Upload
trantuong
View
234
Download
4
Embed Size (px)
Citation preview
UJI MUTAGENISITAS HASIL PARTISI EKSTRAK KLOROFORM
DAUN AMBRE (Geranium radula Cavan.) TERHADAP
BAKTERI Salmonella typhimurium TA 98, TA 100 DAN TA 1535
SERTA PROFIL KANDUNGAN KIMIA BAGIAN TERAKTIF
Skripsi
Untuk memenuhi sebagian persyaratan guna memperoleh gelar Sarjana Sains
Oleh:
Mita Mutia Rahman
NIM. M0406041
JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS SEBELAS MARET
SURAKARTA
2010
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING
SKRIPSI
UJI MUTAGENISITAS HASIL PARTISI EKSTRAK KLOROFORM
DAUN AMBRE (Geranium radula Cavan.) TERHADAP
BAKTERI Salmonella typhimurium TA 98, TA 100 DAN TA 1535
SERTA PROFIL KANDUNGAN KIMIA BAGIAN TERAKTIF
Oleh : Mita Mutia Rahman
M 0406041
Telah disetujui oleh Tim Pembimbing
Tanda Tangan
Pembimbing I : Dr. Artini Pangastuti, M.Si ........................ NIP. 197505312000032001 Pembimbing II : Rita Rakhmawati, S.Farm., M.Si.,Apt. ........................ NIP. 198005102005012002
Surakarta, Mei 2010
Mengetahui
Ketua Jurusan Biologi
Dra. Endang Anggarwulan, M. Si NIP. 195003201978032001
PENGESAHAN
SKRIPSI
UJI MUTAGENISITAS HASIL PARTISI EKSTRAK KLOROFORM
DAUN AMBRE (Geranium radula Cavan.) TERHADAP
BAKTERI Salmonella typhimurium TA 98, TA 100 DAN TA 1535
SERTA PROFIL KANDUNGAN KIMIA BAGIAN TERAKTIF
Oleh : Mita Mutia Rahman
M 0406041
Telah dipertahankan di depan Tim Penguji pada tanggal 26 Maret 2010
dan dinyatakan telah memenuhi syarat Surakarta, ……………
Penguji I
Widya Mudyantini, M.Si., 197305051999032001
Penguji II
Tjahjadi Purwoko, M.Si., 197011302000031002
Penguji III
Dr. Artini Pangastuti, M.Si. NIP. 197505312000032001
Penguji IV
Rita Rakhmawati, S.Farm., M.Si.,Apt.
NIP. 198005102005012002
Mengesahkan
Dekan FMIPA UNS
Prof. Drs. Sutarno, M.Sc. Ph.D. NIP. 196008091986121001
Mengetahui Ketua Jurusan Biologi
Dra. Endang Anggarwulan, M.Si. NIP. 195003201978032001
PERNYATAAN
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi ini adalah hasil penelitian saya sendiri
dan tidak terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar
kesarjanaan di suatu perguruan tinggi, serta tidak terdapat karya atau pendapat
yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali secara tertulis diacu
dalam naskah ini dan disebutkan dalam daftar pustaka.
Apabila dikemudian hari dapat ditemukan adanya unsur penjiplakan maka gelar
kesarjanaan yang telah diperoleh dapat ditinjau dan/atau dicabut.
Surakarta, Mei 2010
Mita Mutia Rahman
NIM. M0406041
UJI MUTAGENISITAS HASIL PARTISI EKSTRAK KLOROFORM DAUN AMBRE (Geranium radula Cavan.) TERHADAP
BAKTERI Salmonella typhimurium TA 98, TA 100 DAN TA 1535 SERTA PROFIL KANDUNGAN KIMIA BAGIAN TERAKTIF
Mita Mutia Rahman
Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,
Universitas Sebelas Maret, Surakarta
ABSTRAK
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui efek mutagenik hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre terhadap bakteri uji Salmonella typhimurium TA 98, 100 dan 1535 dan profil kandungan kimia teraktif dari hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre yang menunjukkan sifat mutagenik terbesar.
Penelitian ini menggunakan metode Ames dengan bakteri termutasi Salmonella typhimurium TA 98 sebagai indikator frameshift mutation dan Salmonella typhimurium 100 dan 1535 sebagai indikator mutasi substitusi pasangan basa. Sampel yang diuji adalah hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre bagian larut dan bagian tidak larut wasbensin dengan konsentrasi 10, 100, 500 dan 1000 µg/mL.
Hasil uji mutagenisitas bagian larut wasbensin ekstrak kloroform daun Ambre yang diuji dengan menggunakan bakteri Salmonella typhimurium TA 100 dan galur TA 1535 dapat menyebabkan mutasi substitusi pasangan basa pada konsentrasi 100 µg/mL dan 500 µg/mL dan yang diuji dengan menggunakan bakteri Salmonella typhimurium TA 98 dapat menyebabkan frameshift mutation pada konsentrasi 10 µg/mL. Hasil uji mutagenisitas bagian tidak larut wasbensin ekstrak kloroform daun Ambre yang diuji dengan menggunakan bakteri Salmonella typhimurium TA 100 dan galur TA 1535 tidak dapat menyebabkan mutasi substitusi pasangan basa dan yang diuji dengan menggunakan bakteri Salmonella typhimurium TA 98 dapat menyebabkan frameshift mutation pada konsentrasi 10 µg/mL.
Hasil uji deteksi bagian larut wasbensin pada plat KLT dengan berbagai deteksi senyawa semprot menunjukkan hasil positif untuk deteksi terpenoid menggunakan vanilin-H2SO4 dan flavonoid menggunakan FeCl3. Senyawa terpenoid dan flavonoid ini diduga merupakan senyawa yang menyebabkan mutasi. Kata kunci: Geranium radula Cavan., metode Ames, frameshift mutation, mutasi
substitusi pasangan basa, partisi.
MUTAGENIC TEST OF PARTITION CHLOROFORM EXTRACT RESULT OF AMBRE LEAVES (Geranium radula Cavan.) TO THE
BACTERIA Salmonella typhimurium TA 98, TA 100 AND TA 1535 AND PROFILE OF THE MOST ACTIVE PART OF CHEMISTRY COMPOUND
Mita Mutia Rahman
Department of Biology, Faculty of Mathematic and Science, University of Sebelas Maret, Surakarta
ABSTRACT
The purpose of research was to know the mutagenic effect of partition chloroform extract of Ambre leaves to the tested bacteria Salmonella typhimurium TA 98, TA 100 and TA 1535 and profile of the most active part of bioactive showing the biggest mutagenic characteristic.
The research used Ames method with mutated bacteria Salmonella typhimurium TA 98 as frameshift mutation indicator and Salmonella typhimurium 100 and 1535 as substitution mutation of base pair indicator. Tested sample was the result of partition chloroform extract of Ambre leaves of the dissolved and non dissolved part in wasbensin at concentration of 10, 100, 500, and 1000 µg/ml.
Mutagenic test result showed chloroform extract of Ambre leaves of the dissolved part in wasbensin used Salmonella typhimurium TA 100 and 1535 could cause substitution mutation of base pair in concentration 100 µg/mL and 500 µg/mL and used Salmonella typhimurium TA 98 could cause frameshift mutation in concentration 10 µg/mL. Mutagenic test result showed chloroform extract of Ambre leaves of non dissolved part in wasbensin used Salmonella typhimurium TA 100 and 1535 couldn’t cause substitution mutation of base pair and used Salmonella typhimurium TA 98 could cause frameshift mutation in concentration 10 µg/mL.
Result of detection on result compound of partition chloroform extract of Ambre leaves of dissolved part in wasbensin on KLT plat with various detection of sprayed compound showed a positive result for detection of terponoid used vanillin-H2SO4 and flavonoid used FeCl3. Terpenoid and flavonoid presumed as compound that causing mutation.
Keywords: Geranium radula Cavan., Ames method, frameshift mutation,
substitution mutation of base pair, partition.
MOTTO
Dengan menyebut nama Allah yang maha pengasih dan penyayang (Al-Fatihah ayat 1)
Allah tidak membebani seseorang melainkan sesuai dengan kesanggupannya (Al-Baqarah ayat 286)
Rahmat sering datang kepada kita dalam bentuk kesakitan, kehilangan dan kekecewaan;
tetapi kalau kita sabar, kita segera akan melihat bentuk aslinya. (Joseph Addison)
Belajarlah dari kesalahan orang lain. Anda tak dapat hidup cukup lama untuk melakukan
semua kesalahan itu sendiri. (Martin Vanbee)
Orang-orang yang sukses telah belajar membuat diri mereka melakukan hal yang harus dikerjakan ketika hal itu memang harus dikerjakan, entah mereka menyukainya atau tidak.
(Aldus Huxley)
Bersikaplah kukuh seperti batu karang yang tidak putus-putusnya dipukul ombak. Ia tidak saja tetap berdiri kukuh, bahkan ia menenteramkan amarah ombak dan gelombang itu.
(Marcus Aurelius)
Jadilah kamu manusia yang pada kelahiranmu semua orang tertawa bahagia, tetapi hanya kamu sendiri yang menangis; dan pada kematianmu semua orang menangis sedih, tetapi
hanya kamu sendiri yang tersenyum. (Mahatma Gandhi)
Kita melihat kebahagiaan itu seperti pelangi, tidak pernah berada di atas kepala kita sendiri,
tetapi selalu berada di atas kepala orang lain. (Thomas Hardy)
PERSEMBAHAN
Skripsi ini aku persembahkan untuk
Allah SWT yang menjadikan aku lebih sabar, lebih semangat menjalani hidup dan selalu yakin bahwa Allah selalu memberiku yang terbaik.
Bapak Dadun Abdurahman dan Ibu Iis Nuriah yang selalu mendukungku dengan doa-doa
terbaiknya, mudah-mudahan aku bisa memberi yang terbaik untuk kalian
Kakakku Tika Kandita Rahman, Adik-adiku Amelia Rahman dan Naura Azkiya Rahman
KATA PENGANTAR
Segala puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas segala
limpahan rahmat, karunia serta hidayah-Nya yang tak tehingga sehingga penulis
dapat menyelesaikan penelitian dan penyusunan skripsi yang berjudul : “Uji
Mutagenisitas Hasil Partisi Ekstrak Kloroform Daun Ambre (Geranium
radula Cavan.) terhadap Bakteri Salmonella typhimurium TA 98, TA 100 dan
TA 1535 Serta Profil Kandungan Kimia Bagian Teraktif”. Penyusunan skripsi
ini merupakan suatu syarat untuk memperoleh gelar kesarjanaan strata 1 (S1) pada
Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas
Sebelas Maret Surakarta.
Dalam pelaksanaan penelitian maupun penyusunan skripsi ini penulis
mendapatkan banyak masukan, bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak yang
sangat bermanfaat baik secara langsung maupun tidak langsung. Oleh karena itu
pada kesempatan ini penulis ingin menyampaikan terima kasih yang setulusnya
kepada:
Prof. Drs. Sutarno, M.Sc. Ph.D., selaku dekan FMIPA Universitas Sebelas
Maret Surakarta atas ijin penelitian untuk keperluan skripsi.
Dra. Endang Anggarwulan, M.Si., selaku Ketua Jurusan Biologi FMIPA
Universitas Sebelas Maret Surakarta yang telah memberikan arahan serta ijin
penelitian skripsi.
Tim Research Grand PHK A2 Jurusan Biologi FMIPA UNS, atas
kesempatan dan fasilitas sehingga penelitian ini dapat berjalan dengan lancar.
Dr. Okid Parama Astirin, MS., selaku pembimbing akademik yang telah
memberikan bimbingan, arahan serta dukungan.
Dr. Artini Pangastuti, M.Si., selaku dosen pembimbing I yang telah
memberikan bimbingan, arahan serta dukungan selama penelitian hingga
selesainya penyusunan skripsi.
Rita Rakhmawati, M.Si., Apt., selaku dosen pembimbing II yang telah
memberikan bimbingan, arahan serta dukungan selama penelitian hingga
selesainya penyusunan skripsi.
Tjahjadi Purwoko, M.Si., selaku dosen penelaah I yang telah memberikan
bimbingan dan petunjuk selama penelitian sampai selesainya penyusunan skripsi.
Widya Mudyantini, M.Si., selaku dosen penelaah II yang telah
memberikan bimbingan dan petunjuk selama penelitian sampai selesainya
penyusunan skripsi.
Dinar Sari C.W., M.Si., Apt. yang telah memberikan bimbingan dan
petunjuk selama penelitian sampai selesainya penelitian.
Kepada segenap dosen dan staf jurusan Biologi FMIPA UNS atas segala
bentuk dukungan yang diberikan.
Keluarga besar Dadun Abdurahman, atas dukungan dan doanya. Keluarga
besar biologi 2006 untuk semangat, kebersamaan, dan persaudaraan yang luar
biasa.
Dengan kerendahan hati penulis menyadari bahwa dalam penelitian dan
penyusunan skripsi ini masih jauh dari sempurna, oleh karena itu saran dan kritik
yang membangun dari para pembaca akan sangat membantu. Semoga skripsi ini
dapat bermanfaat bagi kita semua.
Surakarta, Mei 2010 Penyusun
DAFTAR ISI
Halaman HALAMAN JUDUL…………………………………………………........
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING…………………………..
HALAMAN PENGESAHAN…………………………………….……….
HALAMAN PERNYATAAN…………………………………………….
ABSTRAK…………………………………………………………...……
ABSTRACT……………………………………………………………….
HALAMAN MOTTO……………………………………………………..
HALAMAN PERSEMBAHAN…………………………………………..
KATA PENGANTAR…………………………………………………….
DAFTAR ISI………………………………………………………………
DAFTAR TABEL…………………………………………………………
DAFTAR GAMBAR………………………………………………….......
DAFTAR LAMPIRAN……………………………………………………
DAFTAR SINGKATAN………………………………………………….
