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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
CARRERA DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AMBIENTALES
Trabajo de titulación (Proyecto de Investigación) previo a la obtención del Título de
Licenciada en Ciencias Biológicas y Ambientales
Autor: Estévez Haro Michelle Alejandra
Tutor: Gavilánez Endara María Mercedes, PhD.
Quito, 2019
Análisis de tolerancia a diferentes niveles de pH en renacuajos de Gastrotheca
riobambae (Anura: Hemiphractidae).
i
DERECHOS DE AUTOR
Yo, Michelle Alejandra Estévez Haro en calidad de autor y titular de los derechos
morales y patrimoniales del trabajo de titulación: Análisis de tolerancia a diferentes
niveles de pH en renacuajos de Gastrotheca riobambae (ANURA:
HEMIPHRACTIDAE), modalidad proyecto de investigación, de conformidad con el
Art. 114 del CÓDIGO ORGÁNICO DE LA ECONOMÍA SOCIAL DE LOS
CONOCIMIENTOS, CREATIVIDAD E INNOVACIÓN, concedo a favor de la
Universidad Central del Ecuador una licencia gratuita, intransferible y no exclusiva para
el uso no comercial de la obra, con fines estrictamente académicos. Conservando a mi
favor todos los derechos de autor sobre la obra, establecidos en la normativa citada.
Así mismo, autorizo a la Universidad Central del Ecuador para que realice la
digitalización y publicación de este trabajo de titulación en el repositorio virtual, de
conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.
El autor declara que la obra objeto de la presente autorización es original en su forma de
expresión y no infringe el derecho de autor de terceros, asumiendo la responsabilidad
por cualquier reclamación que pudiera presentarse por esta causa y liberando a la
Universidad de toda responsabilidad.
____________________________
Michelle Alejandra Estévez Haro
C. C.: 1720580842
Dirección electrónica: [email protected]
ii
APROBACIÓN DEL TUTOR
En mi calidad de Tutora del Trabajo de Titulación, presentado por MICHELLE
ALEJANDRA ESTÉVEZ HARO, para optar por el grado de Licenciada en Ciencias
Biológicas y Ambientales; cuyo título es: Análisis de tolerancia a diferentes niveles
de pH en renacuajos de Gastrotheca riobambae (ANURA: HEMIPHRACTIDAE),
considero que dicho trabajo reúne los requisitos y méritos suficientes para ser sometido
a la presentación pública y evaluación por parte del tribunal examinador que se designe.
En la ciudad de Quito, a los 26 días del mes de julio de 2019
____________________
María Mercedes Gavilánez Endara, PhD.
DOCENTE-TUTORA
C.C.: 1713172797
iii
APROBACIÓN DEL INFORME FINAL/TRIBUNAL
El tribunal constituido por: M.Sc. Javier Torres y M.Sc. Juan Francisco Rivadeneira
Luego de Calificar el Informe Final de Investigación del trabajo de titulación
denominado: Análisis de tolerancia a diferentes niveles de pH en renacuajos de
Gastrotheca riobambae (ANURA: HEMIPHRACTIDAE), previo a la obtención del
título de Licenciada en Ciencias Biológicas y Ambientales presentado por la señorita
Michelle Alejandra Estévez Haro.
Emite el siguiente veredicto: APROBADO
Fecha: 10 de septiembre de 2019
Para constancia de lo actuado firman:
Nombre Apellido Calificación Firma
Vocal 1 M.Sc. Javier Torres …..………… ……………………..
Vocal 2 M.Sc. Juan Francisco Rivadeneira …..………… ……………………..
iv
DEDICATORIA
Este trabajo va dedicado a Dios, mi guía y protector, y a mi hermosa familia. En
especial a mi madre y abuelitos, que cada día me enseñan a ser mejor y salir adelante.
v
AGRADECIMIENTOS
Agradezco a mi tutora, María Mercedes Gavilánez por su paciencia, consejos y por ser
una inspiración para las mujeres en la ciencia.
A Andrés Merino, Director del proyecto Balsa de los sapos. Por haberme permitido
realizar este proyecto de investigación en las instalaciones del mismo y por brindarme
todas las facilidades para poder culminarlo con éxito.
Un especial agradecimiento al Docente Max Bonilla que me proporcionó los reactivos
necesarios y me guió en la parte química de la investigación siendo así una parte clave
de la misma.
Agradezco al Zoológico de Guayllabamba. A su director Martín Bustamante, a su
personal veterinario conformado por Shady Heredia, Erika Ortega y David Mora, y
finalmente a su personal de trabajo que apoyó mi investigación, que fueron Heidi
Cabezas, Paulina Sevilla, Marcelo Barrera y Adriana Heredia. Gracias por permitirme
trabajar con renacuajos y ranas adultas de Gastrotheca riobambae presentes en su
establecimiento y apoyarme en todo lo que necesité a lo largo de mi estudio.
Agradezco al personal que trabaja en las instalaciones de la Balsa de los sapos
conformada por Freddy Almeida, Flor Rosero y Xavier Rosero, que me apoyaron a lo
largo de mi tesis y al investigador Pol Pintanel que con sus recomendaciones aportó de
una manera significativa al proyecto.
Agradezco a Andy Proaño por su motivación en el transcurso de todo mi proyecto de
investigación, siendo el compañero de mis días y la persona que siempre me apoya e
incentiva a ser mejor. A mis amigos y amigas Iván de la Cruz, Malki Bustos, Valeria
Ayo y Gabriela Moscoso, por acompañarme a lo largo de mi vida universitaria y en este
trabajo.
Finalmente, pero no menos importante, agradezco a toda mi familia por apoyarme en
todo momento, siendo mi mayor amor, mi fuerza y mi soporte.
vi
ÍNDICE GENERAL
pág.
LISTA DE TABLAS ................................................................................................. viii
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................. ix
LISTA DE ANEXOS ................................................................................................... x
RESUMEN .................................................................................................................. xi
ABSTRACT ............................................................................................................... xii
INTRODUCCIÓN ........................................................................................................ 1
METODOLOGÍA ......................................................................................................... 4
Área de estudio ......................................................................................................... 4
Diseño de la investigación ........................................................................................ 4
Población y muestra .................................................................................................. 5
Metodología .............................................................................................................. 5
Establecimiento de tratamientos ............................................................................... 5
Medición de variables en renacuajos ........................................................................ 7
Supervivencia ............................................................................................................ 7
Peso ........................................................................................................................... 8
Morfometría .............................................................................................................. 8
Tiempo de metamorfosis .......................................................................................... 9
Toma de datos en campo ........................................................................................ 10
Análisis estadístico ................................................................................................. 10
RESULTADOS .......................................................................................................... 11
vii
DISCUSIÓN ............................................................................................................... 18
CONCLUSIONES ...................................................................................................... 23
RECOMENDACIONES ............................................................................................ 24
LITERATURA CITADA ........................................................................................... 25
ANEXOS .................................................................................................................... 33
viii
LISTA DE TABLAS
TABLA pág.
