocaína en sangre incrementadosHasta un 30% de aumento adicional; formación de

cocaetileno

Aumento de la sensación subjetiva de "high" Mayor que el incremento aditivo

Ligeramente disminuidos por altas dosis de

cocaína; formación de cocaetilenoNiveles de alcohol en sangre incrementados

Aumento de la sensación subjetiva de embriaguez Ligeramente disminuida

Cocaína sola Alcohol y Cocaína

Ligero aumento de la tasa cardiaca Tendencia a un incremento mayor que el aditivo

Menor deterioroDeterioro en la función cognitiva y motora

Efectos del consumo combinado: relativos a la Cocaína sola *

Alcohol solo Alcohol y Cocaína

(Efectos dosis-dependientes)

Riesgo incrementado de trastornos psiquiátricos No se han encontrado referencias

Tabla 6. Efectos del consumo combinado de alcohol y cocaína

Efectos del consumo combinado: relativos al Alcohol solo *

Alcohol solo Alcohol y Cocaína

(Efectos dosis-dependientes)

59

INTRODUCCIÓN

potenciación de la estimulación psicomotora inducida por cocaína (Masur et al., 1989).

En otro estudio, en ratones de 2 cepas diferentes, varias de las conductas alteradas por la

cocaína (como la actividad locomotora, las estereotipias, la exploración, y la tigmotaxis)

se vieron afectadas de manera diferencial por el tratamiento simultáneo con alcohol. Sin

embargo, los datos ponen de manifiesto la importancia que tienen las diferencias

genéticas sobre los efectos conductuales del consumo de estas dos sustancias,

observando, por ejemplo, diferencias entre las dos cepas de animales en relación a los

efectos del alcohol sobre la estimulación locomotora inducida por la cocaína (Cook et

al., 1998).

También han sido descritas varias alteraciones producidas por dosis toleradas de ambas

drogas, entre las que se encuentran la elevación de la peroxidación lipídica y de la

actividad de los radicales libres, y la necrosis hepatocelular (Odeleye et al., 1993). El

alcohol incrementa significativamente los efectos tóxicos de la cocaína en hepatocitos

humanos (Ponsoda et al., 1992), e inhibe el metabolismo hidrolítico de la cocaína,

haciendo que este se desvíe hacia el metabolismo oxidativo, con lo que se elevaría la

hepatotoxicidad (Cascales et al., 1997). Otra de las consecuencias importantes del co-

abuso de ambas sustancias es el incremento en 18 veces del riesgo de muerte súbita

asociado a cocaína (Rose et al., 1990), lo que está relacionado con los datos obtenidos

en ratones, que muestran una mayor mortalidad por la formación de cocaetileno, debido

a que su LD50 es significativamente menor que la de la cocaína (Hearn et al., 1991).

Aunque, en general, no hay evidencia de que la combinación de ambas drogas haga más

que aumentar de forma aditiva la fuerte tendencia de cada droga de inducir una variedad

de trastornos físicos y psicológicos, existen ciertas excepciones. Por ejemplo, la cocaína

antagoniza de forma consistente algunos déficits inducidos por alcohol, como es el caso

de déficits de aprendizaje y de rendimiento psicomotor (ver Tabla 6). Además, la

combinación de ambas drogas tiende a tener efectos más grandes que los meramente

aditivos sobre la tasa cardiaca (Pennings et al., 2002).

60

INTRODUCCIÓN

6. TRATAMIENTOS FARMACOLÓGICOS

6.1. Tratamientos farmacológicos en la adicción al alcohol

En apartados anteriores de este manuscrito se ha hecho referencia a las complejas

interacciones entre genética y ambiente. Esto no sólo conlleva una gran heterogeneidad

en cuanto a las dimensiones de los síntomas y severidad del alcoholismo, sino que

también implica una amplia variabilidad en la respuesta a los tratamientos. De hecho,

sólo entre un 20% y un 30% de los pacientes tratados responden a los llamados

compuestos anti-craving y anti-recaída (Spanagel, 2009).

Algunos medicamentos que se utilizan en la actualidad, o que están en desarrollo, para

tratar la dependencia al alcohol, tienen como objetivo las vías de neurotransmisión del

refuerzo, ya sea para normalizar las adaptaciones debidas al consumo crónico de alcohol

o para bloquear el refuerzo. Otros fármacos, sin embargo, intentan restaurar el equilibrio

entre vías de neurotransmisores inhibitorios y excitatorios que contribuyen a la

hiperexcitabilidad por la abstinencia de alcohol y a los estados afectivos negativos que

pueden promover la recaída al consumo (Clapp, 2012). A continuación aparece un

resumen con los fármacos aprobados hasta el momento, así como los que se encuentran

en desarrollo, para el tratamiento de la dependencia de alcohol, haciendo hincapié en los

fármacos que han sido utilizados en los distintos estudios incluidos en esta tesis.

6.1.1. Tratamientos farmacológicos aprobados

- Disulfiram

El disulfiram (Antabus®) fue aprobado por la Administración de Medicamentos y

Alimentos, FDA (Food and Drug Administration, USA), en 1951 para el uso como

disuasorio del consumo de alcohol. Este fármaco inhibe la actividad de la enzima

ALDH, impidiendo así el metabolismo del acetaldehído (Franck y Jayaram-Lindström,

2013). De esta forma, si se ingieren pequeñas cantidades de alcohol después de la

administración de disulfiram, el acetaldehído se acumula, incrementándose entre 5 y 10

veces su concentración en sangre. Esta acumulación de acetaldehído produce reacciones

fisiológicas desagradables, como sudoración, dolor de cabeza, enrojecimiento, náuseas,

vómito, hipotensión, y taquicardia, entre otras, que desaniman al individuo a seguir

consumiendo (Clapp, 2012; Franck y Jayaram-Lindström, 2013). Las pruebas de la

eficacia del disulfiram son limitadas, pero el predictor más fuerte de un efecto del

61

INTRODUCCIÓN

tratamiento se observa en ensayos donde la administración del fármaco se realiza bajo

supervisión (Krampe y Ehrenreich, 2010). Dada la naturaleza aversiva de este

tratamiento, el incumplimiento es uno de los mayores retos en su utilización. El

disulfiram debe utilizarse con precaución en pacientes con patologías hepáticas, y está

contraindicado en pacientes con enfermedades cardiacas (Clapp, 2012). Actualmente se

considera un tratamiento anticuado, ya que no va orientado hacia los fenómenos

fundamentales de la dependencia de alcohol (Heilig y Egli, 2006).

- Naltrexona

La naltrexona, en 1994, pasó a ser el segundo medicamento aprobado por la FDA como

tratamiento para la dependencia de alcohol. La naltrexona es un antagonista opioide,

cuya eficacia clínica se cree que está mediada por las interacciones entre los sistemas

dopaminérgico y opioide endógeno (Clapp, 2012). Los opioides endógenos (como las

endorfinas y encefalinas) están implicados en los efectos reforzantes del alcohol. En

modelos animales de consumo de alcohol, se ha visto que el alcohol promueve la

liberación de β-endorfinas en áreas cerebrales implicadas en el refuerzo. Las β-

endorfinas estimulan la liberación de dopamina en el NAc, bien debido a sus efectos en

el ATV, o actuando directamente en el NAc (Gianoulakis, 1998; Marinelli et al., 2003).

Los efectos centrales de las β-endorfinas son mediados a través de los receptores µ

opioides. Además, la naltrexona muestra mayor afinidad por el receptor µ, con una

selectividad relativa por este receptor a dosis bajas (Heilig y Egli, 2006). Cuando la

naltrexona se administra por vía oral, se absorbe rápidamente y se somete a

metabolismo de primer paso hepático. El principal metabolito es el 6-β-naltrexol, que

reduce por sí mismo el consumo de alcohol en ratas (Rukstalis et al., 2000).

La naltrexona es relativamente bien tolerada, siendo el principal efecto secundario el

malestar gastrointestinal. Se ha sugerido que las dosis altas incrementan el riesgo de

hepatotoxicidad. Además, el uso de este fármaco, al tratarse de un antagonista opioide,

está contraindicado en pacientes alcohólicos que consuman también drogas opioides ya

que puede precipitar el síndrome de abstinencia opioide (Clapp, 2012). Por lo general,

en estudios en humanos, se ha visto que la naltrexona oral tiene un efecto superior al

placebo tanto en la prevención de la recaída en consumidores fuertes de alcohol, tras un

periodo inicial de abstinencia, como en la reducción del ansia por consumir (craving) y

en el incremento del porcentaje de días en abstinencia. Uno de los hallazgos más

62

INTRODUCCIÓN

consistentes con este tratamiento es el incremento en el tiempo hasta la recaída (Franck

y Jayaram-Lindström, 2013).

Desde una aproximación genética, se han encontrado algunos indicadores de una

respuesta positiva a la naltrexona. Por ejemplo, en pacientes alcohólicos con historia

familiar de alcoholismo, la naltrexona parece producir una mayor reducción en el

consumo de alcohol con respecto a aquellos sin historia familiar de alcoholismo

(Krishnan-Sarin et al., 2007). Además, la presencia de un polimorfismo en el gen del

receptor µ opioide (Asn40Asp) se ha asociado con una respuesta más favorable al

tratamiento con naltrexona en algunos estudios, aunque no en otros (Anton, 2008;

Gelernter et al., 2007).

Dada la poca adherencia a un régimen diario de naltrexona por vía oral, según las

observaciones clínicas, se desarrolló la formulación de liberación prolongada,

Vivitrex®/Vivitrol®, para inyecciones intramusculares mensuales. Vivitrol® muestra

picos reducidos y fluctuaciones mínimas de los niveles en plasma, lo que puede mejorar

el perfil de efectos adversos con respecto a la preparación oral (Clapp, 2012). Así

mismo, tiene un riesgo más bajo de hepatotoxicidad, comparado con la formulación

oral, dado que el fármaco no se ve sometido a metabolismo de primer paso hepático

(Franck y Jayaram-Lindström, 2013).

- Acamprosato

Fue aprobado por la FDA, en 2004, como tratamiento farmacológico para la

dependencia de alcohol. El acamprosato (N-acetil homotaurina de calcio), está

disponible para la administración en una fórmula oral de liberación retardada

(Campral®). Aunque los mecanismos de acción de este fármaco no se conocen bien, sus

efectos neuroquímicos se han atribuido a su antagonismo de los receptores NMDA de

glutamato (Franck y Jayaram-Lindström, 2013; Spanagel y Zieglgänsberger, 1997).

También se ha sugerido que puede modular la neurotransmisión a través de los

receptores metabotrópicos de glutamato de tipo 5 (mGluR5), reduciendo así la

acumulación de glutamato durante episodios repetidos de abstinencia de alcohol (Clapp,

2012) (ver Figura 8). Este tratamiento normalizaría el equilibrio entre las vías

excitatorias (glutamato) e inhibitorias (GABA), que se encuentran desreguladas después

del consumo crónico de alcohol, y mitiga el malestar psicológico y fisiológico asociado

a la abstinencia (Littleton y Zieglgänsberger, 2003; Spanagel y Kiefer, 2008). Se cree

63

INTRODUCCIÓN

que estos efectos se dan gracias, también, a la disminución tanto de la hiperexcitabilidad

dopaminérgica en el NAc durante la abstinencia de alcohol, como de la

hiperexcitabilidad neuronal general (Hammarberg et al., 2009).

Figura 8. Acción antiglutamatérgica del acamprosato (modificada de

Spanagel y Kiefer, 2008).

Según muestran algunos datos, en los pacientes tratados con acamprosato aumenta la

tasa de abstinencia completa, el porcentaje de días en abstinencia y el tiempo hasta el

primer consumo (Kranzler y Gage, 2008). En general, este fármaco ha demostrado

efectos pequeños o moderados con respecto a la reducción del consumo de alcohol y las

medidas subjetivas del ansia por consumirlo, así como promoviendo la abstinencia

(Franck y Jayaram-Lindström, 2013). Por otra parte, según los resultados de varios

estudios, la eficacia del acamprosato no ha sido asociada a ninguna variable predictora,

lo que permite considerarlo como una farmacoterapia potencialmente efectiva para

todos los pacientes con dependencia de alcohol (Mason y Lehert, 2012; Verheul et al.,

2005). También es importante señalar que el acamprosato cuenta con un perfil favorable

64

INTRODUCCIÓN

de seguridad y tolerabilidad, y los pacientes, en todos los ensayos clínicos, informan de

efectos secundarios mínimos, siendo la diarrea el más frecuente (Mann, 2004).

- Nalmefeno

El nalmefeno (Selincro®) fue aprobado por la Agencia Europea de Medicamentos

(EMA) en febrero de 2013, para la reducción del consumo de alcohol en pacientes

dependientes que presenten un nivel elevado de riesgo de consumo, sin síntomas de

abstinencia física y que no requieran desintoxicación inmediata (EMA, 2013). El

nalmefeno, estructuralmente relacionado con la naltrexona, es un modulador del sistema

opioide que tiene un efecto antagonista sobre los receptores µ y δ, y un efecto agonista

parcial sobre el receptor κ (Bart et al., 2005; Müller et al., 2014). En comparación con la

naltrexona, el nalmefeno parece ofrecer varias ventajas potenciales entre las que se

encuentran una unión más efectiva a los receptores opioides centrales (Emmerson et al.,

1994; Ingman et al., 2005), más alta biodisponibilidad (Dixon et al., 1987; Gal et al.,

1986), y la ausencia de una asociación dosis-dependiente con toxicidad en el hígado

(Mason et al., 1999). Además, el nalmefeno tiene un inicio más lento y una duración de

la acción más prolongada que la naltrexona (Soyka, 2014).

El nalmefeno, en general, es bien tolerado, y los principales efectos adversos son

náuseas, mareos, insomnio, y dolor de cabeza. La mayoría de estas reacciones son leves

o moderadas y de corta duración (Paille y Martini, 2014).

6.1.2. Nuevos enfoques en el tratamiento farmacológico

En este apartado se hará referencia a los principales tratamientos farmacológicos que

aún no han sido aprobados y que son enfoques actuales para el tratamiento de la

dependencia de alcohol. En la Tabla 7 se muestra un resumen de los mecanismos de

acción y resultados más importantes en relación a algunos de estos fármacos, los cuales

han sido, y siguen siendo, evaluados en ensayos controlados aleatorios. Dentro de esta

variedad de compuestos, el topiramato será el foco de atención, dado que, además de su

relevancia como farmacoterapia potencial, forma parte de los estudios incluidos en la

presente tesis.

65

INTRODUCCIÓN

- Topiramato

El topiramato es un sulfamato sustituido análogo de la fructosa-1,6-difosfato,

químicamente identificado como 2,3:4,5-bis-0-(1-metietilideno)-B-D-fructopiranosa

sulfamato, que fue sintetizado originalmente como un potencial agente antidiabético

(Johnson, 2005). En 1996, el topiramato (Topamax®) fue aprobado por la FDA para el

tratamiento de la epilepsia (FDA, 1996), y posteriormente para la prevención de la

migraña en adultos (FDA, 2004). El uso fuera de indicación del topiramato incluye el

tratamiento adyuvante del trastorno bipolar, el trastorno por estrés post-traumático, la

bulimia nerviosa, la obesidad, entre otros. Además, hay cada vez más estudios que

examinan la eficacia del topiramato en diferentes trastornos relacionados con el

consumo de sustancias como el alcohol, la nicotina, o la cocaína (Cohen et al., 2014;

Shinn y Greenfield, 2010).

El topiramato tiene seis mecanismos de acción importantes:

↑ Aumento; ↓ Disminución

Brodie et al., 2011.

Furieri y Nakamura-

Palacios, 2007. Mason

et al., 2014.

Agonista parcial de los

receptores de acetilcolina

nicotínicos α4β2.

Aprobado para dejar de

fumar.

Litten et al., 2013.

Mitchell et al., 2012.

Steensland et al., 2007.

↓consumo de alcohol y ↓craving

por alcohol, en dependientes de

alcohol fumadores y no fumadores.

Anticonvulsivante no

benzodiacepínico análogo

a GABA. Acción mediada a

través de los canales de

calcio sensibles al voltaje.

↓consumo de alcohol y porcentaje

de días de consumo fuerte.

↓craving. ↑porcentaje de días en

abstinencia.

Antagonista adrenérgico

α1.

↓consumo de alcohol, en

pacientes dependientes de alcohol,

con y sin comorbilidad con

trastorno por estrés postraumático.

Simpson et al., 2015.

Simpson et al., 2009.

Prazosina

Tabla 7. Fármacos no aprobados para el tratamiento de la dependencia de alcohol

Baclofeno

Ondansetrón

Vareniclina

Gabapentina

Mecanismos de acción Resultados principales Referencias

↓consumo en pacientes con

dependencia de alcohol (inicio

temprano). ↓consumo y

↑porcentaje días en abstinencia,

en subgrupos de pacientes de

acuerdo al genotipo.

Antiemético. Antagonista

selectivo del receptor

5-HT3.

Johnson et al., 2013.

Müller et al., 2014.

Antiespástico. Agonista

del receptor

metabotrópico GABA-B.

Addolorato y Leggio,

2010.

↑abstinencia total. ↓consumo de

alcohol y craving. Eficacia en

pacientes con cirrosis.

66

INTRODUCCIÓN

Potenciación de las corrientes inhibitorias mediadas por el receptor GABAA.

Este fármaco ejerce su efecto inhibidor por mecanismos independientes de los

de las benzodiacepinas y barbitúricos (White et al., 1997, 2000).

Antagonismo de los receptores de glutamato AMPA (α-amino-3-hidroxi-5-

metilsoxasole-4-propiónico) y kainato, y no afecta al receptor NMDA (Gryder y

Rogawski, 2003; Skradski y White, 2000).

Inhibición de los canales de calcio tipo L y limitación de los sistemas de

segundo mensajero dependientes de calcio (Zhang et al., 2000).

Limitación de la despolarización y excitabilidad dependientes de actividad de los

canales de sodio dependientes de voltaje (Taverna et al., 1999).

Activación de la conductancia de potasio (Herrero et al., 2002).

Inhibición débil de las isoenzimas II y IV de la anhidrasa carbónica en neuronas

y tejidos periféricos. En los túbulos renales, esta inhibición aumenta la

probabilidad de acidosis y formación de cálculos renales (Dodgson et al., 2000).

A través de distintos mecanismos de acción (ver Figura 9), el topiramato puede modular

el craving asociado al alcoholismo, además de sus efectos sobre la abstinencia en

alcoholismo crónico. Las propiedades del topiramato podrían sugerir el uso de este

tratamiento para el espectro completo de abstinencia, y prevención de la recaída, en la

dependencia de alcohol (ver De Sousa, 2010 y Kenna et al., 2009 para una revisión del

tema).

El perfil de efectos adversos del topiramato es bastante benigno. Los efectos

secundarios más comunes son parestesias transitorias y deterioro cognitivo a la hora de

encontrar palabras y otras dificultades menores. También se ha descrito pérdida de peso,

anorexia, casos de miopía aguda y de glaucoma de ángulo cerrado (De Sousa, 2010;

Nieto-Barrera, 2002).

Además de los tratamientos farmacológicos mencionados anteriormente en la

dependencia de alcohol, existen otros que están siendo estudiados en la actualidad. En el

caso de algunos compuestos se trata de estudios preclínicos, como aproximación a la

posible efectividad del fármaco, mientras que otros compuestos ya están siendo

evaluados en ensayos con pacientes. Algunos de los fármacos que se encuentran en fase

clínica son, por ejemplo, antidepresivos o antipsicóticos, como la Fluvoxamina, el

Aripiprazol, y el Flupentixol (para revisión ver Aubin y Daeppen, 2013; Spanagel y

67

INTRODUCCIÓN

Kiefer, 2008). Hay bastante literatura científica en relación a muchos compuestos, que

tienen distintos mecanismos de acción, y que se encuentran en fase preclínica, como por

ejemplo agentes que modulan el receptor nicotínico, o el receptor 5-HT7, o nuevos

anticonvulsivantes, entre otros (Hauser et al., 2015; Padula et al., 2013; Rahman, et al.,

2015).

Figura 9. Mecanismos de acción del topiramato en el SNC. Incremento de

GABA y disminución de Glu al ATV, suprimiendo el aporte de DA al NAc.

También, reducción de la hipersensibilidad glutamatérgica en el hipocampo y la

corteza, lo que resulta en una disminución de GABA/Glu y la inhibición de la

recompensa desde el NAc a la corteza (modificada de Johnson, 2004).

6.2. Tratamientos farmacológicos en la adicción a la cocaína

Hasta el momento no ha sido aprobada ninguna terapia farmacológica para el

tratamiento de la dependencia de cocaína, a pesar de la gran necesidad de encontrar un

tratamiento eficaz. Muchos de los compuestos que son objeto de estudio en ensayos

clínicos intentan modular las alteraciones neuroquímicas que se dan en los sujetos

dependientes de cocaína. Estos fármacos modulan, predominantemente, la señalización

de DA, SER, Glu, GABA, o NE. Por otra parte, existen terapias experimentales, que se

encuentran en fases iniciales de desarrollo, cuyo objetivo es interceptar la cocaína antes

de que alcance los centros de recompensa cerebrales, o evitar la expresión de genes

resultado de los cambios inducidos por la cocaína a largo plazo. Estas terapias

68

INTRODUCCIÓN

experimentales incluyen, por ejemplo, la vacuna anti-cocaína y los aceleradores del

metabolismo de la cocaína.

6.2.1. Fármacos dopaminérgicos

Este grupo de fármacos representa el 40% de los ensayos clínicos en fase II, en el año

2014, para el tratamiento de la adicción a la cocaína (Kim y Lawrence, 2014).

El modafinilo es un fármaco aprobado por la FDA para el tratamiento de la narcolepsia.

Aunque sus mecanismos de acción no están del todo claros, los datos sugieren que este

compuesto inhibe el DAT, incrementando los niveles extracelulares de DA, y que tiene

una actividad agonista de los receptores D2. Además, inhibe los NETs, aumenta la

función de 5-HT, y estimula la liberación de Glu e histamina (Minzenberg y Carter,

2008; Zolkowska et al., 2009). A través de estos mecanismos, el modafinilo podría

contrarrestar algunas de las alteraciones observadas en estos sistemas, en pacientes

dependientes de cocaína. Aunque no hay evidencias fuertes de que este fármaco

promueva sustancialmente la abstinencia en consumidores de cocaína, algunos estudios

mostraron resultados positivos que incluyen la reducción de los efectos subjetivos de la

cocaína (Hart et al., 2008; Malcolm et al., 2006), además de una disminución del

craving y un aumento en los días sin consumo de cocaína, en pacientes sin dependencia

comórbida de alcohol (Anderson et al., 2009). Por otra parte, otros estudios no han

encontrado diferencias significativas comparando con el placebo o con terapias

conductuales (Dackis et al., 2005; Schmitz et al., 2014). Sin embargo, hay que destacar

las mejoras que se han observado con este tratamiento en algunas medidas cognitivas,

como la toma de decisiones, la memoria de trabajo y la atención sostenida (Baranski et

al., 2004; Kalechstein et al., 2013; Turner et al., 2003).

Las anfetaminas producen una liberación de monoaminas, en particular de DA, y

también bloquean la recaptación de las mismas (Fleckenstein et al., 2007). Estas

acciones son similares a la cocaína. Las sales de anfetamina tienen unas características

farmacocinéticas que sugieren un potencial de abuso bajo, lo que ha permitido

sugerirlas como una terapia de sustitución para la adicción a la cocaína (Rush et al.,

2009; Stoops et al., 2004). El objetivo de esta terapia de sustitución no sería curar la

adicción si no mejorar la calidad de vida de los individuos adictos. Varios estudios en

consumidores de cocaína, muestran resultados prometedores acerca de la

dextroanfetamina, comparada con el placebo (Grabowski et al., 2004; Shearer et al.,

69

INTRODUCCIÓN

2003). La metanfetamina y el mazindol son compuestos que también han sido

estudiados para el tratamiento de la dependencia de cocaína (Mariani y Levin, 2012) y,

al igual que en los casos anteriores, son necesarias más investigaciones en relación a sus

potenciales efectos beneficiosos.

La levodopa y el ropinirol son fármacos aprobados para el tratamiento de la enfermedad

de Parkinson, y han sido estudiados en el ámbito de la dependencia de cocaína.

Respecto a la levodopa encontramos resultados contradictorios, varios estudios

centrados en su efecto sobre la abstinencia no encuentran efectos beneficiosos en las

condiciones estudiadas (Mooney et al., 2007; Wolfsohn et al., 1993), mientras que otros

sí encuentran algún resultado positivo en el incremento del tiempo de abstinencia

(Schmitz et al., 2008, 2010). Por el contrario, El ropinirol ha mostrado resultados

destacables sobre las medidas de abstinencia en individuos dependientes de cocaína

(Meini et al., 2008, 2011), disminuyendo, por ejemplo, la intensidad del craving y el

consumo semanal de la droga. Sin embargo, estos datos no cuentan con grupo placebo,

por lo que es necesario replicar los resultados en estudios más controlados.

El nepicastat es un inhibidor de la dopamina β-hidroxilasa, por tanto reduciendo la

conversión de DA en NE (Stanley et al., 1997). Actualmente, un par de ensayos clínicos

en fase II investigan los efectos de este tratamiento en la dependencia de cocaína. De la

Garza II et al. encuentran que el nepicastat puede suprimir los efectos subjetivos

positivos inducidos por la cocaína en pacientes con trastorno por consumo de cocaína

(De la Garza II et al., 2015). Por otra parte, el disulfiram, al cual ya se ha hecho

referencia en el apartado sobre los tratamientos de la dependencia de alcohol, también

es un inhibidor de la dopamina β-hidroxilasa (Weinshenker, 2010). Este fármaco ha

mostrado algunos resultados prometedores en el tratamiento de la dependencia de

cocaína, en pacientes con y sin co-abuso de opioides (Carroll et al., 2004; George et al.,

2000; Kosten et al., 2013; Oliveto et al., 2011; Petrakis et al., 2000).

6.2.2. Fármacos serotonérgicos

La buspirona, un agonista parcial de los receptores 5-HT1A, está aprobada por la FDA

para el tratamiento del trastorno de ansiedad generalizada. Este fármaco, en

comparación con placebo, mostró una reducción de los síntomas asociados con la

retirada de la cocaína (Giannini et al., 1993), aunque en un ensayo doble ciego posterior

no se observó ningún efecto de la buspirona (Moeller et al., 2001). Por otra parte, el

70

INTRODUCCIÓN

ondansetrón, al cual se ha hecho referencia con anterioridad, también ha sido evaluado

en un estudio como tratamiento de la dependencia de cocaína, mostrando resultados

positivos pero con limitaciones que los distorsionan (Johnson et al., 2006; Kim y

Lawrence, 2014). La psilocibina, un agonista de los receptores 5-HT2A y 5-HT1A, se

encuentra de manera natural en setas alucinógenas. Aún no ha sido aprobada para el

tratamiento de ningún trastorno (Kim y Lawrence, 2014), pero actualmente se está

llevando a cabo un ensayo en fase II con este compuesto en relación con el consumo de

cocaína, cuyos resultados no han sido publicados (ClinicalTrials.gov).

6.2.3. Fármacos GABAérgicos / glutamatérgicos

El topiramato, un fármaco al que se ha hecho referencia en el apartado 6.1.2 y que está

incluido en los experimentos que componen esta tesis, también ha sido estudiado en el

tratamiento de la dependencia de cocaína. Los datos de un estudio reciente parecen

sugerir que el topiramato puede reducir el riesgo de abuso de cocaína para altas dosis de

la misma, pero lo incrementaría si se trata de dosis bajas de esta droga (Johnson et al.,

2013a). Según datos obtenidos por Kampman y colaboradores, este tratamiento no

iniciaría la abstinencia en los sujetos, pero sí la prolonga en aquellos que ya son

abstinentes. Los investigadores también observaron una alta retención al estudio por

parte de los sujetos, lo que podría ser debido a la terapia cognitivo-conductual

(Kampman et al., 2004). Estos hallazgos fueron replicados por un estudio más reciente

en sujetos dependientes de cocaína, en el que también se utilizó terapia cognitivo-

conductual (Johnson et al., 2013b). Teniendo en cuenta estos resultados, y los obtenidos

en un estudio piloto (Reis et al., 2008), la eficacia del topiramato parece depender en

gran medida de que los pacientes reciban regularmente terapia cognitivo-conductual

concomitantemente (Kim y Lawrence, 2014). Otro ensayo, en el que la combinación de

sales de anfetamina y topiramato promueve significativamente la abstinencia en

individuos dependientes de cocaína, aporta datos en la misma dirección (Mariani et al.,

2012).

En el caso del baclofeno, su valor clínico en la adicción a la cocaína no está claro. Se ha

visto que este fármaco puede ser eficaz en la reducción del consumo de cocaína, en

comparación con el placebo, pero sin afectar a la retención ni al craving por cocaína

(Shoptaw et al., 2003). Sin embargo, el estudio de Kahn et al. (2009) no mostró ninguna

eficacia del baclofeno.

71

INTRODUCCIÓN

La ketamina, un antagonista de los receptores NMDA de Glu, está aprobada para la

inducción y mantenimiento de la anestesia general. Según los datos que existen sobre

este fármaco, su uso como terapia de reemplazo de forma crónica puede ser peligroso,

con un alto riesgo de abuso, especialmente cuando hay consumo simultáneo de cocaína

(Jansen y Darracot-Cankovic, 2001; Lankenau et al., 2010; Olthuis et al., 2013).

Solamente la ketamina de forma aguda parecería viable para consumidores de cocaína

(Kim y Lawrence, 2014). En la actualidad, hay dos ensayos clínicos en fase II que

evalúan la eficacia de este fármaco en la dependencia de cocaína (ClinicalTrials.gov).

La N-acetilcisteína, un agente glutamatérgico seguro y bien tolerado, también ha sido

estudiada como farmacoterapia potencial en el tratamiento de la adicción a cocaína. Los

datos sobre este compuesto muestran una disminución del craving por cocaína, eficacia

en la prevención de la recaída en sujetos abstinentes, reducción del consumo de cocaína

y de la impulsividad (LaRowe et al., 2013; Schmaal et al., 2012; para revisión ver

Asevedo et al., 2014 y McClure et al., 2014).

