UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA - repository.uinjkt.ac.idrepository.uinjkt.ac.id/dspace/bitstream/123456789/29198/1/MAZAYA... · SENYAWA NITRASI ETIL P-METOKSISINAMAT TERHADAP AKTIVITAS

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

HUBUNGAN KUANTITATIF STRUKTUR AKTIFITAS

SENYAWA NITRASI ETIL P -METOKSISINAMAT

TERHADAP AKTIVITAS ANTI TUBERKULOSIS

MELALUI PENDEKATAN HANSCH SECARA

KOMPUTASI

SKRIPSI

MAZAYA FADHILA

1111102000079

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

2015

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

HUBUNGAN KUANTITATIF STRUKTUR AKTIFITAS

SENYAWA NITRASI ETIL P -METOKSISINAMAT

TERHADAP AKTIVITAS ANTI TUBERKULOSIS

MELALUI PENDEKATAN HANSCH SECARA

KOMPUTASI

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi

MAZAYA FADHILA

1111102000079

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

2015

vi

iv

v

vi

ABSTRAK

Nama : Mazaya Fadhila

Program Studi : Farmasi

Judul : Hubungan Kuantitatif Struktur Aktifitas Senyawa Nitrasi

Etil P -Metoksisinamat Terhadap Aktivitas Anti

Tuberkulosis Melalui Pendekatan Hansch Secara

Komputasi.

Senyawa etil p -metoksisinamat (EPMS) telah dilaporkan aktif menghambat

virulensi Mycobacterium tuberculosis H37Ra, H37Rv, dan isolat klinik pasien

resisten MDR (Multidrug Resistant) dengan konsentrasi hambat minimum 242-

485 μM. Salah satu reseptor yang berperan dalam pengobatan tuberkulosis adalah

InhA, suatu enzim yang berperan dalam pembentukan asam lemak

Mycobacterium tuberculosis. Dalam penelitian ini, dianalisa hubungan kuantitatif

struktur dan aktifitas senyawa turunan asam sinamat dan EPMS terhadap aktifitas

anti tuberkulosis menggunakan metode Hansch, selanjutnya penambatan molekul

senyawa nitrasi EPMS dengan reseptor inhA menggunakan perangkat lunak

Autodock Vina. Visualisasi menggunakan Autodocktools, Pymol, dan LigPlot.

Persamaan HKSA Hansch yang diperoleh dari turunan EPMS terhadap aktivitas

anti tuberkulosis adalah Log MIC = -0.2909 LogP + 1.6411 LogCPSA - 0.1497

Log sterik - 0.3491. Hasil penambatan molekul terbaik, dengan affinitas -11.2

kcal/mol, adalah 4-nitrophenyl 4-coumarate yang mengikat 6 asam amino yaitu

Ser94, Gly96, Thr39, Ile15, Gly14, dan Val65. Hal ini membuktikan bahwa

senyawa nitrasi EPMS aktif dan efektif sebagai anti tuberkulosis.

Kata kunci : nitrasi EPMS, turunan asam sinamat, inhA, HKSA, penambatan

molekul,

vii

ABSTRACT

Name : Mazaya Fadhila

Program Study : Pharmacy

Title : The Quantitative Structure and Activity Relationship of

Etil P -Metoksisinnamic Nitration To Anti Tuberculosis

Activity By Hansch Method Computationally

Etil p -metoksisinnamic (EPMS) has reported active inhibit Mycobacterium

tuberculosis H37Ra, H37Rv, and clinical isolate of MDR (Multidrug Resistant)

patient‘s virulence with minimum inhibit concentration 242-485 μM. One of kind

receptor that act in tuberculosis is InhA, an enzyme that act in production of

Mycobacterium tuberculosis‘s fatty acid. This research analyze the quantitative of

structure and activity relationship of cinnamic acid derivates and EPMS to anti

tuberculosis activity used Hansch method, and continued by molecular docking

EPMS nitration to inhA receptor by AutoDock Vina. Then, visualization by

AutoDock Tools, PyMol, and LigPlot. The Hansch QSAR‘s regression collected

from EPMS derivates as anti tuberculosis activity is Log MIC = -0.2909 LogP +

1.6411 LogCPSA - 0.1497 Log sterik - 0.3491. The best docking result, with

affinity -11.2 kcal/mol, is 4-nitrophenyl 4-coumarate that binded to 6 amino acid,

those were Ser94, Gly96, Thr39, Ile15, Gly14, and Val65. This proved that EPMS

nitration active and effective as anti tuberculosis.

Key Words : EPMS, cinnamic acid derivates , inhA, QSAR, Molecular docking,

Autodock Vina

viii

KATA PENGANTAR

بسم هللا الر حمن الر حيم

Alhamdulillah segala puji dan syukur penulis sampaikan ke hadirat Allah

SWT yang telah memberikan taufik dan karunia-Nya sehingga penulis dapat

menyelesaikan skripsi ini yang berjudul: ―Hubungan Kuantitati Struktur Aktifitas

Senyawa Nitrasi Etil P –Metoksisinamat Terhadap Aktivitas Anti Tuberkulosis

Melalui Pendekatan Hansch Secara Komputasi‖.

Skripsi ini merupakan hasil perjalanan studi selama kuliah di Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan konsentrasi Farmasi Universitas Islam Negeri

Syarif Hidayatullah Jakarta yang disusun untuk memenuhi syarat terakhir

perkuliahan dalam rangka memperoleh gelar Sarjana Farmasi. Banyak pihak yang

telah membantu dan memberikan dorongan yang sangat besar selama penelitian

dan penyusunan skripsi ini.

Penghargaan dan ucapan terimakasih yang tulus dan tak terhingga

disampaikan penulis kepada:

1. Bapak Supandi, M.Si, Apt., selaku pembimbing pertama dan Ibu Ismiarni

Komala, M.Sc., Ph.D., Apt., selaku pembimbing kedua, yang memiliki andil

besar dalam proses penelitian dan penyelesaian tugas akhir saya ini,

senantiasa meluangkan waktu dan tenaga untuk memberikan arahan dan

petunjuk serta dorongan sehingga penelitian dan penyusunan skripsi ini dapat

terselesaikan dengan baik. Semoga segala bantuan dan bimbingan bapak

mendapat imbalan yang lebih baik di sisi-Nya.

2. Bapak Arief Sumantri SKM, M.Kes., Apt., selaku Dekan Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah

Jakarta.

3. Bapak Drs. Umar Mansur, M.Sc., Apt., selaku ketua Program Studi Farmasi

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif

Hidayatullah Jakarta.

4. Ibu Ofa Suzanti Betha M.Si Apt. selaku sekretaris Program Sudi Farmasi

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif

Hidayatullah Jakarta.

ix

5. Ibu Dr. Dra. Delina Hasan M.Kes Apt. selaku pembimbing akademik yang

telah banyak memberikan nasihat dan saran.

6. Seluruh staf pengajar Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan khususnya

staf pengajar Prodi Farmasi yang telah memberikan ilmu kepada penulis.

7. Bapak Andrianopsyah Mas Jaya Putra, M.Sc., yang telah banyak memberikan

masukan dan arahan terkait penelitian yang penulis lakukan.

8. Keluarga tercinta, papa, mama, kakak, kakek, nenek, adik, om dan tante, yang

senantiasa menyertai setiap langkah penulis dengan cinta dan kasih, tulus dan

ikhlas menyayangi, selalu mendoakan, membantu dan memberikan dorongan

spiritual dan material.

9. Sahabatku tersayang, Tari, Dini, Fitri, Firda, Nurul, Deni, yang selalu

bersama sama melangkah dan berjuang untuk menjadi pribadi yang sukses

dan berhasil. Serta tak bosan dan sabar dalam menghadapi curhatan penulis

dalam penyelesaian skripsi ini.

10. Rekan satu tim Docking, Eko, Wahidin, Acad, Haidar, kak Fikri, yang selalu

dengan sabar hati membantu penulis dalam mempelajari program-program

komputer, berbagi jurnal dan masukan lainnya.

11. Serta rekan rekan seperjuangan Farmasi 2011, khususnya kelas AC tercinta.

Terima kasih kepada teman-teman yang selalu bersedia diminta bantuannya

dalam penyelesaian skripsi ini dan selama empat tahun berbagi suka dan

duka.

12. Setiap orang yang menanyakan, gimana skripsi, kapan wisuda dengan bangga

penulis katakan akhirnya telah terselesaikan.

Dengan segala kemampuan dan keterbatasan yang ada, penulis menyadari

sepenuhnya bahwa masih banyak kekurangan dalam penyusunan skripsi ini. Oleh

sebab itu dengan keterbukaan penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat

membangun.

x

Akhirnya, semoga Allah SWT memberikan taufik dan hidayah-Nya kepada

semua pihak yang telah membantu dalam penyusunan skripsi ini dan semoga

skripsi ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan di bidang

farmasi khususnya dan bidang lain yang ada kaitannya pada umumnya.

Jakarta, 26 Mei 2015

Penulis

xi

xii

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ....................................................................................................... ii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINILITAS ........................................................... iii

HALAMAN PERSETUJUAN SKRIPSI ..................................................................... iv

HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI ........................................................................ v

ABSTRAK ...................................................................................................................... vi

ABSTRACT ................................................................................................................... vii

KATA PENGANTAR .................................................................................................. viii

HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ILMIAH ............................................... xi

DAFTAR ISI .................................................................................................................. xii

DAFTAR GAMBAR .................................................................................................... xiv

DAFTAR TABEL ......................................................................................................... xv

DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................................ xvi

BAB 1 PENDAHULUAN ............................................................................................... 1 1.1 Latar Belakang ............................................................................................................ 1

1.2 Rumusan Masalah ....................................................................................................... 3

1.3 Hipotesis ...................................................................................................................... 3

1.4 Tujuan Penelitian ........................................................................................................ 3

1.5 Manfaat Penelitian ...................................................................................................... 3

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA ...................................................................................... 4

2.1. Etil-p-Metoksisinamat (EPMS) ................................................................................. 4

2.2. Mycobacterium tuberculosis...................................................................................... 4

2.2.1 Karakteristik Bakteri .................................................................................... 4

2.2.2 Asam Mikolat ............................................................................................... 6

2.2.3 inhA .............................................................................................................. 7

2.3. Tuberkulosis .............................................................................................................. 7

2.3.1 Definisi ......................................................................................................... 7

2.3.2 Patofisiologi ................................................................................................. 7

2.3.3 Gambaran Klinis .......................................................................................... 8

2.4. Isoniazid..................................................................................................................... 8

2.4.1 Efek Antibakteri ........................................................................................... 9

2.4.2 Mekanisme Kerja ......................................................................................... 9

2.4.5 Resistensi .................................................................................................. 10

2.5. Hubungan Kuantitatif Struktur Aktifitas (HKSA)................................................... 10

2.6. Model HKSA Pendekatan Hansch .......................................................................... 11

2.6.1 Parameter Sifat Kimia Fisika dalam HKSA Model Hansch ...................... 11

2.6.2 Analisis Statistik dalam HKSA Model Hansch ......................................... 12

2.7. Penambatan Molekuler ............................................................................................ 12

2.8. Interaksi ikatan ........................................................................................................ 12

2.8.1 Ikatan Ion ................................................................................................... 13

2.8.2 Ikatan Hidrogen .......................................................................................... 13

2.8.3 Interaksi Van Der Waals ............................................................................ 14

2.8.4 Interaksi Dipol-Dipol ................................................................................. 14

2.8.5 Ikatan Kovalen ........................................................................................... 14

xiii

BAB 3 METODE PENELITIAN ................................................................................. 16 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian ................................................................................... 16

3.1.1 Tempat.................................................................................................................... 16

3.1.2 Waktu ..................................................................................................................... 16

3.2 Alat ............................................................................................................................ 16

3.2.1 Perangkat Keras ......................................................................................... 16

3.2.2 Perangkat Lunak......................................................................................... 16

3.3 Bahan ........................................................................................................................ 16

