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CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y DE ESTUDIOS AVANZADOS DEL
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD IRAPUATO
“Formación de biopelículas por cianobacterias: el papel de la comunicación microbiana”
Tesis que presenta
Juan Vázquez-Martínez
Para Obtener el Grado de
Doctor en Ciencias
En la Especialidad de
Biotecnología de Plantas
Director de la Tesis: Dr. Jorge Molina-Torres
Irapuato, Guanajuato, México Noviembre de 2017
0
Este trabajo se realizó en el Laboratorio de Fitobioquímica en las instalaciones del
CINVESTAV Unidad Irapuato, bajo la dirección del Dr. Jorge Molina Torres. El trabajo se
llevó a cabo de septiembre de 2012 a septiembre de 2017. Los miembros del comité tutorial
fueron el Dr. Luis Eugenio González de la Vara, la Dra. Nayelli Marsch Martínez, la Dra.
Laila Pamela Partida Martínez, el Dr. Roberto de Philippis, la Dra. Patricia Ríos Chávez y
el Dr. Robert Winkler. El examen de grado se realizó el día 21 de noviembre del 2017.
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I. AGRADECIMIENTOS
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) por la beca recibida que me
permitió enfocarme a la realización de este trabajo. Al Centro de Investigación y de Estudios
Avanzados del IPN por brindar las instalaciones y ambiente laboral necesario para la
realización del trabajo.
A las personas que integraron el Laboratorio de Fitobioquímica durante el periodo en que se
realizó este trabajo.
Al Dr. Jorge Molina Torres por el apoyo recibido durante la realización del posgrado y por
brindarme la oportunidad de aprender de su experiencia. Al comité, integrado por el Dr. Luis
González de la Vara, la Dra. Nayelli Marsch Martínez, la Dra. Laila Pamela Partida Martínez,
el Dr. Roberto de Philippis, la Dra. Patricia Ríos Chávez y el Dr. Robert Winkler, por la
orientación y apoyo recibidos durante cada etapa del trabajo de investigación.
Además, quiero agradecer a las personas que contribuyeron a la realización de alguna parte
del trabajo aquí presentado, particularmente a: MC Enrique Ramírez Chávez (CINVESTAV-
IPN) por el entrenamiento y la orientación en las técnicas empleadas. Al Dr. Juan Manuel
Gutierrez Villagomez (University of Ottawa) por su apoyo en el aislamiento de los
microorganismos y en los análisis estadísticos. Al Dr. Jeffrey Johansen (John Carroll
University) por su apoyo en la caracterización de Nodosilinea chupicuarensis. A la Dra.
Mercedes G. López Pérez (CINVESTAV-IPN) por el apoyo que me permitió finalizar esta
etapa. Al Biol. Arnulfo Negrete Frías (ITESI), la Dra. Lourdes Mondragón (Instituto
Tecnológico de Morelia), al Dr. José Luis Godínez (UNAM), la MC Abigail Pedraza
(CIVESTAV-IPN), la IB Paulina Bravo (ITESI), la Q. Nélida Vázquez (CINVESTAV-IPN),
la MC Rosalinda (CINVESTAV-IPN), el IB Luis Ernesto (CINVESTAV-IPN), la MC María
de Jesús Alvarado (CINVESTAV-IPN) por sus contribuciones técnicas a mi trabajo. Al Sr.
Antonio Cisneros. A Dora Anguiano, Diana Barbosa, Eduardo Mejía, Juan Pablo Jaime,
Baltazar Gutiérrez y Sarita Raya, secretarios del CINVESTAV-IPN.
También quiero agradecer a quienes con su apoyo me permitieron continuar, aún en los
momentos difíciles, en especial a mis hermanos Arturo y Sandra, a mis papás Juan y Sandra
y a mi abuelita Consuelo. A mis amigos de siempre y de ahora, Adriana, Cynthia, Addy,
Canchola, Dany, Charly, Pau, Génesis, Abby, John, Tona, Yilan, Janett, Paty, Hugo, Horacio,
Chayito, Ury Omar, Rafa, Fili, Colli y Juan Manuel. A Susy, María, Marthita, Aliz, Juan
Carlos y Kike que me brindaron el calor de una familia siempre. Y a todas las personas que
no he mencionado, de manera no intencional, pero que de una forma u otra contribuyeron
con la realización de este proyecto no sólo de investigación sino también de vida.
ii
II. DEDICATORIA
A mi Familia, el motor de todo lo que hago.
iii
III. ÍNDICE GENERAL
1. RESUMEN ................................................................................................................................. 1
2. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................... 4
3. ANTECEDENTES Y FUNDAMENTACIÓN TEÓRICA..................................................... 6
3.1. ¿Qué es una biopelícula? .................................................................................................. 6
3.2. Importancia de las SABs ................................................................................................... 8
3.3. Desarrollo de biopelículas ................................................................................................. 9
3.3.1. Desarrollo de SABs .................................................................................................. 11
3.4. La importancia de las EPS en el desarrollo de las SABs ............................................. 13
3.5. Comunicación microbiana .............................................................................................. 16
3.5.1. Sistema de quorum sensing ..................................................................................... 16
3.5.2. Quorum sensing en bacterias Gram negativas ...................................................... 17
3.5.3. Quorum sensing en bacterias Gram positivas ....................................................... 19
3.5.4. Sistema de quorum sensing bacteriano universal ................................................. 22
3.5.5. Quorum sensing en otros grupos microbianos ...................................................... 23
3.5.6. Quorum quenching .................................................................................................. 25
3.5.7. ¿Existe comunicación microbiana en las cianobacterias de biopelículas
subaéreas? ................................................................................................................................ 26
4. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .............................................................................. 28
5. HIPÓTESIS ............................................................................................................................. 29
6. OBJETIVOS ............................................................................................................................ 29
a. Objetivo General ................................................................................................................. 29
b. Objetivos Específicos........................................................................................................... 29
7. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................................... 30
7.1. Material biológico ........................................................................................................ 30
7.2. Solventes y reactivos .................................................................................................... 30
7.3. Microscopía ...................................................................................................................... 31
7.4. Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas con ionización por
impacto de electrones (GC/EIMS) ............................................................................................. 31
7.5. Cromatografía de capa fina (TLC) ................................................................................ 32
7.6. Software ........................................................................................................................... 32
7.7. Obtención de cultivos axénicos de cianobacterias formadoras de SABs .................... 33
iv
7.7.1. Muestreo ................................................................................................................... 33
7.7.2. Sitios de colecta ........................................................................................................ 33
7.7.3. Aislamiento, purificación y selección de microorganismos ................................. 36
7.7.4. Identificación y caracterización de los microorganismos .................................... 36
7.7.5. Evaluación del pH óptimo de crecimiento ............................................................ 40
7.7.6. Herborización de especímenes ............................................................................... 40
7.8. Evaluación de la síntesis de autoinductores tipo quorum sensing ............................... 40
7.8.1. Condiciones de cultivo y cinética de crecimiento.................................................. 40
7.8.2. Síntesis enzimática de AHLs .................................................................................. 42
7.8.3. Extracción de señales tipo QS................................................................................. 43
7.8.4. Análisis de señales químicas mediante GC/EIMS ................................................ 43
7.8.5. Ensayo de la actividad QS con biorreporteros ..................................................... 44
7.8.6. Búsqueda in silico de los genes de sintasas y receptores de señales quorum
sensing en el genomas de cianobacterias ............................................................................... 45
7.9. Evaluación de la síntesis y composición de EPS en relación a la densidad celular y la
síntesis de autoinductores ........................................................................................................... 45
7.9.1. Análisis microscópico del desarrollo de la biopelícula ......................................... 45
7.9.2. Extracción de sustancias poliméricas extracelulares solubles (SEPS) ................ 46
7.9.3. Extracción de las sustancias poliméricas extracelulares de la cubierta celular
(CEPS) ………………………………………………………………………………………………………………………………47
7.9.4. Hidrólisis ácida de las EPS ..................................................................................... 47
7.9.5. Derivatización de los monosacáridos obtenidos por hidrólisis de las EPS ......... 48
7.9.6. Análisis de la composición de monosacáridos de las EPS mediante GC/EIMS . 48
7.10. Determinación del efecto de inductores e inhibidores del QS en la producción de
EPS ………………………………………………………………………………………………………………………………….49
7.10.1. Determinación de la actividad quorum quenching de la piperina ....................... 49
7.10.2. Ensayos de comunicación química ......................................................................... 49
7.11. Análisis estadístico ....................................................................................................... 50
8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................................. 51
8.1. Condiciones ambientales y sustrato ............................................................................... 51
8.2. Muestreo de Biopelículas ................................................................................................ 51
8.2.1. Muestreo en Cañada de la Virgen.......................................................................... 52
8.2.2. Muestreo en el Museo Regional de la Alhóndiga .................................................. 52
8.3. Aislamiento de microorganismos ................................................................................... 53
v
8.3.1. Cañada de la Virgen ................................................................................................ 53
8.3.2. Museo Regional de la Alhóndiga ............................................................................ 54
8.4. Selección de microorganismos ........................................................................................ 54
8.5. Purificación, caracterización e identificación de la cepa seleccionada ....................... 56
8.5.1. Purificación .............................................................................................................. 56
8.5.2. Identificación y caracterización de la cepa selecionada ....................................... 57
8.6. Cíneticas de crecimiento ................................................................................................. 67
8.7. Análisis in silico de la presencia de sistemas de quorum sensing en cianobacterias .. 68
8.8. Evaluación de la síntesis de señales químicas tipo quorum sensing ............................ 69
8.8.1. Síntesis enzimática de AHLs .................................................................................. 69
8.8.2. Detección de señales químicas de quorum sensing................................................ 69
8.9. Estudio microscópico de las biopelículas....................................................................... 71
8.10. Producción de sustancias poliméricas extracelulares .............................................. 72
8.10.1. Cinéticas de producción de polímeros extracelulares solubles ............................ 72
8.10.2. Cinética de producción de polímeros extracelulares capsulares. ........................ 74
8.10.3. Composición de las sustancias poliméricas extracelulares .................................. 76
8.11. Ensayos de comunicación química ............................................................................. 79
8.11.1. Actividad quorum quenching de la piperina ......................................................... 79
8.11.2. Efecto de inductores e inhibidores del quorum sensing sobre N. chupicuarensis
………………………………………………………………………………………………………………………………80
9. CONCLUSIONES ................................................................................................................... 82
10. TEMAS POR ABORDAR EN FUTURAS INVESTIGACIONES ................................. 83
11. APÉNDICES ........................................................................................................................ 84
12. REFERENCIAS .................................................................................................................. 98
1
1. RESUMEN
En la naturaleza, algunos microorganismos se desarrollan en forma de agregados celulares
embebidos en una matriz de sustancias poliméricas extracelulares EPS, los cuales se conocen
como biopelículas. Las biopelículas brindan a los microorganismos ventajas adaptativas en
su entorno, como la resistencia a la desecación y a los cambios de temperatura. Dentro de los
tipos de biopelículas que han sido descritas se encuentran las biopelículas subaéreas SABs,
que se desarrollan en la interfaz de una superficie sólida y la atmósfera, están compuestas por
microorganismos autótrofos y heterótrofos. Estas biopelículas han sido estudiadas por su
impacto en el deterioro de monumentos de roca y obras de ingeniería. Entre los
microorganismos de SABs, las cianobacterias actúan como pioneras en la formación las
biopelículas y contribuyen con la mayor parte del aporte de carbono y nitrógeno al sistema.
La importancia ecológica de las SABs radica en que representan la principal fuente de
carbono y nitrógeno orgánico en sistemas sin plantas. Además, las SABs se han estudiado
recientemente debido al impacto que tienen en el biodeterioro de monumentos de roca. Se
sabe que el desarrollo exitoso de una SAB depende de la síntesis de EPS por las
cianobacterias que se desarrolla en ella. Sin embargo, se desconocen los mecanismos por los
cuales estos microorganismos se coordinan para sintetizar las EPS. En las bacterias
heterótrofas la formación de biopelículas se regula por un mecanismo de comunicación
microbiana, sin embargo en las cianobacterias no se ha comprobado si ocurre algo similar.
El objetivo de este trabajo fue evaluar la síntesis de EPS en cianobacterias formadoras de
SABs, aisladas de monumentos de roca, con relación a un sistema de comunicación tipo
quorum sensing o percepción del quórum (QS), mediante el uso de técnicas microbiológicas
y de análisis instrumental, principalmente cromatografía de gases acoplada a espectrometría
de masas con ionización por impacto electrónico (GC/EIMS). En este trabajo se aisló,
caracterizó y determinó una cepa del género Nodosilinea, descrita aquí como una nueva
especie: Nodosilinea chupicuarensis. Se determinó la cinética de producción de biomasa y
de polímeros extracelulares para N. chupicuarensis, además se monitoreó la composición de
los polímeros extracelulares solubles y de los de la cubierta celular durante las fases de
desarrollo de esta cepa. Se observó que, durante el desarrollo de N. chupicuarensis en medio
BG-11, las EPS varían en contenido respecto a la biomasa pero no en composición. Se obtuvo
un resultado negativo en la búsqueda de señales químicas tipo quorum sensing relacionadas
2
con la producción de las EPS. Sin embargo, se demostró que en N. chupicuarensis la
producción de polímeros de la cubierta celular se induce por acil homoserina lactonas (AHLs)
exógenas, en particular a las AHLs C8 y C10. Pero sin afectar la producción de biomasa ni
el contenido de polímeros solubles. A partir de los resultados obtenidos se concluyó que las
biopelículas de monumentos son fuente de microorganismos aún no descritos y poco
estudiados. Además, se puede concluir que algunas cianobacterias, específicamente N.
chupicuarensis, poseen sistemas de respuesta a señales tipo AHL que inducen la producción
de polímeros extracelulares, lo cual se relaciona a la formación de biopelículas.
ABSTRACT
In nature, some microorganisms develop as cell aggregates embedded in a matrix of
extracellular polymeric substances (EPS), these aggregates are known as biofilms. A biofilm
provides adaptive benefits to microorganisms in their environment, such as resistance to
desiccation. Subaerial biofilms (SABs) are a type of biofilm that develop in the interface
solid surface-atmosphere and are composed by microorganisms of the 3 trophic levels. This
biofilms have been studied due to its impact on biodeterioration of stone monuments. Among
the SABs microorganisms, cyanobacteria act as pioneers in the formation of these biofilms
and are responsible of most of the carbon input to the system. SABs have an important
ecological role since they represent the main source of organic carbon and nitrogen in
systems without plants. In addition, SABs have been studied recently because of their impact
on the biodeterioration of rock monuments. Successful development of a SAB depends on
EPS synthesis by cyanobacteria. However, the mechanisms by which these microorganisms
are coordinated to synthesize the EPS are still unknown. It is hypothesized that EPS synthesis
by cyanobacteria is regulated by a microbial communication system, as occurs in the biofilm
formation by heterotrophic bacteria. The objective of this work was to assess the synthesis
of EPS by a cyanobacterial strain with the capacity to develop SABs, concerning to a quorum
sensing type communication system. This objective was reached using microbiological
techniques and instrumental analysis, mainly gas chromatography coupled to electron impact
mass spectrometry (GC/EIMS). In this study, a cyanobacterial strain was isolated,
characterized and determined as a new species of the Nodosilinea genus herein named
Nodosilinea chupicuarensis. The biomass and EPS kinetics were determined for N.
3
chupicuarensis, also the composition of the soluble and the cell envelope EPS was
determined during the development stages of this strain. It was noted that, during the
development of N. chupicuarensis in BG-11 medium, the EPS vary in content (relative to
biomass) but not in composition. In the search for quorum sensing type signals, related with
the EPS production, a negative result was obtained. However, it was demonstrated that N.
chupicuarensis responds to exogenous acyl homoserine lactones (AHLs), in particular to the
C8 and C10 AHLs. The effect of this response was verified as the increase of the cell
envelope polymer content, but without affecting biomass production or the soluble polymers
content. Based on these results, it was concluded that biofilms of monuments are a source of
microorganisms not described to date and poorly characterized. In addition, it can be
concluded that cyanobacteria, and specifically N. chupicuarensis, have systems of response
to AHL type signals that regulate the production of cell cover polymers -which are related to
the biofilm formation- during its development.
4
2. INTRODUCCIÓN
Durante más de 150 años se ha estudiado a los microorganismos bajo el paradigma del cultivo
puro en condiciones in vitro, considerándolos como entidades celulares individuales
autosuficientes pertenecientes a una misma cepa. Este método de estudio ha permitido
grandes avances en áreas como la medicina, la microbiología y la farmacología, entre otras.
Bajo este enfoque se logró el aislamiento e identificación de los patógenos que provocan
algunas enfermedades que durante cientos de años mermaron las poblaciones humanas,
además esto permitió el desarrollo de las vacunas y los medicamentos que hoy funcionan
para combatirlos (Costerton y Cheng 1987; Davey y O’toole 2000). No obstante, se ha
demostrado que in vivo e in situ los microorganismos se desarrollan en forma de comunidades
complejas y organizadas, coordinándose para poder realizar actividades como la
diferenciación celular o adaptaciones poblacionales al entorno. Esta forma de desarrollo
permite interacciones que rara vez pueden observarse en cultivos axénicos (Griffiths et al.
2001; Järvensivu et al. 2004). Los fenómenos de resistencia a antibióticos de algunos
patógenos in vivo se deben precisamente a la interacción que ocurre entre bacterias, y entre
bacterias y las células del huésped (Lorian et al. 1985; Anderl, Franklin y Stewart 2000).
Se ha observado que en el entorno natural los microorganismos crecen adheridos a
superficies, contrariamente al crecimiento en forma de células suspendidas que generalmente
se da en las condiciones de laboratorio (Hall-Stoodley, Costerton y Stoodley 2004; Flemming
y Wingender 2010). Naturalmente, las células microbianas se agregan mediante una matriz
de sustancias poliméricas extracelulares (EPS) que sirve como material de anclaje así como
un medio en el que fluyen y se concentran las secreciones celulares y los nutrientes (Costerton
y Cheng 1987). Esta forma de desarrollo da a los microorganismos ventajas en su entorno,
las cuales les permiten resistir condiciones ambientales desfavorables como cambios
drásticos de temperatura o humedad (Davey y O’toole 2000; Hall-Stoodley, Costerton y
Stoodley 2004).
Del análisis de estas observaciones se ha evidenciado la importancia de estudiar los
fenómenos de interacción y coordinación microbiana presentes en las condiciones
5
ambientales como: la formación de biopelículas, la producción de factores de virulencia y la
resistencia a antibióticos, entre otras.
La formación de biopelículas es un proceso celular interesante debido al impacto que tiene
en la supervivencia y adaptación de los microorganismos en condiciones ambientales
severas. Además, esta característica permite a los microorganismos agruparse y actuar
coordinadamente, de forma similar a un organismo pluricelular (Hall-Stoodley, Costerton y
Stoodley 2004). Aunque existe una gran gama de biopelículas y microorganismos
formadores de biopelículas, las principales funciones de la matriz de polímeros generalmente
son las mismas: dar soporte y crear un microambiente con condiciones relativamente estables
(Flemming y Wingender 2010).
Dentro de los tipos de biopelículas, se encuentran las biopelículas subaéreas (SABs), que se
desarrollan sobre superficies minerales, generalmente roca, en condiciones de baja humedad
y están expuestas continuamente a las fluctuaciones atmosféricas. Estas biopelículas
constituyen una fuente de microorganismos poco estudiados. Por otro lado, las SABs pueden
ser un problema ya que se adhieren sobre superficies de construcciones, de obras de arte y de
ingeniería, afectando considerablemente la apariencia y durabilidad de dichas estructuras
(Griffin, Indictor y Koestler 1991; Scheerer, Ortega-Morales y Gaylarde 2009; Polo et al.
2012).
El objetivo de este estudio es tratar de entender cómo los microorganismos que forman estas
biopelículas se coordinan para producir EPS.
6
3. ANTECEDENTES Y FUNDAMENTACIÓN TEÓRICA
3.1. ¿Qué es una biopelícula?
Lo que hoy en día se conoce como biopelícula fue descrito por primera vez en la Edad Media
por Paracelso (Krumbein et al. 2003):
“A partir del mucílago del agua crecen y nacen todas las rocas. Los guijarros y arenas están
coaguladas en forma de piedra. Es fácilmente observable como un mucílago, tarde o
temprano, se adhiere a cualquier roca depositada en un flujo de agua. Y al separar dicho
material mucilaginoso de la roca, depositándolo posteriormente dentro de una cucúrbita este
coagulará y se transformará en una roca; justo como cualquier roca creciendo en el agua de
manera natural por medio de un mecanismo de auto-coagulación y génesis después de un
largo periodo”.
Sin embargo, el concepto de “biopelícula” surgió en la década de 1930-1940. En principio
se usó el término “película” para referirse a las células bacterianas adheridas a superficies
sólidas que causan la acumulación de material biológico indeseable (biofouling) sobre
superficies de materiales sumergidos en cuerpos de agua (Henrici 1933; Zobell y Allen
1935). Tiempo después, en la década de 1970-1980 el concepto evolucionó para describir no
solamente un problema técnico ocasionado por microorganismos sino, más específicamente,
la forma de desarrollo de algunas bacterias patógenas (Mack, Mack y Ackerson 1975;
Costerton, Geesey y Cheng 1978). Pero fue hasta 1985 cuando Costerton et al. definieron
como biopelícula a la forma de desarrollo de las bacterias que crecen adheridas entre sí y a
una superficie sólida mediante una matriz de sustancias poliméricas extracelulares o
glicocáliz. El trabajo inicial de Costerton se enfocó a las biopelículas que las bacterias
patógenas desarrollan en los tejidos animales (Nickel et al. 1985). A partir de estos trabajos
pioneros en el tema de las biopelículas microbianas se ha demostrado que en el entorno
natural la mayoría de los microorganismos se desarrollan de esta manera (Hall-Stoodley,
Costerton y Stoodley 2004).
7
Las biopelículas se pueden agrupar en dos tipos de acuerdo al entorno en que habitan (Figura
1):
1) Biopelículas que se desarrollan en ambientes con un nivel humedad
relativamente constante o biopelículas subacuáticas:
a) Tapetes microbianos. Crecen sobre una superficie sólida y en contacto
continuo con agua como en lechos de ríos y lagos, y otros cuerpos de agua.
Generalmente están formados por microorganismos autótrofos y heterótrofos.