6.2.4. Otros fármacos

*Eficacia potencial basada en su perfil farmacológico y datos preclínicos.

Modificada de Kim y Lawrence, 2014

Sales de anfetamina (como

terapia de sustitución)

Sales de anfetamina (como

terapia de sustitución)*

Nepicastat, Ondansetrón, Psilocibina, Carvedilol,

Lidocaína, Mifepristona, Candesartán

TA-CD*

Modafinil*

Levodopa

Ropinirol*

Aripiprazol*

Poca o Sin

Información

Ropinirol

Topiramato

Doxazosina

TA-CD

Buspirona

Baclofeno

Ketamina*

Propranolol

Vareniclina

Modafinilo

Levodopa

Aripiprazol

Tabla 8. Fármacos: eficacia potencial basada en estudios clínicos

Promover la Abstinencia Facilitar la Terapia

Cognitivo-Conductual

Beneficio

Poco o Sin

Beneficio

Topiramato

Baclofeno*

Propranolol*

Ketamina*

72

INTRODUCCIÓN

Hay una variedad de compuestos, aparte de los comentados anteriormente, que están

siendo evaluados en ensayos en fase II. Este es el caso de fármacos noradrenérgicos,

como la doxazosina, el carvedilol y el propranolol, y de otros compuestos como la

lidocaína, vareniclina, mifepristona (RU-486), y el candesartán (Kim y Lawrence,

2014). En la Tabla 8 se muestra información acerca de la eficacia potencial de estos

fármacos, así como de los comentados en el apartado anterior, a la hora de promover la

abstinencia y de facilitar la terapia cognitivo-conductual en el tratamiento de la

dependencia de cocaína.

6.2.5. Nuevos enfoques terapéuticos

En la actualidad se están desarrollando una serie de terapias que, desde un enfoque

farmacocinético, buscan prevenir la entrada de la cocaína en el SNC, aumentar la

difusión de esta droga, y mitigar la acción posterior en el SNC. Su objetivo sería

neutralizar o metabolizar la cocaína, más que contrarrestar sus efectos clínicos. Entre

estos tratamientos encontramos el uso de enzimas que metabolizan la cocaína, las

vacunas, y la emulsión de lípidos. Esta última ha mostrado ser eficaz en la gestión de

casos resistentes y puede ser un tratamiento de rescate económico de pacientes con

toxicidad grave de cocaína (Connors y Hoffman, 2013). Por otra parte, se estudian un

grupo de compuestos reguladores del factor de transcripción ΔFosB, que modularían su

unión al ADN. Estas moléculas pueden ser usadas para evaluar la utilidad de ΔFosB

como una diana terapéutica (Wang et al., 2012).

- Vacuna contra la cocaína (TA-CD): está compuesta de un hapteno de cocaína

conjugado con la subunidad B de la toxina del cólera inactivada, dando lugar a una

molécula capaz de estimular una respuesta de anticuerpos (específicos de cocaína).

Estos anticuerpos se unirán a la cocaína en el torrente sanguíneo, formando un

complejo antígeno-anticuerpo incapaz de cruzar la barrera hematoencefálica (ver

Figura 10), debido a su mayor tamaño (Shorter y Kosten, 2011). Esta vacuna se

encuentra actualmente en ensayo clínico fase II. Kosten et al. hacen una revisión del

tema, y comentan que, basándose en el éxito de esta vacuna en los primeros ensayos

clínicos, puede tratarse de una de las primeras vacunas anti-adicción (Kosten et al.,

2014).

73

INTRODUCCIÓN

- Enzimas: esta aproximación trata de metabolizar la cocaína rápidamente,

produciendo metabolitos biológicamente inactivos, antes de que alcance los centros

cerebrales del refuerzo. La vía más prometedora es mediante el uso de una hidrolasa

de cocaína (CocH), generada mediante mutaciones de la enzima humana

butirilcolinesterasa (BChE) que presenta una mayor actividad catalítica sobre la

cocaína que la nativa (Xue et al., 2013). Zlebnik et al. sugieren que la transferencia

de genes de esta enzima con un vector viral puede producir niveles de CocH en

plasma que provoquen una disminución del consumo de cocaína a largo plazo

(Zlebnik et al., 2014). Otras opciones, que también están siendo estudiadas, son

tanto el desarrollo de anticuerpos catalíticos contra la cocaína, como una esterasa de

cocaína bacterina (CocE) encontrada en el suelo de las plantas de coca (ver revisión

de Schindler y Goldberg, 2012). Por otra parte, estudios en roedores sobre la

combinación de la CocH con la vacuna han mostrado resultados bastante

prometedores (Brimijoin et al., 2013; Connors y Hoffman, 2013).

6.3. Tratamientos farmacológicos en la adicción al alcohol y a la cocaína

En el caso de la codependencia de alcohol y cocaína, los tratamientos que buscan

específicamente reducir el consumo solamente de una de las dos sustancias pueden ser

inadecuados, y la mejor estrategia puede ser una cuyas dianas sean ambas adicciones

simultáneamente (Kampman et al., 2013). Los pacientes con esta codependencia tienden

Figura 10. Mecanismo de acción de una

vacuna contra la adicción a cocaína. A)

La vacuna interactúa con células sanguíneas

dendríticas para producir anticuerpos de las

células B que son secretados al torrente

sanguíneo. B) Si la vacuna es administrada,

se estimula la producción de anticuerpos

contra la cocaína. Posteriormente, si la

cocaína es ingerida, los anticuerpos se unen

a la droga y la secuestran en la circulación

sanguínea, impidiendo su entrada en el

cerebro (modificada de Kosten et al., 2014).

74

INTRODUCCIÓN

a tener más problemas psicosociales, es más probable que no se adhieran a los

regímenes de tratamiento y, en general, los tratamientos tienen peores resultados en

comparación con los tratamientos de la dependencia a una sola de las drogas (Brady et

al., 1995; Brower et al., 1994; Heil et al., 2001).

Como se ha comentado en los apartados 6.1 y 6.2, hay tratamientos farmacológicos

aprobados para la dependencia de alcohol, pero no para la dependencia de cocaína. Sin

embargo, las similitudes en la fisiopatología de ambas dependencias sugieren que estos

trastornos podrían responder a los mismos medicamentos (Johnson, 2005). En la

actualidad, encontramos varios ensayos clínicos en fase II en los que se evalúa la

eficacia de distintos fármacos en el tratamiento de la dependencia simultánea de alcohol

y cocaína (ClinicalTrials.gov).

La naltrexona, en dosis altas, ha mostrado eficacia en la reducción del consumo de

alcohol y cocaína en pacientes varones dependientes de ambas drogas, sin observarse

estos beneficios en mujeres (Pettinati et al., 2008), ni a dosis bajas del fármaco (Hersh

et al., 1998; Schmitz et al., 2004). Schmitz et al. no encontraron efectos de la naltrexona

sobre el consumo de cocaína, aunque a dosis altas sí redujo la frecuencia de consumos

fuertes de alcohol (Schmitz et al., 2009). En un estudio piloto reciente no se encontraron

diferencias en la reducción del consumo de alcohol o cocaína, entre el grupo de

naltrexona de liberación prolongada inyectable y el grupo placebo (Pettinati et al.,

2014). Por otra parte, se han observado resultados positivos de la naltrexona a dosis

altas, en el mantenimiento de la abstinencia de alcohol y cocaína, en pacientes tratados

con la combinación de disulfiram-naltrexona, pero no en los tratados únicamente con

naltrexona (Petttinati et al., 2008). En este estudio, el grupo tratado solo con disulfiram

también tuvo altas tasas de abstinencia a las dos drogas, comparado con el placebo.

Grassi et al., en un estudio piloto en pacientes co-dependientes de alcohol y cocaína,

observaron una disminución en el consumo de ambas drogas cuando se añadía

naltrexona o disulfiram a la terapia cognitivo-conductual, en comparación con la terapia

cognitivo-conductual sola (Grassi et al., 2007). Previamente, en pacientes ambulatorios

dependientes de cocaína, el disulfiram y la terapia cognitivo-conductual fueron más

beneficiosos para quienes no eran dependientes de alcohol o para aquellos que fueron

completamente abstinentes de alcohol durante el tratamiento (Carroll et al., 2004).

Además, en cuanto a la seguridad del disulfiram, parece que los riesgos del consumo

moderado de alcohol y cocaína en sujetos tratados con dosis moderadas de disulfiram,

75

INTRODUCCIÓN

podrían ser menos problemáticos de lo que algunos piensan (Roache et al., 2011).

Teniendo en cuenta todo lo anterior, es evidente que son necesarios más estudios que

evalúen la utilidad tanto de la naltrexona (en su dosis-respuesta, por ejemplo) como del

disulfiram, en el tratamiento de la co-dependencia de alcohol y cocaína.

En los apartados 6.1 y 6.2 también se ha hecho referencia a la utilidad del topiramato en

el tratamiento de la dependencia de alcohol y de cocaína, por separado. Dichos datos

podrían ser evidencias suficientes para sugerir que el topiramato puede ser un

tratamiento eficaz para la dependencia dual de alcohol y cocaína. En esta vía, Kampman

y colaboradores realizaron un estudio reciente en sujetos dependientes de alcohol y

cocaína, concluyendo que el topiramato no fue mejor que el placebo a la hora de reducir

el consumo de ambas drogas ni el craving por cocaína. Sin embargo, el topiramato

aumentó la probabilidad de retención al tratamiento y de ser abstinente de cocaína por

más tiempo. Los sujetos que parecen haber obtenido más beneficios del topiramato

fueron aquellos con síntomas más severos de abstinencia de cocaína (Kampman et al.,

2013).

Como se deduce de los apartados previos sobre tratamientos farmacológicos, hay otros

compuestos, aparte de la naltrexona, el disulfiram y el topiramato, que han sido

evaluados para el tratamiento de la dependencia de alcohol y cocaína. Dichos estudios

han puesto de manifiesto los beneficios de cada fármaco en cada una de estas dos

dependencias, permitiendo sugerir su eficacia potencial en el caso de la co-dependencia

de estas dos drogas.

Algunos de estos fármacos son antidepresivos, como la desipramina, la fluoxetina y el

bupropion. Aunque parece que hay pocas evidencias que apoyen el uso clínico de los

antidepresivos en el tratamiento de la dependencia de cocaína (Silva de Lima et al.,

2010), algunos de ellos han mostrado beneficios en pacientes con depresión comórbida

(Kenna et al., 2007; Nunes y Levin, 2004). Otros compuestos, como el baclofeno y el

ondansetrón, parecen mostrar resultados prometedores en el contexto de la dependencia

de alcohol y cocaína, pero necesitan, sin embargo, más ensayos clínicos y confirmación

de resultados. Algo similar ocurre con la gabapentina y con antipsicóticos, como el

aripiprazol y la olanzapina, que no cuentan en este momento con evidencias suficientes

que apoyen su uso en la dependencia de estas dos drogas (Amato et al., 2007; Minozzi

et al., 2015; para revisión ver Kenna et al., 2007).

76

INTRODUCCIÓN

7. REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA Y ADICCIÓN

La regulación de la expresión génica es uno de los mecanismos que puede conducir a

cambios relativamente estables en las neuronas. De acuerdo con esto, la exposición

repetida a una droga de abuso conduciría eventualmente a cambios en la función nuclear

y a tasas de transcripción alteradas de determinados genes diana, causando la

perturbación repetida de las vías de transducción de señales intracelulares (Kalivas,

2005; Nestler et al., 1993; Nestler y Aghajanian, 1997) (ver Figura 12). La expresión

alterada de estos genes daría lugar a alteraciones en la actividad de las neuronas en las

que están ocurriendo dichos cambios y, por último, a cambios en los circuitos neurales

en los que operan estas neuronas. Como resultado de todo lo anterior se darían cambios

estables en la conducta (Nestler, 2001; Ron y Jurd, 2005).

A continuación se hará una breve referencia al papel que representan los genes de

expresión temprana (IEGs, del inglés immediate early genes), y los principales

mecanismos epigenéticos, en la regulación de la expresión génica, así como su relación

con la adicción.

7.1. Genes de expresión temprana y adicción

Los IEGs pertenecen a una clase de genes que se activan rápidamente, por lo general de

una manera transitoria, en respuesta a cascadas de señalización intracelular inducidas

por un estímulo celular. Los IEGs codifican para muchas proteínas funcionalmente

distintas, como proteínas de secreción, proteínas del citoesqueleto, quimio-atrayentes,

enzimas citoplasmáticas, factores de transcripción dependientes de ligando y factores de

transcripción inducibles (familias de proteínas Fos, Jun y Krox) (Herdegen y Leah,

1998; Sng et al., 2004). Los factores de transcripción actúan reconociendo y uniéndose a

regiones promotoras de numerosos genes, activando o reprimiendo su transcripción.

Algunos lo hacen directamente y otros necesitan combinarse con otros factores. Por

ejemplo, las proteínas de la familia Fos pueden heterodimerizar con proteínas de la

familia Jun para formar el factor transcripcional AP-1. Este factor transcripcional se une

al sitio AP-1, presente en las regiones promotoras de numerosos genes, resultando en la

activación o la represión de la actividad transcripcional (Sng et al., 2004; Vilpoux et al.,

2009).

Los IEGs, al inducirse rápidamente por la activación sináptica de una neurona, son

considerados marcadores de activación neuronal (Chaudhuri, 1997). También se

77

INTRODUCCIÓN

considera que la expresión transitoria de IEGs está implicada en modificaciones

prolongadas de la función celular (Sabban y Kvetnanský, 2001). Así, los factores de

transcripción codificados por IEGs están implicados en la regulación de los cambios en

la expresión génica que subyacen a la plasticidad neuronal a largo plazo (Nestler et al.,

1999). En la Tabla 9 aparece el listado de un grupo de IEGs inducidos por la actividad

neuronal.

En las últimas décadas, varios estudios han mostrado que el consumo agudo o crónico

de drogas de abuso cambia la expresión de IEGs. Estos genes pueden ser parte de los

sustratos neurobiológicos que subyacen a la adicción y, por lo tanto, el mapeo cerebral

de la expresión de IEGs inducida por drogas ha sido utilizado para identificar regiones

cerebrales que pueden estar implicadas en el desarrollo de tolerancia, sensibilización,

craving, abstinencia, recaída, y adicción (Vilpoux et al., 2009).

Mientras que los genes neuronales están probablemente regulados por cientos de tipos

distintos de factores de transcripción, dos de estos factores, en particular, han sido

implicados en la adicción: CREB (del inglés cyclic-AMP response-element-binding

Proteína anclada a GPI: promueve la neuritogénesis

Tabla 9. Subconjunto de genes de expresión temprana

Ciclooxigenasa inducible

Miembre de la familia de las neurotrofinas

Miembro de la superfamilia del TGF-β

Pentraxina neuronal: liberada presinápticamente

Serina proteasa extracelular

Proteína de la familia protocadherina

Regulador del tráfico de AMPAR

Forma inducible de proteínas EVH

Proteína homóloga de Ras: regulación vía mTOR

Regulador de la señalización de proteínas G

heteroméricas

Quinasa tipo polo

Proteína con dedos de zinc

Receptor hormonal huérfano

tPA

c-jun

junB

zif268/egr1/krox24/NGFI-A

egr2/krox20

egr3/pilot

nur-77/NGFI-B

Arc/arg3.1

homer 1a/vesl1s

Rheb

RSG2

Proteína bZIP; componente del complejo AP-1

Proteína bZIP; componente del complejo AP-1

Proteína bZIP; componente del complejo AP-1

Proteína bZIP; componente del complejo AP-1

SNK/Plk2

Cox-2

BDNF

Activin β A

Narp

Modificada de Okuno, 2011* Ver l ista de abreviaturas

Categoría Estructura / función del producto del gen Gen

c-fos

fos BFactores de transcripción

Proteína con dedos de zinc

Proteína con dedos de zinc

Arcadin

CPG15/neuritina

Proteínas postsinápticas

Señalización intracelular

Factores de secreción

Proteínas de membrana

78

INTRODUCCIÓN

protein) y ΔFosB (ver revisión de Nestler, 2001). CREB regula la transcripción de

genes que contienen un sitio CRE (Cyclic-AMP response-element). Estos sitios se han

encontrado en regiones promotoras de casi todos los IEGs neuronales examinados,

incluyendo c-fos, bdnf, zif268, homer1a/vesl1s, cpg15, y Arc. Por lo tanto, se cree que

CREB juega un papel clave en el control de la expresión de IEGs (Okuno, 2011). Por

otra parte, ΔFosB, un miembro de la familia Fos, se ha propuesto como responsable de

la mayoría de los cambios a largo plazo en la expresión génica implicados en la

adicción (Moratalla, 2008).

Además, se ha visto que la administración aguda de varios tipos de drogas de abuso

causa una rápida, y transitoria, inducción de varios miembros de la familia Fos (por

ejemplo c-Fos, FosB, Fra-1, Fra-2) en el NAc y estriado dorsal. Por el contrario, la

exposición aguda a drogas induce sólo ligeramente las isoformas modificadas

bioquímicamente de ΔFosB (ver Figura 11). Sin embrago, estas isoformas comienzan a

acumularse con la administración repetida de la droga debido a su alta estabilidad (Hope

et al., 1994; Kelz y Nestler, 2000; Moratalla et al., 1996).

Algunos IEGs, especialmente Arc o zif268 (Egr-1), parecen estar altamente

correlacionados con actividades neuronales evocadas sensorialmente y conductualmente

(Okuno, 2011). Egr-1 ha sido sugerido como posible marcador de plasticidad sináptica

más que de actividad neuronal (Vilpoux et al., 2009; ver revisión de Veyrac et al.,

2014).

En la última década, aparte de la categoría de factores de transcripción, las funciones de

otros productos codificados por IEGs, tales como proteínas citosólicas y sinápticas, han

sido objeto de estudio. Además, algunos IEGs han recibido gran atención dada su

implicación directa en las funciones sinápticas (ver Tabla 9). Por ejemplo, la proteína

Arc es requerida para las formas duraderas de plasticidad sináptica y aprendizaje, e

interactúa con dinaminas y con isoformas específicas de endofilinas para aumentar la

endocitosis del receptor de membrana (Chowdhury et al., 2006). Por otra parte, el

BDNF es un importante regulador de la transmisión sináptica y la LTP en el hipocampo

y en otras regiones cerebrales (ver revisión de Leal et al., 2014), contribuyendo,

también, a la plasticidad conductual (Cowansage et al., 2010).

79

INTRODUCCIÓN

Figura 11. Regulación de ΔFosB por drogas de abuso. El gráfico superior

muestra las distintas oleadas de inducción de las proteínas de la familia Fos en el

NAc después de una sola exposición (flecha negra) a una droga de abuso. Sin

embargo, en el gráfico inferior se observa cómo las isoformas de ΔFosB se

mantienen en el cerebro después de la exposición a la droga, acumulándose con las

exposiciones repetidas a la misma (modificada de Nestler, 2001).

Loebrich y Nedivi (2009), y Okuno (2011), revisan la función de los principales IEGs,

entre los que incluyen los mencionados anteriormente y otros como: Narp (neuronal

activity-regulated pentraxin), Cox-2 (cyclooxygenase 2), Homer1a/vesl1s (miembro de

una familia de proteínas relacionadas con Homer, derivadas de tres genes distintos), y

CPG15 (neuritin; candidate plasticity gene 15; Nrn1). En apartados posteriores se hará

más hincapié en algunos de estos genes, y su papel en la adicción, dada su relevancia en

los resultados que van a ser presentados en esta tesis.

7.2. Epigenética

El biólogo Conrad Waddington fue el primero en acuñar el término “epigenética” a

mediados del siglo XX. Aunque hay varias definiciones del término, desde un punto de

vista general, la epigenética hace referencia a la regulación reversible de la expresión

génica, que se produce independientemente de la secuencia del ADN, mediada

80

INTRODUCCIÓN

principalmente por cambios en la metilación del ADN y la estructura de la cromatina

(Jaenisch y Bird, 2003). Berger et al. definen un rasgo epigenético como un fenotipo

heredable estable resultante de los cambios en un cromosoma, sin alteraciones en la

secuencia del ADN (Berger et al., 2009).

Figura 12. Regulación epigenética por las drogas de abuso. Las drogas de abuso actúan a

través de dianas sinápticas para alterar las cascadas de señalización intracelular, lo que conduce

a la activación o inhibición de factores de transcripción y de otras proteínas nucleares. Esto lleva

a la inducción o represión de genes particulares, incluyendo aquellos para ARNs no

codificantes. Se hipotetiza que algunos de estos cambios a nivel de la cromatina, inducidos por

las drogas, son muy estables y por tanto subyacen a las conductas duraderas que definen la

adicción. DNMTs, ADN metiltransferasas; HATs, histona acetiltransferasas; HDACs, histona

desacetilasas; HDMs, histona desmetilasas; HMTs, histona metiltransferasas; MEF2, factor

potenciador de miocito-2; NFκB, factor nuclear κB; pol II, ARN polimerasa II (modificado de

Nestler, 2014).

81

INTRODUCCIÓN

En eucariotas el ADN se encuentra organizado y compacto en cromatina en el núcleo.

De manera simplificada, la cromatina existe en un estado condensado

(heterocromatina), el cual no permite la transcripción de genes, y en un estado activo,

abierto (eucromatina), que permite la transcripción de genes individuales. Aunque en

realidad la cromatina se encuentra en muchos estados intermedios entre estos dos

extremos. La unidad básica de la cromatina es el nucleosoma, que en los seres humano

consiste de ~147 pares de bases envueltas alrededor de un octámero de histonas. Cada

octámero contiene dos copias de las histonas H2A, H2B, H3, y H4 (ver Figura 12). El

espaciamiento de los nucleosomas y el grado de condensación de los mismos son

controlados por mecanismos epigenéticos, lo que determina la expresión del gen (García

et al., 2012; Nestler, 2014).

A continuación se hará una breve referencia a los principales mecanismos de regulación

epigenéticos que intervienen en el control de la expresión génica, y al papel que

desempeñan los mismos en el campo de la adicción.

7.2.1. Metilación del ADN

La metilación de la citosina, una de las cuatro bases nitrogenadas del ADN, es la

modificación epigenética más extendida, mejor entendida y la más estable, que regula la

plasticidad transcripcional del genoma de los mamíferos. La metilación del ADN ocurre

cuando un grupo metilo es añadido a la posición 5 del anillo de la pirimidina citosina,

para producir 5-mC (5-metilcitosina), en una reacción catalizada por un grupo de

enzimas llamadas ADN metiltransferasas (DNMTs). Esto ocurre principalmente cuando

una citosina (C) aparece junto a una guanina (G) en la secuencia de ADN (C-enlace

fosfato-G, o dinucleótido CpG), aunque también se ha descrito metilación de citosina en

posiciones no CpG (Wong et al., 2011) [ver Figura 13]. En el genoma hay una escasez

del dinucleótido CpG, y estos se pueden agrupar en regiones que se denominan islas

CpG (CGIs). Estas CGIs representan el 5% de todos los CpG, y normalmente no están

metiladas. El 95% restante de dinucleótidos CpG se encuentran a lo largo del 99% del

genoma, y normalmente están metilados (Vinson y Chatterjee, 2012).

Generalmente, la metilación del ADN ejerce un efecto represivo sobre la transcripción

de genes, y se considera un cambio epigenético más estable que otros cambios

epigenéticos como son las modificaciones de las colas de las histonas, muchas de las

cuales se consideran fácilmente reversibles, y que se comentarán más adelante (Nestler,

82

INTRODUCCIÓN

2014). La metilación de ADN es esencial para regular la expresión génica específica de

tejido, el silenciamiento de elementos retrovirales, la impronta genómica, y la

inactivación del cromosoma X (Moore et al., 2013).

Figura 13. Metilación del ADN. Implica la adición de un grupo metilo en la posición 5

del anillo de la pirimidina citosina, lo que la convierte en 5-metilcitosina. Esta reacción

utiliza SAM (S-adenosilmetionina) como donante del grupo metilo, y es catalizada por las

enzimas DNMTs. SAH, S-adenosilhomocisteína (modificado de Zakhari, 2013).

La familia de las DNMTs está formada por 4 miembros con funciones distintas: la

DNMT3a y la DNMT3b pueden establecer un nuevo patrón de metilación para ADN, y

se conocen como DNMTs de novo (ver Figura 14A). La DNMT3a es la principal

DNMT expresada en el cerebro postnatal. Por otra parte, la DNMT1 (ver Figura 14B) es

la encargada, durante la replicación de ADN, de copiar el patrón de metilación desde la

hebra de ADN parental a la hebra hija recién sintetizada. Por otro lado, la DNMT3L que

se expresa principalmente durante el desarrollo temprano y se restringe en edad adulta a

células germinales y timo, no tiene función catalítica por sí misma, pero se asocia con

DNMT3a y DNMT3b estimulando su actividad metiltransferasa. DNMT3L se expresa

menos durante la diferenciación neuronal, y no se observa en el cerebro postnatal

(Moore et al., 2013). En el caso de la DNMT2, ahora llamada Trdmt1 (del inglés tRNA

aspartic acid methyltrasferase 1), es una metiltransferasa homologa que metila ARN en

lugar de ADN. Esta metiltransferasa es la más pequeña en mamíferos, está compuesta

únicamente del domino C-terminal, y no posee la región reguladora N-terminal. Se cree

que participa en el reconocimiento del daño del ADN, la recombinación de ADN, y

reparación de mutaciones (Subramaniam et al., 2014).

83

INTRODUCCIÓN

Figura 14. Vías de metilación de ADN. A) DNMT3a y DNMT3b son las DNMTs de novo y

transfieren grupos metilo (rojo) a ADN desnudo. B) DNMT1 es la DNMT que mantiene el

patrón de metilación del ADN durante la replicación. Cuando el ADN se somete a la replicación

semiconservativa, la hebra de ADN parental conserva el patrón original de metilación del ADN

(gris). DNMT1 replica el patrón de metilación de ADN original añadiendo grupos metilo (rojo)

a la hebra hija (azul) recién formada (modificada de Moore et al., 2013).

Por otra parte, la desmetilación del ADN puede ser definida como pasiva o activa. La

pasiva ocurre en células en división, mientras que la activa puede darse tanto en células

que estén en división como en células que estén en interfase. El proceso de

desmetilación activa requiere reacciones enzimáticas para procesar la 5-mC, y

convertirla de nuevo en una citosina desnuda, mientras que la desmetilación pasiva se

produce por inhibición o disfunción de la DNMT1, que es la encargada de mantener el

patrón de metilación durante la división celular (Moore et al., 2013).

Hasta ahora, en células de mamíferos, no se conoce ningún mecanismo capaz de romper

los fuertes enlaces covalentes presentes entre los grupos metilo y la citosina. La

desmetilación se produciría a través de una serie de reacciones químicas que por

84

INTRODUCCIÓN

desaminación y/o oxidación modifican aún más la 5-mC, generando un producto que es

reconocido por la vía de reparación por escisión de bases (BER por sus siglas en inglés).

Esta vía que participa en la reparación del ADN, reconoce la base modificada y la

remplaza por otra no modificada o desnuda (Moore et al., 2013).

7.2.2. Histonas

Las histonas son las proteínas básicas alrededor de las cuales se enrolla el ADN para

formar nucleosomas. Otro de los mecanismos epigenéticos de regulación de la

expresión génica es la modulación postraduccional, o cambios que ocurren después de

la biosíntesis, de histonas (Wong et al., 2011). Existen varias modificaciones covalentes

de histonas, que tienden a ocurrir en las colas N-terminales de las mismas, y que

incluyen la acetilación, la sumoilación, o la ubiquitinación en los residuos de lisina, la

metilación en los residuos de lisina o arginina, la fosforilación en los residuos de serina

o treonina, y la ADP-ribosilación en los residuos de glutamato. Esta diversidad de

modificaciones es la base de la “hipótesis del código de histonas”, la cual postula que la

suma de estas modificaciones epigenéticas en un gen particular define el estado

específico de activación o silenciamiento del gen (Jenuwein y Allis, 2001).

Las diferentes modificaciones de las histonas afectan de forma distinta a la expresión

del gen. De esta forma, la acetilación promueve, generalmente, la descondensación de la

cromatina incrementando la actividad del gen. Sin embargo, la metilación de histonas y

la fosforilación pueden tanto promover como reprimir la transcripción del gen. Respecto

a la ubiquitinación, la ADP-ribosilación, y la sumoilación de histonas, aún se desconoce

el papel que juegan en esta modulación (Nestler, 2014). Por tanto, las enzimas que

median esta variedad de modificaciones covalentes de las histonas, son componentes

clave en la regulación general de la expresión génica. Entre estas enzimas se

encuentran, por ejemplo: las histona acetiltransferasas (HATs), que catalizan la

acetilación y las histona desacetilasas (HDACs) que catalizan la desacetilación (ver

Figura 15), mientras que las enzimas que catalizan la metilación y la desmetilación son

las histona metiltransferasas (HMTs) y las histona desmetilasas (HDMs),

respectivamente (Bártová et al., 2008).

85

INTRODUCCIÓN

Figura 15. Las histona acetiltransferasas (HATs) transfieren reversiblemente los grupos

acetilo (Ac) a las histonas mediante la neutralización de la carga positiva de los residuos de

lisina en las colas N-terminales, lo que resulta en una estructura de la cromatina abierta,

accesible a factores transcripcionales, y en una activación de la transcripción génica. Por el

contrario, la acción de las histona desacetilasas (HDACs) conduce generalmente a la

represión transcripcional de genes (modificada de Lu et al., 2015).