3.3.1 Struktur Nitrasi EPMS ............................................................................... 16

3.3.2 Struktur Tiga Dimensi inhA ....................................................................... 17

3.4 Cara Kerja ................................................................................................................. 17

3.4.1 Hubungan kuantitatif struktur aktifitas model Hansch .............................. 17

3.4.1.1 Pemilihan Deskriptor .............................................................. 17

3.4.1.2 Training Set, Test Set dan Sampel Set .................................... 17

3.4.1.3 Menyingkirkan Outlier ........................................................... 21

3.4.1.4 Menilai Kualitas Persamaan HKSA ....................................... 21

3.4.2 Penambatan Molekul dengan Autodock Vina............................................ 21

3.4.2.1 Penyiapan struktur molekul resptor inhA ............................... 21

3.4.2.2 Optimasi Molekul ................................................................... 21

3.4.2.3 Menentukan Lokasi Penambatan Molekul – Ligan ................ 21

3.4.2.4 Penyiapan Struktur Tiga Dimensi (3D) Ligan ....................... 21

3.4.2.5 Optimasi Ligan ....................................................................... 22

3.4.2.6. Penambatan Molekul ............................................................. 22

3.4.2.7 Visualisasi Hasil Penambatan Molekul .................................. 22

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN ....................................................................... 23

4.1 Hubungan Kuantitatif Struktur Aktifitas Model Hansch ........................................ 23

4.1.1 Pemilihan Deskriptor ................................................................................ 23

4.1.2 Training Set ............................................................................................... 23

4.1.3 Test Set ..................................................................................................... 25

4.1.4 Sample Set ................................................................................................ 26

4.2 Penambatan Molekul dengan Autodock Vina.......................................................... 27

4.2.1 Penyiapan Ligand ..................................................................................... 27

4.2.2 Penyiapan Reseptor ................................................................................... 28

4.2.3 Penambatan Molekular ............................................................................. 29

4.2.4 Visualisasi Hasil Penambatan Molekul .................................................... 31

BAB 5 PENUTUP .................................................................................................................... 36

5.1 KESIMPULAN ........................................................................................................ 36

5.2 SARAN .................................................................................................................... 36

DAFTAR PUSTAKA .................................................................................................... 37

LAMPIRAN ................................................................................................................... 40

xiv

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Etil p-metoksisinamat ................................................................................... 4

Gambar 2. Mycobacterium tuberculosis ........................................................................ 5

Gambar 3. NAD+ ........................................................................................................... 27

Gambar 4. 4-nitrophenyl 4-coumarate-NAD+ .............................................................. 27

Gambar 5. Reseptor 1ZID .............................................................................................. 28

Gambar 6. Perbandingan hasil Visualisasi 4-nitrophenyl 4-coumarate dengan PyMol

(kiri) dengan LigPlot (kanan) ...................................................................... 32

xv

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 1. Senyawa Training Set ...................................................................................... 17

Tabel 2. Senyawa Test Set .............................................................................................. 18

Tabel 3. Senyawa Sample Set ........................................................................................ 19

Tabel 4. Hasil HKSA Training set ................................................................................. 23

Tabel 5. Hasil HKSA Test Set ........................................................................................ 24

Tabel 6. Hasil HKSA Sample Set ................................................................................... 25

Tabel 7. Hasil Penambatan Molekular Sampel Uji ........................................................ 29

Tabel 8. Hasil Visualisasi Senyawa Uji dengan LigPlus ............................................... 30

Tabel 9. Perbandingan Hasil Penambatan Molekular dengan HKSA Sampel .............. 33

xvi

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Alur Penelitian ...................................................................................... 38

Lampiran 2. Prosedur Kerja .................................................................................. 39

Lampiran 3. Hasil Penambatan Molekuler Dengan Autodockvina beserta

Visualisasi Dengan Pymol (Kiri), dan Ligplot (Kanan) ...................... 59

Lampiran 4. Reseptor inhA yang Diunduh ............................................................... 66

1

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Etil p-metoksisinamat (EPMS) adalah salah satu senyawa yang digunakan

sebagai dasar senyawa tabir surya yaitu pelindung kulit dari sengatan sinar

matahari. Etil p-metoksisinamat termasuk dalam golongan senyawa ester yang

mengandung cincin benzena dan gugus metoksi yang bersifat nonpolar dan juga

gugus karbonil yang mengikat etil yang bersifat sedikit polar sehingga dalam

ekstraksinya dapat menggunakan pelarut-pelarut yang mempunyai variasi

kepolaran yaitu etanol, etil asetat, metanol, air, dan heksana (Firdausi, 2009).

Etil p-metoksi sinamat telah dilaporkan memiliki aktifitas larvicidal,

nematicidal, antifungi, dan antikarsinogenik, serta menghambat aktifitas enzim

monoaminoksidase. Senyawa EPMS dilaporkan dapat menghambat virulensi

Mycobacterium tuberculosis H37Ra, H37Rv, dan isolat klinik pasien resisten

MDR (Multidrug Resistant) dengan konsentrasi hambat minimum 242-485 μM.

Sehingga menjadi pedoman dalam merancang senyawa baru dengan senyawa

penuntun EPMS sebagai antituberkulosis yang potensial ( Laksamana et al, 2011).

Tuberkulosis (TB) adalah penyakit pembunuh kedua setelah HIV/AIDS di

dunia. Pada tahun 2013, 9 juta orang terserang TB dan 1.5 jutanya meninggal

karena penyakit ini dan sekitar 480.000 orang mengalami multidrug resistant TB

(MDR-TB). Di Indonesia, pada tahun 2013, sekitar 325.582 kasus TB baru dan

terulang terjadi dengan 1.9% kasus MDR-TB (WHO, 2013).

Tuberkulosis adalah penyakit menular langsung yang disebabkan oleh kuman

TB (Mycobacterium tuberculosis). Sebagian kuman TB menyerang paru, tetapi

dapat juga menyerang organ tubuh lainnya. Genus Mycobacterium merupakan

kelompok bakteri Gram positif, berbentuk batang, berukuran lebih kecil

dibandingkan bakteri lainnya. Genus ini mempunyai karakteristik unik karena

dinding selnya kaya akan lipid, dan lapisan tebal peptidoglikan yang mengandung

arabinogalaktan, lipoarabinomanan dan asam mikolat. Asam mikolat tidak biasa

dijumpai pada bakteri dan hanya dijumpai pada dinding sel Mycobacterium dan

2


Corynebacterium. Bersifat tahan asam sehingga dikenal juga sebagai Basil Tahan

Asam (BTA) (Anonim, 2008; depkes RI, 2007; and Poeloengan et. al, 2007).

InhA, adalah enoil reduktase dari Mycobacterium tuberculosis dan bagian

dari keluarga rantai pendek dehidrogenase/reduktase (SDR), mengkatalisis

reduksi NADH-dependent dari rantai panjang trans-2-enoyl-Asam lemak ACP

pada jalur biosintesis asam lemak tipe II dari Mycobacterium tuberculosis.

NADH-Dependen enoil-ACP reduktase dikodekan oleh gen Inha Mycobacterium

telah divalidasi sebagai target molekul utama dari garis depan isoniazid obat

antitubercular (INH). Studi terbaru menunjukkan bahwa InhA juga target untuk

baris kedua obat antituberkulosis etionamid (ETA). InhA mengkatalisis

pengurangan rantai panjang trans-2-enoil-ACP di tipe II asam lemak jalur

biosintesis dari Mycobacterium tuberculosis. Penghambatan InhA mengganggu

biosintesis asam mikolat yang konstituen utama dari dinding sel mikobakteri

(Kumar, 2011).

Hubungan kuantitatif struktur kimia dan aktifitas biologis obat (HKSA)

merupakan bagian penting rancangan obat, dalam usaha mendapatkan obat baru

dengan aktifikas yang lebih besar, keselektifan yang lebih tinggi, toksisitas atau

efek samping sekecil mungkin dan kenyamanan yang lebih besar. Selain itu

dengan menggunakan model HKSA, akan lebih banyak menghemat biaya atau

lebih ekonomis, karena untuk mendapatkan obat baru dengan aktifitas yang

dikehendaki, faktor coba-coba ditekan sekecil mungkin sehingga jalur sintesis

menjadi lebih pendek (Siswandono, 2008).

Penambatan molekul atau Molecular docking adalah prosedur komputasional

yang digunakan untuk memprediksi ikatan nonkovalen makromolekul, lebih

sering, sebuah molekul besar (reseptor) dan sebuah molekul kecil (ligan) secara

efisien, dimulai dari struktur-struktur yang tidak saling berikatan, struktur yang

ditemukan dari simulasi dinamika molekul, homology modeling, dan lain-lain.

Tujuan dari molecular docking adalah untuk memprediksi konformasi ikatan dan

afinitas pengikatan (Yanuar, 2012).

Pada penelitian ini dilakukan analisa hubungan kuantitatif struktur dan

aktifitas (HKSA) senyawa nitrasi EPMS degan metode Hansch, yang dilanjutkan

3


dengan penambatan molekul terhadap reseptor inhA menggunakan software

AutoDock Vina.

1.2 Rumusan Masalah

a. Bagaimana hubungan struktur dan aktifitas biologis senyawa nitrasi EPMS

terhadap aktifitas anti tuberkulosis melalui pendekatan Hansch.

b. Apakah senyawa nitrasi EPMS aktif menghambat reseptor inhA sebagai

anti tuberkulosis dengan metode penambatan molekular.

c. Bagaimana interaksi senyawa nitrasi EPMS terhadap reseptor inhA

sebagai anti tuberkulosis dengan metode penambatan molekular

1.3 Hipotesis

a. Senyawa - senyawa nitrasi EPMS memiliki kemampuan yang berbeda

terhadap aktifitas anti tuberkulosis.

b. Senyawa - senyawa nitrasi EPMS dapat berinteraksi dengan reseptor inhA

pada Mycobacterium tuberculosis sebagai anti tuberkulosis.

1.4 Tujuan Penelitian

a. Melakukan analisa hubungan kuantitatif struktur dan aktifitas (HKSA)

turunan senyawa EPMS terhadap aktifitas anti tuberkulosis.

b. Mengetahui model interaksi senyawa turunan EPMS pada reseptor inhA

Mycobacterium tuberculosis.

1.4 Manfaat Penelitian

a. Sebagai informasi dalam perancangan obat anti tuberkulosis baru yang

lebih potensial dalam menghambat Mycobacterium tuberculosis.

b. Sebagai suatu informasi metode analisa HKSA Hansch dalam penelitian

kimia komputasi.

4


BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Etil P-Metoksisinamat (EPMS)

Etil p-metoksisinamat (EPMS) adalah salah satu senyawa hasil isolasi

rimpang kencur (Kaempferia Galanga L.) yang merupakan bahan dasar senyawa

tabir surya yaitu pelindung kulit dari sengatan sinar matahari. EPMS termasuk

dalam golongan senyawa ester yang mengandung cincin benzena dan gugus

metoksi yang bersifat nonpolar dan juga gugus karbonil yang mengikat etil yang

bersifat sedikit polar sehingga dalam ekstraksinya dapat menggunakan pelarut-

pelarut yang mempunyai variasi kepolaran yaitu etanol, etil asetat, metanol, air,

dan heksana (Firdausi, 2009).

Gambar 1. etil p-metoksi sinamat (Marvin Sketch)

EPMS telah dilaporkan memiliki aktifitas larvicidal, nematicidal, antifungi,

dan antikarsinogenik, serta menghambat aktifitas enzim monoaminoksidase.

Lakshmanan et al, menyebutkan bahwa EPMS juga dapat menghambat virulensi

M. tuberculosis. Sehingga menjadi pedoman untuk merancang senyawa baru

dengan senyawa penuntun EPMS sebagai antituberkulosis yang potensial

(Lakshmanan et al, 2011).