Tabla 1. Concentración y sustancias empleadas por cada tratamiento. ............................ 7
Tabla 2. Número de individuos que fallecieron a diferentes periodos de tiempo en los
tratamientos de pH extremos. ......................................................................................... 11
Tabla 3. Tratamientos entre los que se encontraron diferencias significativas (p= <
0.05). ............................................................................................................................... 13
Tabla 4. Datos fisicoquímicos tomados de cuerpos de agua en ambientes naturales
donde se ha registrado se desarrollan renacuajos de Gastrotheca riobambae. ............. 17
ix
LISTA DE FIGURAS
FIGURA pág.
Figura 1. Equipo utilizado para tomar fotografías de renacuajos. ................................... 9
Figura 2. Medidas tomadas de renacuajos de Gastrotheca riobambae, analizadas en el
estudio. .............................................................................................................................. 9
Figura 3. (A y B) Características de renacuajos expuestos a pH 3.5. (C) renacuajo
expuesto a un pH de 11.5, sin estructuras bucales. ........................................................ 12
Figura 4. Análisis del peso de los individuos al finalizar las 96 horas. .......................... 12
Figura 5. Porcentaje de variación en el peso de renacuajos en los diferentes tratamientos
al inicio y al final de las 96 horas de estudio. ................................................................. 13
Figura 6. Diferencia entre el peso inicial y final de los tratamientos donde se reportó la
muerte de todos los individuos. (A) diferencia de peso del tratamiento 3.5. (B)
diferencia de peso del tratamiento 11.5. ......................................................................... 14
Figura 7. Diferencia de longitud total (LT) de individuos entre tratamientos. ............... 15
Figura 8. Diferencias en el ancho total (AT) de individuos entre tratamientos.............. 15
Figura 9. Días que los renacuajos tardaron en culminar la metamorfosis en función de
los tratamientos establecidos. ......................................................................................... 16
Figura 10. Fotografías de renacuajos encontrados en los diferentes puntos de muestreo
en fechas anteriores. (A) Imbabura. San Pablo-Gualaví. (B) Parque Metropolitano de
Quito. .............................................................................................................................. 16
x
LISTA DE ANEXOS
ANEXO
pág.
ANEXO A. Estadíos por los que pasan renacuajos de anuros. Fuente: (Gosner, 1960). 33
ANEXO B. Permiso de investigación otorgado por el Ministerio del Ambiente
Ecuatoriano. .................................................................................................................... 36
ANEXO C. Aval ético otorgado por la Universidad Central del Ecuador. ................... 38
ANEXO D. Protocolos de modificación de pH y renovación de agua. ......................... 39
ANEXO E. Definición de sustancias utilizadas para modificar el pH .......................... 40
ANEXO F. Protocolo para medición de individuos en el programa Image J. ............... 41
ANEXO G. Individuos ingresados en la colección del Museo de Zoología- Sección
Herpetología QCAZ. ...................................................................................................... 42
ANEXO H. Certificado de permanencia de individuos en cautiverio para su
observación. .................................................................................................................... 44
xi
TEMA: Análisis de tolerancia a diferentes niveles de pH en renacuajos de Gastrotheca
riobambae (ANURA: HEMIPHRACTIDAE).
Autor: Michelle Alejandra Estévez Haro
Tutor: María Mercedes Gavilánez
RESUMEN
Gastrotheca riobambae es una especie endémica del Ecuador que se encuentra en
categoría de amenaza. Es importante realizar estudios que ayuden a entender cómo
diversos factores afectan su crecimiento y supervivencia, por lo que la presente
investigación evaluó los efectos del cambio de pH en la supervivencia, peso, tamaño y
tiempo que tardan en culminar la metamorfosis renacuajos de G. riobambae desde el
estadío 30. Se trabajó con 270 individuos divididos en ocho tratamientos de pH y un
control con pH cercano al neutro. Los resultados indican que renacuajos de G.
riobambae, en condiciones de laboratorio, presentan un amplio rango de tolerancia al
pH que va desde pH 4.5 hasta 10.5. Se encontraron diferencias significativas entre
tratamientos para supervivencia, peso, tamaño (ancho total) y días de metamorfosis,
mientras que la longitud total del cuerpo no se vió afectada por cambios en pH. Los
resultados sugieren que de existir variaciones significativas en los niveles ambientales
normales de pH, los renacuajos podrían sufrir efectos que pueden repercutir en su
supervivencia.
PALABRAS CLAVE: RENACUAJOS, SUPERVIVENCIA, CONTAMINACIÓN, CONSERVACIÓN, PH ÁCIDO, PH BÁSICO
xii
TITLE: Tolerance analysis at different pH levels in Gastrotheca riobambae tadpoles
(ANURA: HEMIPHRACTIDAE).
Author: Michelle Alejandra Estévez Haro
Tutor: María Mercedes Gavilánez
ABSTRACT
Gastrotheca riobambae is an endemic species from Ecuador which is currently
considered as endangered. It is important to carry out studies to understand how several
elements may influence its growth and survival. The present study studied effects of pH
variation in survival, weight, size and time to metamorphose in G. riobambae tadpoles
starting at stage 30. We worked with 270 individuals, divided into eight pH treatments
and one control that was close to neutral pH. Results show that G. riobambae tadpoles
under laboratory conditions have a wide range of pH tolerance, ranging from 4.5 to
10.5. Statistically significant differences among treatments were reported for survival,
weight, size (total width), and time to metamorphosis, while length was not affected by
changes in pH. These results suggest that if is significant variation in natural
environmental pH levels occurs, tadpoles could experience effects that may influence
their survival.
I CERTIFY that the above and foregoing is a true and correct translation of the original
document in Spanish
_________________
Name: Mercedes Gavilánez
Certified Translator
ID: 1713172797
KEYWORDS: TADPOLES, SURVIVAL, POLLUTION, CONSERVATION,
ACID PH, BASIC PH
1
INTRODUCCIÓN
Para las sociedades humanas, los anfibios representan recursos importantes en ámbitos
culturales y científicos (Bioweb 2019). En los ecosistemas son especies clave, actuando
en redes tróficas, en el reciclaje de nutrientes y en procesos de bioturbación
(modelamiento del hábitat en estado larval) (Cortés-Gomez et al. 2015; Dutra y Callisto
2005). Desde hace algunos años atrás se ha observado la disminución de poblaciones de
anfibios debido a factores como la introducción de especies exóticas, el cambio
climático, las enfermedades y la radiación ultravioleta, que actuando de manera
individual o sinérgica, pueden disminuir sus poblaciones (Anzalone y Gordón 2016;
Bustamante et al. 2005; Carey et al. 1999; Heyer y Murphy 2005). Entre estos factores
antrópicos, la modificación de hábitat y la contaminación química de cuerpos de agua
son los que presentan un mayor impacto en este grupo, debido a que poseen un ciclo de
vida que abarca la zona terrestre y acuática, por lo que su degradación los afecta
gravemente (Bustamante et al. 2005; Ceballos y Ortega-Baez 2011; Harper et al. 2008;
Mattoon 2000; Sá 2005).
