Új Technológiai Lehetőségek Alkoholszegény Sörök Előállítására - Farkas

7/23/2019 j Technolgiai Lehetsgek Alkoholszegny Srk Ellltsra - Farkas

1/140

DOKTORI RTEKEZS

J TECHNOLGIAI LEHETSGEK

ALKOHOLSZEGNY SRK ELLLTSRA

FARKAS GABRIELLA

BUDAPEST,2007


2/140

2


3/140

TARTALOMJEGYZK

1 BEVEZETS ................................................................................................................6

2 IRODALMI TTEKINTS ............................................................................................8

2.1 A srlesztjellemzse ................................................................. ...................................................................... 82.1.1 Rendszertani besorols ................................................................. ................................................................... 82.1.2 Tpanyagszksglet.........................................................................................................................................9 2.1.3 Anyagcsere .................................................................... .............................................................. .................. 10

2.2 Killer lesztk jellemzse, ltrehozsa s alkalmazsa..................................................................................132.2.1 A Saccharomyces cerevisiaekiller rendszere.............................................. .................................................. 14

2.2.1.1 Az L-A mikovrus................................................................................................................................142.2.1.2 A szatellit M-dsRNS............................................................ ................................................................ 142.2.1.3 A K1, K2 s K28 toxinok.....................................................................................................................152.2.1.4 A K1, K2 s K28 toxinok hatsmechanizmusa....................................................................................152.2.1.5 Immunits ...................................................... ............................................................... ....................... 16

2.2.2 Killer rendszerek egyb leszt nemzetsgekben..........................................................................................172.2.2.1 Kluyveromyceslactis............................................................................................................................18 2.2.2.2 HanseniasporauvarumsZygosaccharomycesbailii .........................................................................18

2.2.3 Killer lesztk alkalmazsa ........................................................... ................................................................ 182.2.3.1 Borszat................................................................................................................................................19 2.2.3.2 Stipar................................................................................................................................................19 2.2.3.3 lelmiszeripari vonatkozs ozmofil s halofil killer lesztk............................................................20

2.2.4 Killer lesztk ltrehozsa.............................................................................................................................202.2.4.1 Killer srlesztk ltrehozsa rare-mating mdszerrel ............................................................ ............ 212.2.4.2 Killer srlesztk ltrehozsa protoplaszt fzival..............................................................................22

2.2.5 Killer srlesztk erjeszt kpessgnek vizsglata......................................................................................23

2.3 Klcsnhatsok a mikroorganizmusok kztt...............................................................................................26

2.3.1 Klcsnhatsok osztlyozsa.........................................................................................................................262.3.1.1 Fbb klcsnhatsok..................... ..................................................................... .................................. 27

2.4 Kevert mikroba kultrk az lelmiszerekben................................................................................................292.4.1 A bor..............................................................................................................................................................292.4.2 A sr ......................................................... ................................................................ ..................................... 30

2.4.2.1 A lambic s gueze srk erjesztsnek jellemzse...............................................................................30

2.5 Sejtek rgztse s a rgzts fiziolgiai hatsa. Rgztett sejtek ipari alkalmazsai..................................32 2.5.1 Sejtrgztsi technikk...................................................................................................................................33

2.5.1.1 Sejtrgzts hordoz nlkl..................................................................................................................332.5.1.2 Keresztkts.........................................................................................................................................34 2.5.1.3 Kovalens kts.....................................................................................................................................34

2.5.1.4 Adszorpci ....................................................... .................................................................. .................. 342.5.1.5 Glbezrs............................................................................................................................................34 2.5.1.6 Folykony membrnba bezrs............................................................................................................352.5.1.7 Komplex rgztsi eljrsok.................................................................................................................35

2.5.2 A hordozval szembeni elvrsok.................................................................................................................362.5.3 Az immobilizls elnyei s htrnyai ................................................................ .......................................... 362.5.4 A rgztett sejtek fiziolgija.........................................................................................................................37

2.5.4.1 Sejtszaporods......................................................................................................................................38 2.5.4.2 Anyagcsere-termkek kpzdse ................................................................. ........................................ 392.5.4.3 Sejtsszettel (DNS-, RNS- s fehrjetartalom, tartalk sznhidrtok) ............................................... 41

2.5.5 A sejtrgzts sripari vonatkozsai ......................................................................... ..................................... 422.5.5.1 Folyamatos ferjeszts s szokols .......................................................................... .......................... 432.5.5.2 Alkoholmentes sr gyrtsa ............................................................... .................................................. 45

3 KSRLETI CLKITZS .........................................................................................48

3


4/140

4 ANYAGOK S MDSZEREK....................................................................................49

4.1 Felhasznlt anyagok.........................................................................................................................................494.1.1 leszttrzsek................................................................................................................................................49 4.1.2 Tptalajok......................................................................................................................................................50 4.1.3 Killer srleszt ltrehozsa..........................................................................................................................514.1.4 Maltk..........................................................................................................................................................52

4.2 leszttrzsek fenntartsa s szaportsa ............................................................... ....................................... 52

4.3 leszttrzsek szelektlsa a protoplaszt fzihoz........................................................................................524.3.1 Sznhidrt fermentcis teszt ................................................................ ........................................................ 524.3.2 Szaporodkpessg vizsglat 4C-on............................................................................................................534.3.3 Agar diffzis mdszer killer toxin termels kimutatsra ................................................................. .......... 53

4.4 Killer lesztk ltrehozsa s vizsglata ............................................................ ............................................. 534.4.1 Protoplaszt fzi............................................................................................................................................534.4.2 Kariotipizls pulzl glelektroforzissel....................................................................................................544.4.3 dsRNS plazmid izollsa killer lesztbl.....................................................................................................54

4.5 Kevert kultrs erjesztsekkel s klcsnhatsok vizsglatval kapcsolatos mdszerek.......................... 554.5.1 Srleszts idegen leszttrzsek arnynak meghatrozsa morfolgia alapjn..................................... 554.5.2 Lizin agar Saccharomycess nem-Saccharomycesleszttrzs megklnbztetsre.................................554.5.3 Kevert kultrs erjesztsek............................................................................................................................564.5.4 Kt leszttrzs klcsnhatsnak vizsglata................................................................................................56

4.6 Alkoholszegny srk ellltsnak modellezshez alkalmazott mdszerek ........................................... 574.6.1 Srl elllts laboratriumi krlmnyek kztt........................................................................................574.6.2 Vgerjedsfok meghatrozsa .................................................................. ..................................................... 584.6.3 Erjeszts laboratriumi krlmnyek kztt ................................................................... .............................. 584.6.4 lesztsejtek rgztse...................................................................................................................................58

4.7 Analitikai mdszerek .............................................................. ................................................................. ........ 584.7.1 Aromakomponensek meghatrozsa gzkromatogrffal...............................................................................584.7.2 Sznhidrttartalom meghatrozsa HPLC-vel...............................................................................................594.7.3 A sr paramtereinek meghatrozsa ................................................................ ............................................ 59

5 KSRLETI EREDMNYEK S RTKELSK .....................................................60

5.1 Killer srlesztltrehozsa s vizsglata ............................................................... ....................................... 605.1.1 Srleszt trzsek szelektlsa......................................................................................................................615.1.2 Killer srlesztk ltrehozsa protoplaszt fzival ............................................................... ........................ 62

5.1.2.1 dsRNS plazmid izollsa killer lesztbl...........................................................................................63 5.1.2.2 Kariotipizls pulzl glelektroforzissel .................................................................... ...................... 64

5.1.3 A protoplaszt fzival ltrehozott killer srlesztkiller aktivitsnak vizsglata ....................................... 655.1.3.1 Toxintermels klnbzhmrskleteken.........................................................................................65 5.1.3.2 Kevert kultrs toxinvizsglatok..........................................................................................................665.1.3.3 A dsRNS jelenltnek kimutatsa........................................................................................................67

5.2 Kevert kultrs erjesztsek srlesztvel s idegen lesztkkel ......................................................... .......... 695.2.1 leszttrzsek szelekcija ............................................................... .............................................................. 705.2.2 Kevert kultrs erjesztsek............................................................................................................................71

5.2.2.1 I. erjesztsi ksrlet. Monokultrs erjeszts........................................................................................715.2.2.2 II.a erjesztsi ksrlet. Kevert kultrs ferjeszts...............................................................................73 5.2.2.3 II.b erjesztsi ksrlet. Kevert kultrs uterjeszts......................................................................... .... 765.2.2.4 III. erjesztsi ksrlet. Kevert kultrs erjeszts megnvelt idegen leszt arnnyal...........................815.2.2.5 IV. erjesztsi ksrlet. Kevert kultrs erjeszts Saccharomyces cerevisiaeWS 34/70 srlesztvel sSaccharomycodes ludwigiilesztvel.....................................................................................................................85

5.3 leszttrzsek kztti klcsnhats vizsglata.............................................................................................875.3.1 A Saccharomycodes ludwigiilesztkiller aktivitsnak vizsglata ............................................................ 88

4


5/140

5.3.2 A Saccharomyces cerevisiaeWS 34/70 srleszts a Saccharomycodes ludwigiilesztklcsnhatsnakvizsglata kevert kultrs erjesztsekkel ........................................................................... .......................................... 89

5.3.2.1 Klcsnhats vizsglat 8C-on. I. erjesztsi ksrlet............................................................................905.3.2.2 Klcsnhats vizsglat 8C-on. II. erjesztsi ksrlet ................................................................. ......... 915.3.2.3 Klcsnhats vizsglat 20C-on. I. erjesztsi ksrlet..........................................................................925.3.2.4 Klcsnhats vizsglat 20C-on. II. erjesztsi ksrlet ................................................................... ..... 94

5.3.3 A klcsnhats vizsglatok eredmnyeinek sszefoglalsa s rtkelse ..................................................... 95

5.4 Biotechnolgiai mdszerek alkalmazsa alkoholszegny srk ellltsra.............................................. 975.4.1 Saccharomyces cerevisiaeWS 34/70 srlesztt s Saccharomycodes ludwigiilesztt tartalmaz keverkkultra alkalmazsa alkoholszegny sr ellltsra..................................................................................................97

5.4.1.1 Kevert kultrs erjeszts Saccharomyces cerevisiaeWS 34/70 srlesztvel s Saccharomycodesludwigiilesztvel...................................................................................................................................................97 5.4.1.2 Mdostott sznhidrttartalm srl ellltsa laboratriumi krlmnyek kztt ............................ 985.4.1.3 Sr ksztse laboratriumi krlmnyek kztt ...............................................................................102

5.4.2 Alkoholszegny sr ellltsa folyamatos erjesztrendszerben, rgztett hagyomnyos s killersrlesztvel...............................................................................................................................................................104

5.4.2.1 Hagyomnyos s killer srleszt rgztse.......................................................................................1045.4.2.2 Folyamatos erjeszts rgztett hagyomnyos s killer srlesztvel..................................................105

6 SSZEFOGLALS..................................................................................................111

7 SUMMARY...............................................................................................................116

8 J TUDOMNYOS EREDMNYEK........................................................................120

9 FELHASZNLT IRODALOM...................................................................................121

10 MELLKLETEK....................................................................................................132

5


6/140

1 BEVEZETS

A sriparban a kutats s fejleszts hangslya lnyegesen eltr ms ipargaktl. rta Dalgliesh

1972-ben. Rendes krlmnyek kztt az ipari kutats-fejlesztsnek az a clja, hogy a meglv

alapanyagokbl j termket hozzanak ltre, s ezeknek a termkeknek ltalban rvid az

letciklusa. Ezzel szemben a sr olyan termk, aminek az letciklust vtizedekben vagy akr

vszzadokban mrik, s a sripari kutats-fejleszts jelents mrtkben arra irnyul, hogy

alapveten ugyanazt a termket lltsk el vltoz alapanyagokbl. Ezrt a kutats-fejlesztsi

spektrum kutats rsze a tnyfeltrsra sszpontost, mg a fejleszts a folyamatok tkletestsrl

s vizsglatrl szl. (MARZ et al. 1994)

Dalgliesh 1972-ben megfogalmazott gondolatai a mai napig rvnyesek a sriparra. Az azta elmlt

34 v azonban elg hossz id ahhoz mg a sr letciklust figyelembe vve is , hogy j

termkek jelenjenek meg. Az elmlt vtizedben Magyarorszgon is jelents teret nyertek pldul az

alkoholmentes s alkoholszegny srk. Klnbz technolgival, de minden hazai srgyr

elllt ilyen termkeket, a fogyasztk pedig kezdik elfogadni azokat. A sr piacnak

visszaszorulsa miatt a cscstechnolgival felszerelt zemek kapacitsuk egy rszt azonban nem

tudjk kihasznlni. Ez taln jelzsknt szolglhatna a gyrtknak, hogy rdemes jszertermk(ek)

fejlesztsben gondolkodni a fogyasztk j csoportjnak meghdtsa rdekben. A

termkfejlesztst mint minden kutatst alapkutats kell, hogy megelzze.