BAB I. PENDAHULUAN………………………………………………...
A. Latar Belakang…………………………………………………
B. Rumusan Masalah………………………………………...……
C. Tujuan Penelitian……………………………………………….
D. Manfaat Penelitian……………………………………………..
BAB II. LANDASAN TEORI…………………………………………….
A. Tinjauan Pustaka……………………………………………….
1. Uraian Ambre (Geranium radula Cavan.)…………………..
a. Klasifikasi…………………………………………….......
b. Habitat…………………………………………………….
c. Morfologi…………………………………………………
d. Kandungan Kimia dan Manfaat Daun Ambre……………
2. Uji Mutagenisitas dan Bakteri Salmonella typhimurium……
3. Pemisahan Komponen Bioaktif dengan Ekstraksi dan
i
ii
iii
iv
v
vi
vii
viii
ix
xi
xiv
xv
xvi
xvii
1
1
3
3
3
4
4
4
4
4
5
5
7
......Partisi.....................................................................................
4. Kromatografi Lapis Tipis ( KLT)…………………………...
B. Kerangka Pemikiran……………………………………………
BAB III. METODE PENELITIAN……………………………………….
A. Waktu dan Tempat Penelitian………………………………….
B. Alat dan Bahan Penelitian ..………………………………........
1. Alat Penelitian..……………………………………………...
a. Alat untuk pemisahan komponen bioaktif ……………….
b. Alat untuk uji mutagenisitas ……………………………..
c. Alat untuk penentuan profil kandungan senyawa kimia….
2. Bahan Penelitian..…………………………………………...
a. Bahan untuk pemisahan komponen bioaktif ……………..
b. Bahan untuk uji mutagenisitas …………………………...
c. Bahan untuk penentuan profil kandungan senyawa kimia..
C. Cara Kerja…….………………………………………………...
1. Pengambilan Sampel…………………………………….......
2. Pemisahan Komponen Bioaktif...............................................
a. Ekstraksi…………………………………………………..
b. Partisi.......................................…………………………...
3. Uji Mutagenisitas.....................................................................
a. Penanganan bakteri uji……………………………………
b. Pembuatan biakan semalam………………………………
c. Uji mutagenesitas larutan uji……………………………...
d. Uji kontrol positif………………………………………....
e. Uji kontrol negatif………………………………………...
f. Larutan uji……………………………………………......
4. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan Penentuan Profil
......Kandungan Senyawa Kimia..................................................
a. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)........................................
b. Penentuan profil kandungan senyawa kimia.......................
D. Analisis Data…………………………………………………...
11
12
15
18
18
18
18
18
18
18
18
18
19
19
19
19
19
19
20
20
20
21
21
21
22
22
22
22
23
25
BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN…………………………………
A. Ekstraksi dan Partisi……………………………………………
1. Ekstraksi…………………………………………………......
2. Partisi……………………………………………….………..
B. Uji Mutagenisitas…..…………………………………………..
C. Deteksi Golongan Senyawa Partisi Teraktif...............................
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN…………………………………..
A. Kesimpulan…………………………………………………….
B. Saran……………………………………………………………
DAFTAR PUSTAKA……………………………………………………..
RIWAYAT HIDUP PENULIS……………………………………………
26
26
26
29
31
43
48
48
48
50
64
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 1. Rata-rata hasil uji mutagenisitas hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre............................................................
Tabel 2. Rata-rata hasil uji mutagenisitas kontrol................................. Tabel 3. Perbandingan jumlah bakteri yang tumbuh tiap konsentrasi
dengan kelompok kontrol negatif ........................................... Tabel 4. Hasil KLT hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre larut
wasbensin dengan deteksi sinar tampak, sinar UV dan dengan pereaksi semprot spesifik............................................
33
33
34
46
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Geranium radula Cavan................................................... Gambar 2. Bunga Geranium radula Cavan........................................ Gambar 3. Alur Kerangka Pemikiran………………………………. Gambar 4. Skema Cara Kerja.……………………………………… Gambar 5. Kromatogram hasil KLT ekstrak kloroform daun Ambre
deteksi dengan sinar tampak, UV254, UV366, dan serium (IV) sulfat ........................................................................
Gambar 6. Kromatogram hasil KLT partisi ekstrak kloroform daun
Ambre deteksi dengan sinar tampak, UV254, UV366, dan serium (IV) sulfat.............................................................
Gambar 7. Profil KLT hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre
larut wasbensin deteksi dengan sinar tampak, UV254, UV366, dan serium (IV) sulfat...........................................
Gambar 8. Profil KLT hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre
larut wasbensin deteksi dengan Vanilin-H2SO4, Liebermenn-burchard, FeCl3……………………………
6
6
17
24
28
30
43
45
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Kunci determinasi tumbuhan Ambre (Geranium radula Cavan.) ……………………………………………………
Lampiran 2. Hasil uji mutagenisitas dengan menggunakan bakteri
Salmonella typhimurium TA 98…………………………..
Lampiran 3. Hasil uji mutagenisitas dengan menggunakan bakteri Salmonella typhimurium TA 100........................................
Lampiran 4. Hasil uji mutagenisitas dengan menggunakan bakteri Salmonella typhimurium TA 1535......................................
Lampiran 5. Gambar hasil uji mutagenisitas dengan menggunakan bakteri Salmonella typhimurium TA 98..............................
Lampiran 6. Gambar hasil uji mutagenisitas dengan menggunakan
bakteri Salmonella typhimurium TA 100............................ Lampiran 7. Gambar hasil uji mutagenisitas dengan menggunakan
bakteri Salmonella typhimurium TA 1535.......................... Lampiran 8. Komposisi media dan larutan stok....................................... Lampiran 9. Daftar riwayat hidup penulis………………………………
56
57
58
59
60
61
62
63
64
Daftar Singkatan
Singkatan Keterangan BST B2P2TOOT Ce(IV)(SO4)2
DMSO DNA EBPI Faktor R FeCl3
GF254
G2
His IQ KLT LB LC50
MGMT MIPA MMS MNU NOPD OECD PLDB Rf RNA S SA Trp UV uvr A uvr B UV366
UV254
Vanilin H2SO4
2AA 9-AAD 4NQO
Brine Shrimp Letality Test Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional Serium (IV) sulfat Dimethyl sulfoxide Deoksiribonukleic acid/ Asam deoksiribonukleat Enviromental Bio-Detection Products inc. Faktor resistensi Ferri clorida Gypsum Fosforesense pada panjang gelombang 254 Gap 2 Histidin 2-amino-3-methyl-3H-imidazo-(4,5-f-)-quinoline Kromatografi Lapis Tipis Luria Bertani Letal Concentrate 50 % O6-methylguanine-DNA methyltransferase levels Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Methyl methanesulponate N-nitroso-N-methylurea 4-Nitro-o-phenylenediamine Organisasion for Economic Coorperation and Development Protein Linked DNA Breaks Retardation factor Ribonukleic acid/ Asam ribonukleat Sintesis Sodium azide Triptofan Ultraviolet Ultraviolet radiation A Ultraviolet radiation B Ultraviolet panjang gelombang 366 Ultraviolet panjang gelombang 254 Vanilin-asam sulfat 2-aminoanthrancene 9-aminoacridine 4-nitroquinoline-N-oxide
BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Penyakit kanker merupakan salah satu penyakit penyebab kematian
terbesar di dunia terutama di negara-negara maju (Pato, 2003). Kanker merupakan
penyakit sel yang ditandai dengan adanya perubahan (transformasi) pada sel
sehingga bentuk, sifat dan kinetiknya berubah. Sel tumbuh menjadi autonom, liar,
tidak terkendali, terlepas dari koordinasi petumbuhan normal, dan bersifat ganas
(Aulia dkk., 2002; Maliya, 2004). Kejadian dan jenis penyakit kanker erat
hubungannya dengan berbagai faktor antara lain adalah jenis kelamin, usia, ras
dan paparan terhadap beberapa zat yang bersifat karsinogenik (Katzung, 1994).
Zat yang bersifat karsinogenik dapat berupa zat kimia organik maupun anorganik.
Selain itu, virus dan radiasi sinar dapat pula menyebabkan kanker (Dalimartha,
2004).
Dalam pengobatan kanker dibutuhkan pendekatan sistemik melalui
kemoterapi kanker, disamping pembedahan, radiasi, dan kemoterapi ajuvan
(Nafrialdi dan Gan, 1995). Tumbuh-tumbuhan merupakan salah satu sumber obat-
obatan kemoterapi yang potensial sehingga pencarian obat-obatan kemoterapi dari
tumbuh-tumbuhan masih terus dilakukan (Sukardiman dkk., 2006). Berdasarkan
penelitian skrining toksisitas beberapa tanaman di kawasan Tawangmangu
Surakarta dengan menggunakan metode Brine Shrimp Letality Test (BST)
menunjukkan bahwa ekstrak kloroform dari daun Ambre (Geranium radula
Cavan.) memiliki aktivitas toksisitas dengan nilai LC50 sebesar 40,63 µg/mL
(Wahyuni dan Rakhmawati, 2008). Suatu ekstrak berpotensi sebagai kandidat
antikanker berdasarkan metode BST jika harga LC50 kurang dari 1000 µg/mL dan
hasil uji toksisitas menggunakan metode BST ini dapat diasosiasikan dengan sifat
sitotoksik yang digunakan sebagai prasyarat antikanker (Erma dkk., 2004).
Berdasarkan penelitian, Ames telah membuktikan bahwa 90% senyawa
yang bersifat mutagenik juga bersifat karsinogenik (Lehninger, 1982). Disisi lain
banyak teori yang menyebutkan bahwa mekanisme kerja dari beberapa senyawa
yang digunakan sebagai obat antikanker mirip dengan mekanisme kerja senyawa
karsinogen terhadap protein, DNA atau sel normal (Foye, 1996). Ini membuktikan
bahwa senyawa antikanker dapat pula menyebabkan mutasi. Hal ini dapat
dimengerti mengingat ada beberapa obat antikanker yang berasal dari tanaman
dapat secara langsung menghambat perkembangan siklus sel kanker dan
menyebabkan terjadinya kerusakan DNA (Katzung, 1994). Berdasarkan hal
tersebut, maka perlu adanya penelitian untuk melihat efek mutagenik dari daun
Ambre dengan melakukan uji mutagenisitas terhadap hasil partisi dari ekstrak
kloroform daun Ambre menggunakan metode Ames. Pada uji mutagenisitas ini
digunakan bakteri Salmonella typhimurium TA 98, 100 dan 1535. Daun Ambre
diperiksa untuk melihat efek mutagenik dengan melakukan pengamatan terhadap
ada tidaknya pertumbuhan bakteri dalam media. Selanjutnya dicari profil
kandungan senyawa kimia teraktif dari hasil partisi yang menunjukkan sifat
mutagenik terbesar.
B. Perumusan Masalah
Adapun rumusan masalah dalam penelitian ini adalah :
a. Bagaimana efek mutagenik hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre
terhadap bakteri uji Salmonella typhimurium TA 98, 100 dan 1535 ?
b. Bagaimana profil kandungan kimia teraktif dari hasil partisi ekstrak
kloroform daun Ambre yang menunjukkan sifat mutagenik terbesar ?
C. Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah :
a. Mengetahui efek mutagenik dari hasil partisi ekstrak kloroform daun
Ambre terhadap bakteri Salmonella typhimurium TA 98, 100 dan 1535.
b. Mengetahui profil kandungan kimia teraktif dari hasil partisi ekstrak
kloroform daun Ambre yang menunjukkan sifat mutagenik terbesar.
D. Manfaat Penelitian
Manfaat yang diharapkan dari adanya penelitian ini adalah :
a. Memberikan informasi ilmiah dan pengetahuan tentang efek mutagenik
dari hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre sehingga dapat digunakan
sebagai dasar penelitian berikutnya.
b. Menambah nilai ilmiah dan ekonomi tanaman Ambre sehingga dapat
dimanfaatkan sebagai bahan dasar untuk pembuatan obat dari bahan alam.
BAB II
LANDASAN TEORI
A. Tinjauan Pustaka
1. Uraian Ambre (Geranium radula Cavan.)
a. Klasifikasi
Divisi : Spermatophyta
Sub divisi : Angiospermae
Kelas : Dicotyledoneae
Ordo : Geraniales
Famili : Geraniaceae
Genus : Geranium
Spesies : Geranium radula Cavan.
Sinonim : Pelargonium odoratissimum Hort.; Pelargonium roseum Hort.
Nama daerah : Daun Ambre (Sumatra), Ambre (Melayu) (Depkes RI, 2009).
b. Habitat
Tumbuh baik pada tanah yang sedikit asam dengan pH 6,0-6,5, pada
kondisi lingkungan yang lembab dan terkena sinar matahari penuh (Rothman,
2009).
c. Morfologi
Ambre merupakan tanaman perdu, dengan tinggi + 1,5 m. Memiliki
batang berkayu berbentuk bulat dengan permukaan kasar dan berbulu. Pada waktu
muda batang berwarna hijau setelah tua berwarna coklat. Berdaun tunggal dengan
panjang tangkai 5-12 cm dan memiliki rambut yang kasar. Pada daun bagian tepi
bergerigi dengan ujung tumpul dan pangkalnya berlekuk. Pertulangan daun
menyirip dengan panjang + 13 cm dan lebar + 9 cm, daunnya berwarna hijau
muda sampai hijau (Backer dan Bakhuizen,1968).