En el Ecuador actualmente están registradas 622 especies de anfibios de las cuales 164
se encuentran en alguna categoría de amenaza (Bioweb 2019). Gastrotheca riobambae
conocida como la rana marsupial de Quito, se encuentra actualmente categorizada como
“vulnerable” por la Lista roja de anfibios del Ecuador (Bioweb 2019) y “en peligro de
extinción “ por Lista Roja de Especies Amenazadas de la UICN (Coloma et al. 2004),
esto debido a que se ha observado el declive de sus poblaciones (Ramirez y Rodríguez
2011).
Esta especie se distribuye en bosques y valles interandinos del norte y centro del
Ecuador desde los 1800 hasta los 3220 metros sobre el nivel del mar (Chasiluisa et al.
2018). Presenta un modo reproductivo exitoso, ya que reduce la necesidad de agua en el
desarrollo de los embriones (Duellman y Trueb 1994). Después de la fecundación
externa, el macho introduce los huevos en el marsupio de la hembra, en donde puede
2
mantener aproximadamente 120 huevos con 2.7 a 3.6 milímetros de diámetro, durante
todo el desarrollo embrionario (Del Pino y Escobar 1981). Meses después de este
suceso, la madre extrae del marsupio, con sus patas traseras, a los renacuajos, mismos
que salen nadando al cuerpo de agua en horas de la noche para culminar su proceso de
metamorfosis en alrededor de 120 días (Del Pino 1980; Del Pino y Escobar 1981).
Los renacuajos de esta especie, y de otros anuros, pasan por muchos cambios
importantes durante el proceso de metamorfosis denominados estadíos (Gosner 1960).
Los estadíos son diferenciados por números, y cada uno describe los diversos cambios
externos por los que pasa el embrión hasta culminar el proceso de metamorfosis (Anexo
A). Entre estos destacan para la especie el estadío 25 que es cuando salen del marsupio
de sus madres y empiezan su etapa de vida libre, por lo que ya han retraído sus
branquias y pueden comer por ellos mismos (Gosner 1960; Del Pino y Escobar 1981), y
también el estadío 42 que es cuando el renacuajo ya posee las 4 extremidades (Gosner
1960).
Hasta el momento se han realizado varios estudios con renacuajos de la especie que
abarcan temas de enfermedades (Manzano 2010) y de ecofisiología térmica (Yandún
2017), que ayudan a entender como estos factores afectan a esta especie. Es importante
realizar más estudios complementarios como lo son, estudios de tolerancia al pH. Esta
información es significativa debido a que parámetros fisicoquímicos, tales como el pH,
son trascendentales a la hora de determinar la distribución y abundancia de anuros en su
hábitat natural (Angulo et al. 2006).
Los procesos de acidificación en ambientes naturales pueden ocurrir por el drenaje de
contaminantes derivados de fuentes agrícolas (i.e. fertilizantes o plaguicidas) (Acero
2019; Mattoon 2000), o por fenómenos como la lluvia ácida. Los óxidos de azufre,
carbono y nitrógeno contribuyen a la formación de lluvia ácida provocando que a
diferencia de la lluvia normal ( pH de entre 5.7 a 7), su pH descienda hasta 3.9 (Garcés
y Hernández 2004; Likens y Bormann 1974; Weitzenfeld 1992). En Quito, gracias al
estudio de Flores y Bonilla (2008) se registró que la mitad de la ciudad se ve afectada
por la lluvia ácida con un pH de 4.6. Los sistemas lénticos (charcos de agua temporales)
donde se desarrollan renacuajos de G. riobambae pueden verse afectados por procesos
3
de lluvia ácida, al presentarse escorrentía superficial o mediante lixiviados de los suelos
(Granados et al. 2010).
Estos procesos de cambio de pH pueden causar afectaciones a renacuajos. Como
menciona Freda, 1986; Freda & Dunson, (1985) cuando los renacuajos son expuestos a
un pH ácido pierden la estabilidad de sodio (Na) en su cuerpo por lo que mueren.
Además, varios estudios realizados sobre la interacción del pH y los anfibios, en
diferentes especies (Rana temporaria, Rhinella granulosa, Hypsiboas crepitans,
Rhinella marina y Engystomops pustulosus) han encontrado que los individuos pueden
morir en niveles de pH extremos (i.e. menores a pH 4 y mayores a pH 9), o en otros
casos, en condiciones menos extremas de pH se han observado efectos subletales como
el desarrollo retardado y un tamaño corporal reducido, efectos que pueden repercutir en
su supervivencia en la naturaleza (Fominykh 2008; Muñoz y Bautista 2011; Räsänen et
al. 2002).
Con estos antecedentes la presente investigación plantea estudiar el efecto del cambio
del pH en renacuajos de G. riobambae, tomando en cuenta que es una especie endémica
del Ecuador y es una de las últimas especies que se encuentran en Quito (Bioweb 2019).
Se escogió trabajar con estados larvales de la especie ya que son importantes
determinantes del crecimiento poblacional (Lips y Reaser 2001), además los anfibios
son excelentes modelos en bioensayos gracias a que son fáciles de estudiar, debido a
que presentan una alta sensibilidad dada por su fisiología (i.e. piel permeable) y
requerimientos de hábitat (Sparling et al. 2002).
El presente estudio midió la tolerancia de renacuajos de Gastrotheca riobambae a
diferentes niveles de pH basado en variables tales como supervivencia, peso, tamaño y
tiempo que tardan en culminar la metamorfosis, con el fin de aportar datos que son
claves para su conservación in-situ y ex-situ. En este sentido, se plantearon las
siguientes hipótesis:
Ho: La variación de pH no influye en aspectos como la morfometría, peso y tiempo de
metamorfosis de renacuajos de Gastrotheca riobambae.
4
Ha: La variación de pH influye en aspectos como la morfometría, peso y tiempo de
metamorfosis de renacuajos de Gastrotheca riobambae.
METODOLOGÍA
Previo al desarrollo del estudio se obtuvo el respectivo permiso de investigación del
Ministerio de Ambiente del Ecuador (Anexo B). Además, se obtuvo un aval ético
otorgado por el Comité de Ética de la Universidad Central del Ecuador (Anexo C).
Área de estudio
La investigación fue llevada a cabo en el laboratorio de ecofisiología de la Pontificia
Universidad Católica del Ecuador, ubicado en las instalaciones de la iniciativa de
conservación “Balsa de los sapos”, perteneciente al museo de zoología QCAZ (Quito-
Católica-Zoología).
Se trabajó con renacuajos obtenidos de eventos de reproducción de ranas del zoológico
de Guayllabamba para asegurar que el trabajo se dé con una sola cohorte, conociendo
sus datos desde el nacimiento y evitando diferencias de tamaño, estadío u otros factores
que podrían influir en los resultados si los individuos son tomados de la naturaleza.
Diseño de la investigación
El estudio fue de tipo experimental, controlado, aleatorio paralelo. Siendo los distintos
niveles del pH la variable independiente y aspectos tales como la supervivencia en 96
horas, peso, tamaño y tiempo que tardan en culminar el proceso de metamorfosis las
variables de respuesta o dependientes.
5
Población y muestra
El número de individuos seleccionados para la investigación fue escogido en base a
diferentes trabajos previos relacionados (Muñoz y Bautista 2011; Padhye y Ghate
1988), donde establecen un mínimo de 10 individuos por tratamiento con sus
respectivas réplicas. Considerando estos valores, y aplicando la fórmula de muestreo
aleatorio simple, se obtuvo un tamaño de muestra de 270 renacuajos, divididos en 9
tratamientos (30 individuos por cada tratamiento).
