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UNITA’ DI RICERCA DI TRIESTE Direttore Scientifico: Prof. Ennio Zangrando

Complessi fotolabili half sandwich di Ru(II) per la sintesi di ‘caged compounds’

Ilaria Finazzi,a Ioannis Bratsos,a Teresa Gianferrara,a Alberta Bergamo,b Enzo Alessioa a Dipartimento di Scienze Chimiche e Farmaceutiche, Università di Trieste b Fondazione Callerio Onlus, Trieste Sono stati preparati e caratterizzati sei complessi half sandwich di Ru(II) di formula generale [Ru([9]aneS3)(chel)(L)][PF6]n (2 – 7, chel = 2,2'-bipiridina (bpy), 1,2-diaminoetano (en), (±)-trans-1,2-diaminocicloesane (dach), ione picolinato (pic); L = piridina (py), 3-acetilpiridina (3-acpy), imidazolo (im); n = 1 or 2, dipendentemente dalla carica del chelante. Se irradiati con luce blu avente lunghezza d’onda λ = 400 – 490 nm in soluzione acquosa, essi facilmente rilasciano il legante monodentato L e generano selettivamente la specie acquata.

L’entità e la velocità del rilascio fotoindotto del legante dipende principalmente dalla natura del legante chelante (bpy >> en ≈ dach > pic) e in percentuale minore sul legante uscente(py > im > 3-acpy). Quattro particolari composti fotolabili (2 – 5) non hanno mostrato alcuna significativa attività antiproliferativa nei riguardi della linea cellulare del carcinoma mammario MDA-MB-231 sia al buio che dopo irradiazione con luce blu. Il chiaro processo di foto-dissociazione che caratterizza questa classe di composti half sandwich di Ru(II) e la sostanziale mancanza di tossicità dell’acquo complesso fotoprodotto, suggerisce che essi possono essere adatti per la preparazione di composti ‘caged’ di rutenio(II) Nell’ambito di questo lavoro sono stati isolate due complessi dinucleari e precisamente [{Ru([9]aneS3)(en)}2(µ-en)][CF3SO3]4 (9) e [{Ru([9]aneS3)}2(µ-dach)(µ-CH3O)2][CF3SO3]2· 2CH3OH (10), entrambi contenenti rari esempi di sistemi in cui l’etilendiammna e il dach fungono da leganti a ponte.

Nuovi complessi carbonili cationici e neutri di Ru(II)- e Os(II)-dmso Ioannis Bratsos, Simone Calmo, Ennio Zangrando, Gabriele Balducci, Enzo Alessio Dipartimento di Scienze Chimiche e Farmaceutiche, Università di Trieste Sono stati sintetizzati e caratterizzati tre nuovi complessi cationici monocarbonile Ru(II)-dmso e quattro specie mono- e dicarbonil Os(II)-dmso. I due derivati monocarbonili fac-[Ru(CO)(dmso-O)3(dmso-S)2][PF6]2 (11) and cis,cis,cis-[RuCl(CO)(dmso-O)2(dmso-S)2][PF6] (12) sono stati ottenuti dal precursore neutro cis,trans,cis-[RuCl2(CO)(dmso-O)(dmso-S)2] (3) per successiva sostituzione dei leganti cloruro con dmso, che si lega in ciascun caso con l’ossigeno. Il complesso dicarbonile cis,cis,trans-[Ru(CO)2(dmso-O)2(dmso-S)Cl][PF6] (13) è stato invece preparato per trattamento del precursore tricabonilico fac-[RuCl2(CO)3(dmso-O)] (8) con AgPF6 in

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presenza di dmso: la sostituzione di un cloruro con un dmso-O implica la sostizione di un legante carbonile con un altro dmso (coordinato via zolfo trans al Cl). I complessi carbonilici Os(II) trans,trans,trans-[OsCl2(CO)(dmso-O)(dmso-S)2] (17), trans,cis,cis-[OsCl2(CO)2(dmso-O)2] (18), cis,mer-[OsCl2(CO)(dmso-S)3] (19), e cis,trans,cis-[OsCl2(CO)(dmso-O)(dmso-S)2] (20) sono stati ottenuti trattando il precursore Os(II)-dmso trans-[OsCl2(dmso-S)4] (14) e cis,fac-[OsCl2(dmso-O)(dmso-S)3] (15) con CO. Ciascuno di questi complessi di osmio è strutturalmente simile ai già noti corrispondenti complessi di Ru, anche se in accordo con la grande inerzia dell’osmio sono richieste più drastiche condizioni per la loro preparazione. E’ interessante far notare che il complesso 20 non è stato isolato come composto puro, ma solo nella forma di una miscela co-cristallizzata 1:1 con il suo precursore 15. Il legante dmso risulta essere sempre legato attraverso l’atomo di ossigeno quando è posizionato in trans al CO. Siamo fiduciosi che i nuovi complessi carbonilici di Ru(II)- e Os(II)-dmso qui descritti possano rappresentare delle specie utili per ampliare la libreria di complessi contenenti leganti dmso facilmente sostituibili da essere usati come precursori nella sintesi inorganica.

