UJI TOKSISITAS FRAKSI DARI SPONGS LAUT Xestospongia … · tidak dapat beradaptasi saat dipindahkan dari media air laut dari tempat penetasan ke dalam media air laut di botol ampul

UJI TOKSISITAS FRAKSI DARI SPONGS LAUT Xestospongia DENGAN METODE BRINE SHRIMP

TEST (BST)

Oleh:

FRANSISCHA GALUH KARTIKASARI

1506100002

Dosen Pembimbing:

Awik Puji Dyah Nurhayati S.Si, M.Si

Drs. Agus Wahyudi M.S

LATAR BELAKANG

keanekaragaman hayati

laut Indonesia

melimpah

Spons Genus Xestospongia metabolit sekunder

Alkaloid, polycyclic Quinones dan

hydroquinones, derivate

polyacetylenic, aminoalkohol, dan

sterol (aragusterol) (Laurent et

al,2006), oxaquinoleridinesl, β-

Carbdine, terpenoid, laktones

(Kondracki et al,1992)

mempertahankan

diri dari predator

memiliki aktivitas farmakologis

dapat dipisahkan melalui metode

Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Fraksi-fraksi

Diuji ketoksikannya

dengan metode Brine

Shrimp Test (BST)

Menggunakan

Artemia salinaUji pendahuluan

antikanker

Menguji toksisitas dari fraksi yang didapat dari ekstrak

Xestospongia dengan metode Brine Shrimp Test (BST)

Batasan masalah dalam penelitian ini antara lain:

1. menguji secara kualitatif senyawa Xestospongia

2. menguji toksisitas dari fraksi dari hasil KLT pada Xestospongia

Tujuan dari penelitian ini antara lain:

1. untuk mengetahui jenis senyawa dari Xestospongia secara kualitatif

2. untuk mengetahui toksisitas dari fraksi Xestospongia dengan menggunakan metode

Brine Shrimp Test (BST)

Permasalahan

Batasan masalah

Tujuan Penelitian

Manfaat dari penelitian ini diharapkan dapat

digunakan sebagai pengembangan alternatif

pengobatan antikanker dengan menggunakan

produk dari spons laut.

Manfaat Penelitian

METODOLOGI

Waktu Dan Tempat Penelitian

Penelitian dilaksanakan pada bulan April-Juli 2010. UjiKromatografi Lapis Tipis (KLT) dan Kromatografi lapisTipis Preparatif (KLTP) dilakukan di labolatorium KimiaSintesis Fakultas Farmasi UNAIR, Uji kualitatifdilakukan diLabolatorium Farmakognosis FakultasFarmasi UNAIR dan uji Brine Shrimp Test (BST)dilakukan di Labolatorium Zoologi Biologi ITS.

Cara Kerja

1. Isolasi Senyawa Bioaktif

Ekstrak kasar

Xestospongia dari

labolatorium zoologi

biologi ITS yang

telah kering diambil 1

gr

dilarutkan

etanol ±2

ml

Larutan ekstrak dalam etanol, ditotolkan pada

pelat KLT menggunakan pipa kapiler dengan

jarak ± 1 cm dari dasar

Setelah totolan kering,lempengan dimasukkan ke

dalam bejana dan dielusi hingga jarak ± 1 cm dari

tepi atas dengan fase gerak yang sesuai

kemudian di deteksi dengan sinar UV 254 nm dan

UV 365 nm

2. Uji Kualitatif

disemprot dengan anisaldehid, uap amoniak, besi

(III) klorida, Lieberman-Buchard dan

Dragendorff.

Dihitung nilai Rf (Retardation Factor) dengan menggunakan rumus:

Rf = Jarak yang ditempuh substansi

Jarak yang ditempuh oleh pelarut

senyawa yang terpisahkan.

