Upload
others
View
5
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
YÜKSEK LİSANS TEZİ Zeycan KESKİN AKRİLAMİDİN KANDA Na+-K+ ATPaz ENZİM AKTİVİTESİ VE GLUTATYON, HEMOGLOBİN, ALBUMİN DÜZEYLERİNE ETKİSİ
KİMYA ANABİLİM DALI
ADANA, 2007
ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
AKRİLAMİDİN KANDA Na+ - K+ ATPaz ENZİM AKTİVİTESİ VE GLUTATYON,
HEMOGLOBİN, ALBUMİN DÜZEYLERİNE ETKİSİ
Zeycan KESKİN
YÜKSEK LİSANS TEZİ
KİMYA ANABİLİM DALI
Bu tez 09/02/2007 tarihinde aşağıdaki jüri üyeleri tarafından oy birliği ile kabul edilmiştir. İmza……………….. İmza……………… İmza……………….. Doç.Dr.Güzide YÜCEBİLGİÇ Prof.Dr.S.Seyhan TÜKEL Doç.Dr.Elif ORUÇ DANIŞMAN ÜYE ÜYE Bu Tez Enstitümüz Kimya Anabilim Dalında Hazırlanmıştır. Kod No:
Prof.Dr.Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü İmza ve Mühür
Bu çalışma Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarfından desteklenmiştir. Proje No: FEF 2006 YL 38 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaklardan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak göstermeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.
I
ÖZ
YÜKSEK LİSANS TEZİ
AKRİLAMİDİN KANDA Na+-K+ ATPaz ENZİM AKTİVİTESİ VE
GLUTATYON, HEMOGLOBİN, ALBUMİN DÜZEYLERİNE ETKİSİ
Zeycan KESKİN
ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
KİMYA ANABİLİM DALI
Danışman : Doç. Dr. Güzide YÜCEBİLGİÇ
Yıl 2007 , Sayfa 42
Jüri : Prof. Dr. S. Seyhan TÜKEL
Doç. Dr. Güzide YÜCEBİLGİÇ
Doç. Dr. Elif ORUÇ
Akrilamid poliakrilamid malzemelerin yapımında kullanılan bir kimyasaldır.
Poliakrilamid içme ve atık suların iyileştirilmesinde, ayrıca kâğıt ve kozmetiklerde
yapıştırıcı madde yapımında kullanılmaktadır. Akrilamid yüksek sıcaklıklarda
hazırlanmış bazı gıdalarda gıdanın bünyesinde oluşmaktadır. Akrilamidin insanlarda
ve laboratuvar hayvanlarında nörotoksik etkisi kanıtlanmıştır. Uluslararası Kanser
Araştırmaları Kurumu (International Agency for Research into Cancer) gıdalardaki
akrilamidi ‘insanlar için potansiyel kanserojen maddeler’ arasına almıştır.
Çalışmada toksik etkisinin olduğu bilinen akrilamid ile etkileştirilen kanlarda
glutatyon (GSH), hemoglobin (Hb) ve albumin düzeyleri araştırılmıştır. Ayıca, bu
çalışmada akrilamid ile etkileştirilen eritrosit zarında Na+-K+ ATPaz aktivite tayini
yapılmıştır. Akrilamid ile muamele edilen kanlarda GSH, Hb ve albumin
düzeylerinin düştüğü ve akrilamid ile etkileştirilen eritrosit zarında Na+-K+ ATPaz
enziminin aktivitesinin azaldığı saptanmıştır.
Anahtar Kelimeler: Akrilamid, Glutatyon, Hemoglobin , Albumin, Na+-K+ ATPaz
II
ABSTRACT
MY THESIS
INFLUENCE OF ACRYLAMIDE ON Na+ - K+ ATPase ACTIVITY AND
GLUTATHION, HEMOGLOBIN, ALBUMIN CONTENT IN BLOOD
Zeycan KESKİN
UNIVERSITY OF ÇUKUROVA
INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES
DEPARTMENT OF CHEMISTRY
Supervisor: Assoc. Dr. Güzide YÜCEBİLGİÇ
Year 2007, Page 42
Jury : Prof. Dr. S. Seyhan TÜKEL
Assoc. Dr. Güzide YÜCEBİLGİÇ
Assoc. Dr. Elif ORUÇ
Acrylamide is used as a chemical substance in polyacrylamide based
materials. Polyacrylamide is used in improvment of drinking and waste water, as
adhesive in paper and cosmetic industry. While some food are prepared at high
temperatures, acrylamide is formed. It is known that acrylamide has neurotoxic
effect on human and animal. Acrylamide has been defined as a cancerogenic
substance by International Agency for Research into Cancer.
This study was carried out to investigate the effects of different doses
of acrylamide on levels of glutathion (GSH), hemoglobin (Hb), albumin and Na+-K+
ATPase of erythrocyte membrane. It is found that when the bloods were treated with
acrylamide GSH, Hb and albumin levels and Na+-K+ ATPase on the erythrocyte
membrane were all decreased.
Key Words: Acrylamide, Glutathion, Hemoglobin, Albumin, Na+-K+ ATPase
III
TEŞEKKÜR Bu çalışma sürecince beni yönlendiren, çalışmamı değerli kılan danışman
hocam Doç.Dr.Güzide YÜCEBİLGİÇ’e teşekkürlerimi sunarım. Çalışmalarımda
benden yardım ve desteklerini esirgemeyen hocalarım Prof.Dr.S.Seyhan TÜKEL’e,
Yrd.Doç.Dr.Ramazan BİLGİN’e, Arş. Gör. Özlem ALPTEKİN’e ve Arş. Gör. Hasan
KARADAĞ’a teşekkür ederim. Ayrıca hiçbir zaman benden sabrını ve desteğini
esirgemeyen sevgili eşime, aileme ve kızıma da sonsuz teşekkürlerimi sunarım.
İÇİNDEKİLER SAYFA
ÖZ ............................................................................................................................ I
ABSTRACT ............................................................................................................ II
TEŞEKKÜR ........................................................................................................... III
İÇİNDEKİLER ...................................................................................................... IV
ÇİZELGELER DİZİNİ .......................................................................................... VI
ŞEKİLLER DİZİNİ .............................................................................................. VII
SİMGELER VE KISALTMALAR .......................................... . ........................... VIII
l.GİRİŞ ................................................................................................................... 1
1.1. Akrilamid... ........................................................................................ ........... 1
1.2. Na+-K+ATPaz Enzimi .................................................................................... 8
1.3. Glutatyon ..................................................................................................... 10
1.4. Hemoglobin ................................................................................................. 12
1.5. Albumin ....................................................................................................... 13
2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR ................................................................................... 15
3.MATERYAL METOT ......................................................................................... 19
3.1. Materyal ....................................................................................................... 19
3.2. Metot ........................................................................................................... 19.
3.2.1. İnsan Eritrositlerinin Hazırlanması ...................................................... 19
3.2.2. Eritrosit Zarlarının Hazırlanması ......................................................... 19
3.2.3. Eritrositlerin Akrilamid İle Etkileştirilmesi .......................................... 20
3.2.4. Protein Tayini ..................................................................................... 20
3.2.5. İnorganik Fosfat Ölçümü ..................................................................... 21
3.2.6. Na+-K+ ATPaz'ın Spesifik Aktivite Tayini ............................................ 22
3.2.7. Redükte Glutatyon Tayini (GSH) ........................................................ 23
3.2.8. Hemoglobin Tayini ............................................................................. 24
3.2.9. Albumin Tayini .................................................................................. 25
4.BULGULAR VE TARTIŞMA ............................................................................ 27
4.1. Bulgular ........................................................................................................ 27
4.1.1. Standart Protein Eğrisinin Çiziminde Elde Edilen Bulgular................... 27
IV
4.1.2. İnorganik Fosfat Eğrisinin Çizimi ........................................................ 28
4.1.3. Çeşitli Derişimlerde Akrilamid İçeren Kan Örneklerindeki Hemoglobin
Düzeyleri ............................................................................................ 29
4.1.4. Çeşitli Derişimlerde Akrilamid İçeren Tam Kandaki
GSH Düzeyleri.................................................................................... 30
4.1.5. Çeşitli Derişimlerde Akrilamid İçeren Tam Kandaki
Albumin Düzeyleri ............................................................................... 32
4.1.6. Zar Elde Edilmesi ve Zarın Protein Tayini .......................................... 33
4.1.7. Zarın Çeşitli Derişimlerdeki Akrilamid İle Etkileştirilmesi Sonucunda
Na+-K+ ATPaz Enzim Aktivite Değerleri .............................................. 34
4.2. Tartışma ....................................................................................................... 35
5.SONUÇLAR VE ÖNERİLER ............................................................................. 37
5.1. Sonuçlar ....................................................................................................... 37
5.2. Öneriler ........................................................................................................ 37
KAYNAKLAR ...................................................................................................... 38
ÖZGEÇMİŞ ........................................................................................................... 42
V
ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA
Çizelge 1.1. TÜBİTAK'ın Türkiye'deki akrilamid tespiti.......................................... 5