Studi strutturali di recettori artificiali per amminoacidi Giovanna Brancatelli, Silvano Geremia Dipartimento di Scienze Chimiche e Farmaceutiche, Università di Trieste I processi coinvolti nel riconoscimento molecolare altamente specifico tra le molecole di interesse biologico rappresentano un campo di indagine sempre più vasto. La conoscenza della struttura cristallina e gli studi sul riconoscimento della superficie proteica possono fornire indizi su come le proteine interagiscono fra loro. In questo contesto lo studio di recettori artificiali impiegati come strumenti di riconoscimento per biomacromolecole è un ambito di ricerca che sta acquisendo sempre maggiore rilevanza, grazie alle diverse ed importanti applicazioni che tali molecole possono trovare in ambito biologico e non solo. Per le loro peculiari proprietà chimiche e strutturali, calixareni e resorcinareni, generalmente definiti cavitandi, risultano essere recettori ideali in grado di formare con la molecola target interazioni stabili e specifiche di natura non covalente, caratteristiche della chimica host-guest. Per sviluppare recettori artificiali specifici e selettivi capaci di legare molecole biologiche, come ammine biogene, amminoacidi, proteine e carboidrati, è fondamentale la conoscenza delle forze responsabili del legame con il substrato. Lo scopo del nostro studio attuale è quello di ottenere, attraverso l’analisi cristallografica, informazioni strutturali relative a complessi host-guest di un cavitando a base resorcinarenica con α-amminoacidi, utilizzati come sistemi modello della superficie proteica. Il cavitando selezionato, mostrato in Figura 1, è un recettore sintetico che mostra una cavità piuttosto rigida e pre-organizzata, funzionalizzata al bordo superiore con quattro gruppi fosfonato, i cui gruppi P=O puntano verso l’interno della cavità, per sfruttare la basicità degli atomi di ossigeno nel binding di substrati neutri e cationici. Questo cavitando, sintetizzato presso i laboratori del Prof. Dalcanale dell’Università di Parma, si è già rivelato un ottimo recettore per alcoli a catena alchilica e pertanto ne è già noto il modo di binding di tali guest.

Figura 1. Struttura molecolare del cavitando resorcinarenico Tiiii[H,CH3,CH3], 1.

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Per affrontare lo studio delle proprietà di complessazione del cavitando nei confronti di amminoacidi allo stato solido, sono stati allestiti esperimenti sistematici di co-cristallizzazione del resorcinarene in presenza di 15 differenti amminoacidi, attraverso il metodo della diffusione in fase vapore (sitting drop). Come procedura generale, ad una soluzione di cavitando in trifluoroetanolo (TFE), è stato aggiunta una soluzione di amminoacido in modo da ottenere un rapporto molare cavitando:amminoacido di 1:4. Le soluzioni di amminoacidi sono state preparate usando diversi solventi, in base alla loro solubilità: sebbene la maggior parte sia solubile in TFE o in miscela H2O/TFE 1:1, i più idrofobici leucina ed isoleucina e l’aromatico tirosina sono stati solubilizzati in una soluzione di HCl 1M. nella soluzione di reservoir, è stato usato come agente precipitante il PEG 300 nell’intervallo 25-50% v/v. In seguito i cristalli sono stati lasciati crescere alla temperatura di 20°C. Dopo un mese sono stati ottenuti cristalli di qualità adatta all’analisi di diffrazione a raggi X con i 10 amminoacidi elencati di seguito: Ala, Val, Leu, Ile, Tyr, N-Me-Ala, Pro, cis-4-Hyp, Thr, Cys. La raccolta dei dati di diffrazione è stata effettuata utilizzando tecniche di crio-congelamento presso la linea di diffrazione XRD1 del sincrotrone Elettra (Trieste, Italia). Le strutture sono state risolte tramite metodi diretti ed affinate. Di seguito vengono riportati i risultati preliminari dell’indagine strutturale.

