Upload
vucong
View
220
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
/
ELUCIDAO ESTRUTURAL E QUANTIFICAO POR RMN H
1 DOS PRINCPIOS ATIVOS DO EXTRATO DAS
FOLHAS DE Zeyheria tuberculosa (VELL) BUREAU (BIGNONIACEAE)
Maria Amlia Lima dos Santos
UFAL INSTITUTO DE QUMICA E BIOTECNOLOGIA
PROGRAMA DE PS-GRADUAO
EM QUMICA E BIOTECNOLOGIA
Universidade Federal de Alagoas
Campus A. C. Simes Tabuleiro dos Martins
57.072-970 Macei-AL
Livros Grtis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grtis para download.
ELUCIDAO ESTRUTURAL E QUANTIFICAO POR RMN H
1 DOS PRINCPIOS ATIVOS DO EXTRATO DAS
FOLHAS DE Zeyheria tuberculosa (VELL) BUREAU (BIGNONIACEAE)
Maria Amlia Lima dos Santos
Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Qumica e Biotecnologia da Universidade Federal de Alagoas, como requisito parcial para a obteno do ttulo de Mestre em Qumica.
Orientador: Prof. Dr. Edson de Souza Bento Co-orientador: Prof. Dr. Antnio Euzbio Goulart SantAna
Macei Alagoas Novembro de 2009
UFAL
Universidade Federal de Alagoas Instituto de Qumica e Biotecnologia
Programa de Ps-Graduao em Qumica e Biotecnologia
PPGQB
IQB
ii
AGRADECIMENTOS
Ao Senhor Jesus Cristo, pelo seu infinito amor e pela sua presena e providncia em todas as minhas alegrias e aflies;
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq) do Ministrio da Cincia e Tecnologia (MCT) do Governo Brasileiro por ter fomentado a nossa pesquisa e por ter fornecido uma bolsa de mestrado;
Aos meus queridos orientadores, Prof. Dr. Antnio Euzbio Goulart SantAna e Prof. Dr. Edson de Souza Bento, exemplos de dedicao cincia e ao trabalho, pela orientao, oportunidade, confiana e incentivo durante o mestrado;
Ao Instituto de Qumica e Biotecnologia da Universidade Federal de Alagoas pelo Programa de Ps-graduo em Qumica e Biotecnologia, responsvel pela minha qualificao profissional;
Coordenao do Programa de Ps-graduao de Qumica e Biotecnologia pelo apoio e dedicao;
Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior (CAPES) do Ministrio da Educao (MEC) pelo cuidado com a excelncia dos Cursos de ps-graduao stricto sensu e pelo acesso aos Peridicos da Capes;
Ao Instituto do Milnio do Semi-rido pelo material vegetal fornecido pelo projeto IMSEAR; Aos Laboratrios de Pesquisa em Recursos Naturais e de Ressonncia Magntica Nuclear do Instituto de Qumica e Biotecnologia da Universidade Federal de Alagoas onde foram desenvolvidos os experimentos e anlises; Ao Laboratrio de Engenharia Tecidual e Imunofarmacologia do Centro de pesquisas Gonalo Moniz da Fundao Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) pela avaliao da atividade farmacolgica; Ao Prof. Dr. Joo Xavier de Arajo Jnior, pelos ensinamentos e pela contribuio prestada durante a parte experimental deste trabalho;
Aos Professores Doutores Lucia Maria Conserva, Lcia Maria Cunha Rebouas, Marcia Pletsch, Marlia Oliveira Fonseca Goulart e Nivaldo Alves Soares pelos excelentes cursos ministrados;
Aos meus queridos Ruy Albuquerque Tenrio e Yuri Cavalcante Albuquerque Tenrio, pelos ensinamentos, pela ajuda na formatao desta dissertao, enfim, por terem contribudo de forma significativa para a concluso deste trabalho.