Srgyrti krkben taln szokatlan gondolat a hagyomnyos srlesztn kvl ms leszttrzset

bevonni az erjesztsbe. Egy msik leszt kevert kultrban val alkalmazsa jszer zekkel,

aromkkal szolglna. Megfelel leszttrzs (maltz negatv) hasznlata pedig alkoholszegny

termket is eredmnyezhet. Kevert kultra hasznlatakor szmolni kell a sejtek kztti

klcsnhatssal, melynek termszete akr a ksbbi termk jellemzire is hatssal lehet. Ennek

feldertse nlkl nem alkalmazhat sikeresen tbb lesztegyazon folyamatban. Munkm egyik

clja volt egy vagy tbb olyan leszttrzs kivlasztsa, melynek a hagyomnyos srleszttleltr tulajdonsgai rvn szerepe lehet a jvben egy jszer termk kifejlesztsekor. Ehhez

kapcsoldan a hagyomnyos srleszt s a msik leszt klcsnhatsnak feltrkpezst is

feladatomnak tartottam.

Mindemellett gy vlem a sripari folyamatok tovbbi fejlesztse is fontos. Az 1970-es vek ta

az immobilizlt lesztsejtek alkalmazsval szmos kutatcsoport foglalkozik. A fejlesztsek egy

rsznek megvalsulsa a sripari kutatk egyik legjelentsebb eredmnye, m korltozott ipari

felhasznlsuk miatt a siker korn sem teljes. Munkmban genetikailag javtott, killertulajdonsggal rendelkezsrlesztt hoztam ltre protoplaszt fzival, majd rgztve vizsgltam s

6


7/140

hasonltottam ssze erjesztsi kpessgeit hagyomnyos srlesztvel. A genetikailag mdostott

lesztk vagy brmilyen ms sripari alapanyag hasznlatnak gondolata nem npszer a

srgyrtk krben. m, ha ez az leszt az erjesztsen tl tovbbi pozitv tulajdonsgokat is

hordoz, pl. vdekezni tud a vadlesztkkel szemben, akkor lehet ltjogosultsga.

A srgyrts az egyik olyan iparg, mely a tradcikat rendkvl fontosnak tartja. A rszlegesmegjuls azonban nem jelentene presztzs vesztesget, mert a megjuls maga a jv.

7


8/140

2 IRODALMI TTEKINTS

2.1 ASRLESZTJELLEMZSE

Ksrleti munkm lland szereplje volt a Saccharomyces cerevisiae srleszt, melyet az

albbiakban szeretnk bemutatni.

2.1.1 Rendszertani besorols

Emil Christian Hansen, dn fiziolgus az ale srlesztt nevezte Saccharomyces cerevisiae-nek,

mg a lager srleszteltrtulajdonsgait azzal hangslyozta, hogy kln fajba helyezte el, amit

Saccharomyces carlsbergensis-nek nevezett.Kreger-van Rija srlesztfajokat 1984-ben egy fajba

sorolta (Saccharomyces cerevisiae) (PRIEST&CAMPBELL 1996). A taxonmiai besorols jabb

vltozsa rvn a lager srlesztket 1990 ta a Saccharomyces pastorianus (szinonim

S. carlsbergensis) fajba soroljk (DEK 1998).

Rendszertanilag a S. cerevisiaefaj a Saccharomycesnemzetsgbe, a Saccharomycetaceaecsaldba,

azEndomycetalesrendbe, azAscomycetesosztlyba tartozik (DEK 1998).

A srleszt legfbb feladata, hogy a srlben tallhat erjeszthet sznhidrtokat alkoholl s

szn-dioxidd fermentlja gy, hogy ekzben megfelelmennyisgben kpezzen olyan anyagcsere-

termkeket (savakat, sztereket, kozmaolajokat, ketonokat), amelyek rzkszervi szempontbl is

kvnatosak a srben. Erre nem minden lesztkpes, mg ha a S. cerevisiae vagyS. pastorianus

fajba is tartozik (ROSE&HARRISON 1970). Ezeken tl a srleszt alkalmassgnak

meghatrozsban technolgiai szempontbl fontos tnyez a flokkulcis kpessg, amely

genetikailag meghatrozott. Csomsod s porlesztt klnbztetnk meg. A csomsod lesztk

az erjeds vge eltt agglutinldnak, mg a porlesztk hosszabb ideig finoman eloszolva lebegnek

(NARZISS 1981).

A srlesztk kt csoportba sorolhatk az alapjn, ahogy az erjeszts vgn viselkednek. Az n.

alserjeszts srleszt sejtjei a fermentci befejeztvel az erjeszttank aljra lepednek,

gylnek ssze. Ezek az lesztk a S. carlsbergensisfajba tartoznak, lager lesztnek is nevezik ket

s lager srk (pl. pilzeni tpus, mncheni tpus) gyrtshoz hasznljk a kontinentlis

Eurpban s a vilg szmos rszn. Az alserjeszts srlesztk jellemzen flokkull

(csomsod) lesztk. A msik csoportba az n. felserjesztssrlesztktartoznak, amelynek

sejtjei az erjed srl felsznn gylnek ssze, s kztk is elfordulnak flokkull lesztk. A

S. cerevisiae fajba soroljk ket s az ale tpus srk gyrtsakor hasznljk, jellemzenNagy-Britanniban. Kivtelt jelentenek a bzasrk, amikhez szintn felserjeszts srlesztt

8


9/140

alkalmaznak a vilg minden tjn. Megjegyzendazonban, hogy az ale s lager tpus srk kztti

eltrs nem kizrlag az lesztk klnbsgbl addik, mert a tbbi alapanyag (malta, koml,

vz), illetve a technolgia is eltr(ROSE&HARRISON 1970).

A als- s felserjesztslesztk kztt tovbbi klnbsgek is tapasztalhatk. Az alserjeszts

lesztk 5-10C-on erjesztenek, cskkent sprakpzkpessgek. A felserjesztsek 15-25C-onerjesztenek, sarjadzanak s sprznak (NARZISS 1981).

2.1.2 Tpanyagszksglet

A srleszt egyszer tpkzegen is kpes szaporodni, amely szmra erjeszthet sznhidrtot,

megfelelnitrognforrst, svnyi anyagokat s egy vagy tbb nvekedsi faktort tartalmaz. A srl

ha tisztn maltbl kszl idelis tpkzeg a srlesztszmra, tartalmazza a nvekedshez

szksges sszes tpanyagot (PRIEST&CAMPBELL 1996).

Sznhidrt szksgletA srlben tallhat sznhidrtok kzl a srleszt szmra a kvetkezk

erjeszthetk: glkz s fruktz (monoszacharid), maltz s szacharz (diszacharid), valamint

maltotriz s raffinz (triszacharid). A srleszt ezeken tl fel tudja hasznlni a mannzt, a

galaktzt s a pentzok kzl a xilulzt is. A srlesztkre jellemz, hogy a laktzt nem erjesztik

(NARZISS 1981, PRIEST&CAMPBELL 1996).

Nitrogn szksglet A srleszt mint minden ms leszt szmra az ammnium sk is

megfelelnitrognforrsnak szmtanak, ha a tpkzeg egyb szempontbl megfelel. Amennyiben

a tpkzeg srl, az lesztsejtek az abban tallhat aminosavakat veszik fel s asszimilljk

leggyorsabban, de a peptideket hasznostsra is kpesek (ROSE&HARRISON 1970).

svnyi anyag s tpanyag szksglet A srleszt svnyi anyag szksglete hasonl, mint

minden ms l szervezet: szksge van kliumra, vasra, magnziumra, mangnra, kalciumra,

rzre s cinkre. Tovbbi fontos svnyi anyagok a br, a nikkel, a kobalt, s a molibdn.

A srlesztnek szksge van n. nvekedsi faktor(ok)ra, amelyek kzl a biotin elengedhetetlen.

Az 1. tblzatban sszefoglaltam azokat a vegyleteket, amelyek ltalban az lesztk szmra

nvekedsi faktornak szmtanak, de amitl a srlesztk ignyei eltrhetnek

(PRIEST&CAMPBELL 1996, ROSE&HARRISON 1970).

1.tblzat Srleszttrzsek nvekedsi faktor ignye

NVEKEDSI FAKTOR IGNYH-vitamin (biotin) Szksges.pantotn sav Szksges.inozit Egyes srleszttrzseknek szksges, msoknak nem.BB1-vitamin (tiamin) Felserjesztssrlesztk trzseknek szksges, alserjesztssrleszttrzseknek nem.nikotin sav Nem szksges.BB6-vitamin (piridoxin) Nem szksges.

BB2-vitamin (riboflavin) Nem szksges.p-aminobenzoesav Felserjesztssrlesztk trzseknek szksges, alserjesztssrleszttrzseknek nem.folsav Nem szksges.ergoszterin Szigoran anaerob krlmnyek kztt szksges.

9


10/140

2.1.3 Anyagcsere

A srlesztanyagcsere folyamatai alapjaiban megegyeznek az egyb lesztfajokra jellemzekkel.

Itt csak azokat a folyamatokat kvnom kiemelni, amelyek a srgyrts szempontjbl valamely

mdon meghatrozak.

Sznhidrt-anyagcsere

Az leszta monoszacharidokat diffzival veszi fel, a szacharzt -fruktofuranozidz (invertz)

enzim bontja le a sejtfal kzelben glkzz s fruktzz. A maltznak s a maltotriznak kln

szlltrendszerei vannak a maltzpermez s maltotrizpermez rvn. Ezek az enzimek csak

akkor vannak jelen, ha az lesztmr adaptldott a kt sznhidrthoz ha az lesztt a ferjeds

utn azonnal jra felhasznljk, vagy szaportsa srlben trtnt (NARZISS 1981).

A raffinz esetben meg kell jegyezni, hogy azt teljesen (monoszacharidokra) csak az alserjeszts

lesztkpesek lebontani, mert rendelkeznek melibiz enzimmel is a -fruktofuranozidz (invertz)

mellett. A felserjesztsek a melibizt nem bontjk (1.bra) (DEK 1998).

Felserjesztssrleszt(S. cerevisiae)

Alserjesztssrleszt(S. pastorianus)melibiz invertz

invertz

RAFFINZ

Galaktz Glkz Fruktz

Melibiz Szacharz

1.bra. Als- s felserjesztssrlesztraffinz erjesztse (DEK 1998)

Nitrogn anyagcsere

A srleszt az aminosavakat meghatrozott sorrendben veszi fel a srlbl. A srl elegend

aminosavat s peptidet kell hogy tartalmazzon ahhoz, hogy az lesztszaporodst s az erjesztslefolyst a kvnt rtelemben lehetv tegye (NARZISS 1981).

A srl asszimillhat nitrogn tartalmhoz nagyobb mrtkben jrulnak hozz az aminosavak,

mint a polipeptidek, ezrt a srlevek szabad -aminonitrogn (SZAN) tartalmt szoktk megmrni.

A srl tlagos SZAN tartalma 100-140 mg/l. Ennl kisebb rtk mellett a fermentci lefolysa

nem megfelel(PRIEST&CAMPBELL 1996).

A vgtermk minsgnek szempontjbl klnsen fontos, hogy a srl elegend valint

tartalmazzon. Amennyiben nincs elg valin a srlben, az leszt sajt maga szintetizlja. Aszintzis egyik intermedier termke az -acetolaktt, amely kikerlve a sejtbl oxidatv

10


11/140

dekarboxilezdssel diacetill alakul (2. bra). A diacetil zlelsi kszbrtke rendkvl alacsony,

0,12-0,15 mg/l, ze pedig nagyon idegen a sr ztl. A ksz sr minsgt meghatrozan rontja,

ha annyi keletkezik a ficksrben, hogy azt a srlesztnem tudja lebontani az rlels folyamn.

