ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİAroma maddelerinin belirlenmesinde Gaz Kromatografisi-Alev İyonlaşma Dedektörü kullanılmıştır. Elde edilen bulgulara göre ele alınan 3 maya ırkı

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ

FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

DOKTORA TEZİ

Murat YILMAZTEKİN

BİYOTEKNOLOJİK YOLDAN DOĞAL İZOAMİL ASETAT VE ETİL

ASETAT AROMALARININ ÜRETİMİ ÜZERİNDE ARAŞTIRMALAR

GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI

ADANA, 2009

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ

FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Murat YILMAZTEKİN

DOKTORA TEZİ


Bu tez 11/02/2009 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği ileKabul Edilmiştir.

İmza................................. İmza ............................. İmza .............................Prof. Dr. Turgut CABAROĞLU Doç. Dr. Hüseyin ERTEN Prof.Dr. Ahmet CANBAŞI. DANIŞMAN II. DANIŞMAN ÜYE

İmza…………………... İmza……………………Prof. Dr. Filiz ÖZÇELİK Prof. Dr. E. Sultan VAYISOĞLU GİRAYÜYE ÜYE

Bu tez Enstitümüz Gıda Mühendisliği Anabilim Dalında hazırlanmıştır.

Kod No :

Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü İmza ve Mühür

Bu Çalışma Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri ve TÜBİTAK-TOVAGTarafından Desteklenmiştir.Proje Numaraları: ZF2004D34, ZF2004BAP13, ZF2004BAP20 ve TÜBİTAK-TOVAG-3393

Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğraflarınkaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.



I

ÖZDOKTORA TEZİ

Murat YILMAZTEKİN

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİFEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ


I. Danışman : Prof. Dr. Turgut CABAROĞLUII. Danişman : Doç. Dr. Hüseyin ERTEN

Yıl: 2009, Sayfa: 103Jüri : Prof. Dr. Ahmet CANBAŞ

Prof. Dr. Filiz ÖZÇELİKProf. Dr. Turgut CABAROĞLUProf. Dr. E. Sultan VAYISOĞLU GİRAYDoç. Dr. Hüseyin ERTEN

Bu çalışmada, Williopsis saturnus mayası kullanılarak melastan fermantasyon yoluyla vemelas ortamında fuzel yağı ilavesiyle biyodönüşüm yoluyla izoamil asetat üretimi; Pichia mayasıkullanılarak melastan fermantasyon yoluyla etil asetat üretimi ele alınmıştır. Araştırmada 3 farklıWilliopsis saturnus maya ırkının (HUT 7087, IAM 12217 ve NCYC 22), sıcaklığın (15 ºC ve 25 ºC)ve havalandırmanın (havalandırmasız, yarı havalandırmalı ve havalandırmalı) izoamil asetat üretimineetkisi saptanmış ve daha sonra belirlenen en uygun koşullarda ortama ilave edilen fuzel yağınınbiyodönüşümü ile izoamil asetat üretiminin arttırılması hedeflenmiştir. Etil asetat üretiminde isePichia cinsine ait 2 farklı mayanın (Pichia anomala NCYC 432 ve Pichia subpelliculosa NCYC 436),sıcaklığın (15 ºC ve 25 ºC) ve havalandırmanın (havalandırmasız, yarı havalandırmalı vehavalandırmalı) etkileri araştırılmıştır.

Fermantasyon denemeleri kontrollü koşullar altında fermentörlerde, biyodönüşüm denemeleriise orbital karıştırıcıda erlenmayerler içerisinde gerçekleştirilmiştir. Aroma maddelerininbelirlenmesinde Gaz Kromatografisi-Alev İyonlaşma Dedektörü kullanılmıştır.

Elde edilen bulgulara göre ele alınan 3 maya ırkı içerisinde Williopsis saturnus HUT7087’nin en yüksek miktarda izoamil asetat üreten ırk olduğu ve bu maya ırkı ile 25 ºC’de 15 ºC’yegöre, yarı havalandırmalı ortamda havalandırmasız ve havalandırmalı ortama göre daha fazla izoamilasetat üretildiği belirlenmiştir. Saptanan en uygun koşullarda ortama ilave edilen % 1 oranında fuzelyağı izoamil asetat üretiminde 3 kat artışa neden olmuş ve üretilen izoamil asetat miktarı 354 mg/Lolarak belirlenmiştir. Pichia cinsine ait mayalardan ise Pichia anomala NCYC 432 melastan en fazlaetil asetat üreten maya olmuştur. 25 ºC’de 15 ºC’ye göre ve yarı havalandırmalı ortamdahavalandırmasız ve havalandırmalı ortama göre daha fazla etil asetat üretilmiş ve belirlenen en uygunfermantasyon koşullarında ulaşılan en yüksek etil asetat miktarı yaklaşık 6.7 g/L olmuştur.

Anahtar Kelimeler: Doğal aroma, Williopsis saturnus, Pichia, fermantasyon, biyodönüşüm



II

ABSTRACTPhD THESIS

Murat YILMAZTEKİN

DEPARTMENT OF FOOD ENGINEERINGINSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES

UNIVERSITY OF CUKUROVA

I. Supervisor : Prof. Dr. Turgut CABAROĞLUII. Supervisor : Assoc. Prof. Dr. Hüseyin ERTEN

Year: 2009, Pages: 103Jury : Prof. Dr. Ahmet CANBAŞ

Prof. Dr. Filiz ÖZÇELİKProf. Dr. Turgut CABAROĞLUProf. Dr. E. Sultan VAYISOĞLU GİRAYAssoc. Prof. Dr. Hüseyin ERTEN

In this study, the production of isoamyl acetate using Williopsis saturnus from sugarbeetmolasses by fermentation and from fusel oil in a molasses based medium by bioconversin; and theproduction of ethyl acetate using Pichia yeasts by fermentation were studied. For isoamyl acetateproduction the effects of 3 different strains of Williopsis saturnus (HUT 7087, IAM 12217 and NCYC22), temperature (15 ºC and 25 ºC) and aeration (aerated, semi-aerated and unaerated) on theproduction of isoamyl acetate were determined and enhancement of isoamyl acetate production bybioconversion with addition of fusel oil at the most suitable conditions was aimed. For ethyl acetateproduction, the influence of 2 different yeasts (Pichia anomala NCYC 432 and Pichia subpelliculosaNCYC 436), temperature (15 ºC and 25 ºC) and aeration (aerated, semi-aerated and unaerated) wereexamined.

Fermentation and bioconversion trials were performed with batch fermentors at controlledconditions and with orbital shaker in flasks, respectively. Flavour compunds were determined with gaschromatography-flame ionization detector.

According to the results obtained, Williopsis saturnus HUT 7087 was the highest isoamylacetate producer among Williopsis saturnus strains, and that strain formed higher amount of ester at25 ºC than at 15 ºC, at semi-aerated medium than aerated and unaerated mediums. The addition of 1%of fusel oil into medium caused a 3 fold increase in isoamyl acetate production and the maximumamount of isoamyl acetate produced was 354 mg/L. Pichia anomala NCYC 432 produced higher levelof ethyl acetate than that of Pichia subpelliculosa NCYC 436 from molasses. The highest amount ofethyl acetate was determined at 25 ºC than at 15 ºC, at semi-aerated medium than aerated andunaerated mediums, and the maximum amount was found about 6.7 g/L.

Keywords: Natural flavour, Williopsis saturnus, Pichia, fermentation, bioconversion

INVESTIGATIONS ON THE BIOTECHNOLOGICAL PRODUCTION OF

NATURAL ISOAMYL ACETATE AND ETHYL ACETATE

III

TEŞEKKÜR

Doktora tez çalışmam sırasında araştırma konusunun belirlenmesi,

araştırmanın planlanması ve sonuçların değerlendirilmesinde tecrübelerinden

faydalandığım başta birinci danışmanım sayın Prof. Dr. Turgut CABAROĞLU

olmak üzere, ikinci danışmanım sayın Doç. Dr. Hüseyin ERTEN’e, tezin yürütülmesi

sırasında yapmış oldukları katkılardan dolayı Tez İzleme Komitesi üyeleri sayın

Prof. Dr. Ahmet CANBAŞ ve sayın Prof. Dr. E. Sultan VAYISOĞLU GİRAY’a ve

tez jürisinde yer alarak tezimi değerlendiren sayın Prof. Dr. Filiz ÖZÇELİK’e sonsuz

teşekkürlerimi sunarım.

Çalışmalarım sırasında maddi ve manevi desteğini gördüğüm başta değerli

arkadaşım Arş. Gör. Adnan BOZDOĞAN’a, bölüm hocalarıma, acı ve tatlı pek çok

anıyı paylaştığım çalışma arkadaşlarıma ve bölüm çalışanlarına minnet duyduğumu

belirtmek isterim.

Araştırmam sırasında kullanılan melası sağlayan Özmaya A.Ş. (Ceyhan,

ADANA)’ne, fuzel yağının temin edilmesinde yardımcı olan Malatya Şeker

Fabrikası’na, maya suşlarını sağlayan HUT, IAM ve NCYC kültür koleksiyonlarına,

tez çalışmamı maddi olarak destekleyen Çukurova Üniversitesi Araştırma Projeleri

Destekleme Birimi’ne ve Türkiye Bilimsel ve Teknolojik Araştırmalar Kurumu’na

teşekkür ederim.

Son olarak, bu günlere gelmemde sonsuz emekleri olan ve maddi manevi

desteklerini esirgemeyen anneme, babama ve kardeşlerime, son beş yıldır hayatımı

renklendiren sevdiğim insana minnettarlığımı ifade etmek isterim.

IV

Sonsuz sevgi, ilgi ve destekleri ile her zaman yanımda olan anneme ve babama…

V

İÇİNDEKİLER Sayfa No

ÖZ ............................................................................................................................ I

ABSTRACT ............................................................................................................II

TEŞEKKÜR .......................................................................................................... III

İÇİNDEKİLER……. ...............................................................................................V

ÇİZELGELER DİZİNİ .......................................................................................... IX

ŞEKİLLER DİZİNİ .................................................................................................X

RESİMLER DİZİNİ.............................................................................................XIII

SİMGELER VE KISALTMALAR ......................................................................XIV

1. GİRİŞ ................................................................................................................. 1

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR.................................................................................. 4

2.1. Aroma Maddelerinin Sınıflandırılması .......................................................... 4

2.2. Biyoteknolojik Yollarla Doğal Aroma Maddelerinin Üretim Yöntemleri ....... 5

2.2.1. Mikrobiyal Yolla Üretim ........................................................................ 5

2.2.1.1. Fermantayon Yoluyla Üretim........................................................... 6

2.2.1.2. Biyodönüşüm Yoluyla Üretim ......................................................... 8

2.2.2. Enzimatik Yolla Üretim.........................................................................10

2.3. Esterler.........................................................................................................11

2.3.1. Biyoteknolojik Yollarla Esterlerin Üretimi ............................................12

2.3.2. Esterlerin Oluşum Mekanizması ............................................................13

2.3.3. Ester Oluşumunu Etkileyen Faktörler ....................................................15

2.3.3.1. Maya Cinsi .....................................................................................15

2.3.3.2. Ortam Bileşimi ...............................................................................17

2.3.3.3. Sıcaklık...........................................................................................18

2.3.3.4. Havalandırma .................................................................................19

2.3.3.5. Substrat Miktarı ..............................................................................22

2.4. Biyoteknolojik Yolla Aroma Üretiminde Gıda Sanayi Artıklarının Kullanımı

....................................................................................................................23

2.4.1. Melas.....................................................................................................24

2.4.2. Fuzel Yağı .............................................................................................26

VI

3. MATERYAL ve METOT .................................................................................27

3.1. Materyal.......................................................................................................27

3.1.1. Mayalar .................................................................................................27

3.1.2. Besiyerleri ve Kimyasallar.....................................................................27

3.1.3. Melas.....................................................................................................27

3.1.4. Fuzel Yağı .............................................................................................28

3.1.5. Fermentör..............................................................................................29

3.2. Metot ...........................................................................................................29

3.2.1. Fermantasyon ve Biyodönüşümde Kullanılan Melas Çözeltisinin

Hazırlanması .........................................................................................29

3.2.2. Aşılama Kültürünün Hazırlanması .........................................................30

3.2.3. Fermantasyon Koşulları .........................................................................30

3.2.3.1. Havalandırmalı Fermantasyon.........................................................31

3.2.3.2. Havalandırmasız Fermantasyon ......................................................31

3.2.3.3. Yarı-Havalandırmalı Fermantasyon ................................................31

3.2.4. Biyodönüşüm Koşulları .........................................................................31

3.2.5. Fuzel Yağı Toksisitesinin Belirlenmesi..................................................32

3.2.6. Örneklerin Alınması ..............................................................................32

3.2.7. Örnekler Üzerinde Yapılan Analizler.....................................................32

3.2.7.1. Maya Sayımı ve Canlılık Oranı .......................................................32

3.2.7.2. Yoğunluk........................................................................................33

3.2.7.3. pH ..................................................................................................33

3.2.7.4. Etil Alkol........................................................................................33

3.2.7.5. Aroma Maddelerinin Analizi...........................................................34

3.2.7.5.(1). Cevap Faktörünün Hesaplanması ...........................................36

3.2.7.5.(2). Miktar Tayini ........................................................................37

3.2.8. İstatistiksel Değerlendirme ....................................................................37

4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA .................................................38

4.1. İzoamil Asetat Üretimi .................................................................................38

4.1.1. W. saturnus Mayası ile İzoamil Asetat Üretimi ......................................38

4.1.1.1. Maya Gelişimi ve Canlılık Oranı.....................................................38

VII

4.1.1.2. Fermantasyonun Gidişi ...................................................................39

4.1.1.3. pH ..................................................................................................40

4.1.1.4. Etil Alkol Üretimi ...........................................................................41

4.1.1.5. 2-Metil-1-butanol ve 3-Metil-1-butanol Üretimi..............................42

4.1.1.6. İzoamil Asetat/Amil Alkol Oranı ....................................................44

4.1.1.7. İzoamil Asetat Üretimi....................................................................45

4.1.2. W. saturnus HUT 7087 Mayası Kullanılarak Fermantasyon Yoluyla

İzoamil Asetat Üretimi ..........................................................................47

4.1.2.1. W. saturnus HUT 7087 Mayası Kullanılarak Fermantasyon Yoluyla

İzoamil Asetat Üretiminde Sıcaklığın Etkisi.....................................47

4.1.2.1.(1). Maya Gelişimi ve Canlılık Oranı ...........................................47

4.1.2.1.(2). Fermantasyonun Gidişi ..........................................................49

4.1.2.1.(3). pH .........................................................................................50

4.1.2.1.(4). Etil Alkol Üretimi..................................................................51

4.1.2.1.(5). 2-Metil-1-butanol ve 3-Metil-1-butanol Üretimi ....................52

4.1.2.1.(6). İzoamil Asetat Üretimi ..........................................................55


İzoamil Asetat Üretiminde Havalandırmanın Etkisi..........................57



4.1.2.2.(3). pH .........................................................................................60


4.1.2.2.(5). 2-Metil-1-butanol ve 3-Metil-1-butanol Üretimi ....................62

4.1.2.2.(6). İzoamil Asetat Üretimi ..........................................................63

4.1.3. W. saturnus HUT 7087 Mayası Kullanılarak Biyodönüşüm Yoluyla

İzoamil Asetat Üretimi ..........................................................................66

4.1.3.1. Fuzel Yağının Maya Gelişimi ve Canlılık Oranına Etkisi ................66

4.1.3.2. Fuzel Yağının Yoğunluğa Etkisi .....................................................68

4.1.3.3. Fuzel Yağının Etil Alkol Üretimine Etkisi.......................................68

4.1.3.4. 2-Metil-1-butanol ve 3-Metil-1-butanol Miktarlarındaki Değişimler69

4.1.3.5. Fuzel Yağının İzoamil Asetat Üretimine Etkisi ...............................72

VIII

4.2. Etil Asetat Üretimi .......................................................................................74

4.2.1. P. anomala ve P. subpellicolasa Mayaları ile Etil Asetat Üretimi ..........74

4.2.2. P. anomala NCYC 432 Mayası Kullanılarak Fermantasyon Yoluyla Etil

Asetat Üretimi .......................................................................................75

4.2.2.1. P. anomala NCYC 432 Mayası Kullanılarak Fermantasyon Yoluyla

Etil Asetat Üretiminde Sıcaklığın Etkisi...........................................75



4.2.2.1.(3). pH .........................................................................................77


4.2.2.1.(5). Etil Asetat Üretimi.................................................................79

4.2.2.2. P. anomala NCYC 432 Mayası Kullanılarak Fermantasyon Yoluyla

Etil Asetat Üretiminde Havalandırmanın Etkisi................................80



4.2.2.2.(3). pH .........................................................................................82


4.2.2.2.(5). Etil Asetat Üretimi.................................................................85

5. SONUÇ ve ÖNERİLER ....................................................................................88

KAYNAKLAR ......................................................................................................91

ÖZGEÇMİŞ ........................................................................................................103

IX

ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa No

Çizelge 2.1. Fermantasyon ve mikrobiyal biyodönüşümlerin genel özellikleri.......... 6

Çizelge 2.2. Mikrobiyal biyodönüşümle üretilen bazı aroma maddeleri.................... 9

Çizelge 2.3. Fermantasyon sırasında ester oluşumunu etkileyen faktörler................15

Çizelge 2.4. Farklı maya türleri tarafından üretilen esterler .....................................17

Çizelge 2.5. Aerobik mayalar tarafından farklı fermantasyon koşullarında üretilen

şaraplarda tespit edilen etil asetat miktarları........................................21

Çizelge 2.6. Aerobik mayalar tarafından farklı fermantasyon koşullarında üretilen

şaraplarda tespit edilen izoamil asetat miktarları .................................21

Çizelge 2.7. Aroma maddelerinin üretiminde kullanılan bazı gıda artıkları ..............24

Çizelge 2.8. Şeker pancarı melasının kimyasal bileşimi...........................................25

Çizelge 3.1. Melasın fiziksel ve kimyasal özellikleri ...............................................28

Çizelge 3.2. Biyodönüşüm denemelerinde kullanılan fuzel yağının bileşimi............28

Çizelge 3.3. Aroma maddelerinin kalibrasyon verileri.............................................35

Çizelge 4.1. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlarda izoamil

asetat/amil alkol oranı……. ................................................................44

Çizelge 4.2. W. saturnus mayaları tarafından üretilen izoamil asetat miktarları ve

üretim hızları ......................................................................................46

Çizelge 4.3. Farklı sıcaklıklarda W. saturnus HUT 7087 tarafından üretilen izoamil

asetat miktarları ve üretim hızları........................................................55

Çizelge 4.4. Farklı havalandırma koşullarında W. saturnus HUT 7087 tarafından

üretilen izoamil asetat miktarları ve üretim hızları...............................65

Çizelge 4.5. Fuzel yağı konsantrasyonunun amil alkollerin biyodönüşümü üzerine

etkisi...................................................................................................72

Çizelge 4.6. Farklı konsantrasyonlarda fuzel yağı ilavesinde W. saturnus HUT 7087

tarafından üretilen izoamil asetat miktarları ve üretim hızları ..............73

Çizelge 4.7. Farklı sıcaklıklarda P. anomala NCYC 432 tarafından üretilen etil asetat

miktarları ve üretim hızları .................................................................79

Çizelge 4.8. Farklı havalandırma koşullarında P. anomala NCYC 432 tarafından

üretilen etil asetat miktarları ve üretim hızları .....................................86

X

ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa No

Şekil 2.1. Tipik bir fermantasyon işlemi. .................................................................. 8

Şekil 2.2. Aroma sanayinde kullanılan bazı önemli esterler .....................................12

Şekil 2.3. Esterlerin kimyasal ve biyokimyasal yolla sentezlenmesi. .......................13

Şekil 2.4. Mayalarda ester oluşumunun biyokimyası. ..............................................14

Şekil 3.1. Etil alkol analizlerinde elde edilen örnek kromatogram ...........................34

Şekil 3.2. Aroma maddelerinin analizlerinde elde edilen örnek kromatogram..........36

Şekil 4.1. W. saturnus mayalarının gelişimi.............................................................39

Şekil 4.2. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlara ait yoğunluk

değerleri ................................................................................................40

Şekil 4.3. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlara ait pH değerleri

..............................................................................................................41

Şekil 4.4. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlardaki etil alkol

üretimi...................................................................................................42

Şekil 4.5. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlardaki 2-metil-1-

butanol üretimi ......................................................................................43

Şekil 4.6. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlardaki 3-metil-1-

butanol üretimi ......................................................................................44

Şekil 4.7. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlardaki izoamil

asetat üretimi .........................................................................................46

Şekil 4.8. W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı sıcaklıklarda yürütülen

fermantasyonlardaki canlı maya sayısı ...................................................48

Şekil 4.9. W. saturnus HUT 7087 maya ile farklı sıcaklıklarda yürütülen

fermantasyonlardaki yoğunluk değişimi.................................................49


fermantasyonlardaki pH değişimi ..........................................................50


fermantasyonlarda etil alkol üretimi.......................................................51


fermantasyonlarda 2-metil-1-butanol üretimi .........................................53

XI


fermantasyonlarda 3-metil-1-butanol üretimi .........................................53


fermantasyonlarda izoamil asetat üretimi ...............................................55

Şekil 4.15. W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı havalandırma koşullarında

yürütülen fermantasyonlardaki canlı maya sayısı ...................................57


yoğunluk değişimi .................................................................................59

Şekil 4.17. W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı havalandırma koşullarında pH

değişimi.................................................................................................60

Şekil 4.18. W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı havalandırma koşullarında etil

alkol üretimi ..........................................................................................61

Şekil 4.19. W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı havalandırma koşullarında 2-

metil-1-butanol üretimi..........................................................................62

Şekil 4.20. W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı havalandırma koşullarında 3-

metil-1-butanol üretimi..........................................................................63


izoamil asetat üretimi.............................................................................64

Şekil 4.22. Biyodönüşüm süresince canlı maya sayısı .............................................67

Şekil 4.23. Biyodönüşüm süresince canlılık oranı....................................................67

Şekil 4.24. Biyodönüşüm süresince gözlenen yoğunluk değerleri ............................68

Şekil 4.25. Biyodönüşüm süresince etil alkol üretimi ..............................................69

Şekil 4.26. Biyodönüşüm süresince 2-metil-1-butanol miktarlarındaki değişim.......70

Şekil 4.27. Biyodönüşüm süresince 3-metil-1-butanol miktarlarındaki değişim.......71

Şekil 4.28. Biyodönüşüm süresince üretilen izoamil asetat miktarlarındaki değişim 73

Şekil 4.29. P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı sıcaklıklarda gerçekleştirilen

fermantasyonlardaki maya gelişimi........................................................75


fermantasyonlardaki yoğunluk değerleri ................................................76


fermantasyonlardaki pH değerleri ..........................................................77

XII


fermantasyonlarda üretilen etil alkol miktarları ......................................78


fermantasyonlarda üretilen etil asetat miktarları .....................................79

Şekil 4.34. P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı havalandırma koşullarında

yürütülen fermantasyonlardaki canlı maya sayısı ...................................81


yürütülen fermantasyonlardaki yoğunluk değerleri.................................82


yürütülen fermantasyonlardaki pH değerleri ..........................................83


yürütülen fermantasyonlardaki etil alkol üretimi ....................................84


yürütülen fermantasyonlardaki etil asetat üretimi...................................85

XIII

RESİMLER DİZİNİ Sayfa No

Resim 3.1. Fermantasyon denemelerinde kullanılan fermentörler………………….29

XIV

SİMGELER VE KISALTMALAR

W : Williopsis

P : Pichia

S : Saccharomyces

AATaz : Alkol asetiltransferaz

ATF1 ve ATF2 : Alkol asetiltransferaz I ve Alkol asetiltransferaz II

enzimlerini kodlayan genler

NCYC : National Collection of Yeast Cultures (Ulusal Maya

Kültür Koleksiyonu, İngiltere)

IAM : Institute of Applied Microbiology Culture Collection

(Uygulamalı Mikrobiyoloji Enstitüsü Kültür

Koleksiyonu, Japonya)

HUT : Hiroshima University Culture Collection (Hiroşima

Üniversitesi Kültür Koleksiyonu, Japonya)

MEA : Malt Ekstrakt Agar

MEB : Malt Ekstrakt Broth

GC : Gas Chromatography (Gaz Kromatografisi)

FID : Flame Ionization Detector (Alev İyonlaşma Dedektörü)

1. GİRİŞ Murat YILMAZTEKİN

1

1. GİRİŞ

Aroma maddeleri burun yoluyla ve ürün ağızdayken geniz yoluyla algılanan

uçucu ve koku veren özellikteki alifatik ve aromatik yapılı kimyasal bileşiklerdir.

Gıdanın tüketici tarafından tercih edilmesinde birinci derecede rol oynayan aroma

maddeleri, gıdanın en önemli kalite kriterlerinden birini oluşturmaktadır. Bu

bileşikler gıdalarda çok sayıda ve nanogram ile miligram gibi düşük miktarlarda

bulunmalarına rağmen gıdanın kendine özgü duyusal özelliğini belirler. Gıdaların

aroması aldehitler, alkoller, ketonlar, esterler, laktonlar, terpenler, pirazinler, uçucu

fenoller ve kükürtlü bileşikler gibi çeşitli kompleks gruplardan oluşmaktadır

(Reineccius, 2006).

Bir gıdanın aroması hammaddenin doğal yapısından, ürünün işlenmesi

sırasında uygulanan kesme, sıkma, ezme, haşlama, pişirme, kızartma, kavurma,

fermantasyon, tütsüleme vb. çeşitli işlemlerden veya ürüne dışarıdan ilave edilen

aroma bileşiklerinden ileri gelir. Gıdalarda arzu edilen aromanın yeterli olmaması,

üretim sırasında ortaya çıkan kayıpları geri kazandırmak, gıdada doğal olarak

bulunan bir kokuyu maskelemek, aromasız gıdalara başka bir aroma kazandırmak

veya ürünü farklılaştırmak gibi çeşitli nedenlerle ürünlere aroma maddesi ilavesi

yapılmaktadır (Elmacı, 2001; Reineccius, 2006; Bayrak, 2006).

Aroma maddeleri özellikle gıda sanayinde sıkça kullanılan katkı maddeleri

arasında gelmektedir. Uzun zamandan beri bitkiler aroma maddelerinin esas kaynağı

olmuşlardır. Ancak bunların düşük miktarlarda bulunmaları, saflaştırılmalarının zor

olması ve pahalı olmaları nedeniyle günümüzde kimyasal yolla sentezlenen aroma

maddeleri daha çok kullanılmaktadır. Bugün piyasada kullanılan aroma maddelerinin

yaklaşık % 80’den fazlasını sentetik aroma maddeleri oluşturmaktadır (Krings ve

Berger, 1998). Ancak son zamanlarda müşteri taleplerinin doğal ürünlere kayması,

kimyasal ürünlerin insan sağlığını ve çevreyi tehdit etmesi ve uluslararası

mevzuatlarda kimyasal yollarla elde edilen ürünlere getirilen kısıtlamalar alternatif

yolların ortaya çıkmasına neden olmuştur.

Aroma maddelerinin üretiminde son dönemlerde oldukça ilgi gören

yöntemlerden biri de biyoteknolojik işlemlerin kullanılmasıdır. Modern


2

biyoteknolojide yaşanan gelişmeler sonucunda doğal aroma maddelerinin

mikroorganizmalar, izole edilmiş enzimler ve bitki hücre kültürlerinden

yararlanılarak üretilmesi mümkün olmuştur. Günümüzde yaklaşık 100 kadar doğal

aroma bileşiği biyoteknolojik yöntemlerle üretilmektedir (Reineccius, 2006).