Respecto a las HDACs, consideradas co-represores transcripcionales, se han

identificado 18 proteínas y son agrupadas en 4 clases: clase I (HDACs 1, 2, 3, y 8);

clase IIa (HDACs 4, 5, 7, y 9); clase IIb (HDACs 6 y 10); clase III (Sirtuinas 1-7); y

clase IV (HDAC 11) (Lombardi et al., 2011). En cuanto a su distribución en los tejidos,

la clase I se encuentra muy distribuida en todos los tejidos, las clases II y IV se

localizan principalmente en corazón, musculo esquelético, cerebro, hígado, y riñón; y la

clase III se expresa en una gran variedad de tejidos (Dokmanovic et al., 2007; Nogueiras

et al., 2012). Los datos sobre la carencia (knockout) de diferentes proteínas HDACs de

las clases I y II indican que la clase I tiene un papel importante en la supervivencia y

proliferación celular, mientras que las HDACs de la clase II pueden tener roles

específicos de tejido (Dokmanovic et al., 2007). Por ejemplo, la HDAC1 y HDAC2 son

necesarias para el desarrollo cerebral (Jaworska et al., 2015). De manera similar, y

como se expondrá más adelante, se ha demostrado la implicación de distintas HDACs

en la conductas relacionadas con las drogas de abuso (Nestler, 2014), lo que las hace

aún más relevantes para el tema que nos ocupa en esta tesis doctoral.

86

INTRODUCCIÓN

Es importante destacar que las modificaciones epigenéticas del ADN y de las histonas

no son mutuamente excluyentes, si no que interactúan de varias maneras. Por ejemplo,

la proteína MeCP2 (del inglés methyl-CpG-binding protein 2) se une específicamente a

citosinas metiladas, atrayendo HDACs que hipoacetilan histonas e inhiben el acceso de

factores de transcripción. Además, un estudio reciente ha mostrado que los residuos de

la histona H3 no metilados en la posición de la lisina 4 reclutan DNMTs, dando como

resultado una metilación de novo del ADN (Ooi et al., 2007; Wong et al., 2011).

7.2.3. ARN no codificante

Otro de los mecanismos de regulación epigenética está mediado por ARN. La

secuenciación completa del genoma de los mamíferos y sus productos transcripcionales

han revelado un gran número de ARNs expresados que no son traducidos a proteínas.

Así, en humanos, alrededor del 50% del ADN genómico se trascribe, el 2% de este es

traducido a proteínas y el otro 98% son ARNs no codificantes (ARNnc). Estos ARNnc

parecen tener un papel crucial en la regulación de la estructura del ADN, la expresión de

ARN, la traducción de proteínas y sus funciones, a través de distintos mecanismos

(Dunham et al., 2012; Qi et al., 2006; Rinn y Chang, 2012). Los más estudiados son

microARNs (miARNs), que son una clase de moléculas cortas de ARN, de 22

nucleótidos (nt) aproximadamente, y que actúan como reguladores de la expresión

génica (Ambros, 2004). Los miARNs se unen a ARNm específicos, pudiendo inhibir su

traducción o inducir su desglose. Muchos estudios se han centrado en explorar la

relación entre los miARNs y la drogadicción, mostrando que muchos de ellos son

regulados al alza o a la baja por las drogas de abuso (Nestler, 2014). Kenny (2014) y

Pietrzykowski (2010) revisan este tema en relación con la adicción a drogas específicas

como, por ejemplo, la cocaína y el alcohol.

Además, otro tipo de ARN, los ARNs largos no codificantes (ARNlnc), con una

longitud > 200 nt, están emergiendo como reguladores clave de la transcripción génica.

Estos ARNlnc modularían complejos modificadores de la cromatina a través de

interacciones directas con factores de transcripción y otras proteínas nucleares (Nestler,

2014).

7.2.4. Epigenética y adicción

Como se ha comentado con anterioridad, el estriado, en particular el NAc, es un

importante sustrato neural para las acciones adictivas de las drogas. Numerosos estudios

87

INTRODUCCIÓN

han mostrado que la exposición aguda o crónica a una droga de abuso altera la

expresión de genes específicos en el estriado, y esta regulación de genes individuales

estaría relacionada con las anormalidades conductuales que caracterizan la adicción. La

longevidad de estas alteraciones conductuales indica que las drogas de abuso causan

cambios extremadamente duraderos en el cerebro (Colvis et al., 2005).

Figura 16. Relación entre las predisposiciones heredadas, los factores ambientales, la

exposición a sustancias adictivas, y la vulnerabilidad a los trastornos adictivos. Los

individuos portadores de genes o epialelos que los predispongan a conductas adictivas, al ser

expuestos a estímulos ambientales adversos, pueden tener un mayor riesgo de desarrollar una

adicción. El consumo agudo de una droga puede producir alteraciones en la expresión génica a

través de cambios epigenéticos que influyen en la susceptibilidad a trastornos adictivos. La

mayor vulnerabilidad a las drogas de abuso retroalimentará el mayor riesgo de consumo futuro

de drogas (flecha discontinua), lo que aportaría más modificaciones al epigenoma y la expresión

génica (modificado de Wong et al., 2011).

En esta línea, las modificaciones epigenéticas, incluyendo la metilación de ADN y las

modificaciones de histonas, juegan un papel regulador esencial en la plasticidad

sináptica y la adaptación conductual a largo plazo en el sistema nervioso, lo que

justificaría que los cambios epigenéticos sean candidatos probables para el desarrollo de

la drogadicción, su mantenimiento, y la recaída al consumo de la droga (Kalivas y

O’Brien, 2008; Shaham y Hope, 2005; Wong et al., 2011), pudiendo afectar incluso a la

respuesta del individuo a farmacoterapias para las adicciones (Nielsen et al., 2012). En

88

INTRODUCCIÓN

la Figura 16 se muestra la relación, propuesta por Wong y colaboradores, entre las

predisposiciones heredadas, los factores ambientales, la exposición a sustancias

adictivas, y la vulnerabilidad a los trastornos adictivos.

Después de revisar los estudios que relacionan diferentes tipos de modificaciones

epigenéticas con la adicción a distintas drogas de abuso, Nielsen et al. (2012) concluyen

que los cambios epigenéticos descritos en dichos estudios parecen ser indicativos de una

respuesta epigenética a la exposición de la sustancia, en lugar de una predisposición

biológica a desarrollar una adicción. Sin embargo, los estudios sobre los cambios en la

metilación del ADN que se observan en la drogadicción sugieren un posible papel de la

epigenética en la mayor vulnerabilidad para la adicción.

En las Tablas 10 y 11 se presentan, a modo de resumen, los resultados de varios

estudios en los que se exploraron las modificaciones epigenéticas como respuesta a la

exposición a alcohol o cocaína, respectivamente. En apartados posteriores de este

Gen/histona Tratamiento

NR2B Crónico

HDAC Agudo/crónico

H3K9 Crónico

PDYN Crónico

HERP Crónico

SNCA Crónico

AVP Crónico

ANP Crónico

MAOA Crónico

NGF Crónico

DLK1 Crónico

Desmetilación de islas CpG en neuronas corticales de ratón, expresión incrementada de

NR2B.

Respuesta

Tabla 10. Alcohol: algunas modificaciones epigenéticas

Células de neuroblastoma humano tratadas con acetaldehído mostraron una expresión

regulada a la baja del gen PDYN, simultánea con un incremento en la trimetilación de

H3K27 y una acetilación disminuída de H3K4 y H3K9 en el promotor de PDYN.

Alta expresión de PDYN en la CPF de alcohólicos.

Gen HERP hipermetilado y asociado con niveles incrementados de homocisteína en

alcohólicos.

Hipermetilación del gen SNCA asociada con alcoholismo.

La abstinencia incrementó la expresión del gen NR2B , con aumento simultáneo en la

acetilación de H3K9 del promotor de NR2B en neuronas corticales primarias.

Disminución de la actividad de HDAC, en amígdala de rata, después de la exposición

aguda, e incremento con la retirada desde la exposición crónica.

Incremento de la acetilación de H3K9, de manera dosis-dependiente, en hepatocitos de

rata incubados en etanol durante 1 día.

La acetilación de H3K9 fue observada con la administración intragástrica crónica en ratas.

* Ver l ista de abreviaturas Modificada de Nielsen et al., 2012

Hipermetilación del gen AVP asociada con alcoholismo.

Hipometilación en la región promotora de ANP observada en alcohólicos.

Metilación del promotor de la MAOA asociada nominalmente con dependencia de

alcohol en mujeres.

Un incremento en la metilación del promotor de NGF debido a la abstinencia en sujetos

dependientes de alcohol.

Región improntada de IG-DMR hipometilada en esperma de sujetos dependientes de

alcohol.

89

INTRODUCCIÓN

manuscrito se expondrán y discutirán algunos de los resultados específicos más

importantes en esta área, bajo el encuadre de los estudios con estas dos drogas que

forman parte de esta tesis.

Haciendo referencia a la acetilación de histonas, se ha visto, por ejemplo, que tras la

exposición aguda o crónica a cocaína aumentan los niveles globales de acetilación de

las histonas H3 y H4 en el NAc, pero a pesar de este incremento global muchos genes

muestran la acetilación de histonas disminuida después de la exposición crónica a esta

droga (Robison y Nestler, 2011). También se ha observado que la sobreexpresión de

HDAC4 o HDAC5 disminuye las respuestas conductuales a cocaína, mientras que la

carencia de HDAC5 hipersensibiliza a los ratones a los efectos crónicos de la droga

(Kumar et al., 2005; Renthal et al., 2007). Por otra parte, la abstinencia de alcohol en

ratas incrementa la actividad de las HDACs y reduce la acetilación de histonas en la

amígdala (Pandey et al., 2008). En un estudio reciente se encontró un incremento de la

expresión de HDACs en sangre periférica tras la exposición repetida a alcohol, tanto en

Gen/histona Tratamiento

c-fos Agudo

FosB Agudo/crónico

HDAC5 Crónico

CaMKIIa Crónico

Agudo

MeCP2 Agudo

Cdk5 Crónico

Bdnf Crónico

miR-212 Crónico

Incremento en la fosforilación de MeCP2 en la serina 421, en el estriado de rata.

Acumulación de la HDAC1 reclutada por FosB en el promotor de c-fos para limitar la

expresión de c-fos .

La cocaína disminuyó la actividad de HDAC5 en el núcleo accumbens, lo que incrementó la

transcripción de los genes diana de HDAC5.

La fosforilación de la serina 421 controla la capacidad de MeCP2 de regular el patrón

dendrítico, la morfogénesis de espinas, y la inducción de la transcripción de Bdnf

dependiente de la actividad.

Incremento en la acetilación de la histona H4 en el promotor de c-fos , y aumento de la

expresión del gen, en el estriado de ratón.

Respuesta

Tabla 11. Cocaína: algunas modificaciones epigenéticas

DNMT1, Dnmt3a

y Dnmt3b

Hipometilación y disminución de la unión de MeCP2 en el promotor de FosB , e

incremento en la expresión de FosB en el núcleo accumbens.

La cocaína crónica reclutó la proteína de unión a CREB para el promotor de FosB , lo que

reguló al alza la expresión de FosB en el estriado, para aumentar la sensibilidad a la

cocaína y la actividad locomotora.

Expresión inducida por cocaína de Dnmt3a y Dnmt3b en el núcleo accumbens.

La exposición materna a cocaína incrementó la expresión de DNMT1 y DNMT3a , pero no

de DNMT3b , en las neuronas piramidales hipocampales de la descendencia.

Incremento de la acetilación de la histona H3 en el gen CaMKIIa, y expresión regulada al

alza.

* Ver l ista de abreviaturas Modificada de Nielsen et al., 2012

Acetilación de la histona H3 en el promotor de Cdk5 en el estriado.

Señalización de CREB amplificada en el estriado, vía fosforilación de Raf-1, aumentando la

sensibilización de la adenilato ciclasa.

Acetilación de la histona H3 en el promotor de Bdnf , e incremento de Bdnf en el

hipocampo.

90

INTRODUCCIÓN

ratas como en humanos, sugiriendo distintos patrones de expresión dependiendo del tipo

de exposición -aguda o crónica- (López-Moreno et al., 2015), lo que apoyaría la

posibilidad de su uso como biomarcador en los trastornos por consumo de sustancias.

En los últimos años, la investigación con moléculas inhibidoras de las HDACs, que dan

lugar a un aumento de la acetilación de histonas, ha sido bastante fructífera. Estos

inhibidores han demostrado efectos sobre diferentes conductas relacionadas con el

alcohol, como son el consumo del mismo, la sensibilización motora, la ansiedad

asociada a la abstinencia, entre otras (Ponomarev, 2013). Además, la administración a

corto plazo de inhibidores inespecíficos de las HDACs potencia el condicionamiento de

lugar y las respuestas locomotoras de psicoestimulantes y opiáceos (Kumar et al., 2005;

Renthal et al., 2007), pero si esta inhibición es más prolongada los cambios podrían ser

en la dirección opuesta (Kim et al., 2008; Romieu et al., 2008).

Por otra parte, la metilación de histonas también es regulada directamente por las

drogas. Así, el abuso crónico de alcohol en humanos puede dar lugar a un incremento

global, y en genes específicos, de tri-metilación de la histona 3 en la lisina 4

(H3K4me3), en la corteza cerebral (Ponomarev et al., 2012), mientras que la exposición

crónica a cocaína reduce los niveles de H3K9me2 (di-metilación de la histona 3 en la

lisina 9), así como los de H3K9me3 (tri-metilación de la histona 3 en la lisina 9), una

marca de heterocromatina, en el NAc (Maze et al., 2011). De manera similar, tanto la

cocaína como el alcohol disminuyen los niveles de expresión de la proteína G9a, una

HMT, en el NAc y en neuronas corticales cultivadas respectivamente. Esta disminución

de G9a en el NAc incrementa la arborización dendrítica en las neuronas de esta

estructura y es asociada con el incremento de la expresión de varias proteínas

implicadas en la función sináptica (Nestler, 2014).

Respecto a la metilación del ADN, distintos estudios han mostrado que la exposición a

la cocaína altera los niveles de expresión de la DNMT3a en el NAc (Anier et al., 2010;

LaPlant et al., 2010). De manera similar, la reducción de las DNMTs (por ej. con

inhibidores) en esta estructura incrementa las respuestas conductuales a la cocaína,

mientras que la sobreexpresión de la DNMT3a en la misma área tiene efectos opuestos

(LaPlant et al., 2010). Por otro lado, la exposición crónica a cocaína incrementa la

expresión de MeCP2 en el estriado dorsal, donde a su vez, la disminución de esta

proteína provoca una reducción de la autoadministración de la droga (Im et al., 2010).

91

INTRODUCCIÓN

Igualmente, los niveles de metilación del ADN en las regiones promotoras de distintos

genes se han visto alterados en pacientes dependientes de alcohol. Entre los genes

afectados se encuentran los del receptor µ opioide, la proopiomelanocortina (POMC), y

el DAT, así como algunos de los incluidos en la Tabla 10. Sin embargo, mientras varios

de estos estudios muestran una hipermetilación en los pacientes dependientes de

alcohol, otros encuentran una hipometilación de la región del gen investigada

(Nieratschker et al., 2013; Zhang et al., 2013), lo que pone de manifiesto la necesidad de

más estudios al respecto.

Por último, se debe destacar que el campo de la investigación en epigenética de la

drogadicción es relativamente nuevo, por lo que quedan muchas preguntas pendientes,

dianas de futuros estudios, acerca de los mecanismos epigenéticos concretos implicados

en las distintas etapas de la adicción, así como sobre las estructuras/tejidos y genes

específicos que se ven afectados, teniendo en cuenta otras variables genéticas y

ambientales que puedan influir en esta regulación epigenética.

92

INTRODUCCIÓN

93

94

II. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS

95

96

1. HIPÓTESIS

En la presente tesis doctoral quisimos verificar varias hipótesis respecto a la interacción

entre el alcohol y la cocaína, la eficacia de diferentes tratamientos farmacológicos en la

dependencia dual de estas drogas, así como la implicación de la CPF. Las hipótesis

planteadas fueron las siguientes:

1) El tratamiento farmacológico con naltrexona, acamprosato, y topiramato será

efectivo en la reducción del consumo de alcohol en ratas.

2) La exposición crónica a cocaína aumentará el consumo de alcohol y alterará la

actividad locomotora de los animales.

3) El tratamiento farmacológico con naltrexona y topiramato reducirá el

incremento del consumo de alcohol y la estimulación psicomotora inducidos por

cocaína.

4) La naltrexona y el topiramato alterarán la expresión de genes asociados con la

actividad neuronal y genes epigenéticos en la CPF.

2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1) Estudio de la curva dosis-respuesta del tratamiento farmacológico con

acamprosato, naltrexona, y topiramato en el consumo de alcohol en ratas

(Artículos 1 y 2).

2) Estudio de los efectos de la administración crónica de cocaína, mediante una

curva dosis-respuesta, sobre la autoadministración operante de alcohol

(Artículos 1 y 2).

3) Exploración de los efectos del tratamiento con naltrexona, topiramato, y cocaína

sobre la actividad locomotora de los animales (Artículos 1 y 2).

4) Evaluación de la efectividad del tratamiento con naltrexona y topiramato en la

reducción del consumo de alcohol en animales tratados concomitantemente con

cocaína (Artículos 1 y 2).

5) Exploración de los efectos del tratamiento con naltrexona y topiramato sobre la

sensibilización motora inducida por cocaína (Artículos 1 y 2).

97

HIPÓTESIS Y OBJETIVOS

6) Análisis de las alteraciones inducidas por el tratamiento crónico con naltrexona

y la interacción alcohol/cocaína sobre la expresión de varios IEGs, incluyendo

factores de transcripción y genes efectores, en la CPF (Artículo 1).

7) Análisis de los efectos del tratamiento crónico con topiramato sobre el

metabolismo del alcohol y de la cocaína (Artículo 2).

8) Exploraciones de las alteraciones en la memoria episódica producidas por el

tratamiento agudo o crónico con topiramato (Artículo 2).

9) Estudio de los efectos del tratamiento crónico con topiramato y la interacción

alcohol/cocaína sobre la expresión de varios grupos de genes relacionados con

mecanismos de regulación epigenética, proteínas diana del topiramato, y el

sistema de recompensa, en la CPF (Artículo 2).

98

HIPÓTESIS Y OBJETIVOS

99

100

III. RESULTADOS

101

102

ARTÍCULO 1

Echeverry-Alzate et al., 2012. Cocaine reverses the naltrexone-induced

reduction in operant ethanol self-administration: The effects on immediate-early

gene expression in the rat prefrontal cortex. Neuropharmacology. 63(6):927-35.

Impact Factor (2014): 5.106

103

RESULTADOS

104

RESULTADOS

at SciVerse ScienceDirect

Neuropharmacology 63 (2012) 927e935 RESULTADOS

Contents lists available

Neuropharmacology

journal homepage: www.elsevier .com/locate/neuropharm

Cocaine reverses the naltrexone-induced reduction in operant ethanolself-administration: The effects on immediate-early gene expression in the ratprefrontal cortex

Víctor Echeverry-Alzate a, María Tuda-Arízcun a, Kora-Mareen Bühler a, Ángel Santos b, Elena Giné b,Pedro Olmos a,c, Miguel Ángel Gorriti a, Evelio Huertas d, Fernando Rodríguez de Fonseca e,Jose Antonio López-Moreno a,*

aDepartment of Psychobiology, Faculty of Psychology, Campus de Somosaguas, Complutense University, 28223 Madrid, SpainbDepartment of Biochemistry, Faculty of Medicine, Complutense University of Madrid, 28040 Madrid, SpaincC.I.E.M.A.T., Avda. Complutense 22, Madrid, SpaindDepartment of Basic Psychology, Campus de Somosaguas, Complutense University, 28223 Madrid, Spaine Fundación IMABIS, Laboratorio de Medicina Regenerativa, Hospital Regional Universitario Carlos Haya, 29010 Málaga, Spain

a r t i c l e i n f o

Article history:Received 29 February 2012Received in revised form19 May 2012Accepted 7 June 2012

Keywords:NaltrexoneAcamprosatePrefrontalC-fosCOX-2Genetic expression

* Corresponding author. Laboratorio de Psicobiolobiología, Facultad de Psicología, Campus Somosaguas,Madrid, E-28223 Madrid, Spain. Tel.: þ34 91 3943093

E-mail address: jalopezm@psi.ucm.es (J.A. López-M

0028-3908/$ e see front matter � 2012 Elsevier Ltd.http://dx.doi.org/10.1016/j.neuropharm.2012.06.010

a b s t r a c t

Naltrexone is a clinically approved medication for alcoholism. We aimed to investigate the effectivenessof naltrexone co-administered with cocaine and the association of these substances with immediate-early gene expression in the rat prefrontal cortex. We used chronic operant ethanol self-administration and oral treatments prescribed for alcoholism and available in pharmacies to maximisethe predictive validity in humans. We performed real-time PCR analysis to determine gene expressionlevels in the prefrontal cortex. Only the highest dose of naltrexone (1, 3, and 10 mg/kg, p.o.) reduced theresponse to ethanol. Cocaine increased ethanol self-administration in a dose-dependent manner (2.5, 10,20 mg/kg, i.p.) and reversed the naltrexone-induced reduction. Naltrexone failed to prevent the cocaine-induced increase in locomotor activity observed in these animals. Chronic self-administration of ethanolreduced the expression of the C-fos gene 4- to 12-fold and increased expression of the COX-2 (up to 4-fold) and Homer1a genes in the rat prefrontal cortex. Chronic ethanol self-administration is preventedby naltrexone, but cocaine fully reverses this effect. This result suggests that cocaine may overcomenaltrexone’s effectiveness as a treatment for alcoholism. The ethanol-induced reduction in C-fos geneexpression in the prefrontal cortex reveals an abnormal activity of these neurons, which may be relevantin the compulsive consumption of ethanol, the control of reward-related areas and the behaviouralphenotype of ethanol addiction.

� 2012 Elsevier Ltd. All rights reserved.

1. Introduction

Alcoholism is a disabling addiction disorder (WHO, GISAH, 2011).An effective treatment for alcoholism remains elusive despite theadvances that have been made including the development ofnaltrexone (i.e., Antaxone�) and acamprosate (i.e., Campral�), twoclinically approved medications to treat binge ethanol consumption,ethanol abuse and dependence and to prevent relapse (Fuller andGordis, 2001; Johnson, 2010; Mason, 2003; O’Brien et al., 1996;

gía, Departamento de Psico-Universidad Complutense de; fax: þ34 91 3943189.oreno).

All rights reserved.

105

Spanagel and Zieglgänsberger,1997). Treatmentwith oral naltrexonehas been associated with a significant reduction in alcohol-relatedhealthcare costs (Kranzler et al., 2010). Naltrexone is a non-selective opioid antagonist theorised to reduce ethanol consump-tion by blocking central opioid receptors that subsequently directlyor indirectly modulate the effects of ethanol (Hillemacher et al.,2011; Hubbell and Reid, 1990). The mechanism of action of acam-prosate is less well understood. Acamprosate is hypothesised toreduce neuronal hyperexcitability through its putative agonist-likeeffects at GABA receptors and its antagonist effects at the gluta-mate N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor (Kiefer and Mann,2010; Littleton, 1995; Stromberg et al., 2001). The effects ofcombining the two compounds on ethanol consumption have alsobeen assessed. Stromberg et al. (2001) reported no evidence of anadditive or synergistic effect resulting from such a combination nor

V. Echeverry-Alzate et al. / Neuropharmacology 63 (2012) 927e935928 RESULTADOS

was it more effective than naltrexone alone in reducing ethanolconsumption by rats.

The co-abuse of ethanol and cocaine occurs with high frequencyand persistence in human populations worldwide. For example,Miller et al. (1989) reported that 94% of the American patientsdiagnosed as cocaine-dependent were also diagnosed with anethanol dependence. In another study, approximately 12 millionmembers of the general population had used both ethanol andcocaine within the previous twelve months (Grant and Harford,1990). In a more recent study in Europe, 64% of the cocainepowder users (excluding crack cocaine users) reported frequentethanol consumption (Gossop et al., 2006), and the concomitantuse of ethanol was evident by analyses of blood and urine samplesin 76% of cocaine-related cases of sudden death (Lucena et al.,2010). Finally, heavy chronic alcohol use is linked to a three-foldincreased risk of cocaine use (Kulaga et al., 2010). These datasupport the idea that cocaine use could increase the vulnerability tothe development of ethanol dependence (Rubio et al., 2008) andvice versa. A careful examination of the clinical data indicates thatthe concurrent use of ethanol and cocaine is associated withincreased mortality and morbidity resulting from cerebro- andcardiovascular complications (Cami et al., 1998; O’Connor et al.,2005; Randall, 1992; Vroegop et al., 2009) as well as hepatotox-icity and compromised mental status (Odeleye et al., 1993; Vaneket al., 1996). Taken together, these facts underscore the urgencyand necessity to develop pharmacotherapeutic interventions foralcoholism and the comorbidity of alcoholism with cocaine use.

Currently, despite the increasing number of studies investigatingthe effects of naltrexone or acamprosate on ethanol/cocaine co-consumption (Hersh et al., 1998; Oslin et al., 1999; Pettinati et al.,2008a, 2008b; Sable et al., 2004; Schmitz et al., 2004, 2009;Stromberg et al., 2002; Suh et al., 2008), knowledge in this arearemains incomplete. For example, a high dose of naltrexonemodestly reduced heavy ethanol consumption in individualsdependent on both cocaine and ethanol (Schmitz et al., 2009).Therefore, the aim of this study was to gain deeper knowledgeregarding the treatment of alcohol addiction with naltrexone andacamprosate when cocaine is co-administered. For this purpose, weused chronic operant ethanol self-administration in rats, an animalmodel with one of the highest levels of predictive validity in humans(Koob et al., 2003) for the development of pharmacological treat-ments for substance abuse disorders. Furthermore and important inthis study, we investigated the expression of immediate-early genesas biomarkers of neural stimulation in the prefrontal cortex.

Fig. 1. A brief schematic representing the protocol used. Panel A, naltrexone and acamproadministration session (experiment 1). After a wash-out period, experiments 2 and 3 werdecapitation for RTqPCR experiments at the time that they would have been placed in the ethused as the calibrator group. The numbers in grey indicate the cumulative number of operanand 3. Ntx ¼ Naltrexone; Acp ¼ Acamprosate.

10

We focused on the prefrontal cortex because of its contribution toaddictive behaviour (Lüscher and Malenka, 2011), its involvement incompulsive ethanol drinking, its demonstrated sensitivity tonaltrexone and acamprosate treatment (Burattini et al., 2008; Liet al., 2010; Yu et al., 2011), and its critical role in integrating andregulating cognitive behaviour in rodents and in humans (e.g.,Abernathy et al., 2010; Dayas et al., 2007; Vengeliene et al., 2009).

2. Methods

2.1. Subjects

Ninety-two male Wistar rats (Harlan, Barcelona, Spain) weighing 375e425 g atthe start of the pharmacological experiments were housed in groups of 4 per cage ina temperature- and humidity-controlled environment on a 12 h reverse light/darkcycle (lights off at 07:00 h). Experimental sessions were performed during the darkphase (Fig. 1). Food and water were available ad libitum except as specified below.All research was conducted in strict adherence to the European Community CouncilDirective (91/414/EEC). All efforts were made to minimise animal suffering and toreduce the number of animals used.

2.2. Drugs

Ethanol solution was prepared daily as a 10% ethanol v/v solution from 99%ethanol. Acamprosate (3-Acetamidopropane-1-sulfonic acid, Campral�, Merck SantéS.A.S., Lyon, France) and naltrexone (17-(Cyclopropylmethyl)-4,5a-epoxy-3,14-dihydroxymorphinan-6-one, Antaxone�, Pharmazam S.A., Barcelona, Spain) weredissolved in water and administrated by oral gavage (p.o.) at a volume of 3 ml/kg.Cocaine hydrochloride (SigmaeAldrich Co., U.S.A.) was dissolved in physiologicalsaline and injected intraperitoneally at a volume of 1 ml/kg.

2.3. Ethanol self-administration and motor experiments

2.3.1. Apparatus and procedureThe ethanol operant sessions were conducted in modular chambers enclosed in

sound-attenuating cubicles (Letica, LE 850 model; Panlab, Barcelona, Spain andMedAssociates Inc., St. Albans, VT, USA). The association of visual or auditory cues withlever presses or dipper presentations was avoided. The exhaust fans were inacti-vated because they increase the rate of ethanol evaporation. The chambers wereequippedwith two retractable levers located 7 cm above a grid floor on either side ofa drinking reservoir positioned in the centre of the front panel of the chamber and4 cm above the grid floor. The levers were counterbalanced to respond as the activelever (delivering 0.1 ml) or as the inactive lever. The contents of the dipper wereaccessible to the animal until the next lever press, at least 2.5 s later, to avoidmeasuring dipper presentations as lever presses.

Training was conducted using a modification of the method used by López-Moreno et al. (2004). Briefly, the rats were placed on a restricted water intakeschedule ranging from 2 to 4 days to facilitate the training in lever pressing. Thelength of the water restriction depended on the animal’s rate of learning; animalsthat did not learn the first or second day were restricted for 4 days. During the first 4days of training, 76 animals received a 1% saccharin solution in the dipper. There-after, the following sequence was followed on a fixed-ratio schedule of

sate were administrated for 5 consecutive days 1 h before the operant ethanol self-e conducted for 14 consecutive days. On the 15th day, the animals were sacrificed byanol operant chamber (experiment 4). A group of 16 rats responding to saccharin were

t ethanol sessions. Panel B shows the details of the treatment schedule of experiments 2

6

V. Echeverry-Alzate et al. / Neuropharmacology 63 (2012) 927e935 929RESULTADOS

reinforcement: 0.2% saccharin for three sessions, 0.2% saccharin and 0.2% ethanol forthree sessions, 0.16% saccharin and 2% ethanol for three sessions, 0.12% saccharinand 4% ethanol for three sessions, 0.08% saccharin and 6% ethanol for three sessions,0.04% saccharin and 8% ethanol for three sessions, 0.02% saccharin and 10% ethanolfor three sessions and 10% ethanol for the remaining sessions. An additional group of16 animals that had access only to saccharin and did not receive any pharmaco-logical treatment during the study was used as the control group for the geneticexpression experiment (the calibrator group). The baseline (obtained at day 0)corresponded to the average number of ethanol responses obtained on the final 5days before the first experiment (from the 59th day to the 63rd day); the number ofresponses varied by 15% or less. All the ethanol operant sessions lasted 30min undera fixed-ratio 1 schedule for the entire study.

