UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA SUR

ÁREA DE CONOCIMIENTO DE CIENCIAS DEL MAR

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE BIOLOGÍA MARINA

ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA Y ANTIOXIDANTE DEL EXTRACTO

ETANÓLICO DEL ALGA Padina mexicana (PHAEOPHYCEAE: DICTYOTALES).

TESIS

Que, como uno de los requisitos para obtener el título de

BIÓLOGO MARINO

PRESENTA

ELENA STEPHANIE CASTRO SILVA

La Paz, Baja California Sur, Octubre del 2010.

Agradecimientos

A mi familia, principalmente a mi bella madre Clara Silva Geraldo por su apoyo y

comprensión, así también a mis queridas hermanas Paola y Yulissa Cota Silva por aguantar mis

malos ratos de estrés.

A mis preciosas Fernanda y Nubia Carballo Ramírez (mis cuyitos) por su atención, aliento y

apoyo incondicional en todo y siempre, a Sergio Negrete por cuidar de mis niñas y brindar su

apoyo; a mi flaca hermosa Cynthia Arrevillaga por escucharme y aguantar mis rabietas durante el

estrés de la escuela, por ayudarme y estar conmigo. A mi loca bella Yazkara Olachea (la Kazkara)

por retornar a mi vida y brindarme su amistad.

A mi novio precioso Mario Vergara por su ayuda, amor y comprensión en todo momento

así como a su hermosa familia que me ha abierto las puertas de su casa con cariño.

A mis amigos(as) y compañeros(as) de la carrera, Bernardo Sánchez, Joel Soto, José

Manuel Marrón, Ceacatl Arce, Uriel Valdez, Diego Rivera, Sara de las Heras, Merit Mora, Diana

Zaleta, Valerie Schnoler, Pablo Juárez, etc.. que sin sus constantes carrillas, buen humor y apoyo

no hubiese disfrutado tanto estar ahí. Los compas del Cbtis # 230, Sergio Morales Lucero (Mi hijo),

Sarahi Quintero, Juan Manuel Castro, Jorge Pratt, Aaron Chihuahua, Carmen Camacho, Jorge

Ochoa y Christian Higuera, que en su momento me regalaron palabras de aliento y apoyo así como

buenos recuerdos generados en todo este tiempo compartido.

A mis asesores, Dr. Iván Murillo Álvarez, M.C. Mauricio Muñoz Ochoa y Dr. Rafael

Riosmena Rodríguez por toda la ayuda, paciencia y comprensión que me han brindado..¡sobre

todo por aguantarme! A mis compañeros en el Laboratorio de Química de Algas Marinas CICIMAR,

M.C. Elizabeth Rodríguez Montesinos, M.C. Dora Arvizu Higuera, Dr. Gustavo Carmona por toda

su ayuda, y paciencia.

A mis profesores, principalmente a B.M. Marco Antonio Medina López, Dra. Rosalba

Encarnación Dimayuga, Dr. Héctor Reyes, Dr. Volker Kotch, etc. por sus extraordinarias clases que

me dieron el entusiasmo para seguir y terminar la carrera.

Al Centro Interdisciplinario en Ciencias Marinas (CICIMAR-IPN) por prestar sus

instalaciones para llevar a cabo todo el proceso de experimentación, así también al proyecto

CONACYT (ref.: SEP-47942/A-1) e IPN (ref.: CGPI: 20050324, SIP-20060049, SIP-20070020 y

SIP-20082016) por financiar dicho proyecto de donde se deriva el presente trabajo.

A los que han creído en mí, que me han dado palabras de aliento en los momentos que me

sentí flaquear, a los que han compartido conmigo y he olvidado mencionar.. ¡Muchas gracias!

Dedicatoria

A todos aquellos que me han visto crecer, a los que se unieron para verme florecer. A

todos los que en algún momento estuvieron en mi vida y tuvieron que marcharse. A los que me

quieren, a los que me odian. A esos que dijeron que no podría, a los que sinceramente me apoyan.

A todos, les dedico lo siguiente:

Y ella es así, torrente de fuego apasionada. De lustrosos ojos café desesperantes. llorona en naturaleza de la lluvia, seca cuando la arena del desierto le sugiere. Amante de lo bellamente enternecido, imprudente como la ola de tormenta, dócil tal cordero domesticado o fiera leona tras presa sin distintivo. Qué al asno a veces se asemeja, floja –rebuzna entre fantasías de algodón-; se levanta luego y anda-sagaz e inteligente-, ¡águila en el vuelo de plumas rojas!. El corazón le sangra si el amado sufre, su bien antepone antes del propio; vida en guerra daría codo a codo si felicidad para él consiguiere. Pliega sonrisa con la risa de los otros esos que se burlan y le subestiman, no se imaginan que pudiere levantar una montaña entre sus hombros.

Piel trigueña, caderas anchas; me susurra al oído amor, y como bruma se levanta. Soñadora loca, enamorada empedernida, le amo a esa pelirroja desentonada.

....Y así será ella, mientras el aire siga entrando a sus pulmones y el corazón le palpite tan fuerte como las olas en un rompiente... loca..cuerda..floja..inteligente..de vez en cuando distraída e imprudente..empalagozamente dulce y enojona amargosamente ...así es como es.. y no le necesito diferente.

i

Índice general página

Índice general. i Lista de tablas y figuras. ii Lista de gráficos. iii Lista de abreviaciones. iv Glosario. v Resumen. vii Abstract. viii 1. Introducción. 1 2. Antecedentes. 2 2.1. Polifenoles. 2 2.2. Terpenos. 5 2.3. Mecanismo del radical libre estable 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH) y la actividad antioxidante.

7

2.4. Actividad antimicrobiana de las algas pardas. 12 3. Justificación. 17 4. Descripción y distribución de Padina mexicana. 18 4.1. Clasificación taxonómica de Padina mexicana. 20 5. Objetivo general. 21 5.1. Objetivos particulares. 21 6. Materiales y métodos. 22 6.1. Trabajo en campo. 22 6.2. Trabajo de laboratorio. 23 6.2.1. Obtención del extracto crudo. 23 6.2.2. Fraccionamiento del extracto crudo. 23 6.2.3. Actividad antimicrobiana. 26 6.2.3.1. Ensayo de actividad antimicrobiana. 26 6.2.3.2. Microorganismos de prueba 26 6.2.3.3. Medios de cultivo e inóculos. 27 6.2.3.4. Preparación de discos. 27 6.2.4. Pruebas de actividad antioxidante. 28 6.2.4.1. Método espectrofotométrico. 28 6.2.4.2. Método bioautográfico. 28 7. Resultados. 28 7.1. Cromatografía de capa fina (TLC) y fraccionamiento en columna cromatográfica del extracto etanólico de Padina mexicana.

28

7.2. Análisis de actividad antimicrobiana. 31 7.3. Pruebas de actividad antioxidante. 33 7.3.1. Ensayo con el radical libre estable 2,2-difenil-1-picril hidracilo (DPPH). 33 7.3.1.1. Análisis espectrofotométrico. 33 7.3.1.2. Análisis bioautográfico. 34 8. Discusión. 40

ii

9. Conclusiones. 43 10. Literatura citada. 45

Lista de tablas y figuras

página

Figura 1. Ruta biosintética de los phlorotaninos. 3

Figura 2. Derivados de los phlorotaninos identificados en varios géneros y especies de

algas pardas. Donde (1) phloroglucionol, (2) eckol, (3) dieckol, (4) 8,8´-bieckol y (5)

phlorofucofuroeckol A, reproducido de Kang (2004).

4

Figura 3. Unidades de isopreno y estructura reproducido de Dewick, (2002). 5

Figura 4. Ruta biosintética de los terpenoides reproducido de Dewick, (2002). 6

Figura 5. Estructura del radical libre 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH) y mecanismo de

acción reproducido de Pakrash et. al, (2001).

7

Figura 6. Estructura del compuesto diphloretohidroxicarmaloilo extraído de Ishige

okamurae reproducido de Soo-Jin y colaboradores (2008).

11

Figura 7. Estructuras de los compuestos 1) 1-(3´,5´-dihidroxi-peroxi)-7-(2”,4”-

trihidroxiperoxi)-2,4,9-trihidroxidibenzo-1,4-dioxina y 2) 6,6´-bieckol identificados en

Ecklonia cava reproducido de Quang-To y colaboradores (2009).

12

Figura 8. Compuesto derivado del fucosterol activo contra células KB extraído a partir de

Padina pavonica reproducido de Ktari y Guyot (1999).

15

Figura 9. Estructura del compuesto Lobophorido 1 obtenido de Lobophora variegata

reproducido de Kubanek y colaboradores (2002).

16

Figura 10. Apariencia de Padina mexicana. 21

Figura 11. Mapa del área de colecta. 22

Figura 12. Fraccionamiento del extracto etanólico de Padina mexicana. 25

Figura 13. Fraccionamiento de CCC F1 hasta la obtención de un compuesto puro. 26

Figura 14. Cromatografía en capa fina en fase reversa (TLC) realizada con diferentes

solventes para determinar el mejor fraccionamiento del extracto ELS 1F2.

29

Figura 15. Cromatografía del primer fraccionamiento de ELS1F2. Se realizó un punteo en

placa de 10 µL por muestra aproximadamente.

30

Figura 16. Cromatografía del fraccionamiento realizado a CCAF8. Donde 1a representa

las facciones de la columna cromatográfica CCB1, 1b muestra las fracciones de la

columna CCB2 y 1c la columna CCB3.

30

Figura 17. Cromatografía de la columna CCC. La muestra CCB1F17 se fraccionó con un

iii

gradiente de elusión de EtOH: H2O (9:1). 31

Figura 18. Columna cromatográfica DD. Se observa la obtención de un compuesto

parcialmente puro.

31

Figura 19. Placa cromatográfica en fase reversa impregnada con DPPH. 1-2=CCAFU1-2,

3=CCAF3, 4= CCAF4, 5=CCAF5, 6-7=CCAFU6-7,8=CCAF8, 9=CCAF9, 10=CCAF10,

11=CCAF11, 12=CCAF12, 13= CCAF13, 14=CCAF14 y 15=CCAF15

34

Tabla I. Ensayos de actividad antibacteriana de las fracciones CCAFU1-2 –CCAF15 donde

los halos de inhibición están expresados por el promedio ± SD (n=2).

33

Tabla II. Valores de concentración inhibitoria media (IC50 ) requerida para reducir 50% el

radical DPPH.

40

Lista de gráficos

página

Grafica 1. Curva logarítmica donde se muestra la dosis y el efecto del phloroglucinol en el

ensayo espectrofotométrico con DPPH.

35

Grafica 2. Curva logarítmica donde se muestra la dosis y el efecto de la fracción CCAF10

en el ensayo espectrofotométrico con DPPH.

36

Grafica 3. Curva logarítmica donde se muestra la dosis y efecto de la fracción CCAF11 en

el ensayo espectrofotométrico con DPPH.

37

Grafica 4. Curva logarítmica donde se muestra la dosis y efecto de la fracción CCAF12 en

el ensayo espectrofotométrico con DPPH.

38

Grafica 5. Se muestra la dosis y el efecto de la fracción CCAF13 en el ensayo

espectrofotométrico con DPPH.

39

iv

Lista de abreviaciones

nm nanómetros

mg miligramos

mm milímetros

mL mililitros

µm micrómetros

µL microlitros

g gramos

kg kilogramos

IC50 concentración inhibitoria media

H2O agua

DPPH 2,2-difenil-1-picril hidracilo

EtOH etanol

ERO especies reactivas de oxígeno.

HPLC siglas en inglés para cromatografía de líquidos de alta resolución

TLC siglas en inglés para cromatografía en capa fina

CH2Cl2 diclorometano

MeOH metanol

NaCO3 carbonato de sodio

NMR resonancia magnética nuclear.

H2SO4 ácido sulfúrico

LDL lipoproteínas de baja densidad.

v

Glosario

Agar: mezcla heterogénea de dos clases de polisacáridos sin ramificaciones

obtenido a partir de varias especies de algas rojas.

Alga: organismos totipotenciales que llevan a cabo reacciones fotosintéticas,

tienen origen polifilético, principalmente acuáticos.

Anteridios: órgano pluricelular donde se forman los gametos masculinos.

Antibiótico: agente químico producido por un organismo o de manera sintética que es

dañino para otros organismos.

Antimicrobiano: sustancia que puede inhibir el crecimiento de microorganismos o matarlos.

Dioicas: organismos con sexos separados.

Esporangio: estructura que se encuentra en el esporófito y se especializa en llevar a

cabo la meiosis que dará las esporas haploides (n).