Forman una estructura macroscópica multilaminar, v. gr. los estromatolitos. Estas
biopelículas representan un nicho en el que se desarrollan microecosistemas muy
complejos de gran diversidad microbiana. Los microorganismos de estas biopelículas
pueden modular por completo el ecosistema en que se desarrollan a través de su
actividad metabólica (van Gemerden 1993).
b) Biopelículas bacterianas. Crecen sobre superficies de órganos y tejidos
de organismos vivos, ya sea como simbiontes o patógenos. Tienen importancia
clínica, ya que son responsables de cuadros de infecciones de microorganismos
resistentes a antibióticos. Generalmente están formadas por una o pocas especies
bacterianas, aunque en ocasiones pueden contener otros grupos como levaduras (Joo
y Otto 2012).
Figura 1. Clasificación de biopelículas según el ambiente en que se desarrollan.
8
c) Flóculos o biopelículas flotantes. Crecen sin anclaje a una superficie y se
desarrollan en ríos, mares o lagos. Un caso muy estudiado son las grandes masas celulares
que se forman del florecimiento de cianobacterias en cuerpos de agua y que provocan la
intoxicación de peces y otros organismos acuáticos (Flemming y Wingender 2010).
2) Biopelículas que proliferan en entornos con un nivel de humedad variable,
sometidas incluso a largos periodos de sequía. Estas biopelículas crecen sobre superficies
sólidas y secas, comúnmente roca, y se encuentran expuestas continuamente a la atmósfera
por lo que reciben el nombre de biopelículas subaéreas (SABs). El agua necesaria para su
desarrollo la obtienen de la lluvia o del roció. Están formadas por microorganismos de los
tres niveles tróficos (Gorbushina 2007).
3.2. Importancia de las SABs
Las SABs son un tipo interesante de biopelículas, tanto ecológica como biotecnológicamente.
Los grupos de microorganismos considerados como los colonizadores de la Tierra -
actinobacterias, cianobacterias y firmicutes- se encuentran comúnmente en SABs, por lo que
se ha considerado que las biopelículas microbianas fueron las primeras formas de vida en
colonizar la litósfera de la Tierra (Gorbushina y Broughton 2009; Sciuto y Moro 2015).
A través de millones de años los microorganismos de las SABs se han adaptado para
sobrevivir en un entorno inhóspito en condiciones de baja humedad. Estos microorganismos
están adaptados para resistir múltiples factores de estrés, con amplios rangos de variación en
lapsos cortos. Esta adaptación es producto de diversas estrategias fisiológicas y metabólicas
que estos microorganismos han desarrollado. Los microorganismos de SABs no están
protegidos continuamente por la capacidad amortiguadora de una capa de agua líquida en
cuanto a cambios de temperatura y nivel osmótico, sin embargo producen una amplia gama
de metabolitos que les permiten enfrentar condiciones de sequía y elevada irradiación durante
meses, años e incluso décadas (Gorbushina y Broughton 2009).
La importancia ecológica de estas comunidades reside en que ocupan nichos que ningún otro
organismo ocupa. Más notorios son los casos de los desiertos tanto fríos como calientes
(Chan et al. 2012). Por ejemplo, en los valles antárticos se ha observado que aunque estas
9
biopelículas sólo cubren un 0.024% del área superficial, sus productos metabólicos son la
principal fuente de nitrógeno orgánico en ese ecosistema (Cowan et al. 2011). Se ha sugerido
que estas comunidades actúan como “reservorios” de inóculos microbianos de donde, cuando
se presentan las condiciones adecuadas, se dispersan los microorganismos hacia otros
hábitats. Son “islas” de productividad que actúan como la principal fuente de carbono y
nitrógeno orgánicos en ecosistemas sin plantas (Chan et al. 2012). Recientemente se han
encontrado algunas aplicaciones para los microorganismos presentes en SABs, como el
acondicionamiento y estabilización de suelos erosionados (Belnap 2003), o la producción de
pigmentos con potencial como bloqueadores de la radiación solar (Gao y Garcia-Pichel
2011).
Además, las SABs se han estudiado recientemente por su importancia antropológica-cultural,
relacionada al deterioro de monumentos de roca. Aunque la mayoría del daño en los
monumentos es causada por factores abióticos, éstos sobrepasan la capacidad que se tiene
actualmente para prevenir su impacto, por lo que el deterioro biológico es el agente en el que
se enfocan muchos de los trabajos de conservación y restauración (Scheerer, Ortega-Morales
y Gaylarde 2009).
Se ha estimado que la actividad biológica causa entre el 20 y 30% del deterioro de
monumentos de roca (Wakefield y Jones 1998); siendo la actividad metabólica de los
microorganismos de SABs la que propicia los principales daños (Scheerer, Ortega-Morales
y Gaylarde 2009). Entre los agentes microbiológicos que actúan en el biodeterioro, las
cianobacterias tienen una importancia crítica, ya que son los microorganismos colonizadores,
los más persistentes y los mejor adaptados para crecer en esta interfaz. Se ha demostrado que
las cianobacterias producen gran parte de la matriz de polímeros que forman la base de la
biopelícula, además aportan una parte importante del carbono y nitrógeno necesarios para el
desarrollo de la microcomunidad (Crispim y Gaylarde 2005; Crispim et al. 2006; Scheerer,
Ortega-Morales y Gaylarde 2009; Gaylarde et al. 2012).
3.3. Desarrollo de biopelículas
El desarrollo de una biopelícula cualquiera presenta 3 etapas principales: 1) el anclaje de las
células microbianas a la superficie, 2) la formación de la microcolonia y 3) la maduración de
10
la biopelícula, que incluye el incremento del espesor y la configuración tridimensional que
da la arquitectura de la biopelícula (Stanley y Lazazzera 2004), como se presenta en la Figura
2.
En las biopelículas formadas por una o pocas cepas bacterianas la fase de anclaje se
caracteriza por la adhesión de las células a la superficie y la pérdida de la motilidad celular
mediante la eliminación de cilios y flagelos. Esta etapa depende de la osmolaridad del medio
y de la concentración de nutrientes en la superficie (Hall-Stoodley, Costerton y Stoodley
2004; Stanley y Lazazzera 2004).
En la fase de formación de la microcolonia se presenta un incremento en el número de
células, observable como 3 o 5 capas celulares de profundidad. En esta etapa las células
bacterianas desarrollan pili tipo IV, a través de los cuales se unen entre sí para obtener una
mayor adhesión dentro de la biopelícula. Asimismo, se presenta una mayor producción de
polímeros extracelulares. Estos cambios dependen de la disponibilidad de nutrientes en el
entorno de la biopelícula (Hall-Stoodley, Costerton y Stoodley 2004; Flemming y Wingender
2010).
Durante la etapa de maduración ocurren cambios tridimensionales en la arquitectura de la
biopelícula. Pueden desarrollarse estructuras simples en forma de capas celulares
homogéneas sobrepuestas o estructuras complejas formadas por pilares celulares con canales
por donde fluyen los nutrientes y los deshechos, en ambos casos las células están inmersas
en la matriz de EPS. Estos cambios se presentan en respuesta a las fuerzas físicas a las que
está sometida la biopelícula, la disponibilidad de nutrientes, la densidad celular y a sistemas
de comunicación microbiana (Hall-Stoodley, Costerton y Stoodley 2004; Stanley y
Lazazzera 2004), los cuales mencionaremos a detalle más adelante.
Además de estas 3 etapas puede presentarse una fase de desprendimiento y dispersión de
las células de la biopelícula, esto ocurre cuando los nutrientes se han agotado o cuando las
condiciones ambientales dejan de ser favorables para el desarrollo de la biopelícula. También
puede ocurrir el desprendimiento celular cuando las biopelículas alcanzan un tamaño crítico
o por fuerzas físicas externas a la biopelícula. Las células o fragmentos de biopelícula
11
desprendidos pueden iniciar una nueva biopelícula, cerrando el ciclo de desarrollo (Stanley
y Lazazzera 2004).
Figura 2. Diagrama general del desarrollo de una biopelícula bacteriana. Se muestran las 4 etapas
principales de desarrollo.
3.3.1. Desarrollo de SABs
Para el caso de una SAB, que es una biopelícula compleja, se presentan procesos especiales
adicionales a los descritos anteriormente. La primera fase en el desarrollo es la colonización
por microorganismos fotoautótrofos de una superficie expuesta a la atmósfera,
principalmente por cianobacterias (Gorbushina 2007). Las cianobacterias se desarrollan con
mayor éxito debido a su elevada producción de EPS, su capacidad para resistir procesos de
desecación, su producción de pigmentos de protección contra radiación UV y la capacidad
de algunas cepas para fijar nitrógeno atmosférico (Crispim y Gaylarde 2005; Barberousse et
al. 2006; Gaylarde, Gaylarde y Neilan 2012; Rossi et al. 2012). Sin embargo, es posible que
se desarrollen microorganismos heterótrofos al mismo tiempo que los fotoautotrófos, esto
ocurre cuando la superficie de la roca contiene materia orgánica, v. gr. materia proveniente
de partículas depositadas por el aire o la lluvia, que puede ser utilizada como fuente de
carbono (Mitchell y Gu 2000; Viles y Gorbushina 2003). En cualquier escenario, ya sea que
los fotoautótrofos colonicen o no la superficie, es necesaria la coexistencia de fotoautótrofos
y heterótrofos para el establecimiento y la sobrevivencia de estos microecosistemas. Mientras
que los fotótrofos contribuyen con el aporte de carbono y nitrógeno a la biopelícula, los
heterótrofos facilitan la recirculación de los nutrientes, mostrando una de las relaciones
12
simbióticas tempranas en estas comunidades (Gorbushina 2007; Gorbushina y Broughton
2009; Chan et al. 2012). En la Figura 3 se muestra un esquema del desarrollo de una SAB.
En las SABs se presenta un fenómeno de sucesión de poblaciones, una vez que se han
establecido los microorganismos colonizadores, se desarrollan otros grupos microbianos de
acuerdo a la disponibilidad de nutrientes y la estacionalidad. Presentándose, incluso, ciclos
mensuales o anuales de diversidad microbiana en cada biopelícula (Crispim y Gaylarde 2005;
Gorbushina y Broughton 2009).
Figura 3. Esquema del desarrollo y de los componentes de una biopelícula subaérea (SAB). La
matriz de EPS se muestra como una masa de color azul claro.
Entre los microorganismos heterótrofos de SABs, los hongos microcoloniales son los mejor
adaptados para crecer en este tipo de biopelículas (Gorbushina y Broughton 2009; Zakharova
et al. 2013). El término de hongo microcolonial se aplica a aquellos hongos microscópicos
que presentan un crecimiento in situ característico en forma de colonias oscuras compactas
con aspecto de “coliflor”. Su color oscuro se debe a la presencia de hifas melanizadas, las
cuales les permite resistir largos periodos de radiación solar (Sterflinger 2006). Otros
heterótrofos comúnmente presentes en SABs son las bacterias filamentosas del grupo de los
actinomicetos y las bacterias quimiolitótrofas, aunque estas últimas representan una fracción
pequeña del total de microorganismos debido a sus requerimientos nutricionales (Gorbushina
y Broughton 2009; Chan et al. 2012).
Una vez que se ha establecido la biopelícula, las poblaciones microbianas llegan al equilibrio,
siempre y cuando las condiciones ambientales se mantengan relativamente constantes.
13
Cuando la biopelícula se ha equilibrado se alcanza la maduración de la misma, en este punto
cada grupo microbiano tiene una función específica dentro del microecosistema. Cuando las
SABs han madurado, otros organismos como líquenes, plantas, e incluso algunos insectos
pueden desarrollarse sobres estas, aprovechando el microambiente que proporciona la
biopelícula (Gorbushina 2007).
Cianobacterias. Debido a su importancia en el establecimiento y desarrollo de las SABs
describiremos con más detalle este grupo de microorganismos. Son un grupo de procariontes
diverso en cuanto a su morfología y fisiología. Incluyen desde las formas unicelulares que se
reproducen por fisión binaria, hasta las formas filamentosas que poseen una variedad de tipos
celulares altamente diferenciados: las células vegetativas en donde se lleva a cabo la
fotosíntesis oxigénica y las células especializadas llamadas heterocistes en donde se efectúa
la fijación de nitrógeno. Se clasifican en el mismo grupo debido a las características que
comparten: realizar fotosíntesis oxigénica, el contenido de clorofila a y ficobiliproteínas
como sus compuestos fotosintéticos primarios. Además, se agrupan filogenéticamente
formando un clado dentro de las Bacterias y a su vez dentro de las bacterias Gram negativas.
Por su capacidad de realizar fotosíntesis y fijar nitrógeno, generalmente son el grupo de
microorganismos dominantes en los ecosistemas en los que están presentes (Waterbury
2006). El Phylum Cyanobacteria comprende 9 órdenes y alrededor de 4,500 especies
descritas, de las cuales se ha secuenciado el genoma de 39, la mayoría cocoides (AlgaeBase,
CyanoBase).
3.4. La importancia de las EPS en el desarrollo de las SABs
La adaptación de las SABs a condiciones variables se debe en gran medida a la síntesis y
secreción de EPS por los microorganismos que conforman la biopelícula, principalmente por
bacterias heterótrofas y cianobacterias (Gorbushina 2007). Las EPS forman una matriz que
da cohesión y estabilidad a las células microbianas embebidas en estos polímeros. Dicha
matriz funciona como un microambiente de condiciones relativamente estables en el que se
desarrollan las células microbianas, crea una barrera frente al macroambiente hostil y protege
a las células dentro de la biopelícula (Wingender, Neu y Flemming 1999; Flemming y
Wingender 2010). Las EPS tienen gran capacidad higroscópica por lo que pueden retener
14
suficiente agua como para permitir a los microorganismos desarrollarse y responder
oportunamente a los cambios en su macroambiente frente a un periodo de deshidratación
(Flemming y Wingender 2001). Estos polímeros tienen el potencial de quelar iones metálicos
y sorber sustancias orgánicas, por lo que funcionan como un almacén de estos nutrientes.
Asimismo, la matriz de EPS puede concentrar enzimas exógenas y actuar como un digestor
extracelular de macromoléculas (Laspidou y Rittmann 2002).
Las EPS constituyen entre el 50 y 90% del carbono orgánico de las biopelículas. Varían en
su composición y propiedades físico-químicas de acuerdo a la cepa microbiana que las
sintetiza y al entorno en que se desarrolla cada microcomunidad (Sutherland 1979; Pereira et
al. 2009). Están compuestas principalmente por polisacáridos, constituidos mayoritariamente
por glucosa. Cuando los polisacáridos están formados por monómeros de un solo tipo -
regularmente glucosa - se les conoce como homopolisacáridos, en cambio, si están formados
por distintos monómeros - comúnmente D-glucosa, D-galactosa, D-manosa, L-ramnosa, L-
fucosa y ácido galacturónico - se les conoce como heteropolisacáridos. Estos monosacáridos
pueden tener sustituyentes O-acetilo y piruvilo, o contener grupos inorgánicos como sulfato
(Sutherland 1979; Wingender, Neu y Flemming 1999; Bhaskar y Bhosle 2006; Pereira et al.
2009). Además de los polisacáridos, se ha reportado que las EPS pueden contener proteínas
(Hueck 1998) y ADN extracelular (Lorenz y Wackernagel 1994).
Aunque la composición de las EPS varía considerablemente de biopelícula a biopelícula,
tienen las mismas propiedades y funciones: dar protección a las células microbianas frente a
las condiciones ambientales adversas, proporcionar una matriz que permite el flujo y
concentración de nutrientes, pigmentos, factores de crecimiento y otros metabolitos, además
de retener la humedad. Estas características, en conjunto, habilitan a las células microbianas
dentro de la SAB para resistir la desecación, los cambios diurnos de temperatura y la
radicación solar (Davey y O’toole 2000; Gorbushina y Broughton 2009; Flemming y
Wingender 2010; Chan et al. 2012; Flemming et al. 2016).
Para el desarrollo exitoso de una SAB cada etapa es crítica, desde la colonización por los
fotoautótrofos hasta el desarrollo de los heterótrofos que permiten el ciclaje de los nutrientes
(Gorbushina 2007; Gorbushina y Broughton 2009). En cualquier caso, todas las etapas
15
dependen de la síntesis y excreción de EPS por los microorganismos que forman la
biopelícula.
Como se mencionó anteriormente, en las SABs, las cianobacterias son los microorganismos
colonizadores y los que contribuyen con gran parte de la síntesis de EPS. Entonces, si el
establecimiento de una SAB se relaciona con la formación de la matriz de EPS, se puede
concluir que la supervivencia de las SABs depende en gran medida de la producción de EPS
por las cianobacterias. Estos microorganismos sintetizan 2 tipos principales de EPS:
1) Polímeros de bajo grado de polimerización que son secretados y permanecen
solubles en el medio extracelular (SEPS) y
2) Polímeros de grado medio-alto de polimerización que forman la cubierta celular
(CEPS). A su vez, los CEPS se dividen en 2 tipos:
a) polímeros de grado medio de polimerización que forman una capa gomosa
poco densa o mucílago alrededor de las células (MEPS) y
b) polímeros de alto grado de polimerización que forman una capa delgada
y compacta que rodea las células conocida como cápsula (WEPS).
Cada uno de éstos tiene funciones específicas que se relacionan con la captación de
nutrientes, el anclaje a las superficies y la protección contra condiciones ambientales
desfavorables, respectivamente (Plude et al. 1991; Volk, Venzke y Blaschek 2007). El
proceso de síntesis y exportación de los EPS en cianobacterias aún es desconocido, sin
embargo existen reportes basados en estudios in silico en los que se ha observado que los
genomas de cianobacterias contienen genes putativos relacionados a la síntesis de EPS en E.
coli con similitudes alrededor del 35%. Estos genes son los de los sistemas Wzm/Wzt y
Wzx/Wzy (Kehr y Dittmann 2015).
A pesar de la gran cantidad de información publicada sobre el desarrollo de las biopelículas
en general y sobre las SABs en particular, se sabe poco sobre la manera cómo interactúan los
microorganismos entre sí y con su entorno en estas últimas. Aunque se sabe que el desarrollo
de las SABs está íntimamente ligado a la producción de EPS por las cianobacterias, se
16
desconoce el mecanismo por el cual estos microorganismos se coordinan para producir estos
polímeros en el momento y concentración adecuados.
Es de esperar que la interacción microbiana es lo que permite el desarrollo de la SAB como
un todo organizado. Por lo que, la explicación para comprender los medios por los cuales los
microorganismos de las SABs se coordinan de forma precisa para mantener sus proporciones
relativamente constantes, producir la matriz de EPS y responder oportunamente a los cambios
ambientales, podría encontrarse en los sistemas que utilizan para comunicarse entre sí.
3.5. Comunicación microbiana
El concepto de comunicación microbiana se refiere a los sistemas de señalización célula-
célula mediante los cuales algunos microorganismos pueden responder a los estímulos del
entorno, además de permitirles realizar actividades coordinadas de cooperación celular
(Diggle 2010). Como en todo sistema de comunicación debe existir un emisor de la señal, un
receptor con la capacidad de responder a la señal y, obviamente, una señal que se encuentre
en un formato que tanto el emisor y el receptor puedan reconocer.
3.5.1. Sistema de quorum sensing
Las bacterias son el grupo de microorganismos en los que mejor se ha estudiado el fenómeno
de comunicación microbiana, y el sistema más estudiado es el denominado quorum sensing.
Este concepto fue introducido en 1994 por Fuqua, Winans y Greenberg para referirse a la
densidad celular mínima o quorum en que las bacterias cambian su expresión genética.
Este sistema permite la señalización célula-célula mediante la producción, detección y
respuesta a moléculas difusibles de bajo peso molecular que actúan como señales químicas.
Debido a que estas señales son capaces de estimular su propia síntesis se les conoce como
autoinductores. Además, actúan como feromonas (del Griego Antiguo pherein: llevar,
transportar; y hormon: excitar, estimular), ya que pueden provocar cambios en el
comportamiento de las células de la misma especie que las produce. Estas moléculas son
sintetizadas por las células microbianas de manera dependiente a la densidad celular. Cuando
se alcanza una concentración umbral de la señal en el entorno, que se relaciona directamente
17
con una densidad celular específica para cada microorganismo, las células modifican su
expresión genética activando o desactivado rutas bioquímicas. Los microorganismos que
presentan este sistema de comunicación se adaptan mejor a los cambios en su entorno, esto
les permite sobrevivir en condiciones ambientales desfavorables y aprovechar las
condiciones favorables (Miller y Bassler 2001; Williams et al. 2007; Antunes et al. 2010).
Dentro de los procesos celulares dependientes de sistemas de quorum sensing se encuentran
la bioluminiscencia (Lupp et al. 2003), la producción de antibióticos (Thomson et al. 2000)
y de factores de virulencia (Zhu et al. 2002), así como el desarrollo de biopelículas (Lynch
et al. 2002), entre otras.
El sistema de quorum sensing se ha reportado en grupos microbianos comúnmente
encontrados en SABs, por lo cual mencionaremos algunos de los modelos más relevantes.
3.5.2. Quorum sensing en bacterias Gram negativas
El sistema de quorum sensing descrito por primera vez fue el presente en la bacteria Gram
negativa Vibrio fischeri, antes Photobacterium fischeri. Nealson, Platt y Hastings (1970)
observaron que esta bacteria producía luminiscencia cuando alcanzaba densidad celular alta.
Una de sus primeras conclusiones fue que existían compuestos en el medio de cultivo que
inhibían la producción de luciferasa, la enzima encargada de producir luz, y cuando estos
compuestos eran eliminados por el metabolismo de las bacterias se presentaba el fenómeno
de luminiscencia. Más tarde, el mismo grupo logró demostrar que las células bacterianas, al
alcanzar densidades celulares altas, secretaban compuestos al medio de cultivo capaces de
inducir la bioluminiscencia. Además, observaron que era posible inducir la producción de
luciferasa en cultivos de V. fischeri con densidades celulares bajas, solamente variando la
concentración del compuesto inductor. A estos compuestos se les llamo autoinductores,
debido a su capacidad de auto estimulación (Nealson 1977). En 1981, Eberhard et al.
reportaron la estructura del autoinductor de V. fischeri, conocido como N-(3-oxohexanoil)-
3-aminodihidro-2(3H)-furanona o N-(p-cetocaproil) homoserina lactona, y más comúnmente
N-3-oxo-hexanoil homoserina lactona. Estos experimentos abrieron un campo totalmente
nuevo dentro de la microbiología, el campo de la comunicación microbiana.