Çizelge 1.2. Çeşitli gıdalardaki akrilamid seviyesi ................................................... 5
Çizelge 4.1. Standart Protein Eğrisi için elde edilen bulgular ................................. 27
Çizelge 4.2. Fosfatın farklı derişimlerdeki çözeltilerinin 390 nm'de
ölçülen absorbans değerleri ................................................................. 28
Çizelge 4.3. Çeşitli derişimlerde akrilamid eklenen kan örneklerinin
içerdiği hemoglobin düzeyi ................................................................. 29
Çizelge 4.4. Çeşitli derişimlerde akrilamid eklenen kan örneklerinin
içerdiği GSH düzeyi ............................................................................ 31
Çizelge 4.5. Çeşitli derişimlerde akrilamid eklenen kan örneklerinin
içerdiği albumin düzeyi ...................................................................... 32
Çizelge 4.6. Zar örneğinin içerdiği protein miktarı ..................................................33
Çizelge 4.7. Çeşitli derişimlerde akrilamid içeren zar örneklerinde
belirlenen Na+-K+ ATPaz aktivitesi ..................................................... 34
VI
ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA
Şekil 1.1. Akrilamidin yapısı ................................................................................... 1
Şekil 1.2. Akrilamidin oluşum mekanizması .............................................................. 2
Şekil 1.3. Akrilamidin tiyolat anyonlarıyla reaksiyonu ............................................ .3
Şekil 1.4. Akrilamidin küçük reaktif moleküllerle reaksiyonu.................................... 3
Şekil 1.5. Millard Reaksiyonu .................................................................................. 6
Şekil 1.6. Akrilamidin P450 (CYP2E1) enzimleri tarafından glisidamide
dönüşmesi ................................................................................................. 7
Şekil 1.7. Akrilamidin metabolık yollarının CYP2EU GST ve EH enzimleri
ile ilişkisi ................................................................................................. 8
Şekil 1.8. Na^-K+ ATPaz enziminin yapısı.................................................................. 9
Şekil 1.9. Na+-K+ ATPaz enziminin etki şekli ............................................................. 9
Şekil 1.10. Glutatyon (y-glutamil sisteinil glisin) .................................................... 10
Şekil 1.11. Hem'in yapısı ....................................................................................... 12
Şekil 4.1. Standart Protein Eğrisi ............................................................................ 28
Şekil 4.2. İnorganik Fosfatın 390 nm'deki Standart Grafiği .................................... 29
Şekil 4.3. Çeşitli derişimlerde akrilamid içeren tam kandaki hemoglobin
düzeyinde meydana gelen değişiklikler ................................................... 30
Şekil 4.4. Çeşitli derişimlerde akrilamid içeren tam kandaki GSH
düzeyinde meydana gelen değişiklikler .................................................. .31
Şekil 4.5. Çeşitli derişimlerde akrilamid içeren tam kandaki albumin
düzeyinde meydana gelen değişiklikler ................................................... 33
Şekil 4.6. Çeşitli derişimlerde akrilamid içeren zar örneklerinin
Na+-K+ATPaz aktivitesinde meydana gelen değişiklikler ......................... 35
VII
SİMGELER VE KISALTMALAR
ACR Akrilamid
GSH Glutatyon
Hb Hemoglobin
ABS Absorbans
Prot. Protein
TCA Tri Klor Asetik Asit
Inkb İnkübasyon
C Derişim
H2Ö2 Hidroj en Peroksit
VIII
1.GİRİŞ Zeycan KESKİN
1
1.GİRİŞ
2002 yılında İsveç Ulusal Gıda Merkezi tarafından yüksek sıcaklıkta işlem
görmüş gıdalarda akrilamidin yüksek boyutlarda oluştuğunu ortaya koyan bir rapor
yayınlanmıştır. İsveç’te başlayan bu araştırma 2002 yılında Birleşmiş Milletlerin
gündemine taşınmış ve Birleşmiş Milletlere bağlı Dünya Sağlık Organizasyonu
(WHO) çeşitli ülkelerle, çeşitli programlar organize etmiştir. Hollanda, İsviçre,
Norveç, İngiltere ve ABD gibi ülkelerde pişirilmiş ve sıcakta işlem görmüş gıdaların
pek çoğunda akrilamidin oluştuğunu ortaya koyan çalışmalar yapılmıştır.
Akrilamidin insanlarda ve laboratuvar hayvanlarında nörotoksik etkisi kanıtlanmıştır.
Yine laboratuvar hayvanlarında kötü huylu tümör oluşumuna neden olduğu tespit
edilmiştir. İnsanlardaki kanser oluşumuyla henüz bir bağlantısı kanıtlanmasa da
Uluslararası Kanser Araştırmaları Kurumu (International Agency for Research into
Cancer) gıdalardaki akrilamidi ‘insanlar için potansiyel kanserojen maddeler’ arasına
almıştır (Paulsson ve ark, 2002).
1.1.Akrilamid
H2N CHC CH2
O
Şekil 1.1. Akrilamidin yapısı
Akrilamid doymamış çift bağ içeren bir amiddir (Blasiak ve ark, 2004).
2-propenoamid, etilen karboksamid, akrilik asit amid, vinil amid, propenoik asit
amid olarak da bilinmektedir. Sıvı halde iken beyaz bir kristal gibi görülür,
kokusuzdur ve suda yüksek çözünürlüğe sahiptir. Erime sıcaklığı 84,56C, kaynama
sıcaklığı (25 mm Hg) 1256C’dir (atmosfer basıncında 192,66C) (Lingnert ve ark,
2002).
1.GİRİŞ Zeycan KESKİN
2
Akrolein (2-propenal,CH2=CH-CHO) üç karbonlu aldehittir ve akrilamidin
yapısını (CH2=CH-C(O)-NH2) anımsatmaktadır. Bu nedenle akrolein akrilamidin
başlangıcı olarak kabul edilmektedir. Temel kimyasal transformasyonlar ile akrolein
akrilamide dönüşebilir, ancak akrilamidin alternatif oluşum mekanizmalarında
akrolein gerekli değildir. Örneğin, proteinler ve/veya aminoasitler hidroliz,
dekarboksilasyon gibi transformasyonlardan sonra akrilamidin oluşmasına neden
olabilmektedir (Lingnert ve ark, 2002).
Şekil 1.2. Akrilamidin oluşum mekanizması
Akrilamid nükleofillerle özellikle tiyolat anyonlarıyla reaksiyona girebilir
(Tong ve ark, 2004).
1.GİRİŞ Zeycan KESKİN
3
RSH
H+ + RS + CH2 CH X RS CH2 CH2 Xk
X = CONH2 , C N , vs.
Şekil 1.3. Akrilamidin tiyolat anyonlarıyla reaksiyonu
Akrilamid üre (CO(NH2)2) ve formaldehit (HCHO) veya glioksal ((CHO)2),
aldehitler (RCHO), aminler (R2NH), tiyoller (RSH) gibi küçük reaktif moleküllerle
reaksiyona girebilmektedir (Lingnert ve ark, 2002).
Şekil 1.4. Akrilamidin küçük reaktif moleküllerle reaksiyonu
Akrilamid, poliakrilamid malzemeleri yapmak için kullanılan bir kimyasaldır.
Poliakrilamid, içme ve atık sularının iyileştirilmesinde partikülleri ve diğer katışık
maddeleri temizlemede ayrıca kâğıt ve kozmetiklerde yapıştırıcı madde yapımında
1.GİRİŞ Zeycan KESKİN
4
kullanılmaktadır. Poliakrilamidin içinde çok düşük düzeyde akrilamid vardır
(Lingnert ve ark, 2002). İçme suyu kalitesi için, WHO’nun yönergesine göre, bir litre
içme suyunda 0,5 μg akrilamid olarak bildirilmiştir. Avrupa Birliğinde bu rakam 0,1
μ g /1 litre sudur.
Akrilamid’in hayvanlarda kansere sebep olduğu ve belli dozlara çıkıldığında,
insan ve hayvan sinir sisteminde zehirlenme etkisi yaptığı da bilinmektedir.
Farelerdeki araştırmalar, akrilamidin pişirmeye bağlı olarak oluşan diğer bilinen
belirli kanserojenlere benzer bir etkiye sahip olduğunu göstermektedir. İnsanlar için,
gıdalardaki kanser oluşturan ajanların etkileri bilinmemektedir. Diyetteki akrilamid
düzeylerinin diğer bilinen kansorejenlere nazaran daha yüksek oluşması olasıdır
(Yang ve ark, 2005).
Halen, akrilamidin gıdalarda nasıl oluştuğuna dair bilgi ve anlayış çok azdır
ve bilinen şu ki; yüksek sıcaklıklarda pişirilmiş veya işlem görmüş bazı gıdalarda
oluşmaktadır ve yüksek sıcaklıkta bekleme süresi ile de artmaktadır. Gıdalarda
akrilamidin oluştuğu sıcaklıklar tam olarak bilinmemektedir, ancak haşlama sıcaklığı
olan 120BC’nin altındaki sıcaklıklarda hazırlanmış gıdalarda, bugüne kadar
akrilamide rastlanmamıştır ve bugüne kadar akrilamid oluşumunun en büyük
değerleri nişastalı (patates ve mısır gevreği, patates kızartma, tost edilmiş ekmek,
bisküvi, kraker ve cipsi gibi) ürünlerde bulunmuştur.
TÜBİTAK Marmara Araştırma Merkezi laboratuvarında yapılan
Türkiye’deki akrilamid taramalarında evde taze patatesin soyularak kızartılmasına
oranla fast food ürünü olarak doğranıp dondurulmuş patateste çok daha yüksek
miktarda akrilamid tespit edilmiştir.
1.GİRİŞ Zeycan KESKİN
5
Çizelge 1.1. TÜBİTAK’ın Türkiye’deki akrilamid tespiti
Gıda maddesi Akrilamid (µg/kg)
Pirinç pilavı Ölçülebilir değerin altında
Tahin helvası Ölçülebilir değerin altında
Kebap, döner, ızgara Ölçülebilir değerin altında
Çavdar ekmeği Ölçülebilir değerin altında
Beyaz ekmek (kabukta) 40-160
Kızarmış ekmek (hazır) 200
Hazır çorbalar 40-60
Tulumba tatlısı 40-45
Bebe bisküvisi 400-600
Bisküvi 70-130
Kraker 70-200
Kahvaltılık gevrekler 80-350
Çizelge 1.2. Çeşitli gıdalardaki akrilamid seviyesi
Gıda maddesi Akrilamid (µg/kg)
Kızarmış ekmek 90-1430
Sade kek 150-400
Zencefilli kek 1070-1410
Bisküviler 260-1450
Krakerler 180-420
Çeşitli fırıncılık ürünleri 230-3200
Kahvaltılık tahıllar 30-1400
Bebek bisküvileri 150-610
Patates kızartması 330-3700
Kahve 25
1.GİRİŞ Zeycan KESKİN
6
Şeker, yağ ve sütün yüksek sıcaklıkta pişirilmesinin gerek bisküvide gerekse
muhallebi gibi diğer ürünlerle karamelize şekerlerde millard reaksiyonu oluşmaktadır
ve bu sağlığı olumsuz yönde etkilemektedir. Millard reaksiyonu nedeniyle sütteki
proteinler kullanılmaz hale gelmektedir. Bu karaciğerde toksik etki yapabilir
(Becalski ve ark, 2003).