A minha querida MsC. Natlia Velsquez, pela significativa contribuio a este trabalho, pelo apoio constante e pelos bons momentos juntas.
iii
Aos tcnicos Aldy Santos e Margarida Teodoro que sempre estiveram disponveis e muito contriburam para este trabalho;
Aos colegas de laboratrio MsC. Daniel de Melo, MsC. Edjane Vieira, MsC. Alan John, MsC. Cristiane Omena e MsC. Roberta Costa por terem contribudo de forma significativa para a realizao deste trabalho;
Ao tcnico MsC. Marcos S pela dedicao nas anlises de RMN e a tcnica MsC. Cenira Monteiro pela contribuio para o bom andamento deste trabalho;
Aos alunos de iniciao cientfica (IC) Maria dos Prazeres Menezes, Leandro Duarte e Tain Tenrio pelas contribuies prestadas durante a parte experimental deste trabalho;
Raquel Ferreira (IC), sis Torres (IC) e aos demais colegas dos laboratrios de Ressonncia Magntica Nuclear e de Pesquisa em Recursos Naturais pelas contribuies neste trabalho.
Aos colegas de sala de aula que de alguma forma contriburam para a minha formao durante o Curso de Mestrado e tambm pelos bons momentos juntos;
Aos meus queridos pais, Erivaldo Soares dos Santos e Maria Lcia Lima dos Santos, e aos meus irmos, Camila Maria Lima dos Santos, Erivaldo Soares dos Santos Jnior, pelo amor, apoio e pelas oraes;
Aos servidores da UFAL responsveis pela higienizao dos ambientes de estudo e trabalho.
iv
Dedico este trabalho:
Aos meus amados pais, Erivaldo Soares
dos Santos e Maria Lcia Lima dos Santos, por todo o amor, o cuidado, a entrega e os sacrifcios.
Aos meus amados irmos, Camila Maria
Lima dos Santos e Erivaldo Soares dos Santos Jnior, pelo apoio e companheirismo.
Aos meus amados Ruy Albuquerque
Tenrio e Yuri Cavalcanti Albuquerque Tenrio, pelo amor, os cuidados constantes e as oraes.
v
SUMRIO
LISTA DE FIGURAS ........................................................................................... viii
LISTA DE TABELAS .......................................................................................... xiii
LISTA DE FLUXOGRAMAS ............................................................................... xiv
LISTA DE ABREVIATURAS E SMBOLOS ....................................................... xv
RESUMO.............................................................................................................. 1
ABSTRACT.......................................................................................................... 2
1. INTRODUO................................................................................................. 3
1.1 Objetivo Geral................................................................................................ 6
1.2 Objetivos Especficos..................................................................................... 6
1.3 Justificativa.................................................................................................... 6
2. REFERENCIAL TERICO.............................................................................. 8
2.1 A Espcie Zeyheria tuberculosa (Vell.) Bureau.............................................. 8
2.2 Linfoproliferao............................................................................................ 12
2.3 Consideraes Gerais sobre Ressonncia Magntica Nuclear (RMN)......... 13
3. EXPERIMENTAL............................................................................................ 18
3.1 Local de Realizao do Trabalho................................................................... 18
3.2 Material Botnico............................................................................................ 18
3.3 Material, Equipamento, Mtodo de Extrao e Purificao....................... 19
3.3.1 Solventes..................................................................................................... 19
3.3.2 Anlise Cromatogrfica............................................................................... 19
3.3.3 Reveladores................................................................................................ 19
3.3.4 Mtodo de Extrao.................................................................................... 20
3.3.5 Mtodo de Purificao................................................................................. 20
3.3.6 Espectrmetros........................................................................................... 20
3.3.7 Polarmetro.................................................................................................. 21
3.4 Etapas de Isolamento do Princpio Ativo........................................................ 21
3.4.1. Preparao do Extrato Etanlico Bruto das Folhas de Z. tuberculosa.......................................................................................................
21
3.4.2. Partio Lquido-Lquido do Extrato ZTB das Folhas de Z. tuberculosa.......................................................................................................