18
A partir de 1990 se han reportado más de 50 especies de bacterias Gram negativas capaces
de sintetizar moléculas semejantes al autoinductor de V. fischeri (Williams et al. 2007;
Montgomery et al. 2013; Papenfort y Bassler 2016). Este grupo de señales químicas,
conocidas como acil homoserina lactonas (AHLs), se difunden libremente a través de la
membrana celular. Las AHLs se producen por la condensación de una cadena acilo y un
anillo de lactonizado de homoserina. La cadena acilo proviene de la síntesis de ácidos grasos
y el anillo de homoserina tiene como precursor a la S-adenosilmetionina (Hanzelka y
Greenberg 1996b; Parsek et al. 1999; Fuqua y Greenberg 2002). La cadena acilo de las AHLs
puede variar en longitud - de 4 a 16 carbonos - y en su estado de oxidación, por lo que puede
presentar sustituyentes oxo o hidroxilo en la posición 3 de la cadena. El anillo de homoserina
lactona permanece constante en las moléculas de este grupo. Es posible que una misma cepa
sintetice más de un tipo de AHL, y que cada una de estas AHLs regule un proceso distinto
(Fuqua y Greenberg 2002).
El sistema genético más común de regulación de la síntesis y respuesta a las AHLs se
denomina luxI-luxR. Este modelo fue propuesto por Engebrecht, Nealson y Silverman
(1983), quienes plantearon que los genes que expresan la sintasa y el receptor de las AHL,
así como los genes necesarios para la síntesis de la luciferasa se encuentran en una misma
región conocida como operón LUX, poco tiempo después se demostró que este modelo es
muy cercano a la realidad (Fuqua, Winans y Greenberg 1994; Fuqua y Greenberg 2002).
Actualmente se sabe que luxI codifica para LuxI, la sintasa de las AHLs, que cataliza la
reacción de condensación entre la cadena acilo y la S-adenosil metionina; y luxR codifica
para LuxR, el receptor de la AHL. El complejo AHL/LuxR se forma por dos unidades de
LuxR por cada unidad de AHL. Este complejo interactúa con el DNA y tiene la función de
activar o reprimir ciertos genes dependientes de este sistema de señalización. Dentro de los
genes que son activados se encuentra luxI, resultando en la autoinducción de la producción
de la señal (Fuqua, Winans y Greenberg 1994; Hanzelka y Greenberg 1996a; Fuqua y
Greenberg 2002; Williams et al. 2007). Además, los circuitos dependientes de AHLs regulan
la expresión de genes involucrados con la síntesis de productos naturales, la virulencia
(Barnard et al. 2007), la motilidad (Hussain et al. 2008) y la formación de biopelículas
(Kjelleberg y Molin 2002; de Kievit 2009), entre otras actividades celulares. En la Figura 4
se muestra un diagrama del sistema luxI-luxR.
19
En las bacterias Gram negativas se han reportado cerca de 100 AHL sintasas homólogas a
LuxI. Además, en especies del género Vibrio, se ha descrito otro grupo de AHL sintasas
clasificadas como la familia LuxM (Fuqua y Greenberg 2002; Williams et al. 2007; Papenfort
y Bassler 2016). Por otro lado, Laue et al. (2000) identificaron una AHL sintasa (HdtS)
completamente distinta a LuxI y LuxM. A la par de la descripción de los sistemas genéticos,
se han determinado las estructuras de alrededor de 15 señales distintas (Fuqua y Greenberg
2002). Esto sugiere que las señales y sistemas reportados son solo una parte de lo que queda
por explorar.
Figura 4. Sistema de quorum sensing LuxI-LuxR de Vibrio fischeri.
3.5.3. Quorum sensing en bacterias Gram positivas
Se ha observado que las bacterias Gram positivas regulan algunos procesos como la
virulencia (Ji, Beavis y Novick 1995), la competencia para la transformación genética
(Håvarstein, Coomaraswamy y Morrison 1995), la diferenciación celular (Horinouchi y
Beppu 1994) y la formación de biopelículas (Li et al. 2002) de manera dependiente a la
densidad celular, de forma semejante al quorum sensing de las bacterias Gram negativas
(Miller y Bassler 2001).
20
En los actinomicetos, grupo de bacterias Gram positivas con alto contenido de guanina y
citosina en el ADN comúnmente encontrado en SABs, las moléculas señal se conocen como
gama butirolactonas, debido a que contienen una fracción que corresponde a la gama-
butirolactona (Horinouchi y Beppu 1992). La primera de estas moléculas que se describió
fue el factor autoregulatorio o Factor-A (2-Isocapriloil-3-R-hidroximetil-gama-
butirolactona) de Streptomyces griseus, relacionado a la síntesis de estreptomicina
(Horinouchi y Beppu 1993). Asimismo, se ha reportado que el Factor-A regula procesos tales
como la esporulación (Wang y Vining 2003), la producción de antibióticos, la diferenciación
celular (Takano 2006) y el desarrollo de micelio aéreo (Kato et al. 2002).
Los actinomicetos están filogenéticamente distantes de las bacterias Gram negativas y de las
bacterias Gram positivas con bajo contenido de guanina y citosina en el ADN, tal vez debido
a esto el autoinductor y el sistema de síntesis/respuesta al autoinductor son característicos de
este grupo. La ruta de síntesis de la señal de S. griseus comienza con la formación de una 8-
metil-3-oxononanoil-dihidroxicetona, como resultado de la transferencia de la fracción
cetoacil de la proteína acarreadora del 8-metil-3-oxononanoil-acilo al grupo hidroxilo de la
dihidroxicetona por medio de la enzima AfsA. El éster resultante es convertido no
enzimáticamente a un butenolido fosfato por una condensación aldólica, para posteriormente
ser reducido por la enzima bprA. Por último, el grupo fosfato del butenolido es retirado por
una fosfatasa, para dar como resultado el Factor-A (Nishida et al. 2007). El mecanismo de
detección y respuesta a la señal depende del receptor ArpA, el cual actúa como un regulador
tipo represor (Onaka et al. 1995). ArpA reprime la expresión de los genes blanco al estar
ligado al ADN. Cuando el Factor-A se encuentra en la concentración adecuada se une a
ArpA, lo que provoca su separación del ADN y permite la expresión de los genes blanco
(Miyake et al. 1990; Onaka et al. 1995; Nishida et al. 2007). Además del Factor-A se han
reportado las estructuras de otras 8 gama butirolactonas, las cuales varían en la longitud y
presencia de ramificaciones en la cadena acilo (Nishida et al. 2007).
Los firmicutes, bacterias con alto contenido de guanina y citosina en su ADN, son el otro
grupo de bacterias Gram positivas donde se ha estudiado el fenómeno de quorum sensing.
Éstas se señalizan por medio de péptidos de bajo peso molecular que van desde los 2 hasta
los 34 aminoácidos. Estos péptidos son modificados después de su síntesis y la principal
21
modificación consiste en su ciclación. Debido a su capacidad de inducir su propia síntesis se
les conoce como péptidos autoinductores (AIPs). Se ha reportado que estas señales están
involucradas en la regulación de procesos tales como la producción de bacteriocinas (Diep,
Håvarstein y Nes 1995), la virulencia y la competencia genética (Lyon y Novick 2004). La
formación de los AIPs es resultado del fraccionamiento de péptidos grandes provenientes de
síntesis ribosomal. Una vez que se han formado los oligopéptidos, pueden ocurrir reacciones
entre las cadenas laterales produciendo anillos lactonizados o tiolactonizados.
Figura 5. Sistema de quorum sensing AgrA-AgrC de Staphylococcus aureus.
A diferencia de las AHLs, los AIPs no son permeables a través de la membrana celular por
lo que requieren de transportadores específicos para cruzarla. El mecanismo más común para
exportar un AIP fuera de la célula es a través de un transportador de membrana dependiente
de ATP o transportador ABC (Bassler 2002). Una vez que las bacterias alcanzan una
densidad celular específica y los péptidos se encuentran fuera de la célula en la concentración
umbral, éstos se unen a receptores específicos activando una cascada de señalización. El
sistema de respuesta a los AIPs más extendido entre los firmicutes es un sistema de
transductores de dos componentes. La transducción de la señal se da por una cascada de
22
fosforilación-defosforilación. Los detectores de los AIP son sensores tipo cinasas de dos
componentes, los cuales al interactuar con el péptido extracelular inician una serie de
reacciones de fosforilación intracelulares. La cascada de señalización termina con la
fosforilación de una proteína que actúa como regulador de respuesta. Esta proteína
fosforilada se une al ADN, activando o desactivando la transcripción de los genes regulados
por el sistema de quorum sensing (Dunny y Leonard 1997; Miller y Bassler 2001). La Figura
5 muestra el sistema AgrA-AgrC presente en Staphylococcus aureus, éste se relaciona con la
virulencia y la formación de biopelículas.
3.5.4. Sistema de quorum sensing bacteriano universal
Además de los sistemas de comunicación mencionados anteriormente, que son específicos
para cada grupo de microorganismos y funcionan para la comunicación intraespecie, se ha
descrito un sistema de comunicación interespecie i.e. permite la comunicación entre distintas
especies y grupos bacterianos (Li y Tian 2012). Este sistema se describió por primera vez en
la bacteria Vibrio harveyi. En un principio se identificó como un sistema de quorum sensing
accesorio para regular la bioluminiscencia (Bassler et al. 1993). El compuesto que actúa
como señal en este sistema se conoce como autoinductor 2 o AI-2, el cual es un diéster
furanosil borato, este compuesto representa el primer papel bien definido del boro en sistemas
biológicos (Chen et al. 2002). La presencia del AI-2 se ha reportado en alrededor de 50
especies bacterianas, tanto Gram positivas como Gram negativas. No obstante, sólo en
algunas especies del género Vibrio se ha comprobado que el AI-2 actúa como señal en un
sistema de quorum sensing, en bacterias de otros géneros activa otros mecanismos de
señalización (Federle y Bassler 2003; Hardie y Heurlier 2008).
En V. harveyi la síntesis del AI-2 depende de la enzima LuxS. Esta enzima tiene la función
de convertir la S-ribosilhomocisteína, que deriva de la S-adenosilmetionina, en la 4,5-
dihidroxi-2,3-pentanodiona la cual es el precursor del AI-2. Se han reportado varios
mecanismos de respuesta al AI-2, sin embargo, dos son los principales: En uno de estos
mecanismos el receptor del AI-2 es un transductor tipo cinasa de dos componentes (LuxPQ),
el cual al interactuar con el AI-2 inicia una cascada de fosforilación-defosforilación. El
último paso de la cascada de señalización es la defosforilación del regulador de respuesta
23
LuxO. Este regulador defosforilado se une al ADN, activando los genes dependientes de este
sistema de quorum sensing, Figura 6 (Federle y Bassler 2003). En el otro mecanismo, el AI-
2 entra en la célula a través de un transportador ABC. Después de ser modificado y
fosforilado, el AI-2 actúa sobre la proteína reguladora de respuesta que, a su vez, activa o
inhibe la transcripción de los genes blanco (Hardie y Heurlier 2008). Este sistema de
señalización se ha relacionado a procesos celulares tales como la virulencia (Sperandio et al.
2001; Stroeher et al. 2003; Lee y Song 2005; Xu et al. 2006), la motilidad (Elvers y Park
2002; Rader et al. 2007), la formación de biopelículas (McNab et al. 2003; Xu et al. 2006;
Vidal et al. 2013), la producción de antibióticos (Derzelle et al. 2002; Coulthurst, Kurz y
Salmond 2004), de polisacáridos capsulares (Zhao et al. 2010) y de toxinas (Ohtani, Hayashi
y Shimizu 2002; Yang et al. 2014).
Figura 6. Sistema de quorum sensing universal de Vibrio harveyi.
3.5.5. Quorum sensing en otros grupos microbianos
En el 2001, Hornby et al. reportaron un descubrimiento importante en el área de la
comunicación microbiana: los microorganismos eucarióticos también presentan sistemas
semejantes al quorum sensing bacteriano. Específicamente, observaron que el hongo
polimórfico Candida albicans regula la transición de levadura a hifa de manera dependiente
a la densidad celular; mediante la síntesis, detección y respuesta a un terpeno conocido como
24
farnesol. A densidades celulares menores a 106 células mL-1 C. albicans se desarrolla en
forma filamentosa, mientras que a densidades celulares más elevadas se desarrolla en forma
de levadura. Aunque se había documentado extensamente el efecto de factores como el pH,
la temperatura, la presencia de suero sanguíneo de mamíferos, entre otros, sobre este
fenómeno, Hornby et al. demostraron que dicha transición está regulada por la concentración
extracelular de farnesol. Este compuesto es producido de manera dependiente a la densidad
celular y cuando alcanza una concentración umbral en el medio de cultivo inhibe la
formación de los tubos germinales e impide así la formación de hifas. Este es un ejemplo de
una actividad celular reprimida por un sistema de quorum sensing. Hasta el momento no se
ha reportado si algún hongo microcolonial proveniente de una biopelícula subaérea presenta
algún sistema de comunicación. Sin embargo, este precedente abre la posibilidad de que este
fenómeno pueda ocurrir.
Las cianobacterias son otro de los componentes de las SABs en los cuales se han observado
fenómenos de comunicación microbiana. Estos microorganismos presentan actividades de
cooperación celular tales como la producción de EPS (Zhu, Dai y Li 2014) y de toxinas
(Braun y Bachofen 2004), variaciones en el contenido de clorofila a (Agusti y Phlips 1992),
entre otras. Estos procesos celulares concuerdan con los procesos bacterianos regulados
mediante sistemas quorum sensing. Sin embargo, no se ha demostrado con claridad hasta qué
punto este grupo microbiano regula su metabolismo a través la comunicación microbiana. En
un estudio de Mooy et al. (2012) en consorcios marinos de cianobacterias, se observó que
señales tipo AHLs son producidas por bacterias heterótrofas epibiontes de cianobacterias del
género Trichodesmium. Estas señales actúan en un sistema de quorum sensing de los
epibiontes y tiene como efecto el aumento de su actividad de fosfatasas alcalinas,
enriqueciendo el consorcio de fosfato. Las cianobacterias se benefician de manera indirecta
utilizando el fósforo que sus epibiontes hacen biodisponible. Este caso indica que las
cianobacterias pueden beneficiarse al actuar de manera sinérgica con bacterias que son
capaces de comunicarse entre sí, obteniendo ventajas adaptativas en su entorno. A la fecha,
existe un solo trabajo sobre una cepa axénica del género Gloeothece donde se ha demostrado
la capacidad de síntesis y respuesta a señales tipo AHL de las cianobacterias. En este caso el
sistema de quorum sensing tiene efecto sobre la regulación de la expresión de enzimas como
la RuBisCO y otras proteínas relacionadas al metabolismo de carbohidratos (Sharif et al.
25
2008). En otro trabajo, Zhai et al. (2012) reportaron que una cepa de Microcystis
aeuruginosa, es capaz de sintetizar un compuesto con la capacidad de activar el sistema de
quorum sensing en Agrobacterium tumefaciens KYC55 (biorreportero para la detección de
AHLs). Estos autores, observaron el efecto de este compuesto en la inducción de la formación
de biopelículas por M. aeuruginosa, sin embargo, no determinaron la estructura ni el
mecanismo de acción de este compuesto.
3.5.6. Quorum quenching
El quorum quenching es un mecanismo mediante el cual algunos organismos tienen la
capacidad para interferir los sistemas de quorum sensing bacterianos. Este mecanismo se ha
descrito de mejor manera para el caso de los sistemas dependientes de AHLs. Ha sido
reportado en plantas, animales y microorganismos (Zhang 2003).
El quorum quenching se da por tres vías:
a) Degradación de la señal. Se basa en la degradación de las AHLs mediante
dos tipos de enzimas: las AHL-acilasas que separan el anillo de homoserina lactona
de la cadena acilo, y las AHL-lactonasas que hidrolizan el anillo de homoserina
lactona (Zhang 2003).
b) Modificación de la señal. La modificación ocurre por enzimas que
catalizan reacciones de óxido-reducción en la cadena acilo de las AHLs,
principalmente oxidasas y óxido-reductasas. A diferencia de la degradación de la
señal, la modificación puede tener efectos importantes en el sistema de quorum
sensing, ya que las moléculas modificadas siguen siendo reconocidas por los
receptores (Uroz, Dessaux y Oger 2009).
c) Competencia por receptores. Ocurre por compuestos que mimetizan las
AHLs e interfieren con sus receptores. El caso mejor conocido es el de las furanonas
halogenadas producidas por el alga Dalisea pulchra. Se ha demostrado que su efecto
no es directamente como inhibidores de los receptores tipo LuxR, ya que la
estabilidad del complejo furanona-LuxR es muy baja, sino que incrementan el número
26
de recambio de la enzima teniendo como efecto la reducción drástica de su vida media y por
lo tanto la pérdida en la percepción de las señales (Zhang 2003). Manefield et al. (1999)
atribuyeron la capacidad de las furanonas de D. pulchra de interferir con los receptores de
AHLs debido a su similitud estructural. Aunque las estructuras de estas moléculas varían
considerablemente, se dice que tienen un grado de similitud porque su estructura la forman
una fracción cíclica polar y una cadena acilo apolar. Estas características pueden explicar el
hecho de que los receptores de las AHL las reconozcan.
Recientemente se ha estudiado el efecto de algunos extractos de plantas como inhibidores de
sistemas de quorum sensing. Se han evaluado extractos de Allium sativum (Persson y Hansen
2005), Vanilla planifolia (Choo, Rukayadi y Hwang 2006) y Piper nigrum, entre otros.
Además, se han estudiado compuestos puros-tanto naturales como sintéticos-con actividad
quorum quenching (Rumbaugh 2011). Algunos de estos compuestos pertenecen al grupo de
las alcamidas, que son metabolitos producidos por algunas plantas cuya estructura general
resulta de la condensación de una cadena acilo alfa insaturada y una amina (Ramírez et al.
2004, Molina-Torres et al. 2004). Se puede observar que algunas alcamidas tienen similitud
estructural con las AHLs. De hecho, las AHLs también son un tipo de amidas aciladas, por
lo que estos compuestos podrían modular los sistemas de QS basados en AHLs.
3.5.7. ¿Existe comunicación microbiana en las cianobacterias de biopelículas
subaéreas?
Dentro de la gran cantidad de procesos celulares que los microorganismos regulan a través
de sus sistemas de comunicación se encuentra el desarrollo de biopelículas. Específicamente,
la etapa de maduración de la biopelícula depende en gran medida de sistemas de quorum
sensing. En esta etapa se incrementa la síntesis de EPS, se modifica la arquitectura de la
biopelícula y se distribuyen las células microbianas dentro de la matriz de EPS con el objetivo
de optimizar el uso de nutrientes (Lynch et al. 2002; Parsek y Greenberg 2005; Dickschat
2010).
Se ha demostrado que la maduración de la biopelícula, en microorganismos en cultivo
axénico, es inducida por señales de quorum sensing y es inhibida cuando se bloquea la
síntesis o la capacidad de respuesta a dichas señales (Lynch et al. 2002; Zhang et al. 2014;
27
Saurav et al. 2016). Esto deja clara la importancia de la cooperación celular para la formación
exitosa de las biopelículas, tanto en cultivos in vitro como in situ. No obstante, se desconoce
el impacto de la presencia de múltiples sistemas de comunicación de distintos grupos
microbianos sobre el desarrollo de una biopelícula compleja, como podría ocurrir en una
SAB. La diversidad microbiana de una biopelícula depende y contribuye, al mismo tiempo,
a la diversidad metabólica del microambiente bioquímico de dicha biopelícula. Por lo que
estudiar el microambiente bioquímico de estas comunidades microbianas representa un
campo inexplorado donde se puede ahondar para entender su ecología y fisiología, además
de explotar su potencial biotecnológico.
Pero ¿cómo estudiar la relación que se presenta entre cada uno de los grupos microbianos de
una biopelícula? Primeramente, debemos reconocer la dificultad que representa atribuir la
síntesis de un compuesto determinado a un solo grupo microbiano dentro de una comunidad
compleja. Por lo tanto, es más conveniente trabajar con microorganismos en cultivo axénico,
y preferentemente con los colonizadores e iniciadores de la biopelícula. Para, después de
esto, ampliar las observaciones a comunidades más complejas.
28
4. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
En contexto, se puede decir que:
Los fotoautótrofos, especialmente las cianobacterias, son los organismos que
generalmente inician la formación de las SABs y los que contribuyen con el mayor
aporte de carbono y nitrógeno a la misma.
El desarrollo de las SAB depende de la síntesis de EPS por bacterias heterótrofas y
cianobacterias.
Las cianobacterias presentan comportamiento de cooperación celular para la
producción de toxinas, pigmentos y polímeros. Por lo que es probable que este
comportamiento se relacione con un sistema de comunicación microbiana semejante
al sistema de quorum sensing de las bacterias heterótrofas.
Existen un reporte en el que se han detectado AHLs producidas por cianobacterias en
cultivo axénico, pero su relación con la producción de biopelículas sigue en discusión.
Además, se ha demostrado que las cianobacterias pueden responder a AHLs
producidas por bacterias heterótrofas, cambiando su comportamiento para adaptarse
al entorno.
No obstante la información que se ha publicado sobre la importancia de la producción de
EPS por las cianobacterias para el desarrollo de las SABs, quedan algunos puntos por
resolver:
¿Qué sistema usan las cianobacterias para coordinarse?
¿La síntesis de EPS y la formación de biopelículas por las cianobacterias tiene
relación con un sistema de quorum sensing?
¿Pueden las cianobacterias responder a las señales de las bacterias heterótrofas?
Este trabajo se enfocó en tratar de responder si la producción de EPS en cianobacterias
provenientes de SABs se relaciona con un sistema de comunicación tipo quorum sensing,
Para el desarrollo este trabajo se estudió una cianobacteria proveniente de una SAB, la cual
se desarrollaba sobre la superficie de un monumento de roca. Se hizo esta selección debido
29
a la relación de las SABs con la conservación del Patrimonio Cultural y nuestro interés en
este problema. Lo anterior, debido a que actualmente los métodos para regular el crecimiento
de las SAB sobre las superficies de los monumentos se basa en tratamientos físico-químicos
de remoción sin tomar en cuenta las posibles métodos de control biológico. Entender el
mecanismo por el cual estas cianobacterias se coordinan para formar biopelículas puede
aportar información alternativa para el control del desarrollo de SABs en monumentos de
roca. Sin dejar a un lado el impacto ecológico y biotecnológico de comprender la relación
entre un sistema de comunicación y la síntesis de EPS en estos microorganismos.