Gram-negativo: célula procariota que contiene una membrana externa conformada por

lipopolisácaridos, lipoproteínas y otras macromoléculas complejas.

Gram-positivo: célula procariota que tiene una pared conformada principalmente por

peptidoglucano y carece de membranas externas.

In vitro: se refiere a la técnica o procedimiento realizado en un tubo de vidrio en

condiciones controladas fuera de un organismo.

Macroalga: nombre informal que agrupa organismos dentro de tres divisiones y que

comparten ciertas características: productores primarios, oxigénicos,

principalmente bentónicos con reproducción sexual mediante historias de

vida, acuáticas, etc.

Meristemos: tejido vegetal o zona de células indiferenciadas capaces de dividirse

activamente. A de este se forman los otros tejidos que conforman el

cuerpo vegetal. Metabolitos primarios: compuestos orgánicos esenciales para el organismo que los produce

debido a que forman parte de su metabolismo (crecimiento y

reproducción). Metabolitos secundarios: compuestos orgánicos sintetizados por un organismo los cuales no tienen

un papel esencial en su metabolismo.

vi

Monoico: organismo que puede contener órganos de ambos sexos.

Oogonios: estructuras reproductoras femeninas.

Paráfisis: prolongaciones vegetativas que se forman sobre la superficie del talo.

Patógenos: organismos que causan daño a su hospedero.

Phlorotaninos: compuestos fenólicos solubles en agua, con pesos moleculares entre 500

y 3000 los cuales se encuentran en las algas pardas. Precipitación de carbonato de calcio:

depósito de carbonato de calcio en la pared celular de las macroalgas en

forma de cristales de aragonita y calcita.

Radicales libres: átomo o grupos de átomos con un electrón desapareado, extremadamente

inestable y con gran poder reactivo.

Rotavapor: equipo utilizado para evaporar disolventes a presión reducida.

Shikimatos: compuestos orgánicos derivados de la ruta del acido shikímico.

Soro: Estructuras reproductoras que se encuentran concentradas en una región

del talo. Sujetador secundario:

estructura prensil que se desarrolla en cualquier parte del talo para

adherirse a sustratos diferentes.

Talo: estructura de una macroalga compuesta por tres regiones (sujetador,

estipe y fronda) que contienen células totipotenciales que no forman

tejidos verdaderos.

vii

Resumen.

En experimentos preliminares el extracto etanólico del alga parda Padina mexicana resultó

ser activo por el método de difusión en agar con discos contra las cepas resistentes

Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes a una concentración de 2.0 mg/disco, por lo que

fue seleccionado para su fraccionamiento en búsqueda de los compuestos responsables de la

actividad mostrada. Adicionalmente las fracciones obtenidas fueron sometidas a un ensayo de

actividad antioxidante por medio de los métodos bioautográfico y espectrofotométrico utilizando la

reducción del radical libre estable 2,2-difenil-1-picrilhidracilo como indicador de actividad. La

extracción sólido-líquido (ESL1) dio como resultado 4 fracciones denominadas ESL1F1 a ESL1F4

de las cuales ESL1F2 (2.42 g) mostró actividad contra S. aureus, S. pyogenes y Escherichia coli,

además de mostrar interesante actividad antioxidante por el método bioautográfico. Del

fraccionamiento de ESL1F2 por medio de columna cromatográfica se obtuvieron 15 fracciones

denominadas CCAFU1-2 ---CCAF15. La mayoría de las fracciones fueron activas contra S. aureus

excepto CCAF9, CCAF11 y CCAF15, en el caso de S. pyogenes solo la fracción CCAFU6-7 no

mostró actividad contra este microorganismo. Las fracciones CCAFU6-7, CCAF10 y CCAF12

mostraron actividad contra Vibrio parahaemolyticus. En el ensayo de actividad antioxidante de

estas fracciones, CCAF10, CCAF11, CCAF12, CCAF13 y CCAF14 resultaron ser las más activas

en el método bioautográfico, la medición espectrofotométrica de la actividad antioxidante de estas

fracciones mostró un IC50 de 0.20 mg/mL para CCAF10 y de 0.22 mg/mL para CCAF11 mientras

que CCAF12 mostró actividad de 0.13 mg/mL y CCAF13 mostró un IC50 de 0.023 mg/mL siendo

menos activas que el stock de phloroglucinol (0.012 mg/mL). El fraccionamiento de CCAF8 por

cromatografía en fase reversa dio como resultado 17 fracciones (CCB1 a CCBF17). La fracción

CCBF17 resultó ser un sólido de color amarillo claro que fue nuevamente fraccionado en columna

cromatográfica de fase reversa dando 17.9 mg de un compuesto aparentemente puro denominado

DDF1.

Palabras clave: Actividad antimicrobiana, actividad antioxidante, Padina mexicana, metabolitos

secundarios, Baja California Sur.

viii

Abstract.

In previous experiments the ethanolic extract of brown algae Padina mexicana showed to

be active using the agar diffusion method with discs against resistant strains of Staphylococcus

aureus and Streptococcus pyogenes at the concentration of 2.0 mg/disk, because it’s activity the

ethanolic extract was selestec for fractionation in searching for compounds responsible for the

activity showed. Also the fractions obtained were tested for antioxidant activity for the

spectrophotometric and bioautographyc methods by the reduction of the stable free radical 2,2-

diphenyl-1-picrilhidracilo as an indicator of activity. The solid-liquid extraction (ESL1) resulted in four

fractions, named ESL1F1 to ESL1F4 of which ESL1F2 (2.42 g) showed activity against S. aureus,

S. pyogenes and Escherichia coli, with interesting antioxidant activity by the bioautographyc

method. From the ESL1F2 fractionation using chromatographic column were obtained 15 sections,

named CCAFU1-2--- CCAF15. Mostly the fractions were active against S. aureus except CCAF9,

CCAF11 and CCAF15, in the case of S. pyogenes only the fraction CCAFU6-7 was not active

against this organism. Fractions CCAFU6-7, CCAF10 and CCAF12 showed activity against Vibrio

parahaemolyticus. In the experiment of antioxidant activity with those fractions, the CCAF10,

CCAF11, CCAF12, CCAF14 and CCAF13 were the most active with the bioautographyc method,

also spectrophotometric measurement of antioxidant activity showed an IC50 of 0.20 mg/mL for

CCAF10 and 0.22 mg/mL for CCAF11 while the highest activity were obteined with the fractions

CCAF12 (0.13 mg/mL) and CCAF13 (IC50 of 0.023 mg/mL) have less activity that stock of

phloroglucinol (0.012 mg/mL). The fractionation of CCAF8 by reversed phase chromatography

resulted in 17 fractions (CCB1 to CCBF17). The CCBF17 fraction was a light yellow solid that was

fractionated once again by reverse phase chromatographic column giving 17.9 mg of a compound

named DDF1 apparently pure.

Keywords: Antimicrobial activity, antioxidant activity, Padina mexicana, secondary metabolites,

Baja California Sur.

1

1. Introducción.

Los productos naturales también conocidos como metabolitos secundarios son

compuestos (o mezcla de ellos) que poseen una gran diversidad estructural, siendo moléculas

relativamente pequeñas, pueden presentar una amplia gama de efectos biológicos entre los que se

encuentran la actividad inhibitoria del crecimiento bacteriano, actividad inmunoestimulante,

citotóxica, antiviral, anti-incrustante y antioxidante por nombrar algunas (Moreau et al., 1984; Ktari y

Guyot, 1999; De Lara-Isassi et al., 2000; Nagayama et al., 2002; Mi-Jeon et al., 2004; Shibata et al,

2008; Zou et al, 2008). El estudio de los metabolitos secundarios provenientes de organismos

marinos es relativamente reciente, sin embargo en las 3 últimas décadas se han publicado

artículos donde el papel de las algas marinas como fuente de compuestos bioactivos es

preponderante (Blunt et al., 2006). Las algas marinas al ser organismos sésiles están expuestas y

sometidas a diversas condiciones bióticas y abióticas, lo que provoca que sinteticen moléculas que

no tienen equivalencia con las terrestres, lo cual es gran interés debido al gran potencial de

aplicaciones derivadas de la diversidad estructural y bioactividad que presentan. En la actualidad

cerca del 2 % de las especies conocidas de macroalgas han sido estudiadas (Garateix, 2005;

Magallanes et al., 2003). Las investigaciones de manera general han demostrado que muchas

especies de las 3 principales clases de macroalgas (Chlorophyceae, Phaeophyceae y

Rhodophyceae) son fuente potencial de compuestos bioactivos, tan sólo para el 2008 se habían

reportado alrededor de 3000 compuestos y aproximadamente 1,140 de ellos fueron de la clase

Phaeophyceae (Magallanes et al., 2003; Amsler, 2008). Los organismos pertenecientes a dicha

clase tienen un gran potencial bioactivo debido a su capacidad de sintetizar metabolitos mixtos de

origen terpeno-aromático; dentro de esta clase se han encontrado compuestos como

phlorotaninos, polisacáridos, alginatos, manitol, ácidos grasos e inclusive clorofila c2 con actividad

biológica (Mabrouk, 1985; Rosell y Srivastava, 1987; De Lara-Isassi y Álvarez-Hernández, 1999;

Magallanes et al., 2003; Mohsen et al., 2007; Kamei y Aoki, 2007; Zubia et al., 2008; González et

al., 2009).

La familia Dictyotaceae ha sido la más estudiada, cerca del 30 % de los compuestos

reportados han sido obtenidos de especies del género Dictyota, no obstante, dentro del género

Padina también se ha reportado que los extractos muestran actividad antimicrobiana así como

presencia de compuestos de origen fenólico con actividad antioxidante (Mabrouk et al., 1985;

Chkhikvishvili y Ramazanov, 1999; Kang, 2003; Amornlerdpison et al., 2007; Matanjun et al., 2008;

Kumar et al., 2009).

2

Tomando en cuenta lo anterior, el presente estudio se enfocó en la evaluación de la

fracción ESL1F2 obtenida a partir de un extracto crudo de Padina mexicana la cual se fraccionó

nuevamente por medio de columna cromatográfica y aquellas fracciones derivadas fueron

analizadas en pruebas contra las cepas resistentes de Staphylococcus aureus, Streptococcus

pyogenes, Escherichia coli y Vibrio parahaemolyticus así como su potencialidad como agentes

antioxidantes in vitro al ser sometida a pruebas con el radical libre estable 2,2-difenil-1-

picrilhidracilo.

2. Antecedentes.

2.1. Polifenoles.

En las macroalgas podemos encontrar un grupo de moléculas denominadas policétidos,

los cuales son los segundos mayoritarios en el metabolismo secundario de estos organismos;

estas moléculas tienen un origen biosintético muy similar a los ácidos grasos y son polímeros de

acetato y ocasionalmente de propionato. Su clasificación está basada en la policétido sintetasa

responsable de su biosíntesis, principalmente de los policétidos

del tipo I y tipo II. Los policétidos de tipo II condensan sistemas cíclicos aromáticos como

flavonoides que se encuentran en las plantas y los phlorotaninos en las algas (Dewick, 2002;

Amsler, 2008).

Los phlorotaninos o polifenoles son una clase estructural de policétidos que se encuentra

exclusivamente en las algas pardas. Estas moléculas están constituidas por unidades de

phloroglucinol ligadas en enlaces carbono-carbono o carbono-oxígeno cuya estructura base es el

esqueleto dibenzo-1,4-dioxina; se sintetizan por la ruta del malonil-CoA que produce el bloque de

construcción de phloroglucinol y su peso molecular varía entre los 500 y 5000 (Figura 1, Isaza,

2007; Amsler, 2008). Debido a su carácter polar, estos se pueden extraer con mezclas de alcohol

y agua en diversas proporciones, sin embargo, la mezcla mayormente usada es acetona-agua

(70:30) (Isaza, 2007).

Los phlorotaninos se clasifican en seis grupos basados en las variaciones de las unidades

de polimerización del phloroglucinol, entre los cuales tenemos a los fucoles, phloretoles,

fucoforetoles, fuhaloles, isofuhaloles y eckoles (Figura 2) que difieren en el número de grupos

hidroxilo presentes en los vínculos de su enlace y donde todos a excepción de los fucoles están

unidos por enlaces éter. Las unidades son a menudo phloroglucinol esterificado o acilado y puede

3

tener dímeros que polimerizan en unidades más grandes. Estos compuestos también presentan

una amplia gama de tamaños y se cree que polimerizan a medida que envejecen y por lo tanto se

hacen más grandes al paso del tiempo (Amsler, 2008).

Figura 1. Ruta biosintética de los phlorotaninos.

