Figure 1. Les différentes “omiques”, de l’étude du génome (ADN) à l’étude du métabo-lome (métabolite).

Métabolome Métabolite

Protéome

Génome ADN

Transcriptome ARNm

Protéine

La Lettre du Neurologue • Vol. XVIII - no 2 - février 2014 | 53

MISE AU POINT

Une nouvelle “omique” : l’approche métabolomiqueA new “omics”: the metabolomic approach

H. Blasco*, P. Corcia**

* Laboratoire de biochimie et de bio-logie moléculaire, CHRU de Tours, et unité Inserm U930 “neurogénétique et neurométabolomique”, univer-sité François-Rabelais.

** Service de neurologie, centre SLA, CHRU de Tours, et unité Inserm U930 “neurogénétique et neuro-métabolomique”, université Fran-çois-Rabelais.

L a biochimie tradit ionnel le ne permet pas d’accéder à l’ensemble des réactions bio chimiques complexes nécessaires à la

compréhension de la biologie à l’échelle d’un organisme tel que l’homme. Dans le domaine de la santé, la problématique omniprésente de l’iden-tification de biomarqueurs a permis de s’ouvrir à des approches globales : les “omiques”. Par analogie avec la génomique (l’étude de l’ensemble des gènes), à la transcriptomique (l’étude de l’ensemble des ARN messagers) et à la protéomique (l’étude de l’ensemble des protéines) est apparue, depuis la fin des années 1990, la métabolomique (figure 1) [1]. Elle se définit comme l’analyse de tous les composés organiques de petite taille (métabolite < 1 500 Da) contenus dans un système biologique. Cet ensemble de métabolites (acides aminés, acides organiques, sucres, acides gras, etc.) détectés dans les fluides biologiques, les tissus et les cellules notamment, est nommé le métabolome. Il représente les substrats, les produits ou encore les co-cofacteurs des réactions de l’organisme. Le nombre de métabolites est, à ce jour, difficile à évaluer, selon le type de métabolites considérés : plus de 40 000 métabolites sont référencés dans la base de données Human Metabolome Project (HMP), 28 000 composants alimentaires dans la Food Component Database. Dans un contexte médical , l ’approche métabolomique offre l’avantage de fournir un profil métabolique global d’une matrice biologique donnée, sans a priori et de manière quasi exhaustive. S’inscrivant au-delà de la génomique, elle reflète les caractéristiques du protéome, du transcriptome et donc du génome, se positionnant ainsi comme l’étude de l’ultime réponse d’un organisme à des modifications génétiques, environnementales ou pathologiques.

Les différentes approches de la métabolomiqueOn distingue les analyses ciblées et les analyses globales. Premièrement, l’analyse ciblée fait référence à l’identification et à la quantification d’un nombre réduit de métabolites particuliers. Deuxièmement, le profilage métabolique permet d’analyser tous les composés d’une voie métabolique ou d’une famille de composés. Troisièmement, l’empreinte métabo-lique est une approche chimiométrique destinée à la description phénotypique d’un système vivant et à la recherche de biomarqueurs, aboutissant à une classi-fication des échantillons. Cette méthode permet d’identifier des profils spécifiques de pathologies

54 | La Lettre du Neurologue • Vol. XVIII - no 2 - février 2014

RésuméLa métabolomique est une approche émergente qui s’est largement développée depuis une vingtaine d’années, notamment dans le domaine de la santé. L’accès de manière globale à un profil métabolique a suscité de nombreux espoirs dans la recherche de biomarqueurs à visée diagnostique, pronostique ou pour établir des phénotypes biologiques utilisables pour la stratification des patients dans les essais cliniques. Dans cet article, nous définissons la métabolomique, les limites mais aussi les perspectives d’évolution de cette technologie d’avenir. De nombreuses études métabolomiques ont permis d’améliorer les connaissances de voies physiopathologiques de certaines pathologies, notamment en neurologie. Cependant, le manque de validation robuste de modèles de prédiction de diagnostic à partir des données de métabolomique limite l’utilisation de cette approche en routine. Ainsi, malgré les avancées dans ce domaine, il n’est pas encore envisageable à ce jour de l’utiliser pour une médecine personnalisée.