Donde:
p= probabilidad respondan al tratamiento (0.6)
q= probabilidad que no presenten respuesta (0.4)
z= valor de tabla z a un alfa de 0.05 (1.96)
e= nivel de error aceptable (0.17)
Metodología
En la investigación se aplicó el método: Frog embryo teratogénesis assay- Xenopus
(FETAX) (Dumont et al. 1983), que corresponde a un bioensayo comúnmente usado en
ecotoxicología de anfibios desarrollado en 96 horas (Hu et al. 2015). Después de este
periodo se mantuvieron a los renacuajos en los distintos tratamientos hasta la
culminación del proceso de metamorfosis para la realización de los análisis planteados.
Los renacuajos en experimentación se mantuvieron en el laboratorio a una temperatura
promedio de 21ºC y tuvieron 12 horas de iluminación y 12 horas de oscuridad.
Establecimiento de tratamientos
Para la fase experimental, se utilizaron recipientes redondos de 29 x 14 cm, donde se
colocaron 2000 ml de agua reposada junto con 10 renacuajos en estadío 30, debido a
6
que ya poseen vida libre (sus branquias se encuentran retraídas y comen por ellos
mismos) (Gosner 1960).
Se establecieron tratamientos en un rango de valores de pH ácido (3.5, 4.5, 5.5, 6.5),
básico (8.5, 9.5, 10.5 y 11.5) y un control que se asemejó al pH natural donde se
desarrolla la especie (pH 7.5). En el Anexo D se describe el protocolo seguido para
ajustar el pH de cada tratamiento y renovar el agua.
Para facilitar el intercambio de la sustancia ácida o básica en todo el recipiente, y evitar
que el nivel de oxígeno disminuya, todos los tratamientos contaron con aireación. Cada
manguera conectada al recipiente emitía aproximadamente 486 ml de aire/minuto.
La verificación, y en caso de ser necesario modificación del pH, se realizó cada 12
horas, mientras que la renovación del agua se realizó cada 24 horas. Para evitar el
cambio en el pH de los tratamientos no se colocó alimento durante las 96 horas del
estudio. La alimentación de los renacuajos (0,94 g de alimento de tipo omnívoro) se dio
diariamente mientras se renovaba el agua, debido a que el alimento que se usa en la
Balsa de los sapos modifica el pH, haciéndolo alcalino en un nivel de 0.11 (i.e. de pH 4.
50 cambia a pH 4. 61).
Para alcanzar los niveles de pH deseados se utilizaron tres reactivos. Para el pH ácido se
utilizó el ácido clorhídrico y el producto acid regulator, mientras que para el pH básico
se utilizó el hidróxido de sodio (Tabla 1, Anexo E). Se escogieron estas sustancias ya
que han sido aplicadas en estudios previos relacionados con la variación de pH en
ensayos con renacuajos (Gosner y Black 1957; Muñoz y Bautista 2011), por lo que se
conoce que estas sustancias son efectivas, y en bajas cantidades como las que se
emplearon en este estudio no llegan a ser tóxicas para los organismos.
Para la medición del pH se utilizó el potenciómetro marca VOLTCRAFT PH-212. El
pH establecido en cada tratamiento no varió significativamente al paso de las 12 horas,
siendo los tratamientos de 3.5, 4.5 y 8.5 los que mantuvieron su pH más constante,
mientras en los otros hubo una variación que no fue mayor a 1 (i.e. de 6.5 hasta 7)
7
Tabla 1. Concentración y sustancias empleadas por cada tratamiento.
Nivel de pH Sustancia utilizada Concentración de la disolución
(%)
3.5 Ácido clorhídrico 0,1
4.5 Ácido clorhídrico 0,68
5.5 Ácido clorhídrico 0,58
6.5 Acid regulator / Ácido clorhídrico 0,029 / 0,0020
7.5 Ninguna (control) 0
8.5 Hidróxido de sodio 0,00050
9.5 Hidróxido de sodio 0,0014
10.5 Hidróxido de sodio 0,0042
11.5 Hidróxido de sodio 0,0062
Medición de variables en renacuajos
Para determinar la tolerancia de renacuajos a variaciones de pH, se realizaron
mediciones en diferentes momentos de la investigación. En el transcurso de las primeras
96 horas se midió la supervivencia. El peso de los individuos se tomó al inicio y al final
de las 96 horas. De la misma manera al final de las 96 horas se tomaron medidas
morfológicas (longitud y ancho total). Finalmente se contabilizaron en días, el tiempo
que tardaron en culminar la metamorfosis.
Supervivencia
Para medir la supervivencia se revisaron los renacuajos cada 12 horas desde la hora
cero hasta la hora 96 y se contó a los individuos vivos y muertos por cada tratamiento.
Al encontrarse un individuo muerto, este era extraído del recipiente, se tomaba su peso,
era analizado en el estereoscopio para su posterior descripción y finalmente se lo
8
almacenaba en un frasco de vidrio con etanol al 75 %, mismo que se encontraba
etiquetado con datos del pH al que pertenecía.
Peso
Para determinar el peso de los individuos, se ubicaba al renacuajo sin exceso de agua en
su cuerpo, dentro de un vaso con agua reposada, previamente colocado en la balanza
analítica marca BOECO, calibrada y en cero, donde finalmente se obtenía su peso en
gramos.
Morfometría
Para evitar la constante manipulación de los individuos y reducir el tiempo empleado en
toma de datos, se tomaron fotografías que posteriormente fueron procesadas en el
programa Image J (Davis et al. 2008), versión 1.52 a (Rasband 1997) (Anexo F).
Para tomar las fotografías, se utilizó una cámara Nikon D 5300 con un lente de 35-80
milímetros. La cámara fue ubicada en un trípode frente a una caja de vidrio de 125 x 65
cm, diseñado especialmente para la toma de fotografías de renacuajos. En su parte
interior se colocó una pieza móvil de vidrio con papel milimetrado que sirvió de
referencia para medir al individuo, además, que esta pieza ayudó a retener al renacuajo
al presionarlo ligeramente contra la pared para inmovilizarlo (Figura 1). Para guiar el
movimiento del renacuajo se utilizaron palillos de 3,6 mm de grosor.
9
Figura 1. Equipo utilizado para tomar fotografías de renacuajos.
Las medidas analizadas en las fotografías fueron: Longitud total (LT: desde la punta de
la boca hasta la punta de la cola) y el ancho total (AT: Desde un extremo a otro de la
cabeza) (Figura 2).
Figura 2. Medidas tomadas de renacuajos de Gastrotheca riobambae, analizadas en el
estudio.
Tiempo de metamorfosis
El tiempo de metamorfosis se tomó en cuenta desde el día de nacimiento de los
renacuajos hasta que los individuos se encontraban en estadío 42, es decir cuando ya
poseían sus 4 extremidades (Fioramonti et al. 1997; Gosner 1960). El tiempo que
tardaron en culminar la metamorfosis fue medido en días.