Los phlorotaninos provenientes de las algas pardas han presentado actividad biológica

como agentes antibacterianos contra bacterias gram-positivas y gram-negativas, antifúngicos,

antitumorales en pruebas contra células leucémicas, antioxidantes en ensayos in vitro e in vivo así

como análisis citotóxicos en pruebas en células de cultivo y organismos vivos. Así mismo, en la

industria de los vinos, té y cacao y sus productos derivados se les adjudica propiedades

antioxidantes. De igual manera son utilizados en la industria textil como formadores de colorantes,

astringentes y tintas (Rosell y Srivastava, 1987; Isaza, 2007; Sugiura et al., 2006 y 2007; Shibata et

al., 2004 y 2008).

Fotosíntesis

Ruta de la pentosa

CO2 CO2

PO4 Eritrosa

Aminoácidos Aromáticos

Fenoles

Taninos

Ligninas

Azúcares Glucólisis Priruvato

Acetil-CoA

Malonil-CoA

Phloroglucinol

Phlorotaninos

4

Figura 2. Derivados de los phlorotaninos identificados en varios géneros y especies de algas

pardas. Donde (1) phloroglucionol, (2) eckol, (3) dieckol, (4) 8,8´-bieckol y (5) phlorofucofuroeckol

A, reproducido de Kang (2004).

HO OH

OH

O

OHHO

O

O

OH

HO

OH

OH

OH

OH

HO

OH

O

O

HO

O

O O

O OH

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OH

OH

O

O

O

OH

OH

HO

HO

OH

O

OHO

O

O OH

OH

OH

OH

O

HO

HO

OH

1 2 3

4

5

5

2.2. Terpenos.

Más de la mitad de los metabolitos secundarios obtenidos de las macroalgas son de origen

terpenoidal, los cuales forman una gran y estructuralmente diversa familia de productos naturales

derivados de unidades de isopreno (C5); sus estructuras típicas contienen carbono representado

por esqueletos (C5)n, y pueden clasificarse en función del número de unidades isoprenoides que

contienen incorporados como hemiterpenos (C5), monoterpenos (C10), sesquiterpenos (C15),

diterpenos (C20), sesterterpenos (C25), triterpenos (C30) y tetraterpenos (C40).

Figura 3. Unidades de isopreno y estructura reproducido de Dewick, (2002).

Los terpenos se forman por la vía del mevalonato y la ruta recién descubierta de

mevalonato independiente a través de fosfato deoxixilulosa. Las estructuras son conformadas a

través de un amplio uso de los mecanismos de carbocatión y reordenamientos posteriores Wagner-

Meerwein (Dewick, 2002). Los esteroides, carotenoides, quinonas preniladas e hidroquinonas son

algunos de los compuestos derivados. Muchos otros productos naturales que contienen

terpenoides o elementos de sus moléculas en combinación con esqueletos de carbono son

procedentes del acetato y shikimato que generan alcaloides, compuestos fenólicos, vitaminas,

entre otros.

C5 unidad de isopreno Isopreno

6

Figura 4. Ruta biosintética de los terpenoides reproducido de Dewick, (2002).

Según Blunt y colaboradores (2006) los terpenos y polifenoles son los principales

metabolitos que se obtiene de las algas pardas. Por mencionar algunas algas, las especies de

Cystoceira se han obtenido diferentes meroditerpenos, de la especie Bifurcaria bifurcata se

obtuvieron diterpenos trihidroxilados con actividad citotóxica, de Scytosiphon lomentaria se han

aislado bisnorditerpenos y de Dictyopteris divaricada sesquiterpenos.

En el género Dictyota también se ha encontrado gran variedad de estas moléculas. En

Dictyota dichotoma y D. linearis se han aislado nuevos diterpenos así como de D. pfaffi se aisló un

OPP

Dimetilalil PP Isopentenil PP(DMAPP) (C5) (IPP) (C5)

OPP

ácido mevalonico Deoxixilulosa fosfato

Hemiterpenos (C5)

C10 MonoterpenosIridoides

(C10)

IPP

C15

C20

IPP

IPP

C25

C30

C40

Sesquiterpenos (C15)

Diterpenos (C20)

Sesteterpenos (C25)

Triterpenoides(C30)

Tetraterpenos (C40)Carotenoides

Esteroides (C18-C30)

7

derivado de dolabeladieno que presentó actividad anti-HSV-1 y contra la reverso transcriptasa del

VIH in vritro. Así mismo, de la especie Dictyota mertensii se han aislado diterpenos que previenen

la herbivoría.

2.3. Mecanismo del radical libre estable 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH) y la

actividad antioxidante.

El radical libre estable 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH) es un polvo de color púrpura

compuesto por moléculas estables de radicales libres. Su estructura está conformada por tres

anillos aromáticos unidos por enlaces nitrógeno-nitrógeno y en uno de estos anillos contiene tres

moléculas de NO2 como grupos funcionales (Pakrash et al., 2001).

El DPPH tiene dos aplicaciones principales, por un lado es utilizado como un monitor de

reacciones químicas que involucra a dichos radicales y por otro es un estándar en las resonancias

paramagnéticas de electrones; este método se ha utilizado para cuantificar muestras sólidas o

líquidas y no es específico a un componente antioxidante particular (Pakrash et al., 2001).

Al someter en contacto al DPPH con un compuesto antioxidante, su electrón desapareado

genera una fuerte absorción máxima a 517 nm en un espectrofotómetro y se visualiza el cambio de

coloración de púrpura a amarillo como resultado de la oxidación. La oxidación es una reacción

simple donde interviene un agente reductor o antioxidante por ejemplo phloroglucinol el cual

suministra electrones al agente oxidante o DPPH que capta dichos electrones quedando con un

estado de reducción inferior al que tenía, es decir, se reduce (Figura 5; Pakrash et al., 2001).

Figura 5. Estructura del radical libre 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH) y mecanismo de acción

reproducido de Pakrash et al. (2001).

N

NNO2 O2N

NO2

+

OH

OH HO

NO2

O2N NO2

NH

N

OH

OH

+O

DPPH Phloroglucinol

8

Esto mismo sucede en los sistemas biológicos, donde la acción de componentes

enzimáticos o no enzimáticos intervienen en la regulación de los radicales libres. Los componentes

enzimáticos son básicamente las enzimas superóxido dismutasa (SOD), glutation peroxidasa

(GSHPx) y la catalasa (CAT). La enzima SOD dismuta el oxígeno para formar peróxido de

hidrógeno y su principal función es la protección contra el anión superóxido, la enzima GSHPx se

relaciona principalmente con las membranas celulares pues destruye a los peróxidos orgánicos

formados a partir de ácidos grasos poli-insaturados derivados de la acción de radicales libres

oxigenados en las membranas. También reacciona activamente con el peróxido de hidrógeno,

destruyéndolo. Finalmente, la enzima CAT destruye al peróxido de hidrógeno formado en los

peroxisomas como producto de la actividad metabólica. Esta enzima es particularmente importante

en los glóbulos rojos, ya que estas células que no poseen peroxisomas en su estado maduro y la

enzima permanece libre en el citoplasma cumpliendo una actividad citoprotectora de gran

relevancia (Gutiérrez, 2002; Avello y Suwalsky, 2006).

Los componentes no enzimáticos del sistema de defensa antioxidante son muy

numerosos. Sin embargo, los más importantes son el glutation reducido (GSH), la ceruloplasmina

(proteína transportadora de cobre en el plasma), la ferritina (proteína transportadora de hierro), el

ácido úrico, la vitamina E, la vitamina C, el β-caroteno y los aminoácidos derivados de la taurina e

hipotaurina. La actividad antioxidante de estas moléculas no sólo depende del metabolismo celular,

sino también de la nutrición, ya que algunas de estas moléculas no son sintetizadas por el

organismo y deben ser aportados por la dieta (Gutiérrez, 2002; Avello y Suwalsky, 2006).

Al perderse la efectividad de los componentes enzimáticos y no enzimáticos se genera el

estrés oxidativo debido a que el contenido intracelular de EROs sobrepasa las defensas

antioxidantes de la célula induciendo daño a moléculas biológicas como lípidos, proteínas, ácidos

nucleicos, entre otros. Las ERO actúan sobre lípidos poli-insaturados en las membranas celulares

generando pérdida de fluidez y lisis como consecuencia de la peroxidación lipídica. También

alteran funciones de los glúcidos asociados a la actividad de las interleuquinas y la formación de

prostaglandinas, hormonas y neurotransmisores; en cuanto a las proteínas, llevan a cabo una

desnaturalización e inactivación de las mismas y en ácidos nucleicos modifican las bases

produciendo mutaciones y cáncer. Las ERO se han asociado con la aparición de desordenes como

el Alzheimer, cáncer, inflamación, artritis reumatoide y ateroesclerosis, entre otras enfermedades

(Kang et al., 2004; Mosquera et al., 2005; Zou et al., 2008).

9

Por lo anterior, en los últimos 30 años se ha desarrollado cada día más el interés por los

problemas relacionados con el estrés oxidativo, los radicales libres, las especies reactivas del

oxígeno y los antioxidantes, por lo tanto se han buscado nuevas fuentes de moléculas efectivas

contra esta problemática (Gutiérrez, 2002). Las macroalgas tropicales contienen moléculas

antioxidantes denominados phlorotaninos capaces de secuestrar radicales libres. Debido a su alto

potencial redox esas moléculas son especialmente importantes. La efectividad de estos

antioxidantes varía dependiendo de los factores abióticos (Truus et al., 2004; Zubia et al., 2008),

siendo capaces de actuar contra especies reactivas de oxígeno (ERO) tales como el anión

peróxido (O2-), hidroxilo (OH), alcóxilo (RO), peroxilo (ROO) y peróxido de hidrógeno (H2O2) los

cuales tienen efecto dañino en lípidos, proteínas, carbohidratos, enzimas y ácidos nucleicos. Por

otro lado los phlorotaninos poseen mecanismos de fotoprotección contra la radiación solar,

específicamente la radiación ultravioleta y se asume que éstos protegen la fotodestrucción del talo

algal (Kang et al., 2004; Mosquera et al., 2005; Zou et al., 2008).

En los análisis de Le Tutour y colaboradores (1998) mencionan en el texto descubrimientos

en los años 70 sobre fosfolípidos en Porphyra tenera y Eisenia bicyclis así como análisis en los

años 80 enfocados en substitutos de fenoles y o-difenoles en Polysiphonia urceolata. Sin embargo,

Le Tutour y colaboradores (1998) realizaron pruebas en extractos de Laminaria digitata,

Himanthalia elongata, Fucus vesiculosus, F. serratus y Ascophyllum nodosum referente a

captación de radicales libres, con ello determinaron actividad antioxidante por un periodo inducido,

no obstante, mostraron sinergia con la vitamina E adquiriendo gran capacidad oxidativa.

Para el año 2000, Chkhikvishvili y Ramazanov determinan el porcentaje en peso seco de

compuestos fenólicos en varias algas pardas, encontrando mayor porcentaje en Cystoceira

compressa con 4.83% mientras que Padina pavonica fue una de las más bajas con 0.69%;

identificaron phlorotaninos acetilados en Cystoceira compressa los cuales se sometieron a la

prueba de actividad antioxidante con DPPH al igual que los antioxidantes comerciales picnogenol y

phloroglucina siendo estos últimos los que presentaron mayor actividad.

Posteriormente Kang y colaboradores (2003) analizaron extractos fenólicos de Eisenia

bicyclis, Ecklonia estolonifera, Ecklonia cava, Ecklonia kurome y Hizikia fusiformis encontrando en

ellos capacidad de protección vascular, específicamente evaluando la protección de las

lipoproteínas de baja densidad (LDL) y la disfunción eréctil en 31 pacientes; determinaron la

utilidad de los compuestos polifenólicos, como fundamentales agentes preventivos contra los

factores de riesgo vascular procedentes del estrés oxidativo.

10

En el 2004 Truus y colaboradores estimaron que F. vesiculosus contiene 1 µg/mL de

phlorotaninos y discernieron elementos inorgánicos bioactivos como metales pesados y halógenos

en ella. En este mismo año Kang (2004) y colaboradores analizaron 17 extractos y realizaron

pruebas contra las ERO utilizando el marcador 2’,7’-diclorodihidrofluoresceina diacetato.

Determinaron que a una concentración de 25 mg/mL de Ecklonia stolonifera inhibe un 44.30 ±

7.33% la generación total de ERO. Se siguió el estudio con E. stolonifera debido a su uso como

alimento en Korea y se aislaron de ella phloroglucinol, eckstolonol, eckol, phlorofucofuroeckol A y

dieckol (Figura 2).