CH3-CO-COOH CH3-C(OH)-COOHO=C-CH3

NADH+H+ NAD+

CH3-CO-CO-CH3

PIRUVT

-ACETOLAKTT

DIACETIL

(CH3)2-C(OH)-CH(OH)-COOH

(CH3)2-CH-CO-COOH

(CH3)2-CH-CH(NH2)-COOH

,-DIHIDROXI-IZOVALERT

-KETO-IZOVALERT

VALIN2.bra. A diacetil kpzdse

Lipid anyagcsereAz leszt lipidtartalma foszfolipidekbl, trigliceridekbl s szterinekbl tevdik ssze. Az

lesztlipidek a fehrjvel egytt kpezik az lesztsejtmembrnjt. Tekintve, hogy a sejtmembrn

szablyozza a tpanyagok sejtbe val beptst s a kivlasztott anyagcseretermkek sejtbl val

kizrst, a lipidek tevkenysge alapvetfontossg a sejtszaporodsnl.

Amennyiben nincs megfelelmennyisgmolekulris oxign a srlben, az lesztszaporodsa s

viabilitsa korltozott lesz, mert a sejtek nem kpesek teltetlen zsrsavakat ellltani a membrn

bioszintzishez. Msodlagos hatsa ennek ale srlesztknl az, hogy nagy mennyisgszter lesz

a ksztermkben (PRIEST&CAMPBELL 1996).

svnyi anyagok

Az srleszt optimlis mkdshez (a szaporodshoz s a fermentcihoz) szervetlen ionok

szksgesek, makromlos s mikromlos koncentrciban. Az leszt-anyagcsere szempontjbl

nagy jelentsgek a foszftok (ATP, ADP). A klium s a magnzium a sznhidrt-anyagcserben

vesz rszt. A vas s a rz kis mennyisgben is kpesek fiziolgiailag serkenten hatni. A cink

elsegti a fehrjeszintzist s a sejtszaporodst, illetve az alkohol-dehidrogenz alkotrszeknt

jelents hatst gyakorol a sznhidrtlebonts sebessgre. (NARCISS 1981, HEGYESN 2004)

A sr minsge szempontjbl jelents anyagcsere-termkek

Magasabb rendalkoholok (kozmaolajok): aminosavakbl kpzdnek, amelyek transzaminlssal

ketosavv alakulnak, majd dekarboxilezssel s redukcival alkoholl. Emellett keletkezhetnek

aminosavak intracellulris szintzisvel is.

Alifs alkoholok: n-propanol, n-butanol, izobutanol, optikailag aktv amil-alkohol (2-metil-butanol),

izo-amilalkohol (3-metil-butanol).

11


12/140

szterek: a sraroma f hordozi. Intracellulrisan az acetil-Ko-A vegyletek s az alkoholok

kondenzcijval kpzdnek. Kpzdsk sszefgg az leszt nvekedsvel, s a zsrsavak is

hatst gyakorolnak szintziskre. A sr fbb szterei az etil-acett s az izo-amilacett.

Acetaldehid: a ferjeds els48 rjban kpzdik piruvtbl, s a ficksr jellegzetes zt adja.

Kpzdst elsegti a nagy lesztadag, a magas erjesztsi hmrsklet s a kevs levegztets. Af- s uterjeds sorn mennyisge fokozatosan cskken (NARZISS 1981).

CAMPBELL (2000)a srlesztlegfontosabb tulajdonsgait az albbiakban llaptotta meg:

egyenletes z- s aromaanyag termels,

gyors erjeszts,

hatkony fermentci (maximlis etanol hozam, minimlis biomassza kpzds),

a kezdeti sznhidrttartalom okozta ozmotikus stressz, vgsalkohol- s szn-dioxid-tartalomtoxikus hatsval szembeni rezisztencia,

alkohol s sznhidrt tolerancia,

megfelelflokkulcis s lepedsi tulajdonsgok a fermentci vgn,

nagy arny viabilits a fermentci befejeztvel, mely lehetv teszi a felhasznlst tovbbi

erjesztsekhez,

genetikai stabilits.

12


13/140

2.2 KILLER LESZTK JELLEMZSE,LTREHOZSA S

ALKALMAZSA

A killer fenotipus felfedezsrl Saccharomyces cerevisiaelesztben Bevan s Makower szmolt

be elszr 1963-ban a XI. Nemzetkzi Genetikai Konferencin (SCHMITT&BREINIG 2002).

Azta is szmtalan vizsglat foglalkozik a killer jelensggel, bemutatva, hogy az meglehetsen

gyakori a termszetben s az lesztk szmos nemzetsgnl elfordul (BUZZINI et al. 2004,

CHEN et al. 2000, MIDDELBEEK et al. 1980, MITCHELL&BEVAN 1983, YOUNG&YAGIU

1978). Killer lesztket tbb termszetes elfordulsi helyrl izolltak, pl. gymlcskbl, ehet

gombbl, rothad nvnyekbl s talajbl, valamint sr s bor fermentcija sorn (WALKER et

al. 1995).

A killer lesztk exotoxint termelnek, ami elpuszttja az azonos vagy kzeli nemzetsgbe tartoz

rzkeny lesztsejteket, a sajt killer toxinjuk tevkenysgre azonban nem fogkonyak

(MAGLIANI et al. 1997). Noha a jelensg egy rvid mondatban sszefoglalhat, a htterben

tallhat rendszer igen sszetett, bonyolult s korntsem tekinthetteljes mrtkben felfedezettnek

s megismertnek. Pldul, arra az alapvetnek tnkrdsre, hogy mirt nem rzkenyek a killer

lesztk sajt toxinjukra, a mai napig keresik a vlaszt, folynak a vizsglatok (BREINIG et al.

2006).

A killer jelensget egy citoplazmsan rkld ketts-szl RNS (tovbbiakban dsRNS) vrus

jelenlte okozza. Az lesztsejtek tarts fertzttsge tneteket nem okoz, s nem jelent htrnyt az

egyes sejteknek sem.

Taln a Saccharomyces cerevisiae leszt killer rendszert trtk fel a legmlyebben az sszes

ismert leszt-dsRNS vrus rendszer kztt (MITCHELL&BEVAN 1983). YOUNG s YAGIU

1978-ban azt rta, hogy hrom klnbz killer csoport (rendszer) tallhat a Saccharomyces

nemzetsgen bell, majd ksbb mr t killer toxinrl szlnak a cikkek: K1, K2, K3, KT28 (K28

jells is elterjedt) s K3GR1 (EXTREMERA et al. 1982, VAGNOLI et al. 1993). A publikltcikkekbl azonban az is egyrtelm, hogy a mai napig csak a K1, K2 s KT28 toxin termeldsnek

molekulris httert s hatsnak mechanizmust trtk fel (MAGLIANI et al. 1997,

SCHMITT&BREINIG 2002, SCHMITT&TIPPER 1990). A K3 toxin hatsmechanizmusa nem

pontosan ismert (NOVOTN et al. 2004), s tbben is utalnak r, hogy nem klnthetel tisztn a

K2 toxintl, s felttelezhet, hogy az M3-dsRNS csak egy mutcija az M2-dsRNS-nek

(MUSMANNO et al. 1999, VAGNOLI et al. 1993).

13


14/140

2.2.1 A Saccharomyces cerevisiae killer rendszere

A toxintermelSaccharomyces cerevisiaekiller trzseket hrom nagy csoportra lehet osztani K1,

K2 s K28 , amelyek mindegyike egy sajtos killer toxint vlaszt ki. A toxin termelsrt egy

citoplazmsan rkld M-dsRNS szatellit vrus felels (ezeket ScV-M1, ScV-M2 s ScV-M28

jellssel illetik), amelynek stabil fennmaradsa s replikldsa a fertztt gazdasejt citoplazmjn

bell egy L-A segt vrus jelenlttl fgg. Azok a sejtek, amelyek nem tartalmazzk egyik

dsRNS-t sem, vagy csak L-A segtvrust hordoznak, rzkenyek a toxinra s nem killerek. Mg a

ScV-M1, ScV-M2 vagy ScV-M28 vrust hordozk killerek s nem rzkenyek a toxinra

(SCHMITT&BREINIG 2002). A hrom fajta killer toxint kdol hrom dsRNS mrete is

klnbz: ScV-M1 1,8 kilobzis, ScV-M2 1,5 kb s a ScV-M28 1,9 kb, ezek hasonl

szervezettsget mutatnak, mg ha jelentsebb szekvencia homolgia nincs is kzttk (MAGLIANI

et al. 1997).

2.2.1.1 Az L-A mikovrus

Az L-A vrus egy nll replikldsra kpes mikovrus, ami nem eredmnyez szlelhetfenotpust

a gazda sejtben, s nem szksges az M-dsRNS szatellit vrus jelenlte ahhoz, hogy fennmaradjon

vagy replikldjon. Az L-A vrus a Totiviridae vruscsaldhoz tartozik (SCHMITT&BREINIG

2002). A vrus egy 39 nanomter tmrj, burok nlkli izometrikus rszecske, amely egy

osztatlan ketts szl RNS-t tartalmaz (MAGLIANI et al. 1997). Az rett L-A vrus rszecskben adsRNS mrete 4,6 kilobzis, amely egy nagyobb burokfehrjt, s egy RNS fggRNS polimerz

enzimet kdol.

Az L-A mikovrusok segteni tudjk a szmos szatellit M-dsRNS egyiknek repliklst s burokba

zrdst, amelyek mindegyike egy killer-immun rendszert kdol. Az M szatellit genom s az L-A

klcsnhatsnak vizsglata rvn lehetett azonostani ngy termszetes vltozatt az

L-A dsRNS-nek (L-A-H, L-A-E, L-A-HN s L-A-HNB).

2.2.1.2 A szatellit M-dsRNS

A szatellit M-dsRNS-ek az RNS molekulk egy csaldja, ami a vrusszerrszecskkben van jelen,

tartsan megmaradva a Saccharomyces cerevisiae killer trzsek citoplazmjban. Az M-dsRNS

fenntartsa az L-A mindkt ORF-jnek (ORF: nyitott leolvassi keret) kifejezdstl fgg.

Megfigyeltk, hogy lnyegben minden L-A varins s M-dsRNS egymssal felcserlhet.

Ugyanakkor azt is megfigyeltk, hogy az L-A-HN megtallhat minden K1, illetve az L-A-H

minden K2 vad tpus killer trzsben. A genotpustl fggetlenl, az ScV-M1 kirekeszti, kizi az

ScV-M2-tt brmely killer trzsbl. Az M-dsRNS mrete kevesebb, mint fele az L-A dsRNSmretnek, s egy L-A ltal kdolt burokba van csomagolva (MAGLIANI et al. 1997).

14


15/140

2.2.1.3 A K1, K2 s K28 toxinok

A K1, K2 s K28 Saccharomyces cerevisiaekiller toxinok fehrje molekulk, amiket specifikus

szatellit dsRNS-t hordoz killer trzsek vlasztanak ki. A killer trzsek immnisak sajt toxinjukkal

szemben, de ms killer toxinra rzkenyek lehetnek.

A legtbbet tanulmnyozott s legjobban ismert killer toxin a K1-es, mrete 19 kDa. A toxin

molekula kt nem-glikolizlt alegysgbl ll, amit diszulfid-hd kt ssze. Az alegysg

9,5 kDa-os, mg a alegysg 9,0 kDa-os, amelyek egy 42 kDa-os glikolizlt prekurzor

molekulbl, a protoxinbl szrmaznak. Az M1-dsRNS elsdleges transzlcis termke egy 35

kDa-os, 316 aminosavbl ll polipeptid (preprotoxin).

A K2 s K28 toxinokat kevsb behatan tanulmnyoztk, mint a K1 toxint, de alapvet

sajtossgaik ismertek. A K2 toxin prekurzora egy 38,7 kDa nagysg 362 aminosavbl ll

molekula. A vgs s alegysgek nagyobbak, mint a K1 toxin esetben. A K28 toxin

preprotoxinja 345 aminosavbl pl fel, mrete 37,6 kDa. Az lesztsejtben lejtszd talakulsok

utn szintn egy dimer molekula vlasztdik ki a sejtbl, amiben az alegysget (10,5 kDa) s a

alegysget (11 kDa) szintn diszulfid-hd kti ssze.