Memiliki bunga majemuk yang berbentuk payung, panjang tangkainya
5-12 cm, dengan kelopak lepas terdiri dari 5 helai, daun mahkota berjumlah 5
helai berbentuk bulat telur dengan panjang 1-5 cm dan lebar 5-7 mm. Bunga
berwarna merah muda dengan benang sari sebanyak sepuluh buah yang
pangkalnya berlekatan dan memiliki bakal buah sebanyak 5 ruang. Buahnya
merupakan buah buni yang berbentuk kerucut dengan panjang 5-6 mm, berwarna
hijau. Berbiji kecil dan berwarna putih. Perakarannya tunggang dan berwarna
coklat muda (Backer dan Bakhuizen,1968).
d. Kandungan kimia dan manfaat daun Ambre
Daun Ambre dipercaya berkhasiat sebagai obat reumatik, obat jerawat
dan bahan baku kosmetika. Biasanya digunakan hanya untuk dipakai di luar tubuh
dengan cara mengoleskan hasil tumbukkan daun pada bagian yang sakit. Daun
mengandung minyak atsiri, saponin, flavonoida dan tannin (Depkes RI, 2009).
Saponin, flavonoida dan tannin telah dilaporkan memiliki aktivitas antikanker
(Zakaria, 2007). Berdasarkan penelitian ternyata ekstrak daun Ambre memiliki
aktivitas toksisitas dengan nilai LC50 sebesar 40,63 µg/mL (Wahyuni dan
Rakhmawati, 2008). Pada konsentrasi 80% ekstrak daun Ambre efektif
menunjukkan daya tolak terhadap nyamuk Aedes aegypti (Linn.) (Dewi dan Leni,
2006).
Gambar 1. Geranium radula Cavan.
Gambar 2. Bunga Geranium radula Cavan (Depkes RI, 2009)
2. Uji Mutagenisitas dan Bakteri Salmonella typhimurium
Uji mutagenisitas digunakan untuk mengetahui apakah suatu bahan uji
bersifat mutagen atau tidak. Ada beberapa metode uji untuk mengetahui suatu
bahan bersifat mutagenik diantaranya dengan menggunakan mencit yang terdiri
dari metode mikronukleus pada tulang sumsum, metode spot test atau dengan
menggunakan mencit transgenik dan dengan menggunakan bakteri (Wegrzyn dan
Czyz, 2003; Wahnschaffe dkk1., 2005; Wahnschaffe dkk2., 2005; Sumpena dkk.,
2009; Shoebi dkk., 2009).
Uji mutagenisitas dengan menggunakan bakteri lebih banyak digunakan
dengan alasan lebih mudah dilakukan dan waktu yang digunakan lebih singkat
bila dibandingkan dengan uji mutagenisitas lainnya. Uji mutagenisitas dengan
menggunakan bakteri memiliki banyak macam diantaranya adalah uji Ames, uji
mutatox, uji vitotox, dan uji dengan menggunakan bakteri Vibrio harveyi yang
dikenal dengan Vibrio harveyi assay (Ames dkk1., 1973; Wegrzyn dan Czyz,
2003).
Uji Ames telah diperkenalkan sejak 30 tahun lalu, karena uji ini banyak
digunakan untuk mengetahui sifat mutagenik suatu senyawa lambat laun uji ini
mengalami modifikasi, namun tetap dengan prinsip dasar yang sama misalnya
dengan bioluminescent assay yang dipadukan dengan metode Ames (Guadano
dkk., 1999; Wegrzyn dan Czyz, 2003 ).
Prinsip dari uji Ames adalah bakteri yang digunakan sudah dimutasi
sehingga tidak mampu mensintesis salah satu jenis asam amino esensial misalnya
histidin dan triptofan untuk pertumbuhannya, oleh karena itu bakteri butuh media
yang mengandung histidin atau triptofan agar bisa tumbuh normal. Bila bahan uji
yang diperiksa bersifat mutagen, maka bakteri uji akan mengalami mutasi balik ke
fungsinya yang semula. Dengan demikian, gen his dan gen trp yang termutasi
akan mengalami mutasi balik. Gen his dan gen trp tersebut kembali normal
sehingga bakteri uji dapat mensintesis sendiri histidin dan triptofan yang
dibutuhkan dalam pertumbuhannya, ditunjukkan dengan pertumbuhan bakteri di
dalam media yang kekurangan histidin atau triptofan (Radji dkk., 2004).
Uji mutagenisitas dengan menggunakan uji Ames ini umumnya
menggunakan strain bakteri Salmonella typhimurium yang sudah dimodifikasi.
Bakteri tersebut termutasi pada bagian gen his yang menyebabkan terganggunya
proses sintesis histidin (Ames dkk1., 1973; Wegrzyn dan Czyz, 2003). Selain itu,
digunakan juga galur Escherichia coli WP2 yang mengandung gen mutasi uvrA
(OECD, 1997).
Beberapa contoh bakteri Salmonella typhimurium termutasi diantaranya
adalah TA 97, TA 97a, TA 98, TA100, TA 102, TA 104, TA1535, TA 1537, dan
TA 1975. Masing-masing galur mengandung gen termutasi histidin, mutasi rfa,
mutasi uvrB, faktor R (pKM101) dan plasmid pAQ1 untuk meningkatkan
kepekaan bakteri terhadap senyawa mutagenik (Ames dkk1., 1973; OECD, 1997;
Suzuki dkk., 1997; Dillon dkk., 1998).
Mutasi DNA repair (uvr A/B) menghilangkan sistem excision repair
pada DNA. Sistem excision repair merupakan jalur perbaikan DNA yang rusak
akibat terkena sinar UV dan mutagen tertentu. Adanya mutasi uvr A/ B membuat
strain tersebut lebih sensitif terhadap beberapa partikel yang diujikan. Mutasi uvr
A/B juga menyebabkan terjadinya delesi pada gen bio yang mengakibatkan
bakteri tidak dapat mensintesis biotin dan membutuhkan biotin untuk
pertumbuhannya, mutasi uvr A/B ditandai dengan kepekaan terhadap sinar UV
(Genpharmtox, 2009).
Gen rfa merupakan gen yang berfungsi dalam mengatur biosintesis
lipopolisakarida (Sanderson dan Saeed, 1972). Adanya mutasi gen rfa
menyebabkan hilangnya sebagian kapsul lipopolisakarida yang membungkus
permukaan bakteri sehingga mengakibatkan naiknya permeabilitas terhadap
molekul besar seperti benzo-a-piren yang tidak dapat berpenetrasi ke dalam sel
normal. Mutasi rfa ditandai dengan adanya kepekaan terhadap kristal violet
(OECD, 1997; Tejs, 2008; Genpharmtox, 2009).
Plasmid faktor R (pKM101) membuat strain bakteri lebih responsif
terhadap berbagai mutagen. Plasmid ini membawa gen resisten ampisilin. Plasmid
pAQ1 yang terdapat pada strain TA 102 mengandung mutasi hisG428 dan gen
resisten tetrasiklin (McCann dkk., 1975; Levin dkk., 1984; OECD, 1997).
Galur TA 100 mempunyai mutasi hisG46 pada gen hisG yang
mengkodekan enzim untuk biosintesis histidin. Galur TA 100 ini termutasi
pasangan basanya secara substitusi dan bisa digunakan untuk mendeteksi adanya
mutagen yang menyebabkan adanya salah satu substitusi pasangan basa dari enam
kemungkinan terjadinya mutasi substitusi pasangan basa (A-T à T-A, G-C, C-G ;
G-Cà C-G, A-T, T-A) (Skopek dkk., 1978; Burgess dkk., 1985).
Galur TA 1535 memiliki mutasi substitusi pasang basa yang sama
dengan TA 100, hanya saja galur TA 1535 tidak memiliki plasmid pKM101. Hal
ini membuat galur TA 100 secara umum lebih sensitif bila dibandingkan dengan
TA 1535 (McCann dkk., 1975; Prival dan Zeiger, 1998, Akerele dan Ebor, 2002;
Tejs 2008).
Mutasi hisD3052 pada TA 98 adalah gen hisD pengkode histidinol
dehidrogenase. Galur ini dapat mendeteksi beberapa mutagen frameshift. Mutagen
dapat memantapkan pasangan tergeser yang sering terjadi pada pengulangan
urutan DNA atau hot spot DNA yang menghasilkan mutasi frameshift yang
memulihkan pembacaan frame yang benar untuk sintesis histidin. Mutasi
hisD3052 mempunyai urutan pengulangan –GC- atau –CG- dalam urutan -C-G-C-
G-C-G-C-G- yang terdapat di dekat tempat mutasi frameshift a-1 pada gen hisD
(Levine dkk., 1994; DeMarini dkk., 1998). Bakteri galur TA 98, 100 dan TA 1535
tidak sensitif terhadap mutagen oksidatif seperti radikal bebas dan senyawa penaut
silang (cross linked) yang biasanya menyerang pasangan basa A-T (Dillon dkk.,
1998; OECD, 1997; Sotto dkk., 2009). Pemberian suspensi dari sel tumor
payudara dapat meningkatkan mutasi balik bakteri galur TA 98 dan 100 (Fulton
dkk., 1984).
Pada tahun 1973 Ames melakukan penelitian untuk mendeteksi adanya
mutagen dengan menambahkan aktivator metabolik dan sampai saat ini masih
banyak dilakukan (Ames dkk2.,1973; Shoeibi dkk., 2009). Aktivator metabolik
tersebut berupa ekstrak hati tikus yang disebut S-9 mix yang mengandung enzim
microsomal seperti enzim retikulum endoplasmik yang mampu melakukan
hidroksilasi atau mengubah banyak senyawa organik menjadi bentuk akhirnya,
karena banyak senyawa menjadi bersifat karsinogenik setelah mengalami proses
metabolisme oleh sel (Ames dkk2.,1973; Wegrzyn dan Czyz, 2003; Lehninger,
1982).
Beberapa penelitian melakukan uji konfirmasi genotip, uji viabilitas dan
banyaknya reversi spontan sesaat setelah menerima strain bakteri. Tujuannya
adalah membuktikan keutuhan strain uji (Setiadarma, 2002). Selain konfirmasi
genotip, perlu juga dilakukan uji mutagen standar. Walaupun hasil konfirmasi
sifat genotip memenuhi syarat, tetapi jika mutagen standar tidak memberikan hasil
positif, bakteri tersebut tidak dapat digunakan untuk pengujian (Radji dkk., 2004).
Mutagen standar yang sering digunakan diantaranya adalah Methyl
methanesulponate (MMS), 4-nitroquinoline-N-oxide (4NQO), 2-minoanthrancene
(2AA), 2-amino-3-methyl-3H-imidazo-(4,5-f-)-quinoline (IQ), N-nitroso-N-
methylurea (MNU), 4-Nitro-o-phenylenediamine (NOPD), Sodium azide (SA) dan
9-aminoacridine (9-AAD) (Haworth dkk., 1983; OECD, 1997; Guadano dkk.,
1999; Totusek dkk., 2009).
3. Pemisahan Komponen Bioaktif dengan Ekstraksi dan Partisi
Ekstraksi suatu senyawa dalam tumbuhan dapat dilakukan dengan cara
maserasi, perkolasi, sokletasi dan destilasi uap. Maserasi merupakan proses
perendaman sampel dengan pelarut organik yang digunakan pada temperatur
ruangan. Proses ini sangat menguntungkan karena dengan perendaman maka pada
sampel tumbuhan terjadi pemecahan dinding dan membran sel akibat perbedaan
tekanan antara di dalam dan di luar sel sehingga metabolit sekunder yang ada
dalam sitoplasma akan terlarut dalam pelarut organik dan ekstraksi senyawa akan
sempurna karena dapat diatur lama perendaman yang dilakukan. Pemilihan
pelarut untuk proses maserasi akan memberikan efektifitas yang tinggi dengan
memperhatikan kelarutan senyawa bahan alam tersebut (Leny, 2006).
Partisi merupakan proses sorpsi yang analog dengan ekstraksi pelarut
(Rohman, 2007). Hukum distribusi atau partisi dapat dirumuskan bila suatu zat
terlarut terdistribusi antara dua pelarut yang tidak dapat campur, maka pada suatu
temperatur yang konstan untuk setiap spesi molekul terdapat angka banding
distribusi yang konstan antara kedua pelarut itu, dan angka banding distribusi ini
tidak tergantung pada spesi molekul lain apapun yang mungkin ada. Harga angka
banding berubah dengan sifat dasar pelarut, sifat dasar zat terlarut, dan temperatur
(Svehla, 1990). Hasil dari partisi yang diperoleh kemudian akan diuji dengan
menggunakan kromatografi lapis tipis untuk mengetahui pemisahan komponen
bioaktifnya kemudian dilakukan uji bioassay untuk mengidentifikasi komponen
aktif dengan uji Ames.
4. Kromatografi Lapis Tipis ( KLT)
Kromatografi lapis tipis adalah metode pemisahan fitokimia. Lapisan
yang memisahkan terdiri atas bahan berbutir-butir (fase diam), ditempatkan pada
penyangga berupa pelat gelas, logam, atau lapisan yang cocok. Campuran yang
akan dipisah berupa larutan, ditotolkan berbentuk bercak atau pita (awal),
kemudian pelat dimasukkan di dalam bejana tertutup rapat yang berisi larutan
pengembang yang cocok (fase gerak), pemisahan terjadi selama perambatan
kapiler (pengembangan). Senyawa yang tidak berwarna selanjutnya harus
ditampakkan (dideteksi) (Stahl, 1985).
Kromatografi lapis tipis dalam pelaksanaannya lebih mudah dan lebih
murah dibandingkan dengan kromatografi kolom. Demikian juga peralatan yang
digunakan. Dalam kromatografi lapis tipis, peralatan yang digunakan lebih
sederhana dan dapat dikatakan bahwa hampir semua laboratorium dapat
melaksanakan setiap saat secara cepat. Beberapa keuntungan kromatorafi lapis
tipis diantaranya :
1. Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan analisis.
2. Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi
warna, fluorosensi, atau dengan radiasi menggunakan sinar
ultraviolet.
3. Dapat dilakukan elusi secara menarik (ascending), menurun
(descending), atau dengan cara elusi 2 dimensi.
4. Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang
akan ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak (Rohman,
2007).