Şekil 1.5. Millard reaksiyonu
Proteinlerin yapı taşları olan 20 aminoasitten bir tanesi olan asparajin,
akrilamid oluşumunda kilit rol oynar.
Akrilamid sitokrom P450 (CYP2E1) enzimleri tarafından glisidamide
dönüşmektedir. Aşağıda akrilamid ve glisidamid için olası metabolik yollar
gösterilmiştir (Paulsson ve ark, 2005).
1.GİRİŞ Zeycan KESKİN
7
N-AcCys-S-MAA
GSH
C
C H
H2C
O
NH
CH2
OH
N-metiloakrilamid
N-AcCys-S-AA
GSH
H2CCH
C
O
NH2
Akrilamid
P450 P450?
O
H2CCH
C
O
NH
CH2
OH
N-metiloglisidamid (MGA) ?
O
H2CCH
C
O
NH2
Glisidamid (GA)
GSH
GSH
??
N-AcCys-S-MGA ? N-AcCys-S-GA
H2CCH
C
O
NH2
OH
OH
Şekil 1.6. Akrilamidin P450 (CYP2E1) enzimleri tarafından glisidamide dönüşmesi
Akrilamidin metabolizması için en etkili yol GSH ile konjugasyonundan
meydana gelmektedir. Glisamide epoksidasyonu diğer önemli metabolik yoldur.
(Sumner ve ark, 1999). Meslekleri dolayısıyla akrilamide maruz kalan insanlarda
akrilamid ve glisidamidin dozları 10:3 olarak tahmin edilmiştir (Bergmark ve ark,
1993). Glisidamid sonradan GSH konjugasyonundan veya epoksi hidrolaz (EH)
tarafından katalize olan epoksit grubunun hidroliz edilmesiyle metabolize
olmaktadır. Hem akrilamid ve glisidamidden GSH metabolitleri hem de
1.GİRİŞ Zeycan KESKİN
8
glisidamidden hidroliz ürünleri akrilamide maruz bırakılan kemirgen hayvanların
idrarında bulunmuştur (Paulsson ve ark, 2002).
Şekil 1.7. Akrilamidin metabolik yollarının CYP2E1, GST ve EH enzimleri ile ilişkisi
1.2. Sodyum – Potasyum Adenozin 5’ – Trifosfataz (Na+-K+ ATPaz)
Enzimi
Na+-K+ ATPaz plazma zarında bulunan, sodyum ve potasyumun hücre zarı
boyunca taşınmasını katalize eden bir enzimdir. Bütün memelilerin tüm hücrelerinde
bulunur. Memeli hücrelerinin çoğu dış ortama göre düşük konsantrasyonda sodyum
içerir. Bu iyonik gradyanı sağlayan ve sürdüren Na+-K+ ATPaz enzimidir. Na+-K+
ATPaz enzimi α ve β olmak üzere iki tip protein ünitesi içerir. α alt ünitesi sıklıkla
katalitik alt ünite olarak değerlendirilir ve ekstrasellüler parçası üzerinde ouabain
gibi glikozidler için bağlanma alanları içerir. Ayrıca proteinin intrasellüler olarak
yerleşmiş parçası üzerinde ATP için bağlanma alanı vardır. β subunit bir
glikoproteindir. Fakat rolü tam olarak bilinmemektedir (Rossier ve ark, 1987).
1.GİRİŞ Zeycan KESKİN
9
Şekil 1.8. Na+-K+ ATPaz enziminin yapısı
Na+-K+ ATPaz enziminin enzimatik döngüsü aşağıda gösterilmiştir
(Robinson ve ark, 1974).
Mg+2, Na+
E1 + ATP E1 ~ P1 + ADP
Mg+2
E1~P E2 ~ P
E2 ~ P + K+ K+- E2 ~ P
K+- E2 ~ P + H2O K+- E2 + Pi
K+- E2 K++ E2
E2 E1
Şekil 1.9. Na+-K+ ATPaz enziminin etki şekli
1.GİRİŞ Zeycan KESKİN
10
E1 şekli ATP, magnezyum ve sodyum ile reaksiyona girme özelliğindedir.
Diğer bir ifade ile bu kademede meydana gelen ATP ile fosforilasyon ancak
magnezyum ve sodyum varlığında gerçekleşir. E – P kompleksi potasyum karşısında
hidroliz olur.
Her ATP hidrolizinde 3 Na+ hücre dışına 2 K+ hücre içine girmektedir. Bu
enzim vanadat (VO3) ve kardiotonik steroidler tarafından inhibe edilmektedir.
Kardiotonik steroidlerin etkisi enzimin potasyum kısmında gözlenir (Robinson ve
ark, 1974).
1.3. Glutatyon (GSH)
C
O
N
H
CH
CH2
SH
C
O
N
H
CH2
COO-CH2
CH
CH2
NH3+
COO-
Şekil 1.10. Glutatyon (γ-glutamil sisteinil glisin)
Akrilamid nükleofillerle özellikle tiyolat anyonlarıyla, α β doymamış amid,
imid ve nitrillerle (örneğin akrilonitril, N-etil maleimid) reaksiyona girebilir. Tiyol
grupları birçok biyolojik proteinlerin aktivite göstermesi için gereklidir, ayrıca
önemli indirgeyici ajan ve hücresel antioksidantlardır. GSH başlıca tiyol reaktantıdır
(Tong ve ark, 2004).
Glutatyon (γ-glutamil sisteinil glisin) N-terminal glutamatın α-peptidil
olmayan bir bağ aracılığıyla sisteine bağlandığı bir atipik tripeptiddir. Glutatyon
birçok enzim için gereklidir. Glutatyon ve glutatyon redüktaz enzimi, birçok protein
ve polipeptid hormonların disülfit bağlarının oluşumuna iştirak ederler.
1.GİRİŞ Zeycan KESKİN
11
Glutatyon genelde GSH olarak kısaltılır. SH sisteinin sülfidril grubuna iştirak
eder ve molekülün alışveriş yapan kısmıdır. Potansiyel olarak zehirli bazı elektrofilik
ksenobiyotikler aşağıdaki reaksiyonlarda gösterildiği gibi nükleofilik GSH ile
konjuge olurlar.
R+GSH → R-S-G
Burada R toksik potansiyele sahip olan bir elekrofiliktir. Bu reaksiyonları
katalize eden enzimlere glutatyon-S-transferazlar denilir ve bunlar karaciğer
sitozolünde yüksek, diğer dokularda daha düşük miktarlarda bulunurlar.
GSH glutatyon peroksidaz tarafından katalizlenen reaksiyonda toksik
potansiyeli olan hidrojen peroksitin dekompozisyonuna katılır. Enzimlerin çok
önemli grupları olan SH gruplarının redüklenmiş durumda kalmalarına yardım eden
önemli bir intraselüler redüktördür. GSH redükleyici bir ajan olarak etkili
olduğundan SH okside olur ve glutatyonun diğer bir molekülüyle bir disülfit bağı
oluşturur.
GSH + GSH ↔ G-S-S-G
G-S-S-G ürünü okside glutatyondur. Gerektiğinde G-S-S-G’de NADPH’ı
kullanan bir reaksiyon ile glutatyon redüktaz tarafından GSH’a redüklenebilir.
G-S-S-G + NADPH + H+ → 2GSH + NADP
Bu reaksiyon bilhassa kırmızı kan hücrelerinde önemlidir. Bu hücrelerde G6P
dehidrogenaz aktivitesi düşüklüğünde olduğu gibi NADPH düzeyleri düşük ise o
zaman yukarıdaki reaksiyon ile redüklenmiş GSH yeterli miktarlarda rejenere olmaz.
GSH’nin indirgenmiş düzeyleri peroksitlerin kırmızı kan hücrelerinde birikmesine
yol açar ve bunların kırmızı hücre membran lipitleri üzerine olan oksidatif
etkilerinden dolayı hemoliz meydana gelebilir. Böbreklerde bazı aminoasitlerin
membranlardan naklinde bir taşıyıcı olarak GSH’yı kapsayan bir metabolik döngü
ortaya konmuştur. Bu döngünün ilk reaksiyonu şöyledir:
Aminoasid + GSH → γ Glutamil aminoasid + Sisteinilglisin
Bu reaksiyon bazı aminoasidlerin plazma membranından transferlerine
yardım eder. Ardından aminoasid GSH ile yeniden sisteinilglisinden
sentezlenmektedir. Yukarıdaki reaksiyonu katalize eden enzim γ Glutamil-transferaz
(GGT)’dır.
1.GİRİŞ Zeycan KESKİN
12
1.4. Hemoglobin
Hemoglobin prostetik grup olarak “hem” adında bir siklik tetrahidropirol’e
sahiptir ve bu grup, bu proteinlerin kırmızı renginden sorumludur. Tetrapiroller,
düzeysel bir halkada, dört α-metilen köprüleri ile birbirine bağlanmış 4 pirol
molekülünden meydana gelirler. “Hem”de pirol halkasının β karbonlarına, metil (M),
vinil (V) ve propiyonat (Pr) grupları bağlı olup bunlar M, V, M, V, M, Pr, Pr, M
olarak sıralanmışlardır. Bu düzeysel halkanın ortasında ferro demir (Fe+2) atomu
vardır.
Şekil 1.11. Hem’in yapısı
Ferröz demir protoporfirin molekülünde yer alan dört pirol halkasının azot
atomları ile dört valanslı bir koordinasyon kompleksi meydana getirir. Ferröz ve
ferrik haldeki demirin altı valanslı bir koordinasyon kompleksi yapma eğilimleri
vardır. Bu yüzden hem, iki koordinasyon grubu ile daha birleşme yeteneğindedir.
Hemoglobinde, koordinasyon kompleksi yapma yeteneğinde olan ve pirol
halkalarının azotları ile birleşmede arta kalan demirin iki valansından birisi
1.GİRİŞ Zeycan KESKİN
13
polipeptid zincirlerinde yer alan histidin moleküllerinin imidozol halkasındaki azot
atomlarından birisi ile birleşmiş haldedir. Serbest kalan valansı ile de demir O2 veya
başka bir grup ile (HCN, CO gibi) bağ teşkil edebilir.