2.2.1.4 A K1, K2 s K28 toxinok hatsmechanizmusa

Minden kivlasztott rett toxin kpes killer tevkenysgre rzkeny sejteken, klnbz

mechanizmussal (3. bra), ami specifikus elsdleges ktssel kapcsoldik egy a sejtfalban tallhat

receptorhoz. A toxinok hatsmechanizmust is a K1 toxin esetben tanulmnyoztk a

legbehatbban (MAGLIANI et al. 1997).

K1 clpontja:plazma membrn

membrn

membrn

sejtfal

sejtfal Sejt ciklus lelltsa +DNS szintzis blokkolsa

K28 clpontja:sejtmag

3.bra. A K1 s K28 killer toxinok hatsmechanizmusa(SCHMITT&BREINIG 2002)A szenzitv lesztsejt elpuszttst kt lpses folyamatknt mutatja be. Elszr a toxin a sejtfalon tallhat R1receptorhoz ktdik, majd az R2receptorhoz a citoplazma membrnon. A plazma membrnnal val klcsnhats utn aK1 toxin a sejten kvlrl hat s megzavarja a citoplazma membrn mkdst. A K28 toxin endocitzissal jut be a

sejtbe, hogy ott elrje clpontjt, az lesztsejtmagjt. (Az R1 s R2 felszni receptorok klnbzek mindkt toxinesetben.)

15


16/140

Tbb tanulmny arrl szmol be, hogy az rzkeny sejtekben a toxinkthelyeknek kt populcija

tallhat, amelyek nagyon klnbzaffinitssal lpnek klcsnhatsba a killer toxinnal. A ktds

els lpse ersen pH fgg, optimuma 4,6. A killer toxin kis affinitssal, nagy sebessggel

adszorbeldik a sejtfal receptorokhoz, amelyekbl sejtenknt tlagosan 1,1 x 107 molekula van

jelen. A msodik lps egy nagy affinits, kis sebessgenergia-fggklcsnhats a toxin s alehetsges plazma membrn receptor kztt, ami a tnyleges letlis hatshoz vezet. A sejtfal glkn

frakcijnak alkotit, elssorban a -1,6-D-glknt azonostottk, mint elsdleges toxin receptort, s

ezek sszelltshoz szmos lesztKRE (killer rezisztencia) gnre van szksg. Az rett toxin

mindkt alegysge szksges a receptorhoz val ktdshez. Elssorban a hidrofil alegysg

felels a ktdsrt, mg az alegysg multifunkcionlis mdon mkdik klnbz, egymst

rszben takar polipeptid rgikkal, amik szerepet jtszanak a killer aktivitsban, immunitsban s

a ktdsben is. Az leszt sejtfalhoz val ktdst kveten a K1 toxin a citoplazmatikusmembrnhoz szlltdik, ahol klcsnhatsba kerl egy msodlagos toxin receptorral, ami a sejt

felsznhez rgztett Kre1p fehrje. A toxin gy fejti ki a hatst, hogy feszltsgtl fggetlen kation

csatornkat hoz ltre a membrnon, ami az ionok kiramlst, a sejt sszezsugorodst s azutn

hallt okozza (ALFENORE et al. 2003, BREINIG et al. 2006, MAGLIANI et al. 1997,

MARTINAC et al. 1990).

A K2 toxin hatsmechnizmust nem jellemeztk mg ennyire mlyrehatan (NOVOTN et al.

2004), de aktivitsa tulajdonkppen megegyezik a K1 toxinval, annak ellenre, hogy eltr a

szerkezete. A K1 s K2 killer trzsek kpesek egymst elpuszttani, noha a sajt toxinjukra

immnisak. A kt killer fehrje termeldsnek mdja hasonl. A kt toxin egyb tulajdonsgaiban

is klnbzik, pldul a molekulatmegben, az izoelektromos pontban s a pH optimumban.

A K28 toxin viszont gy tnik, ms mdon hat a sejtciklusra. A toxin elssorban a sejtfal egyik 185

kDa nagysg mannoproteinjnek -1,3 ktsmannz reziduumhoz ktdik (MAGLIANI et al.

1997). A toxin receptor kzvettett endocitzissal kerl be az rzkeny sejtbe s miutn a

citoszolba szlltdik, blokkolja a DNS szintzist, majd a sejtciklus lellst, s kaszpz kzvettett

apoptzist eredmnyez (BREINIG et al. 2006). A lellts a G2 fzisban kvetkezik be, ami ahhoz

vezet, hogy az anya- s lenysejt nem tud elvlni, s a sejtmag nukleusz az anyasejtben marad. Azt

mg nem sikerlt tisztzni, hogy a toxin eldleges vagy msodlagos hatsa-e a korai,

visszafordthat DNS szintzis gtlsa.

2.2.1.5 Immunits

A K1 s a K28 toxinoknak mind a szintzise, mind a hatsa jl ismert. Mindezek ellenre, mg

mindig nem ismeretes az a mechanizmus, amivel a toxin termelsejtek elkerlik a fehrjk halloshatst. BREINIG s munkatrsai (2006) a K28 toxint szintetizl sejtek vdekezmechanizmust

16


17/140

vizsgltk. Ksrleteik igazoltk, hogy a toxint a sejt felveszi csakgy, mint az rzkeny sejtek

s az a citoszolba szlltdik. A jelenlegi adatok azt is kimutatjk, hogy mind a preprotoxin, mind

az rett toxin jelen van a K28 termelsejtek citoszoljban, s specifikus klcsnhats jtszdik le

kzttk. A klcsnhats eredmnyeknt egy preprotoxin/K28 komplex jn ltre, ami ubikinci

(egy ubikinin hozzktdik a komplexhez) majd az ezt kvet lebonts clpontjv vlik. Ez ahatkony s kls tnyezktl teljesen fggetlen mechanizmus lehetv teszi, hogy a K28-at

termelsejtek inaktivljk a toxint, mieltt a citotoxikus toxin elri a vgsintracellulris cljt.

Emellett pedig a mechanizmus nincs negatv hatssal a toxin termelsre sem.

2.2.2 Killer rendszerek egyb lesztnemzetsgekben

A Saccharomyces cerevisiaekiller rendszert tanulmnyoztk a legtbbet, de szmos ms leszt

nemzetsgnl is tapasztaltak hasonl jelensget. YOUNG s YAGIU (1978) hsz klnbz

nemzetsgbe s fajba tartoz killer leszt kztti klcsnhatsokat vizsglt, majd a killer

tulajdonsg s immunits alapjn tz tpusra osztotta ket K1-tl K10-ig. Ksbb mg egy tpust, a

K11-t is lertk, de az utbbi vekben felfedezett s vizsglt killer lesztket mg nem soroltk be

ebbe a csoportostsi rendszerbe (IZG&ALTINBAY 2004).

Tovbbi nemzetsgek, amelynek egyes fajai termelnek killer toxint: Candida, Cryptococcus,

Debaryomyces, Hanseniaspora, Kluyveromyces, Metschnikowia, Pichia, Schwanniomyces,

Torulopsis, Ustilago, Williopsis, Yarrowia, Zygosaccharomyces(BUZZINI et al. 2004, CHEN et al.

2000, IZG&ALTINBAY 2004, IZG et al. 2004, MAGLIANI et al. 1997, MARQUINA et al.

2001, MIDDELBEEK et al. 1980, SCHMITT&BREINIG 2002, TRTON et al. 1985).

Megfigyeltk, hogy a killer fenotpus kifejezdsnek genetikai alapja meglehetsen vltozatos

(2. tblzat).

2.tblzat A killer fenotipus kifejezdsnek genetikai alapja lesztkben(SCHMITT&BREINIG 2002)

LESZT GENETIKAI ALAP TOXIN GNSaccharomyces cerevisiae dsRNS vrus M1-, M2-, M28-dsRNSHanseniaspora uvarum dsRNS vrus M-dsRNSZygosaccharomyces bailii dsRNS vrus M-dsRNSUstilago maydis dsRNS vrus M-dsRNSKluyveromyces lactis lineris dsDNS plazmid pGKl1Pichia acaciae lineris dsDNS plazmid pPac1Pichia inositovora lineris dsDNS plazmid pPin1Pichia kluyveri kromoszmlis nincs azonostvaPichia farinosa kromoszmlis SMK1Pichia anomala kromoszmlis nincs azonostvaWilliopsis mrakii kromoszmlis HMK

17


18/140

Ez a genetikai vltozatossg termszetesen megjelenik az egyes toxinok hatsmechanizmusban is.

Megbontjk a citoplazmatikus membrn mkdst azltal, hogy egy ioncsatornt hoznak ltre,

vagy beavatkoznak a sejtfal szintzisbe gy, hogy gtoljk a -1,3-glkn szintzist. Nhny

esetben blokkoljk mind a DNS szintzist, mind a sarjadzs menett, vagy meglltjk a

sejtosztdst a G1 fzisban (IZG&ALTINBAY 2004, TAKASUKA et al. 1995).

2.2.2.1 Kluyveromyceslactis

A vletlennek ksznhet, hogy GUNGE s munkatrsai (1981) felfedeztk a killer tulajdonsgot a

Kluyveromyces lactislesztben. Tizenht lesztnemzetsg 70 trzst vizsgltk DNS plazmidok

utn kutatva. Ekkor fedeztek fel kt lineris DNS plazmidot egy petite negatv K. lactistrzsben,

amiket pGK1-nek s pGK2-nek neveztek el. Az elbbi plazmidot hordoz leszt killer

fenotpussal rendelkezett, elpuszttva a vizsglt Saccharomyces cerevisiae trzsek mindegyikt,

illetve a vizsglt Saccharomyces italicus s Kluyveromyces faj egyes trzseit. A toxin hrom

alegysgbl ll: az egy oligoszachariddal glikozillt polipeptid, mg a s a kisebbek s nem

glikozilltak. Az rett toxin vglegesen lelltja az rzkeny sejt sejtciklust a G1 fzisban gy,

hogy az utna nem kpes a mitotikus osztdsra. (MAGLIANI et al. 1997). Vizsglatok azt is

megmutattk, hogy a K. lactisltal termelt toxin pH 5 s 7 kztt aktv, ami valsznleg egyedl

erre a toxinra jellemz, hiszen a legtbb lesztkiller toxinnak pH 4,5-5 az optimlis tartomnya

(GUNGE et al. 1981).

2.2.2.2 HanseniasporauvarumsZygosaccharomycesbailii

A kt lesztkiller fenotpust lineris dsRNS vrus okozza, melyek rendkvl hasonltanak a S.

cerevisiaeScV-L-A s ScV-M vrusaihoz. Mindkt leszthordoz L- s M-dsRNS-eket, valamint a

Z. bailiiegyes vadtpusaiban egy Z-dsRNS is jelen van. rdekessge s fontossga a kt leszt

ltal termelt toxinnak, hogy azok szles spektrum antimikotikus potencillal brnak. A toxin nem

csak a farothaszt basidiomycetes s fitopatogn gombk, hanem a humn patogn Candida

albicans s Sporothrix schenkii ellen is hallos. A Zygocin (azaz a Z. bailii toxinja) pusztt

kpessge megkzelti bizonyos bakteriocinek s eukarita defenzinek hatst

(SCHMITT&NEUHAUSEN 1994, SCHMITT et al. 1997, SCHMITT&BREINIG 2002).

2.2.3 Killer lesztk alkalmazsa

Az elmlt vekben, vtizedekben mind a killer toxinokat, mind a toxinokat termel lesztket

szmos mdon igyekeztek alkalmazni. Az lelmiszeriparban jelents erfesztseket tettek annak

rdekben, hogy bevezessenek olyan j biotechnolgiai folyamaton alapul technolgikat

(MAGLIANI et al. 1997).

18


19/140

Klns figyelmet kap azoknak a killer lesztknek a hasznlata, amelyeket fermentcis

folyamatokhoz szelektltak starter kultrnak. Nhny trzset mr alkalmaznak a termelsben, mg

msok mg ksrleti szakaszban vannak.