The locomotor activity of the rats was assessed using 6 custom-made40 � 35 � 35 cm rectangular boxes; the boxes were equipped with 8 photocellsarranged in 2 lines (4 and 8 cm above the floor) that detected the locomotor activityas beam breaks. The animals were evaluated in a counterbalanced manner duringa four-day period and in a single 20 min trial immediately following an injectionwith cocaine or the vehicle. The horizontal and rearing activity of the rats wasrecorded.

2.3.2. Experiment 1: the effects of subchronic treatment with naltrexone oracamprosate on the response to ethanol

Experiment 1 was designed to identify which drug (naltrexone or acamprosate)more efficiently reduced ethanol self-administration and to select one of the drugsfor further behavioural studies concerning alcohol/cocaine co-administration. Tothis end, we evaluated the effects of varying doses of naltrexone (0, 1, 3 and 10 mg/kg, p.o.) and acamprosate (0, 35, 75, and 210 mg/kg, p.o.) on the number of limited-access responses to ethanol. Naltrexone and acamprosate were dissolved in waterand administrated by oral gavage 60 min prior to the ethanol operant session dailyfor 5 consecutive days. The route of administration (p.o.) was chosen to strengthenthe ecological validity of the study because it most closely resembled the setting forhuman patients. The rats were deprived of food 12 h prior to the pharmacologicaltreatment (naltrexone/acamprosate); because the medications were orally admin-istered, the food deprivation was intended to improve the drugs’ rate of absorptionand normalise the absorption among the animals. The animals were matched anddistributed among groups according to the number of ethanol responses they hadexhibited at baseline.

2.3.3. Experiment 2: the effects of the chronic administration of cocaine, naltrexoneand both co-administered on the response to ethanol

Experiment 2 was designed to evaluate the effects of varying doses of cocainealone or in combination with 10 mg/kg naltrexone (p.o.) on operant ethanol self-administration. After experiment 1 (see Fig. 1a), the animals continued with dailyethanol operant sessions for an additional 32 days without receiving any treatment;this period was termed the wash-out period. A new five-day baseline was estab-lished by noting that lever presses varied less than 15% within these five days, andthe rats were counterbalanced based on their response to the previous treatments.The rats were again matched and distributed into each group according to thenumber of ethanol responses each had exhibited. In this experiment, the ratsreceived the following treatments for 14 consecutive days: (a) the vehicle groupwasorally treated with water and then injected with saline; (b) the cocaine groups weretreated orally with water and with 2.5, 10 or 20 mg/kg, i.p. cocaine and (c) thenaltrexone groups were treated with naltrexone alone (10 mg/kg, p.o.) or with

Table 1Details of the primers used and cycle numbers required to reach the crossing point (thre

Gene Name GenBank accession no. Direction

18S 18S ribosomal RNA gene M11188.1 LeftRight

Rheb Ras homologue enriched in brain NM_013216.1 LeftRight

Zif-268 Transcription factor Zif268 ENSRNOT00000026303 LeftRight

C-fos Proto-oncogene c-Fos ENSRNOG00000008015 LeftRight

Homer1 Homer homologue 1 NM_031707.1 LeftRight

Arc Activity-regulatedcytoskeleton-associated protein

NM_019361.1 LeftRight

COX-2 Cyclooxygenase-2 S67722.1 LeftRight

Bdnf Brain-derived neurotrophic factor NM_012513.3 LeftRight

A sample’s “Crossing Point” (Cp) depends on the initial concentration of cDNA in theamplification cycles to reach the Cp. A sample with a higher concentration requires fewerincrease assuming 100% PCR efficiency.

107

a combination of 10 mg/kg naltrexone administered orally þ 10 mg/kg, i.p. cocaineor 10 mg/kg naltrexone þ 20 mg/kg, i.p. cocaine. The treatment schedule is depictedin Fig. 1b.

2.3.4. Experiment 3: the effects of cocaine and naltrexone and their co-administration on locomotor activity

In this experiment, we aimed to evaluate whether naltrexone would preventcocaine-induced motor sensitisation. As described above, naltrexone was adminis-tered 1 h before the administration of cocaine to the animals treated witha combination of naltrexone and cocaine (Fig. 1b).

2.4. Genetic expression experiments

2.4.1. Apparatus and procedureReal-time PCR was performed using a LightCycler 480-II machine (Roche) with

primers and assays designed by the Universal Probe Library (UPL) from Roche (seeTable 1). A 10-fold dilution series of the template was employed to amplify everygene to validate the efficiency of each assay and to confirm that the amplificationefficiencies of the target and reference genes were comparable (indicated by a near-zero slope value for both the target and reference genes). The 18S ribosomal RNAgene was used as an internal control for normalisation. The saccharin-vehicle group(the non-ethanol-treated group) was used as a calibrator (an untreated control), andthe 2�DDCTmethodwas used to analyse the expression data (Schmittgen and Livak,2008).

The prefrontal cortex, including the frontal association cortex and the morerostral/anterior regions of the lateraleventraledorsalemedial areas of the orbitalcortex, prelimbic cortex and secondary motor cortex (Paxinos and Watson, 1998 forrats), was immediately dissected on ice and quickly frozen on dry ice at�80 �C. TotalRNA was isolated from the prefrontal cortex of each rat using Tripure IsolationReagent (Roche) and stored at �80 �C. One microgram of total RNA was reversetranscribed into cDNA using the Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche).

2.4.2. Experiment 4: the effects of ethanol, cocaine and naltrexone on theimmediate-early gene expression in the prefrontal cortex

The goal of experiment 4 was to map the brain prefrontal activity related to ourbehavioural results. For this purpose, we assessed the immediate-early geneexpression of two regulatory transcription factors (C-fos and Zif-268) and fiveeffector immediate-early genes (Bdnf, Arc, Homer1a, Rheb and COX-2). To maximisethe association between the prefrontal activity and the animal’s state before theoperant ethanol session, the animals were sacrificed rapidly by decapitation duringthe period they would have been placed into the ethanol operant chamber for the15th day of ethanol operant self-administration (see Fig. 1a).

2.5. Statistical analysis

The data from the two first experiments were analysed using a one-way ANOVAwith treatment as the between-subject factor followed by Tukey’s post hoc test. Atwo-way ANOVA (cocaine � naltrexone as the between-subject factors) was used toanalyse the data from the third experiment. Similarly, a two-way ANOVA (gene �-treatment as the between-subject factors) was used for the fourth experiment, butin this case, the Bonferroni post hoc test was used because of the greater number ofmultiple comparisons. After confirming the significant main effects by ANOVA,

shold) in the saccharin group in the prefrontal cortex.

Primer sequence (50e30) Ampliconlength (nt)

Mean cycles(Cp) saccharin group

SEM

GGAGCCTGAGAAACGGCTA 64 9.42 0.10TCGGGAGTGGGTAATTTGCTCAGACTGCTGTGGATGTTTTT 64 23.80 0.24AGCCGCTCCGTCAATCTTACGAGCACCTGACCACAGA 90 23.83 0.15GGGTAGTTTGGCTGGGATAACACCTCAAGGACTTGAAAGCATC 60 24.91 0.21ACATCTCCGGAAGAGGTGAGTGCACAGCCACAAGACAGA 72 24.92 0.11CCTCTTCCTTTACTTTTAGGGTCTCGCTGAAGCAGCAGACCTGA 64 25.60 0.16TTCACTGGTATGAATCACTGCTGACCAACGCTGCCACAACT 118 28.30 0.21GGTTGGAACAGCAAGGATTTAGCGCGAATGTGTTAGTGGT 66 28.31 0.12GCAATTGTTTGCCTCTTTTTCT

sample. Samples with a lower initial concentration of target DNA require morecycles. The quantity of DNA doubles every cycle, and 3.32 cycles represent a 10-fold

V. Echeverry-Alzate et al. / Neuropharmacology 63 (2012) 927e935930 RESULTADOS

a significance level of p < 0.05 was applied to all statistical analyses. The SPSSstatistical software package (version 17.0) for Windows (Chicago, IL) was used for allstatistical analyses.

3. Results

3.1. Experiment 1: the effects of subchronic treatment withnaltrexone or acamprosate on the response to ethanol

The goal of the first experiment was to establish doseeresponsecurves for naltrexone (0, 1, 3 and 10mg/kg, p.o.) and acamprosate (0,35, 75 and 210 mg/kg, p.o.) on operant ethanol self-administration(n ¼ 10e12 per group). This was performed over five consecutivedays (subchronic treatment). The ANOVA and post hoc data analysesindicated that only the highest dose of naltrexone (10 mg/kg)significantly suppressed the total number of ethanol responses[F(3,39)¼ 10.25, p< 0.001], as shown in Fig. 2a. Ethanol intake levelswere between 0.61 � 0.4 and 0.74 � 0.5 g/kg (mean � SEM) in thevehicle group and between 0.32 � 0.3 and 0.40 � 0.3 g/kg in thegroup treated with 10 mg/kg naltrexone. Doses of 1 and 3 mg/kg ofnaltrexone failed to reduce the number of ethanol responses.Treatment with acamprosate at 35, 70 or 210 mg/kg produced nosignificant changes in the number of ethanol responses[F(3,40) ¼ 0.29, p ¼ 0.831], as shown in Fig. 2b. There were nosignificant differences in the activity towards the inactive lever. Thisexperiment allowed us to select naltrexone for future experimentsand eliminate acamprosate.

3.2. Experiment 2: the effects of the chronic administration ofcocaine, naltrexone and their co-administration on the response toethanol

The purpose of this experiment was two-fold: first, to establisha doseeresponse curve for cocaine (2.5, 10 and 20 mg/kg, i.p.) onthe response to ethanol, and second, to investigate whether theeffective dose of naltrexone (10 mg/kg, p.o.) could prevent operantethanol self-administration even with the co-administration ofcocaine, which is the most common pattern of human cocaine use(e.g., Gossop et al., 2006; Miller et al., 1989). This experiment wasperformed over 14 consecutive days (chronic treatment). Cocainecaused a dose-dependent increase in the number of responses toethanol [F(3,42) ¼ 6.42, p < 0.001], as shown in Fig. 3a (n ¼ 10e12per group). A post hoc analysis revealed that (a) the highest dose of

Fig. 2. Naltrexone significantly reduces operant ethanol self-administration in rats. The totaltreatment with naltrexone (10 mg/kg, p.o., Antaxone�) decreased the self-administration ofchange. Values are expressed as the mean � SEM of n ¼ 10e12. ***p < 0.001 compared withwas followed by Tukey’s post-hoc test.

10

cocaine (20 mg/kg) significantly increased the total number ofethanol responses and (b) the number of ethanol responses fromthe group treated with the lowest dose of cocaine (2.5 mg/kg) waslower than those of the groups receiving the other two doses ofcocaine. There were no significant differences in the activitytowards the inactive lever (between 1 and 7 responses). Fig. 3bshows the evolution of the number of ethanol responses averagedover two days during the 14 days of treatment with cocaine.

Chronic treatment with naltrexone (10 mg/kg, p.o.) significantlyreduced the total number of responses to ethanol comparedwith thenumber of responses made by the vehicle group [F(3,40) ¼ 19.84,p < 0.001], as shown in Fig. 4a (n ¼ 10e12 per group). This supportsour results from the subchronic experiment. Further, the post hocanalysis revealed that both cocaine doses (10 and 20mg/kg, i.p.) fullyreversed the naltrexone-induced reduction in operant ethanol self-administration. Moreover, the number of ethanol responses madeby the groups treated with both cocaine doses was increasedcompared with the number made by the vehicle group. Fig. 4bshows the responses averaged over two days for alcohol self-administration during the 14 days of treatment with naltrexoneand cocaine.

3.3. Experiment 3: the effects of cocaine, naltrexone and their co-administration on locomotor activity

The aim of the third experiment was to evaluate locomotoractivity after treatment with cocaine, with the effective dose ofnaltrexone (10 mg/kg, p.o.) and with a combination of the twodrugs (Fig. 5). With this information, we intended to determinewhether cocaine-induced motor sensitisation would be associatedwith operant ethanol responses and, more importantly, whethercocaine-induced motor sensitisation would be prevented bynaltrexone. An ANOVA [cocaine F(2,44) ¼ 28.37, p < 0.001;naltrexone F(6,609) ¼ 1.44, p ¼ 0.006] and a post hoc analysisshowed that only the 10 and 20 mg/kg i.p. doses of cocaineincreased the total locomotor activity (horizontal and vertical)compared with the responses of the vehicle-control group.Naltrexone had no effect on locomotor activity (n ¼ 10e12 pergroup). Also, naltrexone failed to prevent cocaine-induced loco-motor activity: the locomotor activity of the groups of rats treatedwith naltrexone and 10 or 20 mg/kg of cocaine was significantlyhigher than that of the vehicle-control group. Finally, therewere no

number of lever presses during the 5 day period of treatment is shown. (A) Subchronicethanol. (B) Subchronic treatment with Acamprosate (p.o., Campral�) did not cause anythe vehicle. ##p < 0.01 compared with 1 and 3 mg/kg of naltrexone. A one-way ANOVA

8

Fig. 3. Cocaine significantly increases the operant ethanol self-administration in rats. (A) The total number of lever presses during the 14 day treatment period is shown. Chronictreatment with cocaine (20 mg/kg, i.p.) increased the number of ethanol responses compared to the vehicle treatment. Values are expressed as the mean � SEM of n ¼ 10e12.*p < 0.05. A two-way ANOVAwas followed by Tukey’s post-hoc test. #p < 0.05 and ##p < 0.01 compared with 2.5 mg/kg of cocaine. (B) Two-day time course of ethanol responses.

V. Echeverry-Alzate et al. / Neuropharmacology 63 (2012) 927e935 931RESULTADOS

significant differences between the groups treated with cocainealone and the groups treated with a combination of naltrexone andcocaine.

3.4. Experiment 4: the effects of ethanol, cocaine and naltrexone onimmediate-early gene expression in the rat prefrontal cortex

In the fourth and final experiment, we explored the geneticexpression of the most common immediate-early genes used tomap brain activity associated with behaviour (Kubik et al., 2007).There is ample evidence that the prefrontal cortex is involved indrug addiction (e.g., Lüscher and Malenka, 2011) and, morespecifically, in ethanol operant self-administration (Dayas et al.,2007). Fig. 6 emphasises the results of a two-way ANOVA analysisof C-fos and COX-2 gene expression [treatment F(7,609) ¼ 7.46,p < 0.001; gene F(6,609) ¼ 54.81, p < 0.001; interactionF(42,609)¼ 5.64, p<0.001] and the subsequent Bonferroni post hocanalysis. Operant ethanol self-administration significantly reducedthe expression of the C-fos gene in all groups (p < 0.001) except forthe group treated with 2.5 mg/kg cocaine when compared with thesaccharin group (calibrator group). Furthermore, ethanol treatmentincreased the expression of the COX-2 (p < 0.001) and Homer1a(p ¼ 0.007, data not shown) genes. All treatments blocked the

Fig. 4. Cocaine reverses the naltrexone-induced reduction in operant ethanol self-administrashown. Chronic treatment with cocaine (10 and 20 mg/kg, i.p.) fully reversed the reductioAntaxone�). Values are expressed as the mean � SEM of n ¼ 10e12. *p < 0.05 and **p < 0.0a two-way ANOVA followed by Tukey’s post-hoc test. (B) A two-day time course of ethano

109

increased COX-2 gene expression induced by ethanol (p < 0.001).Zif-268, Bdnf, Arc and Rheb gene expression was not altered byoperant ethanol self-administration.

The right column of Table 1 shows the estimated amount of DNAof each gene in the prefrontal cortex of each rat in the saccharin-untreated group (the calibrator group). The quantity of DNA ofeach gene, assuming a 100% PCR efficiency, doubles every cycle;every 3.32 cycles represent a 10-fold increase in the amount ofDNA. The genes are listed according to their estimated expressionin the prefrontal cortex in the saccharin group.

4. Discussion

4.1. Naltrexone treatment for ethanol dependence

Opioid antagonists have been widely studied for the treatmentof ethanol dependence (Hillemacher et al., 2011; Johnson, 2006,2008; Soyka and Rösner, 2008; Walker and Koob, 2008; Walkeret al., 2011). Of these antagonists, naltrexone seems to be one ofthe safest and most effective by multiple routes of administration(Johnson et al., 2004; Rösner et al., 2010). We selected the dosesbased on the results of previous studies (Blumberg and Ikeda, 1978;Czachowski and DeLory, 2009; Stromberg et al., 1998), and we

tion in rats. (A) The total number of lever presses during the 14 day treatment period isn of ethanol responses caused by chronic treatment with naltrexone (10 mg/kg, p.o.,1 compared with the vehicle. ###p < 0.001 compared with 10 mg/kg naltrexone usingl responses.

Fig. 5. Naltrexone fails to prevent the cocaine-induced increase in locomotor activityin rats. The number of beam breaks during a 20 min period is shown. Cocaine (i.p.) at10 and 20 mg/kg caused a dose-dependent increase in total locomotor activity (hori-zontal and vertical). The 10 mg/kg naltrexone dose (p.o., Antaxone�) did not affectlocomotor activity. Values are expressed as the mean � SEM of n ¼ 10e12. **p < 0.01and ***p < 0.001 compared with the vehicle. #p < 0.05, ###p < 0.001 compared with10 mg/kg cocaine. A one-way ANOVA was followed by Tukey’s post hoc test.

V. Echeverry-Alzate et al. / Neuropharmacology 63 (2012) 927e935932 RESULTADOS

adapted them to the pharmacokinetic and pharmacodynamiccharacteristics of oral administration, that is, oral naltrexone ach-ieves its peak plasma levels 60 min after administration (Verebeyet al., 1976) and the presence of food decreases the pharmacolog-ical activity of acamprosate by decreasing its rate of absorption toless than 10% during the first 24 h (Spanish Agency for Medicines

Fig. 6. Operant ethanol self-administration alters the immediate-early C-fos and COX-2gene expression in the rat prefrontal cortex. Ethanol self-administration alone (greenbar) or combined with cocaine reduced the genetic expression of the C-fos gene 4- to12-fold compared with the expression resulting from the consumption of saccharin(calibrator group, grey dotted line). Ethanol self-administration alone increased COX-2gene expression compared with saccharin consumption, but this effect was reversedby all the treatments. *These results indicate the significant effects of ethanolconsumption (alone or in combination with cocaine/naltrexone) compared tosaccharin consumption. The values are expressed as the mean � SEM of n ¼ 9e12. Atwo-way ANOVA was followed by Tukey’s post hoc test. The levels of significance andother genes are detailed in the Results section.

11

and Health Products (AEMPS), Online Medicines InformationCenter; FDA Approved Drug Products (Drugs@FDA)).

Our data extend previous reports of animalmodels that show thatnaltrexone attenuates context-induced ethanol seeking (Marinelliet al., 2007), blocks the increased ethanol consumption followinga period of abstinence known as the ethanol deprivation effect(Heyser et al., 2003), increases the extinction of responses to ethanoland attenuates the cue-induced reinstatement of ethanol-reinforcedbehaviour (Bienkowski et al.,1999). Furthermore,we believe that ourresults have a higher predictive validity for humans because wetreated the animals orally with the liquid naltrexone available inpharmacies under the brand name of Antaxone�. Here, a dose of10 mg/kg (p.o.) was found effective. However, our results exhibitdistinct differences fromprevious studies using animalmodels. It hasbeen reported that lower doses of naltrexone, 0.05e0.45 mg/kg (Jiet al., 2008) or 0.1e1 mg/kg (Walker and Koob, 2008), decreasedthenumberof leverpresses for ethanol andethanol intake in the two-bottle free-choice paradigm. Themost plausible explanation for thesediscrepancies is that those authors subcutaneously administerednaltrexone, a route approximately 30-fold more potent than anintraperitoneal injection (Williams and Broadbridge, 2009);naltrexone is expected to be even less potent administered orally as itwas in this study than by intraperitoneal injection.

In this study, animals were also orally treated with acamprosate(Campral�), but none of the doses tested reduced the number ofoperant ethanol responses. Acamprosate is prescribed to maintainabstinence in individuals who are already abstinent at the initiationof treatment (Mason, 2005), whereas naltrexone is effective inreducing ethanol intake and relapse but less effective in supportingthe maintenance of abstinence (Garbutt, 2010). These facts suggestthat the specific neurobiology of naltrexone (opioid neurotrans-mission) and acamprosate (the amino acid neurotransmitters GABAand glutamate) may be linked to different stages of alcoholism;thus, it may be useful to integrate these treatments. Accordingly,some research using animal models shows that a combination ofnaltrexone and acamprosate could be more effective than eithercompound alone to prevent the alcohol deprivation effect in rats(Heyser et al., 2003) or in mice in a limited access alcohol model(Kim et al., 2004). In humans, the combined administration of thecompounds has been proven to be behaviourally and pharmaco-logically safe (Johnson et al., 2003; Kiefer and Wiedemann, 2004).

4.2. Cocaine increases operant ethanol self-administration andreverses the naltrexone-induced reduction

Cocaine at 20 mg/kg increased the number of responses toobtain ethanol. Interestingly, this effect results from long-lastingneuroadaptations because cocaine was administrated 6 h afterthe daily operant ethanol self-administration session. Thus, theanimals did not have access to ethanol until approximately 17 hafter the cocaine injection (see Fig. 1b). We followed this extendedschedule because we wanted to avoid (a) cocaine-induced place-conditioned motor sensitisation and motor hyperactivity in theethanol operant chambers (Antoniou et al., 1998; Stromberg andMackler, 2005), (b) a putative cocaine-induced aversion toethanol (this effect has been repeatedly demonstrated withsaccharin by several authors, e.g., Davis and Riley, 2007; Ferrariet al., 1991; Goudie et al., 1978), (c) the formation of coca-ethylene, a psychoactive compound that results from the co-administration of cocaine and ethanol (Hedaya and Pan, 1997;Laizure et al., 2003; Landry, 1992; Schechter, 1995), and (d) othernon-controllable variables resulting from the concomitant expo-sure to cocaine and ethanol. For example, cocaine (1e30 mg/kg)administrated 15 min prior to the test session suppresses lever-pressing for food (Ross and Schaal, 2002), and a similar reduction

0

V. Echeverry-Alzate et al. / Neuropharmacology 63 (2012) 927e935 933RESULTADOS

in lever press rates for an ethanol solution has been observed with10 and 30 mg/kg cocaine (van Haaren and Anderson, 1994).Therefore, we assume that the changes that we would observe inethanol response should reflect long-lasting cocaine-inducedeffects rather than acute cocaine-induced effects.

In contrast, it could be argued that cocaine could cause anincrease of lever presses as a result of the stereotypical behaviourinduced by cocaine (Aliane et al., 2009), but the lack of effect on theactivity towards the inactive lever makes this explanation unlikely.Another explanation that we consider more plausible is that thiseffect could be mediated by cocaine withdrawal. It has beenrecently demonstrated that functional and morphological changesoccur in the brain after repeated injections of cocaine even in theabsence a prolonged withdrawal period (Dobi et al., 2011). If this isthe case, our results may indicate that such neuroadaptationsinduced by cocaine withdrawal alter the sensitivity to the effects ofethanol, resulting in an increased number of ethanol responses.There also appears to be a complementary relationship betweenthe two drugs wherein exposure to ethanol alters the response tococaine (Bernier et al., 2011; Mierzejewski et al., 2003); even ratsthat prefer ethanol are more sensitive to the reinforcing effects ofcocaine self-administered to the brain (Katner et al., 2011).

Subchronic and chronic treatment with naltrexone reducedoperant ethanol self-administration. The reason naltrexone wastotally ineffective in the presence of cocaine remains unclear. Onereasonable explanation is that the neurobiological changes inducedby cocaine overcome those induced by naltrexone. Naltrexoneexhibits an affinity 10e25 times higher for the mu opioid receptorsthan for the kappa or delta receptors (Mannelli et al., 2011). Theactivation of mu opioid receptors indirectly causes excitatory effectsin dopaminergic neurons by inhibiting the release of the inhibitoryneurotransmitter GABA in critical brain areas regulating euphoriaand reward (Corbett et al., 2006; Guy et al., 2011; Nestler, 2001).Consequently, naltrexone blocks the activation of mu opioid recep-tors by ethanol as well as the synthesis and release of endogenousopioids induced by ethanol (Herz, 1997). In contrast, cocaine directlyincreases the extracellular levels of dopamine in brain-rewardingareas by two main mechanisms: inhibiting the dopaminergictransporter and enhancing its exocytotic release (Venton et al.,2006). This abundant release of dopamine is followed by theincreased production of genetic transcription factors, which causessynaptic modifications such as dendrite sprouting and other intra-cellular changes to explain short- and long-term behavioural effects(Nestler, 2005). Therefore, it seems that the cocaine-induced neu-roadaptations were unaffected by naltrexone treatment.

4.3. Naltrexone fails to block cocaine-induced locomotor activity

We can conclude that we replicated previous findings showingthat cocaine increases locomotor activity (Ago et al., 2008). Thisoccurred even in the absence of a context-dependent sensitisation(Mattson et al., 2008; Weiss et al., 1989) as far as the animals weretested only once on the locomotor apparatus. Despite the fact thatnaltrexone can attenuate amphetamine-induced conditionedlocomotor sensitisation (Häggkvist et al., 2011), it did not altercocaine-induced locomotor activity. This fact agrees with otherreports (e.g., Smith et al., 2009), and our interpretation is thatcocaine-induced neuroadaptations are minimally affected bynaltrexone treatment.

4.4. Operant ethanol self-administration regulates the expression ofimmediate-early C-fos and COX-2 genes in the rat prefrontal cortex

The expression of the C-fos gene in the prefrontal cortex wassignificantly reduced in all the groups of animals following ethanol

111

operant self-administration except for the group treated with thelowest dose of cocaine. Because C-fos is considered a marker ofbrain activation that demarcates neuronal populations undergoinglong-term changes in function (Bia1y and Kaczmarek, 1996; Morganand Curran, 1991), our results suggest that there is an abnormalfunctioning of the prefrontal cortex during the time the animal isplaced in the ethanol operant chamber. This has important impli-cations. The prefrontal cortex sends neural projections to thenucleus accumbens and the ventral tegmental area, providingfeedback and controlling these areas of the brain (Feil et al., 2010;López-Moreno et al., 2008). A loss of this feedbackwould impair theability to overcome drives to obtain pleasure through unsafeactions (Kosten and George, 2002) and would make weighingoptions and self-control difficult (Nestler, 2005). Intriguingly, theconditioned stimulus-induced reinstatement of extinguishedethanol seeking in rats has been associated with increased C-fosexpression within the prefrontal cortex that is not attenuated bynaltrexone treatment (Dayas et al., 2007). These results stronglysuggest that changes in C-fos expression within the prefrontalcortex are a useful biomarker of the behavioural phenotype ofethanol addiction.

One of our more interesting findings was that the expression ofthe COX-2 gene was altered. Operant ethanol self-administrationincreased its expression up to four-fold. Because the animalswere sacrificed at the point at which they would have been re-introduced into the operant chambers on day 15, it could behypothesised that COX-2 over-expression is associatedwith ethanolcraving. The following evidence in the literature would not supportthis hypothesis: (a) the COX-2 gene contributes to synapse-specificplasticity; it is a major mediator of inflammation, and it is over-expressed in many types of cancer (Aparicio-Gallego et al., 2007;Harper and Tyson-Capper, 2008; Kubik et al., 2007; Lanahan andWorley, 1998); and (b) previous reports have shown that chronicethanol consumption increases COX-2 mRNA levels in the hippo-campus (Simonyi et al., 2002), the liver (Nanji et al., 1997) and thecerebral cortex of rats (Vallés et al., 2004), participating in theresponse to oxidative stress and ethanol-induced inflammation.Therefore, our results suggest that the over-expression of the COX-2gene may be associated with ethanol-induced neurotoxicity and isa consequence of ethanol exposure rather than a cause of ethanolintake. This is the first report to show that operant ethanol self-administration can modulate the activity of this gene. However,further studies are required to investigate why every treatment,cocaine, naltrexone and their combined administration, blockedthe ethanol-induced over-expression of the COX-2 gene. Currently,no study is exploring whether cocaine or naltrexone modulates theexpression of this gene.

4.5. Final comments

The present work provides support for three ideas. First, ourresults, derived from an experimental set-up designed to maximiseits predictive validity in humans, suggest that pharmacologicaltreatment with naltrexone for alcoholism may be impaired whencocaine is co-administered. Second, our data reveal that dailychronic operant ethanol self-administration is associated withdramatic changes in gene expression in the rat prefrontal cortex.Third, naltrexone failed to block the ethanol-induced alterations ofC-fos and COX-2 gene expression. It would be of great interest tofind a genetic biomarker of neural activation that could predict thebehavioural efficacy of a pharmacological treatment for alcoholism.

Statement of interest

None.

V. Echeverry-Alzate et al. / Neuropharmacology 63 (2012) 927e935934 RESULTADOS

Acknowledgements

This work was supported by the Fondo de Investigación Sani-taria (Red de Trastornos Adictivos, RD06/0001/0011 to J.A.L.M andRD06/0001/0001 to F.R. de F.), the Ministerio de Sanidad y Con-sumo (Plan Nacional Sobre Drogas, PR61/08-16415, to J.A.L.M.), theMinisterio de Ciencia e Innovación (SAF2008-03763 and SAF2011-26818 to J.A.L.M., and SAF2004-06263-C02-02 to A.S.), and theGrupo de Investigación “Psicofarmacología de la Adicción” UCM-Banco Santander (Group 940157) to JALM. English editing wasdone by Elsevier Language Editing Services.

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ARTÍCULO 2

Echeverry-Alzate et al., 2014. Effects of topiramate on ethanol-cocaine

interactions and DNA methyltransferase gene expression in the rat prefrontal

cortex. Br J Pharmacol. 171(12):3023-36.