Omurgalı eritrositlerinde bulunan hemoglobinin iki temel işlevi vardır: (1)
O2’nin solunum organlarından periferal dokulara taşınması ve (2) CO2 ve protonların
atılımı için periferal dokulardan solunum organına taşınmasıdır.
Hemoglobinler her tetramerine 4 oksijen molekülü bağlar (her “hem” alt
birimine bir oksijen molekülü). Hemoglobine O2’nin bağlanması aynı tetramer
üzerinde başka O2 atomlarının bulunup bulunmamasına bağlıdır. Eğer O2 zaten varsa
ardı sıra başka O2 atomlarının bağlanması daha kolay olacaktır. Böylece hemoglobin
kooperatif bağlanma kinetikleri gösterir ve bu özellik hemoglobinin solunum
organında maksimal miktarda O2’i bağlamasını ve periferal dokulara da bu maksimal
miktardaki O2’i, hakim olan pO2’de ulaştırmasını sağlar (Murray ve ark, 1991).
1.5. Albumin
Albumin insan plazmasının ana proteinidir ve kanda çok bulunan tiollerden
biridir (Bergmark ve ark, 1993).
Albumin total plazma proteinin %60 kadarını kapsar. Albuminin %40 kadarı
plazmada, geri kalanın %60’ı ekstrasellüler sıvıda mevcuttur. Karaciğerde günde 12g
kadar albumin üretilir, bu miktar karaciğerde sentezlenen total proteinin %25’ini,
salgılanan tüm proteinin de yarısını oluşturur. Albumin bir preprotein olarak
sentezlenir. Olgun insan albumini 585 aminoasidlik bir polipeptit zincirinden
ibarettir ve 17 disülfit köprüsü içermektedir. Proteazların uygulanması ile albumin
farklı fonksiyonlara sahip 3 bölgeye bölünebilir. Nispeten düşük moleküler ağırlığı
ve yüksek konsantrasyonundan ötürü albuminin insan plazmasındaki ozmatik
basıncın %75-80’inden sorumlu olduğu düşünülmektedir.
Albuminin önemli olan diğer bir işlevi muhtelif ligantları bağlamasıdır.
Bunlar serbest yağ asitleri (FFA), kalsiyum, bazı steroid hormonlar, bilurubin ve
plazma triptofanın bir kısmını kapsamaktadır. İlave olarak albumin plazma bakırının
1.GİRİŞ Zeycan KESKİN
14
yaklaşık %10’unu bağlar, kalanı seruloplazmine bağlıdır. Sulfonamidler, penisilin G,
dikumarol ve aspirin dahil muhtelif ilaçlar da albumine bağlı bulunurlar.
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Zeycan KESKİN
15
2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR
Srivastava ve ark. (1983), karaciğer ve beyine çeşitli oranlarda akrilamid ve
stiren uygulayarak lipid peroksidasyonu, glutatyon düzeyi ve glutatyon-S-transferaz
aktivitesini bulmak amacıyla çalışma yapmışlardır. Karaciğerde akrilamid ve stirenin
lipit peroksidasyonunun artmasına ve glutatyon miktarının ve glutation-S-transferaz
aktivitesinin azalmasına neden olduğunu gözlemlemişlerdir. Beyinde ise sadece
akrilamid varlığında glutatyon miktarının düştüğünü fark etmişlerdir. Lipit
peroksidasyonun ise glutatyon miktarı bittiği zaman meydana geldiğini görmüşlerdir.
İn vitro koşullarda akrilamid ve stirenin lipit peroksidasyonuna etkisi olmadığını,
akrilamid veya stirene maruz bırakılan karaciğerde glutatyon’un azalması sonucu
olarak lipit peroksidasyonunun arttığını gözlemlemişlerdir.
Dixit ve ark. (1984), sıçan eritrositlerinde glutatyon ve akrilamidin etkileşimi
konusunda çalışmışlardır. Sıçanlara 7, 14 ve 21. günlerde düzenli olarak akrilamid
uygulamışlar ve zamanla glutatyon miktarının düştüğünü görmüşlerdir. Akrilamid ve
1-kloro 2,4-dinitrobenzen gibi substratlar kullanarak karaciğer, böbrek, beyin
eritrositlerinde glutatyon-S-transferaz aktivitesini araştırmışlardır. Eritrosite
akrilamid eklenmesiyle glutatyon peroksidaz aktivitesinin in vitro koşullarda inhibe
olduğunu görmüşlerdir.
Patel ve ark. (1993), akroleinin atardamar hücreleri üzerindeki etkisini
incelemişlerdir. Bunun için çeşitli dozlardaki akroleini plazma membranı ile
muamele etmişlerdir. Sonuçta serbest laktat dehidrogenaz (LDH) miktarı artmış ve
GSH ile protein sülfidril (P-SH) miktarı düşmüş fakat oksitlenmiş glutatyon miktarı
değişmemiştir. Akrolein konsantrasyonu arttırıldıkça serbest LDH miktarı artmış ve
GSH miktarı azalmıştır. Çünkü akrolein konsantrasyonu arttırıldıkça P-SH
indirgenmiştir. Akrolein aynı zamanda plazma membranının Na+-K+ ATPaz
miktarının önemli ölçüde azalmasına neden olmuştur. Bu deneylerde akroleinin GSH
ve protein sentezinde kullanılan amino asitlerin azalmasına neden olduğu sonucuna
varılmıştır. Plazma membranındaki P-SH azalması Na+ /K+ ATPaz’ın inaktive
olduğunu göstermektedir.
Odland ve ark. (1994), N1E 115 hücrelerinde nöron dejenerasyonuna neden
olan akrilamidin mekanizmasını açıklamak için çalışmışlardır. Sitotoksik etkiye
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Zeycan KESKİN
16
neden olmayan fakat nöron dejenerasyonunun giderek artmasına neden olan
akrilamid konsantrasyonlarını seçmişlerdir. GST aktivitesinin yükselmesi ile beraber
en yüksek akrilamid konsantrasyonunda test yapmışlardır. GSH miktarının azalması
ve plazma membranının korunmasına karşın lipit peroksidasyon miktarının
yükselmediğini gözlemlemişlerdir.
Awad ve ark. (1998), akrilamidin sıçan hepatositlerindeki toksik etkisini
araştırmışlardır. Hepatositleri ayrıştırmışlar, akrilamidin farklı konsantrasyonlarıyla
muamele etmişler ve iki saat beklemişlerdir. 1mM akrilamid ile muamele
edildiğinde GSH miktarı 60 dakikada düşerken 10 mM akrilamid ile muamele
edildiğinde 30 dakikada düştüğünü gözlemişlerdir.
Meng ve ark. (2001), tavşan kaslarındaki kreatin kinaza akrilamidin etkisi ile
ilgili çalışmalar yapmışlardır. İn vitro koşullarda akrilamid tarafından kreatin kinazın
inhibe olmasının nedenini araştırmışlardır. Akrilamidin 0 ile 1 M konsantrasyonu
arasında kreatin kinazı inhibe ettiğini ve akrilamidin protein tiollerini tükettiğini
gözlemlemişlerdir. İnaktivasyon ve tiol tüketiminin zamana ve akrilamid derişimine
bağlı olduğunu ve akrilamid tarafından inaktive olan kreatin kinazın ditiothreitol’ün
(DTT) eklenmesi ile reaktivasyonunun sağlanmadığını gözlemlemişlerdir. Fakat,
DTT’nin akrilamid ile muamelesinden sonra DTT tiol grupları bloke edilen 5,5’-
dithiobis- (2- nitrobenzoik asit) aracılığıyla kreatin kinazın reaktivasyonunu
sağlayabildiğini bulmuşlardır. Sonuçta akrilamid tarafından kreatin kinazın inaktive
olmasında tiol alkilasyonunun önemli bir olay olduğunu belirlemişlerdir.
Paulsson ve ark. (2002), fare ve sıçanlarda akrilamid ve N-
methilolakrilamid’in nörotoksik ve kanserojenik etkilerini araştırmışlardır. Akrilamid
(AA) ve N-methilolakrilamid’in (MAA) hayvanlarda nörotoksik ve kanserojenik
olduğunu ve MAA’nın AA’dan daha az etkiye sahip olduğunu belirtmişlerdir. İki
akrilamidin üç farklı dozunu erkek CBA farelere vermiş ve erkek Sprague-Dawley
sıçanlarını iki akrilamidin belli bir dozuyla muamele etmişlerdir. Akrilamidlerin
farelerde daha hızlı metabolize olduğunu bulmuşlardır. Farede iki akrilamidin doza
bağlı olarak hem hemoglobin düzeyinde hem de periferal eritrositlerin mikronükleus
frekansında artışa neden olduğunu ve akrilamid ile muameleden sonra sıçan kemik
iliği eritrositlerindeki mikronükleus frekansında bir artış olmadığını gözlemişlerdir.
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Zeycan KESKİN
17
Tong ve ark. (2004), serum albümin ve glutatyon ile akrilamidin
reaksiyonunu incelemişlerdir. Glutatyon ve insan serum albumini ile akrilamidin
reaksiyonunu tespit etmek için çalışmış ve aşırı akrilamid varlığında onların tiol
gruplarının nasıl zarar gördüğünü belirlemişlerdir. Bu sonuçları akrilamidin sağlık
açısından ne kadar risk taşıdığını belirlemek amacıyla kullanmışlardır.
Yang ve ark. (2005), sıçan testislerine akrilamidin toksik etkisini
araştırmışlardır. Akrilamidin sperm kalitesini etkilediğini ve sperm
konsantrasyonunu azalttığını görmüşlerdir.Akrilamidin histopatolojik doku
bozukluğuna neden olduğunu bulmuşlardır. Akrilamidin toksik etkisi nedeniyle
Leyding hücresinin öldüğünü, sperm noksanlıklarının ve çeşitli histopatolojik
anormalliklerin meydana geldiğini gözlemlemişlerdir.
