UJI ENDOTOKSIN

Marlia Singgih WibowoSchool of Pharmacy ITB

Pendahuluan

Produk alat kesehatanKontaminasi bakteriBakteri gram negatifKualitas produk farmasi dari aspekmikrobiologi

Pendahuluan

Produk farmasi parenteral

Produk-produk farmasi parenteral harus steril karena pemberianlangsung ke sistem sirkulasi pembuluh darah.

Salah satu tahap : Sterilisasi

Produk parenteral terkadang terkontaminasi oleh ENDOTOKSIN

Bagaimana produk parenteraldapat terkontaminasi endotoksin?

Pada proses sterilisasi produk parenteral(menggunakan panas), bakteri gram negatifyang mungkin ada dalam produk, akan matidan lisis terjadi, endotoksin akan terlepasdan tetap tinggal di dalam produkSifatnya stabil terhadap panas (heat-stable)

Endotoksin dan Pirogen

Endotoksin adalah toksin yang dihasilkan olehbakteri gram negatifPirogen adalah senyawa yang menyebabkankenaikan suhu tubuh akibat penggunaan produkfarmasi yang diberikan secara intravenaSemua endotoksin bersifat pirogen, tetapi tidaksemua senyawa pirogen itu merupakan endotoksinEndotoksin bakteri terdiri dari Lipopolisakarida(LPS), umumnya terikat pada protein dan fosfolipid. LPS ini menyusun membran luar bakteri gram negatif.

Struktur LPS

Contoh : LPS dari Salmonella terdiridari bagian Lipid A yang hidrofob yang terikat pada suatu daerah inti yang mengandung molekul KDO (2-keto-3-deoksioktonat)

Struktur LPS Salmonella

Mannose-AbequoseRhamnoseGalactose

Glucose-N-acetylglucosamineGalactose

Glucose-Galactose

Heptulose-P-P-Ethanolamine

KDO

P-GlcN-GlcN-P

Heptulose

KDO-KDO-P-Ethanolamine

n

Lipid A

Inti polisakarida

Rantai samping

Efek endotoksin bagi tubuh

• demam• aktivasi sistem sitokin• rusaknya sel-sel endotelial• permeabilitas pembuluh darah

berubah sehingga menyebabkanturunnya tekanan darah

• dll.

Perkembangan regulasitentang uji pirogen

Bacterial endotoxin test (BET) merupakansalah satu uji yang penting terhadap produkparenteral dan alat kesehatan1912 : uji pirogen dilakukan dengan metodekelinci (Rabbit test)Digunakan dalam USP XII pada tahun 1942 sampai 40 tahun kemudian1980 : metode baru diterapkan yaituLimulus amoebocyte lysate (LAL) test

LAL-test

The Limulus amebocyte lysate (LAL) test adalah uji in vitro untuk deteksidan analisis kuantitatif endotoksinbakteri. Metode analisis LAL yang dilakukanmencakup teknik gel-clot danturbidimetri kinetik dan kromogenik(kolorimetri)

Mengapa LAL test?

Limulus amebocyte lysate (LAL) test adalah metode alternatif terhadaprabbit pyrogen test yang difokuskanpada deteksi senyawa pirogen dalamproduk, untuk menghindaripenggunaan hewan/binatang dalampercobaanMetode lebih akurat

Limulus amebocyte lysateLisat diperoleh dari amubosit kepiting landam kuda(Limulus polyphemus)

Penggunaan LAL untuk deteksi endotoksin berawaldari pengamatan Bang (1956) bahwa infeksi bakterigram negatif pada Limulus polyphemusmenyebabkan koagulasi intravaskular yang parah.

Th 1964, Levin and Bang kemudian menunjukkanbahwa penggumpalan itu merupakan hasil reaksiantara endotoksin dan protein yang dapatmenggumpal dalam amubosit.

Solum (1970, 1973) dan Young (1972), melakukan pemurnian dan karaterisasiprotein yang dapat bergumpal dari reaksiLAL dan menunjukkan bahwa reaksidengan endotoksin merupakan reaksienzimatik.