Impact Factor (2014): 4.842

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RESEARCH PAPER

Effects of topiramate onethanol-cocaine interactionsand DNA methyltransferasegene expression in the ratprefrontal cortexV Echeverry-Alzate1, E Giné2, K M Bühler1, J Calleja-Conde1, P Olmos1,3,M A Gorriti1, R Nadal4, F Rodríguez de Fonseca5 and J A López-Moreno1

1Department of Psychobiology, School of Psychology, Campus de Somosaguas, Complutense

University of Madrid, Madrid, Spain, 2Department of Cellular Biology, School of Medicine,

Complutense University of Madrid, Madrid, Spain, 3C.I.E.M.A.T, Madrid, Spain, 4Psychobiology

Unit, School of Psychology, Universitat Autònoma de Barcelona, Barcelona, Spain, and5Fundación IMABIS, Laboratorio de Medicina Regenerativa, Hospital Regional Universitario

Carlos Haya, Málaga, Spain

CorrespondenceJose Antonio López-Moreno,Laboratorio de Psicobiología,Departamento de Psicobiología,Facultad de Psicología, CampusSomosaguas, UniversidadComplutense de Madrid, MadridE-28223, Spain. E-mail:jalopezm@psi.ucm.es----------------------------------------------------------------

Keywordsoperant ethanolself-administration; Dnmt1corepressors; histonedeacetylase-2; dual dependence;DNA methyltransferases;addiction; gene expression----------------------------------------------------------------

Received18 August 2013Revised27 January 2014Accepted1 February 2014

BACKGROUND AND PURPOSERecent and ongoing clinical studies have indicated that topiramate (Topamax®) could be effective in treating ethanol orcocaine abuse. However, the effects of topiramate on the co-administration of ethanol and cocaine remain largely unknown.

EXPERIMENTAL APPROACHWe studied the effects of topiramate, in Wistar rats, on operant ethanol self-administration with the co-administration ofcocaine (i.p.). The psychomotor effects of topiramate were examined before ethanol self-administration and cocaine exposure.Blood samples were collected to analyse ethanol and cocaine metabolism (blood ethanol levels and benzoylecgonine).Quantitative real-time PCR was used to characterize the gene expression in the prefrontal cortex.

KEY RESULTSTopiramate prevented the cocaine-induced increased response to ethanol in a dose-dependent manner without causing anymotor impairment by itself. This effect was observed when topiramate was administered before ethanol access, but not whentopiramate was administered before the cocaine injection. Topiramate did not block cocaine-induced psychomotorstimulation. Topiramate reduced blood ethanol levels but did not affect cocaine metabolism. Ethanol increased the geneexpression of DNA methyltransferases (Dnmt1 and Dnmt3a), the corepressor Dnmt1-associated protein 1 (Dmap1), and theRNA methyltransferase Trdmt1. These effects were prevented by topiramate or cocaine. Gene expression of histonedeacetylase-2 and glutamate receptor kainate-1 were only increased by cocaine treatment. Topiramate and cocaineco-administration caused an up-regulation of dopamine (Drd1, Th) and opioid (Oprm1) receptor genes. Topiramate showed atendency to alter episodic-like memory.

CONCLUSIONS AND IMPLICATIONSTopiramate is an effective inhibitor of the cocaine-induced increase in operant ethanol self-administration.

AbbreviationsCa2, Ca4, carbonic anhydrase enzymes types II and IV; DMAP1, DNA methyltransferase 1-associated protein; DNMT1,DNA methyltransferase; Grik1, kainate receptor gene containing the GluK1 subunit; HDAC2, histone deacetylase-2;TRDMT1, tRNA aspartic acid methyltransferase 1

BJP British Journal ofPharmacology

DOI:10.1111/bph.12636www.brjpharmacol.org

British Journal of Pharmacology (2014) 171 3023–3036 3023© 2014 The British Pharmacological Society 117

RESULTADOS

IntroductionTopiramate (Topamax, Janssen-Cilag S.A., Madrid, Spain) is asulphamate that was discovered by Maryanoff and Gardockithrough a model-based screening procedure, and was pat-ented by McNeil Laboratories, Inc. in 1983 (Maryanoff andGardocki, 1985; Tatum et al., 2009). Work in animal models(mice and cats) revealed that topiramate has potent anticon-vulsant activity, and this drug was approved by the Food andDrug Administration (FDA) for the treatment of epilepsy in1996 (Maryanoff et al., 1987; Nakamura et al., 1993; FDA,1996). Topamax has also been approved for the prevention ofmigraine headaches in adults (FDA, 2012). Although themechanism of action of topiramate is not fully understood,many results have indicated that this drug inhibits carbonicanhydrase enzymes types II and IV, which interact withdiverse ion channels by either enhancing ion channel activ-ity, as in GABAA receptors (for receptor nomenclature seeAlexander et al., 2013b), or reducing ion channel activity, asin voltage-activated Na+ channels, Ca2+ channels and AMPA/kainate (but not at NMDA) receptors (see Johnson, 2005, fora review). Recently, it has been demonstrated that topiramatebinds selectively to kainate receptors containing the GluK1subunit (Braga et al., 2009).

Currently, there are ongoing clinical trials to determinewhether topiramate is effective in the treatment of ethanolabuse, cocaine abuse, or the dual dependence of ethanol andcocaine (ClinicalTrials.gov, US NIH, 2009). Topiramate hasbeen shown to reduce ethanol consumption in Wistar ratsusing two-bottle choice tests (Knapp et al., 2007); it reducedthe motivation to lick for beer (Hargreaves and McGregor,2007) and attenuated the withdrawal signs after chronicintermittent ethanol treatment (Cagetti et al., 2004). Effectsof topiramate on ethanol intake have also been demonstratedin rats that were selectively bred for high ethanol preferenceand in mice (Nguyen et al., 2007; Breslin et al., 2010;Zalewska-Kaszubska et al., 2013). However, little is knownabout the effects of topiramate on operant ethanol self-administration in rats. Most of the evidence about the effectsof topiramate on cocaine abuse comes from clinical studies inwhich topiramate reduced the reinforcing effects and crav-ings induced by cocaine in non-treatment-seeking researchvolunteers (Johnson et al., 2013); reduced the craving inten-sity and duration during outpatient treatment for cocainedependence (Reis et al., 2008); and increased the probabilityof cocaine abstinence compared with placebo-treated subjects(Kampman et al., 2004). These results contrast with previouspreclinical studies in which rats and mice treated with topira-mate did not exhibit a decrease in the response to cocaine (LeFoll et al., 2008). Also topiramate was found to be ineffectiveat preventing cocaine-induced clonic seizures (Gasior et al.,1999).

Currently, many authors are considering epigenetic expla-nations for drug addiction (see Robison and Nestler, 2011, fora review). The hypothesis is that drugs of abuse, such asethanol and cocaine, alter the two key epigenetic mecha-nisms that control gene expression: histone modifications(such as acetylation, methylation and phosphorylation) andDNA methylation patterns. Methyltransferases are enzymesthat transfer methyl groups onto DNA or RNA, and in manycases, methyltransferases recruit corepressor complexes for

repressing gene transcription. For example, DNA methyl-transferase DNMT1 binds to histone deacetylase-2 (HDAC2)and DNA methyltransferase 1-associated protein (DMAP1),which act as corepressors of gene transcription (Rountreeet al., 2000). In addition, the maintenance of genomic meth-ylation patterns are related to the ability of DNMT1 to bind toPCNA and the ability of ubiquitin-like Pleckstrin homologydomain and ring finger domains 1 (UHRF1) to target DNMT1(Schermelleh et al., 2007; Hervouet et al., 2010; Liu et al.,2013; Schneider et al., 2013). Recent studies have shown thatDNMT1 gene expression is associated with alcohol-relatedbehaviours (Botia et al., 2012; Warnault et al., 2013), but theassociation of this gene with cocaine remains unknown.

The aims of this study were (i) to determine the effects oftopiramate on operant ethanol self-administration with theco-administration of cocaine and (ii) to investigate whetherthese effects were paralleled with changes in the expression ofDNA/RNA methyltransferases, of key Dnmt1 corepressor com-plexes, and of topiramate proteins targets. Additionally, weassessed the expression of key genes involved in dopaminer-gic (Drd1, Drd2 and Th) and opioid neurotransmission(Oprm1), which are related directly to the rewarding effects ofethanol and cocaine.

Methods

SubjectsNinety-six male Wistar rats (Harlan, Barcelona, Spain), weigh-ing 275–325 g at the start of the experiments, were housed ingroups of four per cage in a temperature- and humidity-controlled environment (21 ± 2ºC, 60% relative humidity) ona 12 h reverse light/dark cycle (lights off at 0700 h). The sameanimals were used throughout the experiments. Seventy-onerats had access to ethanol and 25 only had access to saccharinin the operant self-administration procedures. An additionalgroup of 32 rats was used to evaluate the effects of topiramateon episodic-like memory. That is, a total of 128 rats were usedin this study. Experimental sessions were performed duringthe dark phase. Food and water were available ad libitumexcept as specified later. All research was conducted in strictadherence to the European Directive 2010/63/EU (EU 2010/63/EU) on the protection of animals used for scientific pur-poses. The Ethics Committee of the Faculty of Psychology ofthe Complutense University of Madrid approved the study.All studies involving animals are reported in accordance withthe ARRIVE guidelines for reporting experiments involvinganimals (Kilkenny et al., 2010; McGrath et al., 2010). Allefforts were made to minimize animal suffering and to reducethe number of animals used.

Drugs and general procedures forpharmacological treatmentsEach day, a 10% ethanol v v-1 solution was prepared from99% ethanol (Alcoholes Aroca, S.L., Madrid, Spain). Cocainehydrochloride (Sigma-Aldrich, S.L., Madrid, Spain) was dis-solved in physiological saline and injected i.p. at a volumeof 1 mL·kg−1. Cocaine-control animals were injected withsaline. Cocaine doses are expressed as the salt. Topiramate(2,3:4,5-bis -O-(1-methylethylidene) -beta-D-fructopyranosesulphamate; prepared as Topamax dispersible capsules,

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Janssen-Cilag, S.A., Madrid, Spain) was dissolved in 25%β-cyclodextrin (Sigma-Aldrich) and was administered p.o. at avolume of 3 mL·kg−1. Topiramate-control animals received asolution of 25% β-cyclodextrin in equivalent proportions tothe animals treated with topiramate.

Throughout all of the experiments, cocaine was injectedi.p. 6 h after the operant ethanol self-administration sessions.We followed this schedule to avoid cocaine-induced place-conditioned motor sensitization and motor hyperactivityin the operant ethanol chambers (Antoniou et al., 1998;Stromberg and Mackler, 2005). The dose of cocaine waschosen based on previous studies done under similar experi-mental conditions, where 20 mg·kg−1 cocaine resulted ina robust increase in operant ethanol self-administration(Echeverry-Alzate et al., 2012).

Topamax was administered (p.o.) at different timesdepending on the experiment, but was generally adminis-tered 120 min before ethanol/cocaine administration becausethe peak plasma concentration occurs approximately 2 hafter an oral dose [FDA, 1995; AEMPS (Spanish Agency forMedicines and Health Products), 2012]. The rats were notdeprived of food before Topamax treatment because theabsorption of topiramate is independent of food intake (FDA,1995; AEMPS, 2012). The doses of Topamax were chosenbased on previous studies in rats that investigated the effectsof topiramate on ethanol-related behaviours (Hargreaves andMcGregor, 2007; Zalewska-Kaszubska et al., 2007; Breslinet al., 2010; Lynch et al., 2011). The administration route andthe use of a marketed drug (Topamax) were chosen tostrengthen the ecological validity of the study, because thesemost closely resemble the situation for human patients.

Ethanol self-administration andmotor experimentsApparatus and procedure. The operant ethanol sessions wereconducted in eight modular chambers enclosed in sound-proof cubicles (Med Associates, Inc., St. Albans, VT, USA). Theexhaust fans were inactivated because the fans increased therate of ethanol evaporation. The chambers were equippedwith two retractable levers located 7 cm above a grid floor oneither side of a drinking reservoir positioned in the centre ofthe front panel of the chamber and 4 cm above the grid floor.The levers were counterbalanced to respond as the activelever (delivering 0.1 mL) or as the inactive lever. As far assome animals press the levers two/three times to obtain therewarding solution, the contents of the stainless dipper wereaccessible to the animal until the next lever press, at least2.5 s later, to avoid measuring dipper presentations (rewards)as lever presses. It did not use light or sound as stimuli.

Training was conducted using a modification of themethods described by Alén et al. (2009). Briefly, the rats wereplaced on a restricted water intake schedule for 11 h rangingfrom 2 to 4 days to facilitate the training in lever pressing.The length of the water restriction was dependent upon therate of learning of the animal, 4 days being the highestnumber of days water intake was restricted. After this period,for the rest of the experiment, the animals had access to foodand water ad libitum. During the first 4 days of training,animals received a 1% w v-1 saccharin solution (Sigma-Aldrich) in the dipper. Thereafter, the following sequence wasused on a fixed-ratio 1 schedule of reinforcement: 0.2% sac-

charin for three sessions, 0.2% saccharin and 0.2% ethanolfor three sessions, 0.16% saccharin and 2% ethanol for threesessions, 0.12% saccharin and 4% ethanol for three sessions,0.08% saccharin and 6% ethanol for three sessions, 0.04%saccharin and 8% ethanol for three sessions, 0.02% saccharinand 10% ethanol for three sessions, and 10% ethanol for theremaining sessions. Twenty animals that had access to sac-charin only and did not receive any pharmacological treat-ment during the study were used as the control group for thegenetic expression experiments (the calibrator group – i.e. thenon-ethanol-treated group). The baseline corresponded tothe average number of ethanol responses obtained on thefinal 3 days before the first experiment in which the numberof responses varied by 15% or less. Animals that did not reachat least 20 ethanol responses during the baseline period wereomitted for the experiments (n = 11). All the operant ethanolsessions lasted 30 min under a fixed-ratio 1 schedule 7 days aweek for the entire study.

The locomotor activity of the rats was assessed using sixcustom-made 40 × 35 × 35 cm rectangular boxes, and theboxes were equipped with eight photocells arranged in twolines (4 and 8 cm above the floor) that detected the locomo-tor activity as beam breaks.

Ethanol and benzoylecgonine analysisTo determine blood ethanol concentrations, 250 μL of bloodwas collected from the rat tail vein into a capillary tube(Microvette® CB 300 K2E, Sarstedt AG & Co, Nümbrecht,Germany) that contained EDTA dipotassium salt. The wholeblood was centrifuged for 15 min at 1500× g using a refriger-ated centrifuge, and the plasma was stored at −20°C until use.The ethanol concentration was measured using the Enzy-Chrom ethanol assay kit following the protocol recom-mended by the manufacturer (Bioassay Systems, Hayward,CA, USA). All measurements were performed in duplicate. Seeexperiment 3 later for further details.

Benzoylecgonine, a main metabolite of cocaine, wasmeasured in blood using the Cocaine Metabolite Direct ELISA

Benzoylecygonine Assay Kit, following the manufacturer’sinstructions (Bio-Quant, Heidelberg, Germany). Approxi-mately 400–450 μL of blood from the rat trunk at themoment of killing (by decapitation) was collected in VACUT-EST tubes (Vacutest Kima S.r.l., Arzergrande, Italy) thatcontain K3 EDTA. Following, plasma was obtained asdescribed earlier and stored at −20°C until use. See experi-ment 3 later for further details.

Test of novel object recognitionObject recognition memory was assessed in the six custom-made 40 × 35 × 35 cm rectangular boxes described earlierlocated in a dimly lit room (20 luxes). All the sessions weremonitored by a video camera above the apparatus. One set oftest objects was made of dark red glass (18 × 8 × 4.5 cm) andthe second set of objects was made of steel (22 × 6 × 6 cm).Sessions were carried out following the protocol describedby Ennaceur et al. (2005). On day 1 (habituation session),each rat was exposed to one box individually for 10 minto habituate to the test environment. On day 2 (samplesession), rats were placed in the box and given 3 min toexplore two identical sample objects. Following, the rats wereremoved from the box and returned to their cages for 15 min

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(retention interval). Then, rats were placed in the same boxwith one familiar and one novel object (counterbalancedacross rats) and given 3 min to explore the objects (testsession). An experimenter who was blind to the experimentaltreatments scored the time the rats spent exploring eachobject, the latency of first approach to explore them and thefrequency of approach. It was considered a valid objectapproach any directed contact with the mouth, nose or pawnot including accidental contacts such as backing into theobject (Bevins and Besheer, 2006).

Real-time quantitative PCR experimentsReal-time quantitative PCR, which has been described as oneof the most powerful tools to quantify gene expression(Schmittgen and Livak, 2008), was performed using a Light-Cycler 480-II machine (Roche, Barcelona, Spain) with SYBRGreen Real-time qPCR master mix (Applied Biosystems, War-rington, UK) and specific primers at 300 nm concentrations(see Table 1). The melting curves analysis showed only asingle clear peak, and the sizes of the PCR products wereconfirmed by agarose gel electrophoresis. A 10-fold dilutionseries of the template was used to amplify each gene tovalidate the efficiency of each assay and to confirm that theamplification efficiencies of the target and reference geneswere comparable (indicated by a near-zero slope value forboth the target and reference genes). The 18S ribosomal RNAgene was used as an internal control for normalization. Thesaccharin-vehicle group (the non-ethanol-treated group) wasused as a calibrator (non-treated group, n = 20 after discardingthe five more high extreme saccharin responses), and the2–ΔΔCT method was used to analyse the expression data(Schmittgen and Livak, 2008).

The animals were killed by decapitation immediatelybefore the ethanol self-administration session (after chronictopiramate treatment). The prefrontal cortex, including thefrontal association cortex and the more rostral/anteriorregions of the lateral-ventral-dorsal-medial areas of theorbital cortex, prelimbic cortex and secondary motor cortex(Paxinos and Watson, 1998) were immediately dissected onice, and were quickly frozen on dry ice at −80°C. Total RNAwas isolated using Tripure Isolation Reagent (Roche) and wasstored at −80°C. One microgram of total RNA was reversetranscribed into cDNA using the Transcriptor First StrandcDNA Synthesis Kit (Roche).

Experimental designExperiment 1: the effects of increasing the dose of topiramate onthe response to ethanol and co-administration of cocaine. Here,we aimed to establish a dose–response curve for topiramate(2.5–40 mg·kg−1) on operant ethanol self-administration andcocaine co-administration (i.p.) (Figure 1A). Because topira-mate often causes uncomfortable CNS side effects, such assedation, and according to the dosage and topiramate admin-istration protocols in clinical studies (Kampman et al., 2004;ClinicalTrials.gov, US NIH, 2009), the doses of topiramatewere progressively increased every 3 days, and each dose wasdivided into two doses (morning and afternoon dosing).Before the pharmacological treatments, the animals werematched and distributed among groups according to thenumber of ethanol responses exhibited at baseline.

To discard any of the sedative effects of topiramate fromthe highest doses, which could confound the results of theoperant ethanol self-administration, we monitored the loco-motor activity of the animals for 30 min before the animalsgained access to the operant ethanol chambers (Figure 1B).The locomotor activity was examined in 5-min periods in asingle assay, and the animals were fully counterbalanced.

Experiment 2: the effect of topiramate on the behavioural effects ofcocaine. We conducted experiment 2 after a washout periodof 3 days from experiment 1. This experiment was conductedto investigate whether the preventative effects of topiramateon the cocaine-induced increase in responses to ethanolcould be determined at the moment of topiramate adminis-tration before cocaine injection or before ethanol self-administration (Figure 2A). In the first case, before cocaineinjection, it might be assumed that topiramate would blockthe acquisition of the effects of cocaine on the response toethanol, whereas in the second case, before ethanol self-administration, it may be assumed that topiramate wouldblock the expression of the effects of cocaine on the responseto ethanol. Therefore, the animals were treated with a dose of40 mg·kg−1 (p.o.) topiramate, which was found, in experi-ment 1, to be the most effective dose at preventing theincrease in ethanol responses induced by cocaine andwithout motor impairment. In experiment 1, each dose wasdivided into two (morning and afternoon dosing). In experi-ment 2, topiramate was given either 120 min before thecocaine injection or 120 min before the operant ethanolsession for 3 consecutive days. We used four group of rats (n= 9–11), that they were fully counterbalanced; one groupreceived the topiramate treatment before cocaine injectionfor 3 days and the other received the topiramate beforeethanol access for another 3 days. There was a washout periodof 3 days between treatments. Thus, all animals were treatedwith topiramate before cocaine and before ethanol, but in adifferent order, except the vehicle group that was nevertreated with either topiramate or cocaine.

In addition, we examined the effects of topiramate on thecocaine-induced psychostimulant motor activity (Figure 2B);120 min after the administration of topiramate, the animalswere treated with cocaine and were introduced immediatelyinto the locomotor activity apparatus for 30 min. The activityof the animal was monitored in 5-min periods. The locomo-tor activity was examined in a single assay, and the animalswere fully counterbalanced.

Experiment 3: the effects of chronic treatment with topiramate onthe response to ethanol, the metabolism of cocaine and bloodethanol levels. We conducted experiment 3 after a washoutperiod of 3 days from experiment 2. To study the effects ofchronic treatment with topiramate on responses to ethanoland according to the results from the previous experiments,we decided to treat the animals with topiramate (40 mg·kg−1,p.o.) 120 min before operant ethanol self-administration for8 consecutive days (Figure 3A). Additionally, we expectedthat with this chronic treatment regimen, we would be ableto highlight the differences among groups for the ethanol/cocaine blood analysis and the subsequent genetic expressionexperiments. Blood for the analysis of ethanol was collectedfrom the tail of the rats immediately after the operant ethanol

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RESULTADOS

self-administration session 2 days before they were killed.Blood for the analysis of the cocaine metabolite benzoylecgo-nine was collected from the rat trunk immediately beforeoperant ethanol self-administration as they were killed.

Experiment 4: the effects of chronic topiramate treatment on thegene expression in the rat prefrontal cortex. The goal of thisexperiment was to investigate the changes in gene expressionin the prefrontal cortex associated with our behaviouralresults (Figure 4A–E). For this purpose, we assessed the geneticexpression of: (i) two DNA methyltransferases (Dnmts),Dnmt1 and Dnmt3a, which methylate DNA; (ii) The RNAmethyltransferases Trdmt1 (formerly known as Dnmt2) andRnmt enzymes, which methylate tRNA and mRNA, respec-tively; (iii); the proteins that form Dnmt1 corepressor com-plexes, Hdac2, Dmap1, Pcna and Uhrf1, which are described inthe Introduction; (iv) key protein receptors targeted bytopiramate, which include the kainate receptor containingthe GluK1 subunit (Grik1) and the carbonic anhydraseenzymes types II and IV (Ca2 and Ca4); and (v) proteins thatregulate importantly the function of the reward system: thedopamine D1 and D2 receptors (for nomenclature see

Alexander et al., 2013a), the tyrosine hydroxylase enzymeand the μ-opioid receptor.

We focused on the prefrontal cortex because of its contri-bution to addictive behaviour (Lüscher and Malenka, 2011),the involvement in regulating cognitive behaviour in rodentsand in humans (Dayas et al., 2007; Vengeliene et al., 2009;Abernathy et al., 2010), and the susceptibility to the effects oftopiramate on genetic expression (Navarrete et al., 2012).

Experiment 5: effects of topiramate on episodic-like memory. Astopiramate has an effect on cognition in humans (e.g.Sommer et al., 2013), we decided to investigate its effect onepisodic memory. With this aim, we used the novel objectrecognition test, which has been proven useful for evaluatingthis type of declarative memory in animal models (Winterset al., 2008). A group of 32 rats were divided as follows: (i)chronic group, which received every 3 days an increasingdose of topiramate p.o. (10, 20, 30 and 40 mg·kg−1), dividedinto two doses (morning and afternoon dosing) as describedin experiment 1; and (ii) acute and (iii) vehicle groups, whichfollowed the same experimental manipulations as thechronic group but were treated with vehicle. Then, on the

Figure 1The effects of increasing the dose of topiramate on the response to ethanol and co-administration of cocaine. The doses of topiramate wereprogressively increased every 3 consecutive days, and each dose was divided into two doses (morning and afternoon dosing). During the morning,topiramate was administered 120 min before access to ethanol. During the afternoon, topiramate was administered 120 min after cocaineadministration. (A) The mean ± SEM of the operant responses for 10% v v-1 ethanol averaged over 3 days (n = 9–11 per group). *P < 0.05compared with the vehicle group; #P < 0.05 and ##P < 0.01 compared with 30/40 mg·kg−1 of topiramate. (B) Motor activity. Mean ± SEM of theaccumulated beam breaks observed for 30 min before the operant ethanol self-administration session. There were no significant differencesbetween the groups.

BJP V Echeverry-Alzate et al.

3028 British Journal of Pharmacology (2014) 171 3023–3036 122

RESULTADOS

13th day, whereas the chronic and acute groups were treatedwith topiramate 40 mg·kg−1 120 min before the novel objectrecognition test (sample session), the vehicle group wastreated with vehicle.

Statistical analysisThe Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) statisticalsoftware package (version 20.0) for Windows (SPSS, Inc.,Chicago, IL, USA) was used for all statistical analyses. Thedata from experiment 1 were analysed using a three-wayANOVA [increasing the doses (×4) or the time intervals (×6) asthe within-subject factors and drug treatments (×2) as thebetween-subject factors]. The results from experiment 2 wereanalysed using a two-way ANOVA (with order and drug treat-ment as the between-subject factors). The motor data wereanalysed using a two-way ANOVA [with time intervals (×6) asthe within-subject factor and the drug treatment as thebetween-subject factor]. The results from experiment 3,chronic topiramate treatment, were analysed using a one-wayANOVA (with drug treatment as the between-subject factor).

To test the relationship between blood ethanol levels andethanol reinforcement, Pearson’s correlation coefficient wasused. The effects of topiramate on cocaine metabolites andblood ethanol levels were analysed using a one-way ANOVA.The data from experiment 4 were analysed using a one-wayANOVA (with the drug treatment as the between-subjectfactor). Here, Bonferroni’s correction for multiple testing wasapplied, and only P-values ≤ 0.01 were considered statisticallysignificant. The data from experiment 5 were analysed usinga two-way ANOVA (with old/new object and drug treatmentas the between-subject factors).

Results

Experiment 1: the effects of increasing thedose of topiramate on the response to ethanoland co-administration of cocaineThe ANOVA and post hoc data analyses indicated that topira-mate did not reduce the response to ethanol, that cocaine

Figure 2The effect of topiramate on the behavioural effects of cocaine. (A) A single dose of topiramate was administered either 120 min before the operantself-administration session or 120 min before the cocaine injection. Mean ± SEM operant responses for 10% v v−1 ethanol was averaged over threedays (n = 9–11 per group). ##P < 0.01 compared with the two cocaine-groups (20 mg·kg−1). *P < 0.05 compared with the group treated withtopiramate before cocaine injection. Only topiramate before ethanol was effective at reducing cocaine-induced responses to ethanol. (B) Motoractivity. Mean ± SEM of the accumulated beam breaks for the 30 min after cocaine injection. Topiramate was administered 120 min before thecocaine injection. *P < 0.05 and ***P < 0.001 compared with the either the vehicle or the topiramate 40 mg·kg−1 group.

BJPThe effects of topiramate on EtOH-cocaine interactions

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RESULTADOS

(20 mg·kg−1, i.p.) increased the responses to ethanol, and thattopiramate blocked the cocaine-induced increase on theresponse to ethanol in a dose-dependent manner [topiramateF(3,162) = 4.91, P < 0.005; cocaine F(1,54) = 6.57, P < 0.05;interaction F(3,162) = 3.34, P < 0.05], as shown in Figure 1A.There were no significant differences in the activity towardsthe inactive lever. Additionally, the effects of cocaine onoperant ethanol self-administration were shown afterrepeated injections (7–9th days).

The locomotor activity of the animal was monitoredduring the 30 min prior to the introduction into the operantethanol self-administration chamber. Figure 1B shows thatthere were no significant depressant/stimulant effects oftopiramate among groups throughout this 30-min period[cocaine F(2,54) = 0.32, not significant (NS); topiramateF(2,54) = 0.49, NS]. These experiments allowed us to select the

dose of 40 mg·kg−1 of topiramate for future experiments anddiscard the two groups of rats treated with the 10 mg·kg−1

dose of topiramate.

Experiment 2: effects of topiramate oncocaine’s behavioural effectsFigure 2A shows that topiramate administration prior to thecocaine injection failed to reduce the higher response rates toethanol induced by cocaine. However, topiramate adminis-tration 120 min before ethanol access fully prevented thecocaine-induced higher response rates for ethanol [treatmentF(3,72) = 9.22, P < 0.001; order F(1,72) = 4.02, P < 0.05;interaction F(3,72) = 1.04, NS].

We also evaluated the effects of topiramate on cocaine-induced psychostimulant motor activity. Figure 2B shows

Figure 3The effects of chronic topiramate treatment on the response to ethanol, cocaine metabolism and blood ethanol levels. (A) Mean ± SEM operantresponses for 10% v v−1 ethanol averaged over 8 consecutive days (n = 9–11 per group). **P < 0.01 compared with the cocaine group(20 mg·kg−1). (B) Scatter plot of reinforcements obtained by the rats during the 30 min ethanol session and blood ethanol levels (mg%)determined immediately after this test session. Reinforcements were significantly correlated with the blood ethanol levels. (C) Topiramateadministered 120 min before the operant self-administration reduced the blood ethanol level (mg%) independently of cocaine treatment. ***P< 0.001 compared with the cocaine group (20 mg·kg−1). #P < 0.05 and ##P < 0.01 compared with the vehicle group. (D) Benzoylecgonine(ng·mL−1) was examined 18 h after the last cocaine administration and after alcohol self-administration. Topiramate did not change themetabolism of the cocaine.

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RESULTADOS

Figure 4The effects of chronic treatment with topiramate on gene expression in the rat prefrontal cortex. Mean ± SEM the relative fold change using the2ΔCt method (see Methods section). The 18S ribosomal RNA gene was used as an internal control for the normalization and gene expression ofthe operant saccharine self-administration group, which was used as the control (calibrator). (A) Ethanol increased the expression of the DNAmethyltransferase genes, and topiramate or cocaine blocked this effect. (B) No changes were observed in the expression of carbonic anhydraseenzymes type II and IV (Ca2 and Ca4), but cocaine increased the gene expression of the kainate receptor containing the GluK1 subunit (Grik1).(C) Dnmt1 DNA methyltransferase corepressors showed heterogeneous results. Gene expression of Hdac2 increased after cocaine treatment, andDmap1 increased after ethanol self-administration. (D) Ethanol increased the gene expression of the enzyme that methylates tRNA (Trdmt1,formerly known as Dnmt2). (E) The co-administration of topiramate and cocaine increased Drd2, Th and Oprm1 gene expression and cocaine aloneincreased the Oprm1 gene expression. *P < 0.01 compared with the saccharine-control group. #P < 0.01 compared with the ethanol group. &P< 0.01 compared with the topiramate + cocaine group.