Baum ve ark. (2005), V79 hücrelerinde ve insan kanında akrilamid ve
glisidamidin genotoksik etkisini araştırmışlardır. Burada N-metil-N´-nitro-N-
nitroso-guanidin (MNNG) ile hprt mutajenik testini kullanarak V79 hücrelerinde
akrilamid ve glisidamid’in mutajenik etkisini karşılaştırmışlardır. Akrilamidin 600
μM konsantrasyonda mutajenik veya genotoksik etkiye neden olmadığını
görmüşlerdir.Glisidamidin ise 300-3000 μM konsantrasyonda ve 4h bekleme
süresinden sonra DNA’ya zarar verdiğini gözlemişlerdir.
Durling ve ark. (2005), akrilamid ve üç heterosiklik amin arasındaki
genotoksik etkinin karşılaştırılması konusunda araştırma yapmışlardır. Üç yaygın
HCAs, 2-amino-1-metil-6-fenilimidazo(4,5-b) pridin(PhIP), 2-amino-3,8-
dimetilimidazo(4,5-f) quinoksalin(MeIQx) ve 2-amino-3-metilimidazo(4,5-f)
quinolin (IQ)’in frekansını belirlemişlerdir. Erkek Balb/C faresinin karın zarına PhIP
MeIQx veya IQ’yu farklı dozlarda enjekte etmişlerdir. İn vitro koşullarda insan
lifoblastoid hücresinde IQ ve MeIQx’in genotoksik gücünün PhIP’nin genotoksik
gücüne eşit veya daha fazla olduğunu gözlemlemişlerdir. Akrilamidin insanlar için
taşıdığı riskin heterosiklik aminlerden 100-1000 kat daha fazla olduğu sonucuna
varmışlardır.
Besaratinia ve ark. (2005), DNA ve akrilamidin mutajenik özellikleri
hakkında çalışmalar yapmışlardır. DNA ile akrilamidin direkt ve indirekt etkileşimini
incelemişler ve bunun için alkilleştirilmiş DNA kullanmışlardır. Sitokrom P4502E1
tarafından akrilamidin epoksidasyonu yoluyla üretilen DNA’yı glisidamid üzerine
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Zeycan KESKİN
18
yerleştirmişlerdir. Bu çalışma ile akrilamidin biyolojik özellikleri hakkında çeşitli
sonuçlara varmışlardır.
3.MATERYAL ve METOD Zeycan KESKİN
19
3.MATERYAL ve METOD
3.1.Materyal
Araştırmada kullanılan kan örnekleri Ç.Ü. Tıp Fakültesi Balcalı
Hastanesi’nden temin edilmiştir.
Araştırmada kullanılan kimyasallar, araç ve gereçler şunlardır:
Kimyasallar, sodyum klorür, potasyum klorür, tris hidroklorik asit, etilen di-
amin tetra asetik asit, akrilamid, sodyum karbonat, sodyum hidroksit, sodyum
potasyum tartarat, Folin- Ciocalteu, sığır albümini, magnezyum klorür, adenozin
trifosfat, ouabain, lubrol, amonyum molibdat, glasiyel metafosforik asit, disodyum
etilen diamin tetraasetik asit, sodyum hidrojen fosfat, potasyum siyanür, sodyum
hidrojen karbonat, sodyum sülfat, dietil eter.
Araç ve gereçler, UV spektrofotometresi, otomatik mikro pipet, analitik
terazi, santrifüj, PH metre, inkübatör.
3.2.Metod
3.2.1.İnsan Eritrositlerinin Hazırlanması
Heparinleşmiş tam kan 3000 rpm’de 15 dakika santrifüj edilmiştir. Plazma ve
lökositler uzaklaştırılmış ve eritrositler fizyolojik tuz çözeltisi (% 0,9’luk NaCl) ile
üç kez yıkandıktan sonra aynı çözeltiyle %40 ( v/v ) oranlı hücre süspansiyonları
hazırlanmıştır.
3.2.2.Eritrosit Zarlarının Hazırlanması
Eritrosit zarlarının hazırlanmasında Hanahan ve Echolm (1974) tarafından
önerilen yöntem kullanılmıştır. Tam kan örnekleri santrifüj edilip plazma kısmı
atılmıştır. Bir hacim hücre çökeleği, 130 mM KCl ve 20 mM Tris-HCl ( pH 7,4 )
içeren çözelti konularak 5000 rpm’de 3 kez santrifüj edilip beyaz kan hücreleri
eritrositlerden uzaklaştırılmıştır. Eritrosit çökeleği hacminin 5 katı olacak şekilde 1
3.MATERYAL ve METOD Zeycan KESKİN
20
mM EDTA ve 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) içeren çözelti ile karıştırılıp 18000 rpm’de
10 dk santrifüj edilerek eritrosit hücrelerinin hemoliz olması sağlanmıştır. Bu işleme
beyaz renkte zar elde edinceye kadar devam edilmiştir. Zar örnekleri 1 mM EDTA
ve 10 mM Tris-HCl içeren tampon çözelti ile seyreltilerek son derişimi 1 mg zar
proteini / mL olacak şekilde zar proteinleri hazırlanmıştır.
3.2.3.Eritrositlerin Akrilamid İle Etkileştirilmesi
pH’ı 7 olan 0,1M fosfat tamponu ile %40’lık orana getirilmiş olan kan
örnekleri çeşitli derişimlerde (0,25-0,5-1-5 mM) akrilamid içerecek şekilde akrilamid
ile etkileştirilmiştir. Örnekler 37BC’de 15 dk su banyosunda bekletildikten sonra
1mL %5’lik TCA ile reaksiyon durdurulmuştur.
2.4.Protein Tayini
Protein tayini Lowry ve ark. (1951) tarafından önerilen metodla yapılmıştır.
Protein tayini için aşağıda bildirilen A , B ve C çözeltileri hazırlanmıştır.
1. Çözelti A: Bu çözelti 2 g Na2CO3 , 0.1 M NaOH çözeltisinde çözülerek ve aynı
çözelti ile son hacim 100 mL’ye seyreltilerek hazırlanır.
2. Çözelti B: 0.5 g CuSO4.5H2O , % 1’lik Na-K Tartarat çözeltisinde çözülerek son
hacim aynı çözelti ile 100 mL’ye tamamlanarak hazırlanır.
3. Çözelti C: 50 mL A çözeltisi ile 1 mL B çözeltisi karıştırılarak hazırlanır.
(Kullanılacağı an hazırlanmasına dikkat edilir.)
4. Folin-Ciocalteu Çözeltisi: Folin-Ciocalteu saf su ile 1:3 oranında seyreltilerek
hazırlanır.
5. Standart Protein Çözeltisi: 1 mL’sinde 10 mg sığır albümini olacak şekilde
%0.9’luk NaCl çözeltisiyle hazırlanır.
6. Standart Protein Eğrisinin Çizimi: Standart protein çözeltisinden 2,5 mL alınıp
%0,9’luk NaCl çözeltisiyle 50 mL’ye seyreltilmiştir. 6 adet deney tüpü alınarak tüpe
sırasıyla 0, 0.05, 0.1, 0.25, 0.50, 1.00 olacak şekilde seyreltilmiş protein (1 mg/mL)
çözeltisinden konulmuştur. Her tüp içeriğinin hacmi serum fizyolojik ile 1 mL’ye
tamamlanıp, her tüpe 5 mL C çözeltisi ilave edilmiştir. 10 dk oda sıcaklığında
3.MATERYAL ve METOD Zeycan KESKİN
21
bekletildikten sonra her tüpe 1:3 oranında seyreltilmiş Folin-Ciocalteu çözeltisinden
0.5 mL eklenmiştir. 30 dk oda sıcaklığında bekletilerek tüp içeriklerinin
absorbansları köre karşı 750 nm’de okunup bu değerler derişime karşı grafiğe
geçirilmiştir. Örneklerin protein içerikleri sığır albumini yerine hazırlanan örnekler
kullanılarak ölçülmüştür.
3.2.5.İnorganik Fosfat Ölçümü
İnkübasyon ortamına eklenen ATP’den açığa çıkan inorganik fosfat Atkinson
ve ark.’nın (1973) önerdiği yönteme göre yapılmıştır. Yöntem ATP’den açığa çıkan
inorganik fosfatın Cirrasol ALN-WP (Lubrol) ve fosfo molibdat ile teşkil ettiği
kompleksin 390 nm dalga boyunda absorbans vermesi ilkesine dayanmaktadır.
İnorganik Fosfat Ölçümünde Kullanılan Çözeltiler:
Cirrasol ALN-WP (Lubrol): %5 konsantrasyonda su banyosu ısıtılarak
hazırlanır. Misel agregasyonuna bağlı bulanıklığın giderilmesi için kullanılmadan
önce 37BC’de su banyosunda bekletilir.
Molibdik Asit Çözeltisi: %2 molibdik asit çözeltisi 1,8 M H2SO4 çözeltisi
içinde hazırlanır.
Ana Çözelti: İnorganik fosfat tayini için aşağıdaki karışım kullanılır.
%5 lubrol 10 hacim
Molibdik asit çözeltisi 25 hacim
Saf su 65 hacim
Standart İnorganik Fosfat Çözeltisinin Hazırlanması: Standart stok çözeltisi
0,2 M potasyum hidrojen fosfattan 1-2 μmol konsantrasyonlarında hazırlanır. Stok
standart çözeltisine %1 kloroform koruyucu olarak ilave edilir.
İşlem: 1mL örnek üzerine 2 mL çözeltiler kısmında açıklanan ana ayıraç
eklenmiş ve karıştırılmıştır. Karışım oda sıcaklığında 10 dk bekletilmiştir. Absorbans
değerleri 390 nm’de köre karşı okunmuştur. Sonuçlar standart K2HP4 eğrisinden
değerlendirilmiştir.
3.MATERYAL ve METOD Zeycan KESKİN
22
3.2.5.Na+-K+ ATPaz’ın Spesifik Aktivite Tayini
Prensip: Sodyum-Potasyum Adenozin Trifosfataz aktivitesi inkübasyon
sırasında ortama ilave edilen 3 mM disodyum adenozin trifosfat (ATP)’den açığa
çıkan inorganik fosfatın ölçülmesi prensibine dayanarak ölçülür (Reading ve ark,
1980).
Yöntem: Aşağıda belirtilen şekilde hazırlanmış olan tüp içerikleri 5 dk su
banyosunda tutulmuştur.