Mots-clésMétabolomiqueBiomarqueursEmpreinte métaboliqueSpectrométrie de masseRésonance magnétique nucléaire

SummaryMetabolomics is an emerging approach that has largely developed since about twenty years, particularly in the field of health. Access to a global metabolic profile is promising in the search for biomarkers. Thus, many hopes are based on this new “omics” science to identify a set of biomarkers for diagnosis, prognosis or to establish different biological phenotypes for stratification of patients in clinical trials. In this review, we define metabolo-mics with the different steps of this approach. A better knowl-edge of this strategy allows us to understand the limitations but also the perspectives for this science. Numerous metabolomics studies have improved the understanding of pathophysiological path-ways of diseases, particularly in neurology. However, the lack of robust validation of diagnosis predictive models based on metabolomics data limits the use of this approach. Moreover, no biological marker identified by metabolomics studies is used in routine practice. Thus, despite the advances in this field, it is not yet possible to use metabolomics for personal-ized medicine.

KeywordsMetabolomics

Biomarkers

Metabolic fingerprint

Mass spectrometry

Nuclear magnetic resonance

sans nécessité d’identification ou de quantification des métabolites perturbés. Enfin, on parle également d’approche métabolomique ou méta bonomique permettant d’identifier et de quantifier tous les métabolites d’un échantillon biologique prélevé dans des conditions données. Cette vue d’ensemble du métabolisme d’un organisme permet d’appréhender les relations entre les voies métaboliques et d’isoler des modifications métaboliques caractéristiques d’une pathologie donnée.

Objectifs des études métabolomiques en santéL’analyse d’un nombre réduit de métabolites ciblés ou d’empreintes métaboliques entre des groupes de malades et de sujets contrôles vise à identifier des spécificités métaboliques inhérentes à la pathologie étudiée. Ainsi ces données pourraient contribuer au diagnostic ou au pronostic de certaines pathologies, dans le but de décrire la population et surtout, à terme, de prédire le statut des patients. Cette analyse pourrait aussi aider à la détermination de sous-groupes particuliers de patients à intégrer dans la stratification des essais cliniques. Enfin, on attend de ce type d’étude une amélioration de la connaissance des voies physiopathologiques d’une maladie par la mise en évidence, par exemple, de l’implication d’une voie biochimique particulière.

Les différentes étapes de l’approche métabolomique

Classiquement, on définit les étapes décrites dans la figure 2.

Recueil des échantillons

Le type de fluide biologique à recueillir est à adapter en fonction de la pertinence des modifica-tions métaboliques à mettre en évidence (liquide céphalorachidien [LCR] en neurologie, par exemple) et de la faisabilité du recueil. Une approche métabo-lomique ciblée ou non reste une étude du métabo-

lisme variable en fonction de l’alimentation ou de la prise en charge médicamenteuse, par exemple. Ainsi, des conditions standard de prélèvement (à jeun, non hémorragique) sont à appliquer de manière rigoureuse pour assurer la fiabilité de l’analyse et de l’interprétation, ainsi que pour limiter les facteurs de confusion.

Traitement pré-analytique

Quelques équipes ont proposé des recommanda-tions pour les conditions de conservation des fluides biologiques destinés à être analysés en métabo-lomique (stockage dans des tubes en polypropylène, conservation à –80° C, etc.) [2]. De même, il est préférable d’appliquer des conditions standard de préparation des échantillons, adaptées aux méthodes analytiques utilisées (déprotéinisation, dérivation, etc.) afin d’assurer une détection optimale des métabolites et une comparabilité avec les autres études.