Prensipte biyoteknolojik yolla aroma maddesi üretiminde iki yöntem yaygın olarak

kullanılmaktadır. Birincisi mikroorganizmaların kullanıldığı fermantasyon yoluyla

üretim (de novo sentezi), ikincisi ise mikroorganizmaların veya enzimlerin

kullanıldığı biyodönüşüm yoluyla üretimdir (Janssens ve ark., 1992). Biyoteknolojik

yöntemlerin sağladığı en önemli avantajlar, tarımsal üretimde karşılaşılan

sorunlardan (iklim, bitkisel hastalıklar, pestisit kullanımı, pazar arayışı, tarım

politikaları vb.) bağımsız olması ve endüstriyel ölçekte uygulanabilir olmasıdır

(Krings ve Berger, 1998). Biyoteknolojik üretimin kimyasal yolla üretime göre

avantajları ise, daha esnek reaksiyon koşullarına, yüksek ürün ve substrat

spesifikliğine sahip olması ve çevreyi daha az kirletmesidir (Xu ve ark., 2007).

Kısa zincirli yağ asitleriyle alkoller arasında meydana gelen esterler, aroma

maddeleri arasında önemli bir grup olup meyve aroması veren bileşikler olarak

tanınırlar. İzoamil asetat ve etil asetat gıdalara meyvemsi tat ve koku verdiklerinden

gıda endüstrisinde sıklıkla kullanılan aroma maddeleridir. Bunların doğal

kaynaklardan elde edilen formları hem pahalı olmakta, hem de miktar olarak yetersiz

kalmaktadır. Bu yüzden aroma maddelerinin üretiminde son yıllarda oldukça ilgi

gören biyoteknolojik yollarla üretim, doğal izoamil asetat ve etil asetat üretiminde de

alternatif yöntemlerden biri olarak görülmektedir.

Ülkemizde gıda sanayi artıklarının yeterince değerlendirilememesi hem çevre

sorunlarına hem de ekonomik kayıplara yol açmaktadır. Biyoteknolojik yöntemlerle

aroma maddelerinin üretiminde, gıda sanayi artıkları karbon ve azot kaynağı olarak

fermantasyon işlemlerinde kullanılabilmektedir. Bu şekilde gıda artıklarının

değerlendirilmesiyle hem doğal aroma maddelerinin üretiminde maliyetin

düşürülmesi, hem de ülke ekonomisine katkı sağlanması düşünülmektedir.

Değerlendirilebilecek gıda artıkları arasında melas hem içerik bakımından, hem de

ucuz temin edilebilmesi açısından potansiyel oluşturabilecek niteliktedir.


3

Tarımsal hammaddelerden etil alkol üretiminde yan ürünlerden biri de

damıtma işlemi sonrasında ortaya çıkan damıtma artıklarıdır. Damıtma işleminden

sonra geride kalan kuyruk (son kısım) fuzel yağları olarak da adlandırılan yüksek

alkolleri ve özellikle amil alkolleri içerir. Mayalar özellikle izoamil asetatı ve bazı

uçucu asetatları yüksek alkollerden üretebilmektedir. Bu durumda, ucuz bir yan ürün

olan damıtma artıkları izoamil asetat üretimi için önemli bir kaynak olarak

görünmektedir.

Bu çalışmada karbon kaynağı olarak melas kullanarak W. saturnus mayası ile

izoamil asetat ve P. anomala ve P. subpelliculosa mayaları ile etil asetat üretimi ele

alınmış ve,

· W. saturnus mayası ile izoamil asetat üretiminde;

- En uygun maya ırkının belirlenmesi

- Fermantasyon yoluyla üretim sırasında sıcaklık (15 ve 25 ºC) ve

havalandırmanın (havalandırmalı, yarı havalandırmalı ve havalandırmasız)

etkisi ve

- Biyodönüşüm yoluyla üretim sırasında ortama farklı konsantrasyonlarda (%

1, 2 ve 3) fuzel yağı ilavesinin etkisi,

· P. anomala ve P. subpelliculosa ile etil asetat üretiminde ise;

- Fermantasyon yoluyla üretim sırasında sıcaklık (15 ve 25 ºC) ve

havalandırmanın (havalandırmalı, yarı havalandırmalı ve havalandırmasız)

etkisi araştırılmıştır.

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN

4

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR

2.1. Aroma Maddelerinin Sınıflandırılması

Aroma maddeleri genel olarak doğal ve yapay aroma maddeleri olarak

gruplandırılır. Aroma maddelerinin elde edildikleri kaynakların çok farklı ve çok

çeşitli olması, uluslararası mevzuatlarda kesin tanımlarının yapılmasına neden

olmuştur. Amerika Birleşik Devletleri’nde aroma maddeleri doğal ve yapay olmak

üzere iki gruba ayrılmış ve doğal aroma maddeleri, “esansiyel yağlar; yağlı reçineler;

esanslar; protein hidrolizatları; baharat, meyve suyu, sebze veya sebze suyu, maya

ekstraktları, bitki tomurcuk, kabuk, kök ve yaprakları, et, deniz ürünleri, kümes

hayvanları, yumurta ve süt ürünlerinin kızartılması, ısıtılması ve enzimle muamele

edilmesinden sonra elde edilen destilatları veya esas işlevi aroma vermek olan

fermantasyon ürünleri“ şeklinde tanımlanmıştır. Avrupa Birliği Aroma

Yönergesi’nde ise doğal aroma maddeleri, “bitkisel veya hayvansal kaynaklardan

fiziksel, enzimatik veya mikrobiyolojik yollarla elde edilen aroma verici madde veya

madde karışımları” olarak ifade edilmiştir (Vandamme ve Soetaert, 2002). Her iki

tanımdan da anlaşıldığı gibi aroma maddelerinin doğal olarak adlandırılabilmesi için

elde edildiği hammaddenin de (substrat veya ön bileşik) doğal olması gerekmektedir.

Doğal bir aroma maddesinin adı “Doğal Çilek Aroması” ifadesinde olduğu gibi bir

gıda maddesine veya bir aroma kaynağına referans oluşturuyorsa, bu aromanın

tamamının uygun fiziksel, enzimatik veya mikrobiyolojik yollarla bu gıdadan veya

kaynaktan elde edilmesi zorunludur. Aksi durumda “doğal” ifadesi kullanılamaz

(Anonim, 1997a).

Birçok Avrupa ülkesinde doğal ve yapay aroma maddelerinin yanında doğala

özdeş aroma maddeleri ayrı bir sınıf olarak kabul edilmektedir. Kimyasal yollarla

sentezlenen bu bileşikler, doğal formlarıyla aynı özellikleri gösterirler (Janssens ve

ark., 1992; Vandamme ve Soetaert, 2002). Türk Gıda Kodeksi Yönetmeliğine göre

aroma maddeleri, “doğal aroma maddeleri”, “doğala özdeş aroma maddeleri” ve

“yapay aroma maddeleri” olarak sınıflandırılmaktadır (Anonim, 1997a).


5

2.2. Biyoteknolojik Yollarla Doğal Aroma Maddelerinin Üretim Yöntemleri

2.2.1. Mikrobiyal Yolla Üretim

İnsanoğlu yüzyıllardan beri farklı teknikler kullanarak hoş kokulu ve aromalı

gıdalar üretmiş, fakat aroma oluşumunda mikroorganizmaların rol oynadığını ancak

geçtiğimiz yüzyılda mikrobiyoloji ve biyokimyada yaşanan gelişmeler sayesinde

öğrenebilmiştir. Yapılan araştırmalar sonucunda mikroorganizmaların, birçoğu

önemli aroma bileşiği olan ikincil ürünleri ürettiği belirlenmiştir (Vanderhaegen ve

ark., 2003).

Biyoteknolojik yolla doğal aroma maddesi üretim yöntemlerinden birisi de

mikroorganizmaların kullanılmasıdır. Mikroorganizmaların kullanıldığı üretim

tekniklerinde fermantasyon ve mikrobiyel biyodönüşüm olmak üzere temel olarak iki

yöntemden yararlanılmaktadır; Birinci yöntemde, ortamda bulunan karbonhidrat, yağ

ve protein gibi maddeler fermantasyona uğramakta ve yıkıma uğrayan bileşiklerden

aroma maddeleri üretilmektedir (de novo sentezi). İkinci yöntemde ise, ortama ilave

edilen ve reaksiyonu başlatan ön bileşiklerden (prekursör) az basamaklı

reaksiyonlarla aroma maddeleri üretilmektedir (Janssens ve ark., 1992).

Fermantasyonla üretimde karbon ve azot kaynaklarına ihtiyaç duyulurken,

mikrobiyel biyodönüşümde uygun bir substrat yeterli olmaktadır. Her iki yöntemin

genel özellikleri karşılaştırılarak Çizelge 2.1’de verilmiştir.


6

Çizelge 2.1. Fermantasyon ve mikrobiyel biyodönüşümlerin genel özellikleri(Winterhalter ve Schreier, 1993)

Özellik Fermantasyon Mikrobiyal biyodönüşüm

Mikroorganizmalar Çoğalan hücreler Çoğalma evresindeki ve durgun

evredeki hücreler

Reaksiyon Birden fazla reaksiyon Basit (tek veya birkaç basamaklı)

katalitik reaksiyonlar

Reaksiyon süresi Uzun Kısa

Substrat Ucuz karbon ve azot

kaynakları

Spesifik (bazen pahalı)

Ürün Doğal Doğal veya yapay

Ürün miktarı Az Yüksek

Ürünün

saflaştırılması

Zor Kolay

2.2.1.1. Fermantasyon Yoluyla Üretim

Fermantasyon, çok eski zamanlardan beri gıda biliminde sürekli kullanılan bir

yöntemdir. Biyokimyasal yönden fermantasyon, mikroorganizmalar tarafından

salgılanan enzimlerin organik maddelerde oluşturduğu parçalanma veya kimyasal

değişiklikler olarak tanımlanır (Canbaş, 1988). Biyoteknolojide ise, bir ürünün

mikroorganizma kültürleri vasıtasıyla uygun koşullarda üretilmesidir. Oluşan ürün

biyokütle, enzimler ve metabolitler olabildiği gibi, bazı bileşiklerin modifikasyonu

da gerçekleştirilebilmektedir (Stanbury ve ark., 1995). Aynı zamanda organik

asitlerin, antibiyotiklerin, amino asitlerin ve nükleik asit türevlerinin üretimi için de

uygun bir yöntemdir. Bu teknikte ucuz karbon ve azot kaynakları kullanılmakta ve

amaçlanan ürün, mikroorganizmaların karmaşık metabolik etkinlikleri sonucu

meydana gelmektedir (Korukluoğlu, 1998).

Mikroorganizmaların bazı aroma maddelerini sentezleyebilme yeteneğinde

oldukları uzun zamandan beri bilinmektedir. Üretiminde fermantasyonun temel rol

oynadığı şarap, bira, yoğurt, ekmek gibi birçok geleneksel gıdanın karakteristik


7

özelliğini ve aromasını mikroorganizmaların faaliyeti sonucunda oluşmaktadır

(Janssens ve ark., 1992). Mikroorganizmalar karbonhidrat, alkol, protein, yağ gibi

çeşitli maddeleri kullanarak aroma maddelerini üretebilmektedir. Fermantasyon

yoluyla aroma maddelerinin üretiminde yüzey kültür ve derin kültür yöntemleri

olmak üzere başlıca iki yöntem kullanılmaktadır (Berger, 1995). Yüzey kültür

yönteminde mikroorganizmalar sıvı, yarı katı veya katı substratların yüzeylerinde

gelişir. Bu sistemde metabolizma ürünü, mikroorganizma türüne göre hücre içinde

kaldığı gibi hücre dışına da salgılanabilir veya her iki halde de bulunabilir. Üretim

sırasında yüzey alanı arttırıldıkça havadan oksijen sağlanması ve mikroorganizmanın

substrat içerisinde homojen bir şekilde dağılımı daha kolay olmakta ve verimde artış

sağlanmaktadır (Pekin, 1993; Najafpour, 2007). Bu amaçla son yıllarda döner

tamburlu ve daldırmalı biyoreaktörler geliştirilmiştir (Longo ve Sanromán, 2006).

Derin kültür yönteminde ise mikroorganizmalar substratın içerisinde gelişir. Gereken

hava/gaz karışımı çoğunlukla uygun bir havalandırma düzeneği ile fermantasyon

ortamına verilir. Bu amaçla karıştırma ve havalandırma özelliğine sahip fermentörler

kullanılır (Pekin, 1993; Najafpour, 2007). Aroma üretiminde yüzey kültür yöntemi

daha yaygın kullanılır ve özellikle ucuz tarımsal atıklardan aroma eldesinde tercih

edilir. Kullanılan bu iki yöntem kıyaslanacak olursa, yüzey kültür yöntemi derin

kültür yöntemine göre düşük maliyetle daha yüksek verimde ve daha iyi özellikte

ürün elde edilmesini sağlamaktadır (Couto ve Sanromán, 2006). Fermantasyon

yoluyla aroma maddesi üretiminde izlenecek yol sırasıyla aşağıda verilmiştir (Şekil

2.1) (Stanbury ve ark., 1995).

-Fermantasyon ortamının formülasyonu veya bileşiminin belirlenmesi,

-Fermantasyon ortamının, fermentörün ve kullanılacak ekipmanların sterilizasyonu,

-Üretim fermentörünün aşılanması için yeterli miktarda aktif saf kültürün üretilmesi,

-Ürün oluşumu için fermentördeki mikroorganizmaların en uygun şartlarda

gelişmesi,

-Ürünün fermantasyon ortamından ekstraksiyonu ve saflaştırılması

-İşlem sonrası oluşan atıkların arıtılması.


8

Stokkültür Orbital

karıştırıcı Aşılamafermentörü

Üretimfermentörü

Biyokütle

Sıvı kısım

AtıklarınarıtılmasıÜrünün

saflaştırılması

Fermantasyonsıvısı

Hücreayırma

Ürün ekstraksiyonu

Ürününpaketlenmesi

Ortam hammaddesi

Ortamın formülasyonu

Ortamın sterilizasyonu

Mikroorganizmaların fermantasyon sırasında oluşturdukları başlıca aroma

maddeleri yüksek alkoller, esterler, uçucu asitler, karbonil bileşikleri, terpenler,

laktonlar, pirazinler ve kükürtlü bileşiklerdir (Reineccius, 2006).

Şekil 2.1. Tipik bir fermantasyon işlemi (Stanbury ve ark., 1995).

2.2.1.2. Biyodönüşüm Yoluyla Üretim

Mikroorganizmaların bir bileşiği yapısal yönden kendisine benzer başka bir

bileşiğe dönüştürmesi olayına mikrobiyel biyodönüşüm denir (Crueger ve Crueger,

1990). Bir başka deyişle, mikroorganizmalar tarafından katalizlenen kimyasal

dönüşümlerdir. (Telefoncu, 1995). Biyodönüşüm olayına en klasik örnek olarak

asetik asit bakterileri tarafından etil alkolden asetik asit üretimi gösterilebilir.

Günümüzde mikrobiyel biyodönüşümle üretilen birçok aroma maddesi olmasına

karşın bunların halen büyük çoğunluğu araştırma düzeyindedir. Bunlardan önemli

bulunanlar ve endüstriyel düzeyde üretilenler Çizelge 2.2’de verilmiştir.


9

Çizelge 2.2. Mikrobiyal biyodönüşümle üretilen bazı aroma maddeleriBileşik Mikroorganizma Substrat Oluşan koku

Vanilin Serratia Ferulik asit Vanilya

Amycolatopsis Öjenol

Pseudomonas İzoöjenol

γ-Dekalakton Candida Risinoleik asit Şeftali

Yarrowia

Sporobolomyces

Benzaldehit Ischnoderma L-Fenilalanin Badem

İzoamil asetat W. saturnus Amil alkol Muz

2-Feniletanol Saccharomyces L-Fenilalanin Gül benzeri

Kluyveromyces

Mikrobiyel biyodönüşüm sırasında gerçekleşen bazı reaksiyon türleri arasında

oksidasyon, hidroliz, esterleşme, dehidrasyon, fosforilasyon, C-C bağlarının

koparılması, indirgenme reaksiyonları gelmektedir. Biyodönüşümde genellikle verim

çok yüksektir. Verimi etkileyen faktörler arasında mikroorganizma türü, pH, sıcaklık,

hücre zarı geçirgenliği, ürün inhibisyonu, substratların ortamda çözünürlük derecesi

gibi özellikler sayılabilir. Birçok mikrobiyal biyodönüşüm olayında iki substrat

gereklidir. Bunlardan biri mikroorganizmaların gelişmesi için gereklidir. Diğeri ise,

dönüşüme uğrayacak substrattır. Mikroorganizma gelişimi için gerekli substrat doğal

kaynaklardan ucuz olarak karşılanabileceğinden maliyet düşürülmüş olur (Crueger

ve Crueger, 1990).

Biyoteknolojide kullanılan farklı mikrobiyal biyodönüşüm teknikleri vardır.

Bunlar;

Çoğalan hücreler ile biyodönüşüm: Hücreler ideal besi ortamında üretilir ve

yapılan testlerle belirlenen şekilde biyodönüşüme uğratılacak substrat ortama katılır,


10

Durgun evredeki hücreler ile biyodönüşüm: Mikroorganizma ideal

besiyerinde üretilir, filtrasyon veya santrifüj ile ayrıldıktan sonra biyodönüşüm

ortamına ilave edilir,

Sporlar ile biyodönüşüm: Küfler spor oluşumu için ideal koşullarda üretilir ve

sporlar misellerden ayrılıp soğukta saklanır. Biyodönüşüm yapılacağı zaman bu

sporlardan yararlanılır,

İmmobilize hücreler ile biyodönüşüm: Mikroorganizmalar ürün ve substratın

geçişine izin veren bir polimer matrikste (poliakrilamid, kapa-karragenan, alginat,

selüloz, nişasta vb.) tutuklanır veya bir polimere bağlanır. İmmobilize hücreler

istenildiği anda ortamdan uzaklaştırılabilir, yeniden kullanılabilir, kesikli ve kesiksiz

fermantasyonlara uygundur (Telefoncu, 1995).

Mikrobiyel biyodönüşüm yüksek substrat seçiciliği, az miktarda yan ürün

oluşumu ve asıl ürünün kolay izole edilmesi ve saflaştırılması gibi önemli avantajlara

sahip olması nedeniyle daha çok tercih edilmektedir. Bu yöntem aroma maddelerinin

yanında bazı katkı maddelerinin endüstriyel ölçekli üretimlerinde de sıklıkla

kullanılmaktadır (Xu ve ark., 2007).

2.2.2. Enzimatik Yolla Üretim

Enzimler mikrobiyel hücrelere nazaran substratların ürüne dönüşümünde

yüksek stereo- ve enantio-seçiciliğe sahip oldukları için aroma maddeleri üretiminde

etkin bir biçimde kullanım alanı bulmuşlardır (Berger, 1995). Lipazlar, esterazlar,

proteazlar, nükleazlar ve farklı glukozidazlar aroma bileşiklerinin ekstraksiyonu

işlemlerinde kullanılan enzimlerden bazılarıdır. Kofaktörden bağımsız olarak çalışan

bu enzimler hidroliz ve transesterifikasyon reaksiyonlarıyla optikçe saf alifatik ve

aromatik esterlerin ve laktonların üretiminde potansiyel oluşturmaktadırlar (Krings

ve Berger, 1998).

Enzimatik biyodönüşüm aroma üretiminde yaygın olarak kullanılmaktadır.

Bu yöntem yaygın olarak ester üretiminde kullanılmaktadır. Lipaz enzimi

kullanılarak asit ve alkolden ester sentezlenebilmektedir (Abbas ve Comeau, 2003).


11

Enzim katalizli reaksiyonların kimyasal katalizli reaksiyonlara göre bazı

önemli üstünlükleri vardır (Telefoncu, 1995). Bunlar;

Spesifiklik: Enzimatik reaksiyonlarda prensip olarak yan ürün oluşmaz (etki

spesifikliği) ve çoğu enzimler yalnız belirli bir substrat ile oluşan reaksiyonu

katalizlerler (substrat spesifikliği),

Reaksiyon Koşullarının Ilımlılığı: Enzimatik reaksiyonlar sulu ortamda nötral

pH dolayında ve genellikle 40 º C’ den daha düşük sıcaklıklarda gerçekleşir,

Aktivasyon Enerjisinin Düşürülmesi: Enzimatik reaksiyonlarda ara madde

katalizi mekanizması sonucu aktivasyon enerjisi çok düşmekte ve reaksiyon yüksek

hızla gerçekleşmektedir. Bu üstünlükler kimyasal olarak çok karmaşık yollardan

gerçekleştirilebilen veya hiç gerçekleştirilemeyen birçok reaksiyonun enzimler

yardımıyla kolayca yürümesine olanak sağlar.

2.3. Esterler

Aroma maddeleri arasında esterler ayrı bir öneme sahiptir. Organik

bileşiklerin önemli bir sınıfını oluşturan esterler farklı yollarla sentezlenirler. Alkol

ve karboksilik asitlerin reaksiyonu sonucu (esterifikasyon); açil gruplarının esterlerle

asitler arasında (asidiolizis), esterle alkoller arasında (alkolizis) ve esterlerin kendi

aralarında (transesterifikasyon) karşılıklı değişimi sonucu meydana

gelebilmektedirler. Uzun zincirli asitlerle alkoller arasında meydana gelen

reaksiyonlar sonucu oluşan esterler gıda, deterjan, kozmetik ve farmakoloji

endüstrilerinde katkı maddesi olarak kullanılmakta, kısa zincirli asitlerle alkollerin

ürünleri ise önemli aroma maddelerini oluşturmaktadır. Fermente içeceklerde en

büyük ve en önemli aroma maddeleri grubunu uçucu esterler oluştururlar. Uçucu

esterler kendi aralarında iki grupta toplanırlar. Birinci grup asetat esterleridir. En

önemlileri etil asetat, izoamil asetat ve feniletil asetat’tır. İkinci grup esterleri ise orta

zincirli yağ asidi etil esterleri oluşturur. Etil hekzanoat, etil oktanoat ve etil dekanoat

yağ asidi etil esterlerine örnek olarak verilebilirler (Verstrepen ve ark., 2003a).

Birçok alkol asetatları ticari olarak önemli bileşikler olup bunlardan etil asetat ve


12

izoamil asetat aroma sanayinde yaygın olarak kullanılmaktadır (Şekil 2.2). Özellikle

izoamil asetat keskin muz aroması vermesi nedeniyle gıda sanayinde tüketimi

oldukça fazladır ve yıllık üretimi 74 ton civarındadır (Krishna ve ark., 2001; Güvenç

ve ark., 2002; Buzzini ve ark., 2003).

O

O

O

O

O

O

Etil asetat İzoamil asetat Feniletil asetat

O

O

O

O

İzobütil asetat Etil kaproat

Şekil 2.2. Aroma sanayinde kullanılan bazı önemli esterler (Verstrepen ve ark.,2003a).

2.3.1. Biyoteknolojik Yollarla Esterlerin Üretimi

Esterlerin doğal formları oldukça pahalı ve zor temin edilirler. Kimyasal

olarak sentezlenenler ise ucuz ama doğal olmadıkları için tercih edilmemektedir

(Vadali ve ark., 2004). Bu nedenle son dönemlerde bu aroma maddelerinin doğal

formlarının enzim ve mikroorganizmalar yardımıyla üretimi üzerine yapılan

çalışmalar artmıştır. Özellikle esterazlar ve lipazlarla üretimleri üzerine yapılmış

çalışmalar fazladır (Horton ve ark., 2003). Genellikle farklı kaynaklardan elde edilen

serbest ve immobilize lipazlarla organik çözücülerde üretimleri üzerine çalışmalar

yapılmıştır. Güvenç ve ark. (2002), Mucor miehei’ den elde ettikleri serbest lipazları

kullanarak heptan içerisinde esterifikasyonla 37˚C’de 24 saat içerisinde 26 g/L (% 80

verimle) izoamil asetat elde edildiğini ve Candida cylindraccea’dan elde edilen


13

immobilize lipazlarla hekzan içerisinde, 30˚C’ de 24 saatlik bir süre sonunda % 100

verimle (17 g/L) izoamil asetat üretiminin gerçekleştirildiğini bildirmişlerdir.

2.3.2. Esterlerin Oluşum Mekanizması

Esterler, kimyasal veya biyokimyasal yolla sentezlenirler (Şekil 2.3).

Kimyasal yol, yani alkol ve asit arasındaki basit ve kondensasyon reaksiyonu ile

oluşum oldukça yavaştır. Bu nedenle, esterler mikroorganizmalar tarafından

genellikle biyokimyasal yolla üretilir (Şekil 2.4).

- Kimyasal sentez (kondensasyon reaksiyonu):

R’-OH + R-COOH R-COO-R’ + H2O

- Biyokimyasal sentez (alkol asetiltransferaz reaksiyonu):

R’-OH + R-CO ~ SCoA R-COO-R’ + CoASH

Şekil 2.3. Esterlerin kimyasal ve biyokimyasal yolla sentezlenmesi (Mason veDufour, 2000).

Maya hücresi esterleri, alkol ve asetil koenzim A arasında meydana gelen ve

çeşitli enzimler tarafından katalizlenen reaksiyonlar sonucunda oluşturur (Peddie,

1990; Mason ve Dufour, 2000; Quilter ve ark., 2003; Verstrepen ve ark., 2003a).

Ester üretiminde etkili olan en önemli enzimler ATF1 ve ATF2 genleri ile kodlanan

alkol asetiltransferazlardır (AATaz I ve AATaz II; EC 2.3.1.84). Ester üretiminden

sorumlu olan enzimlerle esterleri hidroliz eden esterazlar arasındaki denge, oluşan

net ester miktarı açısından önemlidir. Bu yüzden, esteraz aktivitesindeki artış oluşan

ester miktarında düşüşlere neden olabilmektedir (Verstrepen ve ark., 2003a). S.

cerevisiae ile izoamil asetat ve etil asetat gibi asetat esterlerinin üretiminde alkol

asetiltransferaz, etanol asetiltransferaz ve izoamil alkol asetiltransferaz olmak üzere


14

üç farklı enzimin rol oynadığı bildirilmektedir (Peddie, 1990; Erten ve Canbaş,

2003).

Şekil 2.4. Mayalarda ester oluşumunun biyokimyası (Verstrepen ve ark., 2003a).

Mayaların esterleri neden oluşturduğu konusunda kesin bir bilgi

bulunmamaktadır. Ancak bu konuda çeşitli varsayımlar ileri sürülmüştür (Peddie,

1990; Dufour ve Malcorps, 1995). Bu varsayımlara göre;

1. Esterler, alkol fermantasyonu sırasında şekerlerin metabolizmasından ortaya

çıkan bileşikler olabilir ve hücre için önemli değillerdir,

2. Ester oluşumu asetil yükünün kontrolü açısından önemli olabilir, çünkü asetil

koenzim A ve serbest-koenzim A miktarları ara reaksiyonlar için önemlidir,

3. Ester üretimi, toksik maddeleri uzaklaştırma mekanizması ile ilgili olabilir;

özellikle C8-C14 arasındaki yağ asitleri maya için toksiktir; ester oluşumu ile bu yağ

asitlerinin maya hücresine olumsuz etkileri ortadan kaldırılır.