BJPThe effects of topiramate on EtOH-cocaine interactions

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RESULTADOS

that cocaine caused a robust increase in the locomotor activ-ity of the animal, and administering topiramate 120 minbefore the cocaine injection was not able to prevent thisincrease and did not show any effect on the spontaneouslocomotor activity [treatment F(3,37) = 16.94, P < 0.001; timeF(5,185) = 161.83, P < 0.001; interaction F(15,185) = 16.32, P< 0.001].

Experiment 3: the effects of chronic treatmentwith topiramate on the response to ethanol,cocaine metabolism and blood ethanol levelsAs expected from the previous experiments, the chronic treat-ment with topiramate 120 min prior to the operant ethanolself-administration session fully prevented the increasedresponse to ethanol induced by cocaine (Figure 3A). However,chronic topiramate treatment failed to significantly reducethe ethanol response by itself, without cocaine [drug treat-ment F(3,39) = 13.39, P < 0.001].

We found a positive correlation between the bloodethanol levels and the number of ethanol reinforcementsreceived by the animals (Figure 3B) (r = 0.48, P < 0.005). Theblood ethanol levels were significantly different as a functionof the treatment group: topiramate either alone or inco-administration with cocaine reduced the ethanol concen-tration in the blood, and cocaine alone did not produce anysignificant change (Figure 3C) [drug treatment F(3,39) =15.04, P < 0.001].

Benzoylecgonine, one of the two primary metabolites ofcocaine, was detected approximately 18 h after the lastcocaine administration (Figure 3D) [drug treatment F(3,36) =59.75, P < 0.001]. However, topiramate did not change themetabolism of cocaine, and the benzoylecgonine levels weresimilar in the group only treated with cocaine and in thetopiramate-cocaine group.

Experiment 4: the effects of chronictopiramate treatment on gene expression inthe rat prefrontal cortexFigures 4A and 5 show that operant ethanol self-administration caused an increase in the expression of DNAmethyltransferases, and this effect was prevented by eithertopiramate or cocaine [FDnmt1 (4,56) = 12.95, P < 0.001;FDnmt3a (4,61) = 4.60, P < 0.005] (Figure 4A). Cocaine, inde-pendently of topiramate treatment, increased the geneticexpression of glutamate receptor kainate-1 (Grik1) [F(4,56) =2.73, P < 0.05] (Figure 4B), which is targeted by topiramate,and Hdac2 [F(4,54) = 6.27, P < 0.001] (Figure 4C), which is aDnmt1 corepressor. We also found that operant ethanol self-administration increased the mRNA levels of the Dnmt1 core-pressor Dmap1 [F(4,58) = 5.53, P < 0.005] (Figure 4C) and theRNA methyltransferase Trdmt1 [F(4,55) = 8.83, P < 0.001](Figure 4D), which methylates tRNA. The co-administrationof topiramate and cocaine resulted in an increase of Drd2[F(4,64) = 5.40, P < 0.005], Th [F(4,54) = 6.61, P < 0.001] andOprm1 [F(4,58) = 10.61, P < 0.001] gene expression; andcocaine alone induced an increase of Oprm1 gene expression(Figure 4E).

Experiment 5: effects of topiramate onepisodic-like memoryThe two-way ANOVA revealed significant differences in totaltime exploring rats the new object through the test session(Figure 5A), but there were no significant differences causedby topiramate or its interaction with the new/old objects[objects F(1,64) = 18.47, P < 0.001; treatment F(2,64) = 1.59, P= 0.21, NS; interaction F(2,61) = 1.32, P ≤ 0.28, NS]. Never-theless, the individual analysis within-treatment showed thatthere were significant differences between the old and newobjects in the acute and vehicle groups (P = 0.01), but not inthe group treated chronically with topiramate. There were no

Figure 5The effects of topiramate on episodic-like memory. (A) Mean ± SEM total duration of approaches to an object over the three min of the test session.**P < 0.01 compared within-treatments. There were no significant differences between-treatments. (B) Mean ± SEM latency of the first approachto an object and (C) mean ± SEM frequency of approaches to an object over the three min of the test session. For the chronic group, the doseof topiramate (10, 20, 30 and 40 mg·kg−1) was progressively increased every 3 consecutive days. The acute group was treated only once withtopiramate, and the vehicle group was only treated with vehicle. Topiramate 40 mg·kg−1 or vehicle was administered on the 13th day, 120 minbefore the sample session.

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RESULTADOS

significant differences in the latency of first approach andfrequency of approaches (Figure 5B and C).

Discussion

These experiments provide valuable information about therole of topiramate on ethanol–cocaine interactions. Wereport five major findings: (i) topiramate prevented thecocaine-induced increase in the response to ethanol in adose-dependent manner without motor impairments; (ii) thepreventative effects of topiramate on the high response ratesto ethanol were explained by the suppression of the expres-sion of the effects of cocaine rather than the blockade of theacquisition of the effects of cocaine; (iii) topiramate reducedblood ethanol levels independently of the co-administrationof cocaine, but did not change the metabolism of cocaine;(iv) operant ethanol self-administration increased the geneexpression of DNA methyltransferases and the RNA methyl-transferase Trdmt1, and this effect was fully blocked by eithertopiramate or cocaine; and (v) cocaine increased the geneticexpression of Grik1 and Hdac2, and topiramate did notinhibit this increase.

Although there are ongoing clinical trials and a recentstudy regarding the effects of topiramate on the dual depend-ence of ethanol and cocaine has been published (ClinicalTri-als.gov, US NIH, 2009; Kampman et al., 2013), this is the firstpreclinical study demonstrating the effects of topiramatetreatment on the co-administration of ethanol and cocaine.However, topiramate alone was not able to reduce theresponse to ethanol. This result agrees with those from pre-vious studies that showed either that topiramate did not alterthe responses of mice to ethanol (Navarrete et al., 2012), orthat topiramate was ineffective in reducing ethanol con-sumption in Wistar rats (Breslin et al., 2010; Lynch et al.,2011). However, our results contrast with other reportsshowing that topiramate reduced ethanol consumption andreduced the motivation to lick for beer in animal models(Hargreaves and McGregor, 2007; Knapp et al., 2007; Nguyenet al., 2007), and reduced ethanol consumption, craving andincreased the number of abstinent days from ethanol use inhumans (Johnson et al., 2003; Rubio et al., 2004; Shinn andGreenfield, 2010). One plausible hypothesis for these discrep-ancies is that the effects of topiramate on ethanol-relatedbehaviour are dependent upon the amounts of ethanol usedby the subjects. This hypothesis predicts that the probabilityof topiramate having an effect on alcohol intake would begreater in subjects with higher levels of ethanol consumptionthan in subjects with lower levels. Indeed, the Johnson groupdemonstrated in at least two studies that the severity ofdrinking is a predictor of the efficacy of topiramate (Breslinet al., 2010; Lynch et al., 2011). These authors found thattopiramate reduced ethanol consumption and relapse inethanol-preferring rats, which are characterized by excessiveethanol drinking, whereas topiramate did not affect ethanolconsumption in Wistar rats. In the present study, topiramatewas effective at reducing the increased response to ethanolinduced by cocaine. The same response has also beenobserved for cocaine response. Subjects with more severecocaine withdrawal symptoms responded better to topira-mate (Kampman et al., 2013).

Our results also show that the preventative effects oftopiramate were not explained by any motor impairment,and according to previous reports (Echeverry-Alzate et al.,2012), the cocaine-induced increase in the response toethanol is a result of chronic cocaine exposure rather than anacute consequence, as these effects appear after the sixth toseventh day of cocaine treatment. The question remainedwhether topiramate blocks the acquisition of the effects ofthe cocaine treatment or whether topiramate blocks theexpression of the effects of the cocaine treatment on operantethanol self-administration. Repeated exposure to cocainecauses behavioural sensitization, progressively increasingpsychostimulant motor activity, and neuronal sensitizationof glutamatergic projections from the prefrontal cortex tomesolimbic structures (Ghasemzadeh et al., 2009; Liu andSteketee, 2011). In the present study, administering topira-mate 120 min before cocaine did not change the cocaine-induced psychostimulant motor activity and did not preventthe increased response to ethanol. Both results suggest thattopiramate is not altering the main effects of cocaine in therat brain. However, administering topiramate 120 min beforethe operant ethanol self-administration session, acute orchronically, fully prevented the increased response to ethanolinduced by cocaine. Therefore, it seems more reasonable toassume that topiramate is blocking the effects of cocaine onethanol self-administration. It has been proposed that topira-mate normalizes neuronal sensitization and reduces thesymptoms of cocaine withdrawal (Johnson, 2005). Forinstance, because there is an increase in the number of glu-tamate receptors in the nucleus accumbens after a shortperiod of cocaine withdrawal (Dobi et al., 2011) and the glu-tamatergic projections from the prefrontal cortex modulatethe nucleus accumbens (Parsegian and See, 2014), our resultsraise the possibility that topiramate might be adjusting thecortico-mesolimibic activity, and as a consequence, reducingthe craving or incentive salience for ethanol. This explana-tion agrees with the mechanism of action suggested byJohnson (2004), which is that topiramate antagonizes theability of drugs of abuse to increase cortico-mesolimbicdopamine activity by facilitating GABA suppression andreducing the excitatory effects of glutamatergic receptors inthe nucleus accumbens. Although we cannot provide anunequivocal answer to whether topiramate reduces thecraving for ethanol, blocks cocaine withdrawal or reduces thesalience of ethanol within the drinking occasion, our resultsprovide supporting evidence about the efficacy of topiramatein terms of the dual dependence of ethanol and cocaine.

We have shown that topiramate interfered with ethanolmetabolism independently of the cocaine treatment, result-ing in a reduction in blood ethanol levels. This is an inter-esting result, as the reduction in blood ethanol levels was notlinked to a reduction in operant ethanol self-administration.This might suggest that the reducing effects of topiramate onthe cocaine group is likely more associated to psychological/emotional aspects of drug addiction, such as craving andincentive salience for ethanol, rather than the necessity ofanimals to reach fixed blood ethanol levels. According to FDA(2012), the side effects of topiramate include metabolic aci-dosis, which is due to the inhibitory effect of topiramate oncarbonic anhydrase enzymes types II and IV. Additionally, ithas been suggested that carbonic anhydrase inhibitors target

BJPThe effects of topiramate on EtOH-cocaine interactions

British Journal of Pharmacology (2014) 171 3023–3036 3033127

RESULTADOS

the NADH oxidoreductase enzyme, which uses NADH as asubstrate (Innocenti et al., 2005). This is relevant because, inaddition to acetaldehyde, ethanol consumption leads to anaccumulation of NADH, which is detected by the ethanolassay kit that we used here to analyse blood samples. There-fore, our results suggest that the reduction in blood ethanollevels caused by topiramate could be related to the interfer-ence with the activity of the NADH oxidoreductase enzyme.Further studies are needed to identify the mechanism of thisinteraction with additional biochemistry techniques. In con-trast to ethanol, benzoylecgonine, one of the two primarymetabolites of cocaine (Schindler and Goldberg, 2012), didnot show significant differences among the groups after 18 hof cocaine administration, indicating that topiramate doesnot directly affect cocaine metabolism.

We obtained heterogeneous results in the genetic expres-sion studies. We found that the expression of the RNA/DNAmethyltransferases Trmdt1, Dnmt1 and Dnmt3a was increasedin a similar way after operant ethanol self-administration.However, Dnmt1 acts essentially on hemimethylated DNAand is implicated in the maintenance of DNA methylationpatterns during DNA replication, and Dnmt3a shows de novomethyltransferase activity (Okano et al., 1999; Bestor, 2000).Therefore, a logical conclusion would be that ethanol altersthe activity of the maintenance and de novo patterns of DNAmethylation in the rat prefrontal cortex. A recent report hasdemonstrated that either pre- or post-natal ethanol exposureresults in an increase of Dnmt1 and Dnmt3a expression in therat hippocampus (Perkins et al., 2013). Despite the lack of aclear explanation, this is the first study that shows thattopiramate and cocaine prevent the increase of DNA meth-yltransferase gene expression induced by ethanol. Our initialhypothesis was that the expression of Dnmt1 complex core-pressors (Hdac2, Dmap1, Pcna and Uhrf1) would respond in asimilar manner as Dnmt1 did after operant ethanol self-administration. However, only the expression of the Dmap1exhibited an increase similar to Dnmt1. This result suggeststhat the recruitment of gene silencing corepressors byDNMT1 might be specific for the stimuli that cause thechange in activity, which are ethanol and cocaine in thepresent study. Interestingly, despite that, Hdac2 is recruitedby DNMT1 as a corepressor of gene transcription, HDAC2 hastranscriptional silencing activity by itself. HDAC2 is respon-sible for the removal of acetyl groups from specific histones,which results in gene transcription silencing. In this study,cocaine administration resulted in an increase in the geneexpression of Hdac2, and this result agrees with recent work(Host et al., 2011). This result indicates that cocaine admin-istration is associated with an increase of gene silencing inthe prefrontal cortex because of the stimulation of the Hdac2gene. Another unexpected result is that there was not a sig-nificant decrease on the genetic expression of the genescoding for the main proteins targeted for topiramate afterchronic treatment, which include the carbonic anhydraseenzymes types II (Ca2) and IV (Ca4) and Grik1. However,cocaine increased the genetic expression of Grik1. This lastfinding is not surprising, considering all of the evidencelinking cocaine glutamatergic signalling and cocaine addic-tion (see Schmidt and Pierce, 2010, for a review). Three of thefour genes assessed, Drd2, Th and Oprm1, related to thereward system were up-regulated in the group treated with

topiramate and cocaine. Previous studies have demonstratedin animal models that cocaine increased the expression ofthese three genes (Balda et al., 2009; Kreek et al., 2012;Lawhorn et al., 2013). Nevertheless, our results demonstrate,for the first time, that there is a clear effect with theco-administration of topiramate, but the underlying mecha-nism of action is unknown.

We expected to reduce the side effects of topiramateincreasing the dose of topiramate progressively and dividingthem into two doses (morning and afternoon dosing) as it isrecommended in the clinical setting (Kampman et al., 2004;ClinicalTrials.gov, US NIH, 2009). However, and surprisingly,those animals did not show significant differences exploringthe new object (suggesting impaired episodic-like memory),whereas the animals treated acutely with topiramate40 mg·kg−1 and those treated merely with vehicle, showed asignificant increase over the time spent with the new object(suggesting intact episodic-like memory). Therefore, ourresults may indicate that either low doses of topiramateshould be considered in further studies or that it should becarefully evaluated in the risk–benefit ratio of usingmoderate/high doses of topiramate for the treatment ofco-abuse of ethanol and cocaine.

In conclusion, we provided evidence for the efficacy oftopiramate in the context of the dual dependence of ethanoland cocaine. Furthermore, we provided novel informationregarding the effects of topiramate on cocaine- and ethanol-related behaviours and metabolism, and we presented novelinsights regarding the changes in the expression of the genescontrolling the epigenetic mechanisms (epigenetic genes)and genes related directly to the reward system in the pre-frontal cortex.

Acknowledgements

This work was supported by the Fondo de Investigación Sani-taria (Red de Trastornos Adictivos, FEDER, RD12/0028/0015to J.A.L.M., RD12/0028/001 to F.R. de F., RD12/0028/0014 toR.N.), Ministerio de Ciencia e Innovación (SAF2011-26818 toJ.A.L.M.), and the European Foundation for Alcohol Research(EA 12 21 to J.A.L.M.).

Conflict of interest

None.

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3036 British Journal of Pharmacology (2014) 171 3023–3036 130

RESULTADOS

131

132

IV. DISCUSIÓN GENERAL

133

134

Los resultados presentados en esta tesis doctoral aportan nuevos datos sobre la compleja

interacción entre el alcohol y la cocaína, la eficacia de varios tratamientos

farmacológicos en esta codependencia, y la implicación de la corteza prefrontal en la

respuesta a estos tratamientos. Se trata de un tema de gran relevancia, como se ha

expuesto anteriormente, ya que el consumo simultáneo de estas drogas es frecuente en

la población general, por todas las consecuencias que esta práctica puede desencadenar,

y por la ausencia de tratamientos farmacológicos efectivos en la codependencia de

alcohol y cocaína. Dentro de este ámbito, los distintos estudios incluidos en la tesis

abordan varias cuestiones fundamentales que incluyen: 1) los efectos de la

administración de cocaína sobre la autoadministración operante de alcohol en ratas

Wistar; 2) la eficacia de diferentes tratamientos farmacológicos en la reducción del

consumo de alcohol, tanto en los animales que son expuestos solamente a la

autoadministración alcohol como en aquellos que se encuentran bajo la administración

concomitante de alcohol y cocaína; 3) los efectos del tratamiento farmacológico con

naltrexona y topiramato sobre la estimulación psicomotora inducida por la cocaína, así

como sobre el metabolismo del alcohol y de la cocaína; y 4) las consecuencias de las

distintas condiciones experimentales sobre la expresión de varios grupos de genes en la

CPF de la rata, con especial interés en genes relacionados con los mecanismos de

regulación de la expresión génica.

1. Efectos de la administración crónica de cocaína sobre el consumo de alcohol

En primer lugar, y como parte importante del modelo de ingesta de alcohol que se

presenta en los dos estudios que conforman esta tesis, observamos de manera repetida

un incremento en el consumo de alcohol inducido por la cocaína. Este aumento aparece

entorno al sexto día de administración intraperitoneal (i.p.) de cocaína (20 mg/kg).

Knackstedt et al. (2006) encontraron un efecto similar, de forma que los animales

pretratados con cocaína intravenosa (i.v.), de manera crónica, bebían significativamente

más alcohol. También, en un modelo de autoadministración i.v. de alcohol/cocaína,

Ikegami et al. (2002) observaron que las ratas con exposición previa a estas 2 drogas se

autoadministraban más alcohol (i.v) que las ratas expuestas solamente a cocaína.

Por el contrario, Cailhol y Mormède (2000) no encontraron efectos significativos de la

administración i.p. de cocaína sobre el consumo de alcohol en ratas, y Uemura et al.

(1998) muestran una disminución del consumo de alcohol inducida por la cocaína (i.p.)

135

DISCUSIÓN

en ratones. Estos datos contradictorios podrían ser fruto de las diferencias

metodológicas aplicadas, principalmente de las dosis utilizadas en cada estudio y de los

días de tratamiento con cocaína, lo que pone de manifiesto la complejidad de los efectos

que produce la cocaína sobre el consumo de alcohol.

Otro punto a tener en cuenta al observar estos efectos, y que hemos justificado en cada

uno de nuestros estudios, es el tiempo transcurrido entre la administración de cocaína y

la exposición a alcohol, en nuestro caso de unas 17 horas. Como explicamos en el

Artículo 1, con este intervalo de tiempo buscamos evitar los efectos de la

administración concomitante de alcohol y cocaína, entre los que se encuentran: a) la

sensibilización motora inducida por la cocaína mientras los animales estuviesen en las

cajas de autoadministración de alcohol (Stromberg y Mackler, 2005), b) una posible

aversión al alcohol inducida por la cocaína, ya que otros autores han demostrado este

efecto en el caso de la sacarina (Davis y Riley, 2007; Goudie et al., 1978), y c) la

formación de cocaetileno (ver apartado 5.1. de la introducción), en la medida de lo

posible. En este sentido, y aunque nosotros no medimos los niveles de cocaetileno,

Knackstedt et al. (2006) no encontraron este metabolito en sangre, 40 minutos después

de la administración de alcohol + cocaína, concluyendo que el incremento del consumo

de alcohol inducido por la cocaína, en las ratas de su estudio, no podía ser explicado por

la formación de cocaetileno.

En un estudio reciente, Hauser et al. (2014) utilizaron una dosis aguda de cocaína (i.p.)

y encuentran datos que irían en la misma línea que los nuestros, de forma que esta droga

a dosis bajas produce un aumento de la conducta de búsqueda de alcohol que puede

durar al menos 4 horas, y hasta 24 horas si las dosis de cocaína son altas. Estos autores

añaden, como apuntan otros estudios (Mckee and Meshul, 2005; Ungless et al., 2001),

que la mayor activación que produce la cocaína en ciertas vías neuronales podría ser la

base del efecto duradero sobre la conducta de búsqueda de alcohol.

2. Respuesta a los tratamientos farmacológicos en el consumo de alcohol

con/sin coadministración de cocaína

Los dos estudios que se presentan en esta tesis doctoral incluyen varios experimentos en

los que se investiga la eficacia de 3 tratamientos farmacológicos (acamprosato,

naltrexona, y topiramato) en la reducción del consumo de alcohol en ratas Wistar, en un

136

DISCUSIÓN

modelo de autoadministración operante de alcohol con o sin administración

concomitante de cocaína.

2.1. Efectos sobre el consumo de alcohol sin coadministración de cocaína

El acamprosato (Artículo 1) no produjo cambios significativos en el consumo de

alcohol de los animales, en ninguna de las dosis estudiadas (35, 70, o 210 mg/kg). Estos

resultados son congruentes con los obtenidos en humanos en dos importantes estudios

realizados en Estados Unidos y Alemania, COMBINE (Anton et al., 2006) y PREDICT

(Mann et al., 2013) respectivamente. Sin embargo, como ha sido expuesto en apartados

anteriores, hay numerosos estudios previos que muestran los efectos positivos de este

fármaco. Algunas de las posibles explicaciones para estas discrepancias en los

resultados son expuestas en un reciente metanálisis (Maisel et al., 2013) posterior a

nuestro estudio en el que se demostró que las variables más importantes que afectaron a

la eficacia del acamprosato estaban relacionadas con la desintoxicación de los sujetos

previa al ensayo y con tener la abstinencia como objetivo del tratamiento. En otro

metanálisis (Cochrane) con 24 ensayos controlados aleatorios, que incluían a casi 7000

pacientes, el acamprosato incrementó la duración acumulada de abstinencia y redujo el

riesgo de consumo de alcohol (Rösner et al., 2010).

El objeto de nuestro estudio se centró en la eficacia del tratamiento con acamprosato

mientras los animales consumían alcohol de forma crónica, y bajo esa premisa no

encontramos efecto significativo en las dosis estudiadas. Estos resultados van en la

misma dirección que los encontrados en humanos, dado que el acamprosato no parece

ser eficaz en la reducción de los días de consumo fuerte de alcohol (Witkiewitz et al.,

2012).

De manera similar a lo que observamos con el acamprosato, el topiramato (Artículo 2)

no disminuyó el consumo de alcohol en los animales a ninguna de las dosis estudiadas

(2.5-40 mg/kg). Estos datos son congruentes con los obtenidos por Breslin et al. (2010)

y Moore et al. (2014), quienes tampoco encontraron efectos del topiramato sobre el

consumo de alcohol en ratas Wistar. Sin embargo, en varios estudios realizados en ratas

preferentes por alcohol, como las ratas ethanol-preferring (P) y las Warsaw high

preferring (WHP), el topiramato produjo una reducción en el consumo de esta droga

(Breslin et al., 2010; Lynch et al., 2011; Moore et al., 2014; Zalewska-Kaszubska et al.,

137

DISCUSIÓN

2013). Gabriel y Cunningham (2005) y Knapp et al. (2007) también encontraron que el

topiramato reduce el consumo de alcohol en ratones y ratas, respectivamente.

Si nos centramos en los estudios en humanos dependientes de alcohol, se ha visto que el

tratamiento con topiramato reduce el consumo de dicha droga (por ej. el número de

bebidas por día y los días de consumo fuerte), el craving, e incrementa la abstinencia

(Blodgett et al., 2014; Johnson et al., 2003, 2007; Miranda et al., 2008; Rubio et al.,

2004). Por lo tanto, teniendo en cuenta nuestros datos y los mencionados anteriormente,

una hipótesis plausible sobre las diferencias encontradas en la eficacia del topiramato

podría incluir variables como el nivel de consumo de alcohol, según muestran los

resultados clínicos y preclínicos, y la vulnerabilidad genética (por ej. en las ratas Wistar

y en las P). Ambos temas han sido tratados por el grupo de Johnson como posibles

indicadores de la eficacia del topiramato en la dependencia de alcohol (Breslin et al.,

2010; Lynch et al., 2011).

La naltrexona (Artículo 1), por el contrario, sí redujo significativamente el consumo de

alcohol en nuestros animales, a la dosis de 10 mg/kg. En concordancia con estos

resultados, muchos estudios en roedores han mostrado la eficacia de la naltrexona en la

reducción del consumo de alcohol a través de diferentes paradigmas conductuales

(Ciccocioppo et al., 2007; Czachowski y DeLory, 2009; Gilpin et al., 2008; Goodwin et

al., 2001; Henderson-Redmond y Czachowski, 2014; June et al., 1998; Kim et al., 2004;

Le et al., 1999; Stromberg et al., 1998; Verplaetse y Czachowski, 2015; Walker y Koob,

2008). En algunos de estos estudios el consumo de alcohol se vio disminuido utilizando

dosis muy bajas de naltrexona en comparación con el nuestro y con otros de los

mencionados, lo que podría explicarse según el modelo conductual y la vía de

administración del fármaco que se utilizó en cada uno de ellos. En este sentido,

Williams y Broadbridge (2009), encontraron que la naltrexona por vía subcutánea (s.c.)

es aproximadamente 30 veces más potente que por vía i.p. A su vez, cabe esperar que la

vía oral, utilizada en nuestro estudio, sea aún menos potente que la i.p. (DeHaven-

Hudkins et al., 1990).

Nuestros resultados también se ven avalados por la eficacia que muestra la naltrexona

en los estudios realizados en humanos dependientes de alcohol. En estos sujetos, la

naltrexona provocó una reducción en el deseo por consumir (craving) y en la cantidad

de alcohol consumido (O`Malley et al., 2002), también redujo el riesgo de consumos

138

DISCUSIÓN

fuertes de alcohol, así como los días de consumo (Maisel et al., 2013; Rösner et al.,

2010) y la probabilidad de recaída (Volpicelli et al., 1992). En la misma línea, Myrick et

al. (2008) encontraron que la naltrexona podía disminuir la activación en la vía del

refuerzo inducida por estímulos (claves) relacionados con el alcohol.

Por otra parte, algunos metanálisis han mostrado ciertas limitaciones de este tratamiento

farmacológico. Así, Kranzler y Van Kirk (2001) indicaron que la naltrexona podría ser

eficaz, pero de forma modesta, en la reducción del consumo de alcohol en sujetos

alcohólicos, mientras que Garbutt (2010) reveló su eficacia en la reducción de la recaída

al consumo fuerte de alcohol, pero con menor efectividad en el mantenimiento de la

abstinencia.

De manera resumida, y como se ha comentado, el acamprosato está indicado para el

mantenimiento de la abstinencia en pacientes dependientes de alcohol que sean

abstinentes al inicio del tratamiento, y no parece ser eficaz en la reducción de los días de

consumo fuerte de alcohol en humanos. Por otra parte, la eficacia del topiramato podría

depender del nivel de consumo de alcohol y de la vulnerabilidad genética de los sujetos,

siendo más beneficioso en aquellos que presenten un mayor consumo de alcohol. Por

último, la naltrexona es efectiva en la reducción del consumo de alcohol y la recaída,

pero con menor eficacia en el mantenimiento de la abstinencia. Todos estos hechos

parecen sugerir que las propiedades farmacológicas de cada compuesto los vincularían a

estadios diferentes del alcoholismo, así como a características específicas del paciente

(por ej. consumo fuerte de alcohol, vulnerabilidad genética, etc.).

Por lo tanto podríamos sugerir, como señalan varios estudios, que la integración de

estos tratamientos podría resultar útil. Heyser et al. (2003) encuentran que la

combinación de naltrexona y acamprosato puede ser más efectiva que cada compuesto

por separado en la prevención del efecto de privación de alcohol en ratas. La

combinación de estos dos fármacos también fue más efectiva en la reducción del

consumo de alcohol en ratones (Kim et al., 2004), y mostró ser conductualmente y

farmacológicamente segura en humanos (Johnson et al., 2003b). Dos estudios clínicos

también han demostrado que dicha combinación puede ser más efectiva que cada

fármaco por separado, en la prevención de la recaída y en la abstinencia de alcohol

(Feeney et al., 2006; Kiefer et al., 2003).

139

DISCUSIÓN

Otros estudios recientes están explorando la combinación topiramato/naltrexona. Así,

Moore et al. (2014) observaron mayor eficacia de dicha combinación, con respecto a la

de cada fármaco por separado en ratas P, y con un mayor efecto de esta combinación en

los machos que en las hembras (Moore y Lynch, 2015). En la misma línea, el

tratamiento con topiramato/naltrexona en ratones provocó una mayor reducción tanto en

el consumo de alcohol como en la motivación por beber (Navarrete et al., 2013). Por

último, y en esta misma dirección, se está desarrollando un estudio piloto reciente (fase

I), en el que se estudia la seguridad y eficacia de esta combinación en el tratamiento del

alcoholismo en sujetos dependientes (ClinicalTrials.gov). Los resultados aún no han

sido publicados.

2.2. Efectos sobre el consumo de alcohol con coadministración de cocaína

En el estudio 1, la naltrexona no fue capaz de reducir el incremento en el consumo de

alcohol inducido por la cocaína, a pesar de ser efectiva en ausencia de la misma.

Aunque en la literatura científica hay resultados contradictorios con respecto al uso de

la naltrexona en la co-dependencia de alcohol y cocaína, nuestros datos concuerdan con

algunos de los comentados en el apartado 6.3 de la introducción de esta tesis, como el

estudio piloto de Pettinati et al. (2014).