5. HIPÓTESIS
Las cianobacterias de biopelículas subaéreas se coordinan para producir sustancias
poliméricas extracelulares mediante un sistema comunicación tipo quorum sensing.
6. OBJETIVOS
a. Objetivo General
Evaluar si la producción de sustancias poliméricas extracelulares en cianobacterias de
películas subaéreas se relaciona con un sistema de quorum sensing.
b. Objetivos Específicos
i. Obtener cultivos axénicos de cianobacterias formadoras de SABs que sirvan como
modelo de estudio.
ii. Evaluar la síntesis de autoinductores tipo quorum sensing.
iii. Evaluar la síntesis y composición de EPS en relación a la densidad celular y la síntesis
de autoinductores.
iv. Determinar el efecto de inductores e inhibidores de QS en la producción de EPS.
30
7. MATERIALES Y MÉTODOS
El trabajo experimental se dividió en 3 etapas:
1ª) La obtención de cianobacterias con la capacidad de formar biopelículas.
2ª) El estudio de la producción de EPS por las cianobacterias en relación a un sistema
de comunicación microbiana.
3ª) El análisis del efecto de inductores e inhibidores de quorum sensing en la
producción de EPS. Fue necesario concluir la primera etapa para continuar con la
segunda y la tercera, que se realizaron en paralelo. La primera etapa corresponde al
objetivo i. Los objetivos ii y iii se incluyen en la segunda etapa. El objetivo iv se
cubrió en la tercera etapa.
7.1.1. Material biológico
Se usaron las cepas biorreporteras de señales tipo AHL Chromobacterium violaceum CV026
adquirida del cepario de CINVESTAV-IPN Zacatenco y la cepa Agrobacterium tumefaciens
KY52 donada por el Dr. Jun Zhu Profesor asociado del Laboratorio de Microbiología de la
Universidad de Pensilvania.
Se usó la cepa Pseudomonas syringae patovar phasiolicola DC3000 del cepario del
laboratorio de Fisiología y Defensa de las Plantas del CINVESTAV Irapuato como control
positivo en la producción de decanoil homoserina lactona.
7.1.2. Solventes y reactivos
Los medios de cultivo empleados fueron el BG-11 (Apéndice 11.1) para cianobacterias, el
LB para C. violaceum CV026 y P. syringae DC3000, y el AT (Apéndice 11.7) para A.
tumefaciens KY52. Todos los componentes de los medios BG-11 y AT fueron grado reactivo
o bacteriológico, adquiridos principalmente de industrias KEM de León. El caldo LB y el
agar bacteriológico se adquirieron de SIGMA-Aldrich.
El agar para preparar el medio BG-11 requiere ser procesado para eliminar residuos que
afectan el crecimiento de las cianobacterias, se hidrata y se incuba a temperatura ambiente
31
con agua en proporción 1:10 (w/v) durante 3 h, después se filtra al vacío con un filtro Büchner
y se incuba con acetona en proporción 1:5 (w/v) durante 3 h a temperatura ambiente,
finalmente se filtra de nuevo al vacío y se deja secar en estufa a 60°C hasta evaporar toda la
acetona.
Todos los solventes utilizados para las extracciones y análisis de GC/EIMS fueron grado
HPLC, y se adquirieron de diversas compañías, principalmente de SIGMA-Aldrich y KEM.
7.1.3. Microscopía
Las observaciones de microscopía óptica de campo claro se realizaron en un microscopio B3
Professional Series modelo DMB3-223 (Thomas Scientific Co., New Jersey, US). Las
observaciones de microscopía óptica de contraste de interferencia diferencial se realizaron
en un microscopio Nomarski Leica DM6000 B. Las muestras no tuvieron procesamiento y
observándose en fresco.
La microscopía electrónica de barrido se realizó en un microscopio modelo JSM-5910LV
(JEOL, Ltd., Tokio, JA). Las muestras se fijaron y deshidrataron de acuerdo a Li y Brand
(2007), para posteriormente cubrirse con una capa de oro producida por pulverización
catódica en un Denton Vacuum Desk II XLS.
7.2. Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas con ionización por
impacto de electrones (GC/EIMS)
Para los análisis por GC/EIMS se usaron dos equipos. Uno de los equipos está compuesto
por un cromatógrafo de gases (GC) modelo 7890A acoplado a un detector de masas con
ionización por impacto de electrones (EIMS) modelo 5973 (Agilent Technologies, Inc.,
USA). El otro está compuesto por un GC modelo 7890A acoplado a un espectrómetro de
masas con detector de triple eje modelo 5975 (Agilent Technologies, Inc., USA). Se usaron
dos inyectores automáticos modelo 7693A (Agilent Technologies, Inc., USA), uno en cada
sistema GC/EIMS. Se usaron los automuestreadores modelo 7683 y 7693 (Agilent
Technologies, Inc., USA) para los sistemas 5973 y 5975, respectivamente.
32
7.3. Cromatografía de capa fina (TLC)
Los análisis de TLC se realizaron usando un sistema multietapa compuesto de un aplicador
automático modelo ATS4, una cámara de desarrollo automática modelo ADC2 y un
visualizador automático con registro digital modelo TLC Visualizer 2, todos ellos de marca
CAMAG (Muttenz, CHE).
7.4. Software
Para la obtención y procesamiento de las microscopías ópticas se usó el software Motic Image
Plus versión 2.0 (MOTIC, Xiamen, CN). Las microscopías electrónicas de barrido se
adquirieron y procesaron con el software JSM-6490LV (JEOL, Ltd., Tokio, JA).
En la adquisición y procesamiento de los datos de GC/EIMS se usó el software MassHunter
Workstation versión B.06.00 (Agilent Technologies, Inc., USA). La determinación del
tiempo de retención y la extracción del espectro de masas de cada componente en un
cromatograma problema se realizó usando el software libre Automated Mass Spectral
Deconvolution and Identification System "AMDIS" (http://www.amdis.net/). La
identificación de algunos compuestos se realizó usando el software, base de datos y biblioteca
de espectros de masas NIST MS Search versión 2.0 2008 (National Institute of Standards and
Technology, USA).
El procesamiento de los datos de TLC se realizó con el software WinCATS Planar
Chromatography Manager (CAMAG, Muttenz, CHE).
Los análisis estadísticos se realizaron usando el software IBM SPSS Statistics versión 22
(IBM Corp., New York, USA).
Los análisis filogenéticos se realizaron en software MEGA versión 6
(http://www.megasoftware.net/)
El modelado del crecimiento microbiano se realizó con la ayuda del software SciDAVis
(http://scidavis.sourceforge.net/).
33
7.5. Obtención de cultivos axénicos de cianobacterias formadoras de SABs
7.5.1. Muestreo
Todos los materiales utilizados en el muestreo, aislamiento y cultivo de los microorganismos
fueron esterilizados por calor húmedo en autoclave, con excepción de las cajas Petri plásticas
que se compraron pre-esterilizadas.
Para la elección de los sitios de estudio se consultó con la Lic. Gisela Cuen Garibi, Delegada
del Centro INAH Guanajuato. De su recomendación, enfocada a monumentos
representativos del Estado, se eligieron la Zona Arqueológica de Cañada de la Virgen y el
Museo Regional de la Alhóndiga. El objetivo de muestrear más de un sitio fue tener
variabilidad en las comunidades microbianas, en las que posteriormente se pudieran
encontrar cianobacterias con capacidad para formar biopelículas. Los puntos de muestreo se
determinaron por inspección directa, tratando de muestrear las SABs más amplias y con
distintas macromorfologías, según Gaylarde et al., 2012. Se aplicó la técnica no destructiva
de la cinta adhesiva descrita por Cutler et al., 2012.
7.5.2. Sitios de colecta
a) Zona arqueológica de Cañada de la Virgen
Descripción del sitio. La zona arqueológica de Cañada de la Virgen se encuentra ubicada en
el municipio de San Miguel de Allende a 16 km de la cabecera municipal, en el estado de
Guanajuato. Esta zona fue la cabecera o Teocalli del poder político y religioso de la cuenca
central del Río Laja. El panorama histórico de la región comenzó alrededor del año 100 de
nuestra era con la tradición Chupícuaro (“chupicua” nombre de una planta del género Ipomea
usada para obtener un tinte azul; y “ro” lugar; entonces chupícuaro = “lugar azul”). La
tradición Chupícuaro se estableció a lo largo de los bancos de ríos, esparciéndose a la mayoría
del territorio guanajuatense y convirtiéndose en una de las culturas Mesoamericanas más
influyentes durante alrededor de 500 años. Este asentamiento fue fundado por el pueblo
Otomí y alcanzó su esplendor entre el 600 y 900 de nuestra era. Esta zona fue un importante
centro de observación astronómica en donde se realizaban rituales que marcaban el inicio de
los ciclos de cacería y recolección. La principal edificación en Cañada de la Virgen es una
34
estructura arquitectónica conocida como “El complejo A” o “Casa de los Trece Cielos”
(20°51'30.0" N, 100°55'41.8" O), Figura 7. Esta estructura está compuesta de un patio central,
un basamento piramidal, un templo superior, y escalinatas que rodean el patio central (Noé
Porter 1956; Zepeda-García-Moreno 2008, 2010).
Figura 7. Sitio arqueológico de Cañada de la Virgen. Complejo A o “Casa de los trece cielos”. A)
Vista aérea, imagen original tomada de Internet. B) Mural del Templo Rojo. C) Vista panorámica
del patio central. La flecha roja indica un punto de muestreo cerca del canal de desagüe. Las
etiquetas corresponden con los códigos de las muestras de biopelículas.
35
b) Museo Regional de la Alhóndiga de Granaditas
Descripción del sitio. El Museo Regional de la Alhóndiga se encuentra ubicado en el Centro
Histórico de la ciudad de Guanajuato, en un ambiente completamente urbanizado por lo que
sus muros se encuentran continuamente expuestos a los vapores y gases provenientes de la
combustión de gasolinas. Esta edificación data de la época colonial (1809) y está ligada
históricamente a la Guerra de Independencia, ya que fue clave en la toma de la ciudad en el
año de 1810 (Centro INAH Guanajuato 2012). La Figura 8 muestra algunas imágenes de este
edificio.
Figura 8. Museo regional de la Alhóndiga de Granaditas. A) Vista aérea del inmueble tomada de
Google Earth. B) Punto de muestreo de la biopelícula oscura de la azotea. C) Biopelícula que se
desarrollaba sobre la pared noroeste. Las etiquetas corresponden con los códigos de las biopelículas
muestreadas.
36
7.5.3. Aislamiento, purificación y selección de microorganismos
El enriquecimiento y mantenimiento de los microorganismos se realizó en medio de cultivo
BG-11 líquido y sólido (Waterbury 2006), así como en fragmentos de toba volcánica
esterilizados y humedecidos. La toba fue obtenida en una cantera ubicada a las afueras de
Guanajuato capital en la carretera Guanajuato-Irapuato. La inoculación se realizó colocando
un fragmento cuadrado de biopelícula de aproximadamente 0.5 mm de lado en el respectivo
medio. El cultivo se realizó en un cuarto de crecimiento con fotoperiodo de 16 h luz / 8 h
oscuridad, densidad de flujo fotosintético de 40 µmol s-1 m-2 y la temperatura de 25 °C. Se
usaron estas condiciones como factor de selección para fotoautótrofos.
Para el aislamiento se utilizaron las técnicas microbiológicas de diluciones seriadas, estría
cruzada y de la pipeta Pasteur. Se utilizó medio BG-11 líquido y sólido, según fue requerido
(Benson 2001). La axenicidad se comprobó cultivando los aislados en medio nutritivo LB y
medio BG-11 (Zhai et al., 2012) y a través del monitoreo en el microscopio óptico con y sin
tinción simple de safranina.
La selección de las cepas se realizó en base a su capacidad de formar biopelículas, lo cual se
verificó por observación directa del cultivo con dos semanas de crecimiento.
7.5.4. Identificación y caracterización de los microorganismos
a) Identificación morfológica
Se determinaron las características de morfología celular mediante técnicas microscópicas
clásicas (Benson 2001). Para las cianobacterias es posible determinar el género de acuerdo a
la morfología celular (Rippka et al. 1979; Waterbury 2006; Komárek 2008; Lee 2008;
Komárek et al. 2014).
b) Identificación molecular
Extracción del ADN. A 50 mg de material celular se le agregó 500 mL de solución de
extracción Nicholson y se molieron usando perlas de vidrio con el mismo volumen que el
material celular en un tubo de 2 mL, agitando durante 15 minutos en vortex. Posteriormente,
37
se agregaron 50 uL de mezcla fenol-cloroformo proporción 1:1 (v/v) y se incubó en un
Thermomixer comfort (Eppendorf, USA) a temperatura ambiente y 1,400 rpm. Después, se
centrifugó a 12,000 rpm por 15 min, la fase acuosa (fase superior) se transfirió a un tubo de
1 mL agregándole 2.5 uL de RNAasa [10 mg mL-1] y se incubó durante 30 min a 37 °C.
Pasado el tiempo de incubación, se agregaron 0.33 volúmenes de isopropanol frío y se mezcló
suavemente. Para precipitar el ADN Se incubó durante 30 min a -20 °C. Se centrifugó a
12,000 rpm durante 10 min y se decantó el sobrenadante, la pastilla de ADN se lavó con
etanol al 70% a 4 °C, agitando hasta desprender la pastilla. Se centrifugó una vez más a
12,000 rpm durante 5 min. La pastilla se secó en la campana de flujo laminar por
aproximadamente 15 min. Finalmente, la pastilla de ADN se resuspendió en 30 uL de buffer
TE 1x. La integridad del ADN se verificó en un gel de agarosa al 1%.
Amplificación del gen completo 16S. La ampliación del gen completo 16S
(aproximadamente 1,600 pb) se realizó utilizando el par de oligonucleótidos 27F (5’-
AGAGGTTTGATCCTGGTCAG-3’) y R1494 (5’-CTACGGRTACCTTGTTACGAC-3’).
La mezcla para la reacción de amplificación estuvo compuesta de 1 ng de ADN por cada uL
de reacción de PCR: buffer regulador a concentración final de 1x, dNTPs a concentración
final de 0.2 mM (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), MgCl2 a concentración final de 2.5 mM,
DMSO a concentración final de 0.5% (v/v), cada oligonucleótido a concentración final de
0.2 uM y una unidad de ADN Taq polimerasa (QIAGEN, Hudson, NH, USA). El programa
para la PCR consistió un paso de desnaturalización inicial a 95°C durante 2 min, seguido de
25 ciclos térmicos (40 s a 95°C, 30 s a 55°C y 1.5 min a 72°C) y posteriormente a los ciclos,
un paso de extensión final a 72°C durante 7 min. Una vez terminada la reacción se verificó
la integridad del producto de la PCR en un gel de agarosa al 1%.
Clonación del gen completo 16S. La clonación se realizó utilizando el vector pJET1.2/blunt
y el kit de clonación CloneJET PCR Cloning Kit (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA).
El proceso para la ligación, transformación, análisis de clonas recombinantes, PCR de las
colonias recombinantes y extracción del ADN plasmídico se realizó siguiendo el protocolo
del fabricante (http://101.200.202.226/files/prod/manuals/201210/18/449454001.pdf). La
transformación se hizo usando células quimio-competentes de la cepa DH5α de Escherichia
coli, proporcionadas por la I.Q. Nélida Vázquez del Laboratorio de Interacciones
38
Microbianas (CINVESTAV Irapuato). Se evaluaron un total de 15 clonas creciéndolas en
medio LB con una concentración de carbenicilina de 10 mg L-1. La presencia del inserto del
gen 16S se comprobó mediante la digestión del plásmido previamente extraído, y el análisis
del DNA hidrolizado en un gel de agarosa al 1%.
Secuenciación del gen completo 16S y análisis filogenético. La región del ADN plasmídico
que contenía el inserto del gen completo 16S se secuenció usando los siguientes cebadores
pJET1.2Fw (5’-CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC-3’),
16S-515Fw (5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’) y
pJET1.2Rv (5’-AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG-3’)
mediante la plataforma de secuenciación capilar Sanger. La calidad de la secuencia obtenida
se verificó manualmente usando el software MEGA 6. Una vez comprobada la calidad y
longitud de la secuencia (1,498 pb) se realizó una búsqueda basic local alignment seach tool
“BLAST” (National Center for Biotechnology Information “NCBI”,
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) con el objetivo de identificar las coincidencias más
cercanas para la secuencia. De la lista de secuencias encontradas con el BLAST se eligieron
las 50 con los mayores valores de score, query cover, e identity, así como el menor valor de
e-value. Las secuencias obtenidas del NCBI (Tabla 1) y la secuencia problema se alinearon
usando la herramienta MUSCLE de MEGA 6. Una vez realizado el alineamiento, el resultado
se inspeccionó manualmente. Para construir la filogenia de las secuencias alineadas se
procedió a buscar el mejor modelo de sustitución de nucleótidos usando la herramienta “Find
the best DNA model” de MEGA 6. Una vez seleccionado el mejor modelo para la
construcción de la filogenia se obtuvo el árbol filogenético por el método de máxima
verosimilitud (Maximun Likelihood Tree) con un valor de bootstrap = 1000, para este paso
también se usó MEGA 6.
Filogenia y estructura secundaria de la región ITS. El mismo proceso de PCR, clonación
y secuenciación usado para el análisis del gen 16S se siguió para obtener la secuencia
completa de la región ITS 16S-23S, con las siguientes modificaciones: el par de
oligonucleótidos usado para la PCR fue VRF5Fw (5’-TGTACACACCGGCCCGTC-3’) y
VRF1Rv (5’-CTCTGTGTGCCTAGGTATCC-3’) (Johansen et al. 2011), y el cebador usado
para la secuenciación fue pJET1.2Fw.
39
La filogenia basada en la región ITS se construyó comparando la secuencia problema con las
secuencias depositadas en el GenBANK, los números de acceso de las secuencias se listan
en la Tabla 1. Para construir la filogenia se descargaron las secuencias con los valores más
altos de score, query cover e identity, asi como con los valores más bajos de e-value. Se
consideraron solamente aquellas secuencias con al menos 350 pb de longitud y con
asignación al menos de género. Como grupo externo se usó secuencia de la región ITS de
Gloeobacter violaceus. La matriz de secuencias se alineó usando la herramienta MUSCLE y
el alineamiento fue examinado manualmente. El árbol filogenético se construyó usando el
método de máxima verosimilitud, seleccionado el mejor modelo de substitución (K2 + G) y
con bootstrap de 1,000.
Para llevar a cabo el análisis de la estructura secundaria las secuencias de la región ITS se
doblaron usando la plataforma en línea Mfold Web Server
(http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form, Zuker 2003), se seleccionaron
los parámetros por defecto y condiciones de predicción de estructura secundaria con mínimo
de energía libre. La secuencia de los genes tRNA se determinó usando el software tRNAscan-
SE versión 1.21 (http://lowelab.ucsc.edu/tRNAscan-SE/). Para determinar la variabilidad
intergénica entre la secuencia problema y algunas secuencias de especies relacionadas se
analizaron las estructuras secundarias de las hélices D1-D1’, Box-B, V2 y V3. Las estructuras
secundarias fueron redibujadas usando Adobe Illustrator CS6 version 16.0.0 (Adobe Systems
Inc.).
Perfil de ácidos grasos. Estudios recientes han reportado el uso del perfil de ácidos grasos
como marcador taxonómico para microalgas, incluidas cianobacterias (Lang et al. 2011).
Con el propósito de obtener información taxonómica adicional del aislado, se obtuvo su perfil
de ácidos grasos aplicando el siguiente protocolo: A 50 mg de material celular fresco se le
adicionó 1 mL de NaOH 0.5 M en metanol, incubándose a 90 °C durante 1h. Posteriormente,
se dejó enfriar a temperatura ambiente y se adicionó 1 mL de BF3 en metanol, incubándose
a 90°C durante 30 min. Luego, se dejó enfriar a temperatura ambiente y se adicionaron 2 mL
de agua destilada y 4 mL de hexano, y se emulsionó en vortex. Después, se centrifugó a 3,000
rpm y se separó la fase hexánica superior. Finalmente, la fase hexánica que contenía los metil
ésteres de los ácidos grasos se secó con flujo de N2, el residuo se redisolvió en 200 uL de
40
isooctano para analizarse inmediatamente por GC/EIMS. Se adicionó ácido heptadecanoico
a concentración final de 150 ng uL-1 como estándar interno.
7.5.5. Evaluación del pH óptimo de crecimiento
La capacidad del aislado para sobrevivir y crecer a distintos valores de pH se probó
cultivándolo en medio BG-11 líquido. El pH se ajustó con HCl 1 M o con NaOH 2 M. Los
experimentos se realizaron en matraces Erlenmeyer de 125 mL conteniendo 50 mL de medio.
Se probaron valores de pH de 4, 6, 7, 8, 10 y 12. Los matraces se incubaron durante 21 días
con fotoperiodo de 16 h luz (40 µmol s-1 m-2) / 8 h oscuridad y agitación constante de 150
rpm, el valor de pH se midió al final de la incubación. El crecimiento se determinó en base
al peso seco. Los experimentos se realizaron por triplicado.
7.5.6. Herborización de especímenes
El material celular fue herborizado por el Dr. José Luis Godínez Ortega del Instituto de
Biología de UNAM. La técnica usada para la herborización fue la del papel encerado sin
fijación química.
Holotipo: una muestra seca del cultivo de la cepa Nodosilinea chupicuarensis PC471 bajo la
designación MEXU 4813 en el Herbario Nacional de la Universidad Nacional Autónoma de
México.
Isotipos: 4814, 4815.