2.2 Mycobacterium tuberculosis

2.2.1 Karakteristik Bakteri

Mycobacterium tuberculosis berbentuk batang lurus atau sedikit melengkung,

tidak berspora, dan tidak berkapsul. Bakteri ini berukuran lebar 0,3 – 0,6 μm dan

panjang 1 – 4 μm. Dinding Mycobacterium tuberculosis sangat kompleks, terdiri

dari lapisan lemak cukup tinggi (60%). Penyusun utama dinding sel

5


Mycobacterium tuberculosis ialah asam mikolat, lilin kompleks, dan trehalosa

dimikolat yang disebut cord factor.

Bakteri ini dibedakan dari sebagian besar bakteri dan mikobakteri lainnya

karena bersifat patogen, dan dapat berkembang biak dalam sel fagosit hewan dan

manusia. Pertumbuhan Mycobacterium tuberculosis relatif lambat dibandingkan

Mycobacterium lainnya. Mycobacterium tuberculosis tidak menghasilkan

endotoksin maupun eksotoksin. Bagian selubung Mycobacterium tuberculosis

mempunyai sifat pertahanan khusus terhadap proses mikobakterisidal sel hospes.

Dinding sel yang kaya lipid akan melindungi mikobakteri dari proses

fagolisosom, hal ini dapat menerangkan mengapa mikobakteri dapat hidup pada

makrofag normal yang tidak teraktivasi (Handayani, 2008).

Gambar 2. Mycobacterium tuberculosis

Sumber: http://globalbiodefense.com/2014/11/14

Mycobacterium tuberculosis bersifat obligat aerob, sehingga hanya bisa hidup

pada keadaan kandungan oksigen tinggi. Dalam es atau keadaan dingin, bakteri ini

dapat bertahan selama bertahun-tahun, berada dalam keadaan dormant (tidak

aktif). Pertumbuhannya dalam suatu medium pertumbuhan (juga dalam hewan)

sangat lambat. Diperlukan waktu paling cepat dua belas jam bagi bakteri ini untuk

menggandakan dirinya didalam medium kaya nutrisi. Konsentrasi lemak yang

tinggi menyebabkan bakteri ini mempunyai sifat-sifat khusus, yaitu hidrofobik,

http://globalbiodefense.com/2014/11/14

6


tahan asam, impermeabel bila diwarnai, tahan serangan antibodi dan

pertumbuhannya lambat (Pfyffer, G.B., 2003).

Komponen antigen ditemukan di dinding sel dan sitoplasma, yaitu komponen

lipid, polisakarida dan protein. Karakteristik antigen Mycobacterium tuberculosis

dapat diidentifikasi dengan menggunakan antibodi monoklonal. Bakteri/basil ini

cenderung lebih resisten terhadap agen kimia daripada bakteri lainnya karena sifat

hidrofobik permukaan selnya. Basil tuberkel resisten terhadap kekeringan dan

bertahan hidup dalam waktu yang lama dalam sputum yang kering ( Jawetz et al.,

2005 ).

2.2.2 Asam mikolat

Asam mikolat merupakan asam lemak berantai panjang yang dihubungkan

dengan arabinogalaktan oleh ikatan glikolipid, dan dengan peptidoglikan oleh

jembatan fosfodiester. Unsur lain yang terdapat pada dinding sel bakteri adalah

polisakarida sepereti arabinogalaktan dan arabinomanan. Struktur dinding sel

yang kompleks tersebut menyebabkan bakteri Mycobacterium tuberculosis

bersifat tahan asam, yaitu apabila sekali diwarnai akan tetap tahan terhadap upaya

penghilangan zat warna tersebut dengan larutan asam – alkohol (Poeloengan et al,

2007).

Asam mikolat merupakan konstituen utama dari dinding sel mikobakteri.

Biosintesis asam mikolat dicapai melalui sintesis asam lemak Mycobacterium

tuberculosis. Tidak seperti bakteri lain, Mycobacterium tuberculosis unik karena

memiliki kedua tipe I dan tipe II lemak jalur biosintesis asam. Sisntesis asam

lemak tipe I pada Mycobacterium tuberculosis bertanggung jawab untuk generasi

asam lemak rantai alkil pendek jenuh, termasuk asam mikolat R-C24. Beberapa

produk dari sisntesis asam lemak tipe I, seperti produk asam lemak C16-C26,

kemudian dipindahkan ke jalur sisntesis asam lemak tipe II, di mana mereka

diperpanjang hingga menjadi C56, membentuk rantai meromikolat yang berfungsi

sebagai prekursor untuk asam mikolat akhir (Kumar et al, 2011).

2.2.3 inhA

InhA, adalah enoil reduktase dari Mycobacterium tuberculosis dan bagian dari

keluarga rantai pendek dehidrogenase / reduktase (SDR), mengkatalisis reduksi

NADH-dependent dari rantai panjang Asam lemak trans-2-enoyl ACP pada jalur

7


biosintesis asam lemak tipe II dari Mycobacterium tuberculosis. NADH-

Dependen enoil-ACP reduktase dikodekan oleh gen Inha Mycobacterium telah

divalidasi sebagai target molekul utama dari garis depan isoniazid obat

antituberkular (INH).

Studi terbaru menunjukkan bahwa InhA juga target untuk obat antituberkular

lini kedua, etionamid (ETA). InhA mengkatalisis reduksi rantai panjang trans-2-

enoil-ACP di tipe II asam lemak jalur biosintesis dari Mycobacterium

tuberculosis. Penghambatan InhA mengganggu biosintesis asam mikolat sehingga

mengganggu struktur dinding sel mikobakteri ( Kumar et al, 2011).

2.3 Tuberkulosis

2.3.1 Definisi

Tuberculosis adalah penyakit menular langsung yang disebabkan oleh kuman

TB (Mycobacterium tuberculosis). Sebagian kuman TB menyerang paru, tetapi

dapat juga menyerang organ tubuh lainnya (Depkes RI, 2007).

2.3.2 Patofisiologi

Paru merupakan jalan utama masuknya Mycobacterium tuberculosis melalui

udara, yaitu dengan inhalasi droplet. Hanya droplet ukuran 1-5 mikron yang dapat

melewati sistem mukosiliar saluran nafas, sehingga dapat mencapai dan bersarang

di bronkiolus serta alveoli. Tuberkulosis primer terjadi pada individu yang

terpapar pertama kali dengan basil tuberkulosis, sedangkan tuberkulosis paru

kronik (reaktivasi atau pasca primer), adalah hasil reaktivasi infeksi tuberkulosis

pada suatu fokus dorman yang terjadi beberapa tahun lalu. Faktor-faktor yang

berpengaruh terhadap reaktivasi belum dipahami secara keseluruhan (Handayani,

S., 2008).

Organ tubuh yang paling banyak diserang tuberkulosis adalah paru, beberapa

penelitian menunjukkan adanya kenaikan limfosit alveolar, netrofil pada sel

bronkoalveolar dan HLA-DR pada pasien tuberkulosis paru.

Respon imunologik terhadap infeksi TB berupa imunitas seluler dan

hipersensitiviti tipe lambat (delayed-type hypersensitivity). Apabila respons imun

lemah atau gagal maka terjadi TB aktif pada individu yang terinfeksi. Imunitas

seluler menyebabkan proliferasi limfosit T-cluster of differentition (CD4), dan

memproduksi sitokin lokal sebagai respons terhadap antigen yang dikeluarkan

8


Mycobacterium tuberculosis limfosit T helper 1 (Th1), yang mengaktifkan

makrofag sedangkan limfosit T helper 2 (Th2) menambah sistesis antibodi

humoral dan kemudian memproduksi sitokin lokal, tumor necrosing factor alfa

(TNFa) dan interferon gamma (INFg). Sitokin akan menarik monosit darah ke lesi

TB dan mengaktifkannya. Monosit aktif atau makrofag danlimfosit – TCD4

memproduksi enzim lisosim, oksigen radikal, nitrogen intermediate dan

interleukin-2 (Ulrichs, at al, 2003).

2.3.3 Gambaran klinis

TB paru primer biasanya terjadi pada usia muda. TB tersebut sering

asimtomatik tanpa tanda-tanda klinis dan dapat menyebabkan penyakit demam

ringan, eritema nodosum (lesi nyeri, garas berindurasi), dan sedikit efusi pleura.

Kompresi bronkus oleh limfadenopati dapat menyebabkan mengi dan kadang-

kadang kolaps lobar diikuti bronkiektasis lanjut.

TB pasca primer terjadi berbulan-bulang, dengan malaise, anoreksia,

penurunan berat badan, keringat malam, dan batuk produktif. Sulit bernapas,

nyeri dada, hemoptysis, dan limfadenopati servikal dapat terjadi. Tanda klinis

pneumonia dan efusi pleura dapat terjadi (Ward JPT, 2007).

2.4 Isoniazid

Pengobatan terhadap TB dimulai sejak 1940-an dengan streptomisin. Obat anti

tuberkulosis pada saat ini digolongkan menjadi 2 kelompok, yaitu lini pertama

dan lini kedua. Kelompok lini pertama, yaitu isoniazid, rifampisin, etambutol,

streptomisin, dan pirazinamid. Secara umum kelompok lini pertama ini

efektifitasnya tinggi, dan toksisitas dapat ditolerir. Kelompok lini kedua, adalah

antibiotika golongan fluorokuinolon, sikloserin, etionamid, amikasin, kanamisin,

kapreomisin, dan para aminosalisilat (Niemann, S. and Gerdes, S.R., 2003).

Isoniazid, diperkenalkan pada tahun 1952, merupakan obat yang paling aktif

untuk mengobati tuberkulosis yang disebabkan oleh strain-strain yang rentan.

Isoniazid merupakan hidrazida dari asam isonikotinat, yang merupakan suatu

molekul kecil, sederhana (MW 137) yang mudah larut dalam air.

Secara invitro, isoniazid menghambat sebagian besar basil tuberkel pada

konsentrasi 0,2 mp/mL atau kurang dan merupakan bakterisid untuk basil tuberkel

9


yang berkembang secara aktif melawan organisme-organisme yang berada

ekstrasel maupun intrasel (Katzung, 2004).

2.4.1 Efek Antibakteri

Isoniazid secara in vitro bersifat tuberkulostatik dan tuberkulosid dengan

KHM (Kadar Hambat Minimun) sekitar 0,025-0,05 mcg/mL. Pembelahan kuman

masih berlangsung 2 sampai 3 kali sebelum dihambat sama sekali. Efek

bakterisidnya hanya terlihat pada kuman yang sedang tumbuh aktif.

Mikroorganisme yang sedang ‖istirahat‖ mulai lagi dengan pembelahan biasa bila

kontaknya dengan obat dihentikan. Pada uji hewan, ternyata aktifitas isoniazid

lebih kuat dibandingkan streptomisin. Isoniazid dapat menembus sel dengan

mudah (Katzung, 2004).

2.4.2 Mekanisme Kerja

Dependen-NADH enoil-ACP reduktase dikodekan oleh gen Inha

Mycobacterium telah divalidasi sebagai molekul target utama dari obat

antituberkulosis lini pertama isoniazid (INH). Studi terbaru menunjukkan bahwa

InhA juga target untuk lini kedua obat antituberkulosis etionamid (ETA). InhA

mengkatalisis reduksi rantai panjang trans-2-enoil-ACP pada jalur biosintesis

asam lemak tipe II dari Mycobacterium tuberculosis.

Penghambatan InhA mengganggu biosintesis asam mikolat, yaitu konstituen

utama dari dinding sel mikobakteri. Sebagai sebuah prodrug, INH harus

diaktifkan oleh mikobakteri katalase-peroksidase KatG terbeih dahulu ke dalam

bentuk aktif radikal asil nya. Produk tambahan yang dihasilkan dari ikatan

kovalen dari INH aktif dengan InhA kosubstrat NADH, atau produk oksidasi

NAD +, berfungsi sebagai InhA inhibitor poten. INH telah banyak diterapkan

sebagai agen lini pertama untuk pengobatan tuberkulosis selama 40 tahun terakhir

(Kumar, et al, 2011) .