Aunque las razones que justifiquen esta falta de efecto de la naltrexona siguen sin estar

claras, una posible explicación sería que los cambios neurobiológicos inducidos por la

cocaína superan a los que son inducidos por la naltrexona. En este sentido, la naltrexona

muestra mayor afinidad por los receptores µ opioides que por los κ o δ (Mannelli et al.,

2011) y, como se ha explicado anteriormente, la activación de los receptores µ puede

aumentar indirectamente la liberación de DA, en parte gracias a la inhibición de la

liberación de GABA en áreas relevantes del sistema cerebral de recompensa (Corbett et

al., 2006; Johnson, 2010). La naltrexona, por lo tanto, bloquearía la activación de los

receptores µ producida por el alcohol, así como la síntesis y la liberación de opioides

endógenos inducidas por esta droga (Herz, 1997). Sin embargo, la cocaína produce un

aumento en los niveles extracelulares de DA en áreas cerebrales de recompensa,

mediante el aumento de su liberación y la inhibición de su recaptura. Este aumento de

DA provocaría alteraciones en la tasa de transcripción de genes diana [por ej. factores

de transcripción (Nestler, 2005)], que terminarían por producir cambios en la actividad

140

DISCUSIÓN

sináptica de las neuronas como la arborización dendrítica y/o en los circuitos neurales,

que explicaría los efectos a corto y largo plazo en la conducta.

Siguiendo con la explicación de la falta de efecto de la Naltrexona sobre el incremento

del consumo de alcohol producido por la cocaína, es interesante recordar que uno de los

cambios producidos por la cocaína descrito en estudios tanto en roedores como en

humanos, es el incremento de los receptores µ opioides en distintas áreas implicadas en

la adicción. Por ejemplo, se ha visto un aumento de este receptor en la corteza

cingulada, el NAc, el estriado dorsal, y en el núcleo basolateral de la amígdala como

respuesta al tratamiento crónico con cocaína en ratas (Unterwald et al., 1992, 1994). En

un estudio más reciente, Bailey et al. (2005) confirman que el tratamiento crónico con

cocaína produce una regulación al alza de los receptores µ en las cortezas frontal y

cingulada, y en el caudado-putamen de la rata. Estos cambios permanecieron al menos

14 días después del inicio de la abstinencia.

Encontramos resultados similares en estudios en humanos que sugieren este incremento

de receptores µ con el consumo de cocaína. Así, en humanos dependientes de cocaína

también se ha demostrado, mediante PET in vivo (tomografía por emisión de

positrones), un incremento de la unión a los receptores µ en varias regiones cerebrales

(incluyendo las cortezas frontal y cingulada anterior), cambios que persistieron después

de 4 semanas de abstinencia (Zubieta et al., 1996). Gorelick et al. (2005) también

observaron en consumidores de cocaína un incremento de la unión a estos receptores

(mediante PET) en estructuras como la corteza frontal, correlacionando con la cantidad

de cocaína consumida, con el porcentaje de días de consumo, y con la concentración del

metabolito benzoilecgonina en orina. Los resultados obtenidos por Ghitza et al. (2010) y

Gorelick et al. (2008) en humanos consumidores de cocaína irían en la misma línea,

sugiriendo además que la regulación al alza de estos receptores en distintas áreas puede

servir como indicador de los resultados del tratamiento y del tiempo de recaída al

consumo de esta droga.

Apoyando estos resultados, en el estudio 2 de esta tesis también encontramos

incrementados los niveles de ARNm del receptor µ en la CPF de los animales tratados

con alcohol/cocaína (Fig. 4E, Artículo 2). Por lo tanto, podríamos sugerir, con respecto

al estudio 1, que la dosis de naltrexona (10 mg/kg) que fue efectiva en la reducción del

consumo de alcohol en ausencia de cocaína, no lo fue en su presencia, porque sería

141

DISCUSIÓN

necesaria una dosis mayor para hacer frente al incremento de receptores µ que se induce

por la administración crónica de cocaína. También se puede contemplar la elección de

un tratamiento farmacológico similar a la naltrexona en esta interacción

alcohol/cocaína, por ejemplo el nalmefeno, ya que éste presenta una unión más efectiva

a los receptores opioides centrales, más alta biodisponibilidad, y una duración de la

acción más prolongada que la naltrexona (ver apartado 6.1 de la introducción).

La respuesta que observamos en el estudio 2 con el topiramato fue diferente a la

encontrada con la naltrexona, es decir que mientras el topiramato no produjo ninguna

disminución del consumo de alcohol en los animales sin cocaína concomitante, sí redujo

el incremento en el número de respuestas por alcohol que fue inducido por cocaína,

hasta alcanzar el nivel de los animales sin coadministración de cocaína. En la misma

línea, en un estudio de Johnson et al. (2013a) encontraron que el topiramato podía

reducir el riesgo de abuso de cocaína cuando se trataba del consumo de dosis altas de la

misma. Por otro lado, aunque Kampman et al. (2013) no encontraron beneficios del

topiramato en la reducción del consumo de alcohol ni en el de cocaína en sujetos

dependientes de ambas drogas, este tratamiento aumentaba la probabilidad de tener una

abstinencia más prolongada de cocaína, beneficiando más a los sujetos con síntomas

más severos de abstinencia.

En nuestro estudio, la efectividad del topiramato fue observada únicamente cuando el

fármaco era administrado previamente a la sesión de autoadministración de alcohol.

Este beneficio no se observó al administrar el topiramato antes de la administración de

cocaína, por lo que parece más razonable asumir que el topiramato bloquea la expresión

de los efectos inducidos por la cocaína sobre el consumo de alcohol, y no la adquisición

de dichos efectos.

En este sentido, se ha visto que las inyecciones repetidas de cocaína son suficientes para

desencadenar adaptaciones en las sinapsis glutamatérgicas en el NAc (Dobi et al.,

2011), las proyecciones glutamatérgicas de la CPF modulan el NAc, siendo necesaria la

transmisión glutamatérgica en la vía cortico-estriatal para la expresión de conductas

motivadas asociadas con la cocaína y otras drogas de abuso (McFarland et al., 2003;

Parsegian y See, 2014). Los datos también sugieren la transmisión de los receptores de

glutamato AMPA en el NAc como un punto clave para las conductas relacionadas con

la cocaína (Wolf, 2010; Wolf y Ferrario, 2010). De manera similar, la cocaína induce

142

DISCUSIÓN

cambios en la expresión de los receptores NMDA en distintas áreas del sistema

mesocorticolímbico (Ortinski, 2014), y afecta al sistema GABAérgico en la CPF y otras

áreas (Jayaram y Steketee, 2004; Xi et al., 2003).

Todo lo anterior adquiere más relevancia si se tienen en cuenta los efectos del alcohol

sobre los sistemas GABAérgico y glutamatérgico en distintas áreas del sistema cerebral

de recompensa (Johnson, 2004), así como los mecanismos de acción del topiramato

mencionados en la introducción de esta tesis. En concreto, hay que señalar las acciones

neuroquímicas duales del topiramato, ya que facilita la actividad GABAérgica y

produce un antagonismo de las vías glutamatérgicas de AMPA y kainato, lo que podría

suprimir la actividad dopaminérgica cortico-mesolímbica inducida por drogas como el

alcohol (Johnson, 2004). Por lo tanto, como propone este mismo autor, el topiramato

podría restaurar o normalizar la sensibilización neuronal producida por el consumo

repetido de las drogas, siendo conceptualmente atractivo para el tratamiento de la

dependencia y abstinencia de alcohol, y para el tratamiento de la dependencia de

cocaína, y quizás del estado de abstinencia de la misma (Johnson, 2005). Nuestros

resultados apoyan esta hipótesis, de forma que el topiramato podría estar ajustando la

actividad cortico-mesolímbica, dando como resultado una disminución del craving y de

los efectos reforzantes del alcohol. Pero, aunque para esto no podemos proporcionar una

respuesta inequívoca, los datos de nuestro segundo estudio apoyan la eficacia potencial

que puede tener el topiramato en el caso de la dependencia dual de alcohol y cocaína.

Teniendo en consideración los resultados de nuestros 2 estudios y todos los datos

expuestos en este apartado, y en el anterior (2.1), cabría sugerir la combinación de

naltrexona y topiramato para el tratamiento de la codependencia de alcohol/cocaína,

siendo un campo aún sin explorar en estudios preclínicos ni clínicos.

3. Efectos de los tratamientos sobre la actividad locomotora

En los 2 estudios presentados en esta tesis doctoral evaluamos los efectos motores de

los tratamientos farmacológicos a las dosis seleccionadas con la finalidad de descartar

alteraciones motoras que afectaran a los animales durante la sesión de

autoadministración de alcohol. Ni la naltrexona a la dosis de 10 mg/kg (Figura 5,

Artículo 1), ni el topiramato, a las dosis 2.5-40 mg/kg (Figura 1B, Artículo 2),

produjeron alteraciones en la actividad motora de los animales.

143

DISCUSIÓN

Sin embargo, el tratamiento repetido con cocaína (10 y 20 mg/kg) incrementó

significativamente la actividad motora de los animales en ambos estudios, lo que replica

los resultados obtenidos previamente por otros autores (Ago et al., 2008). Este aumento

duradero de la actividad motora que ocurre con la exposición repetida a cocaína se

conoce como sensibilización conductual (Jayaram y Steketee, 2004). En nuestro caso,

no observamos, en ninguno de los estudios, alteraciones motoras inducidas por la

cocaína que afectaran al número de respuestas de los animales en el momento de la

autoadministración de alcohol (17 horas post-inyección de cocaína).

Muchos de los estudios acerca de los mecanismos neurobiológicos que subyacen a la

sensibilización inducida por cocaína se centran en el ATV y el NAc, áreas que están

implicadas en el inicio y la expresión de la sensibilización, respectivamente (Kalivas y

Stewart, 1991; Robinson y Berridge, 1993). Sin embargo el papel de la CPF está siendo

cada vez más estudiado, ya que esta estructura modula el sistema mesocorticolímbico.

La CPF recibe aferencias desde el ATV y envía inervaciones glutamatérgicas al ATV y

NAc, donde la sensibilización inducida por cocaína produce un aumento en las

respuestas de DA (Liu y Steketee, 2011; Steketee, 2005). También el sistema opioide

endógeno ha sido relacionado con la hiperactividad inducida por cocaína. Por ejemplo,

el pretratamiento con naloxona, otro antagonista opioide, bloqueó completamente el

incremento de la actividad locomotora inducido por la cocaína en ratas (Houdi et al.,

1989). De manera similar, el pretratamiento con naltrexona impidió el desarrollo de esta

sensibilización motora (Sala et al., 1995), y el tratamiento crónico con este fármaco

atenuó ligeramente el incremento de la actividad locomotora inducido por la cocaína

crónica en ratas (Kunko et al., 1998). Además, Smith et al. (2009) muestran datos sobre

sensibilización cruzada entre opioides y cocaína que van en la misma línea.

En nuestros experimentos, ninguno de los tratamientos principales (naltrexona y

topiramato) alteró la hiperactividad locomotora inducida por la cocaína, aunque algunos

de los estudios anteriormente mencionados podrían indicar lo contrario. Sin embargo,

otros estudios en roedores encuentran resultados similares a los nuestros en relación a la

naltrexona (Lesscher et al., 2005; Sable et al., 2004). Bajo nuestra interpretación, las

neuroadaptaciones inducidas por la cocaína serían mínimamente afectadas por la

naltrexona. Otros autores sugieren que la naltrexona bloquearía los efectos de la

administración intermitente de cocaína sólo cuando esta última deja de estar presente y

la naltrexona continúa actuando (Kunko et al., 1998). En lo que respecta al topiramato y

144

DISCUSIÓN

sus efectos sobre la sensibilización motora inducida por cocaína, es llamativa la falta de

estudios al respecto, y aún más si se tienen en cuenta las acciones duales de este

fármaco sobre la señalización GABAérgica y glutamatérgica anteriormente

mencionadas, y su posible interacción con el sustrato neurobiológico implicado en dicha

conducta.

4. Corteza prefrontal y expresión génica

Uno de los principales objetivos de esta tesis fue el estudio de los efectos del

tratamiento con naltrexona y topiramato, y la interacción alcohol/cocaína, sobre la

expresión génica en la CPF de la rata. Aunque en cada uno de los estudios nos

centramos en diferentes familias de genes, estas tienen mucha relación entre sí. Mientras

que en el artículo 1 los IEGs fueron nuestro foco de atención, con especial interés por la

categoría de los factores de transcripción, en el artículo 2 nos centramos en genes

relacionados con mecanismos epigenéticos y con el sistema cerebral de recompensa.

Los procesos implicados en la regulación de la expresión génica son variados y

complejos, e incluyen la activación y la inhibición de factores de transcripción, la

modificación de la estructura de la cromatina y el ADN, y la inducción de ARNs no

codificantes. Como sugieren nuestros datos, y como otros autores han propuesto

anteriormente (Nestler, 2001; Robison y Nestler, 2011), estos procesos pueden dar lugar

a cambios en el potencial transcripcional de genes, contribuyendo de manera substancial

a muchas de las neuroadaptaciones producidas por la exposición crónica a drogas de

abuso.

La CPF, al igual que otras regiones del sistema cerebral de recompensa, muestra

alteraciones en la expresión de muchos genes tras la administración crónica de drogas.

Como fue expuesto en la introducción, además de tratarse de una estructura implicada

en la conducta adictiva (Lüscher y Malenka, 2011), juega un importante papel en

muchos otros procesos cognitivo-conductuales (Abernathy et al., 2010; Goldstein y

Volkow, 2011; Ranganath y Jacob, 2015). Por otra parte, distintos estudios han

mostrado que la CPF es sensible al tratamiento con los fármacos utilizados en nuestros

experimentos -acamprosato, naltrexona, y topiramato- (Burattini et al., 2008; Dayas et

al., 2007; Hu et al., 2015; Li et al., 2010; Navarrete et al., 2012).

145

DISCUSIÓN

Dentro de los IEGs analizados, la autoadministración operante de alcohol incrementó la

expresión de 2 genes efectores, COX-2 y Homer1a, los cuales influyen directamente en

funciones celulares (Lanahan y Worley, 1998). Por el contrario, esta exposición crónica

al alcohol provocó una reducción en la expresión de un factor de transcripción, C-fos, y

esta alteración se mantuvo con la exposición crónica a cocaína y al tratamiento con

naltrexona. Estos resultados son congruentes con otros estudios que muestran una

inducción rápida y transitoria de la proteína c-Fos, o su ARNm, en varias áreas

cerebrales tras el tratamiento agudo con drogas como el alcohol o la cocaína. Sin

embargo, y como muestran nuestros datos, el tratamiento crónico con la droga parece

revertir este efecto (Chang et al., 1995; Vilpoux et al., 2009; Nestler, 2001; Moratalla et

al., 1996). Además, esta reducción de la expresión de C-fos en la CPF, resultado del

tratamiento crónico con alcohol o alcohol/cocaína, fue replicado en el segundo estudio

de esta tesis (datos no publicados).

Sin embargo, la exposición crónica a drogas, como el alcohol o la cocaína, produce el

efecto opuesto sobre los niveles de ΔFosB en distintas áreas, incluyendo la CPF

(Nestler, 2001; Perrotti et al., 2008; Robison y Nestler, 2011). ΔFosB es un factor de

transcripción miembro de la familia Fos que ha sido implicado en la plasticidad neural

asociada a la adicción. Un estudio de Li et al. (2010) mostró que el tratamiento con

naltrexona redujo tanto el consumo de alcohol en ratas como el incremento de ΔFosB en

la CPF inducido por el consumo crónico de dicha droga. Por lo tanto, aunque nosotros

no observamos una “normalización” en C-fos con la naltrexona, cabría la posibilidad de

observar estos cambios en ΔFosB, dado que se trata de isoformas más estables. La

exploración de estos factores de transcripción en la CPF, y otras áreas, tras la exposición

al alcohol, la cocaína, o ambas drogas, podría aportar datos acerca de su implicación en

la mayor o menor eficacia de los tratamientos farmacológicos, como la naltrexona o el

topiramato, tanto en la dependencia de cada una de las drogas como en la dependencia

dual.

Los efectos del alcohol y la cocaína sobre los mecanismos de control de la expresión

génica, como se ha comentado anteriormente, no se limitan a los factores de

transcripción. También, los distintos mecanismos epigenéticos expuestos en la

introducción de esta tesis juegan un papel importante en los cambios inducidos por estas

drogas sobre la expresión de genes en el cerebro y la conducta, sin dejar de lado las

146

DISCUSIÓN

distintas formas de interacción que hay entre los factores de transcripción y los

mecanismos epigenéticos (Renthal y Nestler, 2008).

En concreto, la metilación de las regiones promotoras del ADN se ha correlacionado

con el silenciamiento de genes, de forma que la modificación química del ADN estaría

interfiriendo con la unión de factores de transcripción (por ej. c-Fos, ΔFosB, CREB,

entre otros) y atraería proteínas que contienen dominios de unión a grupos metilo, que

actuarían como represores transcripcionales (Jaenisch y Bird, 2003). Anier et al. (2010),

por ejemplo, encuentran que la cocaína provoca una hipometilación y menor unión de

MeCP2 en el área promotora de fosB, lo que se asocia con una regulación al alza de la

transcripción de este gen en el NAc. Aunque hay que tener en cuenta que la metilación

del ADN es un proceso dinámico y puede promover o reprimir la expresión génica

(Suzuki y Bird, 2008).

En el estudio con topiramato (Artículo 2) observamos un incremento en la expresión de

las ARN/ADN metiltransferasas (Trdmt1, Dnmt1 y Dnmt3a) en la CPF producido por la

autoadministración crónica de alcohol. Este aumento en los niveles de ARNm fue

prevenido, o revertido, por el tratamiento con topiramato y/o cocaína, siendo nuestros

datos la única referencia sobre este efecto hasta la fecha.

Los resultado hasta ahora obtenidos en pacientes sobre la metilación del ADN son

contradictorios, mientras que algunos estudios informan de una hipermetilación en

pacientes dependientes de alcohol (Bleich y Hillemacher, 2009), otros encuentran una

hipometilación en los genes investigados (Nieratschker et al., 2013; Zhang et al., 2013).

En este sentido, Ponomarev (2013) concluye que los efectos del alcohol crónico sobre la

metilación del ADN global parecen ser específicos de tejido.

En roedores, se ha visto que la exposición al alcohol durante el desarrollo causa una

hipermetilación del ADN global en la CPF e hipocampo (Otero et al., 2012). En un

modelo similar, Perkins et al. (2013) encuentran un aumento en la expresión de Dnmt1

y Dnmt3a en el hipocampo. La metilación del ADN global en la CPFm también estaba

incrementada en ratas dependientes de alcohol que fueron pre-expuestas a vapor de

alcohol, mostrando además un aumento en la expresión de DNMT1 en esta misma área

(Barbier et al., 2015).

147

DISCUSIÓN

Por otro lado, Tian et al. (2012) informan de una hipometilación de ADN global en la

CPF inducida por el condicionamiento de lugar preferencial (CLP) con cocaína en

ratones. Además, la disminución de la función de la DNMT3a aumenta la respuesta

conductual a cocaína, lo que apoyaría la hipótesis que plantea que la reducción de la

metilación del ADN promueve el incremento de transcripción génica y contribuiría a la

plasticidad conductual inducida por las drogas. En relación a la plasticidad estructural,

la DNMT3a tiene un importante papel en el incremento en la densidad de espinas

dendríticas inducido por cocaína (LaPlant et al., 2010). Estos datos podrían sugerir que

la disminución en la metilación del ADN inducida por la cocaína podría explicar, al

menos en parte, el incremento que observamos en la expresión de algunos de los genes

estudiados en los animales tratados con cocaína (Oprm1, Th, Drd2, Grik1).

Teniendo en cuenta todos estos datos, y la posible hipermetilación e hipometilación del

ADN inducidas por el alcohol y la cocaína respectivamente, en nuestro estudio cabría

suponer que tanto la cocaína como el topiramato compensarían el aumento de la

expresión de las Dnmts inducido por el alcohol en la CPF. Sin embargo, para confirmar

este supuesto harían falta aún varios estudios que incluyeran la investigación de los

efectos de cada tratamiento, y su interacción, sobre la dependencia de alcohol y sobre

los distintos mecanismos epigenéticos que estén controlando la expresión de genes

específicos, ya que la mayor o menor metilación global, o la regulación de genes

implicados en mecanismos generales (por ej. las DNMTs), no implicaría que los

distintos tratamientos estén actuando a través de los mismos genes diana. Por otra parte,

como era de esperar, las estructuras más estudiadas en relación a los temas centrales de

esta tesis son el NAc y el ATV, existiendo pocos estudios que investiguen el papel

crítico de la CPF en todas estas interacciones, por lo que se trata de un amplio campo de

estudio, dadas las funciones de esta estructura y su implicación en las respuestas

observadas en otras áreas cerebrales.

148

DISCUSIÓN

149

150

V. CONCLUSIONES FINALES

151

152

En respuesta a los objetivos plateados, y con los resultados obtenidos en la presente

tesis doctoral, podemos extraer las siguientes conclusiones:

1. De los tratamientos farmacológicos estudiados, la naltrexona es la única capaz

de reducir el consumo de alcohol según nuestras condiciones experimentales.

2. La coadministración crónica de alcohol y cocaína produce un incremento en el

consumo de alcohol que solo se ve reducido por el tratamiento con topiramato.

3. La actividad locomotora no se ve afectada por el tratamiento con naltrexona o

topiramato. Sin embargo, se observa sensibilización motora inducida por el

tratamiento crónico con cocaína que no es alterada por ninguno de los

tratamientos farmacológicos.

4. El tratamiento crónico con topiramato aumenta el metabolismo del alcohol

independientemente de la presencia de cocaína, y no afecta al metabolismo de

esta última.

5. El tratamiento crónico con topiramato en dosis moderadas/altas puede alterar la

memoria de tipo episódica.

6. Los cambios en la expresión de C-fos en la CPF pueden ser un biomarcador útil

en la dependencia de alcohol.

7. El alcohol podría alterar tanto el mantenimiento de los patrones de metilación

como la metilación de novo en la CPF a través del aumento de la expresión

génica de las Dnmts, efecto que es prevenido por la administración de

topiramato y/o cocaína, mientras que la cocaína podría estar asociada con un

silenciamiento génico mediado por Hdac2 en esta región cerebral. Además, los

efectos conductuales del topiramato/cocaína se ven acompañados por una

alteración de la expresión de genes diana implicados en la adicción (Drd2, Th, y

Oprm1).

153

CONCLUSIONES

154

VI. BIBLIOGRAFÍA

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BIBLIOGRAFÍA

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ANEXO 1

ARTÍCULOS

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188

For Peer Review

Nalmefene is effective in treating alcohol-cocaine

interactions and reduces the alcohol-induced histone deacetylases gene expression in blood

Journal: British Journal of Pharmacology

Manuscript ID: Draft

Manuscript Type: Research Paper

Date Submitted by the Author: n/a

Complete List of Authors: Calleja-Conde, Javier; Complutense University, Psychobiology Echeverry-Alzate, Victor; Complutense University, Psychobiology Giné, Elena; Complutense University, Biochemistry Bühler, Kora; Complutense University, Psychobiology Nadal, Roser; Universitat Autònoma de Barcelona, Maldonado, Rafael; Laboratori de Neurofarmacologia. Universitat Pompeu Fabra, Departament de Ciències Experimentals i de la Salut Rodriguez de Fonseca, Fernando; Institute IBIMA, Gual, Antoni; Hospital Clínic, Barcelona, Department of Psychiatry López-Moreno, Jose Antonio; Complutense University, Psychobiology

Major area of pharmacology: Addiction

Cross-cutting area: Pharmacogenomics/pharmacogenetics

Additional area(s): Translational Pharmacology

British Pharmacological Society

British Journal of Pharmacology

Under review

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Histone Deacetylase Gene Expression Following Binge

Alcohol Consumption in Rats and Humans

Jose Antonio L�opez-Moreno, Miguel Marcos, Javier Calleja-Conde, Victor Echeverry-Alzate,Kora M. B€uhler, Pilar Costa-Alba, Edgar Bernardo, Francisco-Javier Laso, Fernando

Rodr�ıguez de Fonseca, Roser Nadal, Maria Paz Viveros, Rafael Maldonado, and Elena Gin�e

Background: Alcohol binge drinking is one of the most common patterns of excessive alcohol useand recent data would suggest that histone deacetylases (HDACs) gene expression profiling could beuseful as a biomarker for psychiatric disorders.

Methods: This study aimed to characterize the gene expression patterns ofHdac 1–11 in samples ofrat peripheral blood, liver, heart, prefrontal cortex, and amygdala following repeated binge alcohol con-sumption and to determine the parallelism ofHdac gene expression between rats and humans in periph-eral blood. To accomplish this goal, we examined Hdac gene expression following 1, 4, or 8 alcoholbinges (3 g/kg, orally) in the rat, in patients who were admitted to the hospital emergency departmentfor acute alcohol intoxication, and in rats trained in daily operant alcohol self-administration.

Results: We primarily found that acute alcohol binging reduced gene expression (Hdac1–10) in theperipheral blood of alcohol-na€ıve rats and that this effect was attenuated following repeated alcoholbinges. There was also a reduction of Hdac gene expression in the liver (Hdac2,4,5), whereas there wasincreased expression in the heart (Hdac1,7,8) and amygdala (Hdac1,2,5). Additionally, increased bloodalcohol concentrations were measured in rat blood at 1 to 4 hours following repeated alcohol binging,and the only group that developed hepatic steotosis (fatty liver) were those animals exposed to 8 alcoholbinge events. Finally, both binge consumption of alcohol in humans and daily operant alcohol self-ad-ministration in rats increasedHdac gene expression in peripheral blood.

Conclusions: Our results suggest that increases in HDAC gene expression within the peripheralblood are associated with chronic alcohol consumption, whereasHDAC gene expression is reduced fol-lowing initial exposure to alcohol.

Key Words: Histone Deacetylases, Gene Expression, Alcohol Binge, Human and Rat,Translational Research.

BINGE ALCOHOL CONSUMPTION is one of themost common patterns of excessive alcohol use

(Centers for Disease Control and Prevention, 2014) andcan be defined as a drinking pattern that increases theblood alcohol concentration (BAC) by up to 80 mg/dl ormore. This generally requires the consumption of at least4 or 5 drinks (for women and men, respectively) withina span of 2 hours (Crabbe et al., 2011; Fillmore andJude, 2011; NIAAA, 2015). Binge drinking is associatedwith many immediate consequences, including intentionaland nonintentional injuries, death from overdose, andadditional long-term consequences if repeated over time(Crabbe et al., 2011). Chronic binge drinking leads toliver and heart disease, abnormal electrophysiological sig-nals within the brain, and psychological impairment(L�opez-Caneda et al., 2013; Maurage et al., 2012; Paradaet al., 2012). Therefore, it would be useful if clinicianshad the ability to reliably assess the progression of alco-holism through biomarker analysis, which in addition toidentifying individuals suffering from alcohol abuse,would further allow the efficacy of pharmacological inter-ventions to be monitored (Litten et al., 2010).

From the Department of Psychobiology (JAL-M, JC-C, VE-A,KMB), School of Psychology, Complutense University of Madrid,Madrid, Spain; Alcoholism Unit (MM, F-JL), Department of InternalMedicine, University Hospital of Salamanca, Salamanca, Spain; Emer-gency Department (PC-A), University Hospital of Salamanca, Sala-manca, Spain; Department of Vascular Biology and Inflammation (EB),Fundaci�on Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares CarlosIII, Madrid, Spain; Fundaci�on IMABIS (FRdF), Laboratorio de Medic-ina Regenerativa, Hospital Regional Universitario Carlos Haya, M�alaga,Spain; Psychobiology Unit (RN), School of Psychology, Institut de Neu-roci�encies, Universitat Aut�onoma de Barcelona, Barcelona, Spain;Department of Physiology (Animal Physiology II) (MPV), School ofBiology, Complutense University of Madrid, Madrid, Spain; Laboratoride Neurofarmacologia (RM), Departament de Ci�encies Experimentals ide la Salut, Universitat Pompeu Fabra, Barcelona, Spain; and Depart-ment of Cellular Biology (EG), School of Medicine, ComplutenseUniversity of Madrid, Madrid, Spain.

Received for publication April 2, 2015; accepted July 22, 2015.Reprint requests: Jose Antonio L�opez-Moreno, Laboratorio de Psico-

biolog�ıa, Department of Psychobiology, School of Psychology, Com-plutense University of Madrid, Campus de Somosaguas, 28223 Madrid,Spain; Tel.: +34-91-3943093; Fax: +34-91-3943189; E-mail:jalopezm@psi.ucm.es

Copyright© 2015 by the Research Society on Alcoholism.

DOI: 10.1111/acer.12850

Alcohol Clin Exp Res,Vol **, No *, 2015: pp 1–12 1

ALCOHOLISM: CLINICAL AND EXPERIMENTAL RESEARCH Vol. **, No. *** 2015

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Common single nucleotide variants underlying drugaddiction: more than a decade of research

Kora-Mareen Bühler1, Elena Giné2, Victor Echeverry-Alzate1, Javier Calleja-Conde1,Fernando Rodriguez de Fonseca3 & Jose Antonio López-Moreno1

Department of Psychobiology, School of Psychology1 and Department of Cellular Biology, School of Medicine,2 Complutense University of Madrid, FundaciónIMABIS,3 Laboratorio de medicina Regenerativa, Hospital Regional Universitario Carlos Haya, Málaga, Spain

ABSTRACT

Drug-related phenotypes are common complex and highly heritable traits. In the last few years, candidate gene (CGAS)and genome-wide association studies (GWAS) have identified a huge number of single nucleotide polymorphisms(SNPs) associated with drug use, abuse or dependence, mainly related to alcohol or nicotine. Nevertheless, few of theseassociations have been replicated in independent studies. The aim of this study was to provide a review of the SNPs thathave been most significantly associated with alcohol-, nicotine-, cannabis- and cocaine-related phenotypes in humansbetween the years of 2000 and 2012. To this end, we selected CGAS, GWAS, family-based association and case-onlystudies published in peer-reviewed international scientific journals (using the PubMed/MEDLINE and Addiction GWASResource databases) in which a significant association was reported. A total of 371 studies fit the search criteria. Wethen filtered SNPs with at least one replication study and performed meta-analysis of the significance of the associa-tions. SNPs in the alcohol metabolizing genes, in the cholinergic gene cluster CHRNA5-CHRNA3-CHRNB4, and in theDRD2 and ANNK1 genes, are, to date, the most replicated and significant gene variants associated with alcohol- andnicotine-related phenotypes. In the case of cannabis and cocaine, a far fewer number of studies and replications havebeen reported, indicating either a need for further investigation or that the genetics of cannabis/cocaine addiction aremore elusive. This review brings a global state-of-the-art vision of the behavioral genetics of addiction and collaborateson formulation of new hypothesis to guide future work.