Chang-Seon (2005) y colaboradores analizaron dieckol y phlorofucofuroeckol (Figura 2)

proveniente de Ecklonia cava verificando su acción en los neurotransmisores ya que la aplicación

de estos en ratas (estudiando tres áreas del cerebro: corte frontal, hipocampo y zona estriada)

incrementó el nivel de acetilcolina inhibiendo la acetilcolinoesterasa. También Gin-Nae y

colaboradores (2007) determinaron phloroglucinol, eckol y dieckol (Figura 2) en el alga Ecklonia

cava con actividad antioxidante; establecieron que dichos compuestos mostraron una alta

inhibición de radicales libres y detienen el daño en el ADN proponiéndolos como compuestos

efectivos y aplicables como antioxidantes.

Amornlerdison y colaboradores (2007) realizaron un estudio de actividad antioxidante en

Padina minor donde evaluaron la reducción del radical DPPH y estimaron los compuestos

fenólicos. En su estudio determinaron que esta alga contenía 217.40 ± 11.28 de fenoles

equivalentes de ácido gálico y con tal cantidad inhibió un 77% el radical DPPH. Por igual, Zubia y

colaboradores (2007) determinaron en Padina gymnospora una cantidad de 5.58 ± 0.30 (peso

seco) de polifenoles y la reducción del radical DPPH con tal cantidad fue de 3.45 mg/mL, sin

embargo, en su estudio encuentran que el mayor porcentaje de reducción está en Avrainvillea

longicaulis, Chondria baileyana y Lobophora variegata.

Matanjun y colaboradores (2008) realizaron análisis de actividad antioxidante con los

métodos, TEAC (capacidad antioxidante equivalente a trolox) y FRAP (poder antioxidante de

reducción férrica); determinaron la capacidad de las tres algas rojas Eucheuma cottoni, E.

spinosum y Halymenia durvillaei, dos algas verdes Caulerpa lentillifera y C. racemosa y las tres

algas pardas Dictyota dichotoma, Sargassum polysystum y Padina sp. Encontrando que C.

lentillifera presentó mayor actividad en el ensayo TEAC (2.16 ± 0.04 mM/mg) y S. polysystum en el

ensayo FRAP (366.69 ± 11.85 mM/mg) así mismo estas dos algas presentaron un alto contenido

de compuestos fenólicos.

11

Shibata y colaboradores (2008) evaluaron el potencial de los phlorotaninos como

inhibidores de la peroxidación fosfolipídica en el sistema liposomal y determinaron la capacidad

oxidativa con DPPH; los oligómeros eckol, phlorofucofuroeckol A, dieckol y 8,8”-bieckol (Figura 2)

aislados de Ecklonia cava, E. kurome y Eisenia bicyclis mostraron potente inhibición en la

peroxidación fosfolipídica (1 µM en el sistema liposomal) y una reducción de DPPH (50%) en

concentración de 12-26 µM.

Soo-Jin y colaboradores (2008) elucidaron el compuesto diphloretohidroxicarmaloilo

(Figura 6) vía NMR proveniente del alga parda Ishige okamurae, midieron la capacidad de

captación en radicales siendo comparada la actividad contra la del ácido ascórbico; se determinó

que el compuesto es más efectivo contra radicales hidroxilo que el mismo ácido. Así también, este

mismo autor determinó junto a You-Jin (2008) los efectos antioxidantes de enzimas extraídas de la

misma alga, encontrando que los extractos generados por proteasas tienen alta captación

reductiva frente a radicales de peróxido de hidrógeno.

Figura 6. Estructura del compuesto diphloretohidroxicarmaloilo extraído de Ishige

okamurae reproducido de Soo-Jin y colaboradores (2008).

Por igual, Zou y colaboradores (2008) analizaron el alga Ishige okamurae y aislaron

phloroglucinol (Figura 2), diphlorethohidroxicarmaloilo (Figura 6) y 6,6´-bieckol (Figura 7) siendo

estas dos últimas moléculas las que presentaron la mayor actividad reductiva frente al DPPH,

radical alquilo, hidroxilo y superóxido, así como también redujeron significativamente el nivel de

especies reactivas de oxígeno en fibroblastos fetales, macrófagos celulares de ratón y en células

leucémicas.

O O

OH

OH

HO

HO

5a

9a8

7

6

1''

2''3''

4''

5''6''

O

O

OH

OH

OH

OH

HO

1'

2'3'

4'

5'6'

1

2

34

4a

10a

12

Quang-To y colaboradores (2009) identificaron en Ecklonia cava phloroglucinol, dieckol,

6,6´-bieckol y 1-(3´,5´-dihidroxi-peroxi)-7-(2”,4”-trihidroxiperoxi)-2,4,9-trihidroxidibenzo-1,4-dioxina

que posteriormente fueron probados en un ensayo de inhibición sobre la liberación de histamina en

células de cultivo (basófilas de leucemia); encontraron un potencial antialérgico a base de un buen

mecanismo de supresión en la liberación de histamina (Figura 7).

Es por esto que en el presente estudio se dio importancia en analizar el extracto etanólico

del alga Padina mexicana con el fin de identificar la actividad antioxidante y antimicrobiana de las

respectivas fracciones, esto basado en la bibliografía antes mencionada donde claramente se han

encontrado que diferentes especies del género presentan dichas actividades.

Figura 7. Estructuras de los compuestos 1) 1-(3´,5´-dihidroxi-peroxi)-7-(2”,4”-trihidroxiperoxi)-2,4,9-

trihidroxidibenzo-1,4-dioxina y 2) 6,6´-bieckol identificados en Ecklonia cava reproducido de

Quang-To y colaboradores (2009).

2.4. Actividad antimicrobiana de las algas pardas.

A lo largo de la historia, ha habido una continua batalla entre los seres humanos y la

multitud de microorganismos que causan enfermedades infecciosas. Esto mejoró con la aparición

de la penicilina en 1940, no obstante la euforia por la conquista potencial de enfermedades

HO

O

OH

OH

OH

OHO

O

OH

OH

OHO

O

OHO

OH

HO

1

24a5a

10a9a

9

7

1'

3'5'

1''

3''5''

O

1'

3'5'HO

O

OH

HO 10a 9a

34a 5a 6

8

HO7

5a 4a3

19a 10a

OH

OH

OH

OHHO

6'2'

O

O

1 2

13

infecciosas fue de corta duración pues casi tan pronto como los fármacos antibacterianos se

desplegaron, las bacterias respondieron manifestando diversas formas de resistencia (Tenover,

2006).

Se conoce que las principales formas de acción que contienen los agentes antibacterianos

son la interferencia en la síntesis de la pared celular, interferencia en la formación de ácidos

nucleicos y proteínas así como inhibición de rutas metabólicas pero esto fue contrarrestado por la

manifestación de la resistencia antibacteriana generada al adquirir genes que codifican enzimas,

tales como β-lactamasas, que destruyen el agente antibacteriano antes de que pueda surtir efecto.

Otro mecanismo, es la adquisición de bombas de flujo que expulsan el agente antibacteriano de la

célula antes de que pueda llegar a su sitio de destino. También pueden sintetizar varios genes por

vía metabólica tomando la unión del agente antimicrobiano de bacterias muertas que inhiban sus

efectos o pueden adquirir mutaciones que limitan accesos a dichos agentes. Se reporta que las

penicilinas, cefalosporinas, tetraciclinas, macrólidos, fluroquinolonas, entre otros ya no resultan

efectivos por lo que se ha enfocado en la búsqueda de compuestos provenientes de nuevas

fuentes como las macroalgas que tengan potencialidad (Tenover, 2006; Džidič et al., 2008).

Shirahama en 1942 publicó el primer reporte de las propiedades antibióticas en algas

donde consiguió aislar una sustancia a partir de Cystophyllum hakodatense que tubo efectos sobre

Lactobacillus vulgaricus y L. helveticus. Pratt y colaboradores en 1951 obtuvieron extractos de

algas marinas solubles en éter capaces de inhibir el crecimiento de Staphylococcus aureus,

Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa (De Lara- Isassi et al., 1989; Durand, 2001).

En contraste con estos años, Colin y Augier (1939) estudiaron el alga Polysiphonia

fastigiata y la presencia de componentes fenólicos en ella, también Leman (1944) aisló una

sustancia cristalina de carácter fenólico. Augier (1949) reaisló el ácido dibromohidroxibenzoico

(Scheuer, 1973).

Así mismo, en los sesenta se produjeron avances aun más significativos en la

investigación de los productos naturales algales consiguiendo con ello el aislamiento de un gran

número de compuestos con actividad antimicrobiana hasta la actualidad (Jing-wen y Wei-ci, 1984).

Durante marzo y junio de 1982, Jing-wen y Wei-ci colectaron 60 algas las cuales fueron extraídas

con tolueno-metanol (1:3) para determinar su actividad antimicrobiana contra Bacillus subtilis,

Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae y Vibrio sp. En ese estudio se encontró que solo

algunos miembros de las Rhodophyceae y Phaeophyceae presentaron dicha actividad.

14

Por su parte, Moreau y colaboradores (1984) reportaron varios géneros de Dictyotales

sometidos a estudios antifúngicos y antibacterianos; encontrando que los extractos hexánicos de

especies del género Dictyota fueron los más activos contra los hongos Microsporum gypseum, M.

fulvum, M. canis y contra bacterias Gram-negativas como Sarcina lutea. Así mismo, en 1988

realizó un muestreo estacional (12 meses) determinando con ello que la variación de la actividad

es dependiente de la madurez sexual, la ecología del sitio y el ciclo de vida del alga.

Bakus (1985) catalogó más de 220 compuestos fenólicos, provenientes de organismos

marinos como bacterias, algas, esponjas y anélidos, entre otros. En ese mismo año Mabrouk

estudió la inhibición del crecimiento micelial y acumulación de aflatoxinas en Aspergillus flavus,

donde encontró que los ácidos grasos y aceites volátiles de Padina pavonica podían inhibirles en

un 35% y 50% a concentraciones de 100, 150, 200 g/L.

Rosell y Srivastava (1987) establecieron que los ácidos grasos de algunas especies de

algas pardas poseen actividad antimicrobiana contra Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Branhamella

catarrhalis, Microccocus luteus y Staphylococcus aureus. Un año después Paul (1988) reportó la

presencia de polifenoles en las algas pardas, a los cuales les atribuyó la defensa química contra

depredadores como invertebrados y peces.

En 1989 De Lara-Isassi y colaboradores reportan actividad antimicrobiana en el extracto

etanólico de Padina crispata (halo de 1-2 mm) así como en los extractos acuoso y etanólico de

Padina durvillaei (halos de 1-2 mm respectivamente). Este análisis fue realizado por el método de

difusión en agar por disco en el cual se añadió 0.1 mL de muestra pero no establece la cantidad de

extracto. Por igual, De Lara-Isassi y colaboradores en 1993 colectaron 57 algas en las costas

mexicanas, 13 de las cuales se encontraban dentro de las Phaeophyceae y se analizaron en

búsqueda de actividad antimicrobiana; para el análisis colocaron 0.1 mL de las muestras en cada

disco encontrando que el extracto acetónico del alga Padina boergesenii presentó un halo de

inhibición de 7 mm contra una cepa de Staphylococcus aureus y un halo de 13 mm en la cepa de

Streptococcus pyogenes, así mismo en un extracto etanólico de la misma alga se obtuvo un halo

de inhibición de 11 mm en la cepa de S. pyogenes, desafortunadamente, es imposible determinar

la concentración a la cual el extracto fue probado.

Ktari y Guyot (1999) aislaron el compuesto derivado del fucosterol (Figura 8) con actividad

citotóxica proveniente de Padina pavonica que inhibió el crecimiento de células KB (carcinoma

epidérmico-bucal humano); el extracto obtenido con diclorometano presentó una inhibición del

15

100% a 10 µg/mL mientras que el extracto obtenido con una combinación de diclorometano-

metanol fue moderadamente activo.

Figura 8. Compuesto derivado del fucosterol activo contra células KB extraído a partir de Padina

pavonica reproducido de Ktari y Guyot (1999).

En el 2000 De Lara-Isassi y colaboradores estudiaron la toxicidad de 73 especies de algas.