2.2.3.1 Borszat

A killer lesztk elfordulsa a spontn borerjesztsekben igen magas, azonban ez vltozik a

fermentci egyes szakaszaiban s az vjratok sorn is, nveked tendencit mutatva az els

vjrattl kezdve az azt kvetekben, illetve az erjeszts megkezdstl annak vgig (VAGNOLI

et al. 1993). Az alkoholos erjeszts sorn a cukrok alkoholl s szn-dioxidd alakulnak, a

malolaktikus fermentci pedig tejsav s szn-dioxid kpzdshez vezet. Ezek olyan folyamatok,

amelyek a borok rzkszervi tulajdonsgait befolysol vegyleteket eredmnyeznek, ezltal

meghatrozzk a minsgket is. Ebbl kvetkezik, hogy a biotranszformcirt felels

mikroorganizmusokat baktriumokat s lesztket behatan tanulmnyozzk azzal a cllal,

hogy optimalizljk a mikrobilis anyagcserjket az ipari alkalmazsnak megfelelirnyba.

A bor spontn erjesztsnek kezdeti szakaszban Kloeckera, Metschnikowia s Hanseniaspora

lesztk is rszt vesznek. Ezek termszetesen fordulnak ela szln s a mustban. Hogy elhrtsk

a nem standardizlt krlmnyek okozta problmkat, borszatilag szelektlt tiszta kultrkbl

szrmaz fajokat hasznlnak.

Az lesztk genetikai manipullsa j transzformlt trzseket eredmnyez, amelyek a borkszts

szempontjbl olyan lnyeges tulajdonsgokkal rendelkeznek, mint a gyors erjeszts, az

alkoholtermels, a SO2 rezisztencia, a -1,4-endoglkanz szintzis, a flokkulci s a kedvez

aromatermels, s emellett killer fenotpusak, ami kedvez az endemikus mikrobita elleni

antagonizmusnak. Korltozott rtket kpvisel, ha olyan S. cerevisiaekiller izoltumot hasznlnak,

aminek toxikus hatsa csak az azonos faj trzseire korltozdik. A nemzetsgek s fajok kztti

ismert killer-rzkeny klcsnhatsok alapjn tanulmnyokat vgeztek, hogy ltrehozzanak egy

olyan szuperkiller lesztt, ami tbbszrs killer faktorral rendelkezik s kpes megelzni a

fertzst a taxonmiailag nem rokon lesztkkel szemben. Az idelis starter kultra jelltet akvetkezkppen kpzelik el: az lesztellenll a mikrobilis toxinoknak s olyan toxint termel,

ami elpuszttja az endemikus lesztket, penszeket s baktriumokat. Ltrehozsra klnbz

genetikai mdszereket prbltak ki.

2.2.3.2 Stipar

IZG s munkatrsai (2004) egy olyan Saccharomyces cerevisiaelesztbe transzferltak K3 killer

tulajdonsgot protoplaszt fzival, amely szles krben alkalmazott Trkorszgban a stiparban.

Erre azrt volt szksg, mert azonostottak egy K3 s K8 tpus toxint termelCandida tropicalis

killer trzset, ami slyos problmkat okozott a stleszt szaportsa sorn. A mvelettel a

19


20/140

S. cerevisiaetrzs rezisztenss vlt a fertzleszttoxinjval szemben. Hasonl sikeres munkrl

szmoltak be BORTOL s munkatrsai (1986), akik olyan killer stlesztt hoztak ltre, amelynek

az ipar szempontjbl fontos tulajdonsgai (felhajt er, klnbzsznhidrtok fermentcija s

asszimilcija) a szli trzzsel megegyezk voltak.

2.2.3.3 lelmiszeripari vonatkozs ozmofil s halofil killer lesztk

Szintn ipari rdekldsre tarthat szmot az ozmofil killer lesztk felfedezse, amelyek a killer

aktivitst csak nagy koncentrcij sk, pl. NaCl vagy KCl jelenltben fejtik ki. Kluyveromyces

trzsek killer aktivitst vizsgltk Zygosaccharomyces rouxii ellen sk jelenltben, s talltak

olyan izoltumokat, amelyek hasznosak lehetnek egy olyan termszetes tartstszer

kifejlesztsben, ami megelzi a szott fermentlt lelmiszerek jra-fermentcijt (MAGLIANI et

al. 1997).

Mivel a halotolerns s halofil lesztk fontos szerepet jtszanak a szjaszsz s egyes szott

zldsgek rzkszervi tulajdonsgainak kialaktsban, elkpzelhetlenne a nemkvnatos fertz

mikrobk gtlsa killer lesztk alkalmazsval. Pldul az olvabogy pclbl izollt Candida

boidinii IGC3430 rzkenynek bizonyult, amely lipolitikus aktivitsval s a tejsav

asszimilcijval kros hatst fejt ki.

2.2.4 Killer lesztk ltrehozsa

A srleszt genetikai mdostsa akrcsak az ilyen mdon megvltoztatott tulajdonsgokkalrendelkezegyb alapanyagok hasznlata a mai napig igen knyes krdsnek szmt a srgyrtk

krben. Ezzel prhuzamosan s ennek ellenre azonban, a sripari kutatsok egy rsze mr

vtizedek ta ezzel a tmval foglalkozik.

Az lesztgenetikai mdostsra kt alapveten klnbzmegkzelts ltezik (ISERENTANT

1989). Az egyik megkzeltsben egy mr lteztrzset csak csekly mrtkben vltoztatnak meg

j tulajdonsgot adva neki anlkl, hogy a trzs tbbi jellegzetessgt ez rinten. Az ilyen

vltoztatst mutagenezissel, klnozssal s transzformcis technikkkal lehet elrni. A msikmegkzeltsben viszont egy teljesen j trzset hoznak ltre gy, hogy lteztrzsekbl szrmaz

ptkveket raknak ssze. Az gy ltrejv kombincinak hordoznia kellene minden pozitv

tulajdonsgot az egyes ptkvekbl. Erre alkalmas mdszerek a sprakpzs s hibridizls,

valamint aprotoplaszt fzis a rare-mating (ritka prosods). A killer srlesztk ltrehozsa ez

utbbi kategriba sorolhat.

A Saccharomyces cerevisiaelesztt mr vezredek ta tenysztik s hasznljk sr-, bor-, illetve

kenyrgyrtshoz. Egszen j szerepet kapott, mikor a genetikai vizsglatok egyik kedvenc alanya

lett. Azonban figyelembe kell venni, hogy az a haploid trzs, amit a molekulris biolgusok

vlasztottak laboratriumi munkjukhoz, teljesen alkalmatlan ipari hasznlatra. A srleszt

20


21/140

pontosan gy szelektldott az idk folyamn, hogy azokkal a tulajdonsgokkal rendelkezzen, ami

ellenllv teszi a laboratriumi genetikai manipullssal szemben. ltalban poliploidok vagy

anueploidok, nem rendelkeznek mating tpussal, gyenge sprakpzk vagy egyltaln nem

sprznak. Ha ltrejnnek sprk, akkor azok nem ngyesvel fordulnak el, gyenge a viabilitsuk,

ami megnehezti a tetrd analzist (RUSSEL&STEWART 1985).Termszetesen ennek ellenre vgeznek genetikai ksrleteket srlesztkkel is. A ksrletek egyik

kre killer tulajdonsggal rendelkez srlesztk ltrehozsra trekszik. Ugyan volt mr arra

precedens, hogy srgyrban izolltak ilyen lesztt, azonban a killer jelensg sokkal ritkbb a

srlesztk, mint pldul a borlesztk kztt (YOUNG 1981). A fent emltett mdszerek kzl a

protoplaszt fzit s a rare-matinget alkalmaztk erre (MARZ et al. 1994, YOUNG 1981,

HAMMOND&ECKERSLEY 1984, ISERENTANT&VAN DE SPIEGLE 1988, SASAKI et al.

1984).

2.2.4.1 Killer srlesztk ltrehozsa rare-mating mdszerrel

A rare-mating vagy ritka prosods mdszere azon alapszik, hogy ha nagy tmegben kevernek

ssze amgy prosodsra kptelen haploid sejteket, akkor ritkn mgis elfordulhat egyesls, amit

ers szelekcis hatssal ki lehet mutatni (DEK 1998).

YOUNG 1981-ben, majd HAMMOND s ECKERSLEY hrom vvel ksbb 1984-ben kzlt

publikcit arrl, hogyan alkalmaztk a rare-mating mdszert killer srlesztltrehozsra.

YOUNG (1981) nem csupn ezt az egy mdszert hasznlta, hanem ksrletben kt genetikai

manipulcis technikt kombinlt. Egyfell a SPENCER s SPENCER (1977) ltal lert rare-

matinget, amelyben egy lgzs-deficiens (petite) srlesztt s egy auxotrf laboratriumi trzset

kevert. A hibrideket olyan tptalajon szelektlta, hogy csak a prototrf s nem lgzs-deficiens

sejtek legyenek kpesek kinni. A mdszer htrnynak tekinthet, hogy gy valdi hibridek jnnek

ltre, ami azt jelenti, hogy mindkt szlnek mind a sejtmagban, mind a citoplazmban hordozott

gnjeit tartalmazza. Emiatt nem valszn, hogy a srleszt trzsnek csak az elnys

tulajdonsgait fogja hordozni a hibrid. Young mdszerhez msfell felhasznlta CONDE s FINK(1976) munkjnak eredmnyt is, akik lertk az S. cerevisiae egy olyan mutcijt (rvidtse

kar), amely megakadlyozza a sejtmagok fzijt (a kariogmit) laboratriumi haploid lesztk

hibridizcijt kveten. Az gy kapott heterokarionok nem stabilak; kt olyan sejt jn ltre

(heteroplazmon), amelyek az egyik, illetve msik szl sejtmagjt hordozzk, de mindkt szl

citoplazmjnak tartalmt. Teht Young ltal a killer srleszt ltrehozshoz felhasznlt egyik

szli trzs haploid killer volt, auxotrf, nem lgzs-deficiens s karmutns, mg a msik egy nem

killer srleszt, poliploid s lgzs-deficiens (petite). A rare-mating sorn gy ltrejtt (1) killer,nem lgzs-deficiens, auxotrf heteroplazmon, ami a haploid szlsejtmagjt hordozta; (2) killer,

21


22/140

nem lgzs-deficiens heteroplazmon, ami a srleszt sejtmagjt hordozta; (3) killer, lgzs-

deficiens, heteroploid valdi hibrid. Megfelelszelektv tptalajok s mdszerek segtsgvel ezek

elvlaszthatk. A mdszer elnye a hagyomnyos rare-matinggel szemben, hogy itt ltrejnnek

nem valdi hibridek is (heteroplazmonok), amelyek csak a kutat ltal kvnatosnak tlt

tulajdonsgot ebben az esetben a srleszts killer voltt hordozzk.HAMMOND s ECKERSLEY 1984-es munkja az elbbi mdszer kismrtkben mdostott

vltozata, melyben tulajdonkppen kt lehetsget is lernak a killer srlesztltrehozsra egy

lpsben, illetve kt lpsben. Az egy lpses esetben a srlesztbl ltrehozott petite mutns volt

az egyik szl s egy killer, auxotrf haploid laboratriumi leszttrzs a msik. Az gy kapott

killer srleszt sejtek egyik negatvuma, hogy az ltaluk hordozott mitokondriumok a killer

haploid sejtbl szrmaztak. A kt lpses mdszer ezt a hinyossgot is kikszbli. Az els

fzisban egy srleszt trzs s egy petite mutns, auxotrf, killer leszt trzs voltak a szlk,amelyek rare-matingje utn az auxotrf, nem lgzs-deficiens sejteket szelektltk, amik viszont a

srlesztk mitokondriumval rendelkeztek. Ezeket a sejteket jabb rare-matingnek vetettk al,

ahol a msik szlegy srleszttrzs petite mutnsa volt. A mvelet utn olyan srlesztsejteket

tudtak szelektlni, amelyek killer tulajdonsggal s srlesztmitokondriummal rendelkeztek.

2.2.4.2 Killer srlesztk ltrehozsa protoplaszt fzival

A protoplaszt fzi mdszert elszr nvnyi sejteken alkalmaztk. A mikroorganizmusok kzl a

gombk s baktriumok protoplaszt fzijrl 1976-ban jelentek meg tanulmnyok. Egy vre r

1977-ben kt egymstl fggetlen kutatcsoport ismertette a mdszer alkalmazst lesztkre

(FERENCZY&MARZ 1977, VAN SOLINGEN&VAN DER PLAAT 1977).