7.6. Evaluación de la síntesis de autoinductores tipo quorum sensing
7.6.1. Condiciones de cultivo y cinética de crecimiento
La cinética de crecimiento se determinó usando matraces de 125 mL conteniendo 50 mL de
medio de cultivo BG-11. El crecimiento se estimó de acuerdo a la producción de biomasa en
peso húmedo y seco, así como el contenido de clorofila-a (Sartory y Grobbelaar 1984)). El
cultivo se realizó durante 42 días muestreando a los 7, 15, 21, 28, 35, y 42 días. Las curvas
de crecimiento se modelaron usando el software libre SciDAVIS aplicando la ecuación de
crecimiento bacteriano:
41
Tabla 1. Número de acceso de GenBank de las secuencias usadas para el análisis
filogenético
Especie Código de la cepa Número de acceso para la
secuencia del gen 16S
Número de acceso para
la secuencia de la región
ITS
Nodosilinea chupicuarensis** PC471/CIB87 KX859298.1 KX859296.1
Leptolyngbya sp. 0BB32S02 AJ639894.1
Leptolyngbya sp. LEGE 07298 HM217044.1
Nodosilinea nodulosa LEGE 06104 KU569325.1
Leptolyngbya sp. MX1 GQ848193.1
Leptolyngbya sp. 0BB24S04 AJ639893.1
Leptolyngbya subtilissima EcFYyyy700 KC463197.1
Leptolyngbya sp. 0BB19S12 AJ639895.1
Nodosilinea nodulosa UTEX 2910A KF307598.1
Leptolyngbya margaretheana 1T12 FR798934.1
Leptolyngbya sp. LEGE 07314 HM217061.1
Leptolyngbya sp. LEGE 07080 HM217085.1
Nodosilinea nodulosa UTEX 2910B EF122600.1 KF307598.1
Leptolyngbya sp. PCC7104 AB039012.1 AY768381.1
Nodosilinea sp. CENA147 KC695841.1
Nodosilinea sp. CENA183 KC695874.1
Nodosilinea sp. CENA137 KC695831.1
Nodosilinea sp. IkpPStn44 KM438183.1 KM438183.1
Nodosilinea sp. CENA167 KC695860.1
Nodosilinea cf. nodulosa LEGE 10377 JQ927349.1
Leptolyngbya sp. LEGE 07084 HM217072.1
Leptolyngbya sp. LEGE 07312 HM217066.1
Nodosilinea sp. CENA322 KT731143.1
Nodosilinea sp. CENA323 KT731144.1
Leptolyngbya sp. KIOST-1 JX401929.1 JX401929.1
Nodosilinea sp. CENA523 KF246490.1
Nodosilinea sp. CENA512 KF246481.1
Nodosilinea sp. CENA522 KF246489.1
Leptolyngbya sp. LEGE 07091 HM217068.1
Nodosilinea sp. CENA144 KC695838.1
Leptolyngbya antarctica ANT.LACV6.1 AY493589.1 AY493632.1
Gloeobacter violaceus PCC 7421 NR_074282.1 AY768373.1
Nodosilinea bijugata PACC 8602 KF770966.1
Nodosilinea epilithica Kovacik 1998/7 HM018677.1
Leptolyngbya antarctica LCR-CYANT27 KM052845.1
Oscillatoria sp. CCMEE AM398957.1
Leptolyngbya antarctica ANT.LAC.1 AY493633.1
Nodosilinea sp. ATA11-6B-CV9 KJ939097.1
Nodosilinea sp. ATA11-6K-CV21 KJ939096.1
Nodosilinea sp. ATA11-6B-LB2 KJ939098.1
Phormidium sp. AA AM398947.1
Leptolyngbya sp. BL0902 JN376077.1
Nodosilinea epilithica Kovacik 1990/52 HM018679.1
Nodosilinea sp. WJT8-NPBG4 KJ939093.1
Nodosilinea sp. CXA007.4 KJ939094.1
Nodosilinea sp. FI2-2HA2 HM018678.1
Nodosilinea bijugata Kovacik 1986/5a EU528669.2
Nodosilinea sp. CMT-3FSIN-NPC22B KJ939095.1
Leptolyngbya sp. CCAP 1442/1 HE975019.1
Phormidium sp. OL 05 AM398977.1
Haloleptolyngbya alcalis KR2005/106 JN712771.1 **Cepa aislada en este trabajo.
42
Ecuación 7.1: [𝐵𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎] =𝑘
1+𝑒𝑤−𝑥𝑝
Dónde: k = carga del sistema,
w = tiempo al que se llega a la mitad de la carga del sistema,
p = tiempo de generación
Los cultivos para evaluar la producción de señales químicas se realizaron en medio BG-11
líquido. Se cultivó en matraces Erlenmeyer de 1L conteniendo 600 mL de medio. El cultivo
se realizó durante 42 días muestreando a los 7, 15, 21, 28, 35, y 42 días. Adicionalmente, se
evaluó la producción de señales en medio BG-11 conteniendo 1.5 g L-1 de casaminoácidos y
150 mg L-1 de triptófano. La adición de aminoácidos al medio de cultivo incrementa la
síntesis de señales químicas en las bacterias (Hanzelka y Greenberg 1996a; Val y Jr 1998;
Fontecave, Atta y Mulliez 2004; Williams et al. 2007).
7.6.2. Síntesis enzimática de AHLs
La síntesis de las AHLs se realizó enzimáticamente usando la lipasa inmovilizada de Candida
antarctica (CAL, Sigma-Aldrich), y como precursores un ácido carboxílico saturado de la
serie C4, C6, C8, C10, C12, C14 y C16 y el bromhidrato de la homoserina lactona. La síntesis
se realizó en un sistema no acuoso y condiciones anhidras. La metodología fue la descrita
por Nieto-Álvarez (2009), con algunas modificaciones: el hidrobromuro de la N-homoserina
lactona se activó con N,N-diisopropiletil lamina, en relación molar 18:1 y como solvente 3
mmL de alcohol tert-amílico. La mezcla se agitó a 70°C durante 30 min. Posteriormente, se
adicionó el respectivo ácido graso (1 mmol), 50 mg de CAL y 20 mg de sulfato de sodio
anhidro. El sistema se dejó reaccionar por 24 h a 70°C. Después de efectuada la reacción, la
enzima se separó por centrifugación se añadieron 3 mL de agua desionizada y 3 mL de acetato
de etilo. La mezcla de emulsionó y se mantuvo en reposo hasta la aparición de 2 fases. La
fracción superior de acetato de etilo se recuperó y la fracción acuosa se extrajo 2 veces más
con 2 mL de acetato de etilo. Las fracciones de acetato de etilo se combinaron y el solvente
se evaporó con la ayuda de un flujo de nitrógeno gaseoso. El producto crudo se purificó
usando placas preparativas de sílica gel (20 cm x 20 cm x 0.5 mm). La fase móvil consistió
en acetona/hexano (1:1 v/v).
43
7.6.3. Extracción de señales tipo QS
Los cultivos axénicos de la cepa P. syringae DC3000 y de las cepas bacterianas heterótrofas
obtenidas en el proceso de aislamiento de cianobacterias se utilizaron para estandarizar la
extracción e identificación de autoinductores tipo QS. Los cultivos se realizaron en medio
LB líquido con una agitación constante de 120 rpm, incubando a 28°C los aislados
bacterianos y a 37°C la cepa de P. syringae.
La extracción de las señales químicas se efectuó de acuerdo a los métodos descritos por
Rumbaugh (2011). Se centrifugó el cultivo y se separó el medio libre de células. El medio se
aciduló con HCl 1N hasta un pH de 2 y se extrajo tres veces con un volumen igual de acetato
de etilo cada vez. Después, se mezclaron las fracciones de acetato de etilo y se evaporó a
sequedad. Posteriormente, se resuspendió en 1 mL de etanol y se almacenó a -20°C para su
posterior análisis por GC/EIMS y pruebas de bioactividad. Además de extraer los metabolitos
del medio de cultivo libre de células, la pastilla celular se extrajo con etanol con el fin de
investigar si las señales se concentran en las biopelículas, ya que en algunos reportes se ha
sugerido que ésta puede ser una de las funciones de las EPS (Flemming y Wingender 2010)
y hasta el momento no se ha probado. Esta metodología se aplicó para cada tiempo de la
cinética de crecimiento.
7.6.4. Análisis de señales químicas mediante GC/EIMS
Los extractos obtenidos se analizaron mediante cromatografía de gases acoplada a
espectrometría de masas con ionización por impacto de electrones (GC/EIMS) como sigue:
a) Método de temperatura inicial alta
Se usó el equipo GC 7890A-EIMS 5975 y la columna DB-1MSUI (Agilent Technologies).
Se inyectó 1 µL en el modo sin partición. La temperatura de la cámara de inyección fue de
250°C. Se utilizó helio como gas acarreador a flujo constante de 1 mL min-1. El programa de
temperaturas del horno del GC inició a 150°C y así se mantuvo por 3 minutos, después se
aplicó una rampa de temperatura de 4°C min-1 hasta alcanzar 300°C y se mantuvo durante 20
minutos. La temperatura de la línea de transferencia al MS fue de 250°C. Las temperaturas
44
de la fuente de ionización y del cuádruplo fueron de 230°C y 150°C, respectivamente. Las
mediciones se efectuaron en el modo SCAN con un rango de masas de 40-550 m/z, se operó
a 2.9 scans s-1. Los espectros de masas se obtuvieron a 70 eV. Los datos fueron colectados
con el software MassHunter Workstation. El tiempo de retención y el espectro de masas de
cada componente se depuraron con el software “AMDIS”. La identificación de los
compuestos se realizó por comparación de espectros de masas usando el software NIST y la
base de datos MS2011 de la misma compañía. Este método permite analizar la mayoría de
las señales de QS, de acuerdo al número de carbonos (C10 – C30).
b) Método de temperatura inicial baja
El método de baja temperatura usa las mismas condiciones del método anterior, exceptuando
el programa de temperaturas del horno, el cual es como sigue: temperatura inicial de 50°C
manteniéndose durante 5 min, después se aplicó una rampa de 10°C min-1 hasta alcanzar
300°C y se mantuvo durante 30 min. Este método permite detectar compuestos de menor
número de carbonos, desde C4, además se obtiene mejor resolución entre picos adyacentes.
Pero tiene la desventaja de que compuestos de más de C25 podrían retenerse en la columna
entre corridas.
7.6.5. Ensayo de la actividad QS con biorreporteros
El estudio de la actividad quorum sensing de los extractos obtenidos en la actividad 7.5.3 se
realizó con las cepas bacterianas biorreporteras Chromobacterium violaceum CVO26 que
responde a AHLs de 4 a 8 carbonos produciendo un antibiótico de color púrpura conocido
como violaceina, y Agrobacterium tumefaciens KYC55 que responde a AHLs desde 4 hasta
14 carbonos presentando actividad beta-galactosidasa. Se usó la metodología descrita por
Zhai et al. (2012) y el protocolo proporcionado por el Dr. Jun Zhu (Joelsson et al. 2005).
45
7.6.6. Búsqueda in silico de los genes de sintasas y receptores de señales quorum sensing
en los genomas de cianobacterias
Se realizó una búsqueda con BLAST con los datos moleculares de cianobacterias
depositados en el GenBank (NCBI 2017, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) para cada
uno de los genes de las distintas sintasas y receptores de las señales de quorum sensing
reportados a la fecha.
Además, se realizó una búsqueda utilizando los datos de la secuencia de aminoácidos de
dichas sintasas y receptores. Los números de acceso de las secuencias de las sintasas y
receptores se listan en la Tabla 2.
7.7. Evaluación de la síntesis y composición de EPS en relación a la densidad celular
y la síntesis de autoinductores
7.7.1. Análisis microscópico del desarrollo de la biopelícula
El desarrollo de las biopelículas se evaluó semicuantitativamente mediante la medición del
área de polímero teñido con azul de alcian, este colorante tiene afinidad por los polisacáridos
aniónicos como es el caso de los EPS de cianobacterias (Rossi et al. 2012). Se efectuaron
Tabla 2. Número de acceso para las secuencias de los genes y proteínas de
las sintasas y los receptores de señales de quorum sensing en bacterias
GENES PROTEÍNAS
Gram negativos Gram negativos
Sintasa Número de
acceso Receptor
Número de
acceso Sintasa
Número de
acceso Receptor
Número de
acceso
luxI AY275714.1 luxR DQ108980.1 LuxI AAP22376.1 LuxR CAA68561.1
luxM DQ987706.1 luxN L13940.1 LuxM BAF43686.1 LuxN BAF43687.1
HdtS AF286536.1 HdtS CAK13009.1
SdiA JQ993366.1 SdiA AFN80302.1
Gram positivos Gram positivos
AfsA AB462507.1 ArpA AB021882.1 AfsA BAH47547.1 ArpA BAA36282.1
AgrA AY183373.1 AgrC AY183373.1 AgrA ALY21623.1 AgrC ABX60402.2
ComD U76218.1 ComE U76218.1 ComD AAC44896.1 ComE AAC44897.1
Sistema universal Sistema universal
LuxS AB114425.1 LuxP U07069.2 LuxS BAF43654.1 LuxP AAA20837.2
LuxQ U07069.2 LuxQ AAA20838.1
46
observaciones en el microscopio óptico para determinar, grosso modo, la extensión y
características de las muestras. De este modo se monitoreó de manera rápida la producción
de EPS.
Tinción con azul de alcian. Se preparó una solución de ácido acético 0.5 M, Sol. A, y una
solución de azul alcian de 1 g (L ácido acético 0.5 M)-1, Sol. B. El protocolo consistió en
mezclar 1 mL o 50 mg de muestra con 8 mL de la solución A y 1mL de la solución B. Se
dejó teñir 6 h con agitación constante. Trascurrido el tiempo de incubación se centrifugó a
14000 rpm, se desechó el sobrenadante y la pastilla celular se lavó con 1 mL de agua destila.
Se centrifugó una vez más y la pastilla celular se resuspendió en agua destilada. Finalmente
se montó para su observación en el microscopio óptico.
Se realizaron observaciones en el microscopio electrónico de barrido con el objetivo de
analizar a detalle las características morfológicas superficiales de la biopelícula como tamaño
y formas celulares. Para la microscopía electrónica las muestras se analizaron con dos
metodologías; una consistió en observar las muestras sin preparación previa con bajo vacío
y la otra en deshidratar el material celular con glutaraldehído (Li y Brand 2007) para
posteriormente metalizarlo con una capa de oro con un Denton Vacuum Desk II XLS sputter
coater (Denton Vacuum, LLC, NJ, USA) y observarse con alto vacío.
7.7.2. Extracción de sustancias poliméricas extracelulares solubles (SEPS)
Las SEPS se extrajeron a los mismos tiempos que los puntos de muestreo de las cinéticas de
crecimiento: 7, 15, 21, 28, 35, y 42 días, de acuerdo a los métodos descritos por Volk et al.
(2006). El cultivo se centrifugó a 10000 rpm durante 15 min y se separó la pastilla celular
del medio libre de células. El medio se concentró hasta un 10% de su volumen en rotavapor
a 50°C. Posteriormente, el medio concentrado se calentó a 95°C durante 5 min para precipitar
proteínas. Se centrifugó a 10, 000 rpm y el sobrenadante se transfirió a un vaso de
precipitados previamente enfriado a 4°C. Al sobrenadante se le adicionó etanol absoluto a
4°C hasta obtener una relación 80% v/v (etanol/sobrenadante). Se agitó y se dejó reposar a
4°C hasta observase la aparición de los grumos de polímero. Se centrifugó a 5, 000 rpm a
4°C durante 5 minutos para formar la pastilla de polímero y el sobrenadante se desechó. La
47
pastilla se lavó con etanol al 80% a 4°C y se dejó secar a 60°C. Finalmente se pesó y se
almaceno a -20°C hasta su análisis.
7.7.3. Extracción de las sustancias poliméricas extracelulares de la cubierta celular
(CEPS)
Se probaron 4 tratamientos para la extracción de los CEPS: a) agua desionizada (≥ 16 MΩ);
b) NaCl, 1.7 M; c) Tween 20, 0.9 mM y d) NaCl, 1.7 M / Tween 20, 0.9 mM. La extracción
de las CEPS se realizó mediante la metodología descrita por Plude y Parker (1991), probando
cada una de las soluciones de extracción. El análisis semicuantitativo de la eficiencia de
extracción se realizó midiendo el área teñida con azul de alcian, que corresponde a la cantidad
de polímero. La eficiencia de cada solución de extracción se determinó calculando el
porcentaje de extracción comparando con una muestra no extraída.
La pastilla celular obtenida en la actividad 7.6.2 se extrajo con 2 mL de la solución que resultó
más eficiente (solución d). Después de agitar vigorosamente, se incubó a 40°C durante 30
minutos. Pasado el tiempo de incubación, se centrifugó a 12, 000 rpm durante 15 min. El
sobrenadante, que teóricamente contenía los polímeros, se colocó en un tubo de ensaye de
15 mL con rosca. La pastilla celular se lavó con 1 mL de agua destilada y se centrifugó
nuevamente a 12, 000 rpm por 15 min. Este sobrenadante se mezcló con el sobrenadante del
primer paso y se le añadió etanol absoluto a 4 °C hasta obtener una proporción del 80% v/v
(etanol/sobrenadante). La solución se refrigeró a 4 °C durante 12 h para provocar la
precipitación de los polímeros. Posteriormente se centrifugó a 5, 000 rpm a 4°C por 5
minutos. La pastilla de polímero se lavó con etanol al 80% y dejó secar a 60 °C. Una vez
seca, se pesó y se almacenó a -20 °C hasta su análisis.
7.7.4. Hidrólisis ácida de las EPS
Con el objetivo de conocer la composición de monosacáridos de las SEPS y CEPS, éstas se
hidrolizaron con una solución acuosa de HCl 4M en relación 1:20 (w/v). La mezcla polímero-
HCl se incubó a 110°C y el tiempo óptimo de reacción se determinó a partir de una cinética
de hidrólisis midiendo la concentración de monosacáridos libres a las 0.25, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5,
6 y 24 h. La concentración de monosacáridos libres se determinó mediante GC/EIMS. Una
48
vez completa la hidrólisis la solución fue neutralizada con NaOH 4M. La solución
neutralizada se liofilizó y el polvo se almacenó a -20°C hasta su análisis por GC/EIMS. No
se retiró el NaCl producido en la reacción de neutralización debido a que es eliminado en el
procesamiento para el análisis de los monosacáridos.
Determinación de hexosas totales. El contenido de hexosas totales se estimó mediante el
método de la antrona (Herbert, Phipps y Strange 1971), Apéndice 11.5.
7.7.5. Derivatización de los monosacáridos obtenidos por hidrólisis de las EPS
Se prepararon derivados trimetil-silanizados de los monosacáridos de acuerdo a Walford
(2010) y Ruiz-Matute et al. (2011), agregando 20 uL de piridina y 80 uL de BSTFA
adicionado con 1% de TMCS (Sigma-Aldrich, India). La mezcla se dejó reaccionar durante
30 minutos en un Thermomixer confort a 80° C y 950 rpm. Se dejó enfriar a temperatura
ambiente. Posteriormente, se adicionaron 100 uL de isooctano para un volumen final de 200
uL y se analizó por GC/EIMS.
7.7.6. Análisis de la composición de monosacáridos de las EPS mediante GC/EIMS
Los derivados silanizados se analizaron con el equipo GC 7890A/EIMS 5973 y la columna
ZB-1MS. Se inyectó 1 µL de muestra en el modo sin partición. La temperatura de la cámara
de inyección fue de 250°C. Se utilizó helio como gas acarreador a flujo constante de 1 mL
min-1. El programa de temperaturas del horno del GC inició a 150°C y así se mantuvo por 3
minutos, después se aplicó una rampa de temperatura de 4°C min-1 hasta alcanzar 280°C y
se mantuvo durante 25 minutos. La temperatura de la línea de transferencia al MS fue de
250°C. Las temperaturas de la fuente de ionización y del cuadrupolo fueron de 230°C y
150°C, respectivamente. Las mediciones se efectuaron en el modo SCAN con un rango de
masas de 50-550 m/z, se operó a 2.9 scans s-1. Los espectros de masas se obtuvieron a 70 eV.
Los datos fueron colectados con el software MassHunter Workstation. El tiempo de retención
y el espectro de masas de cada componente se determinaron con el software “AMDIS”. La
identificación de los compuestos se realizó usando el software y base de datos de espectros
de masas del NIST y a partir del análisis de los espectros de masas y tiempos de retención de
los derivados silanizados de estándares de D-arabinosa, D-fucosa, D-fructosa, D-galactosa,
49
D-manosa, D-ribosa, D-xilosa, L-ramnosa, ácido glucorónico, ácido galacturónico y N-
glucosamina. La cuantificación de cada monosacárido se realizó en base a una curva estándar
de D-glucosa-TMS.
7.8. Determinación del efecto de inductores e inhibidores del QS en la producción de
EPS
7.8.1. Determinación de la actividad quorum quenching de la piperina
La actividad quorum quenching del extracto de Piper nigrum sobre C. violaceum se demostró
en resultados obtenidos previamente en el Laboratorio de Fitobioquímica, así como evidencia
que sugirió que la piperina era uno de los componentes activos. Con el objetivo de determinar
el efecto de un inhibidor del quorum sensing sobre el desarrollo y la producción de EPS en
la cepa en estudio, primeramente se cuantificó la actividad quorum quenching de la piperina
sobre C. violaceum CV026. Para esto, se preparó una solución etanólica de piperina a
concentración de 10 g L-1 y posteriormente se probó el efecto de este compuesto en el
desarrollo de C. violaceum CV026 a concentración de 10, 20, 30, 40 y 50 mg L-1. Los
experimentos se realizaron en medio LB, ajustando la concentración final de etanol a 0.5%
(v/v) en todos los tratamientos. Además, se adicionó DMSO en todos los tratamientos hasta
una concentración final de 0.5% (v/v) para aumentar la solubilidad de los compuestos (Cao
et al. 2009). La hexanoil homoserina lactona se adicionó a concentración final de 25 uM. Los
tratamientos controles para el crecimiento bacteriano no fueron adicionados con solventes ni
hexanoil homoserina lactona. En el tratamiento control para la producción de violaceína no
se añadieron solventes. Para la cuantificación de violaceína se usaron los métodos descritos
por Rettori y Durán (1998).
7.8.2. Ensayos de comunicación química
Para evaluar el efecto de algunas AHLs sobre la producción de EPS en la cepa aislada y
probar si actúan como señales exógenas de comunicación cruzada, se efectuó el siguiente
experimento:
Se prepararon cultivos de N. chupicuarensis añadiendo distintas dosis de: 1) Extractos de los
medios de cultivo libres de células. 2) Estándares de AHLs (C8, C10 y C12). 3) Piperina
50
como compuesto con actividad quorum quenching. El efecto de dicha adición se evaluó en
cuanto a al crecimiento y producción de EPS. Se utilizaron activadores e inhibidores del
quorum sensing paralelamente para comprobar que los efectos observados realmente se
relacionen con un sistema de comunicación y no obedezcan a un caso de estimulación de
crecimiento u otro fenómeno distinto.