Fermantasyonun başlangıcında yani logaritmik çoğalma evresinde esterlerin

sentezi oldukça düşüktür. Bunun sebebi, maya gelişimi için asetil koenzim A’ya

duyulan metabolik ihtiyaçtır. Oksijen ve asetil koenzim A doymamış yağ asitlerinin

Azotmetabolizması

Yüksekalkol

Şeker ve lipidmetabolizması

Asetil koenzim A

OksijenDoymamış yağ asitleri Fermente edilebilir şeker

Azot

Ester

Ester

AATaz genleri(ATF 1, ATF 2)

Ester sintaz


15

ve sterollerin üretiminde hızla tüketilir. Daha sonra, doymamış yağ asitleri ve

sterollerin üretimi ile ester üretimi için kullanılan asetil koenzim A miktarı

dengelenir. Bu evre ester üretiminin ilk aşamasını oluşturur ve fermantasyonun ilk

sekiz saatinde gerçekleşir. Yağ asitlerinin ve sterollerin sentezi sona erdiğinde

ortamdaki asetil koenzim A miktarı (ve asetil yükü) artar ve en yüksek seviyesine

ulaşır. Kısa süren bu evre ise, ester oluşumun ikinci aşamasını oluşturur ve

fermantasyonun ortalarında (yirminci ve otuzuncu saatler arası) yani durgun evrede

görülür. Ancak, esterlerin büyük bir kısmı bu aşamada oluşturulur (Peddie, 1990).

2.3.3. Ester Oluşumunu Etkileyen Faktörler

Fermantasyon işlemlerinde esterlerin oluşumuna etki eden birçok teknolojik

parametre vardır. Bu parametreler Çizelge 2.3’te verilmiştir.

Çizelge 2.3. Fermantasyon sırasında ester oluşumunu etkileyen faktörler (Dufour veMalcorps, 1995)

Maya Karakteristiği Ortam bileşimi Fermantasyon koşulları

Maya türü Lipidler Sıcaklık

Fizyolojik durum Oksijen Basınç

Aşılama oranı Şeker içeriği Karıştırma

Kullanılabilir azot Fermentör dizaynı

Çinko Fermantasyon yöntemi

2.3.3.1. Maya cinsi

Maya ester üretimini etkileyen önemli faktörler arasındadır. Her mayanın

kendine has karakteristik ester profili vardır ve bazı esterleri diğerlerinden fazla

üretebilmektedirler (Peddie, 1990). Mayalar arasındaki ester üretim farklılıkları ise

büyük ölçüde mayalardaki AATaz aktiviteleri ile ilişkilendirilmektedir. Bu yüzden

mayalar arasındaki bu tip genetik farklılıklar ester üretiminin optimizasyonunda bir


16

kriter olarak kullanılmaktadır (Verstrepen ve ark., 2003a). Ortama aşılanan maya

miktarının artması üretilen ester miktarını azaltmaktadır. Peddie (1990), aşılanan

maya miktarının normal miktarın iki katı olması durumunda sadece etil asetat

miktarında önemsiz artışlara neden olduğunu bildirmiştir. Quilter ve ark. (2003) ise,

ortama aşılanan maya miktarında 12 g/L’lik bir artışın sadece izoamil asetat ve amil

alkol miktarlarında çok az bir artışa neden olduğunu belirlemiştir. Pichia ve

Hanseniaspora cinsine ait mayaların etil alkol, jeraniol, izoamil alkol ve 2-

feniletanol gibi alkollerin esterifikasyonunu sağlayarak meyvemsi aromaya sahip

esterleri üretirken (Mingorance-Cazorla ve ark., 2003), benzer şekilde, Williopsis,

Candida, Debaryomyces, Hanseniaspora ve Issatchenkia cinslerine ait mayaların

kullanıldığı fermantasyonlarda izoamil alkol ve izoamil asetat’ın uçucu bileşikler

arasında en yüksek konsantrasyona sahip bileşikler olduğu belirlenmiştir (Buzzini ve

ark., 2003). Kluyveromyces marxianus’un ise elma posası, melas, ayçiçeği kepeği ve

hurma kepeği gibi farklı ortamlarda fermantasyonla aroma bileşiklerini ürettiği

belirlenmiş ve üretilen bileşikler arasında en fazla etil asetat, etanol ve asetaldehite

rastlanmıştır (Medeiros ve ark., 2000). Farklı maya türleri tarafından üretilen çeşitli

esterler Çizelge 2.4’te verilmiştir.


17

Çizelge 2.4. Farklı maya türleri tarafından üretilen esterler (mg/L) (Fleet ve Heard,1993; Erten, 1997; Erten ve Campbell, 2001; Zöhre ve Erten, 2003)

Maya türleriEtil

asetat

İzobütil

asetat

Etil

bütirat

İzoamil

asetat

Etil

hekzanoat

Etil

oktanoat

S. cerevisiae 6-970 0.1-0.4 0.05-3.7 0.1-16 0.01-3.2 0.01-1.5

Kloeckera

apiculata 25-870 0.2 - 0.04-5 0.02-1 0.04-0.8

Hansenula

(Pichia*)

anomala

137-

2150 - - 1-11 - -

P. fermentans 92-554 0.04-0.8 0.04-0.4 0.5-9 0.75 1.3

P.

membranefaciens 30 - - - - -

Hansenula

(Pichia*)

subpelliculosa 21 - - - - -

Hansenula

(Williopsis*)

saturnus 385 - - 27 - -

*KURTZMAN, 1998’a göre

2.3.3.2. Ortam bileşimi

Fermantasyon ortamında bulunan lipitler ester oluşumunu etkileyen faktörler

arasında yer alır. Oleik, linoleik ve linolenik gibi doymamış yağ asitlerini fazla

miktarda içeren fermantasyon ortamlarında sentezlenen ester miktarı düşük

olmaktadır ve bu durumun birkaç nedeninin olduğu tahmin edilmektedir. Bunlar;

doymamış yağ asitlerinin hücreye alınması sırasında hücre membranının

geçirgenliğinin değişmesi, ATTaz enziminin aktivitesinde azalma ve doymamış yağ

asitlerinin hücre gelişimini teşvik ederek ortamda ester sentezi için yeterli miktarda

asetil koenzim A’nın bulunmamasına yol açmasıdır (Peddie, 1990; Dufour ve

Malcorps, 1995). Dufour ve Malcorps (1995), bira şırasına 178 μM linoleik asit


18

ilavesinden sonra oluşan etil asetat miktarında yaklaşık % 80 oranında bir düşüş

olduğunu belirlemişlerdir.

Fermantasyon ortamında bulunan toplam şeker miktarının yanında, fermente

olabilir şeker içeriği de ester oluşumunu etkiler. Genellikle yüksek glukoz ve fruktoz

içeriğine sahip ortamlarda yüksek maltoz içeren ortamlara nazaran daha fazla ester

oluşumu gözlenmiştir. Bunun sebebi henüz açığa kavuşturulmuş değildir. Fakat,

glukoz metabolizmasında yüksek seviyelerde asetil koenzim A üretiminin

gerçekleştiği ve böylece ester üretiminde artış olduğu tahmin edilmektedir. Diğer

varsayımlar ise, glukoz içeren ortamda gelişen hücrelerin daha fazla yüksek alkol

ürettikleri veya glukozun AATaz’ı kodlayan ATF1 ve ATF2 genlerini daha fazla

açığa çıkardığı doğrultusundadır (Younis ve Stewart, 1998; Verstrepen ve ark.,

2003b). Plata ve ark. (2003), farklı kaynaklardan elde edilen P. subpelliculosa,

Kluyveromyces marxianus, Torulaspora delbrueckii ve S. cerevisiae türlerine ait

mayalarla, fermente edilebilir şeker olarak 250 g/L glukoz içeren sentetik şırada

gerçekleştirilen fermantasyon denemelerinde en yüksek izoamil asetat ve etil asetat

üretiminin fermantasyonun ilk 72 saatinde gerçekleştiğini bildirmişlerdir. Ester

üretiminin fermantasyonun ilk safhasında gerçekleşmesinin muhtemel nedeni olarak

AATaz enziminin aktivitesinden kaynaklandığı ileri sürülmüştür. Diğer bir çalışmada

ise, melasta S. cerevisiae ile gerçekleştirilen fermantasyonlarda, ortam yoğunluğu

yani şeker içeriği arttıkça izoamil asetat miktarının 4.2 mg/L’den 17.4 mg/L’ye

yükseldiği belirlenmiştir (Quilter ve ark., 2003).

2.3.3.3. Sıcaklık

Sıcaklık ester oluşumunu etkileyen önemli faktörlerden biridir. Genellikle 10-

25 ºC aralığında artan ortam sıcaklığı üretilen ester miktarını arttırmıştır. 12 ºC’de

üretilen ester miktarının 10 ºC’de üretilen ester miktarından % 75 oranında daha

fazla olduğu bildirilmiştir. Aynı şekilde, ortam sıcaklığı 10 ºC’den 16 ºC’ye

çıkarıldığında üretilen ester miktarındaki artış % 40-50 olarak bulunmuştur (Peddie,

1990; Verstrepen ve ark., 2003a). Fakat mayalar, farklı ester türleri göz önüne


19

alındığında farklı sıcaklık profilleri gösterirler. Etil asetat ve 2-feniletil asetat 20

ºC’de en fazla üretilirken, izoamil asetat ve etil kaprilat 15 ºC’de en yüksek verimle

üretilmektedir. Ancak, elde edilen bu bulgular bütün mayalar için söz konusu

değildir. Ester üretimindeki bu değişim, muhtemelen farklı sıcaklıklarda değişen

AATaz aktivitesine bağlıdır (Verstrepen ve ark., 2003a). Peddie (1990) ise bu

durumu sıcaklıkla beraber hücre membranı geçirgenliğinin artması ve dolayısıyla

hücre dışına salınan ester miktarın artması olarak açıklamaktadır. Sıcaklığın artması

ile ester üretimindeki artışa, ortamda fazla miktarda oluşan yüksek alkolün neden

olabileceği de bir diğer görüştür. Yüksek sıcaklıklarda gerçekleştirilen

fermantasyonlarda ise, buharlaşmaya bağlı olarak uçucu özellikteki esterlerin

miktarlarında azalma olabilmektedir. Ancak bu olay, fermantasyon sonuna doğru

yani, ester konsantrasyonunun yüksek olduğu durumlarda söz konusu olabilmektedir

(Verstrepen ve ark., 2003a).

2.3.3.4. Havalandırma

Fermantasyon ortamında bulunan çözünmüş oksijen uçucu esterlerin

oluşumunu baskılamaktadır. Oksijen maya gelişimini ve dolayısıyla asetil koenzim

A’nın kullanılabilirliğini etkilemektedir. AATaz enzimini kodlayan ATF1 ve ATF2

genleri oksijen tarafından baskılanmakta, dolayısıyla düşen AATaz miktarı ile

paralel olarak ester üretiminde düşüşler meydana gelmektedir. Diğer taraftan, oksijen

miktarı düşük olduğu zaman (<1 mg/L) maya gelişimi yetersiz olmakta ve buna bağlı

olarak ester üretiminde azalmalar görülmektedir (Verstrepen ve ark., 2003a). Çünkü,

oksijen maya gelişimi için gerekli olan doymamış yağ asitlerinin ve sterollerin

sentezi için gereklidir. Havalandırma sonucu maya hücresi lipidlerin, proteinlerin ve

nükleik asitlerin sentezi için daha fazla asetil koenzim A’ya ihtiyaç duyar ve

dolayısıyla ortamda ester oluşumu için yeterli asetil koenzim A bulunmadığından

ester üretimi azalır (Peddie, 1990; Erten, 1997). Ester üretiminde maksimum verime

ancak belirli oksijen seviyelerinde ulaşılır (Verstrepen ve ark., 2003a). Pichia ve

Williopsis cinsine ait mayalarla düşük alkollü şarap üretimi üzerine yapılan bir


20

çalışmada, P. anomala, P. subpelliculosa ve W. saturnus türlerinin havalandırmasız

fermantasyon koşullarında yüksek miktarlarda etil asetat ürettikleri, buna karşın

havalandırmalı koşullarda üretilen etil asetat miktarının daha az olduğu

belirlenmiştir. Aynı sonuca izoamil asetat için de varılmıştır. Elde edilen bulgular

Çizelge 2.5 ve Çizelge 2.6’da verilmiştir (Erten, 1997; Erten ve Campbell, 2001). Bu

çalışmada W. saturnus türü ile elde edilen sonuçlarda, etil asetat’ın aksine izoamil

asetat üretimi karıştırmalı fermantasyonlarda statik fermantasyonlara göre daha fazla

bulunmuştur. Ester oluşumunda önemli rol oynayan asetil koenzim A farklı

fermantasyon koşullarında farklı şekillerde kullanılabilmektedir. W. saturnus izoamil

asetat sentezinde rol alan izoamil alkolü yüksek miktarlarda üretmiştir. Karıştırmalı

fermantasyon koşullarında izoamil asetat miktarının artması muhtemelen fazla

miktarda üretilen izoamil alkolden kaynaklanmaktadır. Etil asetat ve izoamil asetat

miktarları fermantasyonun belirli evrelerinde maksimuma ulaşmış ve daha sonra

düşmeye başlamıştır. Üretilen ester miktarındaki düşüşün ise, ortamda bulunan ester

sentezinden sorumlu enzimlerin ters çalışarak oluşan esterleri metabolize

etmelerinden kaynaklandığı bildirilmiştir (Dufuor ve Malcorps, 1995; Erten, 1997).

Yapılan diğer bir çalışmada ise, P. anomala türü havalandırmalı şartlarda 48

saat sonunda 4143 mg/L etil asetat ve 1.93 mg/L izoamil asetat üretirken,

havalandırmanın kısıtlı olduğu şartlarda etil asetat üretimi 668.6 mg/L ile sınırlı

kalmış, izoamil asetat ise belirlenememiştir (Rojas ve ark., 2001). Valero ve ark.

(2002), yaptıkları çalışmada şarap fermantasyonundan önce cibreyi havalandırmanın

fermantasyon sırasında yüksek alkol ve ester üretimine etkisini araştırmışlardır. Elde

edilen sonuçlara göre, fermantasyondan önce havalandırılan cibrelerden elde edilen

şaraplardaki yüksek alkol ve ester miktarı, kontrol şarabındaki yüksek alkol ve ester

miktarından daha fazla bulunmuştur.


21

Çizelge 2.5. Aerobik mayalar tarafından farklı fermantasyon koşullarında üretilenşaraplarda tespit edilen etil asetat miktarları (Erten, 1997; Erten veCampbell, 2001)

Üretilen etil asetat miktarı (mg/L)Fermantasyon

Koşulları W P 1 P 2 P 3 S

GJ 20 13 ºC S 200 656 3810 5.5 39

GJ 20 20 ºC S 183 337 3460 6.8 20

GJ 20 A 22 303 732 1 -

GJ 20 F 701 988 2400 13 28

GJ 15 F 456 1730 3600 36 13

GJ 10 F 1000 2110 3650 36 15

GJ 6 F 510 2220 3560 27 9.6

GJ 6, 10, 15, 20: % 6, 10, 15 ve 20 (w/w) şeker içeriğine sahip şıralar. F: Statik fermantasyon, S:Karıştırmalı fermantasyon, A: Havalandırmalı ve karıştırmalı fermantasyon. P1: P. subpelliculosa, P2:P. anomala, P3: P. membranaefaciens, W: W. saturnus, S: S. cerevisiae.

Çizelge 2.6. Aerobik mayalar tarafından farklı fermantasyon koşullarında üretilenşaraplarda tespit edilen izoamil asetat miktarları (Erten, 1997; Erten veCampbell, 2001)

Üretilen izoamil asetat miktarı (mg/L)Fermantasyon

Koşulları W P 1 P 2 P 3 S

GJ 20 13 ºC S 7 0.2 1.3 n.d. 0.5

GJ 20 20 ºC S 3 0.4 0.9 n.d. 0.4

GJ 20 A 0.2 0.7 0.4 n.d. -

GJ 20 F 2.7 0.1 0.5 n.d. 0.8

GJ 15 F 1.8 0.2 0.6 n.d. 0.6

GJ 10 F 3.1 0.3 0.6 n.d. 0.2

GJ 6 F 2.6 0.2 0.3 n.d. 0.1

GJ 6, 10, 15, 20: % 6, 10, 15 ve 20 (w/w) şeker içeriğine sahip şıralar. F: Statik fermantasyon, S:Karıştırmalı fermantasyon, A: Havalandırmalı ve karıştırmalı fermantasyon. P1: P. subpelliculosa, P2:P. anomala, P3: P. membranaefaciens, W: W. saturnus, S: S. cerevisiae.


22

2.3.3.5. Substrat Miktarı

Ester oluşumunda substrat olarak rol oynayan asetil koenzim A ile yüksek

alkollerin konsantrasyonları ve ester oluşumunda ve yıkımında etkili olan enzimlerin

toplam aktiviteleri ester oluşumu için çok önemlidir. Bu nedenle, substrat

konsantrasyonunu ve enzim aktivitesini etkileyen tüm faktörler ester üretimini

etkilemektedir. Sıcaklık, doymamış yağ asidi miktarı, azot ve oksijen seviyeleri

ortamdaki asetil koenzim A miktarını etkilemektedir (Verstrepen ve ark., 2003a).

Bazı araştırmacılar ortamdaki oksijenin, katı maddelerin ve lipitlerin maya gelişimini

ve dolayısıyla asetil koenzim A kullanımını arttıracağından ester üretimi için gerekli

asetil koenzim A miktarında da azalmaya yol açabileceğini bildirmişlerdir (Thurston

ve ark., 1982). Yoshioka ve Hashimoto (1984) ise, fermantasyon koşullarının asetil

koenzim A miktarı üzerinde etkili olmadığını savunmuşlardır. Ortamdaki diğer bir

sınırlayıcı faktör olan yüksek alkollerin konsantrasyonları ester üretiminde etkili

olabilmektedir. Fermantasyon ortamına 3-metil bütanol ilavesinin izoamil asetat

üretimini arttırdığı belirlenmiştir. Fakat, ester oluşumunu sadece ortamdaki yüksek

alkol miktarıyla ilişkilendirmek doğru değildir. Örneğin, yüksek oksijen ve

doymamış yağ asidi miktarları, yüksek alkol miktarını arttırırken ester üretimini

azaltmaktadır (Verstrepen ve ark., 2003a).

Mayalarda yüksek alkol üretimi ile amino asit metabolizması arasındaki ilişki

birçok çalışmaya konu olmuştur. Mayalar özellikle izoamil asetat’ı ve bazı uçucu

asetatları yüksek alkollerden üretebilmektedir. Valin, lösin ve izolösin amino asitleri

bu asetatların doğal ön bileşikleri olup mayalar tarafından sırasıyla izobütanol, 2-

metil-1-bütanol ve 3-metil-1-bütanol gibi yüksek alkollere metabolize edilmekte ve

yüksek alkoller de AATaz’lar tarafından katalizlenerek sırasıyla izobütil asetat, 2-

metilbütil asetat ve 3-metilbütil asetat üretilmektedir. (Janssens ve ark., 1989; Gent

ve Slaughter, 1994; Verstrepen ve ark., 2003a). Geotrichum klebahnii mayasının, hoş

kokulu meyve aromasına sahip dallanmış karboksilik asitlerin etil esterlerini ürettiği,

özellikle izolösin ilavesi ile etil-2-metilbütirat’ın esas ürün olarak elde edildiği;

Geotrichum fragrans mayasının ise, L-lösin’i oksidatif deaminasyon yoluyla


23

metabolize ederek etil alkol varlığında etilizovalerat ürettiği belirlenmiştir

(Vandamme ve Soetaert, 2002; Vandamme, 2003).

2.4. Biyoteknolojik Yolla Aroma Üretiminde Gıda Sanayi Artıklarının

Kullanımı

Biyoteknolojik işlemlerde önemli hususlardan biri üretimin endüstriyel

boyutta uygulanıp uygulanamayacağıdır. Endüstriyel ölçekte bir üretimin

yapılabilmesi için de göz önüne alınması gereken en önemli konu üretim

maliyetleridir. Karşılaşılan en önemli sorunlar arasında genellikle hammadde

maliyetinin yüksek oluşu, düşük ürün konsantrasyonu ve ürün saflaştırma maliyeti

gelmektedir.

Endüstriyel boyutta gerçekleştirilen fermantasyonlarda toplam üretim

maliyetinin yaklaşık % 30’unu hammadde teşkil eder (Rivas ve ark., 2004; Lee,

2005). Özellikle büyük çaplı üretimlerde kullanılacak hamaddenin çok ucuz olması

istenir. Bu tip proseslerde karbon ve azot kaynağı olarak genellikle tarım, orman ve

kimya endüstrisi yan ürünleri kullanılmaktadır (Miller ve Churchill, 1986).

Kullanılan karbon kaynakları arasında ise şeker pancarı ve şeker kamışından elde

edilen melas ilk sırayı almaktadır (Hahn-Hagerdal ve ark., 2005).

Dünyada üretilen gıdaların yaklaşık % 30’u daha tüketiciye ulaşmadan

bozulmaktadır. Gıda üretim işlemlerinde oluşan artıklar da göz önüne alındığında

büyük bir ekonomik kayıp ve çevre kirliliği tehlikesi karşımıza bir sorun olarak

çıkmaktadır. Bu artıkların yok edilmesi ise büyük maliyet gerektirmektedir (Stanbury

ve ark., 1995). Gıda artıklarının çoğunu meyve ve sebzelerin kabukları ve

çekirdekleri, hayvan ve balık artıkları, karbonhidratça zengin hububat artıkları,

tarımsal artıklar (buğday, mısır, şeker kamışı, melas, peynir altı suyu, patates v.b.) ve

fermantasyon endüstrisi artıkları oluşturmaktadır. Bu artıklar içerik bakımından

büyük bir enerji potansiyeli oluşturmaktadır (Lee, 1996). Biyoteknolojik işlemlerde

hammadde olarak kullanılan en elverişli substratlardan biri gıda artıklarıdır. Bu

nedenle, gıda artıklarının özellikle aroma maddelerinin üretimi için substrat olarak


24

kullanılması son dönemlerde yoğunluk kazanmıştır. Çizelge 2.7’de aroma

maddelerinin üretiminde kullanılan bazı gıda artıkları verilmiştir (Laufanberg ve ark.,

2003).

Çizelge 2.7. Aroma maddelerinin üretiminde kullanılan bazı gıda sanayi artıkları(Laufanberg ve ark., 2003)

SubstratAroma maddesi

(karakteristiği)Mikroorganizma

Elma posası, küspe,

havuç posası

Etil bütirat (ananas), Etil

pentaonat (elma), İzoamil

asetat (muz)

Ceratocystis fimbriata

Şeker pancarı pulpu Vanilin Pycnoporus cinnabarinus,

Aspergillus niger

Risin yağı keki γ – Dekalakton (şeftali) Yarrowia lipolytica

Pycnoporus pulmonarius

Hint yağı keki 6-Pentil-α-piron

(Hindistan cevizi)

Trichoderma harzanium

Zeytin presi keki δ – Dekalakton Ceratocystis moniliformis

Soya fasulyesi kepeği Pirazin (kızartma kokusu) Bacillus subtilis

2.4.1. Melas

Biyoteknolojik işlemlerde, özellikle ekmek mayası üretiminde substrat olarak

kullanılabilecek hammaddelerden biri, şeker pancarı ve şeker kamışından şeker

üretiminde kristalizasyon aşamasından sonra yan ürün olarak elde edilen melastır.

Diğer şekerli hammaddelerden daha ucuz olan melas koyu renkli ve kıvamlı bir

şurup olup; içeriğinde su, % 47-60 oranında toplam şeker (sakkaroz), protein,

vitamin, amino asitler, organik asitler ve demir, bakır, çinko, manganez, magnezyum,

ve kalsiyum gibi ağır metaller vardır (Canbaş, 1995; Roukas, 1998; Waites ve ark.,

2001; Kalogiannis ve ark., 2003; Göksungur ve ark., 2004). Şeker pancarından elde

edilen melasın kimyasal bileşimi Çizelge 2.8’de verilmiştir. Bileşimi yıllara ve şeker


25

fabrikalarına göre değişmektedir. Özellikle içerdiği pantotenik asit, inositol, bazı

elementler ve az miktarda biotinden dolayı fermantasyon işlemlerinde kullanımı

oldukça yaygındır (Kalogiannis ve ark., 2003). Son yıllarda, proteince zengin hayvan

yemi, enzim, amino asit, organik asit, farmakolojik ürünler ve özellikle aroma

maddeleri melasın substrat olarak kullanıldığı biyoteknolojik yöntemlerle üretilmekte

ve bu alanda yapılan çalışmalar giderek artmaktadır (Pandey ve ark., 2000).

Çizelge 2.8. Şeker pancarı melasının kimyasal bileşimi (Curtin, 1983; Keshk ve ark.,2006)

Parametre Bileşim

Briks (Toplam çözünmüş madde) (%) 80-83

İndirgen şeker (%) 0.1-2.7

Toplam şeker (%) 48-57

Toplam kurumadde (%) 73-79

Kül (%) 8-10

Kalsiyum (%) 0.2-0.5

Fosfor (%) 0.05-0.3

Potasyum (%) 3-5

Sodyum (%) 1

Sülfür (%) 0.5

Protein (%) 11-12

Özgül ağırlık 1.40

pH 5-7

Fermente edilebilir şeker kaynağı olarak kullanılan melasın fermantasyonu

sırasında, içerisinde doğal olarak bulunan amino asitlerin deaminasyonu sonucu fuzel

yağı olarak ta bilinen yüksek alkoller oluşur. Aroma endüstrisi için önemli doğal

hammaddeleri oluşturan bu yüksek alkoller arasında 2-metil-1-butanol, 3-metil-1-

butanol, 1-propanol ve feniletanol gelir. Bu yüksek alkoller kısmi distilasyonla

ayrılabildiği gibi, fermantasyon sırasında kendi asitlerine de dönüşebilmektedir.

Örnek olarak 2-metil-1-butanolun, aynı zamanda önemli bir aroma maddesi olan, 2-


26

metil-1-butirik asite dönüşümü verilebilir. Bu dönüşümler sırasında meydana gelen

ara ürünlerden biride aldehitlerdir ve bu bileşikler de yine önemli aroma maddelerini

oluştururlar. Meydana gelen asitlerin yüksek alkollerle esterifikasyonu sonucu ise

aroma aktif esterler oluşur (Gatfield ve ark., 2003).

2.4.2. Fuzel Yağı

Fermantasyonla etil alkol üretiminde damıtma işlemi son derece önemli bir

aşamadır. Damıtma işleminin sonunda elde edilen yan ürünlerden biri de, fuzel yağı

olarak da adlandırılan ve amil alkolleri fazla miktarda içeren kısımdır. Bileşiminde

yaklaşık olarak 390 g/L izoamil alkol, 158 g/L izobütil alkol, 28.4 g/L etil alkol, 16.6

g/L metil alkol, 11.9 g/L propil alkol bulunmakta ve bu bileşikler toplam ağırlığın %

77 sini oluşturmaktadır (Perez ve ark., 2001). Fuzel yağı bu zengin bileşiminden

dolayı bazı kimyasal bileşiklerin üretilmesi için kullanılabilen ve çok ucuz temin

edilebilen bir hammadde olarak değerlendirilmektedir. Mayalar özellikle izoamil

asetatı ve bazı uçucu asetatları yüksek alkollerden üretebilmektedir. Bu durumda,

ucuz bir yan ürün olan fuzel yağı izoamil asetat üretimi için önemli bir hammadde

olabilecek niteliktedir.