A mdszer elslpse, hogy a sejtfalat litikz enzimmel lebontjk, gy kpzik a csak membrnnal

krlvett sejtet, amit protoplasztnak vagy szferoplasztnak neveznek. A protoplasztokat a

tovbbiakban ozmotikusan stabilizlt krnyezetben kell tartani, gy akr 24 rn t megtartjk mind

fzis, mind regenercis kpessgket. Kvetkez lpsben a klnbz leszttrzsekbl

ksztett protoplasztokat sszekeverik s fzijukat indukljk legtbbszr kmiailag, polietilnglikollal (PEG) kalcium jelenltben, vagy nagy erssgelektromos trrel. A PEG alkalmazsa ,

amit KAO s MICHAYLUK (1974) javasolt elszr egyfajta ttrsnek tekinthet, mert

lnyegesen megnvelte a fzik gyakorisgt. Harmadik lps a regenerls, amikor a sejtfal

jrakpzdik A fzis termkek szelektlsa a szli trzsek ltal hordozott szelekcis tnyezk

segtsgvel trtnik, ami lehet auxotrfia, mutci (pl. lgzs-deficiens mutns) vagy rezisztencia.

(DEK 1998, VAN SOLINGEN&VAN DER PLAAT 1977).

A protoplaszt fzi az ipari leszttrzsek genetikai manipulcijnak nagyon fontos eszkze.Szmos sikeres ksrletet rtak le sr-, bor- s stlesztkkel (BARNEY et al. 1980,

22


23/140

DE FIGUEROA et al. 1984, ISERENTANT&VAN DE SPIEGLE 1988, SKATRUD et al. 1980). A

mdszer nem fgg sem a ploiditstl, sem a mating tpustl, gy klnsen jl alkalmazhat a

poliploid termszets mating tpust nlklzsrlesztk esetben (RUSSEL&STEWART 1985).

A j sr ellltsa nagyban fgg az erjeszts minsgtl. Maga a folyamat a fermentciskrlmnyek s az alkalmazott srleszt trzs tkletes kombincija kell, hogy legyen. Akr a

krlmnyekben, akr az lesztben bekvetkez legkisebb vltozs is lvezhetetlen termket

eredmnyezhet. Emiatt a srfzk igen vonakodva fogadjk, ha brmilyen mdon manipulljk az

leszttrzset, mg ha az csak egy apr mutci is.

Protoplaszt fzival a killer toxin termelkpessg is bevihet a srleszt sejtjeibe. Az ezzel a

tmval foglalkoz kutatk cikkeikben, szinte kivtel nlkl, kt szempontot emelnek ki: a

srlesztgy rendelkezne rezisztencival a killer lesztkkel szemben, illetve a sajt maguk ltaltermelt toxinnal el tudnk puszttani a behatol rzkeny lesztket (MARZ et al. 1994, YOUNG

1983). SASAKI s munkatrsai (1984) olyan killer srlesztt hoztak ltre ezzel a mdszerrel, ami

antibakterilis tulajdonsggal is rendelkezik.

SASAKI s munkatrsai (1984) kt lpsben oldottk meg azt, hogy a ltrehozand srlesztne

csak killer legyen, hanem antibakterilis tulajdonsggal is rendelkezzen. Az elslpsben a lgzs-

deficiens mutns antibakterilis lesztt s a killer lesztt hibridizltak, amelyek ellenttes mating

tpussal rendelkeztek. Glicerines minimum tptalajon prototrf lgzs-deficiens hibrideket

szelektltak a protoplaszt fzihoz. A szelektlt hibridek sprztatsa utn olyan haploid klnokat

kerestek, amelyek a killer s antibakterilis tulajdonsg mellett auxotrfok is voltak, mert a ksbbi

protoplaszt fzihoz ez szksges. A msodik lps mr maga a fzi volt, amihez a srlesztbl

is petite mutnsokat hoztak ltre. A killer-antibakterilis s a petite srlesztsejtekbl ltrehozott

protoplasztokat a szoksos mdon fuzionltattk PEG jelenltben, majd a kvnt tulajdonsgokkal

rendelkezsejteket szelektltk tbb lpsben.

A MARZ s munkatrsai (1994) ltal kidolgozott mdszer esetben nincs szksg a srleszt

mutagn kezelsre vagy brmilyen genetikai mdostsra a fzi eltt. A fzis termkeket az

ltaluk termelt killer toxin alapjn szelektltk. A toxin elpuszttotta a szli srlesztsejteket, s

csak a killer fzis termkek tudtak regenerldni s nvekedni.

2.2.5 Killer srlesztk erjesztkpessgnek vizsglata

A fentiekben rszletezett kt genetikai manipulcis mdszert a kutatk termszetesen nem csupn

a mdszerek kiprblsa vgett vgeztk el, hanem, hogy j tulajdonsggal rendelkezsrlesztt

hozzanak ltre. Ezrt a sikert nem csak azon lehet illetve kell lemrni, hogy elpuszttja-e az

lesztaz rzkeny sejteket, hanem azon is, hogy milyen erjesztsi kpessggel br.

23


24/140

Ezzel a vizsglattal a kutatk eltrmlysggel foglalkoztak. SASAKI s munkatrsai (1984) tbb

fzis termket is elvizsglatnak vetettek al 20C-n val erjesztssel, majd a leggretesebbel

egy rszletesebb vizsglatot vgeztek el, 20 liter srl erjesztsvel. Ebben 8 napig tartott a

ferjeszts 10C-n, majd 32 napig az szokols 0C-n. Az extrakttartalom cskkenst nyomon

kvettk, s alakulst sszehasonltottk a szli srleszt teljestmnyvel. A killer srlesztkezdetben kiss lassabban fermentlt, de a 14. napra szinte egyforma mrtkben hasznltk fel a

srl sznhidrtjait. Az rzkszervi panel szerint a killer srlesztvel erjesztett sr ze s habja

elfogadhat volt. A fermentci sorn vizsgltk a killer toxin s antibakterilis aktivits alakulst

is. Az elbbi a 3. naptl az 5. napig volt a legnagyobb, majd fokozatosan cskkent. Az utbbi

aktivitsa a ferjeszts vgn (8. nap) volt a legnagyobb, s az szokols sorn vgig viszonylag

nagy maradt. Ugyan a killer srleszt ltal termelt killer faktort instabilnak minstettk, ennek

ellenre gy gondoljk, hogy alkalmas lehet a vadlesztk elleni vdekezsben. Az antibakterilisaktivitst viszont gyengbbnek minstettk norml erjesztsi krlmnyek kztt, mint a 20C-n

s kisebb mennyisg srlvel vgzett laboratriumi ksrletekben. Az erjeszts sorn mrt

legnagyobb aktivits sem volt elegend arra, hogy a 11 tesztelt srkrost baktriumbl 3-at

elpuszttson (a baktriumok kezdkoncentrcija 2 x 105sejt/ml volt s 25C-n 10 napig tartott az

inkubci).

A killer s nem killer srlesztk erjesztst sszehasonltva MARZ s munkatrsai (1994) sem

tapasztaltak jelents klnbsgeket. A sr valdi s ltszlagos extrakttartalmt s erjedsfokt,

valamint a kpzdtt alkohol s diacetil mennyisgt mrtk. A fent emltett ksrletekkel

ellenttben, mind az rzkszervi panel minstse, mind a mrt rtkek jobbnak bizonyultak a killer

srlesztesetben. A killer toxin jelenltt nem vizsgltk.

YOUNG 1981-ben nem protoplaszt fzival, hanem ahogy a 2.1.5.1 fejezetben bemutattam

rare-mating technikval hozott ltre killer srlesztt. Egy kt vvel ksbbi ksrletben (YOUNG

1983) vizsglta ennek erjesztsi tulajdonsgait, kontroll srleszt tulajdonsgaival sszevetve.

Mivel olyan genetikai manipulcis technikt alkalmazott, amely sorn a srleszt nukleris

genomja nem vltozott, joggal vrta, hogy fermentcis kpessge is a szli trzshz hasonlatos

legyen. Flzemi ksrletben 5-7 napig tartott az (f)erjeszts 17C-n a szl felserjeszts

srleszt lvn , majd az leszt elvtele utn kt htig 4-5C-n rleltk a termket. A sr

extrakttartalmt, sznt, pH-jt, habtartssgt s sszes nitrogn tartalmt mrtk, valamint

gzkromatogrffal meghatroztk kt szter (etil-acett s izo-amilacett), ngy kozmaolaj

(propanol, 2-metil-propanol, 2-metil-butanol s 3-metil-butanol) s a diacetil koncentrcijt.

Megllaptotta, hogy a kt vizsglt killer srlesztvel erjeszts szinte minden tulajdonsgban

ugyanolyan srt eredmnyezett, mint a kontroll srleszt. Lnyeges klnbsget mindkt trzsnl

a 2-metil-propanol tartalomban, illetve az egyik trzsnl mg a 3-metil-butanol mennyisgben

24


25/140

tapasztalt. Ezt az eltrst azzal magyarzta, hogy a mitokondrium szrmazhat a killer szlbl is,

aminek befolysa lehet a kozmaolaj termelsre. Az analitikai vizsglatokon tl a 31 tag

rzkszervi panel sem mutatott ki klnbsget a killer s nem killer srlesztvel ellltott srk

kztt.

HAMMOND s ECKERSLEY (1984) szintn rare-mating mdszerrel hoztak ltre killersrlesztket, amihez szli trzsknt mind felserjeszts (ale), mind alserjeszts (lager)

srlesztket felhasznltak. Ezzel a mdszerrel valdi hibridek s heteroplazmonok is keletkeztek,

s mindkt esetben voltak sejtek, amelyek a srleszt s olyanok is, amelyek a killer leszt

mitokondriumot hordoztk. Igen alapos s szleskrvizsglataik sorn laboratriumi s flzemi

mretben is vgeztek erjesztseket. A laboratriumi fermentcik sorn azt tapasztaltk, hogy a

heteroplazmonok s hibridek erjesztsi sebessge nhny kivteltl eltekintve nem rte el a

kontroll srlesztt. Az is ltalnos jelensg volt, hogy ezeknek a srknek a pH-ja magasabb volt,mint a kontroll srk. A ksz srk vizsglata sorn a heteroplazmon sejtek alkalmazsval kszlt

vgtermkek rzkszervileg szinte megegyeztek a kontroll srkkel. A flzemi ksrletekbenmr

csak a legjobban szerepltrzseket alkalmaztk: kt ale srleszts a bellk szrmaztatott killer

lesztk (mindkettheteroplazmon, srlesztmitokondriummal), illetve egy lager srleszts a

belle szrmaztatott killer leszt (szintn heteroplazmon, killer mitokondriummal). Az

eredmnyek hasonlak voltak a kisebb volumenben vgzett erjesztshez: a killer srlesztk

ltalban lassabban erjesztettek (az egyik ale trzs esetben jelentsen lassabban), magasabb pH-j

volt a sr, de a ksz srk elfogadhatak voltak. A lager killer srleszt termkt tartottk a a

kontroll srtl leginkbb eltrnek. A termk kevesebb illkony aromt hordozott s kiss savany

s knes volt, br mindezek ellenre elfogadhatnak minstettk. A klnbsget azzal magyarztk

a szerzk, hogy ez a killer srlesztnem a srlesztszlbl, hanem a killer szlbl szrmaz

mitokondriumot hordozta. Termszetesen nem a mitokondriumok klnbzsge az egyedli ok,

ami klnbsget okozhatott; ms extra-mitokondrilis elemek is szerepet jtszanak, mivel az azonos

mitokondriumot hordoz heteroplazmonok erjesztsi kpessgei kztt is jelents eltrseket

tapasztaltak.

25


26/140

2.3 KLCSNHATSOK A MIKROORGANIZMUSOK KZTT

A nem steril krlmnyek kzt zajl biofolyamatokban szmos mikroba faj l egytt. Ebben az

esetben az alapanyag biotranszformcijt nem csak az egyes mikroorganizmusok viselkedse

befolysolja, hanem a mikroorganizmusok kztti klcsnhats is. Ha szablyozni akarnak egykevert kultrt, akkor modellezni kell ezeket a klcsnhatsokat. Az a cl, hogy elre jelezzk a

populcik koncentrcijnak jbli megoszlst a mikroba rendszerben s ennek kihatst a

vgtermk minsgre: az rzkszervi s fizikai-kmiai tulajdonsgaira s a fertzttsgre

(POMMIER et al. 2005).