7.9. Análisis estadístico
En análisis estadístico se realizó con la ayuda del software IBM SPSS Statistics Versión 22.
Los datos se presentan como la media ± DE. El análisis de los datos por comparación de
medias se efectuó cotejando los grupos mediante un análisis de variancia de una vía
(ANDEVA) seguido de una prueba post-hoc de Tukey, siempre y cuando se verificó la
normalidad de los datos así como la prueba de varianzas iguales. Para aquellos datos que no
pasaron la prueba de varianzas iguales se analizaron mediante ANDEVA-Welch seguido de
una prueba post-hoc de Dunett T3 para variancias distintas entre grupos. El valor de p
establecido fue menor o igual a 0.05.
51
8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
8.1. Condiciones ambientales y de los sustratos
a) Cañada de la Virgen
Clima. En la región prevalece un clima semiárido-templado (INEGI 1994). Las muestras
fueron recolectadas el 10 octubre de 2012, la temperatura registrada cerca de la superficie de
las biopelículas fue de 20-23°C con una humedad relativa del 60%.
Características generales del sustrato. El sustrato del Complejo A es toba volcánica la cual,
en algunos puntos está cubierta de una delgada capa de estuco. La composición del estuco es
yeso, polvo de caliza y cal apagada, según la información que compartió con nosotros la Arq.
Gabriela Zepeda-García-Moreno.
b) Museo de la Alhóndiga
Clima. En la ciudad de Guanajuato se presenta un clima templado subhúmedo con lluvias en
verano (INEGI 1994). Las muestras se recolectaron el 17 de octubre de 2012, la temperatura
registrada en la superficie de las biopelículas fue de 18-22°C y la humedad relativa fue del
55-65%.
Características generales del sustrato. El material de construcción es cantera caliza verde
y rosa, algunas paredes exteriores e interiores se encuentra recubierta de una capa de estuco
o pintura de cal.
8.2. Muestreo de Biopelículas
El muestreo se realizó con el mayor cuidado en cuanto asepsia para evitar contaminar las
muestras, considerando las limitaciones técnicas de la interferencia de la atmósfera no estéril
a la que está expuesta la película. Sin embargo, tomando en cuenta el concepto de
enriquecimiento microbiano y la capacidad contrastante del aire y la superficie muestreada
para contener microorganismos, se puede tener confianza de que la mayoría provienen de las
biopelículas (Benson 2002; Prescott y Klein 2002).
52
Los sitios elegidos para el muestreo presentan condiciones contrastantes. Los muros de la
Alhóndiga han estado expuestos durante 200 años a las condiciones ambientales y las
estructuras de Cañada de la Virgen tienen alrededor de 15 años de haber sido desenterradas
y expuestas de nuevo al ambiente. Esta información la compartieron la Arqueóloga Gabriela
Zepeda encargada de la Zona de Cañada de la Virgen y la Arquitecta Alejandra Pérez
Martínez subdirectora del Museo de la Alhóndiga. Debido a la variación de las condiciones
ambientales de los sitios de colecta la diversidad de las comunidades fototróficas resultó ser
interesante en cuanto la proporción de microorganismos heterótrofos y fotótrofos, entre otros
aspectos los cuales tocaremos más adelante.
8.2.1. Muestreo en Cañada de la Virgen
En la superficie del Complejo A se observaron señales de biodeterioro en forma de
biopelículas coloridas, presencia de líquenes y de algunas plantas superiores. Las muestras
fueron tomadas en 4 puntos: C1) en el lado norte de la escalinata norte (20° 51' 30.8" N, 100°
55' 42.5" O), C2) lado norte de la escalinata sur (20° 51' 29.3" N, 100° 55' 42.1" O), C3)
superficie del mural del Templo Rojo (20° 51' 29.5" N, 100° 55' 43.1" O) y C4) canal de
desagüe del patio central (20° 51' 29.6" N, 100° 55' 41.0" O), Figura 7. Las muestras se
tomaron de aquellas biopelículas de mayor tamaño y con macromorfologías distintas en
color, textura y apariencia física.
8.2.2. Muestreo en el Museo Regional de la Alhóndiga
Debido a que en el momento de muestreo se había realizado una limpieza general de las
superficies del inmueble se procedió a muestrear las películas persistentes. Se muestrearon 2
películas de color negro, una ubicada en la azotea del Museo denominada A1 (21° 01' 08.2"
N, 101° 15' 29.2" O), y la otra al lado izquierdo de la escalinata del acceso principal
denominada A2 (21° 01' 08.5" N, 101° 15' 28.2" O), además de una biopelícula color verde
olivo ubicada en el muro exterior oeste denominada A3, (21°01'08.3" N, 101°15'29.5" O),
Figura 8.
53
8.3. Aislamiento de microorganismos
Previo al cultivo y enriquecimiento de las muestras, se realizó la observación microscópica
de muestras de las biopelículas tanto de Cañada de la Virgen como del Museo Regional de
la Alhóndiga. En todas las muestras se observó la presencia de fotótrofos, hongos
filamentosos y bacterias. Sin embargo, el trabajo se enfocó en las cianobacterias cultivables.
La Figura 9 muestra imágenes de colonias aisladas obtenidas de una biopelícula de Cañada
de la Virgen mediante la técnica de diluciones seriadas y plaqueo en caja de Petri. El
enriquecimiento de las muestras tomó alrededor de 1 mes de cultivo, durante este tiempo se
pudo observar el crecimiento de distintos microorganismos. En medio líquido se favoreció
el enriquecimiento de fotótrofos, mientras que en medio sólido se favoreció el crecimiento
de hongos filamentosos. El proceso de aislamiento se enfocó en enriquecer y purificar
cianobacterias con la capacidad de formar biopelículas. Para lograr este propósito el tiempo
requerido fue alrededor de 6 meses aplicando las técnicas de diluciones seriadas y estría en
placa Petri. Durante el proceso de purificación de cianobacterias se fueron obteniendo a la
par cultivos axénicos de hongos, bacterias heterótrofas y microalgas, los cuales se decidió
conservar para estudios posteriores.
8.3.1. Cañada de la Virgen
Después del proceso de enriquecimiento y del aislamiento de colonias, se obtuvieron 90
cepas que comprenden hongos, bacterias heterótrofas, cianobacterias y microalgas, Tabla 3.
De las 4 cianobacterias aisladas, se seleccionó la cepa con la mayor capacidad de producción
de EPS y con la mayor tasa de crecimiento, proveniente de la biopelícula C4, esto se
determinó cualitativamente monitoreando el crecimiento de las cepas en medio BG-11
líquido y sólido. Cabe mencionar que la proporción de microorganismos fotótrofos fue mayor
que la de heterótrofos, esto se debe a las condiciones ambientales a las que están sometidas
las biopelículas de esta zona i.e. a la mayor humedad, tanto atmosférica como precipitaciones,
presente en la región. Algo similar se ha reportado por Ramirez et al. (2010), donde se
observó que en biopelículas provenientes de lugares húmedos y de clima templado proliferan
preferentemente los microorganismos fotótrofos. A partir del recuento de las UFC en las
54
diluciones de cada muestra, se determinó que las biopelículas provenientes de Cañada de la
Virgen tienen un mayor contenido de microorganismos cultivables que las de biopelículas
del Museo de la Alhóndiga; que va de 1.3 x 106 a 3.5 x 106 y de 0.7 x 105 a 4.5 x 105 UFC
respectivamente.
a
Figura 9. Diluciones seriadas de 1:10 (A), 1:100 (B), 1:1000 (C) y 1:10000 (D) obtenidas de la
muestra C4 de Cañada de la Virgen, cultivadas en medio BG-11.
8.3.2. Museo Regional de la Alhóndiga
Para el caso del Museo se obtuvieron 60 aislados, de los cuales 37 son fúngicos y solamente
una cianobacteria, como se muestra en la Tabla 3. Debido a las dificultades para cultivar la
cianobacteria en el laboratorio, ésta no se seleccionó para los posteriores experimentos. En
las biopelículas del Museo se observó una presencia mayor de hongos microcoloniales
oscuros. Estos hongos se desarrollan preferentemente en condiciones de baja humedad y
elevada radiación solar (Zakharova et al. 2013), como es el caso de las superficies del Museo.
8.4. Selección de microorganismos
Puesto que el objetivo era obtener cianobacterias axénicas con la capacidad de formar
biopelículas, el trabajo de selección se enfocó primeramente a los fotótrofos cuyas
características microscópicas correspondían a las de cianobacterias: ausencia de orgánulos,
coloración verde azulada, formación de filamentos o agregados celulares. En este proceso se
observó que las 2 cianobacterias aisladas de Cañada de la Virgen comparten las
características morfológicas por lo que se consideraron de la misma especie o muy
relacionadas, y solo se trabajó con una de ellas etiquetada con el código PC471. Inicialmente,
55
a partir de las características morfológicas, se consideró una microalga cocoide aislada de
una biopelícula de Cañada de la Virgen (etiquetada con el código PC171) como una
cianobacteria del género Chroococcus, Figura A1. Sin embargo, a partir de los análisis
moleculares se determinó que era una microalga cercana al género Chlorosarcinopsis. Por lo
tanto, el trabajo continuó sólo con la cepa PC471.
La cepa PC471 proviene de la biopelícula 4 de Cañada de la Virgen, de la placa
correspondiente a la dilución 7. Esta cepa se seleccionó debido a sus características
morfológicas axiomáticas de una cianobacteria filamentosa, su capacidad para desarrollarse
Tabla 3. Número de cepas microbianas aisladas de cada biopelícula
Biopelícula Macromorfología Bacterias
Fotótrofos Cianobacterias Hongos Total Géneros
Identificados Gram- Gram+
Museo Regional de la Alhóndiga
A1 Negra, rugosa,
elevada 5 4 1 1 16 27
Alternaria,
Stachybotrys,
Ulocladium,
Leptolyngbya
A2
Negra,
filamentosa,
elevada
1 0 1 1 17 20
Alternaria,
Fusarium,
Stachybotrys,
Ulocladium,
Leptolyngbya
A3 Verde olivo, lisa,
aplanada 0 0 10 0 4 14
Alternaria,
Fusarium,
Chlorella
Zona arqueológica de Cañada de la Virgen
C1 Multicolor,
granulada, elevada 3 3 12 0 1 19
Alternaria,
Fusarium,
Rhizoctonia,
Chlorella,
Chlorosarcinopsis
C2 Grisácea,
granulada, elevada 7 3 11 1 3 25
Alternaria,
Fusarium,
Chlorella,
Nodosilinea
C3 Verdosa, lisa,
aplanada 4 3 6 2 3 18
Alternaria,
Fusarium,
Clorella,
Leptolyngbya,
Nodosilinea
C4 Marrón,
granulada, elevada 2 2 19 2 2 27
Fusarium,
Leptolyngbya,
Nodosilinea
56
bien en medio BG-11 líquido y sólido, además de comprobarse su producción de EPS
capsulares y solubles.
Se concluyó que la diversidad microbiana en todas las biopelículas muestreadas es muy
superior a la fracción de los microorganismos cultivables, ya que sólo se pudieron cultivar
microorganismos que representan alrededor del 10% de la diversidad morfológica observada
en el microscopio (Apéndice 11.6). Esto se debe a requerimientos nutricionales específicos
o relaciones complejas entre los microorganismos de las SABs.
8.5. Purificación, caracterización e identificación de la cepa seleccionada
8.5.1. Purificación
Una vez que el aislado seleccionado presentó un solo tipo de macromorfología en caja Petri
y micromorfología bajo microscopio óptico (Figura 10) se procedió a evaluar su desarrollo
en medio nutritivo. En medio líquido nutritivo no se observó turbidez, formación de pellets
ni grumos de microorganismos heterótrofos, mientras que en los cultivos en medio sólido no
se observó crecimiento de colonias bacterianas ni fúngicas. Los cultivos se monitorearon
hasta 120 h. Estos resultados demuestran que la cepa está libre de microorganismos de vida
libre, ya que no se reproducen en el medio de cultivo nutritivo. Este medio de cultivo permite
el desarrollo de un gran número de microorganismos heterótrofos, que de estar presentes
deberían de desarrollarse en los cultivos (Benson, 2001; Sharif et al. 2008; Zhai et al. 2012).
Además, a través del monitoreo microscópico con el objetivo de 100 X, se comprobó que no
están presentes bacterias heterótrofas de vida libre. Aunque los cultivos en medio líquido y
sólido nos dan información para determinar la ausencia de microorganismos de vida libre no
nos permiten descartar la presencia de microorganismos simbiontes, endobiontes o
epibiontes (simbiontes de la matriz extracelular) (Mooy et al. 2012; Zhai et al. 2012). Sin
embargo, una vez que no se observaron microorganismos de vida libre se consideró la cepa
como axénica y se procedió a realizar la caracterización molecular y morfológica.
57
8.5.2. Identificación y caracterización de la cepa selecionada
La cepa en estudio presenta características del género Nodosilinea, sin embargo presenta
peculiaridades que no corresponden a ninguna especie previamente descrita por lo que fue
nombrada como una nueva especie:
Clase Cyanophyceae
Subclase Synechococcophycideae
Orden Synechococcales
Familia Leptolyngbyaceae
Nodosilinea chupicuarensis Vázquez-Martínez, Gutierrez-Villagomez y Molina-Torres sp.
nov.
Descripcción morfológica: El talo esta formado por agregados de filamentos que
ocasionalmente forman tapetes. Éste crece adherido a la superficie de la roca como una
película de color azul-verdoso y se encuentra embebida en una cubierta de mucílago. En
algunos puntos del talo los filamentos se encuentran embebidos en una matriz de EPS. Los
filamentos maduros tienen de 1.1 a 1.3 um de ancho y pueden tener mas de 350 células de
largo (>400 um). Las células tienen forma de barril (0.9 um de ancho x 1.2 um de largo),
ocasionalmente presentan forma de disco (1.2 um de ancho x 0.6 um de largo) o forma de
esfera (0.9 a 1.2 um de diámetro). Las células apicales tienen forma de domo, no capitadas y
están cubiertas por una capa hialina. Los filamentos no presentan falsas ramificaciones, ni
heterocistos, ni acinetos, ni vacuolas de gas. La reproduccion ocurre por hormogonias. Las
puntas de las hormogonias y de los filamentos presentan monvimiento. Bajo condiciones de
baja intensidad luminosa (<4 umol de fotones m-2 s-1) algunos filamentos se curvan y forman
espirales, además en algunos puntos los filamentos se vuelven multiseriados. Se observó la
formación de nódulos sensu stricto y mayormente se observaron estructuras pro-
nodulatorias. Los tricomas están constreñidos en las divisiones entre célula y célula. En
algunos puntos de los tricomas es posible observar la cubierta vacía debido a la necrosis de
algunas células (Figuras 11 y 12)
58
Etimología: Nodosilinea chupicuarensis, Nodosilinea = “Knotted line” trad. línea anudada
(Perkerson et al. 2011); chupicuarensis (chu.pi.cua.ren´sis. N.L. mas. adj. chupicuarensis,
procedente de Chupícuaro, Chupicuarense, el nombre antiguo de la región donde la cepa tipo
fue aislada.
Habitat: Superficie de rocas, epilítica.
Figura 10. Fotografías de PC471 mostrando A) morfología en medio BG-11 sólido y B)
crecimiento en medio BG-11 líquido. Microscopias ópticas mostrando C) micromorfología bajo el
objetivo 100x, D) tinción simple con safranina.
59
Tipo: MEXICO. Guanajuato: San Miguel de Allende, zona arqueológica de Cañada de la
Virgen, Complejo A, 20 °51' 29.6" N, 100° 55' 41.0" O, J. Vázquez-Martínez, J.M. Gutiérrez-
Villagómez, J. Johansen, J. Molina-Torres, 12-10-2012 (holotipo MEXU 4813, Herbario
Nacional de la Universidad Nacional Autónoma de México en la Ciudad de México)
Figura 11. Microscopias ópticas Nomarski de Nodosilinea chupicuarensis bajo el objetivo 100x. A.
Filamentos maduros formando espirales. B. Nódulo. C. Filamento multiseriado. D. Filamento
solitario mostrando una zona con la cubierta celular vacía (necridia).
60
Figura 12. Micrografías de Nodosilinea chupicuarensis obtenidas con el microscopio electrónico
de barrido. A. Filamento maduro formando un espiral. B. Amplificación de un espiral. C. Agregado
de filamentos enrollados. D. Vista interna de un espiral.
61
Caracterización molecular:
Análisis filogenético: Con base en el análisis de la secuencia completa del gen ribosomal
16S se determinó que la cepa en estudio está relacionada a Nodosilinea nodulosa UTEX 2910
con 99.4 a 99.5% de similitud. La cepa esta localizada muy cerca de N. nodulosa UTEX
2910, con una distacia de 0.0065 sustituciones por sitio, estas dos especies se agrupan en un
clado moderadamente robusto (bootstrap = 79), Figura 13. De acuerdo al análisis de la región
ITS 16S-23S, se encontró que la cepa esta relacionada a N. nodulosa UTEX 2910 (95.8% de
similitud, distancia p = 0.042), a Phormidium sp. AA (93.7% de similitud, distancia p = 0.063
) y a Nodosilinea sp. IkpPStn44 (93.4% de similitud, distancia p = 0.066), Tabla 4. De la
misma manera que en el ábol del gen 16S, en el árbol de la región ITS la cepa se agrupa con
N. nodulosa UTEX 2910 (bootstrap = 70) pero con una distancia filogenética mucho mayor.
Esto confirma que ambos son grupos hermanos, pero no la misma especie, Figura 14. Los
miembros de la misma especie bacteriana tienen una distancia p < 0.03, y la distancia p
promedio intraespecies es de aproximadamente 0.01 (Erwin and Thacker 2008; Osorio-
Santos et al. 2014; Pietrasiak et al. 2014).
De acuerdo a las reglas clásicas de la clasificación en base al gen 16S la conclusión sería que
la cepa en estudio es propiamente N. nodulosa. No obstante, la comparación de la secuencia
del gen 16S es insuficiente para establecer la identidad de una especie por lo que no es
apropiada para estudios a nivel más profundo que género. El análisis de la region ITS 16S-
23S, que es una región más variable, es una mejor herramienta para determinar la identidad
de una especie, como ha sido ya validada en cianobacterias (Boyer, Flechtner y Johansen
2001).
Estructura secundaria de la region ITS: La comparación de la estructura secundaria de
ciertos dominios de la region ITS 16S-23S proporciona información valiosa acerca de la
agrupación de la cepa dentro del género Nodosilinea, así como de la separación de ésta de
las demás especies de este género. La estructura de la hélice D1-D1’ es similar a la estructura
de las hélices D1-D1’ de las espcies de Nodosilinea, sin embargo la secuencia varía
considerablemente (91.9% de similitud), i.e. 5 substituciones localizadas en las posiciones
27-29, 44 y 48 (5’-3’), en comparación con N. nodulosa UTEX 2910, Figura 15. Estas
62
mutaciones no afectan la estructura secundaria, pero reflejan la variabilidad genética de esta
cepa. Algo similar ocurre con el análisis de la estructura de hélices Box-B (Figura 15), V2 y
V3: la estructura secundaria esta conservada pero la secuencia varía, y esta variación se
localiza principalmente en los loops de las hélices.
El uso de la estructura secundaria como marcador taxonómico tiene varias ventajas: 1) es
estable y permanente, por lo que una vez determinada puede ser usada consistentemente con
las estructuras de otras secuencias para establecer la identidad de una especie. 2) Debido a la
interacción fina de las moléculas de RNA con las proteinas ribosomales y con las proteínas
de procesamiento del rARN, es muy dificil que se acumulen mutaciones en la region ITS
durante el tiempo que una cepa se mantiene en cultivo. 3) Esta región presenta motivos que
están menos conservados que cualquier región de las moleculas de las dos subunidades de
rARN. Por lo tanto, la variación de la región ITS proporciona más información taxonómica
que la secuencia del rARN 16S. La principal desventaja con la estructura del ITS es la
variabilidad entre operones, sin embargo esto se puede corregir enfocandose en un operón
específico (Boyer et al. 2001; Johansen et al. 2011).
Perfil de ácidos grasos: El perfil de ácidos grasos de N. chupicuarensis mostró que los
ácidos más abundantes son C18:1, 9E (28.16%), C16:0 (25.07%) y C18:2, 9E, 12E (13.69%),
Tabla 5. Estos datos no contribuyen con alguna información adicional sobre la taxonomía de
la cepa, ya que no existe a la fecha una base de datos robusta de los perfiles de ácidos grasos
de las especies la la familia Leptolyngbyaceae, sin embargo estos datos contribuyen a
aumentar las bases de datos actuales. Existe un reporte sobre una cepa del género
Leptolyngbya presenta un perfil de ácidos grasos similar a N. chupicuarensis (Sahu et al.
2013), esto tomando en cuenta los dos ácidos grasos más abundantes (C18:1, 9E y C16:0) lo
cual podría se una característica de este grupo taxonómico.
63
Figura 13. Árbol filogenético basado en las secuencias del gen ribosomal 16S (1463 sitios)
construido mediante el método de máxima verosimilitud donde se localiza Nodosilinea
chupicuarensis (círculo negro). Los valores de bootstrap mayores de 50% se indican en los nodos.
Los números de acceso de GenBank de las secuencias se listan en la Tabla 1. Las especies que
cuentan con genoma secuenciado son Gloeobacter violaceus y Nodosilinea nodulosa.
64
Tabla 4. Comparación de la distancia p de la región ITS 16S-23S entre N. chupicuarensis y algunos grupos taxonómicos relacionados.