Analyse des échantillons

Les techniques analytiques utilisées pour la métabolomique sont des techniques de pointe, à haut débit, et riches de leur complémentarité. Les plus couramment utilisées sont la spectros-copie par résonance magnétique nucléaire (RMN), la chromatographie gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS) et la chroma-tographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MSMS) [3]. La RMN est peu sensible, mais présente l’avantage majeur d’être une technique non destructive, spécifique et permettant d’accéder relativement aisément à l’identification des méta bolites. La GC-MS est une technique nécessitant une étape plus longue de préparation de l’échantillon. Elle est cependant très spécifique et dispose de banques de données informatives pour l’identification des métabolites. Enfin, la LC-MSMS est la technique la plus sensible et résolutive de toutes, mais elle souffre d’un manque d’outils fiables pour l’identification des composés d’intérêt et reste très coûteuse. Une analyse par ces différentes techniques conduit à l’obtention de

Figure 2. Principales étapes d’une étude métabolomique.

4

2

0

– 2

– 4

– 6– 3 – 2 – 1 0 1 2

TémoinsSLA

1.00145 * t(1)

1.10

769 *

to(1

)

87,11 % de sujets bien prédits

La Lettre du Neurologue • Vol. XVIII - no 2 - février 2014 | 55

MISE AU POINT

spectres (RMN) ou de chromatogrammes (GC-MS, LC-MSMS) représentant des pics qui correspondent aux différents composés présents dans le milieu biologique.

Analyse des données

Une analyse non ciblée considère le profil méta bolique global, impliquant un découpage des spectres ou des chromatogrammes en zones dont les aires sont intégrées et quantifiées (c’est-à-dire, quantification relative : aire d’une zone/aire totale du spectre, par exemple). Les approches multivariées sont prisées pour ce type d’étude, notamment l’analyse par composante principale (ACP) et l’analyse discriminante par mesure des moindres carrés partiaux orthogonaux (OPLS-DA) [4]. Ces outils permettent d’identifier des groupes de sujets en fonction de l’empreinte métabolique. À l’issue de l’optimisation du modèle de discrimi-nation des populations étudiées, les métabolites les plus pertinents sont isolés pour être identifiés à l’aide des bases de données existantes (HMP [5], ChemSpider, etc.). L’objectif final de l’identification est de pouvoir suggérer des hypothèses physio-pathologiques ou au moins de proposer une inter-prétation des modifications biochimiques en lien avec le contexte pathologique, et d’en extraire des hypothèses mécanistiques. À l’inverse, une analyse ciblée sur des molécules ou des types de molécules utilise une partie de l’information du profil métabo-lique, en se focalisant sur certaines zones du spectre ou du chromatogramme. Les métabolites pertinents sont alors quantifiés spécifiquement et sont analysés par des tests statistiques univariés ou peuvent être réintégrés dans des analyses multivariées.

Limites de la métabolomique

Méthodologie des études

Les études métabolomiques souffrent particuliè-rement du manque de spécificité, dû notamment à l’hétérogénéité des populations étudiées. Par ailleurs, la lourdeur pratique et le coût élevé de ces stratégies restreignent la taille de la cohorte étudiée, limitant ainsi la puissance de ces études. Bien qu’elles soient les plus pertinentes en neurologie, les études métabolomiques du LCR sont biaisées par l’absence d’une population contrôle idéale, car il est éthiquement impossible de disposer du LCR

de sujets indemnes de toute pathologie. De plus, la méthodologie de ces études est souvent discutable avec, en particulier, des imprécisions sur les étapes de recueil des échantillons, ce qui limite la portée des résultats.

Contraintes des analyses biologiques

La métabolomique étant utilisée avec l’espoir ultime d’une application en clinique, elle nécessite, comme toute analyse biologique de routine, le strict respect des conditions standard pré-analytiques et analy-tiques (type accréditation) qui restent complexes et trop coûteuses. Récemment, la notion de contrôles de qualité s’est développée, afin de s’assurer que les modifications métaboliques observées dans une population sont associées à un contexte clinique et non à une variabilité analytique (6). Malheureusement, ce type de données est rarement publié et conduit à une certaine réticence quant à la fiabilité des résultats, notamment la possibilité de reproduire ces résultats.