Fase diam yang digunakan dalam KLT adalah bahan penyerap. Penyerap
yang umum adalah silika gel, alumunium oksida, selulosa, kiselgur, selulosa dan
turunannya. Dua sifat yang penting dari penyerap adalah besar partikel dan
homogenitasnya, karena adhesi terhadap penyokong sangat tergantung pada hal
tersebut. Partikel yang butirannya sangat kasar tidak akan memberikan hasil yang
memuaskan dan salah satu alasan untuk menaikkan hasil pemisahan adalah
menggunakan penyerap yang butirannya halus (Sastrohamidjojo, 1991).
Fase gerak adalah medium angkut dan terdiri atas satu atau beberapa
pelarut. Ia bergerak di dalam fase diam karena adanya gaya kapiler. Laju rambat
tergantung kepada viskositas pelarut dan struktur lapisan (misalnya butiran
penyerap). Pemisahan yang baik dan reproducible perlu diperhatikan pemilihan
kondisi kerja yang meliputi sifat pengembangan, kejenuhan bejana dan lain-lain
(Stahl, 1985). Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut pengembang akan bergerak
sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik
(ascending), atau karena pengaruh gravitasi pada pengembangan secara menurun
(descending) (Rohman, 2007).
Terdapat berbagai kemungkinan untuk deteksi senyawa tak berwarna
pada kromatogram. Deteksi paling sederhana adalah jika senyawa menunjukkan
penyerapan di daerah ultraviolet (UV) gelombang pendek (radiasi utama pada
kira-kira 254 nm) atau jika senyawa tersebut dapat dieksitasi ke flourosensi radiasi
UV gelombang pendek dan atau gelombang panjang (366 nm). Jika dengan kedua
cara itu senyawa tidak dapat dideteksi, maka harus dicoba dengan menggunakan
reaksi kimia.
Pada sistem KLT dikenal istilah kecepatan rambat suatu senyawa yang
diberi simbol Rf (Retardation factor). Harga Rf ditentukan oleh jarak rambat
senyawa dari titik awal dan jarak rambat fase gerak dari titik awal. Harga Rf ini
dapat digunakan untuk identifikasi senyawa yang dianalisa. Penentuan harga Rf
adalah sebagai berikut:
(Stahl, 1985).
B. Kerangka Pemikiran
Berdasarkan penelitian skrining toksisitas beberapa tanaman di kawasan
Tawangmangu Surakarta dengan menggunakan metode Brine Shrimp Letality Test
(BST) menunjukkan bahwa ekstrak kloroform dari daun Ambre memiliki aktivitas
toksisitas dengan nilai LC50 sebesar 40,63 µg/mL (Wahyuni dan Rakhmawati,
2008). Suatu ekstrak berpotensi sebagai kandidat antikanker berdasarkan metode
BST jika harga LC50 kurang dari 1000 µg/mL dan hasil uji toksisitas
menggunakan metode BST ini dapat diasosiasikan dengan sifat sitotoksik yang
digunakan sebagai prasyarat senyawa antikanker (Erma dkk., 2004).
Berdasarkan penelitian, Ames telah membuktikan bahwa 90% senyawa
yang bersifat mutagenik juga bersifat karsinogenik (Lehninger, 1982). Disisi lain
banyak teori yang menyebutkan bahwa mekanisme kerja dari beberapa senyawa
yang digunakan sebagai obat antikanker mirip dengan mekanisme kerja senyawa
karsinogen terhadap protein, DNA atau sel normal (Foye, 1996). Ini membuktikan
bahwa senyawa antikanker dapat pula menyebabkan mutasi. Berdasarkan hal
tersebut, maka perlu adanya penelitian untuk melihat efek mutagenik dari daun
Ambre dengan melakukan uji mutagenisitas terhadap hasil partisi dari ekstrak
kloroform daun Ambre menggunakan metode Ames. Setiap tahap ekstraksi dan
partisi pemisahannya dimonitor dengan kromatografi lapis tipis
Jarak perambatan bercak dari titik awal Rf = Jarak perambatan fase gerak dari titik awal
Ekstraksi dilakukan dengan menggunakan metode maserasi dengan
pelarut yang digunakan adalah kloroform. Ekstrak kloroform tersebut dipartisi
dengan menggunakan pelarut wasbensin, sehingga dihasilkan bagian yang larut
dan tidak larut wasbensin. Selanjutnya dilakukan uji mutagenisitas dengan uji
Ames dan ditentukan profil kandungan kimia teraktif yang menunjukkan sifat
mutagenik terbesar.
Partisi ekstrak kloroform daun Ambre
Ekstrak kloroform daun Ambre
Pemisahannya dimonitoring dengan KLT
daun Ambre
Uji mutagenisitas
Senyawa antikanker dapat menyebabkan mutasi
Ekstrak kloroform daun Ambre berdasarkan uji BST berpotensi
sebagai kandidat antikanker (Wahyuni dan Rakhmawati, 2008)
Mekanisme kerja beberapa obat antikanker mirip dengan senyawa karsinogen terhadap protein, DNA
dan sel normal (Foye, 1996)
Profil kandungan kimia bagian teraktif yang menunjukkan sifat
mutagenik
Perlu adanya penelitian untuk melihat efek
mutagenik
Sebesar 90% senyawa yang
bersifat mutagenik juga bersifat karsinogenik
(Lehninger, 1982)
Gambar 3. Alur Kerangka Pemikiran
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Pusat MIPA Universitas
Sebelas Maret Surakarta selama bulan Juli-Desember 2009.
B. Alat dan Bahan Penelitian
1. Alat Penelitian
a. Alat untuk pemisahan komponen bioaktif
Alat-alat gelas, Rotary Evaporator (Heidolph vv 2000, Germany),
Sentrifuge, corong buchner.
b. Alat untuk uji mutagenisitas
Tabung reaksi, cawan petri, gelas ukur, mikropipet, gelas beker, jarum
ose, drigalsky, bunsen, laminar air flow.
c. Alat untuk penentuan profil kandungan senyawa kimia
Lampu UV254 dan UV366, pipa kapiler, syringe, chamber, pompa vakum,
alat-alat gelas.
2. Bahan Penelitian
a. Bahan untuk pemisahan komponen bioaktif
Bahan utama untuk pemisahan adalah simplisia kering daun Ambre,
kloroform (untuk maserasi), pelarut wasbensin untuk partisi, plat silika gel 60
GF254 sebagai fase diam dan fase gerak yang digunakan yaitu kloroform.
b. Bahan uji mutagenisitas
Bakteri Salmonella typhimurium TA 98, 100 dan 1535 beserta growth
medium yang diperoleh dari Enviromental Bio-Detection Products inc. (EBPI)
California. Media yang digunakan adalah media Luria Bertani (LB), media
histidin-biotin, dan media minimal yang ditambah glukosa. Bahan kimia yang
digunakan adalah d-biotin, l-histidin, amonium sulfat, dextrose, dipotasium fosfat,
magnesium fosfat, monopotasium fosfat, sodium sitrat, sodium azide (EBPI), 2-
nitrofluorene (EBPI) dan Dimethyl sulfoxide (DMSO).
c. Bahan untuk penentuan profil kandungan senyawa kimia
Plat silika gel 60 GF254, kloroform, pereaksi kimia Ce(IV)(SO4)2 , FeCl3,
vanilin H2SO4, dan Lieberman-Burchard.
C. Cara Kerja
1. Pengambilan Sampel
Sampel berupa simplisia kering daun Ambre sebanyak 290 gram dan
telah dideterminasi yang diperoleh dari Balai Besar Penelitian dan Pengembangan
Tanaman Obat dan Obat Tradisional (B2P2TOOT) pada bulan Mei tahun 2009.
2. Pemisahan Komponen Bioaktif
a. Ekstraksi
Serbuk daun Ambre dimaserasi menggunakan kloroform selama 24 jam
disertai pengadukan, maserasi dilakukan hingga 3 kali. Setelah 24 jam, rendaman
disaring dengan corong buchner, ampasnya dipisahkan dan filtrat I yang diperoleh
diuapkan dengan bantuan rotary evaporator sehingga didapat ekstrak kloroform
yang kemudian dikeringkan dengan bantuan kipas angin dan disimpan di
eksikator. Ampas dimaserasi kembali dengan kloroform seperti cara diatas
sehingga diperoleh filtrat II dan III lalu diuapkan menggunakan rotary
evaporator, ekstrak yang didapat digabung dengan ekstrak kloroform yang
pertama. Profil hasil senyawa pada ekstrak dimonitor dengan kromatografi lapis
tipis.
b. Partisi
Ekstrak kloroform daun Ambre dipartisi dengan cara partisi padat-cair
dengan pelarut wasbensin menggunakan sentrifuge sehingga dihasilkan dua
bagian yaitu bagian larut dan tidak larut wasbensin untuk kemudian pelarut
diuapkan. Kedua bagian yang telah diuapkan dimonitor hasil pemisahannya
dengan kromatografi lapis tipis, apabila hasil pemisahan tidak tumpang tindih
antara keduanya, maka dilakukan uji mutagenisitas dengan uji Ames.
3. Uji Mutagenisitas
Uji mutagenisitas dilakukan dengan menggunakan uji Ames tanpa
aktivator metabolik S-9 mix.
a. Penanganan bakteri uji
Masing-masing bakteri yang akan diuji disimpan pada frezer -4oC dan
growth media disimpan pada lemari pendingin 40C.
b. Pembuatan biakan semalam
Bakteri yang disimpan pada frezer -4oC kemudian dihidrasi dengan
menambahkan growth media kedalam tempat yang berisi bakteri, divortex dan
diinkubasi selama 16-18 jam. Sebanyak 50-100 µL bakteri tersebut diinokulasi
pada media LB dan diinkubasi selama 16-18 jam. Dalam proses pengujian kondisi
harus dalam keadaan fresh yaitu antara jam ke 16-18 setelah proses inokulasi,
karena pada periode jam tersebut bakteri berada pada fase eksponensial sampai
awal fase stasioner, lewat dari itu bakteri tidak boleh digunakan.
c. Uji mutagenesitas larutan uji
Sebanyak 3 mL medium yang mengandung histidin-biotin ditambahkan
50 µL biakan semalam bakteri uji dan larutan uji sesuai konsentrasi, medium
tersebut dituangkan pada cawan petri yang berisi media minimal yang ditambah
glukosa. Setelah medium yang mengandung histidin-biotin memadat, diinkubasi
pada suhu 370 C selama 72 jam. Selanjutnya dihitung jumlah koloni yang tumbuh.
d. Uji kontrol positif
Sebanyak 3 mL medium yang mengandung histidin-biotin ditambahkan
50 µL biakan semalam bakteri uji dan masing-masing sebanyak 17,1 µL sodium
azide untuk Salmonella typhimurium TA 100 dan 1535 dan 2-nitroflourene untuk
Salmonella typhimurium TA 98 sebagai kontrol positif. Sodium azide dan 2-
nitroflourene sebagai kontrol positif karena keduanya telah digunakan sebagai
mutagen standar untuk masing-masing bakteri. Medium histidin-biotin tersebut
dituangkan ke dalam cawan petri berisi media minimal yang ditambah glukosa.
Setelah medium histidin-biotin memadat, diinkubasi pada suhu 370 C selama 72
jam. Selanjutnya dihitung jumlah koloni yang tumbuh.
e. Uji kontrol negatif
Sebanyak 3 mL medium yang mengandung histidin-biotin ditambahkan
50 µL biakan semalam bakteri uji dan sebanyak 100 µL DMSO sebagai kontrol
negatif. Medium tersebut dituang ke dalam cawan petri berisi media minimal yang
ditambah glukosa. Setelah medium histidin-biotin memadat, diinkubasi pada suhu
370 C selama 72 jam. Selanjutnya dihitung jumlah koloni yang tumbuh.
f. Larutan uji
Konsentrasi larutan uji yang digunakan 1000, 500, 100, dan 10 µg/mL.
Larutan uji dibuat dengan menimbang sebanyak 50 mg sampel hasil partisi
ekstrak kloroform daun Ambre, dilarutkan dengan 100 µL DMSO dan air suling
steril hingga volumenya 5 mL. Selanjutnya larutan uji disaring dengan penyaring
bakteri. Data hasil uji mutagenisitas diperoleh dengan penghitungan jumlah koloni
yang tumbuh dari setiap bakteri uji pada masing-masing cawan petri
4. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan Penentuan Profil Kandungan
Senyawa Kimia
a. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Proses pemisahan pada tahap ekstraksi dan partisi dimonitor profil
kandungan senyawa kimianya dengan kromatografi lapis tipis. Hasil setiap
tahapan tersebut dilarutkan di pelarut kemudian ditotolkan pada lempeng KLT
yaitu silika gel 60 GF254 menggunakan pipa kapiler. Pengembangan dilakukan
dalam bejana pengembang menggunakan fase gerak kloroform. Hasil KLT
dideteksi dengan sinar UV254 nm, UV366 nm dan disemprot dengan serium (IV)
sulfat untuk mendeteksi keberadaan senyawa organik secara umum dengan hasil
positif menunjukkan adanya perubahan warna menjadi coklat.
b. Penentuan profil kandungan senyawa kimia
Penentuan golongan senyawa dilakukan setelah diketahui bagian teraktif
dari hasil partisi yang telah dimonitor dengan kromatografi lapis tipis dan uji
mutagenisitas dengan uji Ames. Profil kandungan kimia teraktif yang
menunjukkan sifat mutagenik kemudian ditentukan dengan menggunakan
pereaksi semprot khusus yaitu FeCl3 untuk mendeteksi senyawa flavonoid dengan
hasil positif menunjukkan adanya perubahan warna menjadi kuning. Vanilin
H2SO4 untuk mendeteksi keberadaan senyawa terpenoid dengan hasil positif
menunjukkan adanya perubahan warna menjadi biru sampai ungu setelah
pemanasan pada suhu 110oC selama 10 menit. Lieberman-Burchard untuk
mendeteksi keberadaan senyawa triterpenoid (steroid) dengan hasil positif
menunjukkan adanya perubahan warna menjadi merah untuk triterpenoid dan biru
untuk steroid setelah pemanasan pada suhu 110 oC selama 10 menit.