Al finalizar el estudio un número de individuos fueron ingresados como vouchers de la
investigación en el Museo de Zoología Sección Herpetología- QCAZ (Anexo G). Como
parámetro que se tomó en cuenta para enviar a los individuos al museo fue que se vean
débiles y tengan un bajo peso y talla, a diferencia de los otros individuos que su
comportamiento y aspecto era normal, los mismos que actualmente son mantenidos en
cautiverio para su observación (Anexo H).
10
Toma de datos en campo
Para conocer los parámetros fisicoquímicos de cuerpos de agua en donde se desarrolla
la especie en ambientes naturales, en una salida de campo se recolectaron muestras de
agua en botellas plásticas previamente desinfectadas con etanol al 70 %, en horas de la
mañana en lugares donde se ha registrado la presencia de renacuajos de G. riobambae.
Estas muestras fueron analizadas en el laboratorio de la Facultad de Ciencias Biológicas
de la Universidad Central del Ecuador, usando el equipo Sper Scientific modelo 850038
y 850041, para medir la conductividad, la temperatura y el total de sólidos disueltos, y
el equipo Milwaukee modelo Mi 151 para medir el pH y el voltaje.
Análisis estadístico
Se realizó la prueba Shapiro-Wilk para analizar la normalidad de los datos. Para el
procesamiento de datos de peso y tamaño se aplicó ANOVA de un factor, seguido de
una prueba de significancia de Tukey en el programa estadístico SPSS versión
17.0.(SPSS 2008), mientras que para el análisis de datos de supervivencia, datos
complementarios de peso y los días que tardaron en culminar la metamorfosis se utilizó
en el programa Excel (2013). El nivel de significancia (alfa) con el que se trabajó en el
presente estudio fue de 0.05.
11
RESULTADOS
En la presente investigación se observó que aspectos como la morfometría, peso y
tiempo de metamorfosis de renacuajos de Gastrotheca riobambae varían en función a
diferentes niveles de pH, por lo que se rechaza la hipótesis nula.
Datos de supervivencia
En el seguimiento realizado a lo largo de las 96 horas se reportó la muerte de todos los
individuos de los tratamientos extremos de pH 3.5 y 11.5, mientras que pocos murieron
en el tratamiento de pH 10.5 (Tabla 2).
Tabla 2. Número de individuos que fallecieron a diferentes periodos de tiempo en los
tratamientos de pH extremos.
Tiempo
Tratamiento
12
horas
24
horas
36
horas
48
horas
60
horas
72
horas
84
horas
96
horas
3.5 1 12 _ 13 3 _ 1 _
10.5 _ _ _ _ _ 1 _ _
11.5 30 _ _ _ _ _ _ _
Las características que presentaron los renacuajos que murieron variaron, en función del
tratamiento al que estuvieron expuestos. Para el pH 3.5 se observó desmembramiento y
una reducción de la altura de la aleta caudal (Figura 3, A y B). En los individuos del
tratamiento 11.5 se observó el desprendimiento de una sustancia de aspecto
mucilaginoso de todo el cuerpo del renacuajo, además se registró el desprendimiento de
sus estructuras bucales (Figura 3, C).
12
A. B. C.
Figura 3. (A y B) Características de renacuajos expuestos a pH 3.5. (C) renacuajo
expuesto a un pH de 11.5, sin estructuras bucales.
Peso de individuos
En el análisis de varianza del peso de los individuos se encontraron diferencias
significativas entre tratamientos de pH (p= 0,000 y f= 5,681) (Figura 4).
Figura 4. Análisis del peso de los individuos al finalizar las 96 horas.
Al realizar la prueba de Tukey, se encontraron diferencias significativas entre varios de
los tratamientos (Tabla 3).
13
Tabla 3. Tratamientos entre los que se encontraron diferencias significativas (p= <
0.05).
Tratamiento de
pH ácido 4.5
Tratamiento de
pH ácido 5.5
Control Tratamiento
de pH básico
8.5
Tratamiento
de pH básico
9.5
Tratamiento de pH
ácido 4.5
_ _ _ _ _
Tratamiento de pH
ácido 5.5
0,037 _ _ _ 0,027
Control _ 0,000 _ _ _
Tratamiento de pH
básico 8.5
_ _ 0,000 _ _
Tratamiento de pH
básico 9.5
_ _ _ 0,041 -
Al analizar el porcentaje de cambio de peso de los individuos (inicial y final) a lo largo
de 96 horas, se observó un crecimiento normal en los tratamientos a excepción de los
renacuajos expuestos a pH ácido de 4.5 y básico de 10.5 donde los de tratamiento ácido
redujeron su peso y los de básico no presentaron un aumento del mismo, por lo que el
patrón observado denota que a niveles más alejados del control el peso disminuye
(Figura 5).
Figura 5. Porcentaje de variación en el peso de renacuajos en los diferentes
tratamientos al inicio y al final de las 96 horas de estudio.
-8,16%
9,68%
16,03%
12,00%
16,00%
7,83%
-0,53%
4.5 5.5 6.5 Control 8.5 9.5 10.5
-10,00%
-5,00%
0,00%
5,00%
10,00%
15,00%
20,00%
Tratamientos
Po
rcen
taje
de
dif
eren
cia
de
pes
o en
96
ho
ras
14
Se evidenció además que los individuos de tratamientos letales de 3.5 y 11.5
mostraron diferentes patrones en su peso, encontrándose que a un pH 3.5 los individuos
murieron con un peso reducido y los de pH 11.5 incrementaron en gran medida el
mismo (Figura 6).
Figura 6. Diferencia entre el peso inicial y final de los tratamientos donde se reportó la
muerte de todos los individuos. (A) diferencia de peso del tratamiento 3.5. (B)
diferencia de peso del tratamiento 11.5.
Tamaño de renacuajos
En el análisis de varianza realizado con el tamaño de los individuos, no se encontraron
diferencias significativas entre tratamientos en la longitud total, a diferencia del ancho
donde sí se encontraron variaciones. El análisis de Tukey mostró que estas variaciones
de ancho total (AT) se presentaron en los tratamientos de pH 4.5 con el pH 10.5
(p=0,044) y de la misma forma el pH 10.5 tuvo diferencia con el control (p=0,042)
(Figuras 7 y 8).
A B
15
Figura 7. Diferencia de longitud total (LT) de individuos entre tratamientos.
Figura 8. Diferencias en el ancho total (AT) de individuos entre tratamientos.
Proceso de metamorfosis
Los días que tardaron en culminar la metamorfosis variaron entre tratamientos, siendo
los individuos del tratamiento de pH 9.5 los que tardaron más días, seguidos por el
tratamiento de pH 5.5, a diferencia de los otros que tardaron casi el mismo tiempo,
como se evidencia en la Figura 9.
16
Figura 9. Días que los renacuajos tardaron en culminar la metamorfosis en función de
los tratamientos establecidos.
pH en cuerpos de agua
El pH medido en ambientes naturales donde se ha registrado la presencia de la especie
(Figura 10) varió en función de si era de origen natural, artificial y el nivel del agua.