Complexité et multiplicité des donnéesLa puissance et l’évolution des techniques analytiques actuelles conduisent à la détection de modifications métaboliques subtiles que peuvent traduire des facteurs environnementaux ou épidémio logiques (7). La maîtrise de ces paramètres devient donc indispen-sable pour focaliser l’interprétation des données sur une pathologie précise, sans être perturbés par des

Interprétation dans le contexte clinique

Analyse statistique univariée Analyse statistique multivariée

(classification)

Identification des métabolites

d’intérêt

Étape pré-analytique

Étape analytique

RMN-GC-MS-LC-MSMS

Recueil des échantillons

– LCR, sang, urine– Tissus– Cellules

Acquisition, réduction des données

4

2

0

– 2

– 4

– 6– 3 – 2 – 1 0 1 2

TémoinsSLA

1.00145 * t(1)

1.10

769 *

to(1

)

87,11 % de sujets bien prédits

Figure 3. Modèle multivarié (OPLS DA) réalisé à partir du métabolome du LCR de patients SLA (n = 66) et de sujets témoins (n = 128), analysé par LC-MSMS (d’après Blasco H et al., J Prot Res 2013).

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Une nouvelle “omique” : l’approche métabolomiqueMISE AU POINT

facteurs de confusion. Une des difficultés majeures de la métabolomique est la gestion de la grande quantité de données générées. Les analyses multi-variées montrent souvent des modèles discriminants mais ce type de modèle devient pertinent surtout après une identification des métabolites d’intérêt. Cette étape est souvent longue, très difficile, et reste souvent inachevée. De plus, une validation rigoureuse du modèle, type validation externe, n’est pas souvent réalisée, expliquant que la métabolomique n’est pas encore suffisamment robuste pour une utilisation en pratique de routine.

Perspectives

Combinaison des méthodes

Chacune des techniques analytiques utilisées pour la métabolomique présente des limites et ne peut détecter tous les métabolites tant les propriétés physicochimiques des molécules sont variées. Ainsi, la combinaison de différentes méthodes semble être une perspective prometteuse dans la recherche de biomarqueurs, mais elle reste compliquée en termes de faisabilité pratique et de coût. Une association du métabolome de différents fluides biologiques serait également pertinente, telle que l’analyse simultanée du LCR et du sang pour documenter les échanges à travers la barrière hémato-encéphalique. De même, des études prenant en compte la dynamique des modifications métaboliques au cours de l’évolution d’une maladie seraient particulièrement informa-

tives dans des pathologies d’évolution hétérogène. Comme le suggèrent souvent les chercheurs, une combinaison des différentes sciences “omiques” pourrait apporter de nombreuses précisions dans l’interprétation des données. Cependant, en toute lucidité, aucune méthode mathématique convain-cante n’a été établie à ce jour pour prendre en compte une telle quantité de données avec autant de redondance d’informations. De plus, une colla-boration forte entre cliniciens, analystes, chimistes, bio-informaticiens, biostatisticiens et biochimistes est indispensable pour ces études, avec notamment le développement de nouveaux outils (8).

Validation des modèles

Des efforts sont à fournir pour la validation des modèles : de la technique analytique jusqu’aux modèles de prédiction. Une attention toute parti-culière doit être portée aux étapes de l’analyse statistique : épuration des données avant d’établir les modèles multivariés afin de ne pas y intégrer du bruit de fond analytique, application de la correction pour tests multiples pour les tests univariés, par exemple. Enfin, une validation externe des modèles de prédiction est l’outil le plus prometteur pour juger de la pertinence d’un modèle. Cette validation consiste à appliquer un modèle établi dans une étude métabolomique obéissant à tous les critères précités à une autre population, indépendante, analysée en aveugle, et même, si possible, par une autre plate-forme analytique avec d’autres intervenants.

Applications en neurologie

Quelques études ont été publiées dans des pathologies neurologiques ou neuropsychia-triques (9) telles que la maladie d’Alzheimer (10), la dépression (11), la maladie de Parkinson (12) ou encore l’autisme (13). La pathologie qui a été le plus étudiée avec cette approche est la sclérose latérale amyotrophique (SLA), pour laquelle le diagnostic est particulièrement difficile, avec un délai élevé entre les premiers symptômes et le diagnostic (14). Parmi les études menées dans cette pathologie, une étude suédoise a mis en évidence des profils métaboliques différents selon le statut génétique des patients SLA (15), et notre équipe a validé pour la première fois l’utilisation de la LC-MSMS pour analyser le LCR de sujets atteints de SLA avec une discrimination correcte entre les patients et les témoins (figure 3).