La medición de la toxicidad fue clasificada en tres rangos: tóxica (T), moderadamente tóxica (MT) y

no tóxica (NT) esto de acuerdo a las reacciones que los peces Carassius aratus presentaron; se

consideró alta toxicidad si el organismo sometido a prueba moría en un periodo de 2 h después de

aplicar el extracto, la moderada toxicidad implicó la observación del comportamiento como

movimiento rápido, equilibrio, cambio de coloración, entre otros, durante un periodo de 20 h; al no

presentar ningún efecto dentro de los intervalos anteriores se consideró no tóxico. Con lo anterior

se determinó que los extractos acetónicos y etanólicos de Padina boergesenii eran altamente

tóxicos al igual que el extracto etanólico de Padina durvillaei, mientras que los extractos acetónicos

y etanólicos de Padina gymnospora fueron moderadamente tóxicos. Gonzáles del Val y

colaboradores (2001) reporta a Padina pavonica con actividad antimicrobiana contra Bacillus

subtilis así como otras algas pardas con potencial bioactivo.

Nagayama y colaboradores (2002) dicen haber realizado el primer estudio que demuestra

actividad bactericida de cinco phlorotaninos purificados del alga parda Ecklonia kurome (Figura 4);

se probó phloroglucinol, eckol, phlorofucofuroeckol A, dieckol y 8,8′-bieckol contra patógenos como

S. aureus, S pyogenes y V. parahaemolyticus entre otros encontrando en el análisis que no había

una diferente susceptibilidad entre las Gram-negativas y Gram-positivas.

1

2

34

HO

10

56

7

89

19 11 13

12

1415

1617

21

20

22

23HOO

27

25

2624

2829

16

Después, Kubanek y colaboradores (2002) aislaron el compuesto denominado Lobophorido

1 del alga parda Lobophora variegata (Figura 9); se determinó que dicho compuesto es utilizado

por la misma como defensa química contra los hogos Lindra thalassiae y Dendryphiella salina, así

también mencionan que podría ser producto de un simbionte microbiano del alga al tener similitud

estructural con metabolitos bacterianos.

Figura 9. Estructura del compuesto Lobophorido 1 obtenido de Lobophora variegata reproducido de

Kubanek y colaboradores (2002).

Mi-Jeon y colaboradores (2004) aislaron de Ecklonia cava cuatro derivados de

phloroglucinol denominados eckol, 8,8’-bieckol, 8,4”-dieckol y phlorofucofuroeckol A (Figura 2),

posteriormente los probaron como inhibidor de la transcriptasa reversa y proteasa del virus VIH-1;

con ello encontraron que 8,8’-bieckol y 8,4”-dieckol (Figura 2) tienen potente actividad antiviral,

comparable con otros supresores de dichas enzimas. Por otro lado, Shibata y colaboradores (2004)

determinaron la localización de los phlorotaninos en las células vegetativas de la parte externa en

el talo de E. kurome, E. cava y E. bicyclis, así mismo elucidaron el contenido de compuestos como

eckol, dieckol, 8,8” bieckol, phlorofucofuroeckol A (Figura 2), tetrámero de phloroglucinol y

phloroglucinol en varias concentraciones utilizando la técnica de HPLC y microscopia con vainillina-

HCI.

Tuney (2006) analizó cuatro extractos de Padina pavonica obtenidos con acetona, metanol,

dietil éter y etanol respectivamente, siendo éste último el único que mostró actividad antimicrobiana

sobre Candida albicans, S. faecalis, P. aeruginosa y E. coli. Por su parte, Kamei y Aoki (2007)

analizaron 342 especies de algas en la búsqueda de un compuesto capaz de inhibir el virus

infeccioso de necrosis hematopoyética en peces, encontrando 15 especies de algas pardas con

actividad antiviral. Padina crassa, Padina arborescens y Eisenia bicyclis mostraron una inhibición

O

OMe

42

2829

3031

27 26

25

40

24 23

O OH

22

39

2120

OMe37

1918

O OMe OMeOH

OMe

36

17

O

16

35

15

34

14

1312

11

10

9

8 7

65

43

21

32 38

O

17

del 90% del virus, siendo esta última seleccionada para la determinación de su acción. El estudio

de E. bicyclis condujo al aislamiento e identificación del pigmento fotosintético clorofila c2 como el

responsable de la actividad en E. bicyclis.

Kandhasamy y Arunachalam (2008) reportan que el extracto metanólico de Padina

tetrastomatica inhibe el crecimiento de S. aureus (entre otros) al igual que un extracto etanólico de

Kumar y colaboradores (2009). Chiheb y colaboradores (2009) determinaron la acción del extracto

metanólico de Padina pavonica encontrando que presentó alta actividad contra S. aureus.

3. Justificación.

La Secretaría de Salud reportó para el 2006 que las enfermedades del sistema urinario

ocupaba el séptimo lugar en egresos hospitalarios mientras que enfermedades en tejido conjuntivo

el treceavo, enfermedades infecciosas intestinales el dieciseisavo y enfermedades respiratorias

como la neumonía el decimoctavo. Así mismo, el Sistema Nacional de Información en Salud

reportó para el 2007 que la causa de muerte por enfermedades infecciosas respiratorias bajas son

de un 27.6 % y las enfermedades de vías urinarias como nefritis o nefrosis 22.2%.

Se ha establecido, que los microorganismos causantes de tales enfermedades han

adquirido resistencia a los fármacos disminuyendo la susceptibilidad a estos, tal es el caso de E.

coli que comúnmente es causante de infecciones en el tracto urinario y bacteremia pero que ahora

es resistente a los productos que eran utilizados para su erradicación como amoxicilina o

ampicilina y cefalosporinas de alto espectro (Rosales y Rodríguez, 2006; Tenover, 2006). Por su

parte S. aureus es causante de enfermedades respiratorias que regularmente se trataban con

vacomicina, tienen inmunidad a su acción y a otros antibióticos como la meticilina (Sá-Leáo et al.,

1999; Tenover, 2006).

En cuanto a Streptococcus pyogenes se refiere, este microorganismo es causante de

faringitis, infecciones cutáneas y de tejidos blandos, sepsis puerperal, neumonía, endocarditis,

meningitis y artritis las cuales eran tratadas con penicilina, eritromicina u otros macrólidos pero este

microorganismo ha adquirido residencia a ellos (Bassetti et al, 2000; Rodríguez et al, 2000)

Los organismos del género Vibrio son causantes de enfermedades como la gastroenteritis

y al no ser tratada podría ser mortal; se reporta que este microorganismo es susceptible a

tetraciclina, doxiciclina, furazolidona, cotrimoxazol, cloranfenicol, cefalosporinas de tercera

generación, aminoglucósidos y quinolonas. Sin embargo, pueden presentar resistencia a las

18

sulfonamidas, penicilinas, colistín, ampicilina y cefalosporinas de primera y segunda generación

(cefalotina y cefuroximaes) (Dabanch et al, 2009).

Los cambios en las epidemiologías infecciosas causadas por estos microorganismos y las

secuelas producidas tienen una estrecha relación con la disponibilidad de antibióticos, la mejoría

en el acceso a la atención médica para precisar con oportunidad el diagnóstico de las infecciones

así como la eficacia de los antibióticos y el adecuado huso de los mismos (Rodríguez et al, 2000).

Es por esto que la búsqueda de compuestos que presenten actividad antimicrobiana contra cepas

resistentes es de gran importancia ya que es necesario obtener moléculas con estructuras

novedosas que ayuden a contrarrestar las enfermedades de manera efectiva y que al mismo

tiempo puedan ser obtenidas de manera rápida y con bajos costos.

En cuanto a enfermedades degenerativas crónicas, el Sistema Nacional de Información en

Salud establece para el 2007 que el 60.5% de la población masculina y el 45 % de la población

femenina para ese año murió de enfermedades isquémicas del corazón, el 26.7% y 28.6% de

enfermedades cerebro-vasculares y el 64% y 69.2 % de diabetes mellitus respectivamente. Las

enfermedades cancerígenas causantes de muerte para ese año en la población masculina fueron

de próstata en un 15.7%, tráquea, bronquios y pulmón en un 14% y estómago en 9 % mientras que

para la población femenina el cáncer de mama fue mayoritario con 13.8 %, en el cuello del útero

con 12.1% e hígado con 7.6%.

Por lo tanto, la búsqueda de moléculas con potencial para contrarrestar enfermedades

degenerativas causadas por el estrés oxidativo ha adquirido auge en los últimos años (Rosales y

Rodríguez, 2006). Las macroalgas tropicales del género Padina contienen moléculas antioxidantes

capaces de secuestrar radicales libres. La efectividad de estos antioxidantes varía dependiendo de

los factores abióticos, siendo capaces de actuar contra especies reactivas de oxígeno (ERO) las

cuales tienen efecto dañino en lípidos, proteínas, carbohidratos, enzimas y ácidos nucleicos lo que

les asocia con las enfermedades degenerativas (Kang et al., 2004; Mosquera et al., 2005; Truus et

al., 2004; Zubia et al., 2008; Zou et al., 2008).

4. Descripción y distribución de Padina mexicana.

Las algas de la clase Phaeophycea son organismos multicelulares fotosintéticos que se

reproducen sexualmente y contienen clorofila a, c, c1 y c2 así como también pigmentos accesorios

19

como fucoxantinas y ß-caroteno; esta clase tiene alrededor de 14 órdenes dentro de los cuales se

encuentra el orden Dictyotales (Van den Hoek et al., 1995).

Dentro de dicho Orden se encuentra la familia Dictyotaceae, la cual presenta 26 géneros y

222 especies. Las Dictyotales contienen talos aplanados con diferentes tipos de meristemos,

mechones de pelos superficiales y crecimiento apical; usualmente presentan frondas erectas,

dicotómicas subdivididas o irregulares dependiendo si el crecimiento es inducido por una célula

apical o un grupo pequeño de células apicales, flaveadas o irregulares (Ceseña, 2003).

Uno de los géneros que se encuentra dentro de este orden es Padina, el cual se

caracteriza por tener un talo aplanado y en forma de abanico con una coloración que va desde

amarillo a café claro (Chávez, 2000; Ceseña, 2003). Las estructuras reproductivas denominadas

oogonios, anteriodios y esporangios se encuentran regularmente entre bandas concéntricas de

paráfisis; muchas especies se consideran dioicas, no obstante, en algunas poblaciones esto se ve

influenciado por la profundidad y estación del año. Los soros concéntricos alternantes y la línea de

pelos son consistentes en el medio apical de frondas bien desarrolladas, siendo rasgo distintivo

para determinar las especies (Ceseña, 2003).

Por otra parte, la especie Padina mexicana tiene un talo de aproximadamente 5 a 15 cm

de longitud y de 5 a 20 cm de amplitud, el cual no siempre se presentará erecto pues en ocasiones

no cuenta con sujetadores secundarios sobre la superficie del talo. Estas son capaces de precipitar

carbonato de calcio que puede ser depositado como aragonita en las zonas extracelulares

concéntricas comenzando en el espacio intercelular formando el margen apical del talo (Lüning,

1990; Chávez, 2000). Se pueden encontrar dos fenotipos de ella, en el primero los sujetadores

secundarios no precipitan carbonato de calcio por uno de los lados, midiendo de largo entre 10 y

15 cm con un número de células basales de 5 a 6 (dos células corticales) y el segundo, el

crecimiento se origina en forma de roseta y desarrolla sujetadores secundarios en uno de los lados

(sin células corticales), teniendo una altura máxima de 10 cm (Chávez, 2000).

En cuanto a su reproducción se refiere, posee talos monoicos con reproductores

arreglados en soros encontrados en la superficie del abanico; los oogonios miden 50 a 55 µm de

largo y 40 a 45 µm de ancho localizados en la región subapical entre las bandas de paráfisis y

están dentro de una cápsula de 220 µm. Los anteridios miden de 80 a 85 µm de largo y 10 a 15 µm

de ancho encontrándose sobre las bandas de paráfisis en la región apical como filamentos cortos

pluriloculares; los esporangios se localizan a lo largo de todo el talo entre las bandas de paráfisis y

20

carbonato de calcio, pueden medir entre 55 y 60 µm de largo y 40 a 45 µm de ancho (Chávez,

2000).

Padina mexicana se puede definir como una especie esporádica ya que puede estar

presente en primavera y verano y ausente durante el otoño e invierno; se ha registrado en todo el

Golfo de California sin embargo, en la región media y norte no es constante (Riosmena-Rodríguez

et al, 2009). Su principal distribución es en la región sur del golfo con una extensión al Pacífico

tropical mexicano; el crecimiento se ha reportado en la zona intermareal asociada a otras algas del

mismo género, así como también en sustratos arenoso-rocoso y en canto rodado (Chávez, 2000;

Riosmena-Rodríguez et al, 2009).