2.4.3 Resistensi

Resistensi terhadap isoniazid telah diasosiasikan dengan mutasi yang

menghasilkan over-ekspresi dari inhA, yang mengkode suatu pembawa acyl

protein reductase dependent-NADH, mutasi atau delesi dari katG, mutasi

promotor menghasilkan over-ekspresi dari ahpC, sebuah gen virulence dugaan

yang terlibat dalam proteksi sel dari stres oksidatif, dan mutasi kasA. Organisme

10


yang secara berlebihan memproduksi inhA menunjukan resistensi tingkat rendah

dan resistensi-silang terhadap ethionamide. Mutan-mutan katG menunjukan

resistensi tingkat tinggi isoniazid dan tidak menyebabkan resistensi-silang

terhadap ethionamide (Katzung, 2004).

2.5 Hubungan Kuantitatif Struktur dan Aktifitas (HKSA)

Pendekatan hubungan struktur dan aktifitas biologis mulai berkembang

dengan pesat setelah tahun 1960-an, dengan dipelopori oleh Corwin Hansch dan

kawan-kawan, yang menghubungkan struktur kimia dan aktifitas biologis obat

melalui sifat-sifat kimia fisika umum seperti kelarutan dalam lemak, derajat

ionisasi, atau ukuran molekul. Setelah itu, hubungan kuantitatif antara aktifitas

biologis dan parameter yang menggambarkan perubahan sifat kimia fisika, yaitu

parameter hidrofobik, elektronik dan sterik, pada suatu seri molekul, mulai

dikembangkan secara lebih intensif. Hubungan atau korelasi yang baik digunakan

untuk menunjang model interaksi obat-reseptor dan meramalkan jalur sintesis obat

yang lebih menguntungkan (Siswandono, 2008).

Hubungan kuantitatif struktur kimia dan aktifitas biologis obat (HKSA)

merupakan bagian penting rancangan obat, dalam usaha mendapatkan obat baru

dengan aktifikas yang lebih besar, keselektifan yang lebih tinggi, toksisitas atau

efek samping sekecil mungkin dan kenyamanan yang lebih besar. Selain itu

dengan menggunakan model HKSA, akan lebih banyak menghemat biaya atau

lebih ekonomis, karena untuk mendapatkan obat baru dengan aktifitas yang

dikehendaki, factor coba-coba ditekan sekecil mungkin sehingga jalur sintesis

menjadi lebih pendek (Siswandono, 2008).

2.6 Model Pendekatan HKSA Hansch

Hansch (1963), mengemukakan suatu konsep bahwa hubungan struktur kimia

dengan aktifitas biologis (log 1/C )suatu turunan senyawa dapat dinyatakan secara

kuantitatif melalui parameter-parameter sifat fisika kimia dari subsituen yaitu

parameter hidrofobik (π), elektronik (σ), dan sterik (Es) yang terdapat pada

molekul, yang dapat dinyatakan secara matematis sebagai persamaan berikut:

Log A = aΣπ + bΣ σ + cΣ Es + d

11


Model pendekatan ini disebut juga model energi bebas linier (linier free

energy relationship = LFER) atau pendekatan ekstratermodinamik. (Siswandono,

2008)

2.6.1 Parameter Sifat Kimia Fisika dalam HKSA Model Hansch

Parameter sifat kimia fisika yang sering digunakan dalam HKSA model

Hansch adalah parameter hidrofobik, elektronik dan sterik. Pada proses distribusi

atau pengangkutan obat, penembusan membran biologis sangat dipengaruhi oleh

kelarutan obat dalam lemak/air, suasana pH dan derajat ionisasi (pKa) sehingga

dalam hubungan kuantitatif struktur dan aktifitas, parameter kimia fisika yang

sering dilibatkan adalah parameter hidrofobik dan elektronik. Pada proses

distribusi obat pengaruh sifat hidrofobik pada umumnya lebih besar dibanding

sifat elektronik.

a. Parameter hidofobik

Parameter hidrofobik (lipofilik) yang sering digunakan dalam HKSA antara

lain adalah logaritma koefisien partisi (log P), tetapan π Hansch, tetapan

fragmentasi f Rekker-Manhold dan tetapan kromatogram Rm.

b. Parameter elektronik

Ada tiga jenis sifat elektronik yang digunakan dalam HKSA model Hansch,

yaitu: pengaruh berbagai substituen terhadap reaktifitas bagian molekul yang

tidak mengalami perubahan, sifat elektronik yang berkaitan dengan tetapan

ionisasi (pKa) dan berhubungan dengan bentuk terionkan dan tak terionkan

dari suatu senyawa pada pH tertentu, dan sifat oksidasi-reduksi atau reaktifitas

senyawa.

c. Parameter sterik

Tetapan sterik substituent dapat diukur berdasarkan sifat meruah gugus-gugus dan

efek gugus pada ontak obat dengan sisi reseptor yang berdekatan (Siswandono,

2008).

2.6.2 Analisis Statistik dalam HKSA Model Hansch

Perhitungan statistik yang sering digunakan dalam hubungan struktur dan

aktifitas melalui parameter-parameter kimia fisika adalah analisis regresi linier

dan non linier. Untuk mengetahui hubungan kuantitatif antara struktur kimia dan

aktifitas biologi melalui parameter kimia fisika, dapat dilakukan perhitungan

12


statistic dengan bantuan computer, menggunakan program MICROSAT,

ABSTAT, QSAR, STATGRAPHIC, STATISTIKA, SIGMASTAT, SPSS atau

program statistic yang lain (Siswandono, 2008).

2.7 Penambatan Molekul

Molecular docking atau penambatan molekul adalah prosedur komputasional




ditemukandari simulasi dinamika molekul, homology modeling, dan lain-lain.


afinitas pengikatan (Yanuar, 2012).

Pediksi pengikatan molekul kecil pada protein penting karena data tersebut

digunakna untuk screening database virtual molekul mirip obat untuk

menentukan senyawa penuntun untuk pengembangan obat selanjutnya. Docking

dapat juga digunakan untuk mencoba memprediksi konformasi ikatan dari

pengikat yang diketahui, ketika percobaan seluruh struktur tidak tersedia (Yanuar,

2012).

2.8 Interaksi Ikatan

Pada umunya, ikatan obat-reseptor bersifat reversibel sehingga obat segera

meninggalkan reseptor bila kadar obat dalam cairan luar sel menurun. Untuk ini

ikatan yang terlibat pada interaksi obat reseptor harus relative lemah, tetapi masih

cukup kuat untuk berkopetensi dengan lain-lain ikatan dengan tempat kehilangan

(site of loss) (Siswandono, 2008).

Pada interaksi obat dengan reseptor, senyawa dapat menggabungkan beberapa

ikatan yang lemah, seperti ikatan hidrogen, ion, dipol-dipol, transfer muatan,

hidrofob, dan ikatan van der Waal‘s, sehingga secara total menghasilkan ikatan

yang cukup kuat dan stabil. Untuk suatu tujuan tertentu, missal diinginkan efek

berlangsung lama dan ireversibel, seperti pada obat antibakteri dan antikanker,

diperlukan ikatan yang lebih kuat yaitu ikatan kovalen (Siswandono, 2008).

13


2.8.1 Ikatan Ion

Ikatan ion adalah ikatan yang dihasilkan oleh daya tarik menarik elektrostatik

antara ion=ion yang muatannya berlawanan. Kekuatan tarik menarik akan

semakin berkuran bila jarak antara ion-ion bermuatan semakin jauh dan

pengurangan tersebut berbanding terbalik dengan jaraknya (Siswandono, 2008).

Makromolekul dalam sistem biologis yang berfungsi sebagai komponen

reseptor mengandung gugus protein dan asam nukleat yang bervariasi,

mempunyai gugus kation dan anion potensial tetapi hanya beberapa saja yang

dapat terionisasi pada pH fisiologis. Gugus kation protein berupa gugus amino

yang terdapat pada asam-asam amino, seperti lisin, glutamin dan asparagine.

Gugus anion protein berupa gugus karboksilat, misal pada asam aspartate dan

asam glutamate, gugus sulfhidril, missal pada sistein dan metionin dan gugus

fosforil, missal pada asam nukleat (Siswandono, 2008).

2.8.2 Ikatan Hidrogen

Ikatan hidrogen adalah sutau ikatan antara atom H yang mempunyai muatan

positif parsial dengan atom lain yang bersifat elektronegatifan dan mempunyai

sepasang elektron bebas dengan oktet lengkap, seperti O, N, dan F. Atom yang

bermuatan positif parsial dapat berinteraksi dengan atom negatif parsial dari

molekul atau atom lain yang berbeda ikatan kovalennya dalam satu molekul.

Ikatan hidrogen pada umumnya terjadi pada senyawa yang mempunyai gugus-

gugus seperti OH…O, NH…O, NH…N, NH…F, dan OH…F (Siswandono,

2008).

Ikatan hidrogen ada dua, yaitu ikatan hidrogen intramolekul, ikatan hidrogen

yang terjadi dalam satu molekul, dan ikatan hidrogen intermolekul, ikatan

hidrogen yang terjadi antara molekul-molekul. Kekuatan hidrogen intermolekul

lebih lama dibanding ikatan hidrogen intramolekul. Ikatan hydrogen dapat

mempengaruhi sifat-sifat kimia fisika senyawa, seperti titik didih, titik lebur,

kelarutan dalam air, kemampuan pembentukan kelat, dan keasaman. Perubahan

sifat-sifat tersebut dapat berpengaruh terhadap aktifitas biologis senyawa

(Siswandono, 2008).

14


2.8.3 Interaksi Van Der Waal‘s

Ikatan van der Waal‘s merupakan kekuatan tarik-menarik antar molekul atau

atom yang tidak bermuatan, dan letaknya berdekatan atau jaraknya ±4-6 A. Ikatan

ini terjadi karena sifat kepolarisasian molekul atau atom. Meskipun secara

individu lemah tetapi hasil penjumlahan ikatan van der Waal‘s merupakan faktor

pengikat yang cukup bermakna, terutama untuk senyawa-senyawa yang

mempunyai berat molekul tinggi. Ikatan van der Waal‘s terlibat pada interaksi

cincin benzen dengan daerah bidang datar reseptor dan pada interaksi rantai

hidrokarbon dengan makromolekul protein atau reseptor (Siswandono, 2008).

2.8.4 Interaksi Dipol-Dipol

Adanya perbedaan keelektronegatifan atom C dengan atom yang lain, seperti

O dan N, akan membentuk distribusi elektron tidak simetrik atau dipol, yang

mampu membentuk ikatan dengan ion atau dipol lain, baik yang mempunyai

daerah kerapatan elektron tinggi maupun yang rendah. Gugus-gugus yang

mempunyai fungsi dipolar antara lain adalah gugus karbonil, ester, amida, eter,

dan nitril. Gugus-gugus tersebut sering didapatkan pada senyawa berstruktur

spesifik (Siswandono, 2008).

2.8.5 Ikatan Kovalen

Ikatan kovaeln terbentuk bila ada dua atom saling menggunakan sepasang

elektron secara bersama-sama. Ikatan kovalen merupakan ikatan kimia yang

paling kuat dengan rata-rata kekuatan 100 kkal/mol. Dengan kekuatan ikatan yang

tinggi ini, pada suhu normal ikatan bersifat ireversibel dan hanya pecah bila

adapengaruh katalisator enzim tertentu. Interaksi obat-reseptor melalui ikatan

kovalen menghasilkan kompleks yang cukup stabil, dan sifat ini dapat digunakan

untuk tujuan pengobaan tertentu (Siswandono, 2008).

15


BAB 3

METODE PENELITIAN

3.1. Tempat dan Waktu Penelitian

3.1.1. Tempat

Penelitian dilaksanakan bertempat di Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

(FKIK) Universita Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta dan Lembaga Ilmu

Pengetahuan Indonesia (LIPI) Serpong.

3.1.2. Waktu

Penelitian dilaksanakan selama program komputasi dijalankan pada bulan

Febuari dan Maret 2015.