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MISE AU POINT

1. Patti GJ, Yanes O, Siuzdak G. Innovation. Metabolomics: the apogee of the omics trilogy. Nat Rev Mol Cell Biol 2012;13(4):263-9.2. Wuolikainen A, Hedenström M, Moritz T et al. Optimi-zation of procedures for collecting and storing of CSF for studying the metabolome in ALS. Amyotroph Lateral Scler 2009;10(4):229-36.3. Theodoridis GA, Gika HG, Want EJ et al. Liquid chro-matography-mass spectrometry based global metabolite profiling: a review. Anal Chim Acta 2012;711:7-16.4. Madsen R, Lundstedt T, Trygg J. Chemometrics in metabolomics−a review in human disease diagnosis. Anal Chim Acta 2010;659(1-2):23-33.5. Wishart DS, Jewison T, Guo AC et al. HMDB 3.0−The Human Metabolome Database in 2013. Nucleic Acids Res 2013;41(D1):D801-7.6. Crews B, Wikoff WR, Patti GJ et al. Variability analysis of human plasma and cerebral spinal fluid reveals statis-

tical significance of changes in mass spectrometry-based metabolomics data. Anal Chem 2009;81(20):8538- 44.7. Krug S, Kastenmüller G, Stückler F et al. The dynamic range of the human metabolome revealed by challenges. FASEB J 2012;26(6):2607-19.8. Courant F, Royer AL, Chéreau S et al. Implementation of a semi-automated strategy for the annotation of metabolomic fingerprints generated by liquid chromatography-high reso-lution mass spectrometry from biological samples. Analyst 2012;137(21):4958-67.9. Quinones MP, Kaddurah-Daouk R. Metabolomics tools for identifying biomarkers for neuropsychiatric diseases. Neurobiol Dis 2009;35(2):165-76.10. Trushina E, Dutta T, Persson XM et al. Identification of altered metabolic pathways in plasma and CSF in mild cognitive impairment and Alzheimer’s disease using meta-bolomics. PLoS One 2013;8(5):e63644.

11. Zheng P, Gao HC, Li Q et al. Plasma metabonomics as a novel diagnostic approach for major depressive disorder. J Proteome Res 2012;11(3):1741-8.

12. Caudle WM, Bammler TK, Lin Y et al. Using ‘omics’ to define pathogenesis and biomarkers of Parkinson’s disease. Expert Rev Neurother 2010;10(6):925-42.

13. Emond P, Mavel S, Aïdoud N et al. GC-MS-based urine metabolic profiling of autism spectrum disorders. Anal Bioanal Chem 2013;405(15):5291-300.

14. Rocchetti I, Taruscio D, Pierannunzio D. Modeling delay to diagnosis for amyotrophic lateral sclerosis: under repor-ting and incidence estimates. BMC Neurol 2012;12:160.

15. Wuolikainen A, Andersen PM, Moritz T et al. ALS patients with mutations in the SOD1 gene have an unique metabolomic profile in the cerebrospinal fluid compared with ALS patients without mutations. Mol Genet Metab 2012;105(3):472-8.

Références bibliographiques

Conclusion

La métabolomique est une approche globale émergente, pouvant apporter une aide précieuse en santé, notamment dans la recherche de biomarqueurs. À ce jour, aucun marqueur ou profil de marqueurs issu des études métabolomiques n’est utilisé en pratique de routine. Les progrès de cette technologie visent à renforcer la robustesse de toutes les étapes de ce

type d’analyse où la combinaison des compétences humaines est indispensable. L’utilisation en pratique de routine pour aider au diagnostic, pour améliorer la prise en charge des patients ou pour stratifier les patients inclus dans les essais cliniques n’est pas envisageable à court terme, mais les efforts de standardisation de cette approche sont amorcés, et l’acceptation de souscrire à ces recommandations par la communauté scientifique est en bonne voie. ■

H. Blasco déclare ne pas avoir de liens d’intérêts.