21
3.4.3. Filtrao da Frao ZTP2 Proveniente do Extrato ZTB............................. 22
vi
3.4.4. Filtrao da Frao ZTF3 Proveniente da Frao ZTP2............................ 23
3.4.5. Filtrao da Frao ZTF3.3 Proveniente da Frao ZTF3......................... 24
3.4.6. Fracionamento Cromatogrfico I, Cristalizao e Recristalizao das Fraes Reunidas da Filtrao da ZTF3.3...........................................................
25
3.4.7. Fracionamento Cromatogrfico II, Cristalizao e Recristalizao da Subfrao (48 - 78) Proveniente da Coluna I.......................................................
26
3.4.8. Fracionamento Cromatogrfico III, Cristalizao e Recristalizao da Frao ZTF3.2......................................................................................................
28
3.5 Prospeco Fitoqumica................................................................................. 29
3.5.1. Teste para Fenis e Taninos...................................................................... 29
3.5.2. Teste para Antocianinas, Antocianidinas e Flavonides............................ 29
3.5.3. Teste para Leucoantocianidinas, Catequinas e Flavononas...................... 30
3.5.4. Teste para Flavonis, Flavanonas, Flavanonis e Xantonas..................... 31
3.5.5. Teste para Esteroides e Triterpenoides..................................................... 31
3.5.6. Teste para Saponinas................................................................................ 31
3.5.7. Teste para Alcalides................................................................................. 32
3.5.8. Teste para Antraquinonas, Antronas e Cumarinas.................................... 32
3.6 Ensaio Biolgico............................................................................................. 32
3.7 Resultado da Prospeco Fitoqumica do Extrato ZTB das Folhas de Z. tuberculosa......................................................................................
34
3.8 Resultado do Bioensaio................................................................................. 35
3.8.1 Atividade Citotxica do Extrato e Fraes das Folhas de Z. tuberculosa.......................................................................................................
35
3.8.2 Atividade Inibitria da Linfoproliferao in vitro, da Frao Clorofrmica das Folhas de Z. tuberculosa...............................................................................
35
3.9 Identificao Estrutural das Substncias Isoladas da Frao ZTP2.............. 36
3.10 Identificao Estrutural da Substncia Codificada como ZTC9................... 36
3.11 Identificao Estrutural da Substncia Codificada como ZTC10................. 58
3.12 Metodologia das Quantificaes da ZTC9 e ZTC10 no Extrato Semi-Bruto (Frao Clorofrmica da Partio) da Folha de Z. tuberculosa pelo Mtodo de RMN H1................................................................................................................
79
3.13 Resultados das Quantificaes da ZTC9 e ZTC10 no Extrato Semi-Bruto (Frao Clorofrmica da Partio) da Folha de Z. tuberculosa pelo Mtodo de RMN H1..........................................................................................................
82
3.13.1 Resultado da Quantificao da Substncia ZTC9 no Extrato Semi-Bruto (Frao Clorofrmica da Partio) das Folhas de Z. tuberculosa......................................................................................................
85
vii
3.13.2 Resultado da Quantificao da Substncia ZTC10 no Extrato Semi-Bruto (Frao Clorofrmica da Partio) das Folhas de Z. tuberculosa...................................................................................................
94
4. 4. CONSIDERAES FINAIS......................................................................... 104
5. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS........................................................... 105
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura 01. Zeyheria tuberculosa; (a) Folhas e Flores, (b) Frutos, (c) Sementes, (d) Casca, (e) Madeira.............................................................
8
Figura 02. Laboratrio de Pesquisa em Recursos Naturais (a),
Laboratrio de Ressonncia Magntica Nuclear (b)......................................
18
Figura 03. Espectro da Substncia ZTC9 na Regio do Infravermelho [Y=Transmitncia/X=nmero de ondas (cm-1)]...............................................
36
Figura 04. Espectro de RMN H1 de ZTC9 com Expanso, Solvente CDCl3/MeOD 3:1..............................................................................
38
Figura 05. Expanso do Espectro de RMN H1 de ZTC9, Solvente CDCl3/MeOD 3:1............................................................................
38
Figura 06. Espectro de RMN C13 de ZTC9 com Expanso, Solvente CDCl3/MeOD 3:1...........................................................................