4.1. Clasificación taxonómica de Padina mexicana.

Dominio: Eucariota (Chatton)

Reino: Cromista (T. Cavalier-Smith)

Subreino: Cromobionta (T. Cavalier-Smith)

Infrareino: Heteroconta (T. Cavalier-Smith)

Phylum: Heterocontofita (Moestrup)

Clase: Phaeophyceae (Kjellman)

Orden: Dictyotales (Bory de Saynt)

Familia: Dictyotaceae (Lamouroux ex Dumortier)

Tribu: Zonarieae

Género: Padina (Adanson)

Especie: Padina mexicana (Thivy, 1945)

21

Figura 10. Apariencia de Padina mexicana.

5. Objetivo general.

Evaluar las fracciones obtenidas de Padina mexicana por su actividad antibacteriana y

antioxidante.

Identificar las fracciones del alga Padina mexicana que contengan actividad inhibitoria

contra cepas bacterianas resistentes a los antibióticos así como determinar la actividad

antioxidante en las mismas.

5.1. Objetivos particulares.

a) Fraccionar por cromatografía en columna la fracción ESL1F2 obtenida del extracto

etanólico de Padina mexicana.

b) Evaluar la actividad antibacteriana de las fracciones obtenidas, por medio del método de

difusión en agar contra tres cepas patógenas de humanos S. aureus (ATCC BAA-42), S.

pyogenes (ATCC BAA-946) y E. coli (ATCC BAA-196).

22

c) Determinar el potencial antioxidante de todas las fracciones obtenidas utilizando el

ensayo del radical libre estable 2,2-difenil-1-picril hidracilo (DPPH) por los métodos

bioautográfico y espectrofotométrico.

6. Materiales y Métodos.

6.1. Trabajo en campo.

Padina mexicana fue recolectada el 5 de junio de 2004 por Dr. Jesús Iván Murillo Álvarez y

M. en C. Mauricio Muñoz Ochoa en de San Juan de la Costa, Baja California Sur a los 24° 24’

47.08” latitud Norte, 110° 41’ 28.66” longitud Oeste. El alga se tomó del sustrato rocoso en la zona

intermareal, fue limpiada de material extraño y colocada en bolsas de plástico previamente

etiquetada como 04-002. Posteriormente, fue identificada en Escuela Nacional de Ciencias

Biológicas por la Dr. Luz Elena Mateo Cid y la Bióloga Catalina Mendoza y confirmada por el Dr.

Rafael Riosmena Rodríguez de la Universidad Autónoma de Baja California Sur.

Figura 11. Mapa del área de colecta.

23

6.2 Trabajo de laboratorio.

6.2.1. Obtención del extracto crudo.

El alga fue secada al sol y almacenada a -20° C hasta el momento de su extracción. 839 g

del alga Padina mexicana (etiquetada como 04-002) seca y molida fueron extraídos por

maceración con etanol destilado en proporción de 1:2 (masa:volumen). Cada 3 días se cambió el

disolvente. El extracto resultante fue concentrado a sequedad a presión reducida en un rotavapor

Yamato RE500. El sólido resultante (extracto etanólico crudo) fue transferido a un vial tarado y

etiquetado como 04-002-41.

6.2.2. Fraccionamiento del extracto crudo.

Inicialmente, el extracto crudo sé sometió a un proceso de extracción en fase sólida para

separar sus componentes en fracciones gruesas; esto se realizó disolviendo el extracto en

etanol:agua (9:1) seguidamente se mezcló con 250 g de sílica gel de fase normal (40 μm, 60 Å); se

mantuvo en movimiento constante hasta evaporar el disolvente y se dejó en la campana de

extracción. La mezcla completamente seca, fue extraída por percolación utilizando CH2Cl2 (1.5 L),

EtOAc (1.5 L), EtOH (0.9 L) y H2O (0.9 L), obteniéndose 4 fracciones denominadas

ESL1F1…ESL1F4 respectivamente. Todas las fracciones fueron sometidas a los ensayos de

actividad antimicrobiana y antioxidante. La fracción ESL1F2 (eluída con EtOAc) mostró actividad

contra S. aureus y S. pyogenes en el ensayo de difusión en agar con discos y actividad reductora

del radical libre estable 2,2’-difenil-1-picrilhidracilo. Considerando esto, la fracción ESL1F2 fue

seleccionada para continuar su fraccionamiento, por lo que 2.41 g de esta fracción fueron

sometidos a un fraccionamiento en columna cromatográfica sobre sílica gel de fase normal (40 μm,

60 Å). La muestra fue adsorbida en sílica gel a una proporción muestra: adsorbente igual a 1:2.5.

La columna fue empacada por vía húmeda con 120 g de sílica gel suspendida en CH2Cl2. La

muestra fue depositada en la parte alta de la columna. La elusión fue realizada utilizando CH2Cl2 (3

volúmenes, equivalentes a 690 mL), CH2Cl2:EtOH en gradiente 98:2, 96:4, 92:8, 90:10, 85:15,

80:20, 50:50 y finalmente EtOH y H2O. Después de analizar el patrón de separación por medio de

cromatografía en capa fina, y las fracciones fueron unidas por similitud en 15 fracciones nombradas

24

como CCAF1…CCAF15. Todas las fracciones fueron sometidas nuevamente a los ensayos de

actividad antimicrobiana y antioxidante.

Entre otras, CCAF8 mostró actividad inhibitoria contra S. aureus, S. pyogenes, Por lo que

fue fraccionada adicionalmente por cromatografía en columna de fase reversa. Para ello, 330.6 mg

de CCAF8 fueron disueltos en 2.5 mL de EtOH:H2O (9:1) e inyectados a una columna Lobar 240

LiChroprep RP18 (Merck) acoplada a una bomba peristáltica Masterflex (Cole-Parmer Instrument).

La elusión se realizó con EtOH:H2O (9:1) a 1 mL/min. El total de la fracción CCAF8 fue procesado

en 3 inyecciones sucesivas de donde, después de unir las fracciones semejantes se obtuvieron 18

nuevas fracciones las cuales fueron denominadas CCBF1…CCBF17. De estas fracciones,

CCBF17 (52 mg) resultó ser un sólido amorfo ligeramente amarillo, el cual fue adicionalmente

procesado en las mismas condiciones que la anterior habiéndose obtenido el compuesto puro

DDF1 (Figuras 12 y 13).

25

CCA F10

64.1mg

Columna CCC HPLC

EtOH:H2O

Columna CCB3 HPLC EtOH:H2O Inyección 3

Columna CCB2 HPLC EtOH:H2O Inyección 2

Columna CCB1HPLC EtOH:H2O Inyección 1

04-002-41 51g

ESL1F4 6.8g

ESL1F3 32.76g

ESL1F2 2.419g

ESL1F1 4.2581g

CCA F1

14.8mg

CCAF2 26mg

CCA F3

159mg

CCA F4

104.4mg

CCA F5

111.8mg

CCA F6

63.6mg

CCA F7

22.3mg

CCA F8

330.6mg

CCA F9

119.8mg

CCA F11

149.5 mg

CCA F12

453.0mg

CCA F13

7.62mg

CCA F14

45.4mg

CCA F15

129.3mg

CCA FU1-2 CCA FU6-7

CCB1 F1

10.2mg

CCB1 F2

29mg

CCB1 F3 2mg

CCB1 F4

4.7mg

CCB1 F5 mg

CCB1 F6

15.9mg

CCB1 F7

0.8mg

CCB1 F8

5.3mg

CCB1 F9

2.9mg

CCB1 F10

8.8mg

CCB1 F11

3.3mg

CCB1 F12

9.2mg

CCB1 F13

5.1mg

CCB1 F14

523.7mg

CCB1 F15

14.7mg

CCB1 F16 4mg

CCB1 F17

52.4mg

CCC F1 32.3mg

CCC F2 9.6mg

Columna CCA CH2Cl2 : EtOH

Figura 12. Fraccionamiento del extracto etanólico de Padina mexicana.

26

Figura 13. Fraccionamiento de CCC F1 hasta la obtención de un compuesto puro.

6.2.3. Actividad antimicrobiana.

6.2.3.1. Ensayo de actividad antimicrobiana.

Las fracciones de Padina mexicana fueron sometidas a un ensayo de actividad

antimicrobiana utilizando el método de difusión en agar con discos. El ensayo consiste en

colocar discos de papel filtro (6.4 mm de diámetro) impregnados individualmente con una

solución stock de cada fracción, sobre placas de agar inoculadas con la suspensión del

microorganismo de prueba. Las placas fueron incubadas a 37º C por 24 h, después de este

lapso el diámetro de los halos de inhibición fue medido. Cada ensayo se realizó por duplicado

y los resultados expresados como el promedio ± la desviación estándar en milímetros.

6.2.3.2. Microorganismos de prueba.

Los organismos de prueba utilizados en este estudio fueron obtenidos de la American

Type Culture Collection (ATCC), proveedor de cepas bacterianas previamente aisladas de

sitios específicos; se etiquetaron con el número de lote proporcionado por dicha institución.

El microorganismo Staphylococcus aureus (ATCC BAA-42) fue aislado de pacientes en

el hospital pediátrico Ward, Lisboa, Portugal en 1996; ésta bacteria es clasificada como grado

de seguridad 2 por su resistencia contra meticilina, penicilina, oxacilina, ampicilina y cefalotina.

La temperatura óptima de crecimiento es de 37º C.

CCC F1 32.4mg

DDF2 0.6mg

DDF3 --

DDF4 0.7mg

DDF5 2.1mg

DDF6 8.7mg

DDF7 6mg

DDF8 1.6mg

DDF9 5.2mg

DD F1 17.9mg

Compuesto puro

Columna cromatográfica

DD HPLC

EtOH:H2O

27

Por su parte Streptococcus pyogenes (ATCC BAA-946) se aisló durante la epidemia de

faringitis originada en el 2001 dentro de una escuela elemental en Pittsburgh, E.U.A. La

bacteria presenta resistencia a la eritromicina, grado de seguridad 2 y crecimiento óptimo a los

37º C.

Escherichia coli (ATCC BAA-196) se obtuvo de un aislamiento clínico de Klebsiella

pneumoniae; con características similares de bioseguridad que las otras 2 cepas anteriores. E.

coli mostró resistencia a todos los antibióticos probados y es capaz de producir β-lactamasas.

Vibrio parahaemolyticus (ATCC 17802) se aisló de un stock de Shirasu contaminado,

presentando susceptibilidad moderada a oxitetraciclina, ciproxina, tetraciclina y una alta

susceptibilidad al ácido oxalínico y sulfonamida.

6.2.3.3. Medios de cultivo e inóculos.

Se preparó agar Muller-Hinton en condiciones asépticas, fue esterilizado en autoclave a

120º C durante 15 minutos para verterse en cajas petri (100 x 15 mm) asignadas a cultivo de

Escherichia coli (ATCC BAA-196), Staphylococcus aureus (ATCC BAA-42) S. pyogenes

(ATCC BAA-946). De igual manera se preparó medio de cultivo Vibrio parahaemolyticus el agar

fue preparado con una solución salina al 2%.

A partir de un cultivo masivo de 24 h se prepararon suspensiones de cada

microorganismo de prueba en solución salina (al 2.5 % para V. parahaemolyticus y 0.85% para

los demás microorganismos), la suspensión fue estandarizada a una densidad óptica igual a 1

UA a 585 nm en el espectrofotómetro Merck SQ 118.

6.2.3.4. Preparación de discos.

En condiciones asépticas dentro de la campana de flujo laminar se impregnaron discos

de papel filtro de 6.4 mm de diámetro con 100 μL de una solución stock (20 mg/mL) de cada

una de las fracciones de prueba una concentración de 2 mg/disco. Así mismo, se impregnaron

discos con el disolvente utilizado en la disolución de las fracciones como control negativo.

28

6.2.4. Pruebas de actividad antioxidante.

6.2.4.1. Método espectrofotométrico.

Se preparo una solución stocks con 20 mg /mL de phloroglucionol en EtOH, se

realizaron diluciones para obtener concentraciones de 10, 5, 2.5, 1.25 mg/mL respectivamente.

Así mismo, se realizó una solución de 0.008g de DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidracilo) en 200 mL

MeOH. Dentro de celdas espectrofotométricas de vidrio de 10 mL, se añadieron 5 mL de la

solución stock de DPPH y 50 μL phloroglucinol y un blanco (DPPH); se procedió a leer en el

espectrofotómetro Spectronic 20D (Milton Roy Company) a una longitud de onda de 517 nm.

Se leyó la absorbancia inicial y a los 30 minutos para luego determinar el porcentaje de

reducción mediante la formula: AbsBLANCO-AbsMUESTRA/AbsBLANCO*100 tomada de Lee et al.