Entre los datos analizados se destaca el único punto donde se encontraron renacuajos de
la especie, el mismo que presentaba un pH de 7.34. En otros puntos como el ubicado en
el Parque Metropolitano se presentó un pH de 6.90 (ligeramente ácido), mientras que en
otro punto ubicado en San Pablo se encontró un pH de 8.43 que fue básico (Tabla 4).
Figura 10. Fotografías de renacuajos encontrados en los diferentes puntos de muestreo
en fechas anteriores. (A) Imbabura. San Pablo-Gualaví. (B) Parque Metropolitano de
Quito.
66
67
66 66
65
69
65
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
4.5 5.5 6.5 Control 8.5 9.5 10.5
Tie
mp
o d
e m
etao
rfo
sis
(Día
s)
Tratamientos
A B
17
Tabla 4. Datos fisicoquímicos tomados de cuerpos de agua en ambientes naturales donde se ha registrado se desarrollan renacuajos de
Gastrotheca riobambae.
Pu
nto
Lo
cali
da
d
Co
ord
ena
da
s
(UT
M)
Tem
per
atu
ra
(ºC
)
pH
Co
nd
uct
ivid
ad
(µs)
Só
lid
os
dis
uel
tos
tota
les
(pp
m)
Po
ten
cia
l
eléc
tric
o (
mV
)
Co
lor
Pro
fun
did
ad
pro
med
io (
cm)
An
cho
(m
)
La
rgo
(m
)
Est
ad
o t
rófi
co
Ob
serv
aci
on
es
1 Imbabura. San
Pablo-Araque
17+
811045 22985 17,7 7.34 290 145 -19,60 transparente 22 3 60
no
eutrofizado
Se encontraron
renacuajos
junto a
preñadillas.
2
Imbabura. San
Pablo- Gualaví
(superficie)
17+
807281 22333
18,7 8.43 150,3 75,2 -82,30 transparente 36 0,96 3,75 no
eutrofizado De origen
artificial, no se
registraron
renacuajos
pero se los
observo en el
mes de Enero.
2
Imbabura San
Pablo- Gualaví
(parte media)
17,9 8.31 148,3 74,1 -75,80 transparente 36 0,96 3,75 no
eutrofizado
2
Imbabura. San
Pablo- Gualaví
(fondo)
18,5 8.21 147,9 73,9 -70,30 transparente/
amarillenta 36 0,96 3,75
no
eutrofizado
3
Pichincha. Parque
Metropolitano
Guangüiltagua
17-
782287 9979269 17,1 6.90 233 117 -6,2
café oscuro/
grisáceo 11 3,9 3
muy
eutrofizado
La poza se
estaba
secando.
4
Pichincha. Parque
Metropolitano
Guangüiltagua
17-
782223 9980178 16,4 7.08 93,5 46,7 -1,7
amarillenta
con partículas
de color café
30
(cerca de
orilla)
14 23 eutrofizado
No se
observaron
renacuajos.
18
DISCUSIÓN
Gastrotheca riobambae mostró ser una especie tolerante a un amplio rango de pH
(desde 4.5 hasta 10.5), lo que podría estar asociado a su habilidad de habitar en áreas
intervenidas (i.e. cultivos y parques) (Duellman y Trueb 2015), ya que, anfibios
comúnmente expuestos a factores de estrés de origen antropogénico, presentan
adaptaciones evolutivas rápidas (Glos et al. 2003; Räsänen 2002).
La especie es resistente a varios parámetros fisicoquímicos en niveles altos, tomando en
cuenta los resultados del presente estudio, así como los de Yandún (2017) donde
menciona que renacuajos de G. riobambae pueden resistir hasta 40.3 ºC. Esta tolerancia
podría variar si se analiza su respuesta en base la sinergia de estos dos factores, llevando
posiblemente a determinar la causa de la disminución de sus poblaciones, ya que los
efectos combinados de pH, fragmentación o enfermedades pueden causar procesos de
extinciones locales (Harper et al. 2008; Siavichay-Pesántez et al. 2016).
Los resultados obtenidos de la exposición de renacuajos de G. riobambae a niveles de
pH ácido letales en este estudio, coinciden con lo expuesto por Barth y Wilson (2010)
donde encontraron que los renacuajos de Limnodynastes peronei morían a un pH
extremo (entre 3.5 y 4). Los resultados de pH básico letal (pH 11.5) para esta especie,
contrasta con el estudio de Fominykh (2008) realizado en dos especies de salamandra y
una de rana (Salamandrella keyserlingii, Lissotriton vulgaris y Rana temporaria) las
cuales no toleraron niveles de pH mayores a 9.
En el presente trabajo todos los individuos expuestos a pH básico de 11.5 murieron en
12 horas, mientras que individuos expuestos a un pH ácido de 3.5 murieron en
diferentes periodos de tiempo, lo que se puede atribuir a la naturaleza de la sustancia
aplicada para modificar el pH. Como menciona Rodríguez (2014), en su estudio con
cuatro especies de anuros (Rhinella humboldti, Rhinella marina, Hypsiboas crepitans,
y Leptodactylus insularum) el ácido clorhídrico y el hidróxido de sodio (sustancias
utilizadas en esta investigación) conllevaron un supervivencia menor al 50%, mientras
que el ácido acético y el hidróxido de amonio, conllevaron una supervivencia menor al
30%, en menos tiempo, por lo que, diferentes sustancias contaminantes que modifican
19
el pH en cuerpos de agua naturales, pueden reducir o incrementar la supervivencia de
renacuajos.
Los individuos que no murieron en las primeras 96 horas, continuaron con su desarrollo
normal, coincidiendo con lo observado por Muñoz y Bautista (2011) en su estudio a
diferentes niveles de pH (desde 3.5 hasta 11.5) con cuatro especies de anuros
colombianos (Rhinella granulosa, Rhinella marina, Engystomops pustulosus e
Hypsiboas crepitans).
Si bien en la presente investigación se observó que los renacuajos continuaron con su
desarrollo, en algunos tratamientos se presentaron efectos subletales como peso
reducido o diferencias en días de metamorfosis, que pueden disminuir su supervivencia
a largo plazo (Pahkala et al. 2001).
Las características observadas en individuos que murieron a pH 11.5, concuerdan con lo
indicado por Padhye y Ghate (1988), que al experimentar con la especie Microhyla
ornata describieron que a un pH de 11, la cola de los individuos se desintegró. Estos
resultados pueden deberse a la naturaleza del hidróxido de sodio, que al ser una
sustancia alcalina soluble en agua puede desdoblar lípidos causando un proceso de
saponificación (Nuñez 2008). Por otro lado, las características físicas observadas en los
individuos que murieron en el tratamiento de pH 3.5 pueden estar asociadas a la pérdida
del balance de iones dentro de su cuerpo, principalmente de sodio (Na) y Cloro (Cl)
(Freda 1986; Moore y Klerks 1998).
Los individuos expuestos a pH ácidos altos, no letales (4.5) presentaron una reducción
de peso, posiblemente relacionado con la pérdida de iones de sodio de su cuerpo en
niveles bajos (Freda y Dunson 1984). Los renacuajos expuestos a pH básicos no letales
(10.5) no incrementaron de peso. Según (Vanatta y Frazier 1981) esto pudo deberse a la
pérdida de iones bicarbonato de su cuerpo. Si estos efectos se observaran en la
naturaleza, posiblemente podrían incluso llegar a debilitar a los individuos y hacerlos
más susceptibles a enfermedades o depredadores (Harper et al. 2008).