39
Figura 07. Expanso do Espectro de RMN C13 de ZTC9, Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................
40
Figura 08. Espectro de RMN DEPT 90 de ZTC9, Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................
40
Figura 09. Expanso do Espectro de RMN DEPT 90 de ZTC9, Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................
41
Figura 10. Espectro de RMN DEPT 135 de ZTC9, Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................
41
Figura 11. Espectro de RMN 2D HSQC de ZTC9, Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................
43
Figura 12. Expanso do Espectro de RMN 2D HSQC de ZTC9, Solvente CDCl3/MeOD 3:1 ............................................................................
43
Figura 13. Espectro de RMN 2D COSY de ZTC9, Solvente CDCl3/MeOD 3:1............................................................................................
45
Figura 14. Expanso (1) do Espectro de RMN 2D COSY de ZTC9, Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................
45
Figura 15. Expanso (2) do Espectro de RMN 2D COSY de ZTC9, Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................
46
Figura 16. Reduo dos Sinais da Expanso (2) do Espectro de RMN 2D COSY de ZTC9, Solvente CDCl3/MeOD 3:1...................................
46
Figura 17. Espectro de RMN 2D HMBC de ZTC9, Solvente CDCl3/MeOD 3:1............................................................................................
47
Figura 18. Expanso do Espectro de RMN 2D HMBC de ZTC9, Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................
48
Figura 19. Espectro de RMN 2D NOESY de ZTC9, Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................
48
ix
Figura 20. Expanso (1) do Espectro de RMN 2D NOESY de ZTC9, Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................
49
Figura 21. Montagem Estrutural da ZTC9..................................................... 50
Figura 22. Correlaes Observadas no Espectro HMBC de ZTC9
(a) 2-4JC,H; (b) 2JC,H; (c)
3JC,H; (d) 4JC,H............................................................................................
51
Figura 23. Correlaes Observadas no Espectro COSY de ZTC9.............. 52
Figura 24. Correlaes Observadas no Espectro NOESY de ZTC9............ 52
Figura 25. Estrutura do (+)-cido Urslico (ZTC9)....................................... 55
Figura 26. Espectro de Massas (m/z) do cido Urslico (ZTC9)................. 57
Figura 27. Fragmentao do cido Urslico do Tipo Retro-Diels-Alder............................................................................................
57
Figura 28. Espectro da Substncia ZTC10 na Regio do Infravermelho [Y=Transmitncia/X=nmero de ondas (cm-1)].............................................
58
Figura 29. Espectro de RMN H1 de ZTC10 com Expanso, Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................
59
Figura 30. Expanso do Espectro de RMN H1 de ZTC10, Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................
60
Figura 31. Espectro de RMN C13 de ZTC10 com Expanso, Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................
61
Figura 32. Expanso do Espectro de RMN C13 de ZTC10, Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................
61
Figura 33. Espectro de RMN DEPT 90 de ZTC10, Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................
62
Figura 34. Espectro de RMN DEPT 135 de ZTC10, Solvente CDCl3/MeOD 3:1............................................................................................
62
Figura 35. Expanso do Espectro de RMN DEPT 135 de ZTC10, Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................
63
Figura 36. Espectro de RMN 2D HSQC de ZTC10, Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................
64
Figura 37. Expanso do Espectro de RMN 2D HSQC de ZTC10, Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................
65
Figura38. Espectro de RMN 2D COSY de ZTC10, Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................
66
Figura 39. Expanso (1) do Espectro de RMN 2D COSY de ZTC10, Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................
67
Figura 40. Expanso (2) do Espectro de RMN 2D COSY de ZTC10, Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................
67
Figura 41. Reduo dos Sinais da Expanso (2) do Espectro de RMN 2D COSY de ZTC10, Solvente CDCl3/MeOD 3:1.................................
68
Figura 42. Espectro de RMN 2D HMBC de ZTC10,
x
Solvente CDCl3/MeOD 3:1............................................................................. 69
Figura 43. Expanso (1) do Espectro de RMN 2D HMBC de ZTC10, Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................
69
Figura 44. Espectro de RMN 2D NOESY de ZTC10, Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................