(2003).

Posteriormente, de las fracciones CCAF10—CCAF13 se tomaron 20 mg y fueron

disueltos con 1 mL de EtOH realizando después diluciones seriadas en diferentes

concentraciones: 10, 5, 2.5, 1.25, 0.0625 y 0.3125 mg respectivamente. De cada fracción, se

tomó 250 μL y se vertieron en la celda espectrofotométrica con 4.75 mL de DPPH. Se leyó a

una longitud de onda de 517 nm la absorbancia inicial y después de los 30 minutos; esto se

realizó por duplicado y de igual manera, el porcentaje de reducción se estimó con la ecuación

anteriormente mencionada.

6.2.4.2. Método bioautográfico.

Se tomaron 150 µg de las fracciones CCAFU1-2—CCAF15 y se diluyeron en 360 µL

de EtOH. Posteriormente se impregnó una placa de cromatografía en fase reversa con 10 µL

de cada muestra. La placa fue sometida a una fase móvil con el sistema EtOH:H2O (9:1) y una

vez que estuvo seca se impregnó con DPPH diluido al 0.02%.

7. Resultados.

7.1. Cromatografía de capa fina (TLC) y fraccionamiento en columna

cromatográfica del extracto etanólico de Padina mexicana.

Como se observa en la figura 14 de los diferentes disolventes con distintos gradientes

de polaridad probados, la combinación CH2Cl2:EtOH resultó satisfactoria para el

29

fraccionamiento de ESL1F2. La fase móvil con CH2Cl2:EtOH permitió una separación clara

entre una mancha con respecto a otra dentro de la fase estacionaria. Con lo anterior, se

obtuvieron 15 fracciones (Figura 15) etiquetadas como CCAFU1-2–CCAF15 respectivamente,

en las cuales la fase móvil fue EtOH:H2O (9:1) permitió discernir en la fase estacionaria las

diferentes manchas afines para la posterior unión de las fracciones en base a su semejanza.

Seguidamente, se eligió la fracción CCAF8 aplicándose en su fraccionamiento una

proporción 9:1 de EtOH:H2O que permitió una lejanía de la fracción con respecto al punto de

aplicación en la placa cromatográfica. Así mismo se eligió la fracción CCAF8 por presentar

actividad antimicrobiana en pruebas posteriores del la obtención (Sección 7.2). Por lo tanto, al

desarrollarse las columnas cromatográficas denominadas CCB1, CCB2 y CCB3 (Figura 16,

1a, 1b y 1c respectivamente) se obtuvieron 17 fracciones etiquetadas como CCB1F1–

CCB1F17 donde CCB1F17 presentó una coloración blanca y pequeños cristales signo de

menor impureza. Como se puede ver en la figura 17, del fraccionamiento de CCB1F17 se

obtuvieron dos fracciones denominadas CCCF1 y CCCF2 donde la fracción CCCF1 presentó

una coloración blanca indicativa de menor impurezas así como también se obtuvo una cantidad

factible (32.4mg). Al someter a fraccionamiento la fracción CCCF1 se obtuvieron nueve

fracciones etiquetadas como DDF1 a DDF9 de las cuales se determinó que DDF1 se

encontraba visiblemente libre de impurezas lo que llevó a asumirle como un compuesto

parcialmente puro (Figura 18).

Figura 14. Cromatografía en capa fina en fase reversa realizada con diferentes disolventes

para determinar el mejor fraccionamiento del extracto ELS1F2.

1 2 3 4 5

Determinación del fraccionamiento de ELS 1F2 con distintos gradientes

Fase móvil: 1) 100% CH2Cl2 2) 98:2 CH2Cl2:EtOH 3) 94:6 CH2Cl2:EtOH 4) 92:8 CH2Cl2:EtOH 5) 9:1 CH2Cl2:EtOH Revelador: H2SO4 y calor Fase estacionaria: Placas Merck KGaA fase reversa 60Ǻ 254µm

30

Figura 15. Cromatografía del primer fraccionamiento de ELS 1F2. Se realizó un punteo en

placa de 10µL por muestra aproximadamente.

Figura 16. Cromatografía del fraccionamiento realizado a CCAF8. Donde 1a representa las

facciones de la columna cromatográfica CCB1, 1b muestra las fracciones de la columna CCB2

y 1c la columna CCB3.

Fraccionamiento de ESL1F2 Columna CCA

Punteo de cada 5 tubos del 101 al 206 Fase estacionaria: Placas Merck KGaA fase reversa 60Ǻ 254µm Fase móvil: EtOH:H2O (9:1) Revelador: H2SO4 y calor

Fraccionamiento de CCAF8 Columnas CCB1. CCB2 y CCB3

Punteo cada 5 tubos Fase estacionaria: Placas Merck KGaA fase reversa 60Ǻ 254µm Fase móvil: EtOH:H2O (9:1) Revelador: H2SO4 y calor

1a

1b

1c

31

Figura 17. Cromatografía de la columna CCC. La muestra CCB1F17 se fraccionó con un

gradiente de elusión de EtOH: H2O (9:1).

Figura 18. Columna cromatográfica DD. Se observa la obtención de un compuesto

parcialmente puro.

7.2. Análisis de actividad antimicrobiana.

Una vez realizada la primera columna cromatográfica del extracto ESL1F2 se

obtuvieron 15 fracciones que se sometieron a pruebas de actividad antimicrobiana. Como se

muestra en la tabla I, ninguna fracción presentó actividad contra E. coli (ATCC BAA-196).

Por otro lado, la fracción CCAFU1-2, presentó inhibición contra S. aureus (ATCC

BAA-42) de 9 ± 0 y contra S. pyogenes (ATCC BAA-946) de 10 ± 0 mientras que CCAF3,

Punteo cada 5 tubos Fase estacionaria: Placas Merck KGaA fase reversa 60Ǻ 254µm Fase móvil: EtOH: H2O 9:1 Revelador: H2SO4 y calor

Fraccionamiento de CCB1F17 Columna CCC

Fase estacionaria: Placas Merck KGaA fase reversa 60Ǻ 254µm Fase móvil: EtOH: H2O 9:1 Revelador: H2SO4 y calor

Fraccionamiento de CCC F1 Columna DD

32

CCAF4, CCAF5 mostraron actividad similar contra ambas bacterias (Tabla I). A diferencia de

las anteriores, la fracción CCAFU6-7 sólo mostró actividad contra S. aureus (ATCC BAA-42)

con halos de 9.5 ± 0.7 y actividad contra V. parahaemolyticus (ATCC 17802) con 8 ± 0.

La fracción CCAF8 probada contra S. pyogenes (ATCC BAA-946) mostró halos de

inhibición de 15 ± 2.8 y en las pruebas realizadas contra S. aureus (ATCC BAA-42) una

inhibición de 8 ± 0. Esta fracción fue elegida para seguir su fraccionamiento en base a lo

anterior así como también por la fácil dilución en EtOH en comparación con las otras y por

tener una cantidad considerable de 330.6 mg.

Por su parte, CCAF10 presentó un comportamiento semejante a la fracción CCAF8 en

las pruebas contra S. aureus (ATCC BAA-42), sin embargo en las pruebas contra S. pyogenes

(ATCC BAA-946) y V. parahaemolyticus (ATCC 17802) los halos de inhibición fueron de 17.5 ±

3.5 y 8 ± 0 respectivamente. Las fracciones CCAF11 y CCAF15 presentaron actividad

solamente contra la cepa de S. pyogenes (ATCC BAA-946) teniendo halos de inhibición muy

similares (13.5 ± 2.1 y 14 ± 0, respectivamente).

Así mismo, CCAF12 mostró actividad contra las cepas de S. aureus (ATCC BAA-42),

S. pyogenes (ATCC BAA-946) y V. parahaemolyticus (ATCC 17802) al igual que CCAFU1-2 y

CCAF10 difiriendo en los valores ya que CCAF12 inhibió 12 ± 0, 18 ± 1.4 y 8.5 ± 0.7 en cada

caso siendo mayoritario.

Finalmente, como se muestra en la tabla I, las fracciones CCAF13 y CCAF14

presentaron un comportamiento semejante en las pruebas contra S. aureus (ATCC BAA-42) y

S. pyogenes (ATCC BAA-946).

33

Tabla I. Ensayos de actividad antibacteriana de las fracciones CCAFU1-2–CCAF15 donde los

halos de inhibición están expresados por el promedio ± SD (n=2).

+ halo marginal

-- actividad nula

7.3. Pruebas de actividad antioxidante.

7.3.1. Ensayo con el radical libre estable 2,2-difenil-1-picril hidracilo (DPPH).

7.3.1.1. Análisis espectrofotométrico.

Dentro de las gráficas 1 a 5 se muestra la acción de las fracciones sometidas al análisis

espectrofotométrico. Las fracciones CCAF10 y CCAF11 tuvieron una acción similar entre si

presentando un IC50 de 0.20 mg/mL y 0.22 mg/mL respectivamente (gráficas 2 y 3, tabla II). Por

su parte, la fracción CCAF12 presentó un IC50 de 0.13 mg/mL y CCAF13 mostró un valor de

0.023 mg/mL (graficas 4 y 5, tabla II) para inhibir el radical libre estable 2,2-difenil-1-

picrilhidracilo siendo estas las más activas. El análisis para el stock de phloroglucinol mostró un

Fracción E. coli

(ATCC BAA-196)

S. aureus

(ATCC BAA-42)

S. pyogenes

(ATCC BAA-946)

V. parahaemolyticus

(ATCC 17802)

CCAFU1-2 -- 9 ± 0 10 ± 0 --

CCAF3 -- 14.5 ± 0.7 20 ± 0 +

CCAF4 -- 14.5 ± 0.7 22 ± 0 +

CCAF5 -- 14.5 ± 2.1 15 ± 0 +

CCAFU6-7 -- 9.5 ± 0.7 -- 8 ± 0

CCAF8 -- 8 ± 0 15 ± 2.8 --

CCAF9 -- -- 14 ± 1.4 --

CCAF10 -- 8 ± 0 17.5 ± 3.5 8 ± 0

CCAF11 -- -- 13.5 ± 2.1 --

CCAF12 -- 12 ± 0 18 ± 1.4 8.5 ± 0.7

CCAF13 -- 10.5 ± 0.7 13.5 ± 2.1 --

CCAF14 -- 10.5 ± 0.7 14 ± 2.8 +

CCAF15 -- -- 14 ± 0 --

Blanco -- -- -- --

34

valor de IC50 de 0.012 mg/mL (grafica 1, tabla II) por lo que las cuatro fracciones anteriormente

mencionadas mostraron menor actividad reductora en comparación con este.

7.3.1.2. Análisis bioautográfico.

En la figura 19 se muestra la cromatografía en capa fina de fase reversa impregnada

con DPPH (0.02%) después de haber colocado las fracciones; es notable la coloración

amarilla indicativa de la oxidación del radical. La aplicación homogénea de las fracciones (10

µL/muestra) permitió observar claramente la potente actividad de las fracciones CCAF10,

CCAF11, CCAF12, CCAF13 y CCAF14 donde la coloración amarilla apareció inmediatamente

al impregnar la placa.

Figura 19. Placa cromatográfica en fase reversa revelada con DPPH al 0.2%. 1-2=CCAFU1-2,

3=CCAF3, 4= CCAF4, 5=CCAF5, 6-7=CCAFU6-7,8=CCAF8, 9=CCAF9, 10=CCAF10,

11=CCAF11, 12=CCAF12, 13= CCAF13, 14=CCAF14 y 15=CCAF15.

35

Curva dosis-efecto del Phloroglucinol

y = 13.324Ln(x) + 108.7R2 = 0.9991

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

0.006 0.016 0.026 0.036 0.046 0.056 0.066 0.076 0.086 0.096

Concentración en mg/mL

Porc

enta

je d

e re

ducc

ión

del D

PPH

IC50=0.012mg/mL

Grafica 1. Curva logarítmica donde se muestra la dosis y el efecto del phloroglucinol en el ensayo espectrofotométrico con DPPH.

36

Curva dosis-efecto de la fracción CCAF10

y = 16.036Ln(x) + 75.203R2 = 0.9616

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

Concentración en mg/mL

Porc

enta

je d

e re

ducc

ión

del D

PPH

IC50 = 0.20mg/mL

Grafica 2. Curva logarítmica donde se muestra la dosis y el efecto de la fracción CCAF10 en el ensayo espectrofotométrico con DPPH.