Respecto al tamaño de los individuos, estudios anteriores (Barth y Wilson 2010;
Pahkala et al. 2001; Pakkasmaa et al. 2003) mencionan que la longitud de los
20
renacuajos es menor en niveles de pH ácidos, lo que indicaría que a este nivel, el pH
puede ser considerado como factor fisiológico estresante. En el presente estudio no se
encontraron diferencias en la longitud de los individuos, mientras que si se
identificaron diferencias en el ancho total. Estas observaciones se dieron entre
tratamientos extremos (pH 4.5 y 10.5), observando que el tamaño más bajo ocurrió en el
pH 4.5, en donde se registró un porcentaje negativo de peso, por lo que se confirma que
si bien este nivel de pH no es letal, puede ser negativo para la especie, posiblemente
alterando su potencial de respuesta frente a depredadores, el tamaño de presa que
consumen, e inclusive su termorregulación, factores importantes en el desarrollo de los
anfibios en su medio natural (Cortés et al. 2016).
El tiempo que tardan los individuos en culminar la metamorfosis, se da en función de
factores ambientales (Del Pino y Escobar 1981), siendo mediado por hormonas como la
tiroidea o la corticoesterona, esta última es vinculada a factores estresantes (i.e. la
alteración de niveles de pH) (Fabrezi 2016; Wilbur y Collins 1973). Chambers et al.
(2013) en su estudio con Lambistona jeffersonianum, menciona que a niveles bajos de
pH (entre 5 a 6), la corticoesterona se incrementó en los individuos en un 123 %. Esta
hormona causa que los individuos posean un desarrollo acelerado, que en ocasiones
puede acarrear procesos de canibalismo (Fabrezi 2016). En el presente estudio, se
observó que tres individuos del tratamiento de pH 10.5 (presentaron una culminación de
metamorfosis rápida), mostraban su cola con mordeduras, por lo que se hipotetiza,
existieron inicios de canibalismo posiblemente accionado por la corticoesterona, debido
a factores estresantes como un nivel de pH elevado (Acero 2019). De tal forma que, si
en condiciones naturales los cuerpos de agua presentan niveles extremos de pH podrían
ocurrir procesos de canibalismo, o los individuos se debilitarían, llegando a ser presas
fáciles, disminuyendo las poblaciones de renacuajos de esta especie clave en los
ecosistemas (Heyer et al. 1975).
La densidad puede también ser un factor que delimite los días de metamorfosis, ya que a
mayor densidad se presentan eventos de competencia intraespecífica por recursos
(Warner et al. 1991; Wilbur y Collins 1973), por lo que posiblemente algunos
renacuajos retarden su metamorfosis y permanezcan más tiempo en cuerpos de agua,
21
volviéndose más susceptibles a procesos de depredación (Crane y Ferrari 2017; Kats et
al. 1988).
Algunos individuos al culminar su metamorfosis murieron repentinamente, efecto que
se atribuyó a una posible infección por microorganismos patógenos, posiblemente por el
hongo Batrachochytrium dendrobatidis, identificado debido a que los individuos antes
de perecer presentaron síntomas como movimientos lentos y nula respuesta frente a
estímulos. Esta infección se pudo deber a que al estar expuestos a niveles de pH altos,
estresantes para los individuos, suprimieron su sistema inmunológico (Carey 1993),
además que al desarrollarse en laboratorio no tuvieron exposición directa a luz solar, lo
que pudo contribuir a su enfermedad, tomando en cuenta que larvas expuestas a rayos
solares son más saludables (Arbeláez y Vega 2014). El hongo pudo haber tenido
condiciones adecuadas para su desarrollo (Piotrowski et al. 2004). Una medida tomada
para contrarrestar esta enfermedad fue la utilización de un tratamiento con Itraconazol y
una desinfección completa de los terrarios, observando que después de esta aplicación
no perecieron más individuos.
El rango de pH 6.5 y 8.5 favoreció a G. riobambae en el condiciones de laboratorio, ya
que en estos niveles de pH se observó un incremento en su peso al final de las 96 horas,
lo que puede significar que los individuos expuestos a estos niveles de pH pueden tener
una mayor probabilidad de culminar su proceso de metamorfosis con éxito.
G. riobambae actualmente es la única especie con desarrollo larval en cuerpos de agua
presente en la ciudad de Quito, un factor que la hace vulnerable a procesos de extinción.
Como menciona Bustamante et al. (2005) especies con desarrollo larval dependientes de
cuerpos de agua tienden a disminuir sus poblaciones, a diferencia de las especies con
desarrollo directo (i.e. Pristimantis unistrigatus). Esta disminución se puede relacionar a
que los renacuajos no eligen el sitio donde desarrollarse (Alford 1999), por lo que
pueden ser ubicados por sus progenitores en cuerpos de agua donde posiblemente se
presenten condiciones subóptimas para su normal desarrollo.
Entre los factores que alteran el nivel de pH en los cuerpos de agua, se encuentra el
grado de intervención antropogénica; por ejemplo, Simbaña et al. (2019) encontró que
22
el nivel de pH en cuerpos de agua ubicados en zonas externas del Parque Nacional
Cotopaxi presentaron niveles de pH ligeramente ácidos (6.7), a diferencia de los cuerpos
de agua dentro del parque (pH de 7.9 y 8.1).
El fenómeno de la lluvia ácida causada por la contaminación ambiental puede repercutir
en cuerpos de agua temporales donde se desarrolla la especie, en donde esta es la fuente
principal de agua. Debido a este fenómeno, el agua de lluvia que llega al cuerpo de agua
puede presentar niveles ácidos, llegando a presentar valores de pH de hasta 3.9, en
comparación con los valores normales de pH (entre 5 -7) (Garcés y Hernández 2004;
Likens y Bormann 1974; Weitzenfeld 1992; Granados et al. 2010). A su vez, las altas
temperaturas causan que el pH de los cuerpos de agua temporales se vuelvan más ácidos
ya que el agua pasa por procesos de desecación (Pérez et al. 2015).
La presencia de especies de árboles introducidos también puede modificar el pH de
cuerpos de agua (Ramírez 2017). En Quito, se han obtenido un mayor número de
registros de G. riobambae en el Parque Metropolitano Guangüiltagua (Bioweb 2019) el
cual presenta una gran abundancia de eucalipto, lo que podría estar generando un
impacto negativo en poblaciones naturales de G. riobambae, debido a que las hojas que
caen a cuerpos de agua donde se desarrolla la especie, expulsan taninos, que si bien no
se conoce el nivel de variación de pH que puede causar en un cuerpo de agua temporal.
Se conoce que los taninos pueden alterar el pH volviéndolo más ácido (Glos et al. 2003;
Horne y Dunson 1995; Young et al. 2001; Duellman y Trueb 2015 ).