Ortama substrat olarak ilave edilen yüksek alkollerin W. saturnus mayası

tarafından biyodönüşüm yoluyla asetatlara dönüştürüldüğü ve 3-metilbütanol’ün en

hızlı ve en yüksek verimle esterleştirildiği belirlenmiştir. İzoamil asetat, üretilen

esterler arasında en yüksek verime (% 91) sahiptir. Üretilen ester miktarının

biyodönüşümde kullanılan karbon ve azot kaynaklarına ve ortama ilave edilen

spesifik ön bileşiklerin özelliklerine bağlı olduğu ve aynı zamanda biyodönüşümün

kontrollü şartlarda (sıcaklık ve havalandırma gibi) gerçekleştirilmesinin önemli

olduğu belirlenmiştir (Janssens ve ark., 1987; Janssens ve ark., 1989). Quilter ve ark.

(2003) tarafından S. cerevisiae ile yapılan çalışmada, melas içeren fermantasyon

ortamına fuzel yağı (% 54.5 amil alkol, % 17.8 2-metil bütanol, % 11.2 izobütanol,

% 9.6 propanol) ilavesinin ester üretimine etkisi araştırılmıştır. Ortama ilave edilen

fuzel yağının izoamil asetat üretiminde 4.4 kat artışa neden olduğu tespit edilmiştir.

3. MATERYAL ve METOT Murat YILMAZTEKİN

27

3. MATERYAL ve METOT

3.1. Materyal

3.1.1. Mayalar

İzoamil asetat üretim denemelerinde W. saturnus HUT 7087 (Japonya), W.

saturnus IAM 12217 (Japonya), W. saturnus NCYC 22 (İngiltere), etil asetat

denemelerinde P. anomala NCYC 432 (İngiltere) ve P. subpelliculosa NCYC 436

(İngiltere) mayaları kullanılmıştır. Kültür koleksiyonlarından liyofilize halde temin

edilen mayalar MEB içeren sıvı besiyerinde aktif hale getirilmiş ve MEA içeren katı

besiyerinde çoğaltılmıştır. Kültürler aynı besiyerini içeren yatık agarlarda + 4 ºC’de

muhafaza edilmiş ve her altı ayda bir yenilenmiştir.

3.1.2. Besiyerleri ve Kimyasallar

Mayaların aktif hale getirilmesinde, çoğaltılmasında ve saklanmasında MEB

(Merck) ve MEA (Merck) kullanılmıştır. Fermantasyon ortamının hazırlanmasında

kullanılan H2SO4, NaOH ve örneklerin etil alkol ve aroma maddeleri analizlerinde

kullanılan etil alkol, 1-butanol, 3-pentanol, 2-metil-1-butanol (aktif amil alkol), 3-

metil-1-butanol (izoamil alkol), izoamil asetat ve etil asetat Merck firmasından temin

edilmiştir.

3.1.3. Melas

Fermantasyon ortamı olarak kullanılan melas Özmaya A.Ş. (Ceyhan,

Adana)’dan temin edilmiştir. Denemelerde kullanılan melasın fiziksel ve kimyasal

özellikleri Çizelge 3.1’de verilmiştir.


28

Çizelge 3.1. Melasın fiziksel ve kimyasal özellikleriÖzellik Değer

Briks 80

Kurumadde % 78

Nem % 22

pH 7

İndirgen Şeker % 2

Toplam Şeker % 53

3.1.4. Fuzel Yağı

Biyodönüşüm denemelerinde kullanılan fuzel yağı Malatya Şeker

Fabrikası’ndan temin edilmiştir. Fuzel yağı 5000 devir/dakika (d/d)’da santrifüj

edilerek yabancı maddeler uzaklaştırılmış, daha sonra 0.45 µm gözenek çaplı steril

filtreden süzülmüş ve biyodönüşüm ortamına ilave edilmiştir. Kullanılan fuzel

yağının bileşimi Çizelge 3.2’de verilmiştir.

Çizelge 3.2. Biyodönüşüm denemelerinde kullanılan fuzel yağının bileşimiBileşen Miktar (g/L) Bileşim (%)

1-propanol 17.4 1.7

2-metil-1-propanol 52.5 5.3

1-butanol 1.1 0.1

2-metil-1-butanol 229.0 22.9

3-metil-1-butanol 236.9 23.7

Etil alkol - 28.7

Su - 17.6


29

3.1.5. Fermentör

Fermantasyon denemelerinde 3 litre hacimli kesikli, karıştırmalı, sıcaklık ve

havalandırma kontrollü fermentörler (BioFlo110, New Brunswick, ABD)

kullanılmıştır. Fermantasyon denemelerinde kullanılan fermentörler Resim 3.1’de

verilmiştir.

Resim 3.1. Fermantasyon denemelerinde kullanılan fermentörler.

3.2. Metot

3.2.1. Fermantasyon ve Biyodönüşümde Kullanılan Melas Çözeltisinin

Hazırlanması

Fermantasyon ve biyodönüşüm ortamı olarak kullanılan melas 10 ºBriks

olacak şekilde saf suyla seyreltilmiştir. Melasın içerisinde mayalar için toksik etki


30

yapabilecek ağır metal iyonlarının ve yabancı maddelerin uzaklaştırılması amacıyla

melas çözeltisinin pH’sı 10 N sülfürik asit kullanılarak 3’e ayarlanmış ve 24 saat

bekletilmiştir. Bekletilen melas çözeltisi kaba filtre kağıdı ile süzülmüş ve yabancı

maddeler uzaklaştırılmıştır (Çalık ve ark., 2001). Daha sonra elde edilen melas

çözeltisinin pH’sı 10 N NaOH ile 5’e ayarlanmış ve fermantasyon ve biyodönüşüm

denemelerinde kullanılmıştır.

3.2.2. Aşılama Kültürünün Hazırlanması

MEA’da geliştirilen mayalar 250 mL’lik steril erlenmayerler içerisinde

bulunan 100 mL 10 ºBriks fermantasyon ortamına aşılanmış ve daha sonra

erlenmayerler orbital karıştırıcıya yerleştirilerek 25 ºC’de, 160 d/d’da, 48 saat süreyle

çoğaltılmıştır. 48 saatlik süre sonunda erlenmayerdeki kültür sıvısı steril tüpler

içerisinde +4 ºC’de, 4000 d/d’da, 10 dk. santrifüj edilmiş ve mayalar +4 ºC’deki

steril suyla 2 defa yıkanmıştır. Maya hücrelerinin oluşturduğu pellet 5 mL steril

fermantasyon ortamına aktarılmış, mikroskop altında sayılmış ve daha sonra 1x107

hücre/mL olacak şekilde fermantasyon veya biyodönüşüm ortamına aşılanmıştır.

3.2.3. Fermantasyon Koşulları

Fermantasyon denemeleri farklı havalandırma (havalandırmalı, yarı-

havalandırmalı ve havalandırmasız) ve sıcaklık (15 ve 25 °C) koşullarında

gerçekleştirilmiştir. Fermentörlerde paralelli olarak gerçekleştirilen denemelerde her

bir fermentöre 2 L fermantasyon ortamı konulmuş, otoklavda 121 ºC’de 15 dk. steril

edilmiş ve daha sonra soğutulmuştur. Ortama çoğaltılan kültürden aşılanmış ve

karıştırma 100 d/d olacak şekilde ayarlanmıştır.


31

3.2.3.1. Havalandırmalı Fermantasyon

Havalandırmalı fermantasyon denemeleri fermentörlerde gerçekleştirilmiştir.

Havalandırma kompresör yardımıyla yapılmış ve ortama verilen steril hava miktarı

200 mL/L/dk olacak şekilde ayarlanmıştır.

3.2.3.2. Havalandırmasız Fermantasyon

Havalandırmasız fermantasyon denemeleri aynı şekilde fermentörlerde

gerçekleştirilmiştir. Fermantasyondan önce fermentörlere azot gazı verilerek

ortamdaki oksijen uzaklaştırılmıştır.

3.2.3.3. Yarı-havalandırmalı Fermantasyon

Yarı-havalandırmalı fermantasyon denemeleri orbital karıştırıcıda ağızları

steril pamukla kapatılmış erlenmayerlerde gerçekleştirilmiştir.

3.2.4. Biyodönüşüm Koşulları

Biyodönöşüm denemeleri W. saturnus HUT 7087 mayası ile fermantasyon

denemelerinde belirlenen en uygun sıcaklık ve havalandırma koşullarında

gerçekleştirilmiştir. İçerisinde 200 mL melas çözeltisi bulunan ağızları pamukla

kapatılmış 1 L’lik erlenlere 1x107 hücre/mL olacak şekilde maya kültürü

aşılanmıştır. Orbital karıştırıcıya paralelli olarak yerleştirilen 4 erlen içerisindeki

melas çözeltileri 25 °C ve 100 d/d’da mayalar durgun faza girinceye kadar fermente

edilmiş, daha sonra bir örnek tanık olarak alınmış ve diğer örneklerde ortama,

sırasıyla, % 1, % 2 ve % 3 oranlarında fuzel yağı ilave edilerek diğer koşullar aynı

kalmak şartıyla biyodönüşüm gerçekleştirilmiştir.


32

3.2.5. Fuzel Yağı Toksisitesinin Belirlenmesi

Biyodönüşüm denemelerinde kullanılacak olan fuzel yağının mayalar

üzerindeki etkisini belirlemek amacıyla maya aşılanmış melas çözeltilerine farklı

oranlarda fuzel yağı ilave edilmiştir. Fuzel yağı ilavesini takip eden her 24 saatte bir

maya sayımı yapılarak canlılık oranları belirlenmiştir.

3.2.6. Örneklerin Alınması

Fermantasyon ve biyodönüşüm süresince 24 saat aralıklarla ortamdan 25

mL’lik örnek alınmıştır. Alınan örnekten 1 mL maya sayımı için kullanılmış ve

geriye kalan kısım mayaları uzaklaştırmak amacıyla +4 ºC’de, 4000 d/d’da 10 dk.

santrifüj edilmiştir. Elde edilen süpernatant yoğunluk ve pH ölçümlerinden sonra

aroma maddelerinin analizleri için – 18 ºC’de muhafaza edilmiştir.

3.2.7. Örnekler Üzerinde Yapılan Analizler

Tüm analizler iki kez tekrarlanarak yapılmış ve sonuçlar ortalama olarak

verilmiştir.

3.2.7.1. Maya Sayımı ve Canlılık Oranı

Maya sayımı ve canlılık oranı için örnekler aseptik koşullarda alınmış ve

sayımlar metilen mavisi kullanılarak Thoma lamı ile mikroskop altında

gerçekleştirilmiştir (Anonim, 1997b).


33

3.2.7.2. Yoğunluk Tayini

Yoğunluk tayini “Mettler Toledo Densito 30PX (İsviçre)” marka dijital

yoğunluk ölçer ile 20 ºC’de gerçekleştirilmiştir. Fermantasyon ve biyodönüşüm

denemeleri yoğunluk değerindeki düşüş ile izlenmiştir (Erten, 1997).

3.2.7.3. pH

pH ölçümünde ortamdan örnek alımı sırasında fermentör kontrol panelinde

okunan pH değerleri ve örnek alındıktan sonra pH metre ile ölçülen değerler dikkate

alınmıştır.

3.2.7.4. Etil Alkol Miktarının Belirlenmesi

Etil alkol miktarı Shimadzu GC-14B (Kyoto, Japonya) marka GC-FID

kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Örnekler % 1’in altında etil alkol içerecek şekilde

saf suyla seyreltildikten sonra iç standart ilave edilerek gaz kromatografisine direkt

enjekte edilmiştir. Standart olarak % 1’lik (h/h) etil alkol (mutlak, % 99.9) ve iç

standart olarak % 1’lik (h/h) 1-butanol kullanılmıştır (Erten ve Campbell, 2001). Etil

alkol analizlerinde elde edilen örnek kromatogram Şekil 3.1’de verilmiştir. GC

koşulları aşağıdaki gibidir;

Enjeksiyon : Split (1:70)

Dedektör : FID

Kolon : CP-WAX 57-CB (Chrompack, Hollanda) 60 m uzunluk, 0.25

mm iç çap ve 0.4 µm film kalınlığında fused silika kapiler

kolon

Enjeksiyon Sıcaklığı : 180 ºC

Dedektör Sıcaklığı : 200 ºC


34

Fırın Sıcaklığı : 70 ºC izotermal

Taşıyıcı Gaz : Helyum (3 mL/dk.)

Diğer Gazlar : Kuru hava (350 mL/dk.) ve Hidrojen (35 mL/dk.)

Enjeksiyon Miktarı : 1 µL

Maddelerin Alıkonma Zamanları:

Bileşen Alıkonma Zamanı (dakika)

Etil Alkol 5.576

n-butanol (iç standart) 12.385

min0 2 4 6 8 10 12

Norm.

12.5

15

17.5

20

22.5

25

27.5

30

32.5

ADC1 A, ADC1 CHANNEL A (MURAT\04070510.D)

5.5

76 -

ETI

L A

LKO

L

12.

385

- N

-BU

TAN

OL

Şekil 3.1. Etil alkol analizlerinde elde edilen örnek kromatogram.

3.2.7.5. Aroma Maddelerinin Analizi

Örneklerdeki izoamil asetat, etil asetat, 2-metil-1-butanol ve 3-metil-1-

butanol miktarları iç standart yöntemiyle belirlenmiştir (Kelly ve ark., 1999).

Analizlerde Shimadzu GC-14B (Kyoto, Japonya) marka alev iyonlaşma dedektörlü

GC kullanılmıştır. Alıkonma zamanları standart maddelerin tek tek GC’ne enjekte

edilmesi ile belirlenmiştir. 5 farklı konsantrasyondaki kalibrasyon çözeltileri gaz

kromotografisine 3 kez tekrarlanarak enjekte edilmiş ve elde edilen piklerin alanları

temel alınarak her bir bileşik için cevap faktörü hesaplanmıştır. Aroma maddelerinin


35

miktarı cevap faktörleri kullanılarak hesaplanmıştır (Anonim, 2002). Kalibrasyon

grafiklerinin değerlendirilmesiyle elde edilen veriler Çizelge 3.3’te verilmiştir.

Çizelge 3.3. Aroma maddelerinin kalibrasyon verileri

BileşiklerKorelasyon

(R2)

Standart

Sapma

Doğrusal Kalibrasyon

Denklemi

Etil Asetat

İzoamil Asetat

2-metil-1-bütanol

3-metil-1-bütanol

0.9998

0.9997

0.9996

0.9996

0.01239

0.02343

0.03227

0.03165

y = 0.54682x+0.5433

y = 0.65432x+0.0032

y = 1.04388x+0.1238

y = 1.05023x+0.7654

İç standart olarak 58.4 mg/L konsantrasyonunda 3-pentanol kullanılmıştır.

Aroma maddelerinin analizlerinde elde edilen örnek kromatogram Şekil 3.2’de

verilmiştir. GC koşulları aşağıdaki gibidir (Erten ve Campbell, 2001);

Enjeksiyon : Split (1:50)

Dedektör : FID

Kolon : CP-WAX 57-CB (Chrompack, Hollanda) 60 m uzunluk, 0.25

mm iç çap ve 0.4 µm film kalınlığında fused silika kapiler

kolon

Enjeksiyon Sıcaklığı : 160 ºC

Dedektör Sıcaklığı : 180 ºC

Fırın Sıcaklığı : 40 ºC’de 4 dk. izotermal

40 ºC’denà 94 ºC’ye 1.8 ºC/dk. artış

94 ºC’denà 180 ºC’ye 30 ºC/dk. artış

180 ºC’de 4 dk. izotermal

Taşıyıcı Gaz : Helyum (1.3 mL/dk.)

Diğer Gazlar : Kuru hava (350 mL/dk.) ve Hidrojen (35 mL/dk.)

Enjeksiyon Miktarı : 1 µL


36

Maddelerin Alıkonma Zamanları:

Bileşen Alıkonma Zamanı (dakika)

Etil Asetat 9.174

İzoamil Asetat 22.028

3-pentanol (iç standart) 22.471

2-metil-1-butanol 29.807

3-metil-1-butanol 30.003

min5 10 15 20 25 30

mAU

11

11.2

11.4

11.6

11.8

12

12.2

12.4

12.6

ADC1 A, ADC1 CHANNEL A (MURAT\15060502.D)

9.1

74 -

ETI

L AS

ETAT

22.

028

- IZ

OA

MIL

ASE

TAT

22.

471

- 3-

PEN

TANO

L

29.

807

- 2-

MET

IL-1

-BU

TAN

OL

30.

003

- 3-

MET

IL-1

-BUT

ANO

L

Şekil 3.2. Aroma maddelerinin analizlerinde elde edilen örnek kromatogram.

3.2.7.5.(1). Cevap Faktörünün Hesaplanması

Her bir aroma maddesi için cevap faktörü aşağıdaki formül yardımıyla

hesaplanmıştır (Anonim, 2002).

RF= (Ast / Ai) x (Ci / Cst)

Ci : Bileşiğin konsantrasyonu (mg/L)

Ai : Bileşiğin pik alanı

Ast : İç standardın pik alanı

Cst : İç standardın konsantrasyonu (mg/L)

RF : Cevap faktörü.


37

3.2.7.5.(2). Miktar Tayini

Örneklerdeki aroma maddelerinin konsantrasyonları aşağıdaki formül

yardımıyla hesaplanmış, sonuçlar mg/L cinsinden verilmiştir (Kelly ve ark., 1999).

Ci = (Ai / Ast) x Cst x RF

3.2.8. İstatistiksel Değerlendirme

İki kez tekrarlanarak yürütülen denemelerden elde edilen sonuçlar SPSS 10.0

(Özdamar, 1999) istatistik yazılım programı kullanılarak değerlendirilmiştir.

Faktörlerin etkisini belirlemek amacıyla elde edilen araştırma bulguları tek yönlü

varyans analizine tabi tutulmuştur. Önemli çıkan gruplar arasındaki farklılıklar

Duncan çoklu karşılaştırma testi ile % 5 önem düzeyinde belirlenmiştir. İkili

karşılaştırmalarda ise Student-t testi kullanılmıştır.

4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN

38

4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA

4.1. İzoamil Asetat Üretimi

4.1.1. FarklıW. saturnus Mayaları ile İzoamil Asetat Üretimi

Farklı kültür koleksiyonlarından temin edilen W. saturnus HUT 7087

(Japonya), W. saturnus IAM 12217 (Japonya) ve W. saturnus NCYC 22 (İngiltere)

mayaları ile melas ortamında fermantasyon denemeleri kurulmuş ve en iyi izoamil

asetat üreten maya belirlenmiştir. Fermantasyon denemelerinden elde edilen sonuçlar

aşağıda verilmiştir.

4.1.1.1. Maya Gelişimi ve Canlılık Oranı

Maya gelişimi, canlı maya sayısı ve canlılık oranı ile izlenmiştir.

Fermantasyon süresince canlılık oranı bütün maya ırkları için % 100 bulunmuştur.

Maya gelişim grafiği Şekil 4.1’de verilmiştir. W. saturnus HUT 7087 ve W. saturnus

NCYC 22 mayaları durgun faza 48. saatte sırasıyla 9.7x107 hücre/mL ve 9.0x107

hücre/mL canlı maya sayısı ile girerken, W. saturnus IAM 12217 mayası yine 48.

saatte 5.1x107 hücre/mL canlı maya sayısı ile girmiştir. Fermantasyon sonunda ise

canlı maya sayıları W. saturnus HUT 7087, W. saturnus IAM 12217 ve W. saturnus

NCYC 22 mayaları için sırasıyla 5.8x107, 3.7x107 ve 5.5x107 hücre/mL olarak

saptanmıştır.


39

0

2

4

6

8

10

12

0 12 36 72 108 132 156 180 204 228

Fermantasyon süresi (saat)

Canlı m

aya

sayısı

(x10

7 hüc

re/m

L)HUT 7087 IAM 12217 NCYC 22

Şekil 4.1. W. saturnus mayalarının gelişimi.

4.1.1.2. Fermantasyonun Gidişi

Fermantasyonun gidişi yoğunluk düşüşü ile takip edilmiştir ve yoğunluk

değerlerindeki düşüşler Şekil 4.2’de verilmiştir. Fermantasyon sonunda yoğunluk

değerleri tüm maya ırkları için 1.014 g/cm3 değerine kadar düşmüştür.

Fermantasyonlar son 36 saat yoğunlukta değişme olmayınca sonlandırılmıştır. W.

saturnus HUT 7087, W. saturnus IAM 12217 ve W. saturnus NCYC 22 mayaları ile

gerçekleştirilen fermantasyonlar sırasıyla 228., 192. ve 204. saatlerde son bulmuştur.


40

1.000

1.010

1.020

1.030

1.040

1.050

0 12 36 72 108 132 156 180 204 228

Fermantayon süresi (saat)

Yoğu

nluk

(g/c

m3 )

HUT 7087 IAM 12217 NCYC 22

Şekil 4.2. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlara ait yoğunlukdeğerleri.

4.1.1.3. pH

Fermantasyonlar süresince pH’da meydana gelen değişimler Şekil 4.3’te

verilmiştir. W. saturnus HUT 7087 mayası ile gerçekleştirilen fermantasyon

denemesinde pH 4.84’e kadar düşmüş ve fermantasyon sonunda 4.90 olarak

belirlenmiştir. W. saturnus NCYC 22 mayası ile yürütülen fermantasyon denmesinde

benzer şekilde 4.83 değerine kadar düşmüş ve fermantasyon sonunda bu değer 5.01

olarak saptanmıştır. W. saturnus IAM 12217 mayası ile yürütülen fermantasyon

denemesinde ise pH diğer denemelerin aksine fermantasyon süresince düşmeye

devam etmiş ve fermantasyon sonunda 4.80 olarak belirlenmiştir.

Mayalar genellikle asidofilik mikroorganizmalar olarak kabul edilirler ve

asidik ortamlarda daha iyi gelişirler. Mayaların gelişimi için en uygun pH aralığı 4-6

arasında olup, optimum pH 4.5 civarındadır ki bu ortam sıcaklığına, ortamda bulunan

oksijene ve maya cinsine göre değişebilmektedir. Fermantasyon başlangıcında maya

gelişimi ile birlikte fermantasyon ortamının pH’sında genellikle bir düşüş gözlenir.


41

pH’daki bu düşüşün farklı bir kaç mekanizma sonucu oluşabileceği tahmin

edilmektedir. Fermantasyon sırasında ortamda H+ iyonları ve CO2 oluşması ve daha

sonra oluşan CO2 su ile reaksiyona girerek daha fazla H+ iyonları oluşturarak ortamın

pH’sını düşürmesi bunlardan biridir. Maya hücresi fermantasyon sırasında hücre

içerisinde meydana gelen biyokimyasal olayları devam ettirebilmek için hücre içi

pH’sını içeriye veya dışarıya H+ iyonu pompalayarak optimum bir değerde tutmaya

çalışır (Chang, 2000).

4.600

4.700

4.800

4.900

5.000

5.100

0 12 36 72 108 132 156 180 204 228


pH

HUT 7087 IAM 12217 NCYC 22

Şekil 4.3. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlara ait pH değerleri.

4.1.1.4. Etil Alkol Üretimi

Şekil 4.4’te W. saturnus HUT 7087, W. saturnus IAM 12217 ve W. saturnus

NCYC 22 mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyon denemeleri süresince etil alkol

üretimindeki değişim verilmiştir. Bütün maya ırklarıyla yürütülen fermantasyon

denemelerinde üretilen etil alkol miktarı fermantasyon sonuna kadar sürekli artış

göstermiştir. En yüksek etil alkol üretimi hacim olarak % 3.3 ile W. saturnus HUT


42

7087 mayası ile gerçekleşmiştir. Fermantasyon sonunda belirlenen etil alkol

miktarları ise W. saturnus HUT 7087, W. saturnus IAM 12217 ve W. saturnus

NCYC 22 mayaları için sırasıyla hacim olarak % 3.3, 3.2 ve 3.0 olarak tespit

edilmiştir. Mayalar etil alkolü hücre içerisinde metabolik yolla üretilen asetaldehitten

oluşturur. Asetaldehidin etil alkole dönüşümü sırasında reaksiyon alkol dehidrogenaz

enzimi tarafından katalizlenir. Etil alkol hücre içerisinde sentezlenmeye başladıktan

sonra hücre membranından ortama geçer ve ortamda biriken etil alkol, glukoz

azaldığı zaman karbon kaynağı olarak CO2’in ve suyun glioksilat yolu ile

oksidasyonu için kullanılabilmektedir (Fredlund, 2004).

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

0 24 48 72 96 120 144 168 192 204 228


Etil

alk

ol (%

, h/h

)

HUT 7087 IAM 12217 NCYC 22

Şekil 4.4. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlardaki etil alkolüretimi.

4.1.1.5. 2-Metil-1-butanol ve 3-Metil-1-butanol Üretimi

W. saturnus HUT 7087, W. saturnus IAM 12217 ve W. saturnus NCYC 22

mayaları ile fermantasyonlar süresince üretilen 2-metil-1-butanol ve 3-metil-1-

butanol’ün miktarlarındaki değişimler, sırasıyla, Şekil 4.5 ve 4.6’da verilmiştir.

Kullanılan bütün maya ırklarında fermantasyon süresince üretilen 2-metil-1-butanol


43

ve 3-metil-1-butanol miktarları sürekli bir artış göstermiştir. Fermantasyon sonunda

ortamda bulunan 2-metil-1-butanol miktarı W. saturnus HUT 7087, W. saturnus IAM

12217 ve W. saturnus NCYC 22 mayaları için sırasıyla 24.7, 22.4 ve 21.7 mg/L’dır.

3-Metil-1-butanol için belirlenen miktar ise yine, sırasıyla, 24.3, 19.6 ve 22.2

mg/L’dir.

0

5

10

15

20

25

30

0 12 36 72 108 132 156 180 204 228


2-M

etil-

1-bu

tano

l (m

g/L)

HUT 7087 IAM 12217 NCYC 22

Şekil 4.5. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlardaki 2-metil-1-butanol üretimi.


44

0

5

10

15

20

25

30

0 12 36 72 108 132 156 180 204 228


3-M

etil-

1-bu

tano

l (m

g/L)

HUT 7087 IAM 12217 NCYC 22

Şekil 4.6. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlardaki 3-metil-1-butanol üretimi.

4.1.1.6. İzoamil Asetat/Amil Alkol Oranı


mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyon denemelerinde saptanan izoamil

asetat/amil alkol oranları Çizelge 4.1’de verilmiştir.

Çizelge 4.1. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlarda izoamilasetat/amil alkol oranı

Maya ırkı İzoamil asetat/amil alkol oranıx

HUT 7087 4.66ay±0.029

IAM 12217 1.48b±0.099

NCYC 22 4.46a±0.019

Önem düzeyi *x: İzoamil asetat/amil alkol oranı denemeler sırasında en yüksek izoamil asetat miktarına ulaşılansaatlerde hesaplanmıştır. y: Aynı sütunda değişik harflerle gösterilen değerler arasındaki farkistatistiksel olarak önemlidir (p<0.05). *: p<0.05, HUT 7087: W. saturnus HUT 7087; IAM 12217:W. saturnus IAM 12217; NCYC 22: W. saturnus NCYC 22


45

Ester/yüksek alkol oranı fermente içkilerde duyusal özellikler üzerinde etkili

bir parametre olarak görülmektedir. Üretilen ester miktarının yüksek ve yüksek alkol

miktarının düşük olduğu durumlarda hoşa giden meyve aromalarının daha çok

hissedildiği belirtilmiştir (Iwase, 1995; Valero ve ark., 2002). Kullanılan maya ırkları

arasında izoamil asetat/amil alkol oranları açısından W. saturnus HUT 7087 ve W.

saturnus NCYC 22 mayaları arasında istatistiksel açıdan fark bulunmazken (p>0.05),

W. saturnus IAM 12217 mayası ile diğer iki maya arasındaki fark önemli

bulunmuştur (p<0.05). Inoue ve ark. (1997), Hansenula mrakii ve S. cerevisiae

kültürlerinde izoamil asetat/izoamil alkol oranını sırasıyla 1.33 ve 0.0054 olarak

bulmuşlardır. Farklı W. saturnus ırkları ile gerçekleştirilen bu araştırmada ise en

yüksek izoamil asetat/amil alkol oranı 4.66 ile W. saturnus HUT 7087 mayası ile

gerçekleştirilen fermantasyon denemesinde saptanmıştır.