Na+-K+ ATPaz için inkübasyon ortamındaki son iyon derişimleri:
İnkübasyon ortamı = 100 mM NaCl 3mM ATP
20 mM KCl 1mM Ouabain
4 mM MgCl2
40 mM Tris HCl
Örnek 1
(Total-ATPaz)
Örnek 2
(Mg-ATPaz)
Ör Kör ATP Kör
-Ouabain inkb ort 870µL 870µL 870µL
+Ouabain inkb ort 870µL
Örnek hmj 30µL 30µL - 30µL
dH2O - - 30µL 100µL
ATP 100µL 100µL 100µL -
Tüplere inkübasyon ortamından sonra örnek homojenatı eklenerek 5 dk
370C’de inkübasyona bırakılmıştır. Ardından ATP eklenerek reaksiyon başlatılmış,
30 dk 370C’de gerçekleşen inkübasyon sonrasında, reaksiyon 500 µL soğuk saf su ile
durdurulmuştur. Atkinson ve ark (1973) kullandığı yönteme dayanarak tüplerde
açığa çıkan inorganik fosfat miktarı, son hacmi 1.5 mL olan tüplere 3 mL lubrol (%5
polioksietilen 10-lauril eter)-molibdat (%2 amonyum molibdat) karışımı (100 mL
için 10 mL %5’lik polioksietilen 10-lauril eter + 25 mL %2’lik amonyum molibdat +
65 mL dH2O) konduktan sonra 10 dk oda sıcaklığında bekletilerek 390nm dalga
boyunda açığa çıkan sarı renkli kompleksin absorbansının okunmasıyla ölçülmüştür.
3.MATERYAL ve METOD Zeycan KESKİN
23
Enzim aktivitesi µmol Pi/mg prot/saat olarak ifade edilmiştir. (Na+-K+ ATPaz
aktivitesi Total-ATPaz aktivitesinden Mg-ATPaz aktivitesinin çıkarılmasıyla
hesaplanır.)
3.2.6.Redükte Glutatyon Tayini
Prensip: Hemen hemen eritrositlerin bütün nonprotein sülfidril grupları
indirgenmiş glutatyon şeklinde bulunur. 5, 5’-ditiyo-bis [2-nitrobenzoik asit]
(DTNB), sülfidril bileşikleri tarafından redükte edilmiş bir disülfit bileşiğidir.
Oldukça sarı renkli anyon oluşturur. GSH madde miktarı bu sarı bileşiğin 412 nm
dalga boyunda optik dansitesi saptanarak değerlendirilir.
Ayıraçlar:
1. Çöktürücü Çözelti
Glasiyel metafosforik asit 1.67g
Disodyum EDTA 0.20g
NaCl 30.0g
Saf su ile 100 mL’ye tamamlanır.
2. 0.3 M Na2HPO4
Na2HPO4 42.59g
Saf su ile 100mL’ye tamamlanır.
3. DTNB Çözeltisi
DTNB 20.0mg
%1’lik sodyum sitrat ile 100 mL’ye tamamlanır.
Yöntem:
Kör(mL) Örnek(mL)
Hemolizat - 2
Saf Su 2 -
Çöktürücü 3 3
3.MATERYAL ve METOD Zeycan KESKİN
24
5 dk bekletilerek, örnek filtre kağıdından süzülmüştür.
Süzüntü 2 2
0.3 M Na2HPO4 8 8
412 nm’de köre karşı okunmuştur. (OD1). Tüplere:
%0.02 DTNB 1 1
İlave edilmiş ve 412 nm’de köre karşı okunmuştur.(OD2)
Hesaplama:
Glutatyon derişimi mmol/g protein biriminden hesaplanır.
C / 1000 = (OD2-OD1)/13600 x E1 x 5/2 x 1/2
C(mmol/mg protein) = (OD2-OD1) x 0.092 / Protein(g/mL)
13600: GSH ile DTNB etkileşimi sırasında oluşan sarı rengin molar ekstinksiyon
katsayısı
E1 : Eni 6 nm’den büyük olan bant kullanılırsa hem ışık yolu hem de bant
genişliği farklarını düzelten bir türev ekstrinksiyon katsayısı kullanılır. Bizim
kullandığımız 2 nm’dir. Hesaplamalarda E1 kullanılmamıştır.
C : mmol glutatyon
OD1 : DTNB ilave edilmeden önce 412 nm dalga boyunda ölçülecek optik
dansite
OD2 : DTNB ilave edildikten sonra 412 nm dalga boyunda ölçülecek optik
dansite
1000: mmol’e dönüşüm katsayısı
3.2.7.Hemoglobin Tayini
Prensip: Drapkin çözeltisinde bulunan ferrisiyanür hemoglobindeki +2
değerlikli demiri +3 değere yükseltgeyerek hemoglobini methemoglobine
3.MATERYAL ve METOD Zeycan KESKİN
25
dönüştürür. Bu ise potasyum siyanür ile birleşerek stabil olan siyanomethemoglobini
oluşturur. Siyanomethemoglobinin 540 nm dalga boyunda verdiği optik dansite
ölçülerek hemoglobin (Hb) miktarı saptanır (Kampen, 1961).
Ayıraçlar:
1. Drapkin Çözeltisi
K3Fe(CN)6 189mg
KCN 52mg
NaHCO3 1g
Saf su ile 100 mL’ye tamamlanmıştır.
Yöntem : Çözeltiler tüplere aşağıdaki gibi koyulmuştur.
Kör Örnek
Hemolizat(mL) - 100
Drapkin Çözeltisi(mL) 5 5
15 dk oda sıcaklığında bekletilmiştir. Spektrofotometrede 540 nm dalga
boyunda optik dansite okunarak hemoglobin değerlendirme cetvelinden
değerlendirmesi yapılmıştır.
3.2.8.Albumin Tayini
Prensip: Bir santrifüj tüpüne 0.5 mL sulandırılmış serum koyulmuştur.
Üzerine 7.5 mL %23’lük sodyum sülfat ilave edilerek iyice çalkalanmıştır. 3 mL
dietil eter konan tüpün ağzı kapatılıp, iyice çalkalanmış ve 15 dk santrifüj edilmiştir.
Eter tabakasının altında kalan berrak kısımda albumin bulunur. Bu berrak kısımla
eter tabakasının altında yüzer şekilde çöktürülmüş beyaz globulin halkası göze
çarpar. Böylece sodyum sülfat kullanılarak serumdaki globulinler çöktürülmüş olur.
Bir pipetin ağzı kapatılarak eter tabakasından dikkatlice geçirilmiş ve beyaz globulin
tabakasını mümkün olduğunca kırmadan alttaki berrak sıvıyı bulandırmadan sıvı
pipete geçirilmiştir. Bu, albumin miktar tayini için bundan sonraki basamaklarda
kullanılmıştır (Gornall ve ark, 1949).
3.MATERYAL ve METOD Zeycan KESKİN
26
Yöntem : Üç adet deney tüpü alınır ve aşağıdaki şekilde hazırlanmıştır;
Kör Albumin Total Protein
Arık Su 1mL - -
Albumin Süzüntüsü - 1mL -
Serum (1/20
seyreltilmiş)
- - 1mL
Sıvı, serum fizyolojik (%0,9’luk NaCl) ile 1/20 oranında seyreltilip daha
sonra protein tayini yapılmış ve 750 nm dalga boyunda köre karşı absorbans
değerleri okunmuştur. Elde edilen absorbans değerleri standart protein eğrisinden
değerlendirilerek albumin miktarı tespit edilmiştir.
4.BULGULAR ve TARTIŞMA Zeycan KESKİN
27
4.BULGULAR ve TARTIŞMA
4.1.Bulgular
4.1.1.Standart Protein Eğrisinin Çiziminde Elde Edilen Bulgular
Bölüm 3.2.4’de açıklandığı gibi hazırlanan sığır albumini kullanılarak
yapılan deneylerde elde edilen sonuçlar değerlendirilerek standart protein eğrisi
çizilmiştir. Ölçülen absorbans değerleri Çizelge 4.1’de verilmiştir. Bu verilere göre
çizilen standart protein eğrisi ise Şekil 4.1.’de gösterilmiştir.
Çizelge 4.1. Standart Protein Eğrisi İçin Elde Edilen Bulgular
Protein
Derişim (mg/mL)
Absorbans
0,007 0,022
0,014 0,044
0,0175 0,069
0,035 0,116
0,07 0,220
0,105 0,316
0,14 0,398
4.BULGULAR ve TARTIŞMA Zeycan KESKİN
28
y = 2,958xR2 = 0,9928
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 0,16
mg prot/mL
Abs
orba
ns
Şekil 4.1. Standart Protein Eğrisi
4.1.2. İnorganik Fosfat Eğrisinin Çizimi
Hazırlanan standart fosfat çözeltileri kullanılarak yapılan deneylerde bilinen
fosfat derişimleri için 390 nm’deki ölçülen absorbans değerleri Çizelge 4.2’de
verilmiştir. Bu verilere göre çizilen inorganik fosfat eğrisi ise Şekil 4.2.’de
gösterilmiştir.
Çizelge 4.2. Fosfatın Farklı Derişimlerdeki Çözeltilerinin 390 nm’deki Ölçülen Absorbans Değerleri
Fosfat (mg/mL) Absorbans 0,025 0,021
0,05 0,060
0,1 0,129
0,15 0,196
0,2 0,277
0,4 0,522
4.BULGULAR ve TARTIŞMA Zeycan KESKİN
29
y = 1,3158xR2 = 0,9976
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Fosfat (mg/mL)
Abs
orba
ns
Şekil 4.2. İnorganik Fosfatın 390 nm’deki Standart Grafiği
4.1.3. Çeşitli Derişimlerde Akrilamid İçeren Kan Örneklerindeki
Hemoglobin Düzeyleri
Çeşitli derişimlerde akrilamid içerecek şekilde hazırlanan kan örneklerinde
hemoglobin düzeyinin belirlenmesi sonucunda elde edilen veriler Çizelge 4.3’de
verilmiş ve Şekil 4.3’de şematik olarak gösterilmiştir.