3.2. Alat

3.2.1. Perangkat keras

Notebook Compac (Serial CNF02588L3) dengan spesifikasi Intel® Core ™ i5

CPU M 450 @ 2.40GHz 2.40GHz, RAM (Random Access Memory) 2.00

gigabyte, dan jenis system 32-bit Operating System, x64-based processor,

Notebook terhubung dengan AC/DC adapter dan terkoneksi internet.

3.2.2. Perangkat lunak

Sistem operasi menggunakan Windows 8 Pro, Autodock Tools, Python 2.5.2

dan MGLTools 1.5.6 (Scripps Research Institute), Discovery Studio 3.5

Visualizer (Accelrys Enterprise Platform), Open Babel 2.3.2, Autodock Vina,

Pymol (De Lano Scitientific LLC), LigPlot, Marvin Sketch 5.5.1.0

(http://www.chemaxon.com), CDK Descriptor Calculator

(http://rguha.net/code/java/cdkdesc.html), Microsoft Exel, Protein Data Bank

(http://www.rcsb.org/pdb).

3.3. Bahan

3.3.1. Struktur Nitrasi EPMS

Ligan yang digunakan adalah ligan dari nitrasi etil p-metoksisinamat (EPMS)

yang telah beikatan dengan NAD+, dan kontrol positif isoniazid dibuat dengan

Marvin Sketch 5.5.1.0 dengan format.sdf. Senyawa nitrasi EPMS yang digunakan

ada 6, yaitu 2-nitro-4-methylcinnamaldehyde, 3-nitrocinnamic acid, 4-

http://www.chemaxon.com/

http://rguha.net/code/java/cdkdesc.html

http://www.rcsb.org/pdb

16


nitrocinnamic acid, 4-nitrophenyl 4-coumarate, (2E)‐3‐(4‐methoxyphenyl)‐N,N‐

dioxoprop‐2‐enamide, dan (2E)‐3‐(4‐methoxy‐3,5‐dinitrophenyl)‐N,N‐dioxoprop‐

2‐enamide, yang dibuat dengan MarvinSketch.

3.3.2. Struktur Tiga Dimensi (3D) inhA

Makromolekul protein yang dipilih adalah inhA. Struktur tiga dimensi inhA

diunduh dari Bank Data Protein melalui situs http://www.rcsb.org/pdb dan

diunggah dengan format text (gz) atau .pdb. Protein dengan identitas 1ZID yang

berasal dari organisme Mycobacterium tuberculosis.

3.4. Cara kerja

3.4.1. Hubungan kuantitatif struktur aktifitas model Hansch

Hubungan kuantitatif struktur dan aktifitas diperoleh dengan menggunakan program

CDK Descriptor. Data senyawa disimpan dalam bentuk Microsoft Exel. Browse input file

dengan nama senyawa yang akan diuji dengan format .mol . Pada kolom output tentukan

nama dan lokasi file hasil.

3.4.1.1. Pemilihan Deskriptor

Descriptor yang dipakai ada tiga jenis, yaitu LogP dan Harary Index, dari

program Marvin Sketch, serta Charged Partial Surface Areas (CPSA) dari

program CDK Deskriptor.

Dengan menggunakan Marvin sketch, senyawa yang diuji diubah dalam bentuk

aromatis dan dibersihkan secara 3 dimensi, lalu pilih calculating → partition →

LogP untuk memperoleh nilai logP. Selanjutnya, untuk nilai sterik pilih

calculating → geometrical → Topology Analysis → Harary Index → ok.

Untuk memperoleh nilai elektronik, menggunakan program CDK Deskriptor,

pada folder electroni → Charged Partial Surface Areas. Kemudian semua data

yang diperoleh disatukan dalam Microsoft exel sesuai kelompok masing-masing

set.

3.4.1.2. Senyawa Training Set, Test Set dan Sample Set

Dari 10 senyawa turunan sinamat dan EPMS yang diperoleh dari referensi, 5

senyawa untuk training set, dan 5 senyawa lainnya untuk test set. (Guzman,

2014). Sedangkan untuk sample set, digunakan 6 senyawa nitrasi EPMS yang

akan diuji aktifitasnya, sekaligus dijadikan sebagai ligan penambatan. Dua

http://ww.rcsb.org/pdb

17


senyawa terakhir dari sample set adalah senyawa yang dirancang sendiri dan

diberi nama secara IUPAC, dan sisanya diambil dari refensi yang sama dengan

training set dan test set. Senyawa yang diambil dari referensi ini adalah senyawa

yang telah disintesis dan telah diujikan kepada Mycobacterium tuberculosis secara

in vivo dan menghasilkan nilai MIC (Minimum Inhibit Concentration) Data

digunakan untuk memperoleh regresi HKSA.

Tabel 1. Senyawa Training Set

No Nama Senyawa MIC

(uM)

Struktur

1 Ehretiolide 41

2 4-O-prenylcoumaric

acid 86.1

3 3-coumaric acid 366


5 EPMS 242

18


Tabel 2. Senyawa Tes Set

No Nama Senyawa MIC

(uM)

Struktur

1 4-O-geranylcoumaric acid 66.8

2 3-O-prenylcoumaric acid 172

3 3,4-methylenedioxycinnamic

acid 312


5 Trans-cinnamic acid 270

19


Tabel 3. Senyawa Sample Set

No Nama Senyawa Struktur

1 2-nitro-4-methylcinnamaldehyde

2 3-nitrocinnamic acid

3 4-nitrocinnamic acid

4 4-nitrophenyl 4-coumarate

5 (2E)‐3‐(4‐methoxyphenyl)‐N,N‐dioxoprop‐2‐enamide

6

(2E)‐3‐(4‐methoxy‐3,5‐dinitrophenyl)‐N,N‐dioxoprop‐2‐ enamide

3.4.1.3. Menyingkirkan Outlier

Pada training set, jika terdapat suatu data yang jauh menyimpang

dibandingkan data-data lainnya, maka data ini dapat dihilangkan atau diabaikan

dari hasil untuk menghasilkan nilai regresi yang baik.

20


3.4.1.4. Menilai Kualitas Persamaan HKSA

Dari masing-masing hasil training set, test set, dan sample set, analisa hasil

regresi dan penyimpangan data dari nilai r2, rata-rata data SD (Root mean square

deviation), dan RMSD (Root mean square deviation).

3.4.2. Penambatan Molekul dengan Autodock Vina

3.4.2.1. Penyiapan struktur molekul resptor inhA

Pengunduhan makromolekul inhA dari Bank Data Protein melalui situs

http://www.rcsb.org/pdb/. Identitas molekul yaitu 1ZID. Data makromolekul

diunduh dalam format text (gz).

3.4.2.2. Optimasi Makromolekul

Makromolekul protein yang telah diunggah, dipisahkan dari ligan dan molekul

air. Pemisahan menggunakan Discovery Studio 3.5 Setelah dipisahankan,

kemudian simpan dalam format .pdb. Lalu dilakukan ditambahkan hydrogen

menggunakan Autodock Tool (edit → Hydrogens → add) dan disimpan dalam

format .pdb

3.4.2.3. Menentukan Lokasi Penambatan Molekul – Ligan

Penentuan lokasi penambatan molekul dilakukan berdasarkan jurnal referensi

dengan menggunakan Autodock Tools. Pengaturan dilakukan dengan grid box

(grid → grid box) yang meliputi ukuran (size x, y, z), kordinat (center x, y, z) dan,

besarnya ukuran (amstrong) dan disimpan (file → close saving current).

3.4.2.4. Penyiapan Struktur Tiga Dimensi (3D) Ligan

Ligan yang digunakan adalah isoniazid diunggah melalui PubChem

(http://PubChem.ncbi.blm.nih.gov) sebagai pembanding dan senyawa nitrasi

EPMS yang dibuat dengan menggunakan Marvin Sketch yang disimpan dengan

format .pdb.

3.4.2.5. Optimasi Ligan

Struktur ligan yang telah dibuat, kemudian dioptimasi dengan menggunakan

Autodock Tools. Kemudian, ligan yang telah dibuat (ligand → input → open),

disimpan dalam bentuk .pdbqt (ligand → output → save as pdbqt →save). Ligan

dan Protein yang telah tersimpan dalam format .pdbqt dikopi atau dipindah

kedalam folder Vina.

http://www.rcsb.org/pdb/

http://pubchem.ncbi.blm.nih.gov/

21


3.4.2.6. Penambatan Molekul

Penambatan molekul diilakukan dengan AutoDock Vina. Kedalam folder vina

disediakan file-file reserptor, ligan, vina, conf.txt, vina_split. reseptor, ligan,

conf.txt, vina, vina_license, dan vina split. Pada file conf.txt, diisi gridbox sesuai

pengaturan dengan size 70x70x70, dan autocenter.

Penambatan dimulai dengan membuka program Command Prompt, dan ditulis

perintah sebagai berikut: Vina --config conf.txt --log log.txt

3.4.2.7. Visualisasi Hasil Penambatan Molekul

Hasil kalkulasi penambatan dilihat pada output dalam format out.pdbqt atau

bentuk notepad. Hasil penambatan diperoleh dengan memilih ligan yang memiliki

energi ikatan yang paling rendah, nilai ikatan dapat dilihat pada file ‗log.txt‘.

Posisi ligan-ligan pada makromolekul divisualisasikan dengan perangkat lunak

PyMol untuk melihat kecocokan bentuk dan volume antara ligan dan situs

tambatanya.

Makromolekul dan output dalam bentuk .pdbqt dibuka dengan menggunakan

Wordpad. Kopi isi dalam output.pdbqt dan tambahkan kedalam makromolekul

dan simpan dalam format .pdb.

Visualisi interaksi makromolekul dan ligan dengan menggunakan Ligplot

untuk melihat kekuatan interaksi dan ikatan pada asam amino dalam bentuk dua

dimensi dan masukan file .pdb (output makromolekul dan ligan).

22


BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hubungan Kuantitatif Struktur Aktifitas Model Hansch

Merumuskan hubungan kuantitatif sementara antara struktur – aktifitas

biologis dari senyawa yang jumlahnya terbatas dengan menggunakan statistik

analisa regresi.

4.1.1 Pemilihan Deskriptor.

Parameter sifat kimia fisika yang sering digunakan dalam HKSA model

Hansch adalah parameter hidrofobik, elektronik dan sterik. (Siswandono, 2008).

Pada penelitian ini dipilih satu deskriptor yang menggambarkan masing-

masing parameter model HKSA Hansch. Pada penelitian ini, dipilih koefisien

partisi (log P) untuk parameter hidrofobik (lipofilik), CPSA (Charged Partial

Surface Areas) untuk parameter elektronik, dan Harary Index untuk parameter

sterik.

Program komputer yang digunakan untuk memperoleh nilai HKSA ini adalah

CDK Descriptor, yang digunakan untuk mencari nilai CPSA, dan Marvinskecth ,

digunakan untuk mencari nilai LogP dan Harary Index.

Untuk memperoleh nilai elektronik, menggunakan program CDK Descriptor,

pada folder electronic → Charged Partial Surface Areas → Go. Dengan

menggunakan Marvin sketch, senyawa yang diuji diiubah dalam bentuk aromatis

dan dibersihkan secara 3 dimensi, lalu pilih calculating → partition → LogP

untuk memperoleh nilai logP. Selanjutnya, untuk nilai sterik pilih calculating →

geometrical → Topology Analysis → Harary Index → ok.

Untuk setiap nilai deskriptor yang diperoleh, masing-masing dikelompokkan

pada senyawanya membentuk kelompok training set, test set, dan sample set.

4.1.2 Training Set

Training set menggunakan 5 senyawa turunan asam sinamat yang telah

diketahui aktifitas anti tuberkulosisnya terhadap bakteri spesies Mycobacterium

tuberculosis

23


H37Rv. Pemilihan data training set maupun test set didasarkan pada kemiripan

struktur senyawa dari data yang tersedia. Training set ini digunakan untuk

memperoleh persamaan HKSA model Hansch.

Tabel 4. Hasil HKSA Training set.