4.1.1.7. İzoamil Asetat Üretimi


mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyon denemeleri süresince izoamil asetat

üretimindeki değişim Şekil 4.7’de, bu mayalar tarafından üretilen izoamil asetat

miktarları ve üretim hızları ise Çizelge 4.2’de verilmiştir.


46

0

5

10

15

20

25

0 12 36 72 108 132 156 180 204 228


İzoa

mil

aset

at (m

g/L)

HUT 7087 IAM 12217 NCYC 22

Şekil 4.7. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlardaki izoamilasetat üretimi.

Çizelge 4.2. W. saturnus mayaları tarafından üretilen izoamil asetat miktarları veüretim hızları

Maya Irkıİzoamil asetat miktarı

(mg/L)

İzoamil asetat üretim hızıx

(mg/L/saat)

HUT 7087 20.71±0.27 0.157ay±0.0020

IAM 12217 19.55±0.35 0.146a±0.0027

NCYC 22 18.75±0.78 0.130b±0.0054

Önem düzeyi ö.d. *x: İzoamil asetat üretim hızları denemeler sırasında en yüksek değere ulaşılan saatlerdehesaplanmıştır. y: Aynı sütunda değişik harflerle gösterilen değerler arasındaki fark istatistikselolarak önemlidir (p<0.05). *: p<0.05, ö.d.: önemli değil, HUT 7087: W. saturnus HUT 7087; IAM12217: W. saturnus IAM 12217; NCYC 22: W. saturnus NCYC 22

Denemelerde kullanılan maya ırkları arasında izoamil asetat üretim miktarı

bakımından istatistiksel olarak fark bulunmazken (p>0.05), izoamil asetat üretim

hızları açısından önemli farklılık gözlenmiştir (p<0.05). Yapılan Duncan çoklu

karşılaştırma testine göre izoamil asetat üretim hızları açısından W. saturnus HUT

7087 ve W. saturnus IAM 12217 mayaları arasındaki farklılık önemsiz bulunurken,


47

bu mayalar ile W. saturnus NCYC 22 mayası arasındaki farklılık önemli

bulunmuştur (p<0.05). Ancak, W. saturnus HUT 7087 mayasının izoamil asetat

üretim hızı diğer mayalardan yüksek olduğu için araştırmanın ileri safhalarında bu

maya ırkı kullanılmıştır.

4.1.2. W. saturnus HUT 7087 Mayası Kullanılarak Fermantasyon Yoluyla

İzoamil Asetat Üretimi

W. saturnus HUT 7087 ile izoamil asetat üretiminde sıcaklığın ve

havalandırmanın etkisini araştırmak amacıyla melas kullanılarak önce

havalandırmasız ortamda, 15 ºC ve 25 ºC’de fermantasyon denemeleri kurulmuştur.

Havalandırmanın etkisini araştırmak amacıyla ise yine melas ortamında ve belirlenen

en uygun sıcaklıkta, havalandırmalı (200 mL/L/dakika), havalandırmasız ve yarı

havalandırmalı ortamlarda fermantasyon denemeleri gerçekleştirilmiştir.

Havalandırmalı ve havalandırmasız fermantasyon denemeleri havanın kontrollü

olarak verildiği fermentörlerde gerçekleştirilirken, yarı havalandırmalı fermantasyon

denemeleri orbital karıştırıcıda erlenmayerler içerisinde gerçekleştirilmiştir. Bu

denemelerden elde edilen bulgular aşağıda verilmiştir.


İzoamil Asetat Üretiminde Sıcaklığın Etkisi

4.1.2.1.(1). Maya Gelişimi ve Canlılık Oranı

W. saturnus HUT 7087 ile izoamil asetat üretiminde fermantasyon süresince

her iki sıcaklıkta da canlılık oranı % 100 bulunmuştur ve maya gelişimi Şekil 4.8’de

verilmiştir.


48

0

2

4

6

8

10

12

0 36 72 108 144 180 216 264 300 372 444 516


Can

lı m

aya

sayısı

(x10

7 hüc

re/m

L)15 °C 25 °C

Şekil 4.8. W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı sıcaklıklarda yürütülenfermantasyonlardaki canlı maya sayısı.

25 ºC’de yürütülen fermantasyon denemesinde mayalar logaritmik çoğalma

evresini 15 ºC’de yürütülen fermantasyon denemesine nazaran daha hızlı ve daha

fazla sayıda maya ile tamamlamıştır. 25 ºC’de gerçekleştirilen denemede durgun faza

48. saatte girilirken, 15 ºC’de 84. saatte girilmiştir. 25 ºC’de gerçekleştirilen

fermantasyonda maya sayısı 72. saatte 1.1x108 hücre/mL ile en yüksek değerine

ulaşmıştır. 15 ºC’de yürütülen fermantasyonda ise maya sayısı fermantasyonun 180.

saatinde 7.2x107 hücre/mL ile en yüksek değere ulaşmıştır. Fermantasyon sonunda

ise maya sayısı 25 ºC’de ve 15 ºC’de, sırasıyla, 5.6x107 ve 5.1x107 hücre/mL

bulunmuştur. Alkol fermantasyonunda maya popülasyonunu ve mayalar tarafından

gerçekleştirilen biyokimyasal olayları etkileyen en önemli faktörlerden biri de

sıcaklıktır (Fleet ve Heard, 1993). Literatürde alkol fermantasyonu sırasında

sıcaklığın S. cerevisiae (Epifanio ve ark., 1999) ve farklı mayaların (Sharf ve

Margalith, 1983; Heard ve Fleet, 1988; Mateo ve ark., 1991) gelişimleri üzerine

etkisini konu alan farklı çalışmalar yapılmıştır. 20 ve 30 ºC’de gerçekleştirilen

fermantasyonlarda, genellikle kısa lag, logaritmik, durgun ve ölüm evrelerini içeren


49

alışılmış mikroorganizma gelişme eğrisi gözlenirken, 35 ºC gibi yüksek sıcaklıklarda

büyük miktarda maya canlı kalmamaktadır (Torija ve ark., 2003). Literatürdeki diğer

bulgular da sıcaklıktaki artışla beraber maya canlılık oranında düşüşlerin meydana

geldiğini bildirmektedir (Ough, 1966; Nagodawithana ve ark, 1974; Casey ve ark.,

1984). Erten (1997) yaptığı çalışmada, W. saturnus mayasının 20 ºC’de 13 ºC’den

1.2 kat daha fazla geliştiğini bildirmiştir. Torija ve ark. (2003) tarafından yapılan

araştırmada ise, 15 ºC’de ulaşılan maksimum maya sayısı 1.2x108 hücre/mL

bulunurken, 25 ºC’de bu değer 1.7x108 hücre/mL olarak saptanmıştır. Casellas

(2005), 25 ºC’de maya gelişiminin ve fermantasyon hızının 13 ºC’den daha yüksek

olduğunu bildirmiştir.

4.1.2.1.(2). Fermantasyonun Gidişi

Fermantasyonun gidişi yoğunluk düşüşü ile izlenmiştir. Yoğunluk değerindeki

düşüşler Şekil 4.9’da verilmiştir.

1.000

1.010

1.020

1.030

1.040

1.050

0 36 72 108 144 180 216 264 300 372 444 516


Yoğ

unlu

k (g

/cm

3 )

15 °C 25 °C

Şekil 4.9. W. saturnus HUT 7087 maya ile farklı sıcaklıklarda yürütülenfermantasyonlardaki yoğunluk değişimi.


50

25 ºC’de gerçekleştirilen fermantasyon denemesi 210 saatte tamamlanırken,

15 ºC’de gerçekleştirilen fermantasyon denemesi ise 540 saatte tamamlanmıştır. 15

ºC’de yürütülen fermantasyonda yoğunluk değerindeki düşüş, 25 ºC’de

gerçekleştirilen fermantasyondan daha yavaş ve daha az olmuştur. Fermantasyon

sonunda 25 ºC’de yürütülen denemede yoğunluk 1.040 g/cm3’ten 1.016 g/cm3’e

düşmüştür. 15 ºC’de gerçekleştirilen fermantasyon sonunda ise yoğunluk 1.022

g/cm3 değerine kadar düşmüştür. Fermantasyon sıcaklığındaki düşüşe paralel olarak

ortamdaki fermente edilebilir şekerlerin tüketim hızında da düşüşler yaşanmıştır. Her

iki sıcaklıkta yürütülen fermantasyonda ortamda mayalar tarafından tüketilemeyen

şeker kalmış, ancak 15 ºC’de fermente edilemeyen şeker miktarı daha fazla olmuştur.

Sıcaklık maya gelişimi ve fermantasyon hızı üzerine etkilidir. Düşük sıcaklıklarda

gerçekleştirilen fermantasyonlarda fermantasyon hızı düşük, fermantasyon süresi ise

uzundur (Fleet ve Heard, 1993; Ribereau-Gayon ve ark., 2000).

4.1.2.1.(3). pH

Fermantasyon süresince pH değişimi Şekil 4.10’da verilmiştir.

4.6

4.7

4.8

4.9

5.0

5.1

5.2

0 36 72 108 144 180 216 264 300 372 444 516


pH

15 °C 25 °C

Şekil 4.10. W. saturnus HUT 7087 maya ile farklı sıcaklıklarda yürütülenfermantasyonlardaki pH değişimi.


51

25 ºC’de gerçekleştirilen fermantasyon denemesinde pH logaritmik fazda

hızlı bir düşüş ile 4.81 değerine gerilerken, 15 ºC’de gerçekleştirilen denemede pH 5

civarında bulunmuştur. 25 ºC’de gerçekleştirilen denemede pH durgun fazda tekrar

yükselmeye başlamış ve fermantasyon sonunda 4.85 değerine ulaşmıştır. 15 ºC’de

yürütülen denemede ise pH 5.15 olarak ölçülmüştür. Benzer sonuçlar Janssens ve

ark. (1987) tarafından da bulunmuştur. Fermantasyon başlangıcında pH, ortamda

oluşan yağ asitleri, amino asitler ve organik asitlerden dolayı düşmektedir. Oluşan bu

asitler daha sonra maya tarafından metabolik olaylarda kullanılmakta, dolayısıyla

miktarları azaldığından ortam pH’sı tekrar yükselmektedir (Boulton ve Quain, 2001).

4.1.2.1.(4). Etil Alkol Üretimi

Fermantasyon süresince oluşan etil alkol miktarı Şekil 4.11’de verilmiştir.

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

0 72 120 168 216 252 300 348 396 444 492 540


Etil

alko

l (%

, h/h

)

15 °C 25 °C

Şekil 4.11. W. saturnus HUT 7087 maya ile farklı sıcaklıklarda yürütülenfermantasyonlarda etil alkol üretimi.


52

Fermantasyon süresince hacim olarak % 3.2 ile en fazla etil alkol 25 ºC’de

üretilirken, 15 ºC’de gerçekleştirilen denemede bu değer % 2.8 bulunmuştur. 25

ºC’de etil alkol miktarı fermantasyonun sonunda % 3.2, 15 ºC’de ise en yüksek etil

alkol miktarı fermantasyonun 444. saatinde hacim olarak % 2.8 bulunmuş ve bu

değer fermantasyon sonunda % 2.3’e düşmüştür. Etil alkol üretimini etkileyen

önemli faktörlerden biri maya cinsidir. Saccharomyces cinsi mayalar ile

karşılaştırıldığında Pichia, Williopsis gibi aerobik mayalar düşük alkol üretme

yeteneğine sahiptir (Erten, 1997). Bunun yanında, maya gelişimini etkileyen tüm

faktörler aynı zamanda etil alkol üretimini de etkilemektedir. Sıcaklığın maya

gelişiminde çok önemli bir etken olduğu, dolayısıyla etil alkol üretimini de etkilediği

belirtilmiştir. Genel görüşe göre, sıcaklıktaki artış fermantasyon hızında da artışı

beraberinde getirmekte, ancak etil alkol veriminde düşüşe yol açmaktadır (Ribereau

Gayon ve ark., 1975; Llaurado ve ark., 2002; Torija ve ark., 2003). Ancak, farklı

sıcaklıklarda üretilen etil alkol miktarı maya cinsi ile yakından ilgilidir. Heard ve

Fleet’e (1988) göre, üzüm suyunda 10 ve 25 ºC’de Candida stelleta, sırasıyla,

hacimce % 6.1 ve 6.3, Candida krusei % 6.6 ve 6.3, Candida pulcherrima % 4 ve

2.5, Hansenula anomala % 3.5 ve 4.3 ve S. cerevisiae % 9.5 ve 13.9 etil alkol

üretirken, Klockera apiculata her iki sıcaklıkta hacimce % 2.7 etil alkol üretmiştir.

4.1.2.1.(5). 2-Metil-1-butanol ve 3-Metil-1-butanol Üretimi

Fermantasyon süresince 15 ºC’de ve 25 ºC’de üretilen 2-metil-1-butanol ve 3-

metil-1-butanol’ün miktarlarındaki değişim, sırasıyla, Şekil 4.12 ve Şekil 4.13’te

verilmiştir. Her iki sıcaklıkta amil alkol miktarları fermantasyon sonunda kadar

artmıştır. 25 ºC’de gerçekleştirilen denemede en yüksek 2-metil-1-butanol ve 3-

metil-1-butanol değerleri fermantasyonun sonunda, sırasıyla, 24.8 ve 24.9 mg/L

olarak tespit edilmiştir. 15 ºC’de ise en yüksek 2-metil-1-butanol ve 3-metil-1-

butanol miktarları yine fermantasyonun 444. saatinde, sırasıyla, 19.2 ve 12.4 mg/L

değerleriyle elde edilmiş ve fermantasyonun sonunda 15.9 ve 11.1 mg/L değerlerine

düşmüştür.


53

0

5

10

15

20

25

30

0 36 72 108 144 180 216 264 300 372 444 516


2-M

etil-

1-bu

tano

l (m

g/L)

15 °C 25 °C

Şekil 4.12. W. saturnus HUT 7087 maya ile farklı sıcaklıklarda yürütülenfermantasyonlarda 2-metil-1-butanol üretimi.

0

5

10

15

20

25

30

0 36 72 108 144 180 216 264 300 372 444 516


3-M

etil-

1-bu

tano

l (m

g/L)

15 °C 25 °C

Şekil 4.13. W. saturnus HUT 7087 maya ile farklı sıcaklıklarda yürütülenfermantasyonlarda 3-metil-1-butanol üretimi.


54

Yüksek alkoller fermantasyon sırasında iki farklı metabolik yolla sentezlenirler.

Birincisi, ortamdaki karbohidratların kullanıldığı pirüvat yolu (anabolik yol), ikincisi

ise amino asit asimilasyonu (katabolik veya Ehrlich yolu)’dur (Ouchi ve ark., 1980;

Berry, 1995; Oshita ve ark., 1995). Her iki yolda da ön bileşik olarak 2-okso (α-keto)

asitler oluşur. Bu asitler bir aldehit oluşturmak üzere dekarboksile edilir ve daha

sonra ilgili alkollere indirgenirler. Anabolik yolda 2-okso asit, amino asit sentezinde

kullanılan biyokimyasal yollarda pirüvattan veya asetil-CoA’dan elde edilir.

Katabolik yolda ise, 2-okso asit bir amino asidin transaminasyonu ile oluşur (Boulton

ve Quain, 2001). Ancak, mayalarda yüksek alkollerin üretiminde daha çok Ehrlich

yolunun kullanıldığı ileri sürülmektedir (Erten, 1997). Fermantasyon sırasında

yüksek alkollerin oluşumunu kontrol eden üç etken vardır. Bunlar maya cinsi,

fermantasyon ortamının bileşimi (özellikle azot miktarı) ve sıcaklık, havalandırma

gibi fermantasyon koşullarıdır. Maya cinsi yüksek alkollerin üretiminde en önemli

faktör olarak göze çarparken, maya gelişimini teşvik eden havalandırma, ortamdaki

doymamış yağ asidi ve steroller de yüksek alkol üretimini arttırmaktadır. Yüksek

sıcaklıklarda yürütülen fermantasyonlarda maya gelişiminde düşük sıcaklıklara

nazaran artış gözlendiği ve buna paralel olarak sıcaklığın yüksek alkollerin

miktarında da artışa neden olduğu belirtilmektedir (Hammond, 1993; Boulton ve

Quain, 2001). Landaud ve ark. (2001), 16 ºC’de 10 ºC’ye nazaran iki kat fazla

yüksek alkol üretildiğini bildirmişlerdir. Araştırmacılara göre, fermantasyon

sıcaklığındaki artış ortamdaki amino asit ve şekerlerin kullanımını teşvik etmekte ve

dolayısıyla bu besin maddelerinin metabolizması sonucu oluşan yüksek alkollerin

miktarında da artışlar gözlenmektedir. Ough ve Amerine (1967), 2-metil-1-butanol

ve 3-metil-1-butanol’ün daha çok 21-27 ºC arasında oluştuğunu, Calderbank ve

Hammond (1994) ise sıcaklıktaki artışa paralel olarak oluşan izoamil alkol

miktarında da artışlar meydana geldiğini bildirmişlerdir. Bu çalışmada da sıcaklıktaki

artışa paralel olarak 2-metil-1-butanol ve 3-metil-1-butanol miktarlarında da artışlar

gözlenmiştir.


55

4.1.2.1.(6). İzoamil Asetat Üretimi

Fermantasyon süresince üretilen izoamil asetat miktarındaki değişim Şekil

4.14’te, üretilen izoamil asetat miktarları ve izoamil asetat üretim hızları ise Çizelge

4.3’te verilmiştir.

0

5

10

15

20

25

30

35

0 36 72 108 144 180 216 264 300 372 444 516


İzoa

mil

aset

at (m

g/L)

15 °C 25 °C

Şekil 4.14. W. saturnus HUT 7087 maya ile farklı sıcaklıklarda yürütülenfermantasyonlarda izoamil asetat üretimi.

Çizelge 4.3. Farklı sıcaklıklarda W. saturnus HUT 7087 tarafından üretilen izoamilasetat miktarları ve üretim hızları

Sıcaklıkİzoamil asetat miktarı

(mg/L)


(mg/L/saat)

15 °C 29.43±0.10 0.136±0.0005

25 °C 20.72±0.02 0.432±0.0004

Önem düzeyi *** ***x: İzoamil asetat üretim hızları denemeler sırasında en yüksek değere ulaşılan saatlerdehesaplanmıştır. ***: p<0.001.


56

Üretilen izoamil asetat miktarları ve izoamil asetat üretim hızları bakımından

25 ºC’de gerçekleştirilen fermantasyon denemesi ile 15 ºC’de gerçekleştirilen

fermantasyon denemesi arasındaki farklılık istatistiksel olarak önemli bulunmuştur

(p<0.001). 25 ºC’de üretilen izoamil asetat miktarı fermantasyonun 48. saatinde 20.7

mg/L ile en yüksek seviyesine ulaşırken, 15 ºC’de üretilen izoamil asetat miktarı ise

fermantasyonun 216. saatinde 29.4 mg/L ile en yüksek seviyesine ulaşmıştır. 15

ºC’de üretilen izoamil asetat miktarı 25 ºC’de üretilen izoamil asetat miktarından

fazla bulunurken, izoamil asetat üretim hızlarında aksine bir durum söz konusudur.

Calderbank ve Hammond (1994), artan sıcaklığa paralel olarak ester üretim hızında

da artış olduğunu bildirmişlerdir. Fermantasyon sonunda üretilen izoamil asetat

miktarları 25 ºC ve 15 ºC için, sırasıyla, 14 ve 20 mg/L’dir. Üretim verimliliği

açısından birim zamanda üretilen izoamil asetat miktarı yani üretim hızı göz önüne

alındığında, 25 ºC’de daha fazla izoamil asetat üretilmiştir.

Fermantasyon sırasında mayalar tarafından üretilen ester miktarı başta maya

cinsi olmak üzere, ester oluşumu için gerekli substratların (asetil koenzim A ve

yüksek alkoller) konsantrasyonuna ve ester oluşumunda ve yıkımında rol alan

enzimlerin toplam aktivitelerine bağlıdır. Dolayısıyla substrat konsantrasyonunu ve

enzim aktivitesini etkileyen tüm faktörler ester oluşumunu etkilemektedir (Peddie,

1990; Hammond, 1993; Boulton ve Quain, 2001; Verstrepen ve ark., 2003a;

Verstrepen ve ark., 2003b; Dufour ve ark., 2003). Genellikle, 10-25 ºC arasında

sıcaklık artışına paralel olarak oluşan ester miktarı da artmaktadır. Bazı çalışmalarda,

12 ºC’de 10 ºC’den % 75 daha fazla ester oluştuğu, fermantasyon sıcaklığının 10

ºC’den 16 ºC’ye yükseltildiğinde oluşan ester miktarının % 40-50 civarında arttığı

belirtilmiştir. Daudt ve Ough (1973)’e göre esterler farklı sıcaklık profilleri

gösterebilmektedirler. Örneğin, etil asetat ve feniletil asetat en fazla 20 ºC’de

üretilirken, izoamil asetat ve etil oktanoat 15 ºC’de daha fazla üretilmektedir. Fakat,

bu durum bütün mayalar için geçerli değildir. Sıcaklığın oluşan ester miktarını neden

etkilediği henüz tam olarak netlik kazanmamıştır. Ancak, sıcaklığın AATaz

aktivitesini etkilediği tahmin edilmektedir. Bazı araştırmacılar, sıcaklığın mayalarda

hücre içi yağ asidi bileşimini değiştirdiğini, dolayısıyla doymamış yağ asitlerinden

etkilenen AATaz enziminin aktivitesinde değişimlere yol açarak ester üretimini


57

etkilediğini belirtmişlerdir (Fujii ve ark., 1997; Kajiwara ve ark., 1997). Bunun

yanında, sıcaklıkta meydana gelen değişimlerin ester oluşumu için gerekli olan

yüksek alkollerin miktarında da değişime neden olduğu bilinmektedir (Hammond,

1993; Dufour ve ark., 2003; Cole ve Noble, 2003; Verstrepen ve ark., 2003b).


İzoamil Asetat Üretiminde Havalandırmanın Etkisi


Fermantasyon süresince mayalar havalandırmalı ve yarı havalandırmalı

ortamlarda havalandırmasız ortama göre daha hızlı ve daha fazla gelişmişlerdir.

Bütün denemelerde canlılık oranı % 100 bulunmuştur. Maya gelişimi Şekil 4.15’te

verilmiştir.

0

5

10

15

20

25

30

0 12 36 72 90 114 138 162 186 210


Can

lı m

aya

sayısı

(x10

7 hüc

re/m

L)

Havalı Havasız Yarı havalı

Şekil 4.15. W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı havalandırma koşullarındayürütülen fermantasyonlardaki canlı maya sayısı.


58

Mayalar durgun faza, havalandırmalı ve yarı havalandırmalı fermantasyonlarda

24. saatte girerken, havalandırmasız fermantasyonda 48. saatte girmişlerdir. Yarı

havalandırmalı fermantasyonda 24. saatte 2.8x108 hücre/mL ile en yüksek maya

sayısına ulaşılırken, havalandırmalı ve havalandırmasız gerçekleştirilen

fermantasyonlarda maya sayıları sırasıyla 78. ve 150. saatlerde 2.2x108 ve 1.1x108

hücre/mL ile en yüksek maya sayısına ulaşmıştır. Fermantasyon sonunda yarı

havalandırmalı fermantasyonda maya sayısında bir değişiklik olmazken,

havalandırmalı ve havalandırmasız fermantasyonlardaki maya sayılarında azalma

olmuştur. Havalandırmanın maya gelişimini teşvik ettiği yapılan farklı çalışmalarla

ortaya konulmuştur. Kuriyama ve Kobayashi (1993) ve Erten (1997) yaptıkları

çalışmalarda havalandırma ve karıştırmanın fermantasyon sırasında maya gelişim

hızı ve miktarını arttırdığını bildirmişlerdir. Mauricio ve ark. (1997) ise

havalandırmasız ortamda gerçekleştirilen fermantasyonun maya gelişimini inhibe

ettiğini bildirmişlerdir. Nitekim oksijen maya gelişimi için gerekli olan sterollerin ve

doymamış yağ asitlerinin üretimi için gereklidir (Peddie, 1990).


Fermantasyonun gidişi yoğunluktaki düşüş ile izlenmiştir. Yoğunluk

değerindeki düşüşler Şekil 4.16’da verilmiştir.


59

1.0000

1.0100

1.0200

1.0300

1.0400

1.0500

0 24 48 78 102 126 150 174 198


Yoğ

unlu

k (g

/cm

3 )Havalı Havasız Yarı havalı

Şekil 4.16. W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı havalandırma koşullarındayoğunluk değişimi.

Havalandırmalı ortamda gerçekleştirilen denemede fermantasyon 168. saatte,

havalandırmasız ortamda gerçekleştirilen denemede 210. saatte ve yarı

havalandırmalı ortamda gerçekleştirilen denemede ise 126. saatte tamamlanmıştır.

Havalandırmalı ortamda 48. saatten sonra şeker tüketimi oldukça yavaşlamıştır.

Fermantasyon sonunda, havalandırmalı ortamda gerçekleştirilen denemede yoğunluk

1.020 g/cm3’e düşerken, yarı havalandırmalı ve havalandırmasız ortamda

gerçekleştirilen denemelerde bu değer 1.016 g/cm3 olarak ölçülmüştür. Mayalar

logaritmik fazda ortamdaki fermente edilebilir şekeri kullanarak gelişirler.

Havalandırmalı fermantasyonlarda, ortamda bulunan şeker miktarı azalınca maya

hücresi oksijeni kullanarak solunum metabolizması ile enerji üretmeye devam eder.

“Dioksik shift (değişim)” adı verilen bu geçiş noktasından sonra maya ortamda

bulunan etil alkolü karbon kaynağı olarak kullanarak daha yavaş bir gelişme sürecine

girer (Erten, 1997; Herman, 2002). Havalandırma yapılan denemede mayanın 48.

saatte “diauxic shift (değişim)” safhasına girerek ortamda bulunan şekeri daha fazla

tüketemediği ve bu saatten sonra etil alkolü kullanmaya başladığı düşünülmektedir

(Şekil 4.16).


60

4.1.2.2.(3). pH

Fermantasyon süresince pH’da meydana gelen değişim Şekil 4.17’de

verilmiştir. Fermantasyon süresince havalandırmalı ve yarı havalandırmalı

ortamlarda gerçekleştirilen denemelerde pH başlangıç değerine göre artış

gösterirken, havalandırmasız ortamda düşüş göstermiştir. Fermantasyon sonunda pH

değerleri havalandırmalı, yarı havalandırmalı ve havalandırmasız ortamda

gerçekleştirilen denemeler için, sırasıyla, 5.74, 5.70 ve 4.85 olarak bulunmuştur.

4.50

5.00

5.50

6.00

0 12 36 72 90 114 138 162 186 210


pH


Şekil 4.17. W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı havalandırma koşullarında pHdeğişimi.


Fermantasyon süresince oluşan etil alkol miktarları Şekil 4.18’de verilmiştir.