Çizelge 4.3. Çeşitli derişimlerde akrilamid eklenen kan örneklerinin içerdiği hemoglobin düzeyleri
Akrilamid Derişimi
(mM)
Hemoglobin
Düzeyleri (g/dL)
0 16,3±1,1
0,25 12,1±1,1
0,5 8,3±1,3
1 7,2±0,4
5 5,5±0,2
4.BULGULAR ve TARTIŞMA Zeycan KESKİN
30
0
4
8
12
16
20
0 1 2 3 4 5 6
Akrilamid Derişimi (mM)
Hem
oglo
bin
Düz
eyi (
gr/d
L)
Şekil 4.3. Çeşitli derişimlerde akrilamid içeren tam kandaki hemoglobin düzeyinde meydana gelen değişiklikler
Akrilamid ile etkileştirilmeyen kandaki hemoglobin düzeyi 16,3 g/dL olarak
ölçülmüştür. 0,25; 0,5; 1; 1,5 mM derişimlerdeki akrilamid ile etkileştirilen
kanlardaki hemoglobin düzeyleri ise sırasıyla 12,1; 8,3; 7,2 ve 5,5 g/dL olarak
bulunmuştur.
4.1.4. Çeşitli Derişimlerde Akrilamid İçeren Tam Kandaki GSH
Düzeyleri
Çeşitli derişimlerde akrilamid içerecek şekilde hazırlanan kan örneklerindeki
GSH düzeylerinin belirlenmesi sonucunda elde edilen veriler Çizelge 4.4’de
verilmiş, Şekil 4.4’de ise şematik olarak gösterilmiştir.
4.BULGULAR ve TARTIŞMA Zeycan KESKİN
31
Çizelge 4.4. Çeşitli derişimlerde akrilamid içeren kan örneklerinde tespit edilen GSH düzeyi
Akrilamid Derişimi
(mM)
GSH Düzeyi
(mmol/mg prot)
0 4,430±0,130
0,25 1,704±0,200
0,5 1,227±0,007
1 1,022±0,140
5 0,954±0,004
0
1
2
3
4
5
0 1 2 3 4 5 6
Akrilamid Derişimi (mM)
GSH
Düz
eyi (
mm
ol/m
g pr
ot)
Şekil 4.4. Çeşitli derişimlerde akrilamid içeren tam kandaki GSH düzeyinde meydana gelen değişiklikler
Akrilamid ile etkileştirilmeyen kandaki GSH düzeyi 4,43 mmol/mg prot
olarak ölçülmüştür. 0,25; 0,5; 1; 1,5 mM derişimlerdeki akrilamid ile etkileştirilen
4.BULGULAR ve TARTIŞMA Zeycan KESKİN
32
kanlardaki GSH düzeyleri ise sırasıyla 1,704; 1,227; 1,022 ve 0,954 mmol/mg prot
olarak bulunmuştur.
4.1.5. Çeşitli Derişimlerde Akrilamid İçeren Tam Kandaki Albumin
Düzeyleri
Çeşitli derişimlerde akrilamid içerecek şekilde hazırlanan kan örneklerindeki
albumin düzeylerinin belirlenmesi sonucunda elde edilen veriler Çizelge 4.5’de
verilmiş Şekil 4.5’de ise şematik olarak gösterilmiştir.
Çizelge 4.5. Çeşitli derişimlerde akrilamid eklenen kan örneklerinde belirlenen albumin düzeyi
Akrilamid
Derişimi (mM)
Albumin Düzeyi
(gr prot/L serum)
0 1,520±0,050
0,25 0,755±0,050
0,5 0,130±0,080
1 0,128±0,040
5 0,108±0,008
4.BULGULAR ve TARTIŞMA Zeycan KESKİN
33
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
0 1 2 3 4 5 6
Akrilamid Derişimi (mM)
Alb
umin
Düz
eyi (
gr p
rot/L
ser
um)
Şekil 4.5. Çeşitli derişimlerde akrilamid içeren tam kandaki albumin düzeyinde meydana gelen değişiklikler
Çizelgede görüldüğü gibi akrilamid ile etkileştirilmemiş kandaki albumin
düzeyi 1,520 g prot/L serum olarak bulunmuştur. 0,25; 0,5; 1; 1,5 mM derişimlerdeki
akrilamid ile etkileştirilen kanlardaki albumin düzeyleri ise sırasıyla 0,755; 0,130;
0,128 ve 0,108 g prot/L serum olarak ölçülmüştür.
4.1.6. Zar Elde Edilmesi ve Zarın Protein Tayini
Elde edilen zar örneğinden bir miktar alınarak protein tayini yapılmıştır.
Protein tayini sonucunda elde edilen veriler Çizelge 4.6’da verilmiştir.
Çizelge 4. 6. Zar örneğinin içerdiği protein miktarı
Absorbans Protein Miktarı
(mg prot/mL)
0,07 2,37
4.BULGULAR ve TARTIŞMA Zeycan KESKİN
34
Elde edilen verilerden yararlanılarak zar örnekleri 1 mM EDTA ve 10 mM
Tris-HCl içeren tampon çözelti ile seyreltilerek son derişimi 1 mg zar proteini/mL
olacak şekilde zar proteinleri hazırlanmıştır.
4.1.7. Zarın Çeşitli Derişimlerdeki Akrilamid İle Etkileştirilmesi
Sonucunda Na+-K+ ATPaz Enzim Aktivite Değerleri
Çeşitli derişimlerdeki akrilamid ile etkileştirilen zarda Na+-K+ ATPaz enzim
aktivite değerlerinin belirlenmesi sonucunda elde edilen veriler Çizelge 4.7’de
verilmiştir. Şematik olarak ise Şekil 4.6’da gösterilmiştir.
Çizelge 4.7. Çeşitli derişimlerde akrilamid içeren zar örneklerinde belirlenen Na+-K+ ATPaz enzim aktivitesi
Akrilamid
Derişimi (mM)
Na+-K+ ATPaz
Aktivitesi
(µmol Pi/mg prot/saat)
0 1,66±0,05
0,25 1,17±0,04
0,5 0,68±0,004
1 0,29±0,002
5 0,19±0,002
4.BULGULAR ve TARTIŞMA Zeycan KESKİN
35
0
0,4
0,8
1,2
1,6
2
0 1 2 3 4 5 6
Akrilamid Derişimi (mM)
Na-
K A
TPaz
Akt
ivite
si (m
ikro
mol
Pi/m
g pr
ot/s
aat)
Şekil 4.6. Çeşitli derişimlerde akrilamid içeren zar örneklerinin Na+-K+ ATPaz aktivitesinde meydana gelen değişiklikler
Çizelgede görüldüğü gibi akrilamid ile etkileştirilmemiş zar örneğindeki Na+-
K+ ATPaz aktivitesi 1,66 µmol Pi/mg prot/saat olarak belirlenmiştir. 0,25; 0,5; 1; 1,5
mM derişimlerdeki akrilamid ile etkileştirilen zar örneğindeki Na,K-ATPaz aktivitesi
ise sırasıyla 1,17; 0,68; 0,29 ve 0,19 g µmol Pi/mg prot/saat olarak ölçülmüştür.
4.2. Tartışma
Akrilamid nükleofillerle, özellikle tiyolat anyonlarıyla reaksiyona girer. Tiyol
grupları birçok önemli biyolojik proteinlerin aktivasyonu için gereklidir ve aynı
zamanda indirgeyici ajanlar ve hücresel antioksidanlar için önemlidir. Hemoglobin,
serum albumini ve GSH muhtemelen kanda en fazla bulunan tiyollerdir. (Friedman
ve ark.1965, Blumental ve ark. 1995).
Bu çalışmada in vitro olarak çeşitli derişimlerde akrilamid ile etkileştirilen
kanlara ait GSH düzeyleri araştırılmıştır. Elde ettiğimiz verilerden akrilamid derişimi
4.BULGULAR ve TARTIŞMA Zeycan KESKİN
36
arttıkça GSH düzeyinin anlamlı ölçüde azaldığı bulunmuştur. Bu azalış, akrilamid
derişimi 0,25 mM olduğunda %61,5, 0,5 mM olduğunda %72,3, 1 mM olduğunda
%76,9 ve 5 mM olduğunda ise %78,5 oranındadır (Çizelge 4.4).
Srivastava ve ark. (1983) karaciğerde ve beyinde akrilamidin GSH düzeyine
olan etkisini araştırmışlar ve akrilamidin karaciğerde ve beyinde GSH miktarının
azalmasına neden olduğunu rapor etmişlerdir. Dixit ve ark. (1984) sıçan
eritrositlerinde GSH ve akrilamidin etkileşimi ile ilgili araştırma yapmışlar ve
akrilamid varlığında GSH miktarının azaldığını belirlemişlerdir. Tong ve ark. (2004)
yaptıkları çalışmada GSH ile akrilamidin reaksiyona girdiğini ve bunun sonucunda
GSH miktarının azaldığını rapor etmişlerdir. Bulgularımız bu çalışmaların sonuçları
ile uyumludur.
Yaptığımız çalışmada farklı derişimlerdeki akrilamidin hemoglobin ve
albumin düzeylerine olan etkileri de araştırılmıştır. Kan örneği 0,25 mM akrilamid
ile etkileştirildiğinde hemoglobin düzeyinde %25,8, albumin düzeyinde %50,3’lük
bir azalma saptanmıştır.Akrilamid miktarına bağlı olarak belirlenen hemoglobin ve
albumin düzeyindeki bu azalışın akrilamid derişimi 0,5 mM olduğunda hemoglobin
için %49,1 , albumin için %91,5 , 1mM olduğunda hemoglobin için %55,8 , albumin
için %91,6 ve 5mM olduğunda ise hemoglobin için %66,3 albumin için ise %92,9
olduğu bulunmuştur (Çizelge 4.3 ve 4.5).
Akrilamid hemoglobinin amino terminal ucuyla reaksiyona girmekte ancak
tiyol gruplarının akrilamidle daha hızlı reaksiyona girdiği bilinmektedir (Bergmark
ve ark. 1993). Yaptığımız bu çalışmada akrilamid miktarına bağlı olarak hemoglobin
ve albumin düzeyinde belirlenen azalmalar karşılaştırıldığında albumin miktarındaki
azalmanın hemoglobin miktarındaki azalmaya oranla daha fazla olduğu saptanmıştır.