70
Figura 45. Expanso (1) do Espectro de RMN 2D NOESY de ZTC10, Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................
70
Figura 46. Expanso (2) do Espectro de RMN 2D NOESY de ZTC10, Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................
71
Figura 47. Montagem Estrutural da ZTC10................................................... 72
Figura 48. Correlaes Observadas no Espectro HMBC de ZTC10 (a) 2-4JC,H; (b)
2JC,H; (c) 3JC,H; (d)
4JC,H............................................................. 73
Figura 49. Correlaes Observadas no Espectro COSY de ZTC10............ 74
Figura 50. Correlaes Observadas no Espectro NOESY de ZTC10.......... 74
Figura 51. Estrutura do (+)-cido Oleanlico (ZTC10) ................................ 76
Figura 52. Espectro de Massas (m/z) do cido Oleanlico (ZTC10).......... 78
Figura 53. Fragmentao do cido Oleanlico do Tipo Retro-Diels-Alder............................................................................................
78
Figura 54. Espectro de RMN H1 de ZTC9 (Deslocamentos dos Picos Escolhidos para a Quantificao de ZTC9), Solvente CDCl3/MeOD 3:1.......
82
Figura 55. Espectro de RMN H1 da Frao Clorofrmio (Deslocamentos dos Picos Escolhidos para a Quantificao de ZTC9), Solvente CDCl3/MeOD 3:1............................................................................................
83
Figura 56. Expanso do Espectro de RMN H1 de ZTC9 (A), ZTC10 (B) e Frao Clorofrmica (C), Solvente CDCl3/MeOD 3:1....................................
83
Figura 57. Espectro de RMN H1 de ZTC10 (Deslocamentos dos Picos Escolhidos para a Quantificao de ZTC10), Solvente CDCl3/MeOD 3:1...........................................................................................
84
Figura 58. Espectro de RMN H1 da frao clorofrmio (Deslocamentos dos picos escolhidos para a quantificao de ZTC10), solvente CDCl3/MeOD 3:1...........................................................................................
84
Figura 59. Espectro de RMN H1 de ZTC9, ZTC10 e Extrato Semi-Bruto (Frao Clorofrmica), Solvente CDCl3/MeOD 3:1........................................
85
Figura 60. Quantificao da ZTC9, Espectro de RMN H1 (Amostra 1), Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................
88
Figura 61. Quantificao da ZTC9, Expanso do Espectro de RMN H1 (Amostra 1), Solvente CDCl3/MeOD 3:1........................................................
88
Figura 62. Quantificao da ZTC9, Espectro de RMN H1 (Amostra 2), Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................
89
Figura 63. Quantificao da ZTC9, Expanso do Espectro de RMN H1 (Amostra 2), Solvente CDCl3/MeOD 3:1........................................................
89
xi
Figura 64. Quantificao da ZTC9, Espectro de RMN H1 (Amostra 3), Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................
90
Figura 65. Quantificao da ZTC9, Expanso do Espectro de RMN H1 (Amostra 3), Solvente CDCl3/MeOD 3:1........................................................
90
Figura 66. Quantificao da ZTC9, Espectro de RMN H1 (Amostra 4), Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................
91
Figura 67. Quantificao da ZTC9, Expanso do Espectro de RMN H1 (Amostra 4), Solvente CDCl3/MeOD 3:1........................................................
91
Figura 68. Quantificao da ZTC9, Espectro de RMN H1 (Amostra 5), Solvente CDCl3/MeOD 1:1.............................................................................
92
Figura 69. Quantificao da ZTC9, Expanso do Espectro de RMN H1 (Amostra 5), Solvente CDCl3/MeOD 1:1........................................................
92
Figura 70. Quantificao da ZTC9, Espectro de RMN H1 (Amostra 6), Solvente CDCl3/MeOD 1:1.............................................................................
93
Figura 71. Quantificao da ZTC9, Expanso do Espectro de RMN H1 (Amostra 6), Solvente CDCl3/MeOD 1:1........................................................
93
Figura 72. Quantificao da ZTC9, Espectro de RMN H1 (Amostra 1-6), solvente CDCl3/MeOD 1:1.............................................................................