Fermantasyon süresince en fazla etil alkol yarı havalandırmalı ortamda

gerçekleştirilen denemede hacim olarak % 4.15 ile fermantasyonun 48. saatinde

gözlemlenirken, en düşük etil alkol üretimi havalandırmalı ortamda gerçekleştirilen


61

denemede 24. saatte kaydedilmiştir. Havalandırmalı ve yarı havalandırmalı ortamda

fermantasyonun ilerleyen saatlerinde etil alkol miktarlarında azalma görülürken,

havalandırmasız ortamda yürütülen denemede fermantasyon sonuna kadar artış

göstermiştir. Fermantasyon sonunda ortamda bulunan etil alkol miktarları

havalandırmalı, yarı havalandırmalı ve havalandırmasız denemelerde sırasıyla %

0.85, 0.90 ve 3.20 olarak belirlenmiştir.

Birçok maya etil alkolü karbon kaynağı olarak kullanabilir. Havalandırma

yapılan fermantasyonlarda glikoliz ve glukoneogenesis olmak üzere iki safha vardır.

Glikoliz safhasında şekerler etil alkole fermente edilir. Ortamda şeker

konsantrasyonunun azaldığı durumlarda ise glikoliz sırasında oluşan etil alkol hücre

gelişimi için karbon kaynağı olarak kullanılır ki bu safha glukoneogenesis safhasıdır

(Wales ve ark., 1980; Van Urk ve ark., 1989; Erten, 1997). Havalandırmalı ve yarı

havalandırmalı ortamlarda gerçekleştirilen fermantasyon denemelerinde etil alkol

miktarı sırasıyla 24. ve 72. saatten sonra düşmeye başlamıştır ki bu düşüşlerin

glukoneogenesis safhasından kaynaklandığı ve oluşan etil alkolün daha sonra maya

tarafından karbon kaynağı olarak kullanılmaya başlandığı düşünülmektedir.

0

1

2

3

4

5

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240


Etil

alk

ol (%

, h/h

)


h

Şekil 4.18. W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı havalandırma koşullarında etilalkol üretimi.


62

4.1.2.2.(5). 2-Metil-1-butanol ve 3-Metil-1-butanol Üretimi

Fermantasyon süresince havalandırmalı, havalandırmasız ve yarı

havalandırmalı ortamlarda gerçekleştirilen denemelerde üretilen 2-metil-1-butanol ve

3-metil-1-butanol miktarlarındaki değişim, sırasıyla, Şekil 4.19 ve 4.20’de

verilmiştir. 2-metil-1-butanol ve 3-metil-1-butanol en fazla yarı havalandırmalı

fermantasyon denemesinde üretilmiştir. Yarı havalandırmalı denemede üretilen 2-

metil-1-butanol ve 3-metil-1-butanol miktarları fermantasyonun 72. saatinde sırasıyla

92.8 ve 43.8 mg/L ile gerçekleşmiştir. Havalandırmasız fermantasyon denemesinde

üretilen en yüksek 2-metil-1-butanol ve 3-metil-1-butanol miktarları sırasıyla 29.4 ve

6.3 mg/L bulunurken, havalandırmasız fermantasyon denemesinde bu değerler

fermantasyon sonunda 24.8 ve 24.9 mg/L olarak belirlenmiştir.

0

20

40

60

80

100

0 12 36 72 90 114 138 162 186 210


2-M

etil-

1-bu

tano

l (m

g/L)


Şekil 4.19. W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı havalandırma koşullarında 2-metil-1-butanol üretimi.


63

0

10

20

30

40

50

0 12 36 72 90 114 138 162 186 210


3-M

etil-

1-bu

tano

l (m

g/L)


Şekil 4.20. W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı havalandırma koşullarında 3-metil-1-butanol üretimi.

Maya cinsi, sabit ortam koşullarında oluşan yüksek alkol miktarını etkileyen

en önemli parametredir. Farklı kaynaklarda, fermantasyon koşulları dikkate

alındığında ise yüksek pH, yüksek sıcaklık ve havalandırmanın yüksek alkol

üretimini arttırdığına dair bulgulara rastlanmıştır (Crowel ve Guymon, 1963; Berry,

1995; Mauricio ve ark., 1997; Bisson ve ark., 1998; Boulton ve Quain, 2001;

Verstrepen ve ark., 2003b; Ribéreau-Gayon ve ark., 2006). Guymon ve ark. (1961),

havalandırmanın fermantasyon sırasında oluşan yüksek alkollerin miktarında

yaklaşık 5 kat artışa neden olduğunu bildirmişlerdir. Araştırmada elde edilen verilere

göre, yarı havalandırmalı koşullarda gerçekleştirilen fermantasyon denemesinde

oluşan 2-metil-1-butanol ve 3-metil-1-butanol miktarları daha yüksek bulunmuştur.

4.1.2.2.(6). İzoamil Asetat Üretimi


havalandırmalı ortamlarda gerçekleştirilen denemelerde üretilen izoamil asetat

http://www.amazon.com/exec/obidos/search-handle-url/ref=ntt_athr_dp_sr_1?_encoding=UTF8&search-type=ss&index=books&field-author=Pascal%20Rib%E9reau-Gayon


64

miktarındaki değişimler Şekil 4.21’de, üretilen izoamil asetat miktarları ve izoamil

asetat üretim hızları ise Çizelge 4.4’te verilmiştir.

0

20

40

60

80

100

120

140

0 24 48 78 102 126 150 174 198


İzoa

mil

aset

at (m

g/L)


Şekil 4.21. W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı havalandırma koşullarındaizoamil asetat üretimi.

Fermantasyon sırasında üretilen izoamil asetat miktarları ve izoamil asetat

üretim hızları açısından uygulanan havalandırma koşulları arasındaki farklılıklar

istatistiksel olarak önemli bulunmuştur (p<0.001). En yüksek izoamil asetat miktarı

yarı havalandırmalı ortamda gerçekleştirilen fermantasyon denemesinde 90. saatte

118.1 mg/L olarak saptanırken, en düşük izoamil asetat miktarına 8.8 mg/L ile

havalandırmalı ortamda yürütülen denemede 108. saatte rastlanmıştır. İzoamil asetat

hızları karşılaştırıldığında ise, en yüksek izoamil asetat üretim hızı 0.703 mg/L/saat

ile yarı havalandırmalı fermantasyon denemesinde saptanmıştır. Fermantasyon

sonunda ortamda bulunan izoamil asetat miktarları ise havalandırmalı,

havalandırmasız ve yarı havalandırmalı ortamlarda gerçekleştirilen denemeler için,

sırasıyla, 8.5, 14 ve 80 mg/L olarak belirlenmiştir.


65

Çizelge 4.4. Farklı havalandırma koşullarında W. saturnus HUT 7087 tarafındanüretilen izoamil asetat miktarları ve üretim hızları

Havalandırma

koşulu

İzoamil asetat miktarı

(mg/L)


(mg/L/saat)

Havalandırmalı 8.84c±0.08 0.082cy±0.0005

Havalandırmasız 20.72b±0.02 0.432b±0.0004

Yarı havalandırmalı 118.05a±5.59 0.703a±0.0333

Önem düzeyi *** ***x: İzoamil asetat üretim hızları denemeler sırasında en yüksek değere ulaşılan saatlerdehesaplanmıştır. y: Aynı sütunda değişik harflerle gösterilen değerler arasındaki fark istatistikselolarak önemlidir (p<0.05). ***: p<0.001.

Mauricio ve ark. (1997)’na göre, Bertrand ve Torres-Alegre (1984)

fermantasyon ortamına oksijen ilavesinin etil asetat ve yağ asidi etil esterlerini

arttırdığını bildirmişlerdir. Nykanen (1986) ise, havalandırmasız ortamda üretilen

izoamil asetat miktarının havalandırmalı ortamda üretilenden sekiz kat fazla

olduğunu bildirmiştir. Havalandırmalı ortamda gerçekleştirilen fermantasyonlarda

oksijen maya gelişimini hızlandırmakta ve dolayısıyla ortamda bulunan asetil

koenzim A’nın büyük bir kısmı maya gelişimi için gerekli doymamış yağ asidi ve

sterollerin üretiminde kullanılmakta ve ester üretimi için gerekli asetil koenzim A

yeterince sağlanamadığından oluşan ester miktarı azalmaktadır (Peddie, 1990;

Hammond, 1993; Boulton ve Quain, 2001; Lewis ve Young, 2002; Verstrepen ve

ark., 2003b). Genellikle, havasız ortamlarda yarı havalandırmanın yapıldığı

ortamlarla kıyaslandığında butil asetat, izoamil asetat, feniletil asetat ve hekzil asetat

miktarlarında düşüşler gözlenmiştir (Mauricio ve ark., 1997). Yarı havalandırmalı

koşullarda, ortamda oluşan ester miktarı artarak bir pik yapar ve daha sonra azalmaya

başlar. Bunun nedeni, fermantasyon sonuna doğru aktivitelerinde artış gözlenen

hücre içi esterazların oluşan esterleri hidroliz etmesidir (Mauricio ve ark., 1993). Bu

çalışmada da yarı havalandırmalı koşullarda üretilen izoamil asetat miktarı,

havalandırmalı ve havalandırmasız koşullarda üretilen izoamil asetat miktarlarından

yaklaşık 6-15 kat fazla bulunmuştur.


66

4.1.3. W. saturnus HUT 7087 Mayası Kullanılarak Biyodönüşüm Yoluyla

İzoamil Asetat Üretimi

Melas ortamında 25 °C’de yarı havalandırmalı koşullarda W. saturnus HUT

7087 mayası ile substrat olarak farklı oranlarda fuzel yağı kullanılarak biyodönüşüm

yoluyla izoamil asetat üretim denemeleri gerçekleştirilmiştir. Fuzel yağı mayalar

durgun faza girdiği anda ortama % 1, % 2 ve % 3 oranında ilave edilmiştir.

Biyodönüşüm denemelerinde fuzel yağı ilavesinin maya gelişimi, maya canlılık

oranı, ortam yoğunluğu, etil alkol üretimi, 2 ve 3-metil-1-butanol miktarı ve izoamil

asetat miktarı üzerine etkisi aşağıda verilmiştir.

4.1.3.1. Fuzel Yağının Maya Gelişimi ve Canlılık Oranına Etkisi

Maya gelişimi, canlı maya sayısı ve canlılık oranı ile izlenmiştir.

Denemelerde tespit edilen canlı maya sayısındaki değişim ve canlılık oranı sırasıyla

Şekil 4.22 ve Şekil 4.23’te verilmiştir. Fuzel yağı maya gelişiminin 72. saatinde yani

durgun faza girildiği anda ilave edilmiştir. Biyodönüşüm süresince kontrol

denemesindeki mayalar fuzel yağı ilave edilen denemelerdeki mayalardan daha fazla

gelişmişlerdir. Kontrol denemesini % 1 ve % 2 fuzel yağı ilave edilen denemeler

takip etmiştir. Ortama fuzel yağı ilave edildikten sonra tespit edilen en yüksek maya

sayısı % 1, 2 ve 3 fuzel yağı ilave edilen denemeler için, sırasıyla, 2.1x108, 2x108 ve

1.4x108 hücre/mL olarak bulunmuştur. % 3 fuzel yağı ilave edilen denemedeki canlı

maya sayısında düşüş % 1 ve 2 fuzel yağı ilave edilen denemelere nazaran fazla

bulunmuştur. Biyodönüşüm sonunda tespit edilen canlılık oranı kontrol denemesi

için % 97 olurken, % 1, 2 ve 3 oranında fuzel yağı ilave edilen denemelerde sırasıyla

% 95, 89 ve 72 olarak bulunmuştur. Ortama ilave edilen fuzel yağının belirli bir

konsantrasyondan sonra maya gelişimini olumsuz etkilediği daha önce yapılan

çalışmalarda da tespit edilmiştir (Quilter ve ark., 2003).


67

0

5

10

15

20

25

30

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240

Süre (saat)

Can

lı m

aya

sayısı

(x10

7 hüc

re/m

L)Kontrol 1% 2% 3%

Şekil 4.22. Biyodönüşüm süresince canlı maya sayısı (fuzel yağı ilave edilen saatokla gösterilmiştir).

60

70

80

90

100

110

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240

Süre (saat)

Canlılı

k O

ranı

(%)

Kontrol 1% 2% 3%

Şekil 4.23. Biyodönüşüm süresince canlılık oranı (fuzel yağı ilave edilen saat oklagösterilmiştir).


68

4.1.3.2. Fuzel Yağının Yoğunluğa Etkisi

Yoğunluk değerindeki düşüşler Şekil 4.24’de verilmiştir. Ortamdaki fermente

edilebilir şeker miktarı yoğunluk düşüşü ile takip edilmiştir. Yoğunluk

değerlerindeki düşüşler bütün denemelerde benzer bir seyir izlemiştir. Ortama ilave

edilen fuzel yağının, mayaların ortamdaki şekerleri kullanabilme yeteneğine önemli

bir etkisi olmamıştır.

1

1.01

1.02

1.03

1.04

1.05

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240

Süre (saat)

Yoğu

nluk

(g/c

m3 )

Kontrol 1% 2% 3%

Şekil 4.24. Biyodönüşüm süresince gözlenen yoğunluk değerleri (fuzel yağı ilaveedilen saat okla gösterilmiştir).

4.1.3.3. Fuzel Yağının Etil Alkol Üretimine Etkisi

Biyodönüşüm süresince üretilen etil alkol miktarları Şekil 4.25’de verilmiştir.

Fuzel yağı ilave edildikten sonra, kontrol hariç diğer denemelerde gözlenen etil alkol

değerleri, fuzel yağında bulunan etil alkolden dolayı kontrol denemesine göre

yükselmiştir. Etil alkol üretimi bütün denemelerde durgun faza girildikten sonra


69

azalma eğilimi göstermiştir. Biyodönüşüm sonunda belirlenen etil alkol miktarı

kontrol, % 1, 2 ve 3 fuzel yağı ilave edilen denemeler için, sırasıyla, hacmen % 0.9,

2.5, 2.5, ve 3.1 olarak bulunmuştur.

0

1

2

3

4

5

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240

Süre (saat)

Etil

alko

l (%

, h/h

)

Kontrol 1% 2% 3%

Şekil 4.25. Biyodönüşüm süresince etil alkol üretimi (fuzel yağı ilave edilen saatokla gösterilmiştir).

4.1.3.4. 2-Metil-1-butanol ve 3-Metil-1-butanol Miktarlarındaki Değişimler

Biyodönüşüm süresince ortamda bulunan 2 ve 3-metil-1-butanol miktarları

Şekil 4.26 ve 4.27’de verilmiştir. Fuzel yağı ilave edildikten sonra, % 1, % 2 ve % 3

fuzel yağı ilave edilen denemelerdeki 2-metil-1-butanol miktarları, sırasıyla, 948.2,

1923.1 ve 2450.5 mg/L bulunurken, 3-metil-1-butanol’ün miktarları ise, sırasıyla,

989.2, 1889 ve 2607.3 mg/L bulunmuştur. Biyodönüşüm sonunda 2-metil-1-butanol

miktarları, sırasıyla, 344.7, 1558.6 ve 2371.4 mg/L, 3-metil-1-butanol miktarları ise

yine, sırasıyla, 188.4, 1564.7 ve 2494.1 mg/L olarak belirlenmiştir. Görüldüğü gibi

2- ve 3-metil-1-butanol’ün miktarları fuzel yağı ilavesini takiben sadece % 1 fuzel


70

yağı ilave edilen denemede belirgin şekilde azalmıştır. Meydana gelen bu azalma 2-

metil-1-butanol ve 3-metil-1-butanol’ün, sırasıyla, 2-metil-1-butil asetat ve 3-metil-

1-butil asetat’a yani izoamil asetat’a dönüşmesinden dolayıdır.

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240

Süre (saat)

2-M

etil-

1-bu

tano

l (m

g/L)

Kontrol 1% 2% 3%

Şekil 4.26. Biyodönüşüm süresince 2-metil-1-butanol miktarlarındaki değişim (fuzelyağı ilave edilen saat okla gösterilmiştir).


71

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240

Süre (saat)

3-M

etil-

1-bu

tano

l (m

g/L)

Kontrol 1% 2% 3%

Şekil 4.27. Biyodönüşüm süresince 3-metil-1-butanol miktarlarındaki değişim (fuzelyağı ilave edilen saat okla gösterilmiştir).

Ortama ilave edilen fuzel yağının izoamil asetata dönüşüm oranları Çizelge

4.5’de verilmiştir. 2-Metil-1-butanol ve 3-metil-1-butanol’ün biyodönüşüm verimleri

kıyaslandığında, fuzel yağı ilave edilen denemeler arasındaki farklılık istatistiksel

açıdan önemli bulunmuştur (p<0.01). En yüksek biyodönüşüm verimleri 2-metil-1-

butanol ve 3-metil-1-butanol için %1 fuzel yağı ilave edilen denemede belirlenmiştir.

Ancak, 3-metil-1-butanol’ün dönüşüm oranı 2-metil-1-butanol’ün dönüşüm

oranından yüksek bulunmuştur. Daha önce yapılmış çalışmalarda da benzer sonuçlar

elde edilmiştir (Janssens ve ark., 1989; Quilter ve ark., 2003). Hammond ve Pye

(1996), alkollerin esterlerine dönüşüm oranlarının, alkollerin zincir uzunluklarına ve

yapılarına bağlı olduğunu bildirmişlerdir. Araştırmacılar, 2-metil-1-butanol ve 3-

metil-1-butanol’ün AATaz tarafından substrat olarak kullanılmaları durumunda Km

değerlerinin birbirlerine yakın olduğunu, ancak 2-metil-1-butanol’ün Vmax değerinin

3-metil-1-butanol’ün sadece %60’ı kadar olduğunu belirtmişlerdir. Dolayısıyla bu iki

yüksek alkolden izoamil asetat oluşum dereceleri farklı olmaktadır.


72

Çizelge 4.5. Fuzel yağı konsantrasyonunun amil alkollerin biyodönüşümü üzerineetkisi

Fuzel yağı

konsantrasyonu

(%)

2-Metil-1-butanol

biyodönüşüm verimix

(%)

3-Metil-1-butanol

biyodönüşüm verimix

(%)

1 63.5a±4.9 80.1ay±0.8

2 18.9b±1.0 18.5b±2.0

3 3.2c±1.8 5.4c±1.3

Önem düzeyi ** **x:Biyodönüşüm verimleri biyodönüşüm sonunda tüketilen amil alkol miktarları göz önüne alınarakhesaplanmıştır. y: Aynı sütunda değişik harflerle gösterilen değerler arasındaki fark istatistikselolarak önemlidir (p<0.05). **: p<0.01.

4.1.3.5. Fuzel Yağının İzoamil Asetat Üretimine Etkisi

Biyodönüşüm süresince üretilen izoamil asetat miktarındaki değişimler Şekil

4.28’de, üretilen izoamil asetat miktarları ve izoamil asetat üretim hızları ise Çizelge

4.6’da verilmiştir. Biyodönüşüm sırasında üretilen izoamil asetat miktarları ve

izoamil asetat üretim hızları açısından ilave edilen fuzel yağı miktarları arasındaki

farklılıklar istatistiksel açıdan önemli bulunmuştur (p<0.001). Fuzel yağı ilave

edildikten sonra %1 ve %2 fuzel yağı ilave edilen denemelerde en yüksek izoamil

asetat miktarları 144. saatte, sırasıyla, 354.1 ve 71.2 mg/L olarak bulunmuştur. %3

fuzel yağı ilave edilen denemede ise izoamil asetat miktarında düşüş gözlenmiştir.

Biyodönüşüm sonunda ortamda bulunan izoamil asetat miktarları kontrol ve %1, %2

ve %3 fuzel yağı ilave edilen denemeler için, sırasıyla, 80, 140, 24.1 ve 14.2 mg/L

olarak bulunmuştur. İzoamil asetat miktarı en fazla %1 fuzel yağı ilave edilen

denemede tespit edilmiştir. Fuzel yağı ilavesi izoamil asetat üretiminde yaklaşık 3

kat artışa neden olmuştur.


73

0

50

100

150

200

250

300

350

400

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240

Süre (saat)

İzoa

mil

aset

at (m

g/L)

Kontrol 1% 2% 3%

Şekil 4.28. Biyodönüşüm süresince üretilen izoamil asetat miktarlarındaki değişim(fuzel yağı ilave edilen saat okla gösterilmiştir).

Çizelge 4.6. Farklı konsantrasyonlarda fuzel yağı ilavesinde W. saturnus HUT 7087 tarafından üretilen izoamil asetat miktarları ve üretim hızları

Fuzel yağı

konsantrasyonu

(%)

İzoamil asetat miktarı

(mg/L)


(mg/L/saat)

Kontrol 118.05b±5.59 0.703by±0.0333

% 1 354.05a±1.20 2.459a±0.0083

% 2 71.15c±4.31 0.494c±0.0300

% 3 57.65d±1.48 0.801b±0.0206

Önem düzeyi *** ***x: İzoamil asetat üretim hızları denemeler sırasında en yüksek değere ulaşılan saatlerde hesaplanmıştır.y: Aynı sütunda değişik harflerle gösterilen değerler arasındaki fark istatistiksel olarak önemlidir(p<0.05). ***: p<0.001.

Fuzel yağının biyodönüşümle izoamil asetat üretiminde substrat olarak

kullanıldığı ilk çalışma Janssens ver ark. (1989) tarafından gerçekleştirilmiştir. Daha

sonra, Calderbank ve Hammond (1994), S. cerevisiae ile gerçekleştirilen

fermantasyonda ortama ilave edilen 3-metil-1-butanol’ün hem izoamil asetat oluşum


74

hızında hem de oluşan izoamil asetat miktarında artışlara neden olduğunu ve ilave

edilen 400 mg/L 3-metil-1-butanol’ün ise izoamil asetat üretimini 7 kat arttırdığını

bildirmişlerdir. Ortama ilave edilen 3-metil-1-butanol’ün miktarı 800 mg/L’ye

çıkarıldığında ise izoamil asetat miktarında herhangi bir değişim olmadığı, bunun

yanında fermantasyon hızında azalma gözlendiği belirlenmiştir. Araştırmacılar,

ortama ilave edilen 3-metil-1-butanol miktarının 400 mg/L’nin üzerinde olduğu

durumda AATaz enziminin doymuş hale geldiğini ve dolayısıyla daha fazla izoamil

asetat üretilmediğini ileri sürmüşlerdir. Quilter ve ark. (2003) ise, S. cerevisiae ile

melas ortamında gerçekleştirdikleri çalışmada ortama ilave edilen fuzel yağının

izoamil asetat üretiminde 4.4 kat artışa neden olduğunu ve ilave edilen fuzel yağı

konsantrasyonunun 1 g/L üzerinde olduğu durumda izoamil asetat miktarında daha

fazla artış gözlenmediğini bildirmişlerdir. Bu çalışmada, En yüksek izoamil asetat

miktarı 354.1 mg/L ile % 1 fuzel yağı ilave edilen denemede bulunmuştur.

4.2. Etil Asetat Üretimi

4.2.1. P. anomala ve P. subpellicolasa Mayaları ile Etil Asetat Üretimi

NCYC kültür koleksiyonundan elde edilen P. anomala NCYC 432 ve P.

subpelliculosa NCYC 436 mayalarının etil asetat üretimlerini karşılaştırmak

amacıyla 25 ºC’de melas içeren erlenmayerlerde orbital karıştırıcı kullanılarak

fermantasyon denemeleri gerçekleştirilmiştir. P. anomala NCYC 432 mayası

fermantasyon sonunda yaklaşık 1400 mg/L etil asetat üretirken, P. subpelliculosa

NCYC 436 mayası 850 mg/L etil asetat üretebilmiştir. P. anomala NCYC 432

mayası daha fazla etil asetat ürettiği için sıcaklığın ve havalandırmanın etil asetat

üretimine etkisini görmek amacıyla yürütülen denemelerde bu maya kullanılmıştır.

P. anomala NCYC 432 ile etil asetat üretiminde sıcaklığın etkisini araştırmak

amacıyla melas kullanılarak önce havalandırmasız ortamda, 15 ºC ve 25 ºC’de


75

fermantasyon denemeleri kurulmuştur. Havalandırmanın etkisini araştırmak amacıyla

ise yine melas ortamında ve belirlenen en uygun sıcaklıkta, havalandırmalı (200

mL/L/dakika), havalandırmasız ve yarı havalandırmalı ortamlarda fermantasyon

denemeleri gerçekleştirilmiştir.

4.2.2. P. anomala NCYC 432 Mayası Kullanılarak Fermantasyon Yoluyla Etil

Asetat Üretimi

4.2.2.1. P. anomala NCYC 432 Mayası Kullanılarak Fermantasyon Yoluyla Etil

Asetat Üretiminde Sıcaklığın Etkisi


P. anomala NCYC 432 ile etil asetat üretiminde her iki sıcaklıkta yürütülen

fermantasyon denemelerinde canlılık oranı % 100 bulunmuştur. Fermantasyonlar

süresince maya gelişimi Şekil 4.29’da verilmiştir.

0

2

4

6

8

10

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 276 324


Can

lı m

aya

sayısı

(x10

7 hüc

re/m

L)

15 °C 25 °C

Şekil 4.29. P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı sıcaklıklarda gerçekleştirilenfermantasyonlardaki maya gelişimi.


76

25 ºC’de yürütülen fermantasyon denemesinde mayalar, 15 ºC’de yürütülen

fermantasyon denemesine nazaran daha hızlı gelişmişlerdir. 25 ºC’de gerçekleştirilen

fermantasyon denemesinde mayalar durgun faza 60. saatte girerken, 15 ºC’de

yürütülen denemede 120. saatte girmiştir. 25 ºC’de gerçekleştirilen fermantasyonda

maya sayısı 60. saatte 8.2x107 hücre/mL ile en yüksek değerine ulaşmıştır. 15 ºC’de

yürütülen fermantasyonda ise maya sayısı fermantasyonun 120. saatinde 7.9x107

hücre/mL ile en yüksek değere ulaşmıştır. Fermantasyon sonunda ise maya sayısı her

iki sıcaklıkta yürütülen denemeler için 6x107 hücre/mL bulunmuştur.


Fermantasyon süresince her iki sıcaklıkta tespit edilen yoğunluk değerleri

Şekil 4.30’da verilmiştir.

1

1.01

1.02

1.03

1.04

1.05

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 276 324


Yoğ

unlu

k (g

/cm

3 )

15 °C 25 °C

Şekil 4.30. P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı sıcaklıklarda gerçekleştirilenfermantasyonlardaki yoğunluk değerleri.


77

25 ºC’de gerçekleştirilen fermantasyon denemesi 192. saatte tamamlanırken,

15 ºC’de gerçekleştirilen fermantasyon denemesi ise 348. saatte tamamlanmıştır.

Yoğunluk değerlerindeki azalmaya bakıldığında, 15 ºC’de yürütülen fermantasyonda

yoğunluk değerindeki azalma, 25 ºC’de gerçekleştirilen fermantasyondan daha yavaş

ve daha az olmuştur. Fermantasyon sonunda 25 ºC’de yürütülen denemede yoğunluk

1.040 g/cm3’ten 1.016 g/cm3’e düşerken, 15 ºC’de gerçekleştirilen fermantasyon

sonunda ise yoğunluk 1.015 g/cm3 olarak belirlenmiştir. Fermantasyon sıcaklığındaki

düşüşe paralel olarak ortamdaki fermente edilebilir şekerlerin tüketim hızında da

düşüşler yaşanmıştır.

4.2.2.1.(3). pH

Fermantasyon süresince takip edilen pH değerleri Şekil 4.31’de verilmiştir.

4.5

4.6

4.7

4.8

4.9

5

5.1

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 276 324


pH

15 °C 25 °C

Şekil 4.31. P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı sıcaklıklarda gerçekleştirilenfermantasyonlardaki pH değerleri.