3. Isolasi Senyawa dengan Kromatografi Lapis Tipis

Preparatif (KLTP)

Ekstrak Xestospongia

sp. yang dilarutkan

dalam ethanol

dielusi dengan fase

gerak yang didapat dari

Kromatografi lapis

Tipis (KLT) hingga

jarak ± 2 cm dari tepi

atas

ditotolkan pada Plat KLTP

berupa garis lurus

menggunakan pipa kapiler

dengan jarak ± 2 cm dari dasar

Senyawa yang berupa fraksi

dikerok dengan menggunakan

spatula berdasarkan nilai Rf yang

didapat dari KLT

dilarutkan dalam etanol

dan disaring dengen

kertas saring

Hasil penyaringan

dikeringkan dalam aeratorHasil berupa fraksi

2. Uji Toksisitas

Fraksi yang didapat dari hasil

Kromatografi Lapis Tipis

Preparatif (KLTP)

dibuat dalam konsentrasi 1000

ppm, 500 ppm, 250 ppm, 100

ppm, 10 ppm dan 0 ppm (kontrol)

1000 ppm 500 ppm 250 ppm 100 ppm 10 ppmkontrol

25 ml+75 ml

50 ml+50 ml

10 ml+90 ml

1 ml+99 ml

ditimbang

Telur Artemia salina

ditetaskan dalam wadah yang berisi 500

ml air laut

dengan kepadatan 5 g/L

diaerasi

selama 48 jam

Setelah menetas, diberi pakan berupa ragi

dengan konsentrasi 3 mg dalam 5 ml air

laut sebanyak 1 tetes

Telur menetas dalam jangka waktu 24-36 jam

Larva umur 48 jam

Digunakan dalam uji BST

3. Uji Brine Shrimp Test (BST)

kontrol 1000 ppm 500 ppm 250 ppm100 ppm 10 ppm

diambil

1 ml

diambil

1 ml

diambil

1 ml

diambil

1 ml

diambil

1 ml

diambil

1 ml

Pada fraksi hasil Kromatografi lapis Tipis (KLT)

5 ml air

laut

5 ml air

laut

5 ml

air laut

5 ml

air

laut5 ml air

laut

5 ml air

laut

masing-masing tabung reaksi

dimasukkan 10 ekor larva

Artemia salina umur 48 jam

diamati jumlah Artemia salina yang mati

dengan kaca pembesar selama 24 jam

dilakukan 3 kali ulangan

dihitung % kematian

Rumus yang digunakan:Jumlah Larva yang mati

%Kematian = x 100%

Jumlah hewan yang diuji(Meyer et al.,1982)

Rumus yang digunakan:Jumlah larva yang mati – jumlah larva yang mati pada kontrol

%kematian = x 100%

Jumlah Hewan uji

(Meyer et al.,1982)

ditentukan besarnya LC50 yang dihitung

dengan analisis probit menggunakan

MINITAB

hasil

Bila pada kontrol ada larva yang

mati

Bila pada kontrol tidak ada larva

yang mati

Rancangan Penelitian dan Analisis Data

Penelitian menggunakan rancangan eksploratif dengan memberi perlakuan

konsentrasi ekstrak spons sebesar 1000 ppm, 500 ppm, 250 ppm, 100 ppm,10

ppm dan 0 ppm sebagai kontrol. Masing-masing perlakuan diulang sebanyak 3

kali.

Data Hasil

Tabel Analisa Kualitatif Jenis Senyawa

Jenis Senyawa Warna

terpenoid Merah atau ungu

steroid biru

fenolik biru ungu

flavonoid warna jingga sampai merah

alkaloid orange sampai merah bata

Persentase kematian A. salina kemudian dilakukan analisis probituntuk mengetahui nilai LC50. Analisis probit menggunakan programMINITAB. Suatu ekstrak dianggap memiliki aktivitas toksik danberpotensi untuk diteliti lebih lanjut jika harga LC50 < 1000 ppm (Meyeret al.,1982).