Trabajos similares a la presente investigación son escasos en Latinoamérica, lo que
puede deberse a un menor índice de contaminación atmosférica en la región, a
diferencia de lo que ocurre en países industrializados (Weitzenfeld 1992). Este y otros
estudios desarrollados con renacuajos y la variación de pH, son importantes debido a
que pueden explicar la variación poblacional en ambientes naturales, teniendo en cuenta
que la supervivencia de los individuos en estado larval es crucial para la viabilidad de
las poblaciones a largo plazo (Melo et al. 2018).
23
CONCLUSIONES
Gastrotheca riobambae es una especie que puede ser definida como resistente a
modificaciones de pH, a niveles ácidos, y básicos. Presentando una tolerancia que va
desde pH 4.5 hasta pH 10.5. Si bien su tolerancia a diferentes niveles de pH es alta, en
tratamientos alejados del pH neutro se pueden presentar efectos subletales, como una
disminución del peso, o de la talla (ancho total) de renacuajos que podrían poner en
riesgo su supervivencia en ambientes naturales a largo plazo.
Variables como la supervivencia, el peso, el ancho total del cuerpo, y el tiempo que
tardan en culminar la metamorfosis presentaron una variación frente al cambio de pH,
mientras que el largo total de los individuos no se vió influenciado por el mismo.
La diferencia entre el peso de los individuos fue dada posiblemente por el intercambio
iónico que conlleva las características de acidez o alcalinidad del agua donde se
desarrollan, por lo que si se encuentran sustancias que modifiquen el pH en ambientes
naturales los organismos pueden variar su peso y por lo tanto disminuir o incrementar
su supervivencia.
La tolerancia que presentó la especie a diferentes niveles de pH, puede variar en base a
las sustancias utilizadas para modificar el pH de los distintos tratamientos.
G. riobambae puede mostrar el estado de los cuerpos de agua naturales, donde se
pueden presentar variaciones drásticas de pH por causas antrópicas.
24
RECOMENDACIONES
Se deben realizar nuevos estudios de tolerancia en la especie relacionando el pH con
más factores (i.e. temperatura o rayos ultravioleta). Además se recomienda medir los
efectos indirectos tales como la reacción que tienen frente a depredadores bajo las
condiciones de pH manejadas, ya que esas interacciones pueden ser la causa de la
disminución local de poblaciones.
Se debería replicar el presente estudio con especies de otras regiones del país en las que
se ha detectado un declive de sus poblaciones, ya que así se puede lograr un contexto
más amplio de lo que pasa en sus hábitats y en su organismo al estar expuestos a
contaminantes y variaciones de pH ácidas o básicas.
Se deben plantear nuevos trabajos enfocados a medir la variación de pH en cuerpos de
agua naturales de manera consecutiva y en diferentes periodos del año, para poder
detallar como varía la población de renacuajos en función del pH y otros parámetros
fisicoquímicos.
Si bien las sustancias empleadas en el estudio lograron el fin deseado se deberían probar
nuevas sustancias, de preferencia que sean encontradas en hábitats donde se desarrollan
renacuajos de la especie.
Se debería realizar un análisis y divulgación del nivel de contaminantes ambientales en
la ciudad de Quito, ya que si no son monitoreados y controlados pueden llegar a afectar
a los habitantes y a todo su entorno.
25
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33
ANEXOS
ANEXO A. Estadíos por los que pasan renacuajos de anuros. Fuente: (Gosner, 1960).
34
35
36
ANEXO B. Permiso de investigación otorgado por el Ministerio del Ambiente
Ecuatoriano.
37
38
ANEXO C. Aval ético otorgado por la Universidad Central del Ecuador.
39
ANEXO D. Protocolos de modificación de pH y renovación de agua.
Protocolo para establecer el pH de cada tratamiento
En un inicio se coloca en el recipiente 1900 ml de agua reposada y se airea la misma por
una hora mediante una manguera ubicada en el costado inferior del recipiente que se
encontraba conectada a un motor de aireación marca BOYU, modelo SE-314. Mientras
este proceso ocurre, se pesa a las sustancias sólidas en gramos en una balanza analítica y
se mide con la ayuda de una jeringa los mililitros de la sustancia líquida. Después de
medir la cantidad de sustancia necesaria se diluye la misma en 100 ml de agua destilada.
Al finalizar la hora de aireación se coloca la disolución de 100 ml en el recipiente
etiquetado por cada pH y replica correspondiente (La aireación se mantiene constante
después de este proceso).
Protocolo para renovar el agua
En un inicio se alistan recipientes secundarios etiquetados de la misma forma que los
recipientes principales donde serán colocados los renacuajos mientras se da el proceso
de renovación del agua. Se desconecta el motor de aireación y se retiran las mangueras
de los recipientes principales. Estos recipientes principales son movilizados a la sección
de lavado, para limpiarlos y proceder a retirar a los renacuajos.
El segundo recipiente es de menor tamaño que el principal por lo que en un inicio se
llena el segundo recipiente con la misma agua del primero y se utiliza a un colador para
que el agua sobrante se filtre y los renacuajos que quedan en el colador sean situados en
el segundo recipiente junto con su comida. Después de que todos los renacuajos se
encuentren en el segundo recipiente y estén comiendo, los primeros recipientes se lavan
con una esponja para platos sin jabón y agua, para posteriormente realizar el protocolo
de ajuste de pH anteriormente descrito.
40
ANEXO E. Definición de sustancias utilizadas para modificar el pH
El hidróxido de sodio (NaOH) también denominado sosa caustica, se presenta en forma
de un sólido blanco el cual es soluble en agua, es un compuesto utilizado a nivel
industrial en la elaboración de plásticos, artículos de limpieza y ayuda en el tratamiento
de la celulosa para hacer celofán (Unam 2016).
El ácido clorhídrico al 10% ( HCL) es un líquido muy soluble en agua comúnmente
utilizado en unión con otras sustancias para formar un compuesto más complejo es decir
en la síntesis química; el mismo puede ser producido por plantas químicas en procesos
de descloración (DLEP 2011).
Acid regulator es un producto presentado en forma sólida comúnmente usado en peceras
para ajustar el pH pudiendo modificarlo entre un rango de 4.5 y 5.5, esto lo logra
precipitando el calcio y el magnesio que contiene el agua y entre sus ingredientes posee
fosfatos (Seachem 2019).
41
ANEXO F. Protocolo para medición de individuos en el programa Image J.
Para medir imágenes en el programa Image J primero se debe abrir un archivo y calibrar
la imagen, en este proceso se cambia el valor de pixeles por el valor deseado, en este
caso en milímetros. En las fotografías analizadas de renacuajos cada milímetro equivalía
a 50.0025 pixeles. Para que este proceso no se repita todas la veces que se abre una
imagen se escogió la opción “Global”.
Para medir la longitud se selecciona la herramienta de línea “Straight” y con la tecla t se
toman medidas que son procesadas con la herramienta ROI Manager donde finalmente
se escoge la opción “Measure” que muestra una ventana de resultados que puede ser
guardada en un archivo de Excel (Gonzalez 2018).
42
ANEXO G. Individuos ingresados en la colección del Museo de Zoología- Sección
Herpetología QCAZ.
43
44
ANEXO H. Certificado de permanencia de individuos en cautiverio para su
observación.