Limulus polyphemus(horseshoe crab)

African Wolf Spider

Horseshoe crab

Cara memperoleh lysate

Untuk memperoleh LAL, horseshoe crabs yang berukuran besar ditangkap, cek kesehatannya, laludarahnya diambil dengan menggunakan jarumsuntik. Darah kepiting ini lalu disentrifuga untukmemisahkan amoebocytes dari plasma cairnya. Amoebocyte lalu di freeze-dried dan diproses untukdigunakan. Harganya : One quart of LAL is worth $15,000! Tiga perusahaan USA :

Associates of Cape Cod: http://www.acciusa.comCambrex: http://www.cambrex.com/default.aspCharles River Endosafe: http://www.criver.com/products/endotoxin/index.html

Metode LAL yang direkomendasioleh FDA – USA

Metode Gel-Clot : prinsip bahwa LAL menggumpal dengan adanya endotoksinMetode kinetik turbidimetri : menggunakankecepatan pembentukan gel untukmenentukan kandungan endotoksinMetode Kromogenik : menggunakansubstrat kromogenik sintetik, denganadanya LAL dan endotoksin, menghasilkanwarna kuning dan secara linier ekuivalendengan konsentrasi endotoksin yang ada

LAL Chromogenic endotoxin assay utilizes a modified Limulus Amoebocyte Lysate and a synthetic color-producing substrate to detect endotoxin presence. This assay is quantitative and the color intensity developed upon addition of the sample to the LAL supplied with the kit is proportional to the amount of endotoxin present in the sample and can be calculated from a standard curve. The kinetic chromogenic quantitative assay for bacterial endotoxin can be performed at the low assay range (0-5 EU/ml) or the higher range (5-50 EU/ml)

Metode kromogenik ada 2 :End point chromogenicKinetic chromogenic

Pemilihan metode tergantung padapenggunaan, volume uji, dan tipeproduk

Prinsip LAL test

• Uji LAL memanfaatkan dasar respon imun darikepiting landam kuda terhadap invasi bakteri gram negatif.

• Bahan-bahan yang terkandung dalam amubositkepiting landam kuda terdiri dari berbagai protein, faktor, kofaktor dan ion-ion yang berinteraksimenyebabkan koagulasi

• Endotoksin Gram negatif mengkatalisis aktivasiproenzim dalam lisat amubosit Limulus. Kecepatanawal aktivasi ditentukan oleh konsentrasiendotoksin

Selanjutnya enzim yang diaktivasi (enzimkoagulase) menghidrolisis ikatan spesifik dalamsuatu protein penggumpal (koagulogen) yang jugaterdapat pada lisat amubosit Limulus menghasilkankoagulin. Sekali terhidrolisis, koagulin yang dihasilkanbergabung dengan sendirinya dan membentuksuatu gumpalan/bekuan seperti gel

Skema reaksi enzimatik padapenggumpalan LAL

ENDOTOKSIN

FAKTOR C FAKTOR C YG DIAKTIVASI

FAKTOR B FAKTOR B YG DIAKTIVASI

PROCLOTTING ENZYME CLOTTING ENZYME

KOAGULOGENKOAGULIN (GEL)

ANTI FAKTOR G

FAKTOR G FAKTOR G YG DIAKTIVASI

Jalur alternatif

Penetapan batas endotoksin

1983 : FDA menentukan batasendotoksin berdasarkan dosismaksimum sediaan obat untukmanusia atau kelincidan penyesuaian batas endotoksinuntuk semua obat (kecuali intratekal) dari 2,5 EU kg-1 sampai 5,0 EU kg-1

EU = Endotoxin Unit

Batas deteksi untuk beberapa produkdiperoleh dari monografi USP atau EP. Kalau tidak dinyatakan dalamfarmakope, batas endotoksin harusdihitung dari dosis maksimum manusia

CALCULATION and MEASUREMENT

Beberapa istilah lain untukbatas deteksi endotoksin

EL: Endotoksin LimitMAEC (maximum allowable endotoxin concentration)ERL (endotoxin release limit)ELC (endotoxin limit concentration)

EL = K/M

K = konstanta = 5 EU atau IU per kg beratbadan, M = dosis maksimum untuk manusiaper kg per jam. Umumnya dinyatakan sbb :Batas endotoksin untuk berat badan rata2 70 kg = 350 EU per jam (5 EU kg-1)

Batas endotoksin vs volume sediaan per jam

Harus diperhatikan bahwa batas endotoksindinyatakan per jam. Oleh karena itu konsentrasiyang dibolehkan untuk endotoksin per mililiterinjeksi beragam tergantung pada volume pemberian dalam satu jam.

Suatu dosis tunggal injeksi 1 ml secara teoritismengandung 349 EU per ml dan masih diijinkanpada uji endotoksin bakteri, sedangkan infusdengan volume 1 L harus mengandung kurang dari0,349 EU per ml

Perhitungan MVD dan MVC

MVD = Maximum Valid Dilution (pengenceranmaksimum)MVC = Minimum Valid Concentration (konsentrasiminimum)MVD dan MVC adalah perhitungan yang menunjukkan seberapa banyak pengenceran yang harus dilakukan untuk mengatasi kemungkinaninterferensi, sebelum efek pengenceran melampauikemampuan uji LAL yang digunakan untukmendeteksi endotoksin dalam sediaan asli

Kapan digunakan istilah MVD?