Figura 2. Strutture dei complessi host-guest 1•Ala, 1•Val, 1•Leu, 1•Ile. Tutti i quattro complessi con amminoacidi idrofobici presentano lo stesso schema di interazioni non covalenti: due legami idrogeno si instaurano fra il gruppo NH3

+ e due unità P=O adiacenti ed un terzo legame a idrogeno si forma fra il gruppo ammonio ed una molecola di acqua trattenuta all’interno della cavità del recettore (Figura 2). Un differente modo di binding si osserva per il complesso con la tirosina in forma di idrocloruro: il guest amminoacidico è capace di interagire con il cavitando attraverso legami idrogeno che coinvolgono l’intera funzionalità peptidica, ed inoltre si instaura un debole contatto esterno del tipo lone pair···π tra l’ossigeno di una unità P=O ed il piano aromatico della tirosina che giace al di fuori della cavità (Figura 3).

Figura 3. Struttura del complesso host-guest 1•Tyr. Figura 4. Complesso host-guest 1•N-Me-Ala. Il complesso contenente l’amminoacido N-metilamminoalanina, recentemente proposto come biomarker del tumore al pancreas, mostra che in questo caso il guest si inserisce all’interno della cavità attraverso il gruppo metilico, formando un complesso di inclusione (Figura 4). Il binding dell’amminoacido è permesso dai due legami a idrogeno che coinvolgono il frammento NH2 carico

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positivamente e due gruppi P=O adiacenti, e dalla simultanea presenza di interazioni dispersive CH···π fra il gruppo metilico dell’amminoacido e le pareti della cavità aromatica del recettore. Contatti simili sono responsabili della stabilizzazione del complesso di inclusione con la prolina, dove oltre ai legami idrogeno numerose interazioni CH···π coinvolgono la catena laterale alifatica dell’amminoacido. Al contrario un minor grado di inclusione del guest si osserva nel complesso con la cis-4-idrossiprolina, poiché il gruppo OH legato al Cγ dell’amminoacido forma un legame idrogeno con un’unità P=O, sollevando il guest al di sopra della cavità (Figura 5).

Figura 5. Strutture dei complessi host-guest 1•Pro e 1•Hyp. Il complesso host-guest con la treonina mostra che la catena laterale dell’amminoacido è inserita all’interno della cavità attraverso il gruppo metilico e che il gruppo OH forma legami idrogeno con un’unità P=O (Figura 6). Questa struttura è di grande interesse perché mostra che il cavitando è capace di riconoscere la treonina, un residuo chiave nelle strutture proteiche. Infatti, tale amminoacido può subire modifiche post-traduzionali, come glicosilazione e fosforilazione. In particolare la fosforilazione gioca un ruolo chiave nella regolazione di molti processi cellulari che includono il ciclo della cellula, la crescita e l’apoptosi ed i percorsi di traduzione del segnale. Diversi tipi di tumore umano coinvolgono alterazioni della cascata di fosforilazione serina/treonina. Pertanto un cavitando che interferisce con le modifiche post-traduzionali della treonina può essere sfruttato in applicazioni diagnostiche e terapeutiche.

Figura 6. Struttura del complesso host-guest 1•Thr. Figura 7. Complesso host-guest 1•Cys. L’inserimento della catena laterale avviene anche con un altro importante amminoacido, la cisteina (Figura 7): oltre ai comuni legami idrogeno che guidano il riconoscimento molecolare, interazioni SH···π e S···π si stabiliscono fra il guest ed il recettore. Si ritiene che queste forze non covalenti giochino un ruolo significativo nella stabilizzazione del folding proteico e sono riscontrate comunemente nelle strutture cristalline proteiche. L’incapsulamento dei residui di L-cisteina in un recettore sintetico può essere una soluzione per aumentare la stabilità del gruppo tiolico contro l’ossidazione ed un possibile modo per controllare il folding proteico. . L’indagine strutturale sui complessi host-guest del cavitando con gli amminoacidi, ed in particolare i risultati ottenuti con treonina e cisteina, suggeriscono la possibilità di applicare tale recettore nel riconoscimento della superficie proteica. Oltre ad una completa caratterizzazione dei complessi

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host-guest (studi in soluzione per il calcolo delle costanti di binding e dei parametri termodinamici), come studio futuro verranno intrapresi tentativi di cristallizzazione di proteine in presenza di cavitandi, per verificare che le proprietà di complessazione possano essere trasferite anche sulla superficie proteica, come recentemente dimostrato per un calixarene capace di riconoscere i residui di lisina esposti sulla superficie del citocromo C.