Analisa Data

Hasil KLT diperoleh spot fraksi sebanyak 4, dengan pelarut kloroform dan aseton (5:1) (v/v)

Kloroform memiliki tingkat kepolaran yang lebih rendah dari pada aseton sehingga gabungan keduanya menghasilkan kepolaran yang berbeda Kepolaran yang dihasilkan dari gabungan kedua pelarut rendah sehingga senyawa yang dapat larut pada pelarut tersebut juga memiliki tingkat kepolaran yang rendah

Plat KLT yang telah dielusi dengan pelarut kloroform dan aceton (5:1) (v/v) berpendar ketika diamati dengan UV pada panjang gelombang 254 nm memiliki energi relatif lebih kuat daripada 365 nm

Hasil Dan pembahasan

Spot noda (fraksi) berpendar pada panjang

gelombang 254 nm

Spot noda (fraksi) tidak berpendar pada

panjang gelombang 365 nm

Fraksi 4

Fraksi 3

Fraksi 2

Fraksi 1

Hasil pada Kromatografi Lapis Tipis(KLT)

Jenis senyawa pada spot fraksi yang telah diperoleh adalah senyawa terpenoid yang ditandai dengan adanya warna ungu setelah dilakukan penyemprotan dengan reagen anisaldehid (Tabel 4.1).

Tabel 4.1. Hasil kualitatif jenis senyawa


Jenis Senyawa Warna Hasil Uji

terpenoid Merah atau ungu +

steroid biru -

fenolik biru ungu -

flavonoid warna jingga sampai merah -

alkaloid orange sampai merah bata -


Hasil

penyemprotan

dengan Liberman

Buchart

Hasil

penyemprotan

dengan

Dragendroff

Hasil

penyemprotan

dengan

anisaldehid

Hasil

penyemprotan

dengan besi (III)

klorida

Hasil

penyemprotan

dengan uap

amonia

Dari harga Rf yang di dapat dari KLT yaitu ½

Nilai Rf yang didapat dari KLT sama dengan Nilai Rf pada Kromatografi lapis Tipis preparatif (KLTP) yang digunakan untuk mengambil senyawa pada KLTP

Rf menunjukkan perjalanan senyawa yang dipisahkan relative terhadap perjalanan pelarut


Hasil uji toksisitas fraksi spons laut Xestospongia menujukkan % kematian terhadap larva

Artemia salina yang ditunjukkan dalam Tabel 4.2

Tabel 4.2. Hasil Uji Brine Shrimp Test (BST) untuk fraksi yang didapat dari Kromatografi

Lapis Tipis (KLT)

Konsentrasi Pengulangan

Jumlah larva Artemia

yang diuji

Jumlah Larva

Artemia yang Mati jumlah rata-rata

%

kematian

0

0

0

1

2

3

10

10

10

0

1

2

3 1.00 10

10

10

10

1

2

3

10

10

10

2

5

3

10 3.33 23.3

100

100

100

1

2

3

10

10

10

3

4

4

11 3.67 26.7

250

250

250

1

2

3

10

10

10

5

4

4

13 4.33 33.3

500

500

500

1

2

3

10

10

10

6

4

4

14 4.67 36.67

1000

1000

1000

1

2

3

10

10

10

5

6

6

17 5.67 46.67

Hasil uji Toksisitas Fraksi Xestospongia sp. dengan Metode


Grafik 4.1 Probability plot untuk jumlah larva Artemia yang mati

Konsentrasi

Pe

rce

nt

7500500025000-2500-5000

99

95

90

80

70

60

50

40

30

20

10

5

1

Table of Statistics

Mean 692.329

StDev 1027.53

Median 692.329

IQ R 1386.11

Probability Plot for Jumlah Larva Artemia yang Mati

Probit Data - ML Estimates

Normal - 95% CI



Larva Artemia yang mati pada kontrol larva pada kondisi yang lemahtidak dapat beradaptasi saat dipindahkan dari media air laut dari

tempat penetasan ke dalam media air laut di botol ampul.