94
Figura 73. Quantificao da ZTC10, Espectro de RMN H1 (Amostra 1), Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................
97
Figura 74. Quantificao da ZTC10, Expanso do Espectro de RMN H1 (Amostra 1), Solvente CDCl3/MeOD 3:1........................................................
97
Figura 75. Quantificao da ZTC10, Espectro de RMN H1 (Amostra 2), Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................
98
Figura 76. Quantificao da ZTC10, Expanso do Espectro de RMN H1 (Amostra 2), Solvente CDCl3/MeOD 3:1........................................................
98
Figura 77. Quantificao da ZTC10, Espectro de RMN H1 (Amostra 3), Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................
99
Figura 78. Quantificao da ZTC10, Expanso do Espectro de RMN H1 (Amostra 3), Solvente CDCl3/MeOD 3:1........................................................
99
Figura 79. Quantificao da ZTC10, Espectro de RMN H1 (Amostra 4), Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................
100
Figura 80. Quantificao da ZTC10, Expanso do Espectro de RMN H1 (Amostra 4), Solvente CDCl3/MeOD 3:1........................................................
100
Figura 81. Quantificao da ZTC10, Espectro de RMN H1 (Amostra 5), Solvente CDCl3/MeOD 3:1.............................................................................
101
Figura 82. Quantificao da ZTC10, Expanso do Espectro de RMN H1 (Amostra 5), Solvente CDCl3/MeOD 3:1.....................................
101
Figura 83. Quantificao da ZTC10, Espectro de RMN H1 (Amostra 6), Solvente CDCl3/MeOD 3:1........................................................
102
Figura 84. Quantificao da ZTC10, Expanso do Espectro
xii
de RMN H1 (Amostra 6), Solvente CDCl3/MeOD 3:1..................................... 102
Figura 85. Quantificao da ZTC10, Espectro de RMN H1 (Amostra 1-6), Solvente CDCl3/MeOD 3:1.....................................................
103
xiii
LISTA DE TABELAS
Tabela 01. Filtrao da Frao ZTP2 Proveniente do Extrato ZTB .................. 23
Tabela 02. Filtrao da Frao ZTF3 Proveniente da ZTP2............................. 24
Tabela 03. Filtrao da Frao ZTF3.3 Proveniente da Frao ZTF3.............. 24
Tabela 04. Fracionamento Cromatogrfico das Fraes Reunidas da
Filtrao da Frao ZTF3.3................................................................................ 26
Tabela 05. Fracionamento Cromatogrfico da Subfrao (48 - 78) ................. 27
Tabela 06. Fracionamento Cromatogrfico da Frao ZTF3.2........................ 28
Tabela 07. Variao de Colorao Observada nos Tubos (I)........................... 30
Tabela 08. Variao de Colorao Observada nos Tubos (II).......................... 30
Tabela 09. Resultado da Prospeco Fitoquimica do Extrato ZTB da Folha de Z. tuberculosa................................................................................................
34
Tabela 10. Apresentao dos Resultados Obtidos Neste Trabalho Acerca da Atividade Inibitria da Linfoproliferao da Frao Ativa ZTP2 da Partio da Folha de Z. tuberculosa................................................................................
35
Tabela 11. Dados de RMN H1, C13 (DEPT 90 e 135), HSQC, HMBC, COSY e NOESY, para a Amostra ZTC9. Valores de Deslocamento Qumico em ppm, Solvente CDCl3/MeOD.............................................................................
56
Tabela 12. Dados de RMN H1, C13 (DEPT 90 e 135), HSQC, HMBC, COSY e NOESY, para a Amostra ZTC10. Valores de Deslocamento Qumico em ppm, Solvente CDCl3/MeOD 3:1........................................................................
77
Tabela 13. Quantificao da ZTC9.................................................................... 86
Tabela 14. Quantificao da ZTC10................................................................. 95
xiv
LISTA DE FLUXOGRAMAS
Fluxograma 1. Partio Lquido-Lquido do Extrato ZTB das Folhas de Z. tuberculosa....................................................................................................