MVD biasanya digunakan untuksediaan yang berbentuk cairan dimanapemberian dinyatakan dalam per mililiter, contoh: dosis tunggal injeksi 2 ml dan batas endotoksin dinyatakandalam EU ml-1

Kapan digunakan istilah MVC?

MVC biasanya digunakan untuksediaan dengan batas endotoksindinyatakan dengan EU mg-1 dan dosisdinyatakan dengan mg/ kg bb.

Penentuan MVD dan MVC tergantungpada sensitivitas lisat yang digunakan(λ). Semakin sensitif lisat atau metoda, semakin tinggi MVD atau semakinrendah MVC

Perhitungan MVC

MVC = λ MK

λ = sensitifitas dari lisat yaitu nilaiterkecil dari standar untuk pengujiankuantitatifK= konstanta = 0,5 EU kg-1 M= dosis maksimum manusia

Perhitungan MVD

MVD = C x Kλ x M

C = konsentrasi obatK = konstanta = 0,5 EU kg-1 M= dosis maksimum manusia

Contoh

Potensi injeksi insulin 100 unit per ml, dosismaksimum 2 unit per kg dan sensitivitas lisat 0,125 unit/ml, maka

MVD = 100x 5 = 1: 20000,125 x 2

Nilai MVD dapat diperoleh dari MVC

MVD = potensi sediaan/MVC

LAL test untuk alat kesehatan

Kadar endotoksin pada alat kesehatan diperolehdengan prosedur ekstraksi, yaitu dengan caramerendam sejumlah alat pada cairan pengekstraksibiasanya pereaksi air LAL. Nilai batas 20 EU per alat dinyatakan dalam addendum USP 1997, jadibatas maksimum konsentrasi endotoksin yang diijinkan dalam cairan hasil ekstraksi (ERL) dihitungdengan rumus:

ERL = K x N/V

K = 20 EU, N = jumlah alat dan V = total volume larutan ekstraksi

Metode Gel-Clot

Pada metode ini, hasil akhir dapatdideteksi berupa spot pada slide, ataumicroplatePerlu pembanding, berupa Control Standard Endotoxin (CSE)Peralatan gelas yang digunakan harusdi “de-pirogenasi”

Prinsip uji dan prosedur

100 ul CSE dimasukkan ke dalam tabunggelas depirogen (positive control)LAL reagent water (negative control)Sampel jumlah sama+ 100 ul lysateInkubasi 37°C di atas penangas air selama1 jamTabung lalu dibalik perlahan (180° ) untukmelihat solid clot yang terjadi

Hal yang harus diperhatikandalam metode gel-clot

Untuk membuat alat-alat depirogen : pemanasan pada 180°C, selama 4 jam atau250°C selama 30 menitTeknik pengerjaan pada saat membaliktabung kira-kira selama 2 detikpH sampel 7,0 – 8,0. Jika diperlukan pH diatur menggunakan asam atau basadepirogen

Sensitivitas Lisat pada Gel-Clot

Diperlukan untuk menentukan konsentrasiminimum endotoksin yang menyebabkanterjadinya gelSatuan dinyatakan dalam EU atau IUDibuat 1 seri pengenceran endotoksin(dalam EU/mL) dan percobaan dilakukanrangkap 4 (quadruplicate)Titik akhir pengenceran (end-point dilution) ditentukan pada pengenceran terakhir yang masih memberikan reaksi positif

Metode kromogenik

Metode kromogenik merupakan metodeLAL test yang paling banyak digunakan saatini karena lebih mudah dan murahSesuai untuk jumlah produk yang diuji tidakbanyak dan tidak sering (infrequent)Digunakan untuk uji sampel serum pada ujiklinis

Prinsip uji dan prosedur

Endotoksin akan mengkatalisis aktivasisuatu proenzimEnzim yang teraktivasi akan mengkatalisisterpecahnya PNA dari substrat Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-PNAPNA yang dilepaskan diukur secaraspektrofotometri pada 405 nmNilai absorbans sebanding dengan jumlahendotoksin , dibandingkan terhadapendotoksin standard menggunakan kurvastandard

New Discoveries

Alternatif thp LAL saat ini telah berhasil diteliti diIndia dan China, yaitu pereaksiTAL, or Tachypleusamoebocyte lysate, fungsinya mirip dengan LAL, juga untuk deteksi gram-negative bacteria.Scientists di Singapore tengah meneliti cloning gene pendeteksi toxin dalam darah horseshoe crab. Jika gen tsb dapat di klon derivat LAL dapat dibuattanpa harus menggunakan horseshoe crabs untukekstraksi darahnya.