Tong ve ark. (2004) serum albumini ile akrilamidin reaksiyonunu
incelemişler ve tiyol gruplarının akrilamid ile reaksiyona girdiğini tespit etmişlerdir.
Schettgen ve ark. (2004) hemoglobin düzeyinin akrilamid varlığında azaldığını,
Paulsson ve ark. (2002) çeşitli dozlarda akrilamid ile muamele edilen eritrositlerdeki
hemoglobin miktarının azaldığını rapor etmişlerdir.
Çalışmamızda ayrıca akrilamidin hücre zarı Na+-K+ ATPaz aktivitesine olan
etkisi araştırılmıştır.
4.BULGULAR ve TARTIŞMA Zeycan KESKİN
37
Yaptığımız çalışmada akrilamid ile etkileştirilmeyen eritrositlerdeki Na+-K+
ATPaz spesifik aktivitesi 1,66 µmol Pi/mg prot/saat olarak belirlenmiştir. 0,25 mM
derişimdeki akrilamid ile etkileştirilen zar örneğindeki Na+-K+ ATPaz spesifik
aktivitesi akrilamid içermeyen örnekle karşılaştırıldığında Na+-K+ ATPaz spesifik
aktivitesinde %29,5’lik bir inhibisyon bulunmuştur. Bu inhibisyonun akrilamid
derişimi 0,5 mM olduğunda %59,1 , 1 mM olduğunda %82,5 ve 5 mM olduğunda ise
%88,5 olduğu saptanmıştır (Çizelge 4.7).
Akrilamid derişiminin artmasına bağlı olarak Na+-K+ ATPaz spesifik
aktivitesinin azaldığı ve 5 mM akrilamid derişiminde enzim spesifik aktivitesindeki
azalma 1 mM akrilamid derişimindeki azalma ile karşılaştırıldığında önemli bir fark
olmadığı saptanmıştır. Enzimin spesifik aktivitesindeki bu azalma akrilamid
varlığında plazma zarında bulunan Na+-K+ ATPaz enziminin inhibe olmasından
kaynaklanmaktadır. Ancak yaptığımız literatür çalışmasında direkt farklı
derişimlerdeki akrilamidin Na+-K+ ATPaz üzerine etkisini inceleyen çalışmaya
rastlanmadığından bulgularımız literatürle tartışılamamıştır.
5.SONUÇLAR VE ÖNERİLER Zeycan KESKİN
38
5. SONUÇLAR ve ÖNERİLER
5.1. Sonuçlar
1) Farklı derişimlerde (0,25mM, 0,5mM, 1mM, 5mM) akrilamid ile etkileştirilen
kandaki hemoglobin düzeyinde bir azalma saptanmıştır. Bu azalmanın 0,25mM
akrilamid derişiminde %25,8 iken akrilamid derişimi 0,5mM olduğunda %55,8
olduğu tespit edilmiştir.
2) Akrilamid derişimi 0,25mM olduğunda dahi kandaki GSH düzeyinde %61,5
oranında oldukça büyük bir azalma saptanmıştır.
3) Derişimi az da olsa akrilamid ile etkileştirilen kandaki albumin düzeyinde
anlamlı bir azalma olduğu saptanmıştır.
4) Yaptığımız çalışmada akrilamidin Na+-K+ ATPaz enzimini inhibe ettiği
belirlenmiştir.
5.2. Öneriler
Akrilamid sadece işlenmiş gıda ürünlerinde değil evde yüksek sıcaklıkta pişirilen
gıdalarda da oluşabilmektedir. Yaptığımız bu in vitro çalışmalara ilave olarak
akrilamidin in vivo etkileri de araştırılabilir.
39
KAYNAKLAR
ATKINSON, A., GATENBY, A.D., LOWE, A.G., 1973. The determination of
inorganic orthophosphate in biological systems. Biochim. Biophys. Acta,
320:195.
AWAD, M.E., ABDEL-RAHMAN, M.S. AND HASSAN S.A., 1998. Acrylamide
toxicity in isolated rat hepatocytes. Toxicol. in Vitro, 12:699-704.
BAUM, M., FAUTH, E., FRITZEN, S., HERRMANN, A., METRES, P., MERZ, K.,
RUDOLPHI, M., ZANKL, H., AND EISENBRAND, G., 2005. Acrylamide and
glycidamide: genotoxic effets in V79-cells and human blood. Mutation
Res./Gen. Toxicol. and Environ. Mutagen., 580:61-69.
BECALSKI, A., LAU, B.P.Y., LEWIS, D., SEAMAN, S.W., 2003. Acrylamide in
foods: occurrence, sources and modelling. J. Agricult. and Food
Chem., 51(3):802-808.
BERGMARK, E., CALLEMAN, C.J., HE, F., COSTA, L.G., 1993. Determination of
hemoglobin adducts in humans occupationally exposed to acrylamide.
Toxicol. Appl. Pharmacol., 120:45-54.
BESARATINIA, A. AND PFEIFER, G.P., 2005. DNA adduction and mutagenic
properties of acrylamide. Mutation Res./Gen. Toxicol. and Environ.
Mutagen., 580:31-40.
BLASIAK. J., GLOC, E., WOZNIAK, K., AND CZECHOWSKA, A., 2004.
Genetoxicity of acrylamide in human lymphocytes. Chemico-Biological
Interac., 149:137-149.
DIXIT, R., DAS, M., SETH, K.P., AND MUKHTAR, H., 1984. Interaction of
acrylamide with glutathione in rat erythrocytes. Toxicol. Letters, 23:291-
298.
DURLING, L.J.K., AND ABRAMSSON-ZETTERBERG, L., 2005. A comparison
of genetoxicity between three common heterocyclic amines and acrylamide.
Mutation Res./Gen. Toxicol. and Environ. Mutagen., 580:103-110.
40
FRIEDMAN, M., CAVIS, J.F., WALL, J.S., 1965. Relative nucleophilic reactivities
of amino groups and mercaptide ions in addition reactions with alpha,
beta-unsaturated compounds. J. Am. Chem. Soc., 87:3672- 3682.
GORNALL, A.G., BARDAWILL, C.J., DAVID, M.M., 1949. Determination of
serum proteins by means of the biüret reaction. J. Biol. Chem., 66:177-751.
HANAHAN, U.J. AND ECHOLM, J.E., 1974. Mth. Enzymol., 31:168-172.
KAMPEN, E.J., 1961. Klinik Kimya. s.78-82.
LINGNERT, H., 2002. Acrylamide in food–mechanisms of formation and
influencing factors during heating of foods. The Swedish Institute For
Food and Biotechnology Chairman of Expert Committee.
LOPACHIN, R.M., ROSS, J.F., LEHNING, E.J., 2002. Nerve terminals as the
primary site of acrylamide action: a hypothesis. Neuro Toxicol., 23:43-59.
LOWRY, O.H., ROSEBROUGH, N.J., FARR, A.L., AND RANDAL, R.S., 1951. J.
Biol. Chem., 193: 265-275.
MENG, F.G., ZHOU, H.W., AND ZHOU, H.M., 2001. Effects of acrylamide on
creatine kinase from rabbit muscle. The International Journal of
Biochemistry & Cell biology., 33:1064-1070.
MURRAY, R.K., MAYES, P.A., GRANNER, D.K., RODWELL, V.W., 1991.
Harper’s Biochemisry. p.48-58.
ODLAND, L., ROMERT, L., CLEMEDSON, C., WALUM, E., 1994. Glutathione
content, glutathione transferase activity and lipid peroxidation in
acrylamide- treated neuroblastoma N1E 115 cells. Toxicol. in Vitro,
8:263-267.
PATEL, J.M., BLOCK, E.R., 1993. Acrolein induced injury to cultured pulmonary
artery endothelial cells. Toxicol. and Appl. Pharmacol., 122:46-53.
PAULSSON, B., GRAWE, S. AND TORNQVIST, M., 2002. Hemoglobin adducts
and micronucleus frequencies in mouse and rat after acrylamide or N-
methylolacrylamide treatment. Mutation Res., 516:101-111.
READING, H.W., AND ISBIR, T., 1980. The role of cation activated ATPase in
transmitter releare from the art iris. QJ Exp Physiol., 65:105.
41
ROBINSON, J.D., 1974. Cation interactions with different functional states of the
Na+-K+ ATPase. Ann-New York Acad Sci., 242: 185.
ROSSIER, B.C., GEERING, K.G., AND KRAEHENBUHL, J.P., 1987. Regulation
of the sodium pump:how and why?. Trends Biochem. Sci., 12: 483.
SCHETTGEN, T., ROSSBACH, B., KUTTING, B., LETZEL, S., DREXLER, H.,
AND ANGERER, J., 2004. Determination of hemoglobin adducts of acrylamide
and glycamide in smoking and non-smoking persons of the general
population. Int. J. Hygiene and Environ. Health, 207:531-539.
SRIVASTAVA, S.P., DAS, M., AND SETH, P.K., 1983. Enhancement of lipid
peroxidation in rat liver on acute exposure to styrene and acrylamide a
consequence of glutathione depletion. Chemico-Biological Interact.,
45:373-380.
SUMNER, S.J.S., FENNELL, T.R., MOORE, T.A., CHANAS, B., GONZALEZ, F.,
GHANAYEM, B. I., 1999. Role of cytochrome P4502E1 in the metabolism of
acrylamide and acrylonitrile in Mice. Chem. Res. Toxicol., 12:1110-1116.
TONG, G.C., CORNWELL, W.K., MEANS, G.E., 2004. Reactions of acrylamide
with glutathione and serum albumin. Toxicol. Letters, 147:127-131.
YANG, H.J., LEE, S.H., JIN, Y., CHOI, J.H., HAN, D.U., CHAE, C., LEE, M.H.,
AND HAN, H.C., 2005. Toxicological effects of acrylamide on rat testicular gene
expression profile. Reproductive Toxicol., 19:527- 534.
42
ÖZGEÇMİŞ
1978 yılında Adana’da doğdum. İlk ve orta öğrenimimi Adana’da
tamamladım. 1999 yılında Dokuz Eylül Üniversitesi, Buca Eğitim Fakültesi, Kimya
Eğitimi Bölümünden mezun oldum. 2000 yılından bu yana sınıf öğretmeni olarak
görev yapmaktayım.