N

o Nama Senyawa

MIC

(uM)

Log

MIC LogP

Log

CPSA

Log

Sterik

Log

MIC Uji

(uM)

MIC Uji

1 4-O-geranylcoumaric acid 66.8 1.824 5.3 2.431 1.821 1.826 66.989

2 3-O-prenylcoumaric acid 172 2.235 3.4 2.329 1.674 2.233 171.230

4 4-coumaric acid 244 2.387 1.67 2.095 1.459 2.386 243.311

5 Trans-cinnamic acid 270 2.431 1.94 2.166 1.399 2.432 270.733

3 3,4-methylenedioxycinnamic

acid 312 2.494 1.63 2.166 1.580 2.495 313.130

Persamaan Hansch yang diperoleh:

Log MIC = a logP + b LogCPSA + c LogSterik + d

Log MIC = -0.2909LogP+1.6411LogCPSA-0.1497Log sterik-

0.3491

R2=0.999964

Dari persaman yang diperoleh diatas, deskriptor (variabel) dari parameter

fisika kimia Log CPSA (elektronik), Log P (koefisien partisi), dan Log Sterik

(sterik) berpengaruh terhadap aktifitas anti tuberculosis secara linier.

Persamaan diatas, digunakan untuk mecari nilai MIC uji, dengan memasukkan

nilai LogP, LogCPSA, dan Log Sterik. Hasil nilai MIC uji atau prediksi yang

diperoleh masing-masing senyawa sudah mendekati nilai MIC sebenarnya (in

vitro).

Nilai R2=0.999964 menunjukan nilai hubungan linearitas antara parameter

sifat fisika kimia struktur senyawa tehadap aktifitas anti tuberkulosis. Nilai r2

harus ≤1, dan nilai r2 dapat diterima dengan nilai diatas 0,8 (80%), jadi nilai r

2

yang diperoleh dari persamaan diatas dapat diterima (Rivai, 2014).

24


4.1.3 Test Set

Test set juga menggunakan 5 senyawa turunan asam sinamat yang telah

diketahui aktifitas anti tuberkulosisnya terhadap bakteri spesies Mycobacterium

tuberculosis H37Rv. Test set bertujuan untuk menilai dan memvalidasi persamaan

HKSA model Hansch yang dihasilkan dari training set yang dilihat dari nilai

RMSD (Root Mean Square Deviation).

Menggunakan persamaan yang diperoleh dari training set, didapatkan nilai

MIC uji test set dengan memasukkan nilai LogP, Log CPSa, dan Log Sterik

masing-masing senyawa test set. Kemudian dihitung perbedaaan MIC uji dengan

MIC in vitro dengsn nilai Standar Deviation (SD) dan Root Mean Square

Deviation (RMSD).

Tabel 5. Hasil HKSA Test Set.

N

o Nama Senyawa

MIC

(uM)

Log

MIC LogP

Log

CPSA

Log

Sterik

Log

MIC Uji

MIC Uji

(uM) SD SD^2

1 Ehretiolide 41 1.612 8.73 2.659 2.363 1.122 13.244 -0.490 0.240

2 4-O-prenylcoumaric acid 86.1 1.935 3.4 2.351 1.669 2.270 186.591 0.335 0.112

3 3-coumaric acid 366 2.563 1.67 2.095 1.461 2.385 243.134 -0.177 0.031

4 4-coumaric acid 244 2.387 1.67 2.095 1.459 2.386 243.311 -0.001 1.51

5 EPMS 242 2.383 2.41 2.413 1.595 2.670 468.755 0.287 0.082

Total

SD^2 0.467

RMSD

(%) 0.683

Nilai RMSD yang diperoleh dari nilai Log MIC in vitro dan Log MIC uji:

SD = Log MIC uji – Log MIC in vitro

RMSD diperoleh dengan Microsoft Exel dengan formula (=SQRT(∑SD2))

Hasil RMSD yand diperoleh dari test set adalah 0.683% dimana masih dalam

rentang nilai yang dapat diterima yaitu lebih kecil atau sama dengan 2%. Hal ini

membuktikan bahwa nilai RMSD masih dapat diterima dan persamaan linear yang

diperoleh dinyatakan akurat.

25


4.1.4 Sample Set

Senyawa uji dibuat dengan menggunakan program Marvin sketch. Sample set

adalah senyawa nitrasi EPMS yang sudah ada disintesis tetapi belum ada data

pengujian terhadap Mycobacterium tuberculosis, sehingga menjadi dasar untuk

mengetahui aktivitasnya terhadap bakteri tersebut. Senyawa uji yang digunakan

yaitu, 2-nitro-4-methylcinnamaldehyde, 3-nitrocinnamic acid, 4-nitrophenyl 4-

coumarate, 4-nitrocinnamic acid, (2E)‐3‐(4‐methoxyphenyl)‐N,N‐dioxoprop‐2‐

enamide, (2E)‐3‐(4‐methoxy‐3,5‐dinitrophenyl)‐N,N‐dioxoprop‐2‐enamide.

Nilai MIC prediksi senyawa uji (sampel) diperoleh dengan memasukkan nilai

Alog P, Log CPSA, dan Log Sterik sampel set ke dalam persamaan HKSA yang

diperoleh sebelumnya. Dari persamaan, diperolehlah nilai MIC uji atau prediksi

sampel.

Tabel 6. Hasil HKSA Sample Set.

No Nama Senyawa ALogP Log

CPSA

Log

Sterik

Log

MIC

Uji

MIC

Uji

(uM)

1 4-nitrophenyl 4-coumarate 3.41 2.304 1.821 2.167 147.035

2 3-nitrocinnamic acid 1.9 2.018 1.564 2.176 150.111

3

(2E)‐3‐(4‐methoxy‐3,5‐

dinitrophenyl)‐N,N‐dioxoprop‐2‐

enamide

1.59 2.048 1.839 2.274 188.181

4 2-nitro-4-methylcinnamaldehyde 2.48 2.184 1.573 2.278 189.929

5 4-nitrocinnamic acid 1.9 2.158 1.560 2.406 255.09

6 (2E)‐3‐(4‐methoxyphenyl)‐N,N‐

dioxoprop‐2‐enamide 1.66 2.235 1.601 2.596 394.664

Dari data diatas, nilai MIC uji prediksi terhadap Mycobacterium tuberculosis

berturut-turut dari yang paling kecil adalah 4-nitrophenyl 4-coumarate (147.035

uM), 3-nitrocinnamic acid (150.111 uM), (2E)‐3‐(4‐methoxy‐3,5‐dinitrophenyl)‐

N,N‐dioxoprop‐2‐enamide (188.181 uM), 2-nitro-4-methylcinnamaldehyde

(189.929 uM), 4-nitrocinnamic acid (255.09 uM), (2E)‐3‐(4‐methoxyphenyl)‐

N,N‐dioxoprop‐2‐enamide (394.664 uM). Hal ini menunjukan bahwa dari sampel

26


yang diuji, senyawa yang memiliki MIC terendah adalah 4-nitrophenyl 4-

coumarate dengan MIC=147.035 uM dan diprediksi sebagai senyawa yang paling

tinggi aktifitasnya sebagai anti tuberkulosis.

Dibandingkan dengan senyawa lead compound EPMS dengan aktifitas 242

uM dan asam sinamat 270 uM, terdapat 4 dari 6 senyawa uji memiliki prediksi

aktifitas anti tuberkulosis yang lebih baik (MIC lebih rendah), yaitu 2-nitro-4-

methylcinnamaldehyde (189.929 uM), 3-nitrocinnamic acid (150.111 uM), 4-

nitrophenyl 4-coumarate (147.035uM), dan (2E)‐3‐(4‐methoxy‐3,5‐

dinitrophenyl)‐N,N‐dioxoprop‐2‐enamide (188.181uM).

Dibandingkan dengan senyawa 3-coumaric acid (243.13 uM), senyawa 3-

nitrocinnamic acid (150.11 uM) memiliki nilai MIC uji prediksi yang lebih

rendah, sehingga menunjukan bahwa perubahan gugus hidroksi (OH) pada rantai

samping senyawa asam kumarat menjadi nitro (NO2), pada posisi yang sama

yaitu meta, meningkatkan aktifitas anti tuberkulosis senyawa turunan asam

sinamat.

Berdasarkan struktur molekul, senyawa 3-nitrocinnamic acid (150.111 uM)

dan 4-nitrocinnamic acid (255.09 uM) hanya terdapat perbedaan letak gugus nitro

(NO2) pada cincin aromatis, namun 3-nitrocinnamic acid memiliki MIC uji lebih

rendah dan affinitas yang lebih rendah juga, sehingga dianggap memiliki aktifitas

antituberkulosis yang lebih baik dibanding 4-nitrocinnamic acid.

4.2 Penambatan Molekul dengan Autodock Vina

4.2.1 Penyiapan Ligand

Ligand yang digunakan adalah senyawa uji yang telah berikatan dengan

NAD+, karena mengikuti mekanisme kerja Isoniazid yang berikatan dengan

NAD+ membentuk INADH sebelum berikatan pada reseptor inhA dan

menimbulkan aktifitas. (Stigliani et al, 2008).

Sedangkan kontrol positif Isoniazid diambil dari situs PubChem. Selanjutnya,

senyawa-senyawa uji tersebut diubah menjadi bentuk aromatis dan dibersihkan

secara 3 dimensi.

Optimasi ligand dilakukan dengan AutoDockTools dengan cara mengatur

torsi, dan mengubah formatnya menjadi .pdbqt.

Berikut adalah contoh gambar struktur sampel yang telah beikatan:

27


Gambar 3. NAD+ (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)

Gambar 4. 4-nitrophenyl 4-coumarate-NAD+ (Marvin Sketch)

4.2.2 Penyiapan Reseptor

Reseptor yang digunakan adalah inhA (PDB:1ZID) yang diunggah dari situs

Protein Data Bank http://www.rcsb.org/pdb. Reseptor dioptimasi dengan program

Discovery studio menghilangkan ligand-ligand yang masih ada berikatan pada

reseptor, Scripts – Selections – Select Ligand – delete. Selanjutnya

menghilangkan molekul air agar tidak mengganggu penambatan dan agar pada

saat penambatan, dan hanya ligang uji lah yang akan menambat, Scripts –

Selection – Select Water Molekules – delete. Selanjutnya penambahan molekul

hidrogen dengan AutoDock Tools , Edit – Hidrogen – Add, dan disimpan dalam

format .pdbqt.

https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/


28


Gambar 5. Reseptor 1ZID (http://www.rcsb.org/pdb)

4.2.3 Penambatan Molekular

Molecular docking atau penambatan molekul adalah prosedur komputasional




ditemukandari simulasi dinamika molekul, homology modeling, dan lain-lain.


afinitas pengikatan. (Arry yanuar, 2012)

Sebelum memulai penambatan, pada folder vina harus sudah ada file-file

reseptor (1ZID.pdbqt), ligan (2-nitro-4-methylcinnamaldehyde.pdbqt), conf.txt,

vina, vina_license, dan vina split. Pada file conf.txt, diisi gridbox sesuai

pengaturan dengan size 70x70x70, dan autocenter.

Penambatan dimulai dengan membuka program Command Prompt, dan ditulis

perintah sebagai berikut.

Vina –config conf.txt –log log.txt

Setelah proses penambatan selesai maka akan muncul file baru yang berisi nilai hasil

penambatan molekul setiap sampel uji, lalu dari 9 nilai yang muncul dari masing-masing

sampel, diambil nilai pertama yang dianggap paling baik.


29


Tabel 7. Hasil Penambatan Molekular Sampel Uji.