Skema cara kerja dalam penelitian ini tergambar dari bagan di bawah ini :
Serbuk simplisia (290 g)
Maserasi dengan kloroform selama 24 jam
(3x)
Residu/Ampas Filtrat yang diuapkan
Ekstrak kloroform (11 g)
dipartisi dengan wasbensin
Uji Ames
Pemisahannya dimonitoring dengan KLT
Bagian larut wasbensin sebagai bagian yang teraktif
dengan efek mutagenik terbesar
Bagian tidak larut wasbensin (3,6 g)
Bagian larut wasbensin (5,9 g)
Kandungan Kimia : Terpenoid dan flavonoid
Menyebabkan mutasi pasangan basa dan frameshift mutation
Gambar 4. Skema Cara Kerja
D. Analisis Data
Data hasil uji mutagenisitas diperoleh secara kuantitatif dengan
penghitungan jumlah koloni yang tumbuh dari setiap bakteri uji pada konsentrasi
yang diberikan. Analisis data uji mutagenisitas dilakukan dengan menghitung
pertumbuhan koloni bakteri dimana jumlah koloni yang tumbuh dibandingkan
dengan jumlah koloni bakteri pada kontrol negatif. Apabila hasilnya : 1,8- 2 kali
atau lebih dari kelompok kontrol negatif maka sampel yang di uji bersifat sangat
mutagen, 1,6 – 1,7 kali dari kelompok kontrol negatif maka sampel yang di uji
kemungkinan bersifat mutagen dan 1< - 1,5 kali dianggap tidak mutagen. Batas
suatu bahan uji dikatakan bersifat mutagen jika konsentrasi sampel yang
memberikan hasil positif kurang dari 10.000 µg/mL (Suprastiwi, 2009; Radji,
2004).
Profil kandungan kimia teraktif yang menunjukkan sifat mutagenik
terbesar dimonitor kromatografi lapis tipis dengan fase gerak dan fase diam yang
sesuai serta pereaksi semprot yang spesifik. Profil kromatografi lapis tipis hasil
deteksi semprot spesifik dianalisis secara kualitatif dengan analisis deskriptif
berdasarkan bercak warna yang terbentuk dan nilai Rf yang ditentukan dengan
rumus :
(Stahl, 1985)
Jarak perambatan bercak dari titik awal Rf = Jarak perambatan fase gerak dari titik awal
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek mutagenik dari hasil
partisi ekstrak kloroform daun Ambre terhadap bakteri Salmonella typhimurium
TA 98, 100 dan 1535 beserta profil kandungan kimia teraktif dari hasil partisi
ekstrak kloroform daun Ambre yang menunjukkan sifat mutagenik terbesar. Uji
mutagenisitas dilakukan dengan menggunakan metode Ames.
A. Ekstraksi dan Partisi
1. Ekstraksi
Metode ekstraksi yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode
maserasi. Maserasi adalah proses ekstraksi zat aktif yang dilakukan dengan
merendam serbuk simplisia dalam pelarut yang sesuai selama periode waktu
tertentu pada suhu ruang dan terlindung dari cahaya matahari, tujuannya adalah
mencegah terjadinya reaksi yang dikatalis oleh cahaya atau mencegah terjadinya
perubahan warna.
Metode maserasi dipilih dalam penelitian ini karena proses
pengerjaannya mudah dan peralatan yang digunakan sederhana, selain itu karena
metode maserasi termasuk metode ekstraksi tanpa pemanasan sehingga senyawa
yang diharapkan tidak menjadi rusak akibat pemanasan. Dalam penelitian ini
pelarut yang digunakan adalah kloroform untuk menarik senyawa-senyawa yang
bersifat nonpolar sampai semi polar (Ristiningsih, 2009). Selain alasan tersebut,
penggunaan kloroform sebagai pelarut dalam proses ekstraksi mengacu pada
penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Wahyuni dan Rakhmawati (2008)
yang menunjukkan bahwa ekstrak kloroform daun Ambre memiliki aktivitas
toksisitas pada uji Brine Shrimp Letality Test (BST). Berat ekstrak yang diperoleh
adalah 11 gram dari 290 gram serbuk daun Ambre yang diekstraksi.
Proses pemisahan pada tahap ekstraksi dimonitor profil kandungan
senyawa kimianya dengan kromatografi lapis tipis, kemudian dilakukan deteksi
terhadap keberadaan senyawa kimia organik secara umum yang ada di dalamnya
menggunakan pereaksi semprot serium (IV) sulfat dengan bercak yang terbentuk
berwarna coklat setelah pemanasan. Warna coklat terbentuk disebabkan karena
dalam serium (IV) sulfat terdapat H2SO4 10% yang bersifat reduktor dalam
merusak gugus kromofor dari zat aktif simplisia sehingga serapan panjang
gelombangnya akan bergeser ke arah yang lebih panjang (UV menjadi VIS) dan
noda menjadi tampak oleh mata. Deteksi UV digunakan untuk mengetahui
senyawa yang tidak terlihat atau dengan sinar tampak (Tim Pengajar Teknik
Laboratorium, 2009).
Profil senyawa pada ekstrak kloroform daun Ambre hasil KLT dapat
dilihat pada Gambar 5.
A B C D
Gambar 5. Kromatogram hasil KLT ekstrak kloroform daun Ambre deteksi dengan (A) sinar tampak (B) UV254 (C) UV366 (D) serium (IV) sulfat
Fase diam : Silika Gel GF254 Fase gerak : Kloroform (CHCl3) Jarak pengembangan : 8 cm
Rf
Deteksi hasil KLT menggunakan sinar tampak, UV254, UV366, dan
serium (IV) sulfat menunjukkan adanya beberapa bercak yang terlihat pada
masing-masing deteksi. Deteksi kromatogram dengan sinar tampak (Gambar 5.A)
memperlihatkan bercak berwarna hijau tua dan kuning. Deteksi kromatogram
dengan sinar UV254 (Gambar 5.B) memperlihatkan terjadinya peredaman yang
ditandai dengan adanya beberapa bercak yang berwarna gelap pada latar belakang
yang berflourosensi hijau yang menunjukkan adanya senyawa.
Deteksi dengan sinar UV366 (Gambar 5.C) memperlihatkan bercak yang
berpendar menunjukkan bahwa senyawa tersebut memiliki ikatan rangkap
terkonjugasi yang panjang sehingga dapat berpendar pada penyinaran UV
0,75
0,5
0,25
0
1
gelombang panjang. Deteksi dengan pereaksi serium (IV) sulfat (Gambar 5.D)
memperlihatkan beberapa bercak berwarna coklat gelap. Hal ini menunjukkan
bahwa pada ekstrak kloroform daun Ambre tersebut terdapat senyawa organik.
2. Partisi
Tahapan partisi yang dilakukan pada penelitian ini menggunakan pelarut
wasbensin. Partisi bertujuan untuk memisahkan ekstrak kloroform daun Ambre
menjadi dua bagian yaitu bagian non polar dan bagian polar. Wasbensin bersifat
non polar, sehingga berdasarkan prinsip like disolve like (Harbone, 1987) bagian
non polar akan larut wasbensin, sedangkan bagian yang polar tidak larut
wasbensin. Berat hasil partisi ekstrak kloroform bagian larut wasbensin yang
diperoleh adalah 5,9 gram dan hasil partisi ekstrak kloroform bagian tidak larut
wasbensin adalah 3,6 gram.
Analisis profil kandungan kimia pada hasil partisi dilakukan untuk
mengetahui kesempurnaan pemisahan senyawa dengan partisi. Hasil dari KLT
partisi ekstrak kloroform daun Ambre dilihat pada Gambar 6.
Deteksi hasil KLT menggunakan sinar tampak, UV254, UV366, dan
serium (IV) sulfat terlihat adanya bercak-bercak pada posisi yang berbeda antara
bercak yang terdapat pada hasil partisi ekstrak kloroform bagian larut wasbensin
dengan bercak yang terdapat pada hasil partisi ekstrak kloroform bagian tidak
larut wasbensin. Hal ini menunjukkan bahwa partisi yang dilakukan dapat
memisahkan senyawa-senyawa yang terdapat ekstrak kloroform daun Ambre.
1 2 1 2 1 2 1 2 A B C D
Gambar 6. Kromatogram hasil KLT hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre deteksi dengan (A) sinar tampak (B) UV254 (C) UV366 (D) serium (IV) sulfat
Fase diam : Silika Gel GF254 Fase gerak : Kloroform (CHCl3) Jarak pengembangan : 8 cm Keterangan : 1. Larut wasbensin
2. Tidak larut wasbensin
Rf
0,75
0,5
0,25
0
1
B. Uji Mutagenisitas
Uji mutagenisitas dilakukan untuk mengetahui apakah suatu senyawa
bersifat mutagenik atau tidak. Uji mutagenisitas dapat dilakukan dengan berbagai
metode salah satunya dengan menggunakan bakteri yang dikenal dengan uji Ames
seperti yang dilakukan dalam penelitian ini. Prinsipnya bakteri yang digunakan
sudah dimutasi sehingga tidak mampu mensintesis salah satu jenis asam amino
esensial misalnya histidin untuk pertumbuhannya, oleh karena itu bakteri butuh
media yang mengandung histidin agar bisa tumbuh normal. Bila bahan uji yang
diperiksa bersifat mutagen, maka bakteri uji akan mengalami mutasi balik ke
fungsinya yang semula. Dengan demikian gen his yang termutasi akan mengalami
mutasi balik, gen his tersebut kembali normal sehingga bakteri uji dapat
mensintesis sendiri histidin yang dibutuhkan dalam pertumbuhannya, ditunjukkan
dengan pertumbuhan bakteri di dalam media yang kekurangan histidin (Radji
dkk., 2004)
Bahan uji berupa hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre yaitu
bagian larut dan bagian tidak larut wasbensin, masing-masing dilarutkan dengan
DMSO dan aquades. Tujuan penambahan DMSO adalah untuk mempermudah
proses pelarutan sampel uji. Pemberian DMSO tidak boleh melebihi 2% total
pelarut, karena DMSO dapat merusak senyawa jika terlalu banyak diberikan.
Selain itu DMSO bersifat tidak membunuh bakteri sehingga cocok digunakan
sebagai pelarut sampel.
Pengujian dilakukan menggunakan 3 bakteri uji dengan 4 seri
konsentrasi bahan uji dengan 3 ulangan. Bakteri dan bahan uji dimasukkan pada
media yang mengandung histidin-biotin. Medium yang mengandung histidin-
biotin sangat dibutuhkan oleh bakteri karena bakteri uji kehilangan kemampuan
dalam mensintesis histidin dan biotin sehingga bakteri membutuhkan histidin dan
biotin dari luar untuk pertumbuhannya (Radji dkk., 2004). Medium yang
mengandung histidin-biotin tersebut dituang pada cawan petri berisi media
minimum yang ditambahkan glukosa, diinkubasi selama 72 jam dan dihitung
jumlah koloni bakteri yang tumbuh. Bakteri dihitung dengan prinsip satu bakteri
akan membentuk satu koloni tanpa memperdulikan besar kecilnya koloni yang
terbentuk.
Sebagai kontrol positif digunakan sodium azide untuk Salmonella
typhimurium TA 100 dan 1535 serta 2-nitroflourene untuk Salmonella
typhimurium TA 98. Sodium azide dan 2-nitroflourene adalah mutagen standar
untuk masing-masing bakteri. Sodium azide dapat menyebabkan terjadinya mutasi
pasangan basa, sedangkan 2-nitrofluorene dapat menyebabkan terjadinya
frameshift mutation. Kontrol positif bertujuan untuk melihat kemampuan
mutagenisitas bakteri uji (Suprastiwi, 2009). Sebagai kontrol negatif digunakan
DMSO untuk melihat bahwa mutasi yang terjadi bukan disebabkan karena
pengaruh DMSO, melainkan dari sampel yang diuji.
Rata-rata hasil uji mutagenisitas partisi ekstrak kloroform daun Ambre
dengan menggunakan tiga bakteri uji Salmonella typhimurium TA 98, TA 100 dan
TA 1535 dapat dilihat pada Tabel 1 dan Tabel 2.