Secuencia-> 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
1. Nodosilinea chupicuarensis
2. Nodosilinea nodulosa UTEX2910 .042
3. Phormidium sp. AA .063 .066
4. Nodosilinea sp. IkpPStn44 .066 .066 .073
5. Nodosilinea sp. ATA11-6B-LB2 .067 .048 .071 .063
6. Nodosilinea sp. CXA007.4 .077 .084 .070 .088 .081
7. Nodosilinea epilithica Kovacik1990/52 .088 .097 .095 .087 .083 .049
8. Nodosilinea sp. ATA11-6B-CV9 .088 .091 .099 .100 .091 .125 .125
9. Leptolyngbya antarctica ANT.LAC.1 .088 .099 .095 .098 .088 .107 .119 .080
10. Nodosilinea sp. FI2-2HA2 .088 .088 .073 .089 .077 .016 .052 .129 .111
11. Nodosilinea sp. CMT-3FSIN-NPC22B .091 .083 .085 .106 .102 .045 .087 .125 .129 .046
12. Nodosilinea sp. WJT8-NPBG4 .091 .101 .087 .080 .076 .056 .012 .121 .115 .052 .087
13. Oscillatoria sp. CCMEE .092 .106 .099 .102 .088 .103 .115 .094 .040 .103 .125 .111
14. Nodosilinea sp. ATA11-6K-CV21 .095 .065 .088 .084 .059 .106 .123 .091 .074 .103 .121 .120 .085
15. Leptolyngbya antarctica ANT.LACV6.1 .095 .106 .099 .106 .086 .115 .123 .087 .009 .119 .133 .119 .040 .081
16. Leptolyngbya antarctica LCR-
CYANT27
.096 .110 .096 .099 .096 .111 .123 .091 .057 .111 .129 .119 .031 .077 .060
17. Leptolyngbya sp. PCC7104 .100 .106 .111 .111 .112 .063 .084 .154 .143 .071 .077 .084 .148 .138 .151 .156
18. Leptolyngbya sp. KIOST-1 .106 .117 .094 .089 .114 .063 .117 .156 .140 .063 .080 .109 .148 .133 .148 .141 .077
19. Nodosilinea bijugata Kovacik 1986/5a .107 .106 .122 .088 .123 .070 .095 .106 .096 .063 .091 .088 .096 .092 .113 .100 .089 .092
20. Haloleptolyngbya alcalis KR2005/106 .168 .179 .168 .175 .167 .168 .174 .178 .191 .181 .172 .174 .192 .198 .196 .197 .164 .190 .181
21. Leptolyngbya sp. BL0902 .173 .183 .160 .154 .157 .160 .164 .205 .178 .156 .172 .164 .161 .183 .178 .175 .169 .172 .177 .252
22. Leptolyngbya sp. CCAP1442/1 .200 .210 .221 .218 .228 .206 .217 .234 .193 .211 .226 .217 .198 .211 .193 .209 .211 .213 .199 .237 .183
23. Phormidium sp. OL05 .244 .254 .271 .252 .268 .244 .255 .258 .261 .244 .265 .255 .272 .240 .272 .273 .250 .268 .233 .251 .218 .188
24. Gloeobacter violceus PCC7421 .340 .338 .345 .352 .351 .334 .348 .313 .340 .348 .344 .348 .347 .345 .340 .336 .343 .375 .327 .361 .368 .403 .418
65
Figura 14. Árbol filogenético basado en las secuencias de la región ITS (419 sitios) construido
mediante el método de máxima verosimilitud donde se localiza N. chupicuarensis (círculo negro).
Los valores de bootstrap mayores de 50% se indican en los nodos. Los números de acceso de
GenBank para las secuencias se listan en la Tabla 1.
pH óptimo de crecimiento: Se determinó que la cepa es capaz de crecer a pH de 7, 8, 10 y
12, además el pH medido al final del cultivo durante 15 días fue 9.5 +/- 0.5 en todos los
casos. Esta característica fisiológica ayuda a diagnosticar esta especie, la cual es alcalófila.
La capacidad para desarrollarse en un pH alcalino podría ser una adaptación al sustrato
calcáreo en donde naturalmente crece.
66
Figura 15. Estructura secundario de algunos dominios conservados de la región ITS 16S-23S para
8 cepas representativas de Nodosilinea. A–H: hélices D1-D1'; I–P: hélices Box-B; Q: hélice V3
(estructura de 19 cepas). Las etiquetas de las cepas en la fila inferior aplican también a las hélices
D1-D1'. Las bases diferenciales respecto a N. chupicuarensis se indican con un círculo.
Tabla 5. Perfil de ácidos grasos
de Nodosilinea chupicuarensis
Ácido graso Contenido % +/- SD
C14:0 0.31 +/- 0.13
C16:4(n-4) 4.01 +/- 0.14
C16:2(n-7) 3.5 +/- 0.11
C16:3(n-7) 2.98 +/- 0.13
C16:1(n-7) 0.87 +/- 0.24
C16:0 25.07 +/- 0.41
C18:3(n-6) 6.49 +/- 0.10
C18:4(n-8) 1.45 +/- 0.48
C18:2(n-9) 13.69 +/- 0.14
C18:3(n-9) 6.24 +/- 1.02
C18:1(9E) 28.16 +/- 0.88
C18:1(9Z) 6.35 +/- 0.11
C18:0 0.88 +/- 0.13
67
8.6. Cinéticas de crecimiento
La fase de adaptación “Lag” de N. chupicuarensis se extendió hasta el día 15, en esta etapa
las células microbianas se adaptan a las condiciones del medio. Después se presentó un
cambio en la pendiente de la curva que corresponde a la fase de crecimiento exponencial, la
cual se mantuvo hasta el día 28. Después de este día la producción de biomasa no presenta
diferencias significativas, por lo que se ha alcanzado la fase estacionaria, Figura 16. La curva
de crecimiento con base en el peso seco presentó el mismo comportamiento que el peso
húmedo, sin embargo se observan algunas diferencias no significativas en la distribución de
los datos, Figura 16. El tiempo de duplicación es de 1.75 días (base peso húmedo y seco),
aproximadamente 40 h. La capacidad de carga es de 9.18 y 1.28 g L-1 en base al peso húmedo
y seco, respectivamente. La velocidad de crecimiento específica máxima es de 0.4 d-1. A la
fecha no existen reportes sobre curvas de crecimiento de cepas del género Nodosilinea con
los cuales se pueda comparar el crecimiento de N. chupicuarensis, sin embargo la duración
de cada una de las fases concuerda con los reportes para otros géneros de cianobacterias
(Colla, Bertolin and Costa 2004; Prasanna et al. 2010).
Figura 16. Curvas de crecimiento de Nodosilinea chupicuarensis en medio BG-11. A. Curva en
base al peso húmedo. B. Curva en base al peso seco. El ajuste exponencial se obtuvo con la
ecuación 6.1.
68
8.7. Análisis in silico de la presencia de sistemas de quorum sensing en cianobacterias
En cuanto a los genes involucrados en la síntesis y percepción de las señales de quorum
sensing, no se encontraron homólogos a las secuencias de cianobacterias depositadas en el
GenBank. Sin embargo, existen proteínas hipotéticas que tienen cierta identidad con los
receptores tipo LuxR, específicamente en un fragmento de la región en donde se unen las
AHLs. Por el contrario, no se encontraron proteínas con identidad respecto a las sintasas de
dichas moléculas en el análisis en GenBank. Además, algunas proteínas hipotéticas de
cianobacterias tienen cierta similitud con los receptores SdiA de las Gram negativas y con el
LuxQ del sistema universal. De forma semejante, se han reportado casos de bacterias
heterótrofas que tienen proteínas homologas a LuxR sin tener su par LuxI, es decir tienen un
sistema de quorum sensing incompleto expresando receptores LuxR “huérfanos”(Patankar y
González 2009). Aunque no se sabe si esto se debe a duplicación y reorganización de los
genes o a una transferencia horizontal durante el proceso evolutivo de las bacterias. Se ha
demostrado que estos homólogos de los receptores permiten a algunas bacterias “escuchar”
la comunicación de otros microorganismos reaccionando a dicha comunicación (Case,
Labbate y Kjelleberg 2008; Patankar y González 2009). Respecto al género Nodosilinea, se
encontraron secuencias de proteínas que tienen similitud con los receptores LuxR y LuxQ,
específicamente las secuencias tienen una similitud del alrededor del 40% con los dominios
encargados de detectar las señales. La secuencia con mayor score (49.7) para el BLAST
contra LuxR es un regulador de respuesta de unión a ADN de la especie N. nodulosa con
identidad del 36% (Número de acceso de GenBank WP_017299190.1). Asimismo, la
secuencia con mayor score (241) contra LuxQ es una proteína hipotética de N. nodulosa con
identidad del 35% (Número de acceso de GenBank WP_083887114.1). Estas dos últimas
comparaciones se muestran en el Apéndice 11.7. Esto sugiere que N. chupicuarensis podría
expresar proteínas que funcionen como receptores de AHLs, sin producir dichas señales,
como se ha observado en otras cianobacterias.
69
8.8. Evaluación de la síntesis de señales químicas tipo quorum sensing
8.8.1. Síntesis enzimática de AHLs
La síntesis enzimática de algunas AHLs re realizo con el objeto de obtener suficiente cantidad
y diversidad de estas moléculas, para posteriormente determinar sus características
cromatografías y espectrales, así como usarlas en los ensayos biológicos. A partir del análisis
de los cromatogramas y espectros de masas de las AHLs sintetizadas se determinaron los
tiempos de retención y los 10 iones m/z más abundantes, Tabla 6. En todas las AHLs
analizadas el ion 143 m/z aparece como el pico base, exceptuando la C4 AHL para la cual
aparece como el segundo pico más abundante. Este ion corresponde al anillo lactonizado de
homoserina, además del grupo amida después de sufrir un rearreglo de McLafferty (Cataldi
et al. 2004). También el ion 101 m/z se puede usar como calificador, ya que se presenta en
todas los espectros de masas de las moléculas analizadas, este ion corresponde al anillo
lactonizado más el grupo amino (Cataldi et al. 2004). Además, los iones 125 y 156 m/z se
pueden usar como diagnóstico para la identificación de las AHLs de C6 a C16, es decir que
monitoreando estos iones se podría determinar la presencia de señales tipo AHL..
8.8.2. Detección de señales químicas de quorum sensing
Solamente en el cultivo de la cepa heterótrofa etiquetada con el código BC4D462,
proveniente de Cañada de la Virgen, se encontró una AHL: la N–decanoil homoserina
lactona. Esta cepa proviene de la misma biopelícula de la que se aisló N. chupicuarensis. La
identificación de la C10 AHL se realizó mediante GC/EIMS, comparando su tiempo de
retención y su espectro de masas con los del estándar de la C10 AHL. En dicha comparación
Tabla 6. Patrón de fragmentación de las AHLs sintetizadas enzimáticamente
AHL Rt Iones m/z (abundancia relativa)
4C 11.072 57 (999), 143 (759), 71 (680), 56 (326), 55 (129), 85 (110), 101 (109), 83 (104), 72 (96), 84 (77)
6C 15.752 143 (999), 57 (719), 71 (340), 99 (265), 56 (253), 55 (218), 125 (217), 101 (186), 83 (182), 102 (145)
8C 21.274 143 (999), 57 (955), 55 (257), 125 (214), 83 (186), 56 (182), 101 (170), 156 (152), 102 (150), 127 (91)
10C 24.475 143 (999), 57 (504), 55 (216), 125 (191), 156 (173), 102 (171), 83 (168), 101 (148), 56 (141), 71 (127)
12C 29.351 143 (999), 57 (425), 55 (198), 156 (191), 102 (176), 125 (165), 83 (158), 101 (123), 56 (111), 98 (75)
14C 33.627 143 (999), 57 (355), 156 (200), 55 (179), 102 (176), 125 (143), 83 (141), 101 (107), 56 (95), 69 (78)
16C 37.426 143 (999), 57 (327), 156 (202), 102 (182), 55 (173), 83 (142), 125 (128), 101( 98), 339 (93), 56 (87)
70
se observa el mismo tiempo de retención para el estándar de la C10 AHL y para un
componente del cultivo de BC4C462. El valor de ajuste (match) para la comparación entre
los espectros de masas del componente del cultivo y el estándar de la 10C AHL fue del 89%.,
este valor indica el nivel de similitud entre los espectros comprados. Un valor de 100% de
ajuste indica una similitud perfecta, mientras que valores por debajo del 70% indican una
similitud pobre o mala. La principal diferencia entre ambos espectros es la ausencia de
algunos iones en el espectro del componente del cultivo, lo cual se debe a la poca abundancia
del compuesto y la baja producción de esos fragmentos durante la ionización, Figura 17.
En los cultivos de N. chupicuarensis no fue posible identificar algún componente que
correspondiera a las AHLs sintetizadas o incluidas en la biblioteca del NIST. Tampoco se
identificó algún componente con los iones m/z característicos de las AHLs. No se detectaron
compuestos que correspondieran a alguno de los dipéptidos cíclicos contenidos en la
biblioteca del NIST o en la base de datos del Laboratorio de Fitobioquímica. Además, de
acuerdo con esto, ninguno de los extractos de los cultivos de N. chupicuarensis activaron los
sistemas de quorum sensing de las cepas biorreporteras, indicando la ausencia de señales tipo
AHL. A la fecha no se ha reportado otro caso de la síntesis de AHLs por cianobacterias,
además de Gloeothece PCC6909 la cual sintetiza la C8 AHL para regular la producción de
la enzima RUBISCO (Sharif et al. 2008). El resultado obtenido en N. chupicuarensis
concuerda con la información actual, y aporta evidencia de que la producción de AHLs por
cianobacterias podría ser un caso muy específico de PCC6909.
71
Figura 17. Comparación de: A. Cromatograma de la C10 AHL (rojo) y extracto de cultivo de la
cepa BC4D462 (azul). B. Espectros de masas de la C10 AHL en el cultivo de BC4D462 (espectro
superior) y C10 AHL estándar (espectro inferior).
8.9. Estudio microscópico de las biopelículas
La Figura 18A muestra una microscopía óptica de la biopelícula de N. chupicuarensis teñida
con azul de alcián. Se pueden observar las cubiertas de los filamentos, así como el mucílago
en que está inmerso el talo. Hay que notar que este mucílago no se distribuye
homogéneamente en el talo y se acumula donde los filamentos forman agregados más densos.
Las biopelículas de cianobacterias filamentosas mantienen su estructura no sólo por la fuerza
de adherencia de los polímeros sino también por los enlaces entre los filamentos. En la Figura
18B se observa con más detalle la estructura de la biopelícula en una micrografía de SEM,
se pueden observar canales profundos de distinto grosor de 1 – 10 um, asimismo se observa
72
como algunos filamentos salen de la matriz de EPS mientras otros se encuentran embebidos
en dicha matriz. Aunque parece que la película no está formada con un patrón definido
podemos notar que existen estructuras que se repiten homogéneamente, tales como los
canales y los espirales. Se ha discutido bastante sobre la importancia de los canales dentro de
una biopelícula, principalmente en relación al flujo de nutrientes y deshechos (Costerton y
Cheng 1987; Flemming y Wingender 2010), seguramente estas estructuras tienen un papel
similar en esta biopelícula.
Figura 18. Fragmentos de una biopelícula de N. chupicuarensis. A) Microscopía óptica con tinción
de azul de alcian. B) Micrografía electrónica de barrido.
8.10. Producción de sustancias poliméricas extracelulares
8.10.1. Cinéticas de producción de polímeros extracelulares solubles
La cinética de producción de SEPS presenta una pendiente variable con máximos de
producción a los días 15 y 42. El punto del día 15 corresponde al inicio de la fase exponencial,
mientras que el punto del día 42 corresponde a la fase estacionaria al final del experimento,
Figuras 16 y 19. El hecho de observar más polímeros solubles en el medio al día 42, que
corresponde al final del crecimiento, se puede explicar de la siguiente manera: cuando ocurre
la lisis todos los componentes solubles de la célula, así como sus productos de degradación,
incluyendo los polisacáridos pasan a formar parte del medio extracelular.
Sin embargo, el máximo observado al día 15 requiere de mayor análisis. Para lo cual
hablaremos del “crecimiento balanceado”, éste se define como la fase de crecimiento donde
73
la composición macromolecular de las células microbianas permanece en la misma
proporción generación tras generación. El crecimiento balanceado se aproxima al
crecimiento observado en la fase exponencial o al crecimiento en un cultivo continuo.
Durante esta fase, la producción de metabolitos relacionados al desarrollo y la reproducción
ocurre de manera proporcional a la producción de biomasa o al número de células, por esta
razón la cinética de producción de los metabolitos relacionados al metabolismo central como
proteínas, lípidos y ADN, corresponde con la cinética de crecimiento. De manera contraria,
aquellos metabolitos “secundarios” cuya cinética de producción no corresponde con la
cinética de crecimiento, se regulan por mecanismos distintos o complementarios a los del
metabolismo central y su síntesis se activa en respuesta a factores ajenos al crecimiento. Estos
factores pueden ser ambientales como temperatura, intensidad luminosa, contenido de
humedad, etc., o factores celulares como hormonas u otras señales químicas (Posten y
Cooney 1993). Además, en algunos microorganismos la síntesis de estos metabolitos
especializados está regulada por sistemas de quorum sensing. En esos casos, el máximo de
producción del metabolito se observa justo después de que la señal química ha alcanzado el
umbral para activar el sistema (Eberhard 1972; Nealson 1977).
Figura 159. Cinéticas de producción de sustancias poliméricas solubles (Línea continua con
cuadros) y de sustancias poliméricas de la cubierta celular (Línea discontinua con círculos) de N.
chupicurarensis.
74
En bacterias heterótrofas la producción de biopelículas, i. e. polisacáridos extracelulares, está
regulada por quorum sensing, específicamente en el proceso de maduración de la biopelícula.
Cuando la señal química alcanza la concentración umbral, se activa la producción de EPS y
su concentración se incrementa en la biopelícula. Al analizar los datos de producción de
SEPS por N. chupicuarensis, la cinética concuerda con la cinética de producción de EPS en
bacterias heterótrofas i.e. se observan máximos de producción a densidades celulares
específicas. Sin embargo, como se discutió en la sección 8.8.2, no se observó la producción
de alguna señal química, bajo las condiciones estudiadas y las técnicas utilizadas. Esto se
puede explicar de dos maneras: una es que no fue posible detectar la señal de quorum sensing
que activa la producción de EPS, ya sea por su baja concentración o debido a que sus
características químicas no permiten analizarla por GC/EIMS ni mediante biorreporteros. La
otra explicación es que el factor que activa la producción de EPS no es propiamente una señal
de quorum sensing, esto significa que la producción de biopelículas en esta cianobacteria está
regulada por un mecanismo distinto o no descrito hasta el momento. Con la información
obtenida no se puede inclinar por ninguna de las explicaciones.
8.10.2. Cinética de producción de polímeros extracelulares capsulares.
La síntesis de polímeros de la cubierta celular (CEPS) se muestra en la Figura 19. Al día 7
no se observó producción de CEPS. Al día 15 se observó presencia de CEPS, sin embargo,
no fueron cuantificables ya que el peso seco fue menor a 0.1 mg. A partir del día 21, el peso
seco de polímero fue cuantificable y la pendiente de la cinética se mantuvo relativamente
constante, observándose un máximo de producción al día 28. Después del día 28 el contenido
de CEPS disminuyó considerablemente. De igual forma que para los SEPS es más sencillo
explicar lo que ocurre al final de la cinética. Puesto que ocurre la lisis de las células, los
polímeros de la cubierta celular se desintegran y desprenden, observándose una disminución
en su contenido. Esto concuerda con la cinética de SEPS, ya que al mismo tiempo que se
observa una disminución de los polímeros de la cubierta se presenta un aumento de los
solubles. El máximo del día 28 puede atribuirse más claramente al final de la fase exponencial
que a un fenómeno de señalización. No obstante, no se puede descartar que ocurra un
fenómeno que sirva como señal para que la biopelícula se desintegre y que las células
75
liberadas puedan iniciar nuevas biopelículas en ambientes más favorables, como lo que
ocurre con las bacterias heterótrofas (Dickschat 2010; Solano, Echeverz y Lasa 2014).
Comparando ambas cinéticas, se puede sugerir que existe una relación entre la síntesis de los
dos tipos de polímeros. Durante la fase de adaptación se sintetizan polímeros solubles que
alcanzan un punto estable en el día 21, justo cuando la síntesis de polímeros de la cubierta se
observa. Después del día 21, la producción de SEPS y CEPS se equilibra y se mantiene en
una relación constante respecto a la biomasa. Al parecer, es necesario que primero se alcance
una concentración extracelular de polímeros solubles para comenzar la formación del
mucílago.
Con los datos obtenidos se puede decir que la síntesis de SEPS y CEPS no está regulada de
manera directa al metabolismo central, sino que se sintetizan en respuesta a un factor
secundario. Además, se observó que los máximos de producción de ambos polímeros se
presentan a concentraciones de biomasa específicas (0.05 g L-1 para SEPS y 1.1 g L-1 para
CEPS), esto significa que la síntesis de estos polímeros podría estar regulada por un
mecanismo dependiente de la densidad celular. Al respecto, se ha reportado que algunas
cepas del género Microcystis presentan un pico de producción de EPS cuando las colonias
alcanzan un tamaño específico de 150 um (Zhu, Dai y Li 2014). Los autores atribuyen este
efecto a la conformación estructural de la matriz que se modifica cuando se alcanza una
concentración crítica de EPS. Sin embargo, estos datos también se pueden explicar por un
fenómeno de regulación dependiente de la densidad celular, ya que el tamaño de colonia se
relaciona directamente con el número de células dentro de la colonia. Generalmente entre
más grande es la colonia más células contiene. Otro caso similar se presenta en una cepa de
Microcystis aeruginosa, la cual sintetiza biopelículas de una manera dependiente a la
densidad celular (Zhai et al. 2012). Las observaciones de estos autores son sólo cualitativas,
pero corresponden a los datos cuantitativos observados en N. chupicuarensis.
76
8.10.3. Composición de las sustancias poliméricas extracelulares
a) Análisis de estándares de monosacáridos
Debido a que los monosacáridos presentan estereoisomería tanto en su forma lineal como en
su forma cíclica, cada monosacárido puede presentar 10 isómeros. Para el caso de la mayoría
de los monosacáridos producidos en la naturaleza, que son D-enantiómeros, el número de
isómeros posibles son 5: dos furanosas, dos piranosas y una estructura lineal. De igual forma,
sus derivados silanizados pueden presentar 5 isómeros. En la Figura 20 se observa el
cromatograma de los estándares de los D-monosacáridos analizados. La Tabla A4 muestra el
número de componentes, representados por picos, para cada estándar y el tiempo de retención
de cada uno, así como los isómeros presentes en las condiciones del análisis. De acuerdo al
número de componentes y el tiempo de retención de cada componente se puede determinar
fácilmente si un monosacárido está o no presente en las muestras a analizar.