Larva Artemia yang mati pada kontrol mengalami penurunan aktivitas.Semakin lama, Artemia dalam kontrol semakin lemah dan terus berada

di dasar tabung.

Larva Artemia dengan perlakuan fraksi (ppm) mengalami disorientasigerak (gerakannya tidak teratur)

Semakin tinggi nilai konsentrasi fraksi ekstrak mortalitas Artemia jugasemakin tinggi (Tabel 4.1)

Harbourne (1994) semakin tinggi konsentrasi ekstrak, maka sifat toksiknyaakan semakin tinggi.



Dari hasil perhitungan Analisa Probit dengan menggunakan MINITAB,

didapat nilai LC50 pada ekstrak fraksi Xestospongia ini adalah 692.329

ppm.

Meyer (1982) suatu ekstrak bersifat toksik bila nilai LC50 ≤1000 ppm

sehingga ekstrak dari fraksi Xestospongia dapat dikatakan toksik.

Terpenoid bersifat toksik pada sebagian besar komponen terpenoid memiliki

struktur lipofilik menyebabkan kerusakan membran sel sehingga

menyebabkan kematian sel.



Sifat nonpolar terpenoid mudah menembus membran sel ataumembran organel dalam sel pada sisi hidrofobik membentukstruktur misel terbentuknya ikatan antara senyawa nonpolar(terpenoid) dengan bagian nonpolar dari membran sel

menyebabkan permeabilitas membran sel terganggu.

Terpenoid memiliki efek sinergis bagi toksin lain denganbertindak sebagai solven untuk memfasilitasi toksin bergerakmelalui membran (Dudareva dan Gershenzon, 2007 dalam Imaria,2008).



Terpenoid merusak DNA merusak ikatan dalam DNA menjadiDNA Single-strand dan dapat menghambat proses mitosis sel (Sladić dan

Gašić, 2006)

Senyawa bioaktif sebagai zat toksik dapat masuk melalui membransel larva Artemia (secara difusi), membran sel : untuk mengaturperpindahan zat ke dalam dan keluar sel pada organela sel

Senyawa toksik masuk menyebabkan terjadinya perusakanatau modifikasi permeabilitas membrane dan mengacaukan systemperpindahan zat dengan cara turut campur dalam pembawa danproduksi ATP mengganggu proses biokimiawi dan fisiologi (Connell dan

Miller,1995)



Masuknya zat toksik melalui saluran pencernaan Artemia bersifatpenyaring tidak selektif (non selective filter feeder) sehingga apa sajayang dapat masuk mulut artemia seakan-akan menjadi makanannya(Isnansetyo dan Kurniastuty,1995 dalam Widyastuti,2005)

Senyawa yang masuk dapat berinteraksi dengan target (misalnya enzim,lemak, membran sel, asam nukleat) mempengaruhi mekanisme tubuh yang akhirnya dapat menyebabkan kematian (Connell dan

Miller,1995)



Masuknya senyawa toksik melalui pernafasan saat pertukarangas melewati permukaan permeable pada bagian tengah tempatkeluarnya di thoraciz appendages

Metabolisme sekunder yang bersifat polar relatif lebih toksik daripada yang bersifat non polar (Nurhayati et al.,2006)

Senyawa metabolit sekunder yang bersifat polar alkaloid dan flavonoid

Senyawa yang bersifat non polar terpenoid dan steroid (Sastroamidjojo

dalam Nurhayati et al.,2006)



Kesimpulan

Hasil dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa hasil kualitatif

pada Rf ½ merupakan terpenoid. Fraksi tersebut mempunyai

nilai LC50 sebesar 692.329 ppm

Saran

Perlu diadakan penelitian terhadap sel kanker untuk mengetahui

potensi senyawa tersebut sebagai anti kanker

Kesimpulan dan Saran

Documents

UJI TOKSISITAS FRAKSI DARI SPONGS LAUT Xestospongia … · tidak dapat beradaptasi saat dipindahkan dari media air laut dari tempat penetasan ke dalam media air laut di botol ampul