Tabel 1. Rata-rata hasil uji mutagenisitas partisi ekstrak kloroform daun Ambre
Jumlah rata-rata pertumbuhan koloni bakteri pada konsentrasi sampel uji (µg/mL)
Strain bakteri uji Sampel uji
1000 500 100 10 A
102 99,3 84,3 115 S. typhimurium
TA 98 B
96,7 93,3 76 79,3
A Tidak Terhingga
Tidak Terhingga
Tidak Terhingga
119 S. typhimurium
TA 100 B
81 56 55 50
A Tidak Terhingga
Tidak Terhingga
64 41 S. typhimurium
TA 1535 B
79,7 28,7 26,7 41
Keterangan : A. Bagian larut wasbensin ekstrak kloroform daun Ambre B. Bagian tidak larut wasbensin ekstrak kloroform daun Ambre
Tabel 2. Rata-rata hasil uji mutagenisitas kontrol
Strain bakteri uji Kontrol
Jumlah rata-rata pertumbuhan koloni bakteri
DMSO (-) 40 S. typhimurium TA 98 2-nitroflourene (+) 99 DMSO (-) 99,7 S. typhimurium TA 100 Sodium azide (+) 173 DMSO (-) 41,3 S. typhimurium TA 1535 Sodium azide (+) 93,7
Adapun perbandingan jumlah bakteri yang tumbuh tiap konsentrasi
dengan kelompok kontrol negatif dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3. Perbandingan jumlah bakteri yang tumbuh tiap konsentrasi dengan kelompok kontrol negatif
Perbandingan jumlah koloni bakteri yang tumbuh tiap konsentrasi dengan kelompok
kontrol negatif (µg/mL) Strain bakteri uji Sampel uji
1000 500 100 10 A
2,5 2,5 2,1 2,9 S. typhimurium
TA 98 B
2,4 2,3 1,9 2
A
Tidak Terhingga
Tidak Terhingga
Tidak Terhingga
1,2 S. typhimurium
TA 100 B
0,8 0,6 0,5 0,5
A
Tidak Terhingga
Tidak Terhingga
1,5 1 S. typhimurium
TA 1535 B
1,9 0,7 0,6 1
Keterangan : A. Bagian larut wasbensin ekstrak kloroform daun Ambre B. Bagian tidak larut wasbensin ekstrak kloroform daun Ambre
Berdasarkan hasil uji mutagenisitas hasil partisi ekstrak kloroform daun
Ambre menggunakan bakteri Salmonella typhimurium TA 100 dan Salmonella
typhimurium TA 1535, terlihat bahwa bagian larut wasbensin relatif lebih bersifat
mutagenik dibandingkan bagian yang tidak larut wasbensin. Hal ini dapat dilihat
dari rata-rata hasil uji yang menunjukkan bahwa jumlah koloni yang tumbuh pada
cawan petri yang berisi sampel bagian larut wasbensin lebih banyak bila
dibandingkan dengan jumlah koloni bakteri yang tumbuh pada kontrol negatif dan
jumlahnya rata-rata melebihi 1,8 kali jumlah bakteri yang tumbuh pada kontrol
negatif. Ini menunjukkan pada bagian larut wasbensin terdapat senyawa
mutagenik karena mampu membalikkan mutasi substitusi pasangan basa pada
bakteri Salmonella typhimurium TA 100 dan Salmonella typhimurium TA 1535.
Senyawa mutagenik tersebut bersifat non polar karena dapat larut dalam pelarut
wasbensin.
Pada bagian tidak larut wasbensin dengan menggunakan Salmonella
typhimurium TA 1535 sebagai bakteri ujinya, terdapat jumlah koloni bakteri yang
tumbuh lebih banyak bila dibandingkan jumlah koloni bakteri yang tumbuh pada
kontrol negatif yaitu 1,9 kali jumlah koloni bakteri pada kontrol negatif. Hal ini
terjadi karena pada bagian tidak larut wasbensin terdapat senyawa yang bersifat
mutagenik, namun tidak begitu kuat sehingga senyawa tersebut bisa bersifat
mutagenik pada konsentrasi tinggi. Ini dapat dilihat dari hasil uji yang
menunjukkan bahwa hanya pada konsentrasi 1000 µg/mL bagian tidak larut
wasbensin yang menunjukkan sifat mutagenik. Senyawa mutagenik tersebut
bersifat polar karena tidak dapat larut dalam pelarut wasbensin.
Pada pengujian sampel dengan menggunakan bakteri Salmonella
typhimurium TA 98 menunjukkan bagian larut wasbensin maupun tidak larut
wasbensin bersifat mutagenik. Keduanya menunjukkan jumlah pertumbuhan
koloni bakteri yang lebih banyak bila dibandingkan dengan kontrol negatif yaitu
rata-rata jumlahnya melebihi 1,8 kali jumlah bakteri pada kontrol negatif. Hasil uji
ini menunjukkan bahwa terdapat senyawa non polar pada bagian larut wasbensin
dan senyawa polar pada bagian tidak larut wasbensin hasil partisi ekstrak
kloroform daun Ambre yang mampu membalikkan frameshift mutation pada
bakteri Salmonella typhimurium TA 98.
Dilihat jumlah koloni bakteri yang tumbuh, senyawa atau zat aktif yang
terdapat pada bagian larut wasbensin dapat menyebabkan mutasi substitusi
pasangan basa dan frameshift mutation karena bakteri Salmonella typhimurium
TA 100 dan Salmonella typhimurium TA 1535 merupakan indikator jenis mutasi
substitusi pasangan basa, sedangkan Salmonella typhimurium TA 98 yang
merupakan indikator jenis mutasi frameshift mutation dapat tumbuh pada
pengujian ini. Berbeda dengan hasil uji bagian larut wasbensin, untuk bagian tidak
larut wasbensin hanya dapat menyebabkan terjadinya mutasi frameshift saja, hal
ini terbukti dengan banyaknya bakteri Salmonella typhimurium TA 98 yang
tumbuh.
Sifat mutagenik yang terdapat pada bagian larut wasbensin yang dapat
menyebabkan frameshift mutation lebih kuat bila dibandingkan sifat mutagenik
yang menyebabkan substitusi pasangan basa, karena pada konsentrasi 10 µg/mL
sudah mampu membalikkan frameshift mutation pada bakteri Salmonella
typhimurium TA 98. Sementara itu, hasil partisi bagian larut wasbensin yang diuji
dengan menggunakan bakteri Salmonella typhimurium TA 100 sudah mampu
membalikkan mutasi pasangan basa pada konsentrasi 100 µg/mL dan galur TA
1535 pada konsentrasi 500 µg/mL.
Perbedaan hasil antara galur TA 100 dan TA 1535 disebabkan karena
galur TA 1535 tidak memiliki plasmid pKM101. Gen his46 yang dimiliki oleh
galur TA 100 bekerjasama dengan plasmid pKM101 dalam mengkodekan gen
mucAB yang analog dengan gen umuDC pada E.coli K-12 yang berperan dalam
SOS-repair, sehingga galur TA 100 secara umum lebih sensitif bila dibandingkan
dengan TA 1535 ( Little dkk., 1989; Prival dan Zeiger, 1998). Ini dapat dilihat
dari jumlah bakteri yang tumbuh pada galur TA 100 jumlah bakteri tidak
terhingga muncul pada sampel dengan konsentrasi 100 µg/mL dan pada galur TA
1535 muncul pada konsentrasi 500 µg/mL.
Mutagen adalah segala sesuatu yang dapat menyebabkan mutasi, baik
berasal dari alam maupun sintetik. Mutasi adalah perubahan dalam materi genetik,
dapat diturunkan dan mencakup mikrolesi dan makrolesi. Mikrolesi adalah
perubahan pada struktur DNA (point of mutation), sedangkan makrolesi adalah
perubahan kromosom atau aberasi kromosom (Isnawati dan Alegantina, 2004).
Mutasi bisa bersifat merugikan bisa juga bersifat menguntungkan. Menurut Ames
menyatakan bahwa 90% senyawa yang menyebabkan mutasi dapat pula bersifat
karsinogenik (Lehninger, 1984). Namun tidak semua senyawa yang menyebabkan
mutasi dapat menyebabkan kanker, bahkan sebaliknya dapat menghentikan
aktivitas sel kanker dengan mekanisme tertentu.
Mutasi yang dapat menyebabkan kanker adalah mutasi yang
menyebabkan kelainan fungsi genetik yang merupakan akibat dari peristiwa-
peristiwa mutasional berganda. Mutasi-mutasi tersebut mengubah fungsi normal
suatu sel sehingga sel itu memiliki ciri-ciri berikut : (1) gangguan diferensiasi dari
sel dan jaringan akibat sel yang menjadi immortal (2) sel menjadi independen dari
kontrol-kontrol selular normal yang membatasi pertumbuhan dan pembelahan sel
(3) sel menjadi invasif dengan menyebar ke jaringan-jaringan lain dalam sebuah
proses yang disebut metastasis, (4) dan adanya pergeseran metabolisme ke arah
pembentukkan makromolekul dari nukleosida dan asam amino serta peningkatan
katabolisme karbohidrat untuk energi sel (Nafrialdi dan Gan, 1995: Elrod dan
Stansfield, 2002).
Selain itu, senyawa mutagen yang dapat menyebabkan kanker harus
memiliki kemampuan menyebabkan mutasi pada sel yang mengarahkan pada
pertumbuhan kanker. Diperlukan 5-10 mutasi genetik, untuk menjadi sel kanker
(Zakaria, 2001). Ada dua tipe mutasi yang berbeda yang bisa mengarah pada
pertumbuhan kanker. Tipe pertama adalah mutasi “pemerolehan fungsi” atau
“gain of function”. Pada sebuah gen yang dalam keadaan normal berfungsi dalam
pertumbuhan dan pembelahan sel. Pembelahan sel adalah suatu proses yang amat
rumit dan kemungkinan besar dikontrol oleh banyak gen berbeda (sebagian
merangsang, sebagian menghambat). Interferensi pada waktu gen-gen tersebut
bekerja, pada jumlah produk gen yang dihasilkan, atau pada aktivitas produk gen,
bisa mengarah pada kanker (Elrod dan Stansfield, 2002).
Kebanyakan sel dalam tubuh telah terdiferensiasi dan tidak membelah
secara aktif, dengan demikian gen-gen pembelahan sel biasanya dimatikan. Jika
gen-gen itu teraktivasi secara tidak benar, bisa mengakibatkan pembelahan sel
yang tidak terkendali, Gen tersebut diantaranya adalah onkogen, yang aktif akibat
mutasi akan memicu pertumbuhan sel yang mengarah pada terjadinya kanker
(Elrod dan Stansfield, 2002; Sofyan, 2005).
Tipe mutasi kedua adalah mutasi “hilangnya fungsi” atau “loss-of-
function” dalam gen supresor tumor. Peran normal gen supresor tumor adalah
sebagai supresor pertumbuhan dan pembelahan sel. Gen supresor tumor diaktifkan
dalam sel-sel normal. Jika gen tersebut dinonaktifkan secara tidak benar, sel bisa
memasuki siklus sel dan membelah (Elrod dan Stansfield, 2002; Sofyan, 2005 ).
Sebaliknya senyawa mutagen juga bisa bersifat sebagai antikanker bisa
dilihat dari mekanisme kerja beberapa obat antikanker yang berpengaruh langsung
terhadap asam nukleat sebagai target sasarannya. Adanya ganguan replikasi DNA,
transkripsi, translasi, dan sebagai zat pengalkil merupakan beberapa mekanisme
yang dapat menyebabkan gangguan fungsi dalam sel kanker yang sedang berlipat
ganda dengan cepat (Katzung, 1994; Myek dkk., 1997; Nogrady, 1992).
Berdasarkan hasil yang diperoleh, terlihat bahwa bagian larut wasbensin
memiliki sifat mutagenik terbesar dibandingkan bagian tidak larut wasbensin
dengan kemampuan dapat menyebabkan mutasi substitusi pasangan basa dan
frameshift mutation.
Mutasi substitusi pasangan basa terdiri dari transisi dan transversi.
Mutasi ini mengakibatkan terjadinya pergantian asam amino oleh asam amino lain
pada urutan polipeptida yang disandi oleh suatu gen. Pada kasus tertentu residu
asam amino yang digantikan dapat bersifat kritis dan menyebabkan protein sama
sekali tidak dapat melakukan fungsi biologis normalnya. Mutasi tersebut
seringkali mematikan sel (Lehninger, 1982; Roberts, 2000).
Frameshift mutation merupakan peristiwa pergeseran bingkai pembacaan
yang disebabkan oleh adanya delesi atau insersi dari satu atau beberapa nukleotida
(Elrod dan Stansfield, 2002). Frameshift mutation dapat menyebabkan perubahan
yang ekstensif pada produk gen sehingga produk gen menjadi tidak aktif, terjadi
kerusakan kolinearitas diantara kodon-kodon pada urutan DNA dan urutan asam
amino polipeptida (Lehninger, 1982 ; Roberts, 2000).
Senyawa yang dapat menyebabkan frameshift mutation memiliki
kemampuan melakukan interkalasi atau penyisipan (Lehninger, 1982; Roberts,
2000). Sifat inilah yang dapat dimanfaatkan sebagai agen antikanker dengan
mekanisme yang sama yang dilakukan oleh beberapa obat antikanker. Beberapa
obat antikanker yang melakukan mekanisme tersebut adalah daktinomisin yang
dikenal dengan aktinomisin D, doksorubisin, adriamisin, dan daunorubisin (Myek
dkk., 1997; Foye, 1996; Nogrady, 1992). Mekanisme yang dilakukan oleh
daktinomisin adalah dengan cara melakukan interkalasi pada celah kecil heliks
rangkap antara pasangan basa DNA guanin dan sitosin, membentuk suatu
kompleks daktinomisin-DNA. Kompleks ini mengganggu polimerase RNA dan
pada dosis tinggi mampu menghambat sintesis DNA dan menstabilkan kompleks
DNA-topoisomerase II (Myek dkk., 1997).
Doksorubisin dan daunorubisin yang maksimal bekerja pada fase S dan
G2 melakukan interkalasi pada pasangan basa yang berdekatan dan mengikat ruas
fosfat-gula DNA sampai melingkar, sehingga menghambat sintesis DNA dan
RNA. Interkalasi ini dapat mengganggu reaksi lepas sambung pilah DNA yang
dikatalisasi oleh topoisomerase II sehingga pecah dan tidak dapat diperbaiki
(Myek dkk., 1997).
Enzim DNA topoisomerase II mempunyai fungsi yang penting dalam
proses intraseluler, yaitu berperan dalam proses replikasi, transkripsi, rekombinasi
DNA, dan proses proliferasi dari sel kanker. Adanya interkalasi yang dilakukan
suatu senyawa dapat mengganggu reaksi lepas sambung DNA yang dikatalisasi
oleh enzim topoisomerase II. Hal ini disebabkan karena ikatan antara enzim
dengan DNA sel kanker menjadi semakin lama. Akibatnya akan terbentuk Protein
Linked DNA Breaks (PLDB), dan terjadi fragmentasi atau kerusakan DNA sel
kanker dan selanjutnya berpengaruh terhadap proses di dalam sel khususnya
proses replikasi sel yang diakhiri dengan kematian sel kanker secara apoptosis
(Cumming dan Smyth, 1993; Sukardiman dkk., 2005; Yuwono, 2005; Myek dkk.,
1997).