No Nama Sampel Affinitas

(kcal/mol)

4 4-nitrophenyl 4-coumarate -11.2

1 2-nitro-4-methylcinnamaldehyde -10.9

2 3-nitrocinnamic acid -10.5

5 (2E)‐3‐(4‐methoxyphenyl)‐N,N‐dioxoprop‐2‐enamide -10.2

6 (2E)‐3‐(4‐methoxy‐3,5‐dinitrophenyl)‐N,N‐dioxoprop‐

2‐enamide

-9.6

3 4-nitrocinnamic acid -9.2

7 Isoniazid (INH) -10.5

Hasil penambatan molekuler adalah afinitas ikatan antara ligan dengan

reseptor yang dinyatakan dengan energi bebas Gibb. Nilai affinitas yang muncul

adalah nilai entalpi energi Gibb, dimana nilai (-) < 0 menunjukan reaksi

eksotermik yang melepaskan panas. (Bresnick, 2004).

Dari hasil penambatan molekul, senyawa yang memiliki affinitas energi yang

paling rendah adalah 4-nitrophenyl 4-coumarate dengan -11.2 kcal/mol, diikuti

oleh 2-nitro-4-methylcinnamaldehyde -10.9 kcal/mol, 3-nitrocinnamic acid -10.5

kcal/mol, (2E)‐3‐(4‐methoxyphenyl)‐N,N‐dioxoprop‐2‐enamide -10.2 kcal/mol,

(2E)‐3‐(4‐methoxy‐3,5‐dinitrophenyl)‐N,N‐dioxoprop‐2‐enamide -9.6 kcal/mol,

dan 4-nitrocinnamic acid -9.2 kcal/mol. Sedangkan kontrol positif INH memiliki

affinitas energy -10.5 kcal/mol.

Nilai affinitas energi yang rendah menunjukan ikatan yang stabil, sehingga,

semakin rendah nilai affinitas, maka semakin stabil dan lebih tidak reaktif (energi

yang dimaksud adalah energi bebas dari Gibb, G. (Bresnick,2004)

Dari data diatas, maka ligan (senyawa uji) yang memiliki nilai affinitas yang

paling rendah dan ikatan yang paling stabil dengan reseptornya adalah 4-

nitrophenyl 4-coumarate.

30


4.2.4 Visualisasi Hasil Penambatan Molekul

Visualisasi docking dilakukan dengan menggunaka program PyMol dan

LigPlot. PyMol bertujuan untuk melihat posisi ligand di dalam situs tambatnya

pada reseptor secara tiga dimensi, sedangkan LigPlus bertujuan untuk

memperoleh ikatan ligand dengan asam amino – asam amino yang terdapat pada

reseptor serta jarak masing-masing ikatan tersebut.

Tabel 8. Hasil Visualisasi Senyawa Uji dengan LigPlus.

No Nama Senyawa Nama Asam Amio Jarak (Å)

1 4-nitrophenyl 4-coumarate Ser94

Gly96

Thr39

Ile15

Gly14

Val65

2.94

2.81

3.08

2.67

2.87

2.94

2 2-nitro-4-

methylcinnamaldehyde

Lys165

Thr196

Ala22

Met147

2.84

3.12

2.94

3.29

3 3-nitrocinnamic acid Val65

Asp64

Gly14

Thr196

2.99

3.34

3.04

2.79

4 Isoniazid (INH) Leu63

Gly14

Ser94

Thr196

Gly96

3.15

2.96

2.72

3.17

2.88

31


(Sambungan)


dioxoprop‐2‐enamide

Met147

Lys165

Gly96

Thr196

Lys118

3.08

3.02

2.96

2.98

3.05

6 (2E)‐3‐(4‐methoxy‐3,5‐

dinitrophenyl)‐N,N‐dioxoprop‐

2‐enamide

Arg153

Asp150

Gln267

Ile21

Thr196

Asp148

2.95

2.50

2.97

3.01

2.97

3.04

7 4-nitrocinnamic acid Gln100

Met98

Gly96

3.24

2.79

2.83

Dari hasil visualisali dengan Ligplot dapat ditarik kesimpulan bahwa,

perubahan molekul senyawa yang berikatan dengan NAD+ menimbulkan

perubahan konformasi ligand (ikatan molekul dengan NAD+) dalam situs tambat

reseptor, sehingga mengakibatkan perbedaan jenis dan jumlah ikatan yang

terbentuk dengan residu asam amino reseptor.

Dari data diatas, terlihat bahwa semua sampel uji memiliki interaksi dengan

reseptor yang terlihat dari sam amino yang terikat. Sampel uji mengikat 3 – 6

asam amino reseptor secara bervariasi, sedangkan kontrol positif INH berikatan

dengan 5 asam amino. Semakin banyak ikatan ligand dengan asam amino

reseptor, serta semakin dekat jarak antara ikatan tersebut, maka ikatan yang

dihasilkan akan semakin kuat.

Senyawa uji yang memiliki afinitas terbaik (-11.2 kcal/mol), 4-nitrophenyl 4-

coumarate mengikat 6 asam amino, dan 3 diantaranya adalah asam amino yang

sama diikat oleh kontrol positif INH yaitu Ser94, Gly96, dan Gly14. Senyawa uji

dengan affinitas ke-2, 2-nitro-4-methylcinnamaldehyde (-10.9 kcal/mol) mengikat

1 asam amino yang sama dengan INH yaitu Thr196 dengan jarak ikatan yang

32


lebih dekat. Sedangkan senyawa uji dengan affinitas yang sama dengan kontrol

positif INH (-10,5kcal/mol), 3-nitrocinnamic acid mengikat 2 asam amino yang

sama dengan INH yaitu Gly14, dan Thr196.

Tamires C. at all (2014), menyebutkan dalam penelitiannya bahwa gugus

ribose pada adenine dan pyrophosphate pada isoniazid+NADH (INADH)

berpengaruh secara kuat terhadap interaksi INADH dengan inhA. Ia juga

menyebutkan bahwa, ikatan hidrogen memiliki peran penting dalam perhitungan

nilai energi ikatan residu terhadap INADH, serta interaksi hidrofobik secara

signifikan berkontribusi pada beberapa residu asam amino yang penting,

diantaranya adalah Val65, Ile16, dan Met147.

Keterangan:

Hijau : C

Merah : O

Biru : N

Putih : H

Jingga : P

Gambar 6. Perbandingan hasil Visualisasi 4-nitrophenyl 4-coumarate

dengan PyMol (kiri) dengan LigPlot (kanan).

33


Tabel 9. Perbandingan Hasil Penambatan Molekular dengan HKSA Sampel.

No

Nama Sampel Penambatan Molekul HKSA

Affinitas (kcal/mol) MIC Uji

1 4-nitrophenyl 4-coumarate -11.2 147.035

2 2-nitro-4-methylcinnamaldehyde -10.9 189.929

3 3-nitrocinnamic acid -10.5 150.111


dioxoprop‐2‐enamide

-10.2 394.664

5

(2E)‐3‐(4‐methoxy‐3,5‐

dinitrophenyl)‐n,n‐dioxoprop‐2‐

enamide

-9.6

188.181

6 4-nitrocinnamic acid -9.2 255.09

Dari perbandingan diatas, diketahui bahwa senyawa 4-nitrophenyl

4-coumarate memiliki nilai MIC terendah sekaligus didukung dengan

hasil docking energi affinitas ikatan terkecil, sehingga dapat disimpulkan

bahwa 4-nitrophenyl 4-coumarate merupakan senyawa paling berpotensi

terhadap aktifitas anti tuberkulosis secara teoritis.

34


BAB 5

PENUTUP

5.1. Kesimpulan

a. Dalam analisa hubungan kuantitatif struktur dan aktifitas (HKSA), parameter

yang memperngaruhi sifat fisika kimia terhadap aktifitas adalah LogP

(koefisien partisi), Log CPSA (elektronik), dan Log sterik (sterik). Persamaan

HKSA Hansch yang diperoleh dari turunan EPMS terhadap aktifitas anti

tuberkulosis adalah Log MIC = -0.2909LogP+1.6411LogCPSA-0.1497Log

sterik-0.3491.

b. Senyawa uji yang memiliki afinitas terbaik, dengan affinitas -11.2 kcal/mol,

adalah 4-nitrophenyl 4-coumarate yang mengikat 6 asam amino yaitu Ser94,

Gly96, Thr39, Ile15, Gly14, dan Val65

5.2. Saran

a. Untuk melihat persamaan HKSA yang lebih baik dapat menggunakan training

set, dan test set dengan jumlah yang lebih banyak. Dengan memvariasikan

jenis sampel set terhadap turunan EPMS dapat diketahui sifat gugus yang

paling baik terhadap aktifitas anti tuberkulosis.

b. Dibutuhkan studi lebih lanjut menggunakan molecular dynamic dan uji in

vitro untuk melihat efektifitas senyawa nitrasi EPMS sebagai anti

tuberkulosis.

35


DAFTAR PUSTAKA

Anonim .2008 . Tuberkulosis, Kedaruratan Global. dalam www.lungsusa.org.

Bresnick, Stephen. 2004. Intisari Kimia Organik. Jakarta: Penerbit Hiprokrates.

Depertemen Kesehatan Republik Indonesia. 2007. Penanggulangan nasional

Tuberkulosis. Jakarta. Depertemen Kesehatan RI.

Firdausi, Nur Indah. (2009). Isolasi Senyawa Etil Para Metoksi Sinamat (Epms)

dari Rimpang Kencur Sebagai Bahan Tabir Surya Pada Industri

Kosmetik, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Jurusan

Kimia Universitas Negeri Malang. Malang.

Guzman , J. D. 2014. Review : Natural Cinnamic Acids, Synthetic Derivatives and

Hybrids with Antimicrobial Activity. Molecules 2014, 19, 19292-19349;

doi:10.3390/molecules191219292

Handayani, S. 2008 . Respon Imunitas Seluler pada Infeksi Tuberkulosis Paru.

Cermin Dunia Kedokteran dalam www._kalbe_com .

http://www.fao.org/docrep/004/y2775e/y2775e0e.htm. Annex 4 - Amino acids,

one and three letter codes. Diakses pada 04.05.2015.

http://globalbiodefense.com/2014/11/14/bmc-awarded-21m-investigate-

tuberculosis-biomarkers/, diakses pada tanggal 21.1.2015, 09:11.

https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/3767, diakses pada tanggal

14.4.2015.

Jawetz, Melnick, Adelberg. 2005. Mikrobiologi Kedokteran, Salemba Medika

Jakarta.

Katzung, B.G. 2007. Basic & Clinical Pharmacology, Tenth Edition. United

States : Lange Medical Publications.

http://www.lungsusa.org/

http://www.fao.org/docrep/004/y2775e/y2775e0e.htm

http://globalbiodefense.com/2014/11/14/bmc-awarded-21m-investigate-tuberculosis-biomarkers/

http://globalbiodefense.com/2014/11/14/bmc-awarded-21m-investigate-tuberculosis-biomarkers/

https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/3767

36


Kumar, U.C, Mahmood, S. 2011. Identification of Novel and Potent Inhibitors

Against Inha Reductase of Mycobacterium Tuberculosis Through a

Ligand-based Virtual Screening Approach. Advances in Natural and

Applied Sciences, 5(1): 58-63, 2011. ISSN 1995-0772

Lakshmanan, D., Werngren, J., Jose, L., Suja, K.P., Nair, M.S., Varma, R.L.,

Mundayoo, S., Hoffner, S., Kumar, R.A. 2011. Ethyl p-methoxycinnamate

Isolated From a Traditional Anti-tuberculosis Medicinal Herb Inhibits

Drrug Resistant Strains of Mycobacterium Tuberculosis In Vitro.

Fitoterapia 82 (2011) 757-761.

Niemann, S., Gerdes, S.R. 2003. Mycobacteria and TB-Therapy and Drug

Resistance. Dalam Mycobacteria and TB. Issues Infect Dis. Basel , Karger,

Vol.2 , p. 67-83.

Pfyffer, G.E. 2003 . Laboratory Diagnosis of Tuberculosis. Dalam Mycobacteria

and TB. Issues Infect Dis. Basel , Karger, Vol.2 , p. 67-83.

Poeloengan, M., I. Komala and S.M. Noor . 2007 . Bahaya dan Penanganan

Tuberculosis. Lokakarya Nasional Zoonosis . Balai Penelitian Veteriner

Bogor.