Her iki sıcaklıkta gerçekleştirilen fermantasyon denemelerinde pH, maya

gelişiminin ilk evresinde yani logaritmik fazda hızlı bir düşüş sergilemiştir. 25 ºC’de


78

gerçekleştirilen denemede pH 4.73 değerine kadar düşerken, 15 ºC’de bu düşüş

4.76’ya kadar olmuştur. Fermantasyon sonunda her iki sıcaklık için pH değerlerinde

artışlar kaydedilmiştir. 25 ºC’de son pH 4.77 olurken, bu değer 15 ºC için 4.83 olarak

kaydedilmiştir.


Fermantasyon sırasında üretilen etil alkol miktarları Şekil 4.32’de verilmiştir.

00.5

11.5

22.5

33.5

44.5

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 276 324


Etil

alko

l (%

, h/h

)

15 °C 25 °C

Şekil 4.32. P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı sıcaklıklarda gerçekleştirilenfermantasyonlarda üretilen etil alkol miktarları.

Fermantasyon süresince her iki sıcaklıktaki etil alkol üretimlerinde iniş ve

çıkışlar gözlenmiştir. Her iki sıcaklıkta yürütülen denemelerde en fazla etil alkol

üretimi % 3.5 olarak saptanmıştır. Fermantasyon sonunda ortamda bulunan etil alkol

miktarları 25 ºC ve 15 ºC’de yürütülen denemeler için, sırasıyla, % 3 ve % 1.7 olarak

bulunmuştur.


79

4.2.2.1.(5). Etil Asetat Üretimi

Fermantasyon süresince üretilen etil asetat miktarındaki değişimler Şekil

4.33’de, üretilen etil asetat miktarları ve etil asetat üretim hızları ise Çizelge 4.7’de

verilmiştir.

0

50

100

150

200

250

300

350

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 276 324


Etil

aset

at (m

g/L)

15 25

Şekil 4.33. P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı sıcaklıklarda gerçekleştirilenfermantasyonlarda üretilen etil asetat miktarları.

Çizelge 4.7. Farklı sıcaklıklarda P. anomala NCYC 432 tarafından üretilen etil asetatmiktarları ve üretim hızları

Sıcaklık Etil asetat miktarı (mg/L) Etil asetat üretim hızıx (mg/L/saat)

15 °C 102.9±0.64 0.572±0.0035

25 °C 319±0.85 1.893±0.0054

Önem düzeyi ** **x: Etil asetat üretim hızları denemeler sırasında en yüksek değere ulaşılan saatlerde hesaplanmıştır.**: p<0.01.

Fermantasyon sırasında üretilen etil asetat miktarları ve etil asetat üretim

hızları bakımından sıcaklıklar arasındaki farklılık istatistiksel olarak önemli

bulunmuştur (p<0.01). 25 ºC’de üretilen etil asetat miktarı fermantasyonun 168.


80

saatinde 319 mg/L ile en yüksek seviyesine ulaşırken, 15 ºC’de üretilen etil asetat

miktarı ise fermantasyonun 276. saatinde 102.9 mg/L ile en yüksek seviyesine

ulaşmıştır. Fermantasyon sonunda üretilen etil asetat miktarları 25 ºC ve 15 ºC için,

sırasıyla, 207.8 ve 65.2 mg/L’dir. Etil asetat üretim hızlarına bakıldığında, 25 ºC’de

gerçekleştirilen denemede üretim hızı 1.893 mg/L/saat olarak bulunurken, bu değer

15 ºC için 0.572 mg/L/saat olmuştur.

Genellikle 10-25 ºC arasında sıcaklık arttıkça oluşan ester miktarı da

artmaktadır. Sıcaklığın ester üretimine etkisi üzerine yapılan çalışmalarda, 12 ºC’de

10 ºC’den % 75 daha fazla ester oluştuğu, fermantasyon sıcaklığının 10 ºC’den 16

ºC’ye yükseltildiğinde oluşan ester miktarının % 40-50 civarında arttığı belirtilmiştir.

Ancak, ester üretimi farklı sıcaklık profilleri gösterebilmektedirler (Peddie, 1990).

Saerens ve ark. (2008), S. cerevisiae ile 14-26 °C arasında gerçekleştirdikleri

denemelerde artan sıcaklıkla beraber oluşan etil asetat miktarının da arttığını ve en

çok artışın 20 ile 26 °C aralığında gerçekleştiğini bildirmişlerdir.

4.2.2.2. P. anomala NCYC 432 Mayası Kullanılarak Fermantasyon Yoluyla Etil

Asetat Üretiminde Havalandırmanın Etkisi


Fermantasyon süresince havalandırmalı ve yarı havalandırmalı ortamlarda

gerçekleştirilen denemelerde mayalar, havalandırmasız ortama göre daha hızlı ve

daha fazla gelişmişlerdir. Denemelerin tümünde canlılık oranı % 100 bulunmuştur.

Maya gelişimi Şekil 4.34’te verilmiştir.


81

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 12 24 36 48 60 72 84 96 10 12 13 14 15 16 18 19


Can

lı m

aya

sayısı

(x10

7 hüc

re/m

L)Havalı Havasız Yarı havalı

Şekil 4.34. P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı havalandırma koşullarındayürütülen fermantasyonlardaki canlı maya sayısı.

Havalandırmalı ve yarı havalandırmalı ortamda yürütülen denemelerde maya

durgun faza 24. saatte girerken, havasız denemede 60. saatte girmiştir. Fermantasyon

süresince ulaşılan en yüksek canlı maya sayıları havalandırmalı ve yarı

havalandırmalı denemeler için 3.6x108 hücre/mL olurken, havalandırmasız

denemede 8.1x107 hücre/mL bulunmuştur. Fermantasyon sununda ortamda bulunan

canlı maya sayıları ise havalandırmalı, yarı havalandırmalı ve havalandırmasız

ortamlarda yürütülen denemeler için, sırasıyla, 1.8x108, 2.6x108 ve 6x107 hücre/mL

olarak saptanmıştır. Fredlund ve ark. (2004a), P. anomala’nın havalandırmalı

koşullarda oksijensiz ortama nazaran daha hızlı ve daha çok geliştiğini

bildirmişlerdir. Diğer bir çalışmada ise ortama verilen kısıtlı oksijenin P.

anomala’nın gelişimini de kısıtladığını bildirilmiştir (Fredlund ve ark., 2004b).


82


Fermantasyon gidişi yoğunluktaki azalma ile takip edilmiştir. Fermantasyon

süresince kaydedilen yoğunluk düşüşleri Şekil 4.35’de verilmiştir.

1

1.01

1.02

1.03

1.04

1.05

0 12 24 36 48 60 72 84 96 10 12 13 14 15 16 18 19


Yoğu

nluk

(g/c

m3 )

Havalı Havas ız Yarı havalı

Şekil 4.35. P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı havalandırma koşullarındayürütülen fermantasyonlardaki yoğunluk değerleri.

Yarı havalandırmalı ortamda gerçekleştirilen fermantasyon denemesindeki

yoğunluk düşüşü diğer denemelerden daha hızlı olmuştur. Fermantasyon sonunda

ölçülen yoğunluk değerleri ise havalandırmalı, yarı havalandırmalı ve

havalandırmasız ortamlarda yürütülen denemeler için, sırasıyla, 1.017, 1.014 ve

1.016 g/cm3’dir.

4.2.2.2.(3). pH

Fermantasyon süresince pH’da meydana gelen değişim Şekil 4.36’da

verilmiştir.


83

4.3

4.44.5

4.64.7

4.84.9

55.1

0 12 24 36 48 60 72 84 96 10 12 13 14 15 16 18 19


pHHavalı Havasız Yarı havalı

Şekil 4.36. P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı havalandırma koşullarındayürütülen fermantasyonlardaki pH değerleri.

Fermantasyon süresince tüm denemelerde pH değerinde düşüşler yaşanmıştır.

Fermantasyon sonunda pH değerleri havalandırmalı, yarı havalandırmalı ve

havalandırmasız ortamda gerçekleştirilen denemeler için, sırasıyla, 4.67, 4.57 ve 4.77

olarak bulunmuştur.


Fermantasyon süresince oluşan etil alkol miktarları Şekil 4.37’de verilmiştir.


84

00.5

11.5

22.5

33.5

44.5

0 24 48 72 96 120 144 168 192


Etil

alko

l (%

, h/h

)Havalı Havasız Yarı havalı

Şekil 4.37. P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı havalandırma koşullarındayürütülen fermantasyonlardaki etil alkol üretimi.

Fermantasyon süresince yarı havalandırmalı ortamda etil alkol üretimi 24.

saate kadar artış göstermiş ve daha sonra düşmeye başlamıştır. Havalandırmalı ve

havalandırmasız ortamlarda gerçekleştirilen denemelerde ise etil alkol üretimi

fermantasyon sonuna kadar genel olarak artarak devam etmiştir. En fazla etil alkol

üretimi fermantasyonun 180. saatinde % 3.48 ile havalandırmasız ortamda

gerçekleşmiştir. Fermantasyon sonunda ortamda bulunan etil alkol miktarları

havalandırmalı, yarı havalandırmalı ve havalandırmasız denemelerde, sırasıyla, %

1.80, 3.01 ve 0.40 olarak belirlenmiştir.

Fredlund (2004), P. anomala’nın havalandırmalı ve havalandırmasız ortamda

etil alkol oluşturduğunu, ancak havalandırmalı ortamda üretilen etil alkolün tekrar

hücre tarafından kullanılırken, havalandırmasız ortamda fermantasyon bitene kadar

ortamda birikmeye devam ettiğini bildirmiştir. Bu çalışmada, havalandırmanın

yapıldığı denemelerde oluşan etil alkolün tekrar maya tarafından kullanıldığı,

havalandırmasız ortamda ise fermantasyon süresince sürekli ortamda birikmeye

devam ettiği gözlenmiştir.


85

4.2.2.2.(5). Etil Asetat Üretimi


havalandırmalı ortamlarda gerçekleştirilen denemelerde üretilen etil asetat

miktarındaki değişimler Şekil 4.38’de, üretilen etil asetat miktarları ve etil asetat

üretim hızları ise Çizelge 4.8’de verilmiştir.

0

50

100

150

200

250

300

350

0 24 48 72 96 120 144 168 192


Hav

alı v

e H

avasız

Etil

aset

at (m

g/L)

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

Yarı

hav

alı E

til a

seta

t(m

g/L)


Şekil 4.38. P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı havalandırma koşullarındayürütülen fermantasyonlardaki etil asetat üretimi.

Fermantasyon sırasında üretilen etil asetat miktarları ve etil asetat üretim

hızları açısından uygulanan havalandırma koşulları arasındaki farklılıklar istatistiksel

olarak önemli bulunmuştur (p<0.001). Denemeler sırasında üretilen en yüksek etil

asetat miktarı yarı havalandırmalı ortamda fermantasyonun 144. saatinde 6706.5

mg/L olarak saptanırken, en düşük etil asetat miktarına 146 mg/L ile havalandırmalı

ortamda fermantasyonun 96. saatinde rastlanmıştır. Etil asetat üretim hızları

karşılaştırıldığında, en yüksek değer 23.287 mg/L/saat ile yarı havalandırmalı

fermantasyon denemesinde saptanmıştır. Fermantasyon sonunda ortamda bulunan

etil asetat miktarları ise havalandırmalı, yarı havalandırmalı ve havalandırmasız


86

ortamlarda gerçekleştirilen denemeler için sırasıyla 91, 1920 ve 207.8 mg/L olarak

belirlenmiştir.

Çizelge 4.8. Farklı havalandırma koşullarında P. anomala NCYC 432 tarafındanüretilen etil asetat miktarları ve üretim hızları

Havalandırma

koşulu

Etil asetat miktarı

(mg/L)

Etil asetat üretim hızıx

(mg/L/saat)

Havalandırmalı 145.98c±2.02 1.521by±0.0210

Havalandırmasız 319b±0.85 1.893c±0.0054

Yarı havalandırmalı 6706.55a±4.88 23.287a±0.0169

Önem düzeyi *** ***x: Etil asetat üretim hızları denemeler sırasında en yüksek değere ulaşılan saatlerde hesaplanmıştır. y:Aynı sütunda değişik harflerle gösterilen değerler arasındaki fark istatistiksel olarak önemlidir(p<0.05). ***: p<0.001.

Mayalarda etil asetat, ya AATaz aktivitesi ile etil alkol ve asetil koenzim

A’dan veya ters esteraz aktivitesi ile etil alkol ve asetat’tan üretilir. Bu iki enzimin

etil asetat üretimine katkısı maya cinsine göre farklılık gösterir. Etil asetat üretimine

neden olarak iki farklı mekanizmanın olduğu düşünülmektedir. Bunlardan biri maya

için toksik etki yapabilecek asetat ve etil alkolün hücreden uzaklaştırılması, diğeri ise

serbest koenzim A sirkülasyonunun sağlanmasıdır (Fredlund, 2004; Fredlund ve ark.,

2004a ). P. anomala’nın glukoz içeren ve havalandırmanın yapıldığı ortamda etil

asetat ürettiği ve oksijen miktarının arttırıldığı zaman üretilen etil asetat miktarında

düşüş olduğu farklı kaynaklarda bildirilmiştir (Gray, 1949; Davies ve ark., 1951;

Tabachnick ve Joslyn, 1953; Fredlund ve ark., 2004a). Passoth ve ark. (2004),

ortama verilen oksijen miktarının kısıtlandığı durumlarda etil asetat miktarında 10

kat artışın meydana geldiğini bildirmişlerdir. Rojas ve ark. (2001) ise bu görüşün

aksine oksijenin kısıtlandığı koşullarda üretilen etil asetat miktarının oksijenli ortam

koşullarına nazaran daha az olduğunu belirtmişlerdir.

Bu araştırmada, havalandırmasız ortamda üretilen etil asetat miktarı

havalandırmalı ortamda üretilenin yaklaşık iki katı bulunmuştur. Yarı havalandırmalı

ortamda ise havalandırmalı ortamda üretilen etil asetat miktarının 45 katına

ulaşılmıştır. Havalandırmanın kısıtlı yapıldığı durumda ortamda oluşan etil asetat


87

miktarının arttığı gözlenmiştir. Benzer sonuçlar Passoth ve ark. (2004) tarafından da

belirlenmiştir.

5. SONUÇ ve ÖNERİLER Murat YILMAZTEKİN

88

5. SONUÇ ve ÖNERİLER

Bu çalışmada, W. saturnus türüne ait üç farklı maya ırkı ile melastan

fermantasyon yoluyla izoamil asetat üretimi gerçekleştirilmiş; en iyi verime sahip W.

saturnus ırkı kullanılarak farklı sıcaklıklarda ve havalandırma koşullarında

fermantasyon denemeleri kurularak sıcaklığın ve havalandırmanın izoamil asetat

üretimine etkisi araştırılmış; saptanan en uygun koşullarda melas ortamına farklı

konsantrasyonlarda fuzel yağı ilave edilerek biyodönüşüm yoluyla izoamil asetat

üretiminin arttırılması hedeflenmiştir. Benzer şekilde Pichia cinsine ait iki farklı

maya kullanılarak fermantasyon yoluyla melastan etil asetat üretimi

gerçekleştirilmiş; en fazla etil asetat üreten maya kullanılarak farklı sıcaklıklarda ve

havalandırma koşullarında fermantasyon gerçekleştirilerek sıcaklığın ve

havalandırmanın etil asetat üretimine etkisi araştırılmıştır.

İzoamil Asetat Üretiminde; W. saturnus türüne ait üç farklı maya ırkından en

fazla izoamil asetat üretenin W. saturnus HUT 7087 olduğu tespit edilmiştir. İzoamil

asetat üretim miktarı açısından yapılan karşılaştırmada bütün maya ırklarının

birbirine yakın olduğu, ancak birim saatte üretilen izoamil asetat miktarı yani üretim

hızı dikkate alındığında mayalar arasındaki farkın önemli olduğu bulunmuştur

(p<0.05).

W. saturnus HUT 7087 mayası ile üretilen izoamil asetat miktarları ve

izoamil asetat üretim hızları bakımından 25 ºC’de gerçekleştirilen fermantasyon

denemesi ile 15 ºC’de gerçekleştirilen fermantasyon denemesi arasındaki farklılık

istatistiksel açıdan önemli bulunmuştur (p<0.001). 25 ºC’de üretilen izoamil asetat

miktarı 20.7 mg/L ile en yüksek seviyesine ulaşırken, 15 ºC’de üretilen izoamil asetat

miktarı 29.4 mg/L ile en yüksek seviyesine ulaşmıştır. Ancak, üretim verimliliği

açısından birim zamanda üretilen izoamil asetat miktarı yani üretim hızı göz önüne

alındığında, 25 ºC’de daha fazla izoamil asetat üretilmiştir.

Aynı maya ırkı kullanılarak farklı havalandırma koşullarında gerçekleştirilen

denemelerde ise izoamil asetat miktarları ve izoamil asetat üretim hızları açısından

uygulanan havalandırma koşulları arasındaki farklılıklar istatistiksel açıdan önemli


89

bulunmuştur (p<0.001). En yüksek izoamil asetat miktarı yarı havalandırmalı

ortamda 118.1 mg/L olarak saptanmıştır.

Fermantasyon denemeleri ile belirlenen en uygun koşullarda biyodönüşüm

yoluyla izoamil asetat üretiminin arttırılmasına yönelik gerçekleştirilen denemelerde

ise, % 1 fuzel yağı ilavesiyle üretilen izoamil asetat miktarı 3 kat artmıştır (354

mg/L). Ortama ilave edilen fuzel yağının belirli bir konsantrasyondan sonra maya

gelişimini olumsuz etkilediği belirlenmiştir. Fuzel yağında büyük oranda bulunan ve

izoamil asetat üretiminde substrat olarak kullanılan 2-metil-1-butanol ve 3-metil-1-

butanol’ün biyodönüşüm verimleri kıyaslandığında, fuzel yağı ilave edilen

denemeler arasındaki farklılık önemli bulunmuştur (p<0.01). En yüksek

biyodönüşüm verimi 2-metil-1-butanol ve 3-metil-1-butanol için %1 fuzel yağı ilave

edilen denemede saptanmıştır. Ancak, 3-metil-1-butanol’ün dönüşüm oranı 2-metil-

1-butanol’ün dönüşüm oranından yüksek bulunmuştur. Ortama ilave edilen fuzel

yağı miktarının % 1’in üzerinde olduğu zaman AATaz enziminin doymuş hale

geldiğini ve dolayısıyla daha fazla izoamil asetat üretilemediği sonucuna varılmıştır.

Etil Asetat Üretiminde; Pichia cinsine ait mayalardan P. anomala NCYC 432

mayasının P. subpelliculosa NCYC 436 mayasına göre daha fazla etil asetat ürettiği

saptanmıştır. P. anomala NCYC 432 mayası ile üretilen etil asetat miktarları ve etil

asetat üretim hızları bakımından uygulanan sıcaklıklar arasındaki farklılık önemli

bulunmuştur (p<0.01). 25 ºC’de üretilen etil asetat miktarı 319 mg/L ile en yüksek

seviyesine ulaşırken, 15 ºC’de üretilen etil asetat miktarı ise 102.9 mg/L ile sınırlı

kalmıştır. Yine aynı şekilde, üretilen etil asetat miktarları ve etil asetat üretim hızları

açısından uygulanan havalandırma koşulları arasındaki farklılık önemli bulunmuştur

(p<0.001). Üretilen en yüksek etil asetat miktarı yarı havalandırmalı ortamda 6.7 g/L

olarak saptanırken, en düşük etil asetat miktarı 146 mg/L olarak belirlenmiştir. Etil

asetat üretim hızları karşılaştırıldığında, en yüksek değer 23.29 mg/L/saat ile yarı

havalandırmalı fermantasyon denemesinde saptanmıştır.

Araştırmadan elde edilen sonuçlara göre dikkate değer bazı önemli hususlar

ve öneriler aşağıda belirtilmiştir;

· Şeker endüstrisinin bir yan ürünü olan melas izoamil asetat ve etil asetat üretimi

için uygun bir fermantasyon ortamı olarak kullanılabilir. Damıtma artığı olan


90

fuzel yağı ise biyodönüşümle izoamil asetat üretiminde uygun bir substrat olarak

değerlendirilebilir.

· Araştırmada kullanılan fermentör, peristaltik pompa düzeneğine sahip olmadığı

için ortam pH’sının kontrolü sağlanamamıştır. Dolayısıyla ileriki çalışmalarda

fermantasyon sırasında üretimde etkili olabilecek önemli bir parametre olan

pH’nın sürekli sabit tutularak farklı pH koşullarının denenmesi yararlı olacaktır.

· Fermantasyon başlangıcında ortama yeterli miktarda hava verilerek maya

gelişiminin teşvik edilmesinin ve daha sonra, mayalar durgun faza girdiği zaman,

verilen hava miktarı azaltılarak fermantasyona devam edilmesinin, üretilen

izoamil asetat ve etil asetat miktarını arttırabileceği düşünülmektedir.

· Üretilen izoamil asetat miktarı şu ana kadar W. saturnus mayası ile elde edilen en

yüksek miktar olmasına rağmen endüstriyel ölçekli üretim için düşüktür. Bu

yüzden, izoamil asetat üretimini arttırmak için başta kullanılan maya türünün

genetik olarak iyileştirilmesine olanak sağlayacak yeni çalışmalara ihtiyaç vardır.

· P. anomala mayası ile üretilen etil asetat miktarının tatminkar olduğu

düşünülmekte ve bundan sonraki aşamalarda üretilen aroma maddesinin

ortamdan izole edilmesi ve saflaştırılması amacıyla yapılacak yeni çalışmalara

gerek duyulmaktadır.

· Biyoteknolojik yolla doğal izoamil asetat ve etil asetat üretiminde, bu alanda

faaliyet gösteren kuruluşlar ve fabrikalar ile karşılıklı işbirliğine gidilerek yeni

projeler geliştirilmesi ve bu projeler sonucunda üretim miktarının arttırılarak

ekonomik açıdan endüstriyel ölçekte üretilebilir seviyelere taşınması, hem gıda

sanayinde doğal aroma maddelerinin kullanılmasına olanak sağlayacak hem de

ülke ekonomisine katkı sağlayacaktır.

91

KAYNAKLAR

ABBAS, H. ve COMEAU, L., 2003. Aroma synthesis by immobilized lipase from

Mucor sp. Enzyme and Microbial Technology, 32(5), 589-595.

ANONİM, 1997a. Türk Gıda Kodeksi Yönetmeliği (16 Kasım 1997). Dünya

Yayıncılık, İstanbul.

ANONİM, 1997b. Methods of Analysis. The Institute of Brewing, London.

ANONİM, 2002. Reference Methods fort he Analysis of Spirit Drinks. Official

Journal of the European Communities, Council regulation (EEC) No:

2870/2000, 47s.

BAYRAK, A. 2006. Gıda Aromaları. Gıda Teknolojisi Derneği Yayın No:32, s.1-44.

BERGER, R.G., 1995. Aroma Biotechnology. Springer, Berlin Heidelberg New

York, s.35-50.

BERRY, D.R., 1995. Alcoholic Beverage Fermentations (Lea, A.G.H. ve Piggott,

J.R editörler). Fermented Beverage Production, Blackie, London, s.169-213.

BERTRAND, A. ve TORRES-ALEGRE, V., 1984. Incidence de L’action de

L’oxygene sur la formation des produits secondaires de la fermentation

alcoolique du mout de raisin, Science des Aliments, 4, 45-64.

BISSON, L.F., KUNKEE, R.E. ve SINGLETON, V.L., 1998. Principles and

Practices of Winemaking. Springer Verlag, New York.

BOULTON, C. ve QUAIN, D., 2001. Brewing Yeast and Fermentation. Blackwell

Science, Great Britain, 644s.

BUZZINI, P., MARTINI, A., PAGNONI, U. M. ve DAVOLI, P., 2003. Production

of flavoured organic compounds (VOCs) by Candida oleophia GK10

optimisation using factorial design and response surface analysis. Enzyme

and Microbial Technology, 33, 668-675.

CALDERBANK, J. ve HAMMOND, J.R.M., 1994. Influence of Higher Alcohol

Availability on Ester Formation by Yeast, Journal of American Society of

Brewing and Chemistry, 52(2), 84-90.

http://apps.isiknowledge.com/full_record.do?product=WOS&search_mode=GeneralSearch&qid=2&SID=Q296JPhNnCNCfHO6G9o&page=3&doc=25




http://artist.ebay.com/Linda-F-Bisson_books_W0QQcZ1024953061

http://artist.ebay.com/Ralph-E-Kunkee_books_W0QQcZ1024953062

http://artist.ebay.com/Vernon-L-Singleton_books_W0QQcZ1023797613

92

CANBAŞ, A., 1988. Gıda Bilimi ve Teknolojisi. Çukurova Üni. Ziraat Fak. ders

kitabı, No:78, Çukurova Üni. Ziraat Fak. Ofset ve Teksir Atölyesi, Adana,

199s.

CANBAŞ, A., 1995. Ekmek Mayacılığı. Gıda Teknolojisi Derneği Yayınları, Yayın

No: 22, Ankara, 44s.

CASELLAS, G.B., 2005. Effect of low temperature fermentation and nitrogen

content on wine yeast metabolism. Universitat Roviari Virgili, Facultat

D’Enologia, Doktora Tezi, Tarragona.

CASEY, G.P., MAGNUS, C.A. ve INGLEDEW, W.M., 1984. High gravity brewing:

effects of nutrition on yeast composition, fermentative ability and alcohol

production. Applied and Environmental Microbiology, 48, 639.

CHANG, R., 2000. Physical Chemistry for the Chemical and Biological Sciences,

1st Edition, University Science Books, Sausalito, 1018s.

COLE, V.C. ve NOBLE, A.C., 2003. Flavor Chemistry, (Lea, A.G.H. ve Piggott,

J.R. editörler) Fermented Beverage Production, 2nd. ed., Kluwer

Academic/Plenum Publishers, New York, 423s.

COUTO, S.R., ve SANROMÁN, M.A, 2006. Application of solid-state fermentation

to food industry-A review. Journal of Food Engineering, 76, 291–302.

CROWEL, E.A. ve GUYMON, J.F., 1963. Influence of aeration and suspended

material on higher alcohols, acetoin, and diacetyl during fermentation. The

Annual Meeting of the American Society of Enologist, Sacremento,

California, 219-222.

CRUEGER, W. ve CRUEGER, A., 1990. Biotechnology: A Textbook of Industrial

Microbiolory. 2nd ed., Sinauer Associates, Inc., USA, 357s.

CURTIN, L.V., 1983. Molasses-General Consideration. Molasses in Animal

Nutrition, National Feed Ingredients Association, West Des Moines, Iowa,

11s.

ÇALIK, G., BERK, M., BOYACI, F.G., ÇALIK, P., TAKAÇ, S. ve ÖZDAMAR,

T.H., 2001. Pretreatment Processes of Molasses for the Utilization in

Fermentation Processes. Engineering and Manufacturaing for Biotechnology,

21-28.

http://www.uscibooks.com/chang.htm

http://www.uscibooks.com/

93

DAUDT, C.E. ve OUGH, C.S., 1973. Variations in some volatile acetate esters

formed during grape juice fermentations: effects of fermentation temperature,

SO2, yeast strain and grape variety. American Journal of Enology and

Viticulture, 24, 130-135.

DAVIES, R., FALKINER, E.A., WILKINSON, J.F. ve PEEL, J.L., 1951. Ester

formation by yeast. 1. Ethyl acetate formation by Hansenula species.