Contoh obat antikanker lain yang melakukan mutasi dalam membunuh
sel kanker adalah cisplatin (cis-diamindikloroplatinum [II]). Cisplatin merupakan
obat kemoterapi yang cukup efektif karena dapat membunuh sel kanker pada
setiap siklus sel dengan menghambat biosintesis DNA, mengikat DNA melalui
pembentukan “interstrand cross-links”. Tempat ikatan utama adalah pada N7
guanin, tetapi interaksi kovalen dengan adenin dan sitosin juga terjadi (Katzung,
1994; Savitri dkk., 2008).
Selain itu terdapat beberapa obat antikanker yang berasal dari tanaman
yang saat ini banyak digunakan, salah satunya adalah paclitaxel. Paclitaxel atau
yang dikenal dengan nama dagang taxol, merupakan senyawa diterpenoid.
Senyawa ini umumnya diproduksi oleh endofit Pestalotiopsis microspora, yang
diisolasi dari tanaman Taxus andreanae, T. brevifolia dan T. wallichiana yang
efektif untuk mengatasi kanker rahim, kanker payudara stadium lanjut, kanker
paru-paru, dan sarcoma karposi. Molekul taxol di dalam tubuh akan berinteraksi
dengan tubulin. Tubulin merupakan komponen dominan dalam mikrotubulus,
berbentuk seperti silinder dan merupakan bagian dari sistem kerangka sel.
Interaksi taxol dengan tubulin akan membentuk ikatan taksol-tubulin sehingga
menciptakan sel yang stabil yang berakibat terhalangnya perubahan formasi
protein. Taxol juga disebut sebagai penstabil mitosis, karena jika taxol
membentuk ikatan dengan tubulin maka protein akan kehilangan fleksibilitasnya
dan mikrotubulus tidak akan bisa dirombak lebih lanjut. Studi lain
memperlihatkan bahwa taxol hanya berikatan dengan tubulin yang telah
terpolimerisasi dalam suatu rantai protofilamen yang biasa terdapat pada sel
kanker, bukan dengan protein bebas (Katzung, 1994; BPOM RI, 2003; Strobel
dan Daisy, 2003; Radji, 2005).
Berdasarkan beberapa contoh obat antikanker tersebut, sifat mutagenik
yang dimiliki suatu senyawa dapat dimanfaatkan sebagai antikanker. Selain itu,
senyawa mutagenik dapat juga mencegah terjadinya mutasi. Kaleeswaran dkk.
(2009) melaporkan hasil penelitiannya tentang senyawa sylimarin yang diisolasi
dari tanaman Silybum marianum. Senyawa ini memiliki sifat mutagenik, dan
dapat berfungsi sebagai antimutagenik. Sifat mutagenik yang dimiliki oleh
senyawa ini efektif meningkatkan sintesis MGMT (O6-methylguanine-DNA
methyltransferase levels). MGMT merupakan suatu enzim yang berfungsi dalam
proses perbaikan protein DNA, melindungi sel dan oncogen yang dapat aktif jika
terkena induksi oleh senyawa mutagenik pengalkil baik yang berasal dari dalam
sel (endogenous alkilating agent) atau yang berasal dari luar sel (exogenous
alkylating agent) (Niture dkk., 2007).
C. Deteksi Golongan Senyawa Partisi Teraktif
Setelah melakukan uji mutagenisitas dengan menggunakan 3 bakteri uji,
diperoleh hasil bahwa hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre bagian larut
wasbensin menunjukkan sifat mutagenik yang lebih besar bila dibandingkan
bagian yang tidak larut wasbensin, sehingga bagian larut wasbensin dideteksi
golongan senyawanya dengan metode KLT dan beberapa pereaksi semprot.
Profil KLT hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre larut wasbensin
dengan berbagai deteksi penampak bercak dapat dilihat pada Gambar 7.
Gambar 7. Profil KLT hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre larut wasbensin deteksi dengan (A) sinar tampak (B) UV254 (C) UV366 (D) serium (IV) sulfat
Fase diam : Silika Gel GF254 Fase gerak : Kloroform (CHCl3) Jarak Pengembangan : 7 cm
A B C D
Rf
0,75
0,5
0,25
0
1
Deteksi hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre larut wasbensin
dengan sinar tampak (visibel) (Gambar 7.A) memperlihatkan beberapa bercak
berwarna kuning, hijau dan coklat. Deteksi dengan sinar UV254 (Gambar 7.B)
memperlihatkan terjadinya peredaman yang ditandai dengan adanya beberapa
bercak yang berwarna gelap berlatar belakang flouresensi hijau. Peredaman yang
terjadi pada UV254 ini menunjukkan adanya suatu senyawa. Deteksi dengan sinar
UV366 (Gambar 7. C) memperlihatkan beberapa bercak yang berflouresensi. Ini
menunjukkan bahwa senyawa tersebut memiliki ikatan rangkap terkonjugasi yang
panjang sehingga dapat berpendar pada penyinaran dengan UV gelombang
panjang. Deteksi untuk senyawa organik secara umum dilakukan penyemprotan
dengan pereaksi semprot serium (IV) sulfat yang memperlihatkan bercak
berwarna coklat (Gambar 7. D) dengan nilai Rf 0,24, 0,39, 0,63, 0,69, 0,77, 0,84
dan 0,79.
Deteksi dilanjutkan dengan menggunakan berbagai pereaksi semprot yang
spesifik untuk mengetahui jenis golongan senyawa yang terdapat pada hasil partisi
ekstrak kloroform daun Ambre bagian larut wasbensin. Pereaksi semprot yang
digunakan diantaranya FeCl3 untuk mendeteksi senyawa flavonoid dengan respon
positif menunjukkan adanya perubahan warna menjadi kuning (Ristiningsih,
2009). Vanilin H2SO4 untuk mendeteksi keberadaan senyawa terpenoid dengan
respon positif menunjukkan adanya perubahan warna menjadi biru sampai ungu
(Sulistijowati dan Gunawan, 2001). Lieberman-Burchard untuk mendeteksi
keberadaan senyawa triterpenoid (steroid) dengan respon positif menunjukkan
adanya perubahan warna menjadi merah untuk triterpenoid atau biru untuk steroid
(Ristiningsih, 2009).
Profil KLT hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre larut wasbensin
dengan berbagai deteksi pereaksi semprot spesifik dapat dilihat pada Gambar 8.
Hasil KLT hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre larut wasbensin
dengan deteksi sinar tampak, sinar UV dan dengan pereaksi semprot spesifik
disajikan pada Tabel 4.
A B C
Gambar 8. Profil KLT hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre larut wasbensin deteksi dengan (A) Vanilin- H2SO4 (B) Liebermenn-burchard (C) FeCl3
Fase diam : Silika Gel GF254 Fase gerak : Kloroform (CHCl3) Jarak Pengembangan : 7 cm
RRf
0,75
0,5
0,25
0
1
Tabel 4. Hasil KLT hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre larut wasbensin dengan deteksi sinar tampak, sinar UV dan dengan pereaksi semprot spesifik
Penampakan Bercak Rf
visibel UV254 UV366 SS VA LB FeCl3 0,24 kuning peredaman - Coklat coklat - coklat 0,39 hijau gelap peredaman - Coklat hijau tua hijau ungu 0,63 kuning peredaman - Coklat ungu ungu ungu 0,69 hijau gelap peredaman putih Coklat ungu coklat ungu 0,77 coklat peredaman - Coklat - hijau kuning 0,84 - peredaman - Coklat coklat hijau - 0,97 kuning peredaman Putih Coklat ungu ungu -
Keterangan : 1. SS = Serium (IV) sulfat 2. VA = Vanilin –asam sulfat 3. LB = Lieberman-Burchard
Berdasarkan data yang diperoleh hasil positif ditunjukkan oleh deteksi
dengan vanilin-H2SO4 dan FeCl3. Hasil positif untuk vanilin-H2SO4 ditunjukkan
dengan bercak berwarna ungu yang menunjukkan adanya senyawa terpenoid
dengan nilai Rf 0,63, 0,69 dan 0,97. Hasil positif untuk FeCl3 ditunjukkan dengan
adanya bercak berwarna kuning yang menunjukkan adanya senyawa flavonoid
dengan nilai Rf 0,77. Senyawa terpenoid dan flavonoid ini diduga merupakan
senyawa yang menyebabkan mutasi.
Senyawa terpenoid golongan diterpenoid dan senyawa flavonoid dari
beberapa tanaman telah diketahui memiliki aktivitas antimutagenik dan antikanker
dengan berbagai metode penelitian. Sotto dkk. (2009) melaporkan, senyawa
diterpenoid secoisopimarane dari tanaman Salvia cinnabarina yang diteliti
dengan uji mutagenisitas, memiliki akitivitas sebagai antimutagenik dengan
menghambat senyawa mutagen. Senyawa diterpenoid andrografolida dari tanaman
Sambiloto (Andrographis paniculata Nees), senyawa clerocidin dari jamur dan
senyawa kuinon salvicina mampu membunuh sel kanker dengan mekanisme
apoptosis (Sukardiman dkk., 2005; Jamora dkk., 2001; Miao dkk., 2003).
Senyawa sylimarin yang merupakan salah satu jenis flavonoida dari
tanamanan Silybum marianum dilaporkan memiliki aktivitas antimutagenik
terhadap beberapa mutagen dengan uji mutagenisitas (Kaleeswaran, 2009). Isolat
flavonoid dari herba benalu mangga (Dendropthoe petandra) mampu
menghambat pertumbuhan kanker pada mencit yang diinduksi dengan
benzopirena (Sukardiman dkk., 1999).
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa daun Ambre mengandung
senyawa terpenoid dan flavonoid yang berpotensi sebagai antikanker dengan sifat
mutasi yang dimilikinya. Diperlukan penelitian yang lebih lanjut untuk
mengetahui apakah sifat mutasi yang dimiliki daun Ambre benar-benar bersifat
selektif atau tidak, sehingga dapat dimanfaatkan untuk kepentingan manusia
khususnya dalam mengobati penyakit kanker.
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian yang diperoleh, maka dapat disimpulkan
bahwa :
1. Bagian larut wasbensin ekstrak kloroform daun Ambre yang diuji dengan
menggunakan bakteri Salmonella typhimurium TA 98 dapat menyebabkan
frameshift mutation pada konsentrasi 10 µg/mL dan yang diuji dengan
menggunakan bakteri Salmonella typhimurium TA 100 dan galur TA 1535
dapat menyebabkan mutasi substitusi pasangan basa pada konsentrasi 100
µg/mL dan 500 µg/, sedangkan bagian tidak larut wasbensin hanya dapat
menyebabkan frameshift mutation pada konsentrasi 10 µg/mL.
2. Pada bagian larut wasbensin ekstrak kloroform daun Ambre ditemukan
senyawa golongan flavonoid dan terpenoid.
B. Saran
1. Perlu adanya uji mutagenisitas lanjutan misalnya dengan menggunakan
aktivator metabolik untuk mengetahui apakah senyawa yang terdapat pada
hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre masih bersifat mutagenik atau
tidak setelah mengalami proses metabolisme.
2. Perlu adanya penelitian untuk mengetahui daya hambat hasil partisi
ekstrak kloroform daun Ambre terhadap senyawa mutagenik dengan uji
antimutagenik.
3. Perlu adanya uji lanjutan dengan meneliti hasil partisi ekstrak kloroform
daun Ambre pada sel kanker atau pada enzim topoisomerase II.
4. Perlu adanya identifikasi lebih lanjut terhadap senyawa yang memiliki
sifat mutagenik tersebut dengan melakukan isolasi.
DAFTAR PUSTAKA
Akrele, J. O. and E. E. O. Ebor. 2002. Studies on the Genotoxic and Mutagenic Potentials of Mefloquine. Tropical Journal of Pharmaceutical Research. 1 (2): 91-98.
Ames, B.N., F. D. Lee and W. E. Durston. 1973. An Improved Bacterial Test System for the Detection and Classification of Mutagens and Carcinogens. Proc. Nat. Acad. Sci. 70 (3) : 782-786.1
Ames, B. N., W. E Durston, E. Yamasaki, and F. D. Lee. 1973. Carcinogens are Mutagens: A Simple Test System Combining Liver Homogenates for Activation and Bacteria for Detection. Proc. Nat. Acad. Sci. 70 (8) : 2281-2285.2
Aulia, Y., J. Sugiyanto dan Y. Aida. 2002. Efek Klorambusil Terhadap Perkembangan Fetus Tikus Putih (Rattus norvegicus) Galur Sprague-Dowley. Biota. 7 (3) : 101-108.
Backer, C. A. and Bakhuizen V.d. B. Jr. 1968. Flora of Java Volume 3.
Netherlands: Netherlands Organisation for the Advancement of Research.
BPOM RI. 2003. Beberapa Tanaman yang Berkhasiat Sebagai Antikanker. InfoPOM. Vol. 6.
Burgess, J. A., C. W. Stevens and W. E. Fahl. 1985. Mutation at Separate Gene Loci in Salmonella typhimurium TA 100 Related to DMA Nucleotide Modification by Stereoisomeric Benzo(a)pyrene 7, 8–Dio l-9, 10-Epoxides. Cancer Research. 45 : 4257-4262.
Cumming, J. and J. F. Smyth. 1993. DNA Topoisomerase I and II as Target of Rational Design of New Anticancer Drugs. Ann. Oncology. 3(7): 533-534.
Dalimartha, S. 2004. Deteksi Dini Kanker dan Simplisia Antikanker. Swadaya, Jakarta.
DeMarini, D.M., M. L. Shelton, A. Abu-Shakra, A. Szakmary, and J. G. Levine. 1998. Spectra of Spontaneous Frameshift Mutations at the hisD3052 Allele of Salmonella typhimurium in Four DNA Repair Backgrounds. Genetics. 149 : 17-36.