Rifai, A.A, Kasmui, Hadisaputro, S. 2014. Kajian Hksa Senyawa Turunan

Deoksibenzoin Terhadap Aktivitas Antioksidan Menggunakan Analisis Regresi

Multilinear. Indo. J. Chem. Sci. 3 (3) (2014)

Siswandono dan Soekardjo, B., (2000). Kimia Medisinal. Edisi 2. Surabaya:

Airlangga University Press.

Stigliani, J.-L., Arnaud, P., Delaine, T., Vania B.-G, Meunier, B.,

Bernadou, J. 2008. Binding of the tautomeric forms of isoniazid-NAD

adducts to the active site of the Mycobacterium tuberculosis enoyl-ACP

reductase (InhA): A theoretical approach. Journal of Molecular Graphics

and Modelling 27 (2008) 536–545.

37


Tamires ,C., Roner, F., Eveline, M.B., Valder, N.F., Marcelo, L.L., Vinicius, M.

2014. The quantum biophysics of the isoniazid adduct NADH binding to its

InhA reductase target. New J. Chem., 2014, 38, 2946—2957

Ulrichs, T., Kaufmann , S.H.E. 2003 . Immunology and Persistence. Dalam

Mycobacteria and TB. Issues Infect Dis. Basel , Karger, Vol.2 , p. 122-

127.

Ward JPT, Ward J, Leach RM, Wiener C. 2007. At a Glance Sistem Respirasi.

Airlangga. Jakarta.

World Health Organization. 2013. Tuberkulosis. Dalam

http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs104/en/ . diakses pada

23/5/2015.

Yanuar, Arry, 2012, Penambatan Molekular : Praktek dan Aplikasi Virtual

Screening, Fakultas Farmasi, Universitas Indonesia.

38


Lampiran 1. Alur Penelitian

Pemilihan deskriptor HKSA Hansch, yaitu Log P

(koefisien partisi), CPSA (elektronik), dan Indeks

harary (sterik)

Menyiapkan data Training set, Test set, dan

Sample set

Menyingkirkan outlier

Analisa dan visualisasi hasil penambatan

molekul dengan PyMol dan LigPlot

Menilai kualitas persamaan linear HKSA dari

nilai RMSD

Penyiapan reseptor 1ZID dan ligan. Reseptor

diunduh dari http://www.rcsb.org/pdb , dan

ligan dibuat dengan Marvin Sketch

Preparasi reseptor dan ligand. Reseptor

dihilangkan dari ligand dan air yang mtengikat.

Ligand dibuat dalam clean 3D

Penambatan molekul dengan AutoDock Vina

Menilai kualitas persamaan linear HKSA dari

nilai RMSD

Membuat persamaan regresi dari data struktur

dan aktifitas (MIC) senyawa training set


39


Lampiran 2. Prosedur Kerja

A. Langkah Kerja Hksa

1. Buka aplikasi CDK Descriptor

2. Input file dengan nama-nama molekul senyawa training set, test set, dan

sampel set dengan format .mol , lalu isi ouput file dengan format .xls.

3. Deskriptor yang dipilih adalah CPSA saja dari folder elektronik, lalu klik

Go

4. Hasil akan muncul dalam bentuk Microsoft Exel. Buka file output

masing-masing senyawa. Ambil data PPSA1 saja, lalu pindahkan ke file

exel yang baru.

40


5. Untuk memperoleh nilai LogP, dan nilai sterik, gunakan software Marvin

Scetch.

6. Buka file molekul senyawa untuk training set, test set, dan sampel dengan

marvin scetch.

7. Convert bentuk senyawa menjadi bentuk aromatik, dan dibersihkan secara

3dimensi.

8. Pilih calculating – partition – logp – pilih PHY – ok – ok, maka akan

muncul tampilan sebagai berikut.

41


Muncul kotak peringatan seperti berikut, lalu klik Ok.

Maka hasilnya muncul seperti berikut.

42


9. Pilih calculating – geometric – topological – pilih index hirary – ok, akan

muncul tampilan seperti berikut.

Pilih type yang diinginkan sepert berikut.

43


Muncul kotak peringatan seperti berikut, lalu klik Ok.

Hasilnya akan muncul sebagai berikut.

44


10. Masukkan masing-masing nilai deskriptor pada senyawa yang sesuai.

11. Kelompokan masing-masing senyawa pada satu sift senyawa sesuai

setnya. Lalu hitung nilai LogMIC, LogCPSA, Log Sterik . Pada kolom

nilai log dimasukan formula =Log(sel yang akan di log-kan)

12. Pada sift training set, untuk membuat persamaan regresi, blok 4 baris dan

4 kolom, lalu masukan rumus =Linest(nilai log MIC,(nilai logP; logCPA;

dan Log Sterik),true,true) <ctrl+shift+enter>. Maka akan muncul hasil

berikut.

LogMIC=2.851051-0.15861AlogP-0.160391logPPSA

45


Nilai pada kolom D12 manunjukan nilai variable Log sterik, E12 untuk

variabel LogCPSA(c), dan F12 untuk variable ALogP, N3 menunjukan

konstanta (a) , dan E14 menunjukan nilai R2.

Untuk persamaan linear LogMIC=a+bx+cy+dz

Maka persamaan yang diperoleh sebagai berikut:

13. Selanjutnya nilai ini digunakan untuk medapatkan nilai MIC senyawa uji .

46


47


14. Selanjutnya persamaan divalidasi dengan nilai RSMD. Data yang

diperlukan yaitu nilai SD, SD2, dan total SD

2 shift tes set.

48


49


15. Hasilnya akan muncul seperti ini.

16. Cara yang sama digunakan untu memperoleh nilai MIC uji sample set.

50


B. Optimasi Ligan Dan Reseptor.

1. Dalam penambatan molekul menggunakan AutodockTools, file yang

digunakan harus dalam format .pdb dan .pdbqt . jika molekul ligan atau

senyawa uji belum disimpan dalam bentuk .pdb , maka harus diubah

sebelumnya dengan software OpenBabel.

2. Masukan file yang akan diubah formatnya pada kolom INPUT FORMAT,

lalu tentukan tempat penyimpanan file yang baru dan format hasil yang

diinginkan pada OUTPUT FORMAT.

51


3. Lalu klik CONVERT. Maka data telah berhasil diconvert.

4. Selanjutnya optimasi ligand menggunakan AutoDoockTools. Input ligand

yang akan dioptimasi. Ligand – input – open – pilih nama ligand – open .

Seperti berikut.

5. Selanjutnya atur jumlah torsi. Ligand – Torsion Tree – Set Number of

Torsion – Dismiss.

52


6. Selanjutnya save dengan format .pdbqt . Ligand – Outpu – Save as

PDBQT

7. Selanjutnya sebelum docking, protein reseptor harus dioptimasi, dapat

menggunakan Discovery Studio. Buka reseptor yang akan digunakan

dengan software Discovery Studio.

53


8. Selanjutnya menghilangkan molekur air yang ada. Scripts – Selection –

Select Water Molekules – delete

9. Selanjutnya menghilangkan ligan yang masih terikat pada reseptor.

Scripts – Selections – Select Ligand – delete . Lalu disimpan dalam bentuk

.pdb .

54


10. Buka molekul reseptor pada AutoDockTools. Tambahkan atom hidrogen

pada molekur reseptor. Edit – Hidrogen – Add – Ok

Disesuaikan dengan pengaturan seperti berikut.

55


11. Lalu untuk optimasi selanjutnya, molekul reseptor diatur kotak grid-nya

dan disimpan dalam format .pdbqt. Grid – Macromolekul – Choose – pilih

1ZID – Select Molekul – Save.

56


12. Isi kotak pilihan pada grid box sesuai dengan pengaturan yang diinginkan

(literatur). Grid – Grid Box – Save As Current.

C. Penambatan Molekular

1. Sebelum memulai penambatan, pada folder vina harus sudah ada file-file

seperti berikut.

57


2. Pada file conf.txt diisi data sesuai pada grid box yang telah diatur pada

autoDockTools sebelumnya.

3. Penambatan dimulai dengan membuka program Command Prompt, dan

ditulis perintah sebagai berikut.

58


Maka akan muncul hasil seperti berikut,

59


Lampiran 3. Hasil Penambatan Molekuler Dengan Autodockvina Beserta

Visualisasi Dengan Pymol (Kiri), Dan Ligplot (Kanan).

1. 4-nitrocinnamic acid:

Mode Affinity (kcal / mol) Dist. From rmsd I.b Best mode rmsd u.b

1 -9.2 0.000 0.000

2 -9.0 3.625 5.724

3 -9.0 3.783 5.343

4 -8.9 3.765 9.591

5 -8.5 4.006 10.194

6 -8.4 3.583 9.750

7 -8.4 3.687 9.942

8 -8.3 3.921 10.239

9 -8.2 4.448 9.488

Keterangan:

Hijau : C

Merah : O

Biru : N

Putih : H

Jingga : P

60


2. 3-nitrocinnamic acid


1 -10.5 0.000 0.000

2 -10.4 3.098 12.685

3 -10.4 2.778 13.478

4 -10.2 3.586 12.003

5 -10.1 3.345 12.549

6 -10.1 4.004 11.809

7 -10.0 5.097 11.684

8 -9.9 3.971 12.328

9 -9.9 5.447 12.037

Keterangan:

Hijau : C

Merah : O

Biru : N

Putih : H

Jingga : P

61


3. 4-nitrophenyl 4-coumarate


1 -11.2 0.000 0.000

2 -10.6 2.807 4.814

3 -10.4 1.906 3.895

4 -9.9 4.544 7.294

5 -9.8 4.442 6.472

6 -9.8 4.248 6.539

7 -9.6 1.683 2.319

8 -9.6 5.273 6.756

9 -9.3 3.936 6.027

Keterangan:

Hijau : C

Merah : O

Biru : N

Putih : H

Jingga : P

62


4. 2-nitro-4-methylcinnamaldehyde


1 -10.9 0.000 0.000

2 -10.7 3.977 7.462

3 -10.3 2.556 4.097

4 -10.2 2.856 13.029

5 -10.2 3.028 10.875

6 -10.0 3.660 5.647

7 -9.9 2.682 4.782

8 -9.8 4.021 7.166

9 -9.4 3.192 6.016

Keterangan:

Hijau : C

Merah : O

Biru : N

Putih : H

Jingga : P

63


5. Nitrasi 4


1 -10.2 0.000 0.000

2 -10.0 4.148 6.710

3 -9.8 3.826 12.301

4 -9.7 3.506 5.353

5 -9.7 5.429 7.652

6 -9.6 4.772 7.516

7 -9.5 5.648 12.461

8 -9.4 3.600 5.273

9 -9.2 5.640 5.117

Keterangan:

Hijau : C

Merah : O

Biru : N

Putih : H

Jingga : P

64


6. Nitrasi 5


1 -10.5 0.000 0.000

2 -10.4 3.098 12.685

3 -10.4 2.778 13.478

4 -10.2 3.586 12.003

5 -10.1 3.345 12.549

6 -10.1 4.004 11.809

7 -10.0 5.097 11.684

8 -9.9 3.971 12.328

9 -9.9 5.447 12.037

Keterangan:

Hijau : C

Merah : O

Biru : N

Putih : H

Jingga : P

65


7. Isoniazid


1 -10.5 0.000 0.000

2 -10.5 1.569 2.013

3 -10.4 3.695 10.383

4 -10.4 2.428 12.296

5 -10.1 4.101 10.392

6 -9.9 2.439 11.069

7 -9.7 2.501 11.236

8 -9.7 3.293 5.901

9 -9.6 2.428 11.485

Keterangan:

Hijau : C

Merah : O

Biru : N

Putih : H

Jingga : P

66


Lampiran 4. Reseptor Inha yang Diunduh

Documents

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA - repository.uinjkt.ac.idrepository.uinjkt.ac.id/dspace/bitstream/123456789/29198/1/MAZAYA... · SENYAWA NITRASI ETIL P-METOKSISINAMAT TERHADAP AKTIVITAS