Georgij Frantsevics Gause orosz biolgus (1910-1986) tekinthet a kevert mikrobakultrkkal

foglalkoz kutatsok, illetve a mikrobilis kolgia atyjnak. volt az els, aki a ltrt folykzdelem (azaz az koszisztma dinamikja) elemi folyamatait (azaz a populcik klcsnhatsa)

prblta elklnteni. Mr az 1930-as vek elejn publiklt cikkeket (GAUSE 1932) ebben a

tmban, 1934-ben pedig A ltrt folytatott kzdelem cmen jelent meg knyve.

Dolgozatomban csak rintlegesen kvnok foglalkozni a mikrobilis kolgia tmjval. Olyan

mlysgben, ami a kevert mikroba elssorban leszt kultrkban elfordul klcsnhatsokat

segt megrteni.

2.3.1 Klcsnhatsok osztlyozsa

FREDRICKSON (1977) sszefoglal jellegcikkben korbbi kzlemnyekre utalva rja, hogy

legtbbszr csak a populcira gyakorolt hatsn alapulva a klcsnhatsokat jtkony s

rtalmas csoportba soroltk. A jtkony ltalban azt jelenti, hogy serkenti a nvekedst, mg az

rtalmas azt, hogy gtolja a nvekedst, vagy serkenti a pusztulst, a sejtbomlst. Ennek az

osztlyozsnak az a htrnya, hogy kt meglehetsen klnbz viselkeds ugyanazon a helyen

tallhat az osztlyozstani rendszerben.

A FREDRICKSON (1977) ltal ajnlott j rendszer megtartotta a rgi jl megalapozott, logikus

felptst, mindssze egy magasabb osztlyozsi szintet adott hozz. Nevezetesen, direktnek

nevezhetegy klcsnhats, ha a kt populci egyedei kztt szksgszeren fizikai kapcsolat jn

ltre. Ha pedig a klcsnhats nem felttlenl jr fizikai rintkezssel, illetve ha az lettelen

krnyezet szksges kzvett a kt populci kztt, akkor indirektnek hvjk. ltalban az

indirekt klcsnhatsoknak nincs olyan fok sajtlagossga, ami a direkt interakcikat gyakran

jellemzi. Lehetsges, hogy emiatt a biolgusok nmileg elhanyagoltk azokat, mivel szmukra egy

klcsnhatsnak ppen a sajtlagossga a legrdekesebb aspektusa.

26


27/140

VERACHTERT s DAWOUD 1990-ben kzlt sszefoglal jellegcikkben az lesztk szerept

elemzi klnbzkevertkultrkban. A cikk tlnyom rsze a tma lelmiszeripari vonatkozsaival

foglalkozik, de az elejn rvid ttekintst ad a kevertkultrk tpusairl. A szerzk egy jfajta

osztlyozst javasolnak: a mikroba kzssgeket klnbzstruktrkba, szervezetekbe soroljk az

alapjn, hogy milyen okbl alakul ki kzttk a klcsnhats (3. tblzat).

3.tblzat Mikrobilis kzssgi struktrk (VERACHTERT&DAWOUD 1990)

1.STRUKTRAMeghatrozott tpanyagok biztostsa klnbz tagok kztt(+ +, + 0 vagy 0 + tpus)

2.STRUKTRAB mikroorganizmus eltvolt egy A mikroorganizmus ltaltermelt vegyletet, ami gtl hats A szmra

3.STRUKTRAA mikroorganizmus modifiklja B szaporodsi feltteleit(+ + vagy + 0, - 0 tpus)

4.STRUKTRA Kombinlt anyagcsere tevkenysgek (+ + tpus)5.STRUKTRA Kzs metabolizmus (+ 0 tpus)

6.STRUKTRA Fajok kztti hidrogn transzfer (+ + tpus)7.STRUKTRA Tbb, mint egy elsdleges szubsztrtum felhasznl jelenlte

Az 4. tblzat bemutatja, hogy milyen lehetsges klcsnhatsok alakulhatnak ki A s B

mikroorganizmusok populcii kztt.

4.tblzat A s B mikroorganizmusok kztt lehetsges klcsnhatsok(VERACHTERT&DAWOUD 1990)

APOPULCI HATSA

BPOPULCIRA

BPOPULCIHATSA

APOPULCIRA + - 0+ + + + - + 0- - + - - 0 -0 0 + 0 - 0 0

++: a kt mikroba pozitv hatssal van

egymsra--: a kt mikroba negatv hatssal vanegymsra00:a kt mikroba nincs hatssal egymsra+-/-+: az egyik mikroba pozitvan, a msiknegatvan hat+0/0+: az egyik mikroba pozitvan hat amsikra; a msiknak nincs hatsa-0/0-: az egyik mikroba negatvan hat amsikra; a msiknak nincs hatsa

2.3.1.1 Fbb klcsnhatsok

A kevert kultra tenyszetek fbb klcsnhatsait mind FREDRICKSON (1977), mind

VERACHTERT s DAWOUD (1990) kzlemnyei alapjn foglalom ssze.

Versengs (- - tpus, indirekt klcsnhats)

Erforrs tpus versengs(vagy egyszeren versengs): mindkt populcira negatv hatssal van

a klcsnhats, melynek sorn mindegyik populci olyan vegyleteket tvolt el a kzs

krnyezetbl, ami a msik nvekedshez szksges.Beavatkoz tpus versengs: szintn negatv

mindkt populcira, de azltal, hogy azok olyan vegyleteket termelnek, ami a msik populci

nvekedst gtolja vagy mrgeza szmra. Kt mikroorganizmus populci, amelynek hasonl a

tpanyagignye, szmos kzs s szksges tpanyagrt fog versengeni, ha egytt szaporodnak.

27


28/140

Ms antagonisztikus indirekt klcsnhatsok (indirekt klcsnhatsok)

Ezeket a klcsnhatsokat az jellemzi, hogy legalbb az egyik populci olyan anyagokat bocst a

tpkzegbe, aminek negatv hatsa lesz a msikra.

Amenzalizmus (- 0 vagy 0 -): ebben az esetben a negatv hats csupn a nvekeds gtlsa. Ez az

eset ll fenn, ha az egyik populci antibiotikumot, enzimet vagy pldul killer toxint termel.Indirekt parazitizmus: a negatv hats mindenkppen a sejt lzishez vezet.

Kommenzalizmus (0 + vagy + 0 tpus, indirekt klcsnhats)

VERACHTERT s DAWOUD (1990) az 1. s a 5. struktrkba sorolja az ide tartoz interakcikat

(3. tblzat). Klnbzmechanizmusok eredmnyezhetnek kommenzalista klcsnhatst. A kt

leggyakrabban emltett eset az amikor (1) az egyik populci olyan anyagokat termel a msik

szmra, ami annak nvekedshez ltfontossg; illetve amikor (2) az egyik populci eltvolt

egy olyan anyagot, ami a msik nvekedst gtoln.Mutualizmus s protokooperci (+ + tpus, indirekt klcsnhatsok)

Ezt a kt kifejezst olyan esetben hasznljk, amikor mindkt populcira pozitv hatssal van a

klcsnhats.

Mutualizmus: az egyik populci olyan vegyletet (vagy vegylet csoportot) termel s vlaszt ki a

tpkzegbe, amit a msik sajt maga nem kpes ellltani. VERACHTERT s DAWOUD (1990)

sajt osztlyozsuk alapjn a mutualizmus klnbz eseteit az 1., a 2., a 3. s a 4. struktrba

soroljk (3. tblzat).

Protokooperci: mg az elzesetben a klcsnhats obligt mindkt populci tllshez, addig

a protokooperci esetn ez nem igaz. FREDRICKSON (1977) ennek a kifejezsnek a hasznlatt

igazbl csak arra a szitucira ajnlja, amikor a klcsnhats egyik populci tllshez sem

szksges. VERACHTERT s DAWOUD (1990) sajt osztlyozsi rendszerkben a

protokoopercit a 6. struktrba soroljk (3. tblzat).

Szimbizis(+ + tpus, direkt klcsnhats)

A Biolgia rtelmezSztr (HALE et al. 1997) defincija szerint a szimbizis (egyttls) olyan

kapcsolat kt klnbz faj populci tagjai kztt, amely mindkt fl szmra elnys.

FREDRICKSON (1977) szerint a szimbizis egy nagyon specifikus, direkt klcsnhats s nem

alkalmazhat a mutualizmus vagy a protokooperci helyett.

Predci s parazitizmus(+ - vagy - + tpus, direkt klcsnhatsok)

Predci: VERACHTERT s DAWOUD (1990) szerint ezt az interakci tpust legjobban a

baktrium-protozoa kzssgek reprezentljk, amelyek szennyvz kezelkben tallhatk meg.

Parazitizmus: legtbb informci a vrusok s a Bdellovibrio parazitizmusrl baktriumokon

(FREDRICKSON 1977).

28


29/140

2.4 KEVERT MIKROBA KULTRK AZ LELMISZEREKBEN

Kevert mikroba kultrk szmos helyen tallhatk a termszetben. Tovbbi jellemz elfordulsi

helyeik a szennyvzkezel berendezsek (TANO-DEBRAH et al. 1999), az llatok emszt

rendszere s a fermentlt lelmiszerek (VERACHTERT&DAWOUD 1990). Dolgozatomban csakez utbbiakkal kvnok foglalkozni.

VERACHTERT s DAWOUD 1990-ben rott cikkben kimert listt lltott ssze azokrl az

lelmiszerekrl a vilg minden tjrl amelyben kevert mikroba kultrk tallhatk, illetve azt

hasznlnak fel ksztskhz. Kzttk megtallhatak levesek, fszerek, zestk, italok, borok s

srk is.

2.4.1 A bor

Hagyomnyosan a szlmust erjesztsben szmos, a termszetben elfordul lesztvehet rszt,

amelyek termszetesen fordulnak el benne. Napjainkban a nagyzemi borszatok azonban

starterkultrt alkalmaznak, amelyek olyan lesztt tartalmaznak, amit az adott borvidk

lesztflrjbl izolltak vagy amit erre szakosodott cgek tartstott (pl. szrtott) llapotban

forgalmaznak (PRETORIUS 2000). Termszetesen a hagyomnyosnak tekinthet borerjeszts is

igen szles krben elterjedt, hiszen a termk minsgt gazdagtja, ha nem csak egyfle leszt

vgzi a fermentcit. Ezt hangslyozzk ROMANO s munkatrsai is (2003), akik Saccharomyces

s nem-Saccharomyceslesztket egyarnt tartalmaz starterkultra hasznlatt ajnljk.

A spontn borerjesztst egymst kvet klnbz leszt populcik vgzik. A korai fzist

bizonyos nem-Saccharomyceslesztk (a Candida, Kloeckera s Hanseniasporanemzetsgekhez

tartozk) nvekedse jellemzi, majd a ksi fzisban mindig az alkoholtrS. cerevisiae trzsek

vannak tlslyban (PRETORIUS 2000). Tbb nem-Saccharomyces trzsre napjainkban mr gy

tekintenek, hogy tevkenysgk kedvez a bor znek kialaktsban, mert a S. cerevisiae

trzseknl nagyobb mennyisgben termelnek bizonyos anyagcsere-termkeket, pl. glicerint,

sztereket s magasabb rend alkoholokat. Ugyanakkor ezeknek a trzseknek a nvekedse

ltalban az erjeds els 2-3 napjra korltozdik, pusztulsuk utn utat adva a Saccharomyces

cerevisiae trzseknek. Tbb okkal magyarzzk a jelensget. ltalnos vlekeds szerint a

Saccharomyces trzsek jobban ellenllnak a nvekv alkohol s szerves sav koncentrcinak, a

cskkenpH-nak s a tpanyagok kimerlsnek. Tovbb a kezdeti mikroflra s a must kmiai

sszettele, valamint olyan klstnyezk, mint a kn-dioxid adagols, az erjesztsi hmrsklet s

a starterkultrk hasznlata, ers szelekcis hatst gyakorol az leszt fajokra a borerjeszts

folyamata sorn (CONSTANT et al 1998). Ezeknek a klasszikus szelekcis tnyezknekuralkod/tlslyban lvszerept mostanban megkrdjelezik s ms, eddig nem meghatrozott,

29


30/140

mikroba-mikroba klcsnhatsok kerlnek eltrbe mint lehetsges tnyezk, melyek befolysoljk

az lesztk sorrendjt (CIANI&PEPE 2002, FLEET 2003, NISSEN&ARNEBORG 2003).