Figura 20. Cromatograma de estándares silanizados de D-Arabinosa (guinda), L-Ramnosa (rosa),
D-Ribosa (verde claro), D-Xilosa (azul claro), D-Fucosa (verde oscuro), D-Manosa (negro), D-
Fructosa (rojo), D-Galactosa (azul oscuro), D-Glucosa (púrpura) y Ácido D-Galacturónico
(naranja). Las flechas indican el isómero más abundante de cada estándar.
77
Los espectros de los derivados silanizados de monosacáridos presentan iones característicos
de m/z = 73, 204 y 217, Figura 21. A partir de los espectros de masas de cada componente se
puede establecer cuáles corresponden a las formas furanosas y cuales a las piranosas. En los
espectros de las furanosas el ion de 217 m/z es el más abundante, después del 73 m/z, Figura
21A. En los espectros de las piranosas el ion 204 m/z tiene una proporción mayor con respecto
al ion de 217 m/z, Figura 21B. Sin embargo, la información de los espectros de masas no
permite distinguir si es un alfa o beta enantiómero ni de qué monosacárido se trata, por lo
que se tiene que complementar con la información de los tiempos de retención (Walford
2010). Los fragmentos 73, 204 y 217 m/z corresponden a C3H9Si, C8H20O2Si2, C9H21O2Si2,
respectivamente, Figura 21.
Figura 161. Espectros de masas de A) D-galactofuranosa y B) D-galactopiranosa.
78
b) Análisis de la composición de monosacáridos en los polímeros extracelulares de
Nodosilinea chupicuarensis
La composición de los SEPS y CEPS se mantuvo constante durante la cinética ya que no se
observaron diferencias significativas en las proporciones de los monosacáridos más
abundantes (Figura 22). La Tabla 7 presenta la composición de los CEPS y SEPS durante la
fase estacionaria, los datos corresponden al día 28 de la cinética. Se pueden observar algunas
diferencias entre ambos polímeros: los SEPS tienen mayor proporción de D-glucosa y ácido
galacturónico, además éstos no contienen D-arabinosa y amino azúcares a diferencia de los
CEPS. La diferencia en la composición de cada polímero podría estar relacionadas con la
función de cada uno: una proporción elevada de azúcares ácidos hace más soluble el polímero
(Pereira et al. 2009). Esto es consistente con lo observado en los SEPS, mientras que los
polímeros insolubles de la cubierta tienen menor contenido de azúcares ácidos. La D-glucosa,
la D-manosa y la D-galactosa representan más del 90% de los monosacáridos identificados
tanto en las SEPS como en las CEPS, lo cual concuerda con la mayoría de los polisacáridos
naturales. Además, se detectaron otros componentes los cuales no se pudieron identificar
debido a la ausencia de estándares para comparar. Sin embargo, de acuerdo a su espectro de
masas y tiempo de retención se puede afirmar con certeza que son monosacáridos.
Figura 22. Composición de monosacáridos de los SEPS durante la fase estacionaria del crecimiento
de N. chupicuarensis.
79
No se encontraron reportes en los cuales se describa el comportamiento de la composición
de las EPS de cianobacterias o bacterias heterótrofas durante su desarrollo, por lo que no se
tiene información para comparar lo observado en la cepa en estudio. Sin embargo, la
composición observada en la fase estacionaria concuerda con lo reportado de manera general
para cianobacterias (Pereira et al. 2009). Se puede concluir que para N. chupicuarensis la
producción de polisacáridos responde a la densidad celular, ya que durante la cinética la
concentración celular es el único factor que varía considerablemente. Además, se determinó
que las EPS de esta cepa varían en cantidad y no en composición durante el desarrollo.
8.11. Ensayos de comunicación química
8.11.1. Actividad quorum quenching de la piperina
La piperina, a concentración de 40 y 50 mg L-1, redujo en menos del 5% el crecimiento de
Chromobacterium violaceum CV026, mientras que a las mismas concentraciones la
producción de violaceína se redujo en aproximadamente el 75%. Estos resultados permitieron
confirmar que la piperina es uno de los responsables de la actividad quorum quenching en el
extracto de P. nigrum. Este resultado demuestra el potencial que la piperina y algunos
compuestos relacionados pueden tener como inhibidores de sistemas de QS basado en señales
tipo AHL.
Tabla 7. Composición de monosacáridos de SEPS y CEPS
de N. chupicuarensis al día 28 de cultivo en medio BG-11
Monosacárido Composición porcentual
SEPS CEPS
D-Glucosa 44.6 33.64
D-Manosa 15.34 29.91
D-Galactosa 9.68 25.77
D-Fucosa 5.67 5.28
D-Xilosa 2.39 1.38
D-Arabinosa - 1.12
L-Ramnosa 8.46 0.5
Levoglucanos 1.39 0.1
Amino azúcares - 0.09
Ácido D-galacturónico 0.57 0.04
No identificados 11.9 2.16
80
8.11.2. Efecto de inductores e inhibidores del quorum sensing sobre N. chupicuarensis
La Figura 23 muestra el efecto de la adición de AHLs sintéticas (C8, C10 y C12) a cultivos
de N. chupicuarensis. Se puede observar que ninguna de las AHLs probadas afectó la
producción de biomasa ni la producción de polímeros solubles, pero se observó un efecto
significativo en la producción de los polímeros de la cubierta celular. Esta observación
concuerda con lo reportado por Zhai et al. (2012) respecto a la pronta formación de una capa
de mucílago alrededor de las células de una cepa de Microcystis aeruginosa, cuando se
adicionan AHLs al cultivo. Lo reportado en este trabajo, junto con lo observado por Zhai et
al. (2012) y Sharif et al. (2008) indica que algunas cianobacterias poseen sistemas semejantes
al quorum sensing. Dichos sistemas pueden estar incompletos o completos, es decir pueden
expresar solamente los receptores de las señales o las sintetasas y los receptores,
respectivamente. Lo observado en este experimento también coincide con estos dos trabajos
en que las señales de tipo AHL afectan el metabolismo de carbohidratos y la producción de
polímeros extracelulares. El efecto de la piperina no fue el esperado, ya que en lugar de actuar
como un inhibidor de alguna actividad celular del metabolismo secundario, afecta
directamente el crecimiento inhibiendo completamente el desarrollo de N. chupicuarensis
(datos no presentados). Este compuesto resultó actuar como un alguicida para esta especie.
Se ha reportado que la piperina puede actuar tanto como compuesto bactericida (Okwute y
Egharevba 2013) o como inhibidor del quorum sensing contra C. violaceum CV026. Cuándo
actúa de una manera u otra parece depender de la susceptibilidad del propio microorganismo.
Un hecho interesante es el que la piperina, a 40 ppm, tuvo un efecto de inhibición total en el
crecimiento de N. chupicuarensis, ya que a futuro se pueden proponer formulaciones en base
a piperina enfocadas a combatir el desarrollo de cianobacterias en superficies de monumentos
y en otros nichos.
81
Figura 23. Efecto de la adición de AHLs sintéticas sobre la producción de biomasa (a), la
producción de SEPS (b) y la producción de CEPS (c) en N. chupicuarensis. Distintas letras
mayúsculas indican diferencias significativas entre tratamientos (p<0.05).
Los resultados de este trabajo han puesto en evidencia la complejidad y diversidad de las
biopelículas subaéreas, en particular de las biopelículas muestreadas en Cañada de la Virgen.
Desde el punto de vista ecológico se encontró que el número de microrganismos cultivables
es mucho menor que la diversidad inicial. Sin embargo, en la fracción cultivable puede ser
(con en este caso) que se encuentren microorganismos aún no descritos. Por otro lado,
respecto a la hipótesis planteada, se comprobó que en todas las biopelículas se encuentran
fotótrofos productores de biopelículas y particularmente cianobacterias. Sin embargo, el
supuesto inicial de que las cianobacterias producen biopelículas en respuesta a un sistema de
comunicación tipo quorum sensing fue rechazado. Ya que por lo menos, la cepa en estudio
no lo hace. Aunque, N. chupicuarensis produce polímeros en respuesta a un fenómeno
semejante a la autoinducción no se pudo comprobar la síntesis de algún tipo de señal química.
El único experimento que permitió relacionar la producción de biopelículas en cianobacterias
con un sistema de comunicación microbiana, fue en el que se demostró que las 8C y 10C
AHLs inducen la producción de sustancias poliméricas extracelulares en esta cepa.
Asimismo, se documentó síntesis de la 10C AHL por una bacteria heterótrofa aislada de la
misma biopelícula de la que fue aislada N. chupicuarensis. Estos resultados ponen de
manifiesto la importancia de las relaciones interespecie en el desarrollo de las biopelículas
subaéreas, además de que se aporta evidencia que algunas redes de comunicación dentro de
estas biopelículas pueden estar mediadas por señales químicas tipo AHL.
82
9. CONCLUSIONES
En base a los resultados obtenidos y en relación a la hipótesis planteada sobre la posible
relación de la producción de sustancias poliméricas extracelulares dependiente de un sistema
de comunicación microbiana en cianobacterias formadoras de SABs, se tienen las siguientes
conclusiones:
Se comprobó que la biodiversidad de las biopelículas subaéreas es mayor que la
proporción cultivable en laboratorio. Asimismo, se observó que estas biopelículas pueden ser
fuente de microorganismos no descritos hasta el momento como el caso de la cepa aquí
descrita y nombrada como Nodosilinea chupicuarensis sp. nov.
Se observó que las biopelículas subaéreas están compuestas de microorganismos de
heterótrofos y fotótrofos, y que en todas las biopelículas muestreadas están presentes
fotótrofos con la capacidad de formar biopelículas.
La producción de las sustancias poliméricas extracelulares por N. chupicuarensis no
sigue la cinética de crecimiento, por lo que no se regula por el metabolismo central. En
cambio, se observaron máximos de producción que corresponden a puntos específicos de la
cinética de crecimiento. La cinética de producción de exopolímeros sugiere que su
producción se regula de manera dependiente de la densidad celular.
Existe una relación entre la producción de SEPS y de los CEPS, esto indica que su
producción puede estar regulada por el mismo mecanismo como ocurre en las bacterias
heterótrofas.
Usando medio BG-11 y con las técnicas de GC/EIMS y TLC, así como el uso de
cepas biorreporteros no fue posible detectar la producción de señales tipo QS en los cultivos
de N. chupicuarensis. Lo anterior indica que son producidas a umbrales menores que los de
las bacterias heterótrofas o que no son producidas en absoluto.
Sin embargo, N. chupicuarensis tiene la capacidad de responder a señales tipo acil
homoserina lactona exógenas de 8 y 10 carbonos de longitud de la cadena acilo. La respuesta
se observó en un aumento de la producción de polímeros de la cubierta celular. Tomando en
cuenta que en el cultivo de una bacteria heterótrofa aislada de la misma biopelícula que N.
chupicuarensis se detectó la C10 AHL se puede sugerir que dentro de esta biopelícula puede
83
ocurrir un fenómeno de comunicación interespecie que propicie la producción de polímeros
en N. chupicuarensis.
Así, podemos decir que esta cianobacteria no regula la producción de
exopolisacáridos a través de un sistema de quorum sensing sensu stricto. Sin embargo, se
comprobó la capacidad de esta cepa para regular la producción de EPS en respuesta a la
densidad celular y a señales exógenas tipo AHL, dejando abierta la posibilidad de un
mecanismo de regulación aún no descrito.
La importancia de estos hallazgos radica en la aproximación que se logró para entender la
producción de polímeros en un cepa caracterizada y aislada de una biopelícula subaérea,
especialmente en que se demostró que la síntesis de estos polímeros no está regulada por el
metabolismo central directamente y que señales tipo quorum sensing exógenas inducen la
producción de exopolímeros. Lo anterior tiene implicaciones ecológicas interesantes ya que
se demuestra que las interacciones químicas dentro de la SAB pueden desembocar en la
síntesis de la matriz polimérica de la propia película. Además, en relación a la conservación
del Patrimonio Cultural, se abre la posibilidad de influir en el desarrollo de las SABs
modulando el microambiente químico con el uso de análogos de señales tipo QS.
10. TEMAS POR ABORDAR EN FUTURAS INVESTIGACIONES
Realizar experimentos para evaluar la expresión diferencial de genes cuando la cepa
se encuentra en las distintas fases de producción de exopolisacáridos, con el objetivo de
determinar las rutas que permiten la producción de los polímeros y los mecanismos de
regulación.
Realizar experimentos para evaluar la expresión diferencial de genes de cultivos
adicionados con acil homoserina lactonas, con el objetivo de detectar los receptores y genes
de respuesta para dichas señales.
Ampliar estas observaciones a otros grupos taxonómicos dentro de las cianobacterias
para determinar si es un fenómeno particular o general.
Trabajar en la caracterización, fisiología y metabolismo de N. chipicuarensis y de los
hongos, bacterias y cianobacterias aislados en este trabajo.
84
11. APÉNDICES
11.1. Medios de cultivo
11.1.1. Composición del medio BG-11
Tabla A1. Macroelementos
Componente Cantidad en 1L de
agua destilada
NaNO3 1.5 g
K2HPO4 0.04 g
MgSO4·7H2O 0.075 g
CaCl2·2H2O 0.036 g
Ácido cítrico 0.006 g
Citrato de amonio férrico 0.006 g
EDTA (sal disódica) 0.001 g
Na2CO3 0.02 g
Mezcla de elementos traza 1.0 ml
Agar (si es necesario) 10.0 g
Tabla A2. Mezcla de elementos traza
Componente Cantidad para 1L de aguad
estilada
H3BO3 2.86 g
MnCl2·4H2O 1.81 g
ZnSO4·7H2O 0.222 g
NaMoO4·2H2O 0.39 g
CuSO4·5H2O 0.079 g
Co(NO3)2·6H2O 49.4 mg
85
11.2. Características cromatográficas de algunos estándares de monosacáridos
Tabla A4. Características cromatográficas de algunos
estándares de monosacáridos. El área relativa se ajustó de
acuerdo al isómero más abundante para cada estándar.
Monosacárido Tiempo de
Retención
Área
Relativa
Tipo de
isómero
D-Arabinosa
22.678 0.370 Furano
22.941 0.837 Pirano
23.817 1.000 Pirano
24.572 0.204 Furano
D-Fucosa
23.508 0.143 Furano
24.807 0.640 Pirano
24.955 1.000 Pirano
D-Ribosa
23.668 0.306 Furano
24.171 1.000 Pirano
24.801 0.292 Pirano
D-Galactosa
28.543 0.193 Furano
29.888 0.509 Pirano
30.906 0.112 Furano
31.072 1.000 Pirano
D-Glucosa 30.729 0.774 Pirano
32.531 1.000 Pirano
D-manosa 28.520 1.000 Pirano
31.324 0.280 Pirano
D-xilosa
23.067 0.096 Furano
23.496 0.073 Furano
25.722 1.000 Pirano
27.078 0.909 Pirano
L-Ramnosa 23.284 1.000 Pirano
25.556 0.133 Pirano
Ácido D-galacturónico
29.607 0.906 Furano
31.535 0.517 Furano
31.970 0.628 Pirano
34.013 1.000 Pirano
86
11.3. Secuencias de los genes amplificados de Nodosilinea chupicuarensis PC471
11.3.1. Gen ribosomal 23S
Número de acceso del GenBank: KX859297.1
Secuencia:
GGACAGAAAGACCCTATGAAGCTTTACTGTAGCTTGGTATTGGGTTCGGGCTTTAATTG
CGCAGGATAGGTGGGAGACTTTGAAGTAGCCCTTGTGGGGGTTATGGAGTCACTGGTG
AGATACCACTCTATTAAGGCTAGAATTCTAACTTTGACCCGTTATCCGGGCAGAGAACA
GTATCAGGTGGGCAGTTTGACTGGGGCGGTCGCCTCCTAAATGGTAACGGAGGCGCGC
AAAGGTTCTCTCAGGCTGGTTGGAAATCAGCCATTGAGTGTAAAGGCATAAGAGAGCT
TGACTGCGAGACTGACAAGTCGAGCAGGTACGAAAGTAGGCCTTAGTGATCCGACGGT
TCCGCGTGGAAGGGCCGTCGCTCAACGGATAAAAGTTACTCTAGGGATAACAGGCTGA
11.3.2. Gen ribosomal 16S
Número de acceso del GenBank: KX859298.1
Secuencia:
AGAGGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCG
AACGGACCCTTCGGGGTTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGAGGATCTGCCCTTA
GGAGGGGAACAACAGTTGGAAACGACTGCTAATGCCCCATATGCCGAGAGGTGAAAA
GTTATATCGCCTGAGGATGAACTCGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAGAGCCTA
CCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTAAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGAC
ACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCC
TGACGGAGCAACGCCGCGTGAGGGAGGAAGGCCTTAGGGTTGTAAACCTCTTTTCTCT
GGGAAGAAGAACTGACGGTACCAGAGGAATAAGCCTCGGCTAACTCCGTGCCAGCAG
CCGCGGTAAGACGGAGGAGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGTCCGC
AGGCGGCTAATTAAGTCTGTTGTCAAAGGTCACAGCTCAACTGTGGATCGGCAATGGA
AACTGGTTAGCTAGAGTGTGGTAGGGGTAGAGGGAATTCCCGGTGTAGCGGTGAAATG
CGTAGATATCGGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGCTCTACTGGGCCACAACTGACGC
TGAAGGACGAAAGCTAGGGGAGCGAAAGGGATTAGATACCCCTGTAGTCCTAGCTGTA
AACGATGGATACTAGGTGTTGGACGTATCGACCCGTGCAGTACCGTAGCTAACGCGTT
AAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCACGCAAGTGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGG
GCCCGCACAAGCGGTGGAGGATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCA
AGGCTTGACATGTCGCGAATCTTTCAGAGATGAGAGAGTGCCTTCGGGAGCGCGAACA
CAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAAC
GAGCGCAACCCTCGTTTTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAAGAGACTGCCG
87
GGGACAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTACGTCTTGG
GCTACACACGTCCTACAATGCTACAGACAGAGGGCAGCAAGCGCGCGAGTGCAAGCA
AATCCCATAAACTGTGGCTCAGTTCAGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGGC
GGAATCGCTAGTAATCGCAGGTCAGCATACTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTA
CACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGCCACGCCCGAAGTCGTTACTCTAACCGTTC
GCGGAGGAGGGCGCCGAAGGCAGGGCTGATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAC
CCGTAG
11.3.3. Región ITS 16S-23S
Número de acceso del GenBank: KX859296.1
Secuencia:
TTTAGGGAGACCTACCCTTGATAACTCCGAACCAATTTGAATTAGGAGTATCGAGCGGT
CACTCTAGGTCGTTCAGGACTTTGAGTAGAGTTTCTAGACTATGGTTGAGGTTTATTTCT
TGACTTTAGGTAACTGCTAGCAATAGTTATTTAGGGAACAAGGAACTAAACACGGGCT
ATTAGCTCAGGTGGTTAGAGCGCACCCCTGATAAGGGTGAGGTCCCTGGTTCGAGTCC
AGGATGGCCCACTGCGTGGGGGTTTAGCTCAGCTGGTAGAGCGCCTGCTTTGCAAGCA
GGATGTCAGCGGTTCGAGTCCGCTAACCTCCACCACGAAAGCATAGATTGAATTCAGC
ACAGTGTGTTTTGGTTTGAGCCAAGGCATAGTCTGCTGGGTGAGAGCCTAGCTGAGAA
CCTTGAAAACTGAATATGAGAGAAGTGTAAGGTAGTACACACAGAACATTCAAAGTTC
GTTGAGAGAAGAGTGAACTTGATTAGTTACGACTAATTGAGTGAA
11.4. Comparación morfológica microscópica entre A) la cepa PC171, B) una cianobacteria
del género Chroococcus y C) una microalga del género Chlorosarcinopsis (Figura A1)
88
11.5. Método de la antrona para determinar hexosas totales según Herbert, Phipps y
Strange 1971
Reactivos:
a) Solución estándar de glucosa. 1mg/mL de ácido benzoico al 0.15%. Esta solución
es estable por largos periodos de tiempo mientras se mantenga a 0°C.
b) Solución stock de ácido sulfúrico (75% v/v). Adicional 750 mL de ácido sulfúrico
concentrado a 250 mL de agua destilada.
c) Reactivo de antrona. Agregar 5 mL de etanol absoluto en un volumétrico de 100
mL, adicionar 200 mg de antrona y aforar con la solución stock de ácido sulfúrico al
75%. Agitar hasta disolver perfectamente. Mantener a 4°C.
Procedimiento
1 mL de solución de la muestra problema se transfiere a un tubo de tamaño y material
apropiado. Los tubos y el reactivo de antrona se enfrían con un baño de hielo. Una vez
fríos, a los tubos se les agregan 5 mL de reactivo de antrona y se transfieren
inmediatamente a un baño de agua hirviendo (100°C). Posteriormente los tubos se
transfieren a un baño de hielo y una vez fríos se mide la absorbancia de las soluciones
resultantes a 625 nm. La curva de calibración se realiza con el mismo procedimiento
usando distintas diluciones de la solución de glucosa, aforadas a 1 mL.
89
11.6. Registro microscópico de la biodiversidad microbiana en las biopelículas
muestreadas
Figura A2. Microscopias de una muestra de la biopelícula C4 obtenida de Cañada de la
Virgen. Se puede observar la diversidad inicial, que resulto mayor a la fracción cultivable.
90
11.7. Búsqueda in silico de receptores para AHLs en el género Nodosilinea
11.7.1. LUXR
91
92
11.7.2. LUXQ
93
94
95
96
97
11.8. Publicaciones derivadas de este trabajo de tesis
Vázquez-Martínez J, Ramírez-Chávez E, Gutierrez-Villagomez J, Molina-
Torrez, J. Extracellular Polysaccharides and Biomass Production in Cyanobacteria
Isolated from Stone Monuments in Dry Zones of Mexico. Journal of Chemical,
Biological and Physical Sciences, 2014:4;33-43.
Vázquez-Martínez J, Nieto-Alvarez E, Ramírez-Chávez E, Molina-Torres J.
Enzimatic method for N-Acyl Homoserine Lactones Synthesis Using Immobilized
Candida antarctica Lipase. Catalysis Letters. Aceptado 2017.
Vázquez-Martínez J et al. Nodosilinea chupicuarensis sp. nov.
(Leptolyngbyaceae, Synechococcales) a subaerial cyanobacterium isolated from a
stone monument in central Mexico. Phytotaxa. En revision.
98
12. REFERENCIAS
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