Biochemical Journal, 49, 58-60.

DUFOUR, J.-P., MALCORPS, P. ve SILCOCK, P., 2003. Control of Ester Synthesis

During brewery Fermentation, (Smart K. editör), 2nd ed., Oxford Brookes

University, Blackwell Science, Oxford, U.K., 308s.

DUFOUR, J-P. ve MALCORPS, P., 1995. Ester synthesis during fermentation:

enzyme characterization and modulation mechanism. Proceedings of the 4th

Aviemore Conference on Malting, Brewing and Distilling, (Cambell I. ve

Priest, F.G. editörler), Institute of Brewing, London, s.137-151.

ELMACI, Y., 2001. Lezzet Maddeleri. Gıda Katkı Maddeleri, (Altuğ, T. editör),

Meta Basım, İzmir, s.143-159.

EPIFANIO, S.I., GUTIERREZ, A.R., SANTAMARI´A, M.P. ve LO´PEZ, R., 1999.

The influence of enological practices on the selection of wild yeast strains in

spontaneous fermentation. American Journal of Enology and Viticulture, 50

(2), 219– 224.

ERTEN, H. ve CAMPBELL, I., 2001. The production of low-alcohol wines by

aerobic yeasts. Journal of Institute of Brewing, 107 (4), 207-215.

ERTEN, H. ve CANBAŞ, A., 2003. Alkol fermantasyonu sırasında oluşan aroma

maddeleri. Gıda, 28(6), 615-619.

ERTEN, H., 1997. The Production of Low Alcohol Wines by Aerobic Yeasts.

Doktora Tezi, Department of Biological Sciences and Centre for Brewing and

Distilling, Heriot-Watt University, Edinburgh, 201s.

FLEET, G.H. ve HEARD, G.M., 1993. Yeasts-Growth during fermentation. Wine

Microbiology and Biotechnology, (Fleet, G.H. editör), Harwood Academic

Publishers, Switzerland, 510s.

94

FREDLUND, E., BLANK, L.M., SCHNURER, J., SAUER, U. ve PASSOTH, V.,

2004a. Oxygen- and glucose-dependent regulation of central carbon

metabolism in Pichia anomala. Applıed nnd Envıronmental

Mıcrobıology, 70(10), 5905-5911.

FREDLUND, E., BROBERG, A., BOYSEN, M.E., KENNE, L. ve SCHNURER, J.,

2004b. Metabolite profiles of the biocontrol yeast Pichia anomala J121

grown under oxygen limitation. Applied Microbiology and Biotechnology,

64, 403-409.

FREDLUND, E., 2004. Central carbom metabolism in the biocontrol yeast Pichia

anomala: Influence of oxygen limitation. Doktora Tezi, Swedish University

of Agricultural Sciences, Uppsala, 54s.

FUJII, T., KOBAYSHI, O., YOSHIMOTO, H., FURUKAWA, S. ve TAMAI, Y.,

1997. Effect of aeration and unsaturated fatty acids on expression of the

Saccharomyces cerevisiae alcohol acetyltransferase gene. Applied and

Environmental Microbiology, 63(3), 910-915.

GATFIELD, I.L., HILMER, J.M. ve BERTRAM, H.J., 2003. The alcohol

fermentation process as a source of natural flavour materials. Intitute of Food

Technologist Annual Meeting, Chicago.

GENT, D.P. ve SLAUGHTER, J.C., 1994. Intracellular distribution of amino acids

and higher alcohol production during fermentation. Proceedings of the 4th

Aviemore Conference on Malting, Brewing and Distilling, (Cambell I. ve

Priest, F.G. editörler), Institute of Brewing, London, 294-297.

GÖKSUNGUR, Y., UÇAN, A. ve GÜVENÇ, U., 2004. Production of pullulan from

beet molasses and synthetic medium by Aureobasidium pullulans. Turkish

Journal of Biology, 28, 23-30.

GRAY, D.W., 1949. Initial studies on the metabolism of Hensenula anomala

(Hansen) Sydow. American Journal of Botany, 36, 475-480.

GUYMON, J.F., INGRAHAM, J.L. ve CROWELL, E.A., 1961. Influence of

Aeration upon the formation of Higher Alcohols by Yeasts. American Journal

of Enology and Viticulture, 12(2), 60-66.

http://apps.isiknowledge.com/DaisyOneClickSearch.do?product=WOS&search_mode=DaisyOneClickSearch&doc=1&db_id=&SID=N1IBIj9NDfiLPFNpKKE&name=Blank%20LM&ut=000224356200026&pos=2

http://apps.isiknowledge.com/DaisyOneClickSearch.do?product=WOS&search_mode=DaisyOneClickSearch&doc=1&db_id=&SID=N1IBIj9NDfiLPFNpKKE&name=Schnurer%20J&ut=000224356200026&pos=3

http://apps.isiknowledge.com/DaisyOneClickSearch.do?product=WOS&search_mode=DaisyOneClickSearch&doc=1&db_id=&SID=N1IBIj9NDfiLPFNpKKE&name=Sauer%20U&ut=000224356200026&pos=4

http://apps.isiknowledge.com/DaisyOneClickSearch.do?product=WOS&search_mode=DaisyOneClickSearch&doc=1&db_id=&SID=N1IBIj9NDfiLPFNpKKE&name=Passoth%20V&ut=000224356200026&pos=5

95

GÜVENÇ, A., KAPUCU, N. ve MEHMETOĞLU, Ü., 2002. The production of

isoamyl acetate using immobilized lipases in a solvent-free system. Process

Biochemistry, 38, 379-386.

HAHN-HAGERDAL, B., KARHUMAA, K., LARSSON, C.U., GORWA-

GRAUSLUND, M., GORGENS, J. ve H van ZYL, W., 2005. Role of

Cultivation media in the development of yeast strains for large scale

industrial use. Microbial Cell Factories, 4(31), 1-16.

HAMMOND, J. R. M. ve PYE, J., 1996. Acetate ester synthesis: The role of alcohol

acetyl transferase. Brewing Technology, The Market and The Environment,

Proceedings of the 6th International Brewing Technology Conference,

Harrogate, North Yorkshire, 421-430.

HAMMOND, J.R.M., 1993. Brewer’s yeast, (Rose, H.A. ve Harrison, J.S. editörler),

The Yeasts, Vol: 5, Academic Pres, London, s. 7-67.

HEARD,G.M. ve FLEET, G.M.,1988. The effects of temperature and pH on the

growth of yeast species during the fermentation of grape juice. Journal of

Applied Bacteriology, 65, 23-28.

HERMAN, P.K., 2002. Stationary phase in yeast. Current Opinion in Microbiology,

5, 602-607.

HORTON, C.E., HUANG, K.-X., BENNETT, G.N. ve RUDOLPH, F.B., 2003.

Heterologous expression of the Saccharomyces cerevisiae alcohol

acetyltransferase genes in Clostridium acetobutylicum and Escherichia coli

for the production of isoamyl acetate. Journal of Industrial Microbiology and

Biotechnology, 30, 427-432.

INOUE, Y., TREVANICHI, S., FUKUDA, K., IZAWA, S., WAKAI, Y. ve

KIMURA, A., 1997. Roles of esterase and alcohol acetyltransferase on

production of isoamyl acetate in Hansenula mrakii. Journal of Agriculture

and Food Chemistry, 45, 644-649.

IWASE, T., MORİKAWA, T., FUKUDA, H., SASAKİ, K. ve YOSHİTAKE, M.,

1995. Production of Fruity Odor by Genus Williopsis. Journal of Brewery

Society of Japan, 90(5), 394-396.

96

JANSSENS, L., DE POOTER, H.L., SCHAMP, N.M. ve VANDAMME, E.J., 1992.

Production of flavours by microorganisms. Process Biochemistry, 27, 195-

215.

JANSSENS, L., DE POORTER, H.L., VANDAMME, E.J. ve SCHAMP, N.M.,

1987. Production of flavours by the yeast Hansenula mrakii. Med. Fac.

Landbouwwet., Rijksuniv. Gent, 54 (4), 1907-1913.

JANSSENS, L., DE POORTER, H.L., DE MEY, L., VANDAMME, E.J. ve

SCHAMP, N.M., 1989. Fusel oil as a precursor for the microbial production

of fruity flavours. Med. Fac. Landbouwwet., Rijksuniv. Gent, 54 (4a), 1387-

1391.

KAJIWARA, Y., OGAWA, K., TAKASHITA, H., OMORI, T., SHIMODA, M. ve

WADA, H., 1997. Intracellular fatty acid formation and alcohol acetyl

transferase gene expression in brewing yeast (Saccharomyces cerevisiae)

treated with heat shock. Journal of Fermentation and Bioengineering, 84(6),

594-598.

KALOGIANNIS, S., IAKOVIDOU, G., LIAKOPOULOU-KYRIAKIDES, M.,

KYRIAKIDIS, D.A. ve SKARACIS G.N., 2003. Optimization of xanthan

gum production by Xanthomonas campestris grown in molasses. Process

Biochemistry, 39(2), 249-256.

KELLY, J., CHAPMAN, S. ve BRERETON, P., 1999. Gas Chromatographic

Determination of Volatile Congeners in Spirit Drinks: Interlaboratory Study.

Journal of AOAC International, 82(6), 1375-1388.

KESHK, S.M.A.S., RAZEK, T.M.A. ve SAMESHIMA, K., 2006. Bacterial

Cellulose Production from Beet Molasses. African Journal of Biotechnology,

5(17), 1519-1523.

KORUKLUOĞLU, M., 1998. Doğal aroma maddeleri üretiminde

mikroorganizmalar. Gıda, 23(1), 48-50.

KRISHNA, S.H., DİVAKAR, S., PRAPULLA, S.G. ve KARANTH, N.G., 2001.

Enzymatic synthesis of isoamyl acetate using immobilized lipaze from

Rhizomucor miehei. Journal of Biotechnology, 87, 193-201.

http://apps.isiknowledge.com/DaisyOneClickSearch.do?product=WOS&search_mode=DaisyOneClickSearch&doc=1&db_id=&SID=N1IBIj9NDfiLPFNpKKE&name=Iakovidou%20G&ut=000186218600014&pos=2

http://apps.isiknowledge.com/DaisyOneClickSearch.do?product=WOS&search_mode=DaisyOneClickSearch&doc=1&db_id=&SID=N1IBIj9NDfiLPFNpKKE&name=Liakopoulou-Kyriakides%20M&ut=000186218600014&pos=3&cacheurlFromRightClick=no

http://apps.isiknowledge.com/DaisyOneClickSearch.do?product=WOS&search_mode=DaisyOneClickSearch&doc=1&db_id=&SID=N1IBIj9NDfiLPFNpKKE&name=Kyriakidis%20DA&ut=000186218600014&pos=4

http://apps.isiknowledge.com/DaisyOneClickSearch.do?product=WOS&search_mode=DaisyOneClickSearch&doc=1&db_id=&SID=N1IBIj9NDfiLPFNpKKE&name=Skaracis%20GN&ut=000186218600014&pos=5

97

KRINGS, U. ve BERGER, R.G., 1998. Biotechnological production of flavours and

fragrances. Applied Microbiology and Biotechnology, 49, 1-8.

KURIYAMA, H. ve KOBAYASHI, H., 1993. Effects of oxygen supply on yeast

growth and metabolism in continuous fermentation. Journal of Fermentation

and Bioengineering, 75, 364-367.

KURTZMAN, C.P., 1998. Pichia E.C. Hansen emend. Kurtzman. (Kurtzman, C.P.

ve. Fell, J.W. editörler) The Yeasts, a Taxonomic Study, 4th ed., Elsevier,

Amsterdam, 273-352.

LANDAUD, S. KATRİLLE, E. ve CORRİEU, G., 2001. Top pressure and

temperature control the fusel alcohol/ester ratio through yeast growth in beer

fermentation. Journal of The Institute of Brewing, 107(2), 107-117.

LAUFENBERG, G., KUNZ, B. ve NYSTROEM, M., 2003. Transformation of

vegetable waste into value added products: (A) the upgrading concept; (B)

practical implementations. Bioresource Technology, 87, 167-198.

LEE, B.H., 1996. Fundamentals of Food Biotechnology. VCH Publishers Inc., USA,

431s.

LEE, K., 2005. A media design program for lactic acid production coupled with

extraction by electrodialysis, Bioresource Technology, 96, 1505-1510.

LEWIS, M.J. ve YOUNG, T.W., 2002. Brewing, 2nd ed., Kluwer Academic/Plenum

Publishers, New York, 398s.

LLAURADO, J., ROZES, N., BOBET, R., MAS, A. ve CONSTANTI, M., 2002.

Low temperature alcoholic fermentations in high sugar concentration grape

musts. Journal of Food Science, 67(1), 268-273.

LONGO, M.A. ve SANROMÁN, M.A, 2006. Production of Food Aroma

Compounds. Food Technology and Biotechnology 44 (3), 335–353.

MASON, A.B. ve DUFOUR, J-P., 2000. Alcohol acetyltranferases and the

significance of ester synthesis in yeast. Yeast, 16, 1287-1298.

MATEO, J.J., JIMENEZ, M., HUERTA, T. ve PASTOR, A., 1991. Contribution of

different yeasts isolated from musts of monastrell grapes to the aroma of

wine. International Journal of Food Microbiology, 14, 153-160.

http://apps.isiknowledge.com/DaisyOneClickSearch.do?product=WOS&search_mode=DaisyOneClickSearch&doc=2&db_id=&SID=N1IBIj9NDfiLPFNpKKE&name=Rozes%20N&ut=000173893100048&pos=2

http://apps.isiknowledge.com/DaisyOneClickSearch.do?product=WOS&search_mode=DaisyOneClickSearch&doc=2&db_id=&SID=N1IBIj9NDfiLPFNpKKE&name=Bobet%20R&ut=000173893100048&pos=3

http://apps.isiknowledge.com/DaisyOneClickSearch.do?product=WOS&search_mode=DaisyOneClickSearch&doc=2&db_id=&SID=N1IBIj9NDfiLPFNpKKE&name=Mas%20A&ut=000173893100048&pos=4

http://apps.isiknowledge.com/DaisyOneClickSearch.do?product=WOS&search_mode=DaisyOneClickSearch&doc=2&db_id=&SID=N1IBIj9NDfiLPFNpKKE&name=Constanti%20M&ut=000173893100048&pos=5&cacheurlFromRightClick=no

98

MAURICIO, J.C., MORENO, J., ZEA, L., ORTEGA, J.M. ve MEDINA, M., 1997.

The Effect of Grape Must Fermentation Conditions on Volatile Alcohols and

Esters Formed by Saccharomyces cerevisiae, Journal of Science of Food and

Agriculture, 75, 155-160.

MAURICIO, J.C., MORENO, J.J., VALERO, E.M., ZEA, L., MEDINA, M. ve

ORTEGA, J.M., 1993. Ester formation and specific activities of in vitro

alcohol acetyltransferase and esterase by Saccharomyces cerevisiae during

grape juice fermentation. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 41,

2086-2091.

MEDEIROS, A.B., PANDEY, A., FREİTAS, R.J.S., CHRİSTEN, P. ve SOCCOL,

C.R., 2000. Optimization of the production of aroma compounds by

Kluyveromyces marxianus in solid-state fermentation using factorial design

and response surface methodology. Biochemical Engineering Journal, 6, 33-

39.

MILLER, T.L. ve CHURCHILL, B.W., 1986. Substrates for large scale

fermentations. (Demain, A.L. ve Solomon, N.A. editörler), Industrial

Microbiology and Biotechnology, American Society for Microbiology,

Washington, D.C., 122-136.

MINGORANCE-CAZORLA, L., CLEMENTE-JIMENEZ, J.M., MARTINEZ-

RODRIGUEZ, S. ve LAS HERAS-VASQUEZ, F.J., 1993. Contribution of

different natural yeasts to the aroma of two alcoholic beverages. World

Journal of Microbiology and Biotechnology, 19, 297-304.

NAGODAWITHANA, T.W., CASTELLANO, C. ve STEINKRAUS, K.H., 1974.

Effect of dissolved oxygen, temperature, initial cell count and sugar

concentration on the viability of Saccharomyces cerevisiae in rapid

fermentations. Applied Microbiology, 28, 383.

NAJAFPOUR, G.D., 2007. Biochemical Engineering and Biotechnology. Elsevier

Press, Amsterdam. s.1-13.

NYKANEN, L., 1986. Formation and occurance of flavor compounds in wine and

distilled alcoholic beverages. American Journal of Enology and Viticulture,

37(1), 84-95.

99

OSHITA, K., KUBATO, M., UCHIDA, M. ve ONO, M., 1995. Clarification of the

relationship between fusel alcohol formation and amino acid assimilation by

brewing yeast using 13C-labeled amino acid. Proceedings of the 25th

European Brewery Congress, Brussels, IRL, Oxford, s 387-394.

OUCHI, K., YAMAMOTO, Y., TAKAGISHI, M. ve AKIYAMA, H., 1980.

Regulation of isoamyl alcohol formation via Erlich pathway in

Saccharomyces cerevisiae. Journal of Fermentation Technology, 58, 301-309.

OUGH, C.S. ve AMERINE, M.A., 1967. Studies with controlled fermentation. X.

Effect of fermentation temperature on some volatile compounds. American

Journal of Enology and Viticulture,12,117-128.

OUGH, C.S., 1966. Fermentation rates of grape juice. III. Effects of initial ethyl

alcohol, pH and fermentation temperature. American Journal of Enology and

Viticulture, 17, 74.

ÖZDAMAR, K., 1999. Paket programlar ile istatistiksel veri analizi. Kaan Kitabevi,

Eskişehir, 535s.

PANDEY, A., SOCCOL, R.C., NIGAM, P. ve SOCCOL, V.T., 2000.

Biotechnological potential agro-industrial residues. I. Sugarcane bagasse.

Biosesource Technology, 74, 69-80.

PASSOTH, V., FREDLUND, E., DRUVEFORS, U.A. ve SCHNURER, J., 2006.

Biotechnology, physiology and genetics of the yeast Pichia anomala. FEMS

Yeast Research, 6, 3-13.

PEDDIE, A.B.H., 1990. Ester formation in brewery fermentations. Journal of

Institute of Brewing, 96, 327-331.

PEKİN, B., 1993. Biyokimya Mühendisliği (Biyoteknoloji). Ege Üniversitesi Kimya

Fakültesi Yayınları, No: 3, Mas Ambalaj, s.1-89.

PEREZ, E.R., CARDOSO, D.R. ve FRANCO, D.W., 2001. Análıse Dos Álcooıs,

Ésteres E Compostos Carbonílıcos Em Amostras De Óleo Fúsel, Quim. Nova,

Vol. 24, No. 1, 10-12.

PLATA, C., MILLAN, C., MAURICIO, J.C. ve ORTEGA, J.M., 2003. Formation of

ethyl acetate and isoamyl acetate by various spicies of wine yeasts. Food

Microbiology, 20, 217-224.

100

QUILTER, M.G., HURLEY, J.C., LYNCH, F.J. ve MURPHY, M.G., 2003. The

production of isoamyl acetate from amyl alcohol by Saccharomyces

cerevisiae. Journal of Insitute of Brewing, 109 (1), 34-40.

REINECCIUS, G., 2006. Flavor Chemistry and Technology, CRC Press, Boca

Raton. s.123-298.

RIBÉREAU-GAYON, P., DUBOURDIEU, D., DONÈCHE, B. ve LONVAUD, A.,

2006. Handbook of Enology, Vol. 1, 2nd edition, The Microbiology of Wine

and Vinifications, Wiley, 512s.

RIBE´REAU-GAYON, J., PEYNAUD, E., RIBE´REAU-GAYON, P. ve

SUDRAUD, P., 1975. Sciences et Techniques du vinTraite´ d’Oenologie II.

Dunod, Paris.

RIBE´REAU-GAYON, P., DUBOURDIEU, D., DONE`CHE, B. VE LONVAUD,

A., 2000. Handbook of Enology. The Microbiology of Wine and

Vinifications, vol. I. Wiley, West Sussex, England.

RIVAS, B., MOLDES, A.B., DOMINGUEZ, J.M. ve PARAJO, J.C., 2004.

Development of culture medium containing spent yeast cells of Debaromyces

hansenii and corn step liquor for lactic acid production with Lactobacillus

rhamnosus. International Journal of Food Microbiology, 97, 93-98.

ROJAS, V., GIL, J.V., PINAGA, F. ve MANZANARES, P., 2001. Studies on

acetate ester production by non-Saccharomyces wine yeasts. International

journal of Food Microbiology, 70, 283-289.

ROUKAS, T., 1998. Pretreatment of beet molasses pullulan production to increase

pollulan production. Process Biochemistry, 33(8), 805-810.

SAERENS, S.M.G., DELVAUX, F., VERSTREPEN, K.J., DIJCK, P.V.,

THEVELEIN, J.M. ve DELVAUX, F.R., 2008. Parameters affecting ethyl

ester production by Saccharomyces cerevisiae during fermentation. Applied

and Environmental Microbiology, 74(2), 454-461.

SHARF, R. ve MARGALITH, P., 1983. The effect of temperature on spontaneous

wine fermentation. European Journal of Applied Microbiology and


http://www.amazon.com/exec/obidos/search-handle-url/ref=ntt_athr_dp_sr_1?_encoding=UTF8&search-type=ss&index=books&field-author=Pascal%20Rib%E9reau-Gayon

http://www.amazon.com/exec/obidos/search-handle-url/ref=ntt_athr_dp_sr_2?_encoding=UTF8&search-type=ss&index=books&field-author=Denis%20Dubourdieu

http://www.amazon.com/exec/obidos/search-handle-url/ref=ntt_athr_dp_sr_3?_encoding=UTF8&search-type=ss&index=books&field-author=B.%20Don%E8che

http://www.amazon.com/exec/obidos/search-handle-url/ref=ntt_athr_dp_sr_4?_encoding=UTF8&search-type=ss&index=books&field-author=A.%20Lonvaud

101

STANBURY, P. F., WHITAKER, A. ve HALL, S. J., 1995. Principles of

Fermentation Technology, 2nd ed., Pergamon, U. K., 357s.

TABACHNICK, J. ve JOSLYN, M.A., 1953. Formation of esters by yeast. I. The

production ethyl acetate by standing surface cultures of Hansenula anomala.

Journal of Bacteriology, 65, 1-9.

TELEFONCU, A., 1995. Biyoteknoloji. Ege Üniversitesi Fen Fakültesi Yayınları,

No: 152, Ege Üniversitesi Basımevi, İzmir, 357s.

THURSTON, P.A., QUAİN, D.E. ve TUBB, R.S., 1982. Lipid-Metabolism and The

Regulation of Volatile Ester Synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Journal

of the Institute of Brewing, 88(2), 90-94.

TORIJA, M.J., ROZE`S, N., POBLET, M., GUILLAMO´N, J.M. ve MAS, A., 2003.

Effects of fermentation temperature on the strain population of

Saccharomyces cerevisiae. International Journal of Food Microbiology, 80,

47-53.

VAN URK, H., POSTMA, E., SCHEFFERS, W.A. ve VAN DIJKEN, J., 1989.

Glucose transport in Crabtree-positive and Crabtree-negative yeasts. Journal

of General Microbiology, 135, 2399-2406.

VADALI, R.V., HORTON, C.E., RUDOLPH, F.B., BENNETT, G.N. ve SAN, K.–

Y., 2004. Production of isoamyl acetate in ackA-pta and/or ldh mutants of

Ecsherichia coli with overexpression of yeast ATF2. Applied Microbiology

and Biotechnology, 63(6), 698-704.

VALERO, E., MOYANO, L., MILLAN, M.C., MEDINA, M. ve ORTEGA, J.M.,

2002. Higher alcohol and ester production by Saccharomyces cerevisiae.

Influence of initial oxygenation of the grape must. Food Chemistry, 78, 57-

61.

VANDAMME, E. J. ve SOETAERT, W., 2002. Bioflavours and fragrances via

fermentation and biocatalysis. Journal of Chemical Technology and


VANDAMME, E.J., 2003. Bioflavours and fragrances via fungi and their enzymes.

Fungal Diversity, 13, 153-165.

102

VANDERHAEGEN, B., NEVEN, H., COGHE, S., VERSTREPEN, K. J.,

DERDELINCKX, G. ve VERACHTERT, H., 2003. Bioflavouring and beer

refermentation. Applied Microbiology and Biotechnology, 62, 140-150.

VERSTREPEN, K.J., DERDELİNCKX, G., DUFOUR, J-P., WİNDERİCKX, J.,

THEVELEİN, J.M., PRETORİUS, I.S. ve DELVAUX, F.R., 2003a. Flavor-

active esters: Adding fruitiness to beer. Journal of Bioscience and

Bioengineering, 96 (2), 110-118.

VERSTREPEN, K.J., DERDELİNCKX, G. ve DELVAUX, F.R., 2003b. Esters in

beer-part 2: Controlling ester levels during beer fermentation: a biochemical

approach. Cerevisiae, 28 (4).

WAITES, M. J., MERGAN, N. L., ROCKEY, J. S. ve HIGTON, G., 2001. Industrial

Microbiology: An Introduction, Blackwell Science Ltd., USA, 288s.

WALES, D.S., CARTLEDGE, T.G. ve LLOYD, D., 1980. Effect of Glucose and

aerobiosis on the activities and subcellular distribution of Tricarboxylic acid

cycle and associated enzymes in Saccharomyces carlsbergensis. Journal of

General Microbiology, 116, 93-98.

WINTERHALTER, P. ve SCHREIER, P., 1993. Biotechnology: Challenge for the

Flavor Industry. Flavor Science, American Chemical Society, 225-258.

XU, P., HUA, D. ve MA, C., 2007. Microbial transformation of propenylbenzenes

for natural flavour production. Trends in Biotechnology 25, 571-576.

YOSHIOKA, K. ve HASHIMOTO, N., 1984. Ester Formation By Brewers-Yeast

During Sugar Fermentation, Agricultural and Biological Chemistry, 48 (2):

333-340.

YOUNIS, S.O. ve STEWART, G.G., 1998. Sugar uptake and subsequent ester and

higher alcohol production by Saccaharomyces cerevisiae. Journal of Institute

of Brewing, 104, 255-264.

ZÖHRE, D. E. ve ERTEN, H., 2003. The influence of Kloeckera apiculata and

Candida pulcherrima yeasts on wine fermentation. Process Biochemistry, 38

(3): 319-324.

http://apps.isiknowledge.com/WoS/CIW.cgi?SID=X1dp3fC2NCJKPaI19aJ&Func=Abstract&doc=1/21



103

ÖZGEÇMİŞ

1975 yılında Şanlıurfa’da doğdu. İlk öğrenimini Şanlıurfa’da tamamladıktan

sonra 1994 yılında İnönü Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Gıda Mühendisliği

Bölümü’nde lisans öğrenimine başladı. 1998 yılında bu bölümden mezun olduktan

sonra aynı yıl Harran Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği

Anabilim Dalı’nda Yüksek Lisans öğrenimine başladı. 2000 yılında İnönü

Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü’ne araştırma

görevlisi olarak atandı. 2001 yılında yüksek lisans öğrenimini tamamladıktan sonra

2003 yılında Yüksek Öğretim Kurulu Kanunu’nun 35. maddesi gereğince Çukurova

Üniversitesi Ziraat Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü’ne atanarak doktora

öğrenimine başladı. Halen aynı bölümde araştırma görevlisi olarak akademik

hayatına devam etmektedir.

Documents

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİAroma maddelerinin belirlenmesinde Gaz Kromatografisi-Alev İyonlaşma Dedektörü kullanılmıştır. Elde edilen bulgulara göre ele alınan 3 maya ırkı