Tbb olyan vegyletet is termelhetnek az lesztk az alkoholos fermentci sorn, ami gtlolhat

ms leszt fajoknak vagy trzseknek. Az etanolon kvl bizonyos anyagcsere-termkek, mint

pldul a rvid- s kzepes-lnc zsrsavak (pl. ecetsav, kapronsav, kaprilsav, kaprinsav) elrhetnekolyan koncentrcit, ami egyes leszt fajoknl kztk nhny S. cerevisiae trzsnl

sejthallhoz vezetnek (LUDOVICO et al. 2001, FLEET 2003). Az lesztk killer tevkenysge is

egyfajta gtl mechanizmus az erjeds sorn.

Az elzekben emltett beszmolk ellenre a nem-Saccharomyces lesztk korai pusztulsa a

S. cerevisiae-t is tartalmaz kevert kultrs erjesztsek sorn, alig kerl emltsre a

szakirodalomban. Elsgondolatknt a nem-Saccharomyceslesztk S. cerevisiae-hez hasonltva

alacsonyabb etanol tolerancijnak tulajdontjk a pusztulst. Valjban csak nhny alapostanulmny kszlt azzal a cllal, hogy tisztzza az okokat s a jelensg alapjul szolgl

mechanizmusokat (HANSEN et al. 2001, NISSEN&ARNEBORG 2003, NISSEN et al. 2003).

2.4.2 A sr

Teljesen ms a helyzet a srrel. VERACHTERT s DAWOUD (1990) ltal megemltett srk kzl

mindssze hrom a belga lambic (gueze) s savas ale, illetve a nmet weissbier kszl

Eurpban, s taln csak az utbbi hangzik ismersen a magyarorszgi srkedvelk szmra.

Ebbl is kitnik, hogy a sr napjainkban nem az az alkoholos ital, amelyre jellemz lenne, hogy

ksztsben (erjesztsben) tbb mikroorganizmus venne rszt. A srgyrts trtnetnek els2 s

fl vezredben ez nem gy volt, de egy a dniai Carlsbergben tevkenyked fermentcis

fiziolgusnak,Emil Christian Hansennek ksznheten 1883 ta a srt a kevs emltett kivteltl

eltekintve egyetlen mikroorganizmussal, a srlesztvel ksztik. Hansen kidolgozott egy

mdszert tiszta lesztkultra szaportsra, ami forradalmastotta a sripart. Az lesztt

Saccharomyces carlsbergensis-nek neveztk el s ingyen a vilg rendelkezsre bocstottk

(http://info.carlsberg.com/).

2.4.2.1 A lambic s gueze srk erjesztsnek jellemzse

A lambicegy spontn erjedsale a Brsszel krnykn fekvZenne trsgbl. A lambic tpus

srk savanyak, s egyltaln nincs bennk sznsav. Kis mennyisg (10-20%) bzt is

hasznlnak a sr fzshez, amelyet azutn vekig rlelnek tlgyfahordkban, ahol is az erjeds

tovbb folytatdik. Ritkn fogyasztjk eredeti formjukban, ltalban gueze, faro s gymlcss

lambic srkellltshoz hasznljk ket (VERHOEF 2002).

30


31/140

AguezeBrsszel tipikus lambic ale-je, amely a rgi s az j lambic srk keverkbl kszl. Ez

egyesti magban a fiatal lambic ale lnksgt, a rgi karakteres zvel. Az alkoholtartalma 5%

krli. A gueze igazi nyenc sr (VERHOEF 2002).

Teht a lambic az erjesztett (spontn erjesztssel!) sr, s a gueze belle szrmazik gy, hogy a

lambic srt msodlagos erjesztsnek vetik al palackban. A spontn erjesztst vgzmikroorganizmusok akkor kerlnek a srlbe, amikor azt a komlforralst kveten egy

jszakn t nagy sekly kdakban htik. Vizsglatok kimutattk a lambic srre jellemz

mikroorganizmusokat a srgyr levegjbl is. Az erjeszts a mr emltett fahordkban folytatdik,

s akr kt vig is eltarthat. A palackban vgzett msodlagos erjeszts tovbbi 6 hnapot vesz

ignybe (VERACHTERT s DAWOUD 1990).

VERACHTERT s DAWOUD (1990) kzli egy 1976-ban megjelent cikk eredmnyeit a gueze

mikrobiolgiai jellemzsrl. A szerzk kt srgyrban vizsgltak lambic srket, vgigksrveazok erjedst. Az erjedst klnbz mikrobafajok egymsutnisga jellemzi. A spontn

fermentciEnterobacteriagyors szaporodsval indul, ami 30-40 nap elteltvel teljesen kipusztul.

Ugyanekkor nhny leszt is kimutathat. Ennek a baktriumos fzisnak a vgn a ferjeds

kezddik meg, amit lesztk vgeznek, s nhny hnapig tart. Ezt a fzist egy olyan idszak

kveti, amit a tejsavbaktriumok gyors nvekedse jellemez. Vgl az utols idszakban a

tejsavbaktriumok jelenlte fennmarad, m az ekkor kimutathat lesztk mr az aktidion rezisztens

fajok kz tartoznak, s legtbbjk a Brettanomycesnemzetsghez sorolhat. A tejsavbaktriumok

ltal jellemzett fzisban az ecetsavbaktriumok szma is megn, de ksbb ezek elpusztulnak. A

jelenlvtejsavbaktriumok mindigPediococcusokvoltak.

A palackozst kveten is folytatdtak a vizsglatok. Kt mikroorganizmus csoportot talltak

jelentsnek: az aktidion rezisztens lesztket (Brettanomyces) s a tejsavbaktriumokat. Az

elbbiek 10 hnapig voltak jelen egyre cskkenkoncentrciban, az utbbiak viszont a palackban

erjeszts sorn vgig (14 hnapig) kzel azonos mennyisgben kimutathatk voltak. Emltsre

mltk mg az ecetsavbaktriumok, amik 3-4 hnapig voltak jelen, konstans mennyisgben.

31


32/140

2.5 SEJTEK RGZTSE S A RGZTS FIZIOLGIAI HATSA.

RGZTETT SEJTEK IPARI ALKALMAZSAI

A mikroorganizmusok sajt termszetes krnyezetkben komoly vltozsokat is kpesek tllni.

Egy ilyen krnyezetben a sejteknek tudniuk kell alkalmazkodni, klnben elpusztulnak. A tlls

egyik formja, hogy a sejtek felletekhez vagy egymshoz tapadnak. Ebben a formban jobban

vdve vannak a krnyezet veszlyeitl, pldul a nyrertl vagy toxikus anyagoktl. A

termszetben is elfordul biofilm j plda erre (POULSEN 1999). Kvetkezskppen a sejtek

rgztst s a rgztett sejtek alkalmazst egy termszetes jelensg emberek ltal val

tovbbfejlesztsnek is tekinthetjk.

A sejtrgztst gy lehet definilni, hogy az az p sejtek fizikai bezrsa vagy helyhez ktse a tr

egy bizonyos, meghatrozott rgijban, annak nhny kvnatos aktivitsnak megrzse mellett

(WILLAERT et al. 1996).

A sejtek s enzimek rgztsnek technolgija folyamatosan fejldtt ltezse els 25 vben,

majd az 1990-es vekben elrt egy szintet, ahol ez a fejlds tetztt. Azonban a biotechnolgia

bvlsnek s a gntechnolgia fejldsnek kvetkeztben, a sejtek s enzimek immobilizlsa

irnti lelkeseds jraledt. Az elvgzett kutatsok s fejlesztsek a hordozk s rgztsi technikk

hossz sort eredmnyeztk. A bvls jelents rszt adtk azok a hasznos vltozsok, amik egy-

egy meghatrozott alkalmazshoz trsthatk (BICKERSTAFF 1997).A sriparban dolgozk s kutatk is ers ksztetst reztek mr a kezdetektl fogva, hogy a

termelsben rgztett lesztket alkalmazzanak. Ezt nagyban segtette, hogy az ltaluk hasznlt

Saccharomyces cerevisiae faj az egyik legkedveltebb teszt mikroorganizmus (volt) az

immobilizls hatsnak tanulmnyozsra. Szmos laboratriumi mretekben elvgzett sokszor

sikeres erjesztsrl szmoltak be a kutatk, azonban a lptknvels problmja sokakat

eltntortott a tovbblpstl. Kitart kutatknak s fejlesztmrnkknek ksznheten mr 1990

ta hasznlnak rgztett sejtes rendszert a srgyrts egy bizonyos folyamatban az szokolsban ipari mretekben. A srgyrtk lma, hogy az erjeszts teljes egszt folyamatoss tegyk

anlkl, hogy kompromisszumot ktnnek a vgtermk minsgt illeten, sajnos mg nem

valsult meg.

32


33/140

2.5.1 Sejtrgztsi technikk

Szmos sejtrgztsi mdszer az enzimek rgztsi technikinak mdostsval, fejlesztsvel jtt

ltre. Termszetesen a sejtek nagyobb mrete befolysolta ezeket a mdszereket s szmos jat

eredmnyezett (BRODELIUS&VANDAMME 1991). A sejtek rgztse ngy alapelv szerintlehetsges:

A sejtek egymssal val keresztktse bi- vagy multifunkcionlis reagensekkel. Kovalens kts elformzott hordozhoz. Adszorpci elformzott hordozhoz. Bezrs rszecskkbe, rostokba vagy mikrokapszulba.

A sejtrgztsi mdszerek csoportostst a 4. bra mutatja be.

SEJTRGZTSI MDSZEREK

Rgzts hordozval Rgzts hordoz nlkl

Kts Bezrs

Keresztkts Folykony

membrnba zrsGlbezrs

Hordozhoz kts

AdszorpciKovalens kts

4.bra. Sejtrgztsi mdszerek

A sejtrgztsi technikkat az albbi csoportokba soroljk.

2.5.1.1 Sejtrgzts hordoz nlkl

A termszetes mdon aggregld, sszetapad, pelletet alkot vagy flokkull sejtek is

tekinthetk immobilizlt sejteknek. A folyamatot mestersgesen is el lehet idzni kmiai

anyagokkal vagy genetikai mdostssal. A jelensgben kulcsszerepet jtsz sejtfal rgit biolgiai

s krnyezeti tnyezk is befolysoljk az anyagcsern keresztl, kzvetlenl vagy kzvetve

(JIN&SPEERS 1998, WILLAERT et al. 1996). A mestersges flokkulcit elsegtszerek vagy a

keresztktst ltrehozk fokozhatjk/elsegthetik az aggregcis folyamatot azon sejtek kztt is,

amelyek termszetes krlmnyek kztt nem flokkullnak. Genetikai szinten is vizsgltk a

mechanizmust, ami a flokkulcit szablyozza a Saccharomyces cerevisiae lesztben, s 3 gnt

rtak le s jellemeztek (FLO1, FLO5 s FLO8). A gneket sikeresen tvittk nem-flokkull

lesztbe is (JIN&SPEERS 1998).

33


34/140

2.5.1.2 Keresztkts

A mikroorganizmusok sejtfala szabad amino- s/vagy karboxil-csoportokkal rendelkezik.

Keresztkts knnyen kialakthat ezek kztt olyan bi- vagy multifunkcionlis reagensekkel, mint

a glutraldehid vagy a tolun diizociant. A mikrobasejtek rgzthetk ionos keresztktssel is gy,

hogy polielektrolitok hozzadsval flokkulcit vltanak ki. nmagban ritkn alkalmazzk ezt a

rgztsi mdszert, viszont glbezrssal kombinlva stabilabb teszi a gl szerkezett

(BRODELIUS&VANDAMME 1991).

2.5.1.3 Kovalens kts

A sejt rgztse kovalens ktssel egy hordozhoz lehetsges (1) a mtrixon tallhat reakcis

csoporton keresztl vagy (2) egy vegylet segtsgvel, ami a sejtet a hordozhoz kti. Ez utbbira

plda lehet a BrCN aktivlt cellulz vagy a glutraldehiddel kombinlt zselatin. Ugyan az

irreverzibilis kovalens ktssel rgztett sejteket tartalmaz rendszerben nincs korltozva a diffzi

(mint glbezrskor), s kevsb van kitve az j sejtek kiramlsnak (mint adszorpci esetn), m

Documents

Új Technológiai Lehetőségek Alkoholszegény Sörök Előállítására - Farkas