Departemen Kesehatan RI. 2009. Ambre. http://tanamanobat.org//artikel//tentang tanaman obat/depkes/ buu/ 1-134.pdf [10 April 2009].
Dewi dan M. Leni. 2006. Efektivitas Daya Tolak Ekstrak Geranium radula Cavan. Terhadap Nyamuk Aedes aegypti (Linn.). Koleksi Skripsi, Tesis dan Disertasi Perpustakaan UPI. http://digilib.upi.edu/pasca/available/etd-0626106-084844/ [ 2 Mei 2009].
Dillon, D., R. Combes, and E. Zeiger.1998. The Effectiveness of Salmonella Strains TA100, TA102 and TA104 for Detecting Mutagenicity of Some Aldehydes and Peroxides. Mutagenesis. 13 (1): 19-26.
Erma, N. N. S., T. Sundari, A. I. Susanty, D. R. O. Palupi, Isnaeni, dan Sukardiman. 2004. Kajian Pendahuluan Uji Toksisitas Ekstrak Air Miselia dan Tubuh Buah Jamur Shiitake (Lentinus edodes) dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BST). Berk. Penel Hayati. 10 : 13-18.
Erold, S. L. dan W. D. Stansfield. 2002. Genetika edisi keempat. Erlangga, Jakarta.
Foye, W. 1996. Prinsip-prinsip Kimia Medisinal Edisi II. UGM press, Yogyakarta.
Fulton, A. M., S. E. Loveless and G. H. Heppner. 1984. Mutagenic Activity of Tumor-associated Macrophages in Salmonella typhimurium Strains TA98 and TA100. Cancer Research. 44 : 4308-4311.
Gernpharmtox. 2009. AMES TEST: Bacterial Reverse Mutation Assay. http://www.genpharmtox.com/[ 1 Januari 2010].
Guadano, A., E.D.L. Pena, A. Gonzalez-Coloma, and J.E. Alvarez. 1999. Development of New Bioluminescent Mutagenicity Assay Based on the Ames Test. Mutagenesis. 14 (4): 411-415.
Harbone, J.B. 1987. Metode Fitokimia. ITB, Bandung.
Haworth, S., T. Lawlor, K. Mortelmans, W. Specks, and E. Zeiger. 1983. Salmonella Mutagenicity Test Result for Chemicals. Enviromental Mutagenesis Suplement. Vol. 1.
Isnawati, A. dan S. Alegantina. 2004. Efek Mutagenik Ekstrak Etanol Daun Kajibeling (Strobilantus crispus). Bul. Penel. Kesehatan. 32 (3): 112-118.
Jamora, C., M. A. Theodoraki, V. Malhotra, and E. A. Theodorakis. 2001. Investigation of the Biological Mode of Action of Clerocidin Using Whole Cells Assay. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 9 : 1365-1370.
Kaleeswaran, S., P. Sriram, D. Prabhu, C. Vijayakumar, and L. N. Mathuram. 2009. Anti- and Pro-Mutagenic Effects of Silymarin in the Ames Bacterial Reverse Mutation Assay. Phytother. Res. 23 : 1378–1384.
Katzung, B. G. 1994. Basic and Clinical Pharmacology, 6th
Edition. Prentice Hall International Inc., London.
Lehninger, A.L. 1982. Dasar-dasar Biokimia Jilid 3. Erlangga, Jakarta
Leny, S. 2006. Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Pudding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp. USU Repository, Medan.
Levin, D. E., L. J. Marnett, and B. N. Ames. 1984. Spontaneous and Mutagen-Induced Deletions: Mechanistic Studies in Salmonella Tester Strain TA102. Proc. Nal. Acad. Sci. 81: 4457-4461.
Levine, J. G., R. M. Schaaper and D. M. DeMarini. 1994. Complex Frameshift Mutations Mediated by Plasmid pKM101: Mutational Mechanisms Deduced From 4-Aminobiphenyl-Induced Mutation Spectra in Salmonella. Genetics. 136 : 731-746.
Little, C. A., D. J. Tweats and R. J. Pinney. 1989. Relevance of plasmid pKM101-mediated mutagenicity in bacteria to genotoxicity in mammalian cells. Mutagenesis. 4 (5): 371-376.
Maliya, A. 2004. Perubahan Sel Menjadi Kanker dari Sudut Pandang Biologi Molekuler. Infokes. 8 (1).
Miao Z. H., T. Tao, Z. Y. Xiang, Z. J. Sheng, and D. Jian. 2003. Cytotoxicity, Apoptosis Induction and Downregulation of MDR-1 Expression by the Anti-Topoisomerase II Agent, Salvicine, in Multidrug-Resistant Tumor Cells. International Journal of Cancer. 106 (1) : 108-115.
McCann, J., N. E. Spingarn, J. Kobori, and B. N. Ames. 1975. Detection of Carcinogens as Mutagens: Bacterial Tester Strains With R Factor Plasmids. Proc. Nat. Acad. Sci. 72 (3) : 979-983.
Myek, M. J., R. A. Harvey, P. C. Champe, and B. D. Fisher. 1997. Farmakologi Ulasan Bergambar Edisi 2. Widya Medika, Jakarta.
Nafrialdi dan S. Gan. 1995. Farmakologi dan Terapi. Fakultas Kedokteran UI, Depok.
Niture, S. K., C. S. Velu, Q. R. Smith, G. J. Bhat, and K. S. Srivenugopa. 2007. Increased Expression of the MGMT Repair Protein Mediated by Cysteine Prodrugs and Chemopreventative Natural Products in Human Lymphocytes and Tumor Cell Lines. Carcinogenesis. 28 (2) : 378-389.
Nogrady, T. 1992. Kimia Medisinal Pendekatan secara Biokimia. ITB, Bandung.
OECD. (Organisasion for Economic Coorperation and Development). 1997. Guideline for the testing of Chemical : Bacteria Reverse Mutation Test. Guideline.471.
Pato, U. 2003. Potensi Bakteri Asam Laktat Yang Diisolasi Dari Dadih Untuk Menurunkan Resiko Penyakit Kanker. Jurnal Natur Indonesia. 5 (2): 162-166.
Prival M. J. and E. Zeiger.1998. Chemicals Mutagenic in Salmonella typhimurium Strain TA1535 But Not in TA100. Mutation research. Genetic toxicology and environmental mutagenesis. Vol. 412 : 251-260.
Radji, M., A. Sumiaty, dan N. Indani. 2004. Uji Mutagenisitas dan Anti Kanker Ekstrak Aseton dan N-Heksana dari Kulit Batang Sesoot (Garcinia picrorrhiza Miq.). Majalah Ilmu Kefarmasian. 1(2): 69-78.
Radji, M. 2005. Peranan Bioteknologi dan Mikroba Endofit dalam Pengembangan Obat Herbal. Majalah Ilmu Kefarmasian. 2 (3) : 113-126.
Ristiningsih, T. 2009. Uji Antibakteri Komponen Bioaktif Daun Lobak (Raphanus sativus L var. hortensis Back.) Terhadap Staphylococcus aureus Rosenbach. dan Profil Kromatografi Lapis Tipisnya. Skripsi. Universitas Sebelas Maret. Surakarta.
Roberts, G. 2000. Bacterial Genetics. University of Wisconins, Madison. http://lecturer.ukdw.ac.id/dhira/BactGenetics/TOC.html [ 1 Januari 2010].
Rohman, A. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar, Jakarta.
Rothman, S. 2009. Flower Morphology Of Pelargonium Odoratissimum And Pelargonium Ionidiflorum Using Scanning Electron Microscopy. Smith College, Northampton MA.
Sanderson, K. E. and Y. A. Saeed. 1972. P22-Mediated Transduction Analysis of The Rough A (rfa) Region of the Chromosome of Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 112 (1): 58-63.
Sastrohamidjojo, H. 1991. Kromatografi. Liberti, Jakarta.
Savitri, E., Eryadi D. dan Nur Q. 2008. Audiology Figures for Nasopharynx Carcinoma Patients from Wahidin Sudirohusodo Hospital, Makassar Before and After Treatment with Cisplatin. The Indonesian Journal of Medical Science. 1 (1) : 17-21.
Setiadarma, K. 2001. Penentuan Mutagenesis berbagai Zat Kimia dengan Bakteria untuk Kepentingan Manusia (Pendahuluan). Badan Litbang Kesehatan, Jakarta.
Shoeibi S., Rahimifard N., Pirouz N., Yalfani R., Pakzad S. R., Mirab S., and Pirali H.M. 2009. Mutagenicity of Four Natural Flavors: Clove, Cinnamon, Thyme and Zataria multiflora Boiss. Journal of Medicinal Plants. 8 (5) : 89-96.
Skopek, T.R., H. L. Liber, J.J Krolewski, and W. G. Thilly. 1978. Quantitative Forward Mutation Assay in Salmonella typhimurium Using 8-Azaguanine Resistance as a Genetic Marker. Proc. Natl. Acad. Sci. 75 (1) : 410-414.
Sofyan, R. 2005. Terapi Kanker Pada Tingkat Molekuler. Cermin Dunia Kedokteran No. 127.
Sotto, A. D., S. Mastrangelo, G. Romussi, A. Bisio, and G. Mazzanti. 2009. Antimutagenic Activity Of a Secoisopimarane Diterpenoid From Salvia cinnabarina M. Martens et Galeotti in The Bacterial Reverse Mutation Assay. Food and Chemical Toxicology 47 : 2092–2096.
Sukardiman, IGP Santa dan Rahmadhany. 1999. Efek Antikanker Isolat Flavonoid dari Herba Benalu Mangga (Dendrophtoe petandra). Cermin Dunia Kedokteran 122 : 5-8.
Sukardiman, A. Rahman, W. Ekasari, dan Sisimandari. 2005. Induksi Apoptosis Senyawa Andrografolida dari Sambiloto (Andrographis paniculata Nees) terhadap Kultur Sel Kanker. Media Kedokteran Hewan. 21 (3): 105-110.
Sukardiman, W. Ekasari, dan P. P. Hapsari. 2006. Aktivitas Antikanker dan Induksi Apoptosis Fraksi Kloroform Daun Pepaya (Carica papaya L) terhadap Kultur Sel Kanker Mieloma. Media Kedokteran. 22 (2): 104-111.
Sulistijowati, A., dan Gunawan, D. 2001. Efek Ekstrak Daun Kembang Bulan (Tithonia diversifolia) Terhadap Candida albicans Serta Profil Kromatografinya. Cermin Dunia Kedokteran 130: 32-36.
Sumpena, Y., R. Sofyan dan R. Rusilawati. 2009. Uji Mutagenisitas Benzo(a)piren dengan Metode Mikronukleus pada Sumsum Tulang Mencit Albino (Mus musculus). Cermin Dunia Kedokteran. Vol. 36 (1).
Suprastiwi, E. 2009. Analisis Mutagenisitas Tiga Jenis Semen Ionomer Kaca (SIK). Departement of Conservative Dentistry, Faculty of Dentistry University of Indonesia.
Suzuki M., Matsui K., Yamada M., Kasai H., Sofuni T., and Nohmi T. 1997. Construction of Mutants of Salmonella typhimurium Deficient in 8-Hydroxyguanine DNA Glycosylase and Their Sensitivities to Oxidative Mutagens and Nitro Compounds. Mutation Research. 393 (3) : 233-246.
Stahl, E. 1985. Analisis Obat secara Kromatografi dan Mikroskopi, diterjemahkan oleh Kokasih Padmawinata dan Iwang Soedira. ITB, Bandung.
Strobel, G. and B. Daisy. 2003. Bioprospecting for Microbial Endophytes and Their Natural Products. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (4): 491-502.
Svehla, G. 1990. Buku Teks Analisis Anorganik Kualitatif Mikro dan Semimikro. PT. Kalman Media Pustaka, Jakarta.
Tejs, S. 2008. The Ames Test: A Methodological Short Review. Environmental Biotechnology. 4 (1) : 7-14.
Tim Pengajar Teknik Laboratorium. 2009. Mata Kuliah Teknik Laboratorium. Biologi FMIPA Universitas Sebelas Maret, Surakarta.
Totušek, J., D. Lefnerová, M. Kyseláková, J. Balík, J. Veverka, J. Tříska, and N. Vrchotová. 2009. Antimutagenic Activity of Raw Materials and By-Products from Production of Grape Wines .Czech J. Food Sci. 26: 55-59.
Wahnschaffe, U. A. Bitsch, J. Kielhorn and I. Mangelsdorf. 2005. Mutagenicity Testing with Transgenic Mice. Part I: Comparison with the Mouse Spot Test. Journal of Carcinogenesis. 4 :3.1
Wahnschaffe, U. A. Bitsch, J. Kielhorn and I. Mangelsdorf. 2005. Mutagenicity Testing with Transgenic Mice. Part II: Comparison with the Mouse Borne Marrow Micronucleus Test. Journal of Carcinogenesis. 4 :4.2
Wahyuni, D. S. C. dan R. Rakhmawati. 2008. Skrining Toksisitas Beberapa Tanaman di Kawasan Tawangmangu Surakarta dan Profil Kandungan Kimianya. Laporan Penelitian LPPM, Universitas Sebelas Maret.
Wegrzyn G. and A. Czyz. 2003. A REVIEW : Detection of Mutagenic Pollution of Natural Environment Using Microbiological Assays. Journal of Applied Microbiology 95 : 1175–1181.
Yuwono, T. 2005. Biologi Molekuler. Erlangga, Jakarta.
Zakaria, F.R. 2001. Pangan dan Pencegahan Kanker. Teknol dan Industri Pangan. 12 (2).
Zakaria, Z. A. 2007. Free Radical Scavenging Activity of Some Plants Available in Malaysia. Pharmacology and Therapeutics. 5 (1): 87-91.