22
Fluxograma 2. Esquema Geral das Etapas Experimentais................................... 33 Fluxograma 3. Metodologia das Quantificaes da ZTC9 e ZTC10 no Extrato Semi-Bruto (Frao Clorofrmica da Partio) da Folha de Z. tuberculosa pelo Mtodo de RMN H1.................................................................................................
81
xv
LISTA DE ABREVIATURAS E SMBOLOS
Deslocamento Qumico
AcOEt Acetato de Etila CC Cromatografia em Coluna CCDA Cromatografia em Camada Delgada Analtica COSY Correlation Spectroscopy d Dupleto dd Duplo Dupleto DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer EtOH Etanol HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation HSQC Heteronuclear Single Quantun Coherence Hz Hertz IV Infravermelho IMSEAR Instituto do Milnio do Semi-rido J Constante de Acoplamento MeOH Metanol MeOD Metanol Deuterado m Multipleto MHz Megahertz mL Mililitros nm Nanmetro NOE Nuclear Overhauser Effect OC Onda Contnua OMS Organizao Mundial de Sade RMN C13 Ressonncia Magntica Nuclear de Carbono Treze RMN H1 Ressonncia Magntica Nuclear de Hidrognio s Simpleto t Tripleto TF Transformada de Fourier L Microlitros
1
RESUMO
Desde os tempos antigos, os produtos naturais so utilizados como fonte de
medicamentos, para prevenir e tratar doenas. Embora os extratos vegetais
continuem a ser utilizados como remdios, estes esto sendo substitudos pelos
compostos ativos isolados dos extratos brutos e seus derivados sintticos. Este
trabalho teve como objetivo o isolamento e a identificao estrutural dos princpios
ativos do extrato das folhas de Zeyheria tuberculosa (Vell) Bureau e suas
quantificaes por RMN H1. O extrato etanlico de Z. tuberculosa foi ativo no ensaio
de inibio da linfoproliferao. O extrato etanlico desta planta foi submetido
anlise cromatogrfica e o isolamento guiado pelo ensaio da linfoproliferao indicou
que a frao em clorofrmio era a mais ativa. A partir desta frao clorofrmica, dois
principais compostos foram isolados, ZTC9 e ZTC10. Estes compostos foram
analisados por RMN visando elucidao estrutural e quantificao. A elucidao
estrutural detalhada destes dois compostos foi feita com base na anlise espectral
de RMN, incluindo experimentos 1D (H1, C13, DEPT 90, DEPT 135) e 2D (COSY,
HSQC, HMBC e NOESY). Para o estudo da quantificao, uma srie de cinco
solues foi preparada para cada composto, variando a concentrao de ZTC9 e
ZTC10. Cada uma das solues foi submetida a um experimento de RMN H1. A
partir dos espectros de RMN H1 obtidos, alguns sinais selecionados foram
integrados e suas intensidades foram utilizadas para quantificar os compostos
presentes no extrato ( 5,39 e 2,33 para ZTC9; 5,38 e 2,96 para ZTC10). Os
dados de RMN H1 foram processados e analisados utilizando os softwares TOPSPIN
(Bruker) e SpinWorks. A anlise dos espectros de RMN 1D e 2D identificou as
estruturas qumicas de ZTC9 e ZTC10, como sendo, respectivamente, cido
Urslico e cido Oleanlico. Os estudos da quantificao de cido Urslico e cido
Oleanlico indicaram, respectivamente, os valores de 43% e 45,9%, em massa, e
concentraes de 4,71 x 10-3 mol.L-1 e 5,04 x 10 -3 mol.L-1.
Palavras-chave: RMN, cido Urslico, cido Oleanlico, Quantificao.