37

Curva dosis-efecto de la fracción CCAF11

y = 16.583Ln(x) + 74.653R2 = 0.9699

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

Concentración en mg/mL

Porc

enta

ja d

e re

ducc

ión

del D

PPH

IC50= 0.22mg/mL

Grafica 3. Curva logarítmica donde se muestra la dosis y efecto de la fracción CCAF11 en el ensayo espectrofotométrico con DPPH.

38

Curva dosis-efecto de la fracción CCAF12

y = 20.249Ln(x) + 91.242R2 = 0.9526

30

40

50

60

70

80

90

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

Concentración en mg/mL

Porc

enta

je d

e re

ducc

ión

del D

PPH

IC50= 0.13mg/mL

Grafica 4. Curva logarítmica donde se muestra la dosis y efecto de la fracción CCAF12 en el ensayo espectrofotométrico con DPPH.

39

Dosis-efecto de la fracción CCAF13

y = 19.062Ln(x) + 121.63R2 = 0.9902

30

40

50

60

70

80

90

0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14

Concentración en mg/mL

Porc

enta

je d

e re

ducc

ión

del D

PPH

IC50= 0.023mg/mL

Grafica 5. Se muestra la dosis y el efecto de la fracción CCAF13 en el ensayo espectrofotométrico con DPPH.

40

Tabla II. Valores de concentración inhibitoria media (IC50 ) requerida para reducir 50% el radical

DPPH.

Fracción IC50 (mg/mL)

Phloroglucinol 0.012

CCA10 0.20

CCA11 0.22

CCA12 0.13

CCA13 0.023

8. Discusión

Al igual que el presente estudio, en algunos otros análisis del género Padina no se han

encontrado resultados de actividad antimicrobiana contra cepas Gram-negativas, tal es el caso

de los estudios realizados por Jin-Wen y colaboradores (1984) donde Padina crassa no generó

ningún efecto positivo contra E. coli y Vibrio sp. u otros microorganismos; por igual, Ballesteros

y colaboradores (1992) tampoco encontraron en Padina pavonica actividad antimicrobiana

solamente antimitótica con una inhibición del 25% en pruebas de crecimiento de células

leucémicas y actividad citotóxica contra células de riñón de mono teniendo una zona de

inhibición 1 mm.

Sin embargo, Kumar y colaboradores (2009) reportan actividad de Padina

tetrastomatica contra el organismo Gram-negativo Proteus vulgaris con halos de inhibición de

11 mm. Tuney y colaboradores (2006) así como Chiheb y colaboradores (2009) reportan mayor

susceptibilidad de los extractos algales contra bacterias Gam-positivas principalmente S.

aureus pero muestran resultados contra E. coli (halo de inhibición entre 7-10 mm y 10-16 mm

respectivamente) proveniente de extracto etanólico y metanólico de Padina pavonica; esto

sugiere que el género Padina también puede presentar actividad antimicrobiana contra

microorganismos gram-negativos.

De Lara-Isassi y colaboradores (1989, 1999) publican la acción antimicrobiana de

Padina crispata, Padina divoillaci contra S. aureus y Padina boerguesenii contra S. pyogenes

pero no es posible establecer el rendimiento ya que estos autores no revelan el contenido total

de extracto obtenido, no obstante, sus análisis indican al menos la presencia de componentes

con actividad antimicrobiana en estas especies.

41

Asimismo, González del Val y colaboradores (2001) probaron un extracto metanólico

de Padina pavonica teniendo actividad contra Bacillus subtilis (halo mayor a 15 mm) y

Kandhasamy y Arunachalam (2008) reportan a Padina tetrastomatica contra Gram-positivas.

De las 15 fracciones de Padina mexicana analizadas en el presente estudio, se puede

determinar que existe una alta potencialidad contra bacterias Gram-positivas como S. aureus

(ATCC BAA-42) y S. pyogenes (ATCC BAA-946), esto constata con estudios mencionados

anteriormente y los realizados por Durand (2001), Magallanes y colaboradores (2003) quienes

establecen que los extractos etanólicos presentan más capacidad inhibitoria en Gram positivas

debido a su carácter lipofílico; inclusive Magallanes y colaboradores (2003) dicen que S. aureus

es el microorganismo con mayor susceptibilidad a extractos y exudados algales.

La actividad mayoritaria se observó en las fracciones CCAFU1-2, CCAF3, CCAF4,

CCAF5 contra las bacterias Gram-positivas S. aureus (ATCC BAA-42) y S. pyogenes (ATCC

BAA-946) y las fracciones CCAFU6-7, CCAF9 y CCAF15 mostraron actividad contra una sola

cepa en cada caso (Tabla I). Las fracciones CCAF8 y CCAF10 mostraron actividad

antimicrobiana similar a pesar que visiblemente su naturaleza difiere. La distinta actividad

antimicrobiana observada sobre Gram-positivas y Gram-negativas puede deberse a las

diferencias estructurales de la pared celular puesto que estas últimas son más complejas y los

extractos no logran penetrarlas fácilmente o es posible que las concentraciones de los

principios activos no sean altos u estén siendo opacados por compuestos antagonistas (De

Lara-Isassi, 1999; Durand, 2001; Zubia et al., 2008; Kumar et al., 2009).

Así mismo, los resultados encontrados en las fracciones de Padina mexicana no sólo

pueden diferir por tales razones, si no que también los cambios estaciónales y geográficos

(ecología del sitio), la variabilidad morfológica de cada especie en análisis (madurez sexual y

ciclo de vida) y el método utilizado para obtener el extracto algal (polaridad de disolventes

utilizados) son factores que influyen en la potencialidad de los compuestos (Jin-Wen et al.,

1984; Moreau et al., 1984 y 1988; Ballesteros et al., 1992; De Lara-Isassi et al., 1999; Tuney et

al., 2006; Kandhasamy y Arunachalam, 2008; Chiheb et al., 2009).

Cabe señalar que la posible presencia de phlorotaninos en las fracciones CCA11,

CCA12 y CCA13 pudiere ser causa de tales efectos positivos en las pruebas antimicrobianas,

ya que según Nagayama y colaboradores (2002) establecen que la actividad bactericida de los

phlorotaninos tiende a incrementar con la polimerización del phloroglucinol y la actividad

antimicrobiana de los polifenoles puede ser resultado de la interacción de estos con las

enzimas y proteínas de las bacterias.

Como se puede ver en la gráfica 1 el stock de phloroglucinol mostró IC50 = 0.012

mg/mL lo cual es comparable con el valor de la fracción CCAF13 la cual mostró un IC50 = 0.023

42

mg/mL (gráfica 5, tabla II). Por su parte, las fracciones CCAF10 y CCAF11 mostraron un IC50 =

0.20 mg/mL y 0.22 mg/mL respectivamente mostrando semejanza entre si, pero al ser mayores

al stock de phloroglucinol resultan menos activas (gráficas 2 y 3, Tabla II); en la gráfica 4 se

observa como la fracción CCAF12 mostró un valor IC50 = 0.13 mg/mL.

En cuanto a los resultados mencionados anteriormente y los reportados por

Amornlerdpison y colaboradores (2007) con el extracto de Padina minor, existe discordancia

puesto que dichos autores presentan en los ensayos contra el radical libre DPPH un IC50 = 6.92

± 0.16 mg/mL (expresado en mg equivalentes de ácido gálico) y los valores del presente

estudio son mucho menores. De igual manera, Zubia y colaboradores (2007) determinan en

Padina gymnospora la captación del radical DPPH a un IC50 = 3.45 mg/mL lo cual también

difiere con los ensayos espectrofotométricos. En la tabla II se evidencia que las fracciones del

extracto de Padina mexicana muestran mayor actividad que las especies anteriores pues se

requiere de una menor cantidad de estas para inhibir el radical libre estable 2,2-difenil-1-

picrilhidracilo.

No obstante, Zubia y colaboradores (2007) también reportan contra el radical DPPH un

IC50 = 0.32 ± 0.01 mg/mL y un contenido de fenoles de 29.18 ± 0.32 (en peso seco) en el alga

parda Lobophora variegata perteneciente a la misma familia de Padina mexicana; en sus

análisis, el valor de IC50 de L. variegata es comparado con los antioxidantes comerciales

sometidos al ensayo con DPPH, tales como α-tocopherol (0.31 ± 0.03 mg/mL), BHT (0.16± 0.01

mg/mL), ácido ascórbico (0.09 ± 0.02 mg/mL) y BHA (0.06 ± 0.02 mg/mL). Se puede inferir con

lo anterior, que los valores de las fracciones CCAF10, CCAF11 y CCAF12 (tabla II) son

significativamente concordantes con los del alga L. variegata y los antioxidantes comerciales,

por tanto son igualmente activas contra el radical DPPH y es posible que contengan

compuestos de origen fenólico.

La diferenciación entre los resultados en los análisis de otros autores y el presente

estudio tal vez se deba a que la polaridad de los disolventes con que se obtuvieron los

extractos en cada caso hace que incremente o descienda su efectividad y también el hecho de

que el stock utilizado en cada análisis es diferente (De Lara-Isassi et al., 1999; Matanjun et al.,

2008).

La prueba bioautográfica (figura 19) muestra el comportamiento de las fracciones en la

placa cromatográfica y es notable la coloración amarilla intensa de CCAF10, CCAF11, CCAF12

y CCAF13 las cuales reaccionaron inmediatamente después del rocío con DPPH; sin embargo

las fracciones CCAFU1-2, CCAF3, CCAF4, CCAF5, CCAFU6-7 y CCAF9 denotan ligera

coloración amarilla en este ensayo pero no mostraron actividad en los análisis

espectrofotométricos. Por su parte, la facción CCAF8 no mostró actividad en ninguno de los

43

dos análisis. El hecho de que no hayan mostrado actividad puede deberse a la propia

pigmentación de las fracciones (en cuanto a la absorbancia) o a la presencia de un número alto

de compuestos fenólicos en la fracción inicial (ESL1F2) con estructuras químicas muy

parecidas lo que provoca que en varias fracciones aparezcan los mismos metabolitos en

diferente cantidad (Novoa et al., 2001; Chandrasekar et al., 2005).

Otro aspecto que es importante mencionar, es el sinergismo que puede existir entre los

diferentes compuestos presentes en las fracciones; según Le Tutour y colaboradores (1998) los

compuestos identificados con efecto sinérgico en sus pruebas antioxidantes y pro-oxidantes

más potentes son los pigmentos no polares, especialmente la clorofila a y compuestos

liposolubles relacionados. De igual manera Zhang y colaboradores (2007) menciona que no

solamente compuestos de origen fenólico pueden estar presentes en este tipo de análisis

puesto que es posible la presencia de otros componentes como ácido ascórbico, carotenoides

y tocoferol. Por lo tanto, las fracciones obtenidas del extracto etanólico de Padina mexicana

sometidas al presente análisis no se encontraban puras por lo que se pudiere pensar que

existen otras moléculas en sinergismo con los phlorotaninos siendo causantes de los efectos

positivos.

9. Conclusiones.

• El compuesto parcialmente puro obtenido de CCAF8 derivó del fraccionamiento por

cromatografía en columna. La elección de esta fracción para su procesamiento se basó

en la actividad antimicrobiana observada, la cantidad de la fracción de 330.6 mg y su

fácil solubilidad. Es necesario dar seguimiento a su análisis.

• La fracción CCAF13 presentó potencialidad para reducir radicales libres semejante al

phloroglucinol en los análisis espectrofotométricos.

• Las fracciones CCAF10, CCAF11 y CCAF12 mostraron actividad antioxidante en

menor potencialidad en comparación con el phloroglucinol.

• La presencia de compuestos de origen fenólico en las fracciones de Padina mexicana

probadas contra las cepas pudieron causar efecto bactericida y la actividad

antioxidante contra el radical DPPH. Se puede asumir que la fracción CCAF13 pudiere

contener metabolitos de origen fenólico ya que al observar a la par los análisis de

actividad antimicrobiana (tabla I) bioautográficos (figura 19) y espectrofotométricos

(gráfica 5, tabla II) la fracción CCAF13 muestra un comportamiento semejante al

phloroglucinol e inhibe a S. aureus (ATCC BAA-42) y S. pyogenes (ATCC BAA-946)

(tabla I).

44

• Todas las fracciones derivadas de Padina mexicana presentaron actividad

antimicrobiana al menos contra un microorganismo Gram-positivo principalmente

contra S. pyogenes (ATCC BAA-946), siendo mayor la actividad en CCAFU1-2,

CCAF3, CCAF4 y CCAF5 en comparación con CCAFU6-7, CCAF8, CCAF9, CCAF10,

CCAF11, CCAF12, CCAF13, CCAF14 y CCAF15.

• Es necesario realizar el análisis cuantitativo del contenido fenólico en las fracciones.

45

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