Keywords Candidate gene association studies, drug addiction, GWAS, single nucleotide polymorphisms.

Correspondence to: Jose Antonio López-Moreno, Department of Psychobiology, School of Psychology, Complutense University of Madrid, Campus deSomosaguas, Madrid 28223, Spain. E-mail: jalopezm@psi.ucm.es

INTRODUCTION

Like most psychiatric disorders, drug addiction is acommon complex disease determined by multiple factors,including genetics. Family, adoption and twin studieshave estimated that genetic vulnerability (i.e. the suscep-tibility to develop a disease because of inherited-geneticcomponents) to drug addiction may be as high as 50percent (Duaux et al. 2000; Ball 2008). Nevertheless, fewaddiction-risk or protective genes have been validated,and the genetic architecture of drug addiction remainselusive.

Inheritance of a common complex disease is notattributable to a mutation in one single gene (as in aclassical Mendelian disorder) but to a combination ofeffects of several different gene variants (Lander & Schork1994). A major part of these gene variants are common,

with each having only a small individual effect on diseaserisk. These common low-effect variants are also calledpolymorphisms. Polymorphisms are defined as DNAsequence variations that produce more than one alter-nate form of a particular gene (i.e. alleles) within thepopulation, with the least common allele having a fre-quency (minor allele frequency—MAF) of a minimum of1 percent in the population (Twyman & Primrose 2003).The most frequent types of polymorphism are singlenucleotide polymorphisms (SNPs), i.e. variants of DNAsequences that differ in one single nucleotide base.Human SNPs are nearly always bi-allelic (although, inprinciple, an SNP could also be tri- or tetra-allelic), withone allele possessing the ancestral or more commonnucleotide, and a second allele in which this ancestralnucleotide is substituted by another. The consequences ofsuch a nucleotide substitution on a gene depend on its

INVITED REVIEW

bs_bs_bannerAddiction Biologydoi:10.1111/adb.12204

© 2015 Society for the Study of Addiction Addiction Biology

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Consequences of early life stress on the expression ofendocannabinoid-related genes in the rat brainEva M. Marcoa, Victor Echeverry-Alzateb, Jose Antonio López-Morenob,Elena Ginéc, Sara Peñascoa and Maria Paz Viverosa

The endocannabinoid system is involved in severalphysiological and pathological states including anxiety,depression, addiction and other neuropsychiatric disorders.Evidence from human and rodent studies suggests thatexposure to early life stress may increase the risk ofpsychopathology later in life. Indeed, maternal deprivation(MD) (24 h at postnatal day 9) in rats induces behaviouralalterations associated with depressive-like and psychotic-like symptoms, as well as important changes in theendocannabinoid system. As most neuropsychiatricdisorders first appear at adolescence, and show remarkablesexual dimorphisms in their prevalence and severity, in thepresent study, we analysed the gene expression of the maincomponents of the brain cannabinoid system in adolescent(postnatal day 46) Wistar male and female rats reared understandard conditions or exposed to MD. For this, weanalysed, by real-time quantitative PCR, the expression ofgenes encoding for CB1 and CB2 receptors, TRPV1 andGPR55 (Cnr1, Cnr2a, Cnr2b, Trpv1, and Gpr55), for the majorenzymes of synthesis, N-acyl phosphatidyl-ethanolaminephospholipase D (NAPE-PLD) and diacylglycerol lipase(DAGL) (Nape-pld, Dagla and Daglb), and degradation, fattyacid amide hydrolase (FAAH) and monoacylglycerol lipase(MAGL) (Faah, Magl and Cox-2), in specific brain regions,

that is, the frontal cortex, ventral and dorsal striatum, dorsalhippocampus and amygdala. In males, MD increased thegenetic expression of all the genes studied within thefrontal cortex, whereas in females such an increase wasobserved only in the hippocampus. In conclusion, theendocannabinoid system is sensitive to early life stress atthe gene expression level in a sex-dependent and region-dependent manner, and these changes are already evidentin the adolescent brain. Behavioural Pharmacology25:547–556 © 2014 Wolters Kluwer Health | LippincottWilliams & Wilkins.

Behavioural Pharmacology 2014, 25:547–556

Keywords: adolescent, cannabinoid, maternal deprivation,polymerase chain reaction, rat, stress

aDepartment of Physiology (Animal Physiology II), Faculty of Biology, ComplutenseUniversity of Madrid, Institute of Biomedical Research of the San Carlos ClinicalHospital, bDepartment of Psychobiology, Faculty of Psychology, Campus deSomosaguas and cDepartment of Biochemistry, Faculty of Medicine,Complutense University of Madrid, Madrid, Spain

Correspondence to Eva M. Marco, PhD, Department of Physiology (AnimalPhysiology II), Faculty of Biology, Complutense University of Madrid, C/ JoseAntonio Novais, no 12. 28040-Madrid, SpainE-mail: emmarco@bio.ucm.es

Received 28 February 2014 Accepted as revised 22 June 2014

IntroductionThe endocannabinoid system is a neuromodulatory sys-

tem composed of (a) cannabinoid CB receptors, meta-

botropic receptors coupled to G-proteins, the CB1 and

CB2 receptors, (b) endogenous ligands (endocannabi-

noids), mainly N-arachidonoylethanolamine [anandamide

(AEA)] and 2-arachidonoylglycerol (2-AG), and (c)

enzymes responsible for their synthesis and degradation.

Endocannabinoids, because of their lipophilic nature, are

synthesized and released ‘on demand’ by the cleavage of

membrane phospholipid precursors; AEA may be formed

by the action of the enzyme N-acyl phosphatidyl-

ethanolamine phospholipase D (NAPE-PLD), whereas

2-AG is produced by sn-1-selective diacylglycerol lipases

(DAGLs). In contrast, endocannabinoid signalling is

inactivated by a fatty acid amide hydrolase (FAAH)

responsible for AEA hydrolysis and a monoacylglycerol

lipase (MAGL) responsible for the hydrolysis and inac-

tivation of 2-AG. Although CB1 and CB2 receptors are the

main CB receptors, additional receptors have been pro-

posed, that is, the transient receptor potential vanilloid

type 1 (TRPV1) ion channel and a G-protein-coupled

receptor, GPR55, among others. More recently, an

additional degradative pathway, for both AEA and 2-AG,

that involves cyclooxygenase-2 (COX-2) has been pro-

posed (Piomelli, 2003; Di Marzo et al., 2004; Battista et al.,2012).

The endocannabinoid system has been implicated in a

wide range of physiological and pathological brain func-

tions. Clinical and animal studies consistently support the

central role of the endocannabinoid system in emotional

homeostasis, stress responsiveness, energy balance and

cognitive function, whereas a deregulation of the endo-

cannabinoid signalling has been related to neu-

ropsychiatric conditions, such as depression, anxiety

disorders and schizophrenia (Pacher et al., 2006; Di Marzo

and Petrosino, 2007; Moreira et al., 2009; Marco et al.,2011a; López-Moreno et al., 2012; Marco and Laviola,

2012).

Early life stress has long been associated with psycho-

pathology. Indeed, data from both human and animal

studies suggest a solid relationship between early life

trauma and psychopathology (Heim and Nemeroff, 2001;

Research report 547

0955-8810 © 2014 Wolters Kluwer Health | Lippincott Williams & Wilkins DOI: 10.1097/FBP.0000000000000068

Copyright © Lippincott Williams & Wilkins. Unauthorized reproduction of this article is prohibited.

195

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Mol Genet Genomics (2014) 289:279–289DOI 10.1007/s00438-013-0809-x

OrIGInal PaPer

Risky alcohol consumption in young people is associated with the fatty acid amide hydrolase gene polymorphism C385A and affective rating of drug pictures

Kora‑Mareen Bühler · Evelio Huertas · Víctor Echeverry‑Alzate · Elena Giné · Eduardo Moltó · Lluis Montoliu · Jose Antonio López‑Moreno

received: 30 august 2013 / accepted: 24 December 2013 / Published online: 10 January 2014 © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2014

cannabis consumption in young individuals (n = 91). also, affective rating for alcohol-, tobacco- and cannabis-related pictures was examined in each individual. Our results make it possible to select the rs324420 SnP (C385a) of the FAAH gene for further analysis. Increasing the sam-ple size up to n = 185 we found that the homozygous CC C385a SnP genotype was associated with risky alcohol use (p = 0.006, odds ratio 2.38). Subsequently, we repli-cated this genetic association with risky alcohol use using another independent sample. risky drinkers (mean 166.8 g pure alcohol) and smokers (more than 15 cigarettes) rated drug pictures more positively (p < 0.001) and they showed a strong positive correlation with drug use during weekends, which is the period in which the first problematic experi-ences with alcohol and other drugs appear (initial stages of the drug addiction process). as conclusion, because drug addiction is a multi-step process and a preventable disease, our results indicate that the FAAH C385a SnP is one of the most promising candidates for individuals who are at higher risk for alcohol problems.

Keywords Drug addiction · evaluative learning · endocannabinoid system · FaaH gene · Genetic association study

Introduction

Drug addiction is a complex disease. Specifically, drug addiction is a multi-step process with overlapping stages (initiation, intermittent use, habituation, escalation, prob-lematic experiences, abstinence and relapse), which are associated with numerous neurobiological alterations (Chao and nestler 2004; Koob and Volkow 2010; Man-dyam and Koob 2012). Current research provides a general

Abstract Drug addiction is a complex disease with overlapping stages and influenced by multiple environ-mental and genetic factors. In addition to neurobiologi-cal changes, repeated drug exposure modulates affective responses to drug stimuli including visual cues. Here, we made a preliminary screening among ten Single nucleotide Polymorphisms (SnP) of the CNR1 (rs806368, rs1049353, rs6454674, rs7766029), FAAH (rs324420, rs12075550), DRD2 (rs6277), ANKK1 (rs1800497), COMT (rs4680), and OPRM1 (rs1799971) genes to identify that SnPs that were more directly associated with alcohol, tobacco and/or

Communicated by S. Hohmann.

Electronic supplementary material The online version of this article (doi:10.1007/s00438-013-0809-x) contains supplementary material, which is available to authorized users.

K.-M. Bühler · V. echeverry-alzate · J. a. lópez-Moreno (*) Department of Psychobiology, Faculty of Psychology, Complutense University of Madrid, Campus de Somosaguas, 28223 Madrid, Spaine-mail: jalopezm@psi.ucm.es

e. Huertas Department of Basic Psychology, Complutense University of Madrid, Campus de Somosaguas, 28223 Madrid, Spain

e. Giné Department of Cellular Biology, Faculty of Medicine, Complutense University of Madrid, 28040 Madrid, Spain

e. Moltó · l. Montoliu Department of Molecular and Cellular Biology, Centro nacional de Biotecnología (CnB-CSIC), Campus de Cantoblanco, Darwin 3, 28049 Madrid, Spain

e. Moltó · l. Montoliu Centro de Investigación Biomédica en red de enfermedades raras (CIBerer), ISCIII, Madrid, Spain

Author's personal copy

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A spontaneous deletion of α-synuclein is associated with anincrease in CB1 mRNA transcript and receptor expression in thehippocampus and amygdala: effects on alcohol consumption

Alejandro López-Jiménez1, Nicole A. R. Walter2, Elena Giné3, Ángel Santos3, VictorEcheverry-Alzate1, Kora-Mareen Bühler1, Pedro Olmos4, Stéphanie Giezendanner5,Rosario Moratalla6, Lluis Montoliu7,8, Kari J. Buck2, and Jose Antonio López-Moreno1

1Department of Psychobiology, Faculty of Psychology, Campus de Somosaguas, ComplutenseUniversity, 28223, Madrid, Spain 2Department of Behavioral Neuroscience, Veterans AffairsMedical Center and Oregon Health & Science University, Portland, Oregon 97239-30983Department of Biochemistry, Faculty of Medicine, Complutense University of Madrid, 28040,Madrid, Spain 4C.I.E.M.A.T. Avda. Complutense 22. Madrid. Spain 5Department of Psychology,University of Bern, Switzerland, Muesmattstrasse 45, 3000 Bern 9, Switzerland 6Instituto Cajal,Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), Avda. Dr. Arce 37, 28002, Madrid, Spain7Centro Nacional de Biotecnología, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Departmentof Molecular and Cellular Biology, Campus de Cantoblanco, C/Darwin 3, 28049 Madrid, Spain8Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Raras (CIBERER), ISCIII, Madrid,Spain

Abstractα-Synuclein (α-syn) protein and endocannabinoid CB1 receptors are primarily located inpresynaptic terminals. An association between α-syn and CB1 receptors has recently beenestablished in Parkinson’s disease, but it is completely unknown whether there is an associationbetween these two proteins in alcohol addiction. Therefore, we aimed to examine the α-synmRNA transcript and protein expression levels in the prefrontal cortex, striatum, amygdala andhippocampus. These brain regions are the most frequently implicated in alcohol and other drugaddiction. In these studies, we used C57BL/6 mice carrying a spontaneous deletion of the α-syngene (C57BL/6Snca−/−) and their respective controls (C57BL/6Snca+/+). These animals weremonitored for spontaneous alcohol consumption (3–10%) and their response to a hypnotic-sedative dose of alcohol (3 g/kg) was also assessed. Compared with the C57BL/6Snca+/+ mice, wefound that the C57BL/6Snca−/− mice exhibited a higher expression level of the CB1 mRNAtranscript and CB1 receptor in the hippocampus and amygdala. Furthermore, C57BL/6Snca−/− miceshowed an increase in alcohol consumption when offered a 10% alcohol solution. There was nosignificant difference in sleep time after the injection of 3 g/kg alcohol. These results are the firstto reveal an association between α-syn and the CB1 receptor in the brain regions that are mostfrequently implicated in alcohol and other drug addictions.

Corresponding author: Jose Antonio López Moreno, Laboratorio de Psicobiología, Departamento de Psicobiología, Facultad dePsicología, Campus Somosaguas Universidad Complutense de Madrid, E-28223 Madrid, Spain. Telephone no. +34–91–3943093, fax+34–91–3943189, jalopezm@psi.ucm.es, buckk@ohsu.edu.

Conflict of interestsNone

NIH Public AccessAuthor ManuscriptSynapse. Author manuscript; available in PMC 2014 June 01.

Published in final edited form as:Synapse. 2013 June ; 67(6): 280–289. doi:10.1002/syn.21639.

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Molecular and Cellular Endocrinology 365 (2013) 119–128

Contents lists available at SciVerse ScienceDirect

Molecular and Cellular Endocrinology

journal homepage: www.elsevier .com/locate /mce

Developmentally-induced hypothyroidism alters the expression of Egr-1 andArc genes and the sensitivity to cannabinoid agonists in the hippocampus.Possible implications for memory and learning

Elena Giné a,b, Victor Echeverry-Alzate c, Jose Antonio López-Moreno c, Alejandro López-Jimenez c,Daniel Torres-Romero b, Ana Perez-Castillo d,e,⇑, Angel Santos b,⇑a Departamento de Biología Celular, Facultad de Medicina, Universidad Complutense de Madrid, 28040 Madrid, Spainb Departamento de Bioquímica y Biología Molecular III, Facultad de Medicina, Universidad Complutense de Madrid, 28040 Madrid, Spainc Departamento de Psicobiología, Facultad de Psicología, Universidad Complutense de Madrid, 28040 Madrid, Spaind Instituto de Investigaciones Biomédicas, Consejo Superior de Investigaciones Cientificas, Universidad Autonoma de Madrid, 28029 Madrid, Spaine Centro de Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades Neurodegenerativas, CIBERNED, 28029 Madrid, Spain

a r t i c l e i n f o

Article history:Received 19 January 2012Received in revised form 7 September 2012Accepted 4 October 2012Available online 16 October 2012

Keywords:Thyroid hormoneCannabinoidDevelopmentHippocampusSpatial memory

0303-7207/$ - see front matter � 2012 Elsevier Irelanhttp://dx.doi.org/10.1016/j.mce.2012.10.004

Abbreviations: CB1R, cannabinoid type 1 receptorT4, L-thyroxine; T3, 3,5,30-triiodothyronine; CREB, cAMprotein; WIN 55,212-2, R-(+)-(2,3-dihydro-5-methpyrrolo[1,2,3-de]-1,4-benzoxazinyl](1-naphthalenyl)m(-)-11-hydroxy–8-tetrahydrocannabinol-dimethylhept1-yl)-5-(4-chlorophenyl)-1-(2,4-dichlorophenyl)-4mamide hydrochloride; AM251, N-(Piperidin-1-dichlorophenyl)-4-methyl-1H-pyrazole-3-carboxami⇑ Corresponding authors. Addresses: Departament

Molecular III, Facultad de Medicina, Universidad ComMadrid, Spain. Tel.: +34 91 3941446; fax: +34 91 394Investigaciones Biomedicas, Consejo Superior de Invversidad Autonoma, Arturo Duperier 4, 28029 Madridfax: +34 91 5854401 (A. Perez-Castillo).

E-mail addresses: aperez@iib.uam.es (A. Perez-Ca(A. Santos).

a b s t r a c t

We analyzed the role of the cannabinoid system in the cognitive deficits caused by developmentally-induced hypothyroidism. We studied in control and hypothyroid rats the effect of a cannabinoid agoniston spatial memory, hippocampal phosphorylation of CREB and expression of early genes. Our resultsshow that, 1-basal hippocampal expression of early genes and spatial learning are decreased in hypothyr-oid rats; 2-hypothyroid rats are very sensitive to cannabinoid agonists. Low dose of cannabinoid agonistineffective in controls altered spatial memory, CREB’s phosphorylation and early gene expression inhypothyroids. These effects are not due a change in CB1 receptor (CB1R) content. 3-Treatment ofhypothyroid rats with thyroid hormones normalized the biochemical and behavioral responses to canna-binoid agonists but did not correct the low basal levels of early gene transcripts and the deficits in spatiallearning. All these data suggest that the hippocampal deregulation of early genes expression could playan important role in the basal cognitive deficits of hypothyroid rats.

� 2012 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved.

1. Introduction superfamily, which includes, among others, the receptors for ste-

Thyroid hormones (L-thyroxine (T4) and 3,5,30-triiodothyronine(T3)) play an important role in the regulation of development andmetabolism in many mammalian tissues. Most of the actions ofthese hormones are mediated by the binding of T3 to specific nu-clear receptors. These receptors belong to the nuclear receptor

d Ltd. All rights reserved.

; MWM, Morris Water Maze;P responsive element bindingyl)-3-[(morpholinyl)methyl]ethanone mesylate; HU210,yl; SR141716A, N-(piperidin-

ethyl-1H-pyrazole-3-carbox-yl)-5-(4-iodophenyl)-1-(2,4-de.o de Bioquímica y Biologíaplutense de Madrid, 28040

2691 (A. Santos), Instituto deestigaciones Cientificas, Uni-, Spain. Tel.: +34 91 5854436;

stillo), piedras3@med.ucm.es

201

roid hormones, retinoids, vitamin D3, peroxisomal proliferatorsand many other proteins without known ligand (orphan receptors)(Aranda and Pascual, 2001). The nuclear receptors are transcriptionfactors, whose activity can be regulated by ligand-dependent and/or ligand-independent mechanisms (Beekum et al., 2009). Thyroidhormone receptors bind to specific DNA sequences in target genes,called thyroid hormone response elements, and regulate transcrip-tion initiation in a ligand dependent manner (Aranda and Pascual,2001; Flamant et al., 2007). Hence the regulation by thyroid hor-mones of the expression of a number of genes represents theirmain mechanism of action.

The brain is an important target for thyroid hormones (Bernal,2007; Williams, 2008), being the perinatal period the most criticalfor their action. It is during this period when the expression ofthyroid hormone receptors in the rat brain increases rapidly(Perez-Castillo et al., 1985) and when the consequences of hypothy-roidism are more dramatic, resulting in numerous alterations (Ber-nal, 2007). The sensitivity of the brain to the action of thyroidhormones depends of the developmental stage of the animals andthe specific area being considered. Marked differences in theresponse to these hormones have been reported in different areas

202

Genes, Brain and Behavior (2012) doi: 10.1111/j.1601-183X.2012.00793.x

C957T polymorphism of the dopamine D2 receptorgene is associated with motor learning and heart rate

E. Huertas∗,†,§, K.-M. Buhler‡,§,V. Echeverry-Alzate‡,§, T. Gimenez†,§

and J. A. Lopez-Moreno‡,§

†Laboratory of Human Experimental Psychology, Departmentof Basic Psychology, ‡Laboratory of Psychobiology,Department of Psychobiology, and §Faculty of Psychology,Universidad Complutense, Madrid, Spain*Corresponding author: E. Huertas, Facultad de Psicología, Cam-pus de Somosaguas, 28223 Madrid, Spain. E-mail: ehuertas@psi.ucm.es

Genetic variants that are related to the dopaminergic

system have been frequently found to be associated

with various neurological and mental disorders. Here,

we studied the relationships between some of these

genetic variants and some cognitive and psychophysio-

logical processes that are implicated in such disorders.

Two single nucleotide polymorphisms were chosen: one

in the dopamine D2 receptor gene (rs6277-C957T) and

one in the catechol-O-methyltransferase gene (rs4680-

Val158Met), which is involved in the metabolic degra-

dation of dopamine. The performance of participants on

two long-term memory tasks was assessed: free recall

(declarative memory) and mirror drawing (procedural

motor learning). Heart rate (HR) was also monitored dur-

ing the initial trials of the mirror-drawing task, which is

considered to be a laboratory middle-stress generator

(moderate stress), and during a rest period (low stress).

Data were collected from 213 healthy Caucasian uni-

versity students. The C957T C homozygous participants

showed more rapid learning than the T allele carriers in

the procedural motor learning task and smaller differ-

ences in HR between the moderate- and the low-stress

conditions. These results provide useful information

regarding phenotypic variance in both healthy individu-

als and patients.

Keywords: Dopaminergic, genetic polymorphism, heart rate,mirror drawing, procedural memory, recall, stress

Received 25 December 2011, revised 9 March 2012 and 31March 2012, accepted for publication 3 April 2012

Polymorphisms that are related to dopamine, and morespecifically, those that are linked to the dopamine D2 receptorgene (DRD2) and the catechol-O-methyltransferase (COMT)gene are frequently associated with various neurological andmental disorders characterized by alterations in cognitive

and emotional processes. One of the most clinically relevantsingle nucleotide polymorphisms (SNPs) of the DRD2 geneis C957T (rs6277), located at the Pro319 codon in the exon7. The C allele of the C957T SNP has been associated withlow striatal DRD2 availability (Hirvonen et al. 2004, 2005) andwith high DRD2 binding potential throughout the cortex andthalamus (Hirvonen et al. 2009b).

The Val158Met polymorphism (rs4680), which is locatedin exon 3 of the COMT gene, affects the activity of theCOMT enzyme, which degrades dopamine and other cate-cholamines (Lachman et al. 1996). The Met variant showslower dopamine-degrading activity relative to the Val vari-ant, resulting in higher dopamine levels, particularly withinthe prefrontal cortex and hippocampus (Chen et al. 2004;Dennis et al. 2010; Honea et al. 2009).

The striatum, one of the structures over which the C957TSNP has functional effects, plays a fundamental role in proce-dural memory, and more specifically, in skill acquisition (seeD’Amours et al. 2011; Seger & Spiering 2011). In fact, thistype of learning seems to be altered in disorders that affectthe presence of dopamine in the striatum, such as Parkin-son’s disease and Huntington’s disease (e.g. Ghilardi et al.2008; Harrington et al. 1990; Heindel et al. 1989; Muslimovicet al. 2007; see also Pendt et al. 2011). The Val158Met SNPcould also affect this type of learning either directly or indi-rectly (Dickinson & Elvevag 2009; Krugel et al. 2009).

For their part, the hippocampus and thalamus playfundamental roles in declarative memory, particularly inepisodic memory (e.g. Kopelman 1995; Squire 1982; Stewartet al. 2009; van der Werf et al. 2000). Some studies havesuggested that the COMT Met allele is associated withimproved performances on declarative memory tasks (e.g.de Frias et al. 2004), although other studies have foundno association between declarative memory and COMT(e.g. Dennis et al. 2010; Schott et al. 2006). A possible linkbetween the C957T SNP and declarative memory has notyet been established.

The C957T and Val158Met SNPs have also been linked tostress responsiveness. For example, CC genotype carriers ofthe C957T SNP showed more persistent high-amplitude skin-conductance responses in threatening situations (Huertaset al. 2010). Moreover, an examination of genetically alteredmice showed that COMT reduction results in exaggeratedstress reactivity (Papaleo et al. 2008). The low-activity COMTvariant has also been linked to greater stress sensitivity inhumans (van Winkel et al. 2008).

Therefore, the purpose of this study was to investigatewhether the C957T and Val158Met SNPs are functionallyrelated to either procedural memory (mirror-drawing learning)or declarative memory (verbal free recall). We also aimed tostudy possible links between these SNPs and autonomic

© 2012 The Authors 1Genes, Brain and Behavior © 2012 Blackwell Publishing Ltd and International Behavioural and Neural Genetics Society

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Review

The genetic basis of the endocannabinoidsystem and drug addiction in humans

Jose Antonio Lopez-Moreno, Victor Echeverry-Alzate andKora-Mareen Buhler

AbstractThe cannabinoid receptor (CNR1) and the fatty acid amide hydrolase (FAAH) genes are located on chromosomes 6 and 1 in the 6q15 and 1p33

cytogenetic bands, respectively. CNR1 encodes a seven-transmembrane domain protein of 472 amino acids, whereas FAAH encodes one transmembrane

domain of 579 amino acids. Several mutations found in these genes lead to altered mRNA stability and transcription rate or a reduction of the activity

of the encoded protein. Increasing evidence shows that these functional mutations are related to dependence upon cocaine, alcohol, marijuana,

heroin, nicotine and other drugs. One of the most compelling associations is with the C385A single nucleotide polymorphism (SNP), which is found in

the FAAH gene. For all of the genetic polymorphisms reviewed here, it is difficult to form overall conclusions due to the high diversity of population

samples being studied, ethnicity, the use of volunteers, heterogeneity of the recruitment criteria and the drug addiction phenotype studied. Care

should be taken when generalizing the results from different studies. However, many works have repeatedly associated polymorphisms in the CNR1 and

FAAH genes with drug-related behaviours; this suggests that these genes should be examined in further genetic studies focusing on drug addiction and

other psychiatric disorders.

KeywordsCannabinoid, CNR1, drug addiction, FAAH, genetic polymorphism, human, SNP

Introduction

Drug addiction is a chronic, relapsing disease characterized

by the compulsion to seek and take a drug, loss of control inlimiting intake and emergence of negative emotional stateswhen access to the drug is prevented (Koob and Le Moal,

1997). These emotional, cognitive and behavioural effectsare commonly linked to a neurobiological subtract. Manystudies have demonstrated that the endogenous cannabinoidsystem is directly linked to drug addiction. Such findings

range from preclinical to clinical trials and include themain legal and illegal drugs used in developed countries:nicotine, alcohol, cannabis, cocaine and opioids (Arnold,

2005; Colombo et al., 2005; Lopez-Moreno et al., 2010;Maldonado et al., 2006; Maldonado and Berrendero, 2010;Piomelli, 2004).

The endocannabinoid system is a signalling systemcomposed of (a) cannabinoid receptors, mainly CB1 andCB2; (b) endogenous ligands for these receptors, i.e. ananda-mide and 2-arachidonoylglycerol; and (c) enzymes involved in

the biosynthesis and deactivation of the endogenous ligands,i.e. fatty acid amide hydrolase (FAAH) and monoacylglycerol(MAG) lipase (Pertwee, 2006; Piomelli, 2003, 2004). The

endocannabinoid system is widely expressed throughout thebody; however, the CB1 receptor is primarily expressed inthe central nervous system. In fact, the CB1 receptor is the

most abundant G-coupled receptor in the brain (Herkenham

et al., 1990; Matsuda et al., 1990) and is expressed in thepre-synaptic terminals of GABAergic neurons such as theneocortical, amygdalar and hippocampal neurons, as well as

neurons at the outflow nuclei of basal ganglia (Julian et al.,2003; Mackie, 2005; Tsou et al., 1999). There is also denseCB1 expression in telencephalic, cerebellar glutamatergic and

cholinergic neurons (Piomelli, 2003; Rodrıguez de Fonsecaet al., 2005).

Immunocytochemical analysis indicates a complementarypattern of FAAH distribution and CB1 receptor localization

(Basavarajappa, 2007). However, there is a lack of CB1 andFAAH complementarity in certain brain areas, such as thethalamic, mesencephalic trigeminal and cerebellar nuclei.

FAAH-expressing neurons are widely present in these areas,but CB1 expression is absent. A possible explanation for thisphenomenon is the presence of anandamide targets other than

the CB1 receptor (Basavarajappa, 2007).

Department of Psychobiology, Faculty of Psychology, Complutense

University, Madrid, Spain.

Corresponding author:Jose Antonio Lopez Moreno, Laboratorio de Psicobiologıa, Department of

Psychobiology, Faculty of Psychology, Complutense University, Campus

Somosaguas, E-28223 Madrid, Spain

Email: jalopezm@psi.ucm.es

Journal of Psychopharmacology

26(1) 133–143

� The Author(s) 2012

Reprints and permissions:

sagepub.co.uk/journalsPermissions.nav

DOI: 10.1177/0269881111416689

jop.sagepub.com

at GEORGIAN COURT UNIV on April 2, 2015jop.sagepub.comDownloaded from

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