2
ABSTRACT
Since ancient times, vegetables are used as source of medicine, to prevent and treat
disease. Although plants extracts continue to be used as medicine, it has been
replaced by the actives compounds isolated from crude extracts and its synthetic
derivatives. This study aimed at the isolation and the structural identification of the
actives principles extract of the leaves of Zeyheria tuberculosis (Vell) Bureau and its
quantification by H1 NMR. The ethanolic extract of Z. tuberculosa was active in the
tests tripanossida of inhibition of NO generation and lymphoproliferation. The
ethanol extract of this plant was submitted to chromatographic analysis and the
isolation process, guided by lymphoproliferation test, indicated that the fraction in
chloroform was the most active. From this chloroform fraction, two major compounds
were isolated, ZTC9 and ZTC10. These compounds were analyzed by NMR aiming
its structural elucidation and quantification. The detailed structural elucidation of
these two compounds was done on the basis of NMR spectral analysis, including 1D
experiments (H1, C13, DEPT 90 and DEPT135) and 2D (COSY, HSQC, HMBC and
NOESY). For the quantification studies, a series of five solutions were prepared for
each compound by varying the concentration of ZTC9 and ZTC10. Each one of these
solutions was submitted to a H1 NMR experiment. From the NMR H1 spectra
obtained, some selected signals were integrated and its intensities used to quantify
the compounds present in the extract ( 5,38 and 2,33 for ZTC9; 5,38 and 2,96
for ZTC10). The NMR H1 data had been processed and analyzed using the
TOPSPIN (Bruker) and SpinWorks softwares. The analysis of the spectra of 1D and
2D NMR identified the chemical structures of ZTC9 and ZTC10, as, respectively,
Ursolic Acid and Oleanolic Acid. The quantification studies of Ursolic Acid and
Oleanolic Acid showed, respectively, the values of 43% and 45,9%, in mass, and
concentration of 4,71 x10-3 mol.L-1 and 5,04 x 10-3 mol.L-1.
Key-words: NMR, Ursolic Acid, Oleanolic Acid, Quantification.
3
1. INTRODUO
Desde os tempos primitivos os vegetais so necessrios existncia da
sociedade como fonte de alimentos, de materiais para o vesturio, construo de
casas, defesa e ataque, na produo de meios de transporte, como instrumento de
trabalhos artsticos, culturais e religiosos, no controle de pragas e ainda com fins
medicinais, para preveno, tratamento e cura de doenas (PINTO et al., 2002;
SIMES et al., 2003).
Dentro desse campo vasto de utilizao dos vegetais ser enfocado neste
trabalho apenas o seu potencial medicinal. Porm nem todos os vegetais possuem
propriedades medicinais. A Organizao Mundial de Sade (OMS) define planta
medicinal como todo e qualquer vegetal que possui, em um ou mais rgos,
substncias que podem ser utilizadas para fins teraputicos (TRRES et al., 2005;
VEIGA JNIOR et al., 2005).
As substncias que podem ser usadas na teraputica so conhecidas como
metablitos secundrios, no sendo comuns maioria das plantas, mas so
caractersticos de grupos taxonmicos como famlia e gnero, possuindo funes
especficas que podem ser de defesa, atrao, entre outras, e so classificados de
acordo com a sua rota biossinttica (HARBORNE, 1999; MACEDO JNIOR, 2007).
Dentre os metablitos secundrios existe a famlia dos terpenides conhecidos pelas suas funes fisiolgicas e biolgicas, sendo usados como anti-
inflamatrios, analgsicos, anti-tumorais e aes no sistema cardiovascular, tendo
os triterpenos como um grupo importante (NIERO e MALHEIROS, 2007; PINTO et
al., 2008).
Os triterpenos (C30) originam-se da ciclizao do esqualeno, a exemplo do
cido Oleanlico e seu ismero, o cido Urslico. Estes compostos triterpnicos
encontrados nas plantas apresentam efeitos hipoglicmico, antioxidante e anti-
hipertensivo. Este ltimo foi atribudo a um potente efeito diurtico e natriurtico
desses compostos (SOMOVA et al., 2003).
At a dcada de 1950, houve pouco progresso na caracterizao dos
princpios ativos e elucidao desses compostos secundrios presentes nas
espcies vegetais, por isso as plantas medicinais in natura e seus extratos
constituam a maioria dos remdios, que naquela poca eram de uso quase
4
exclusivo na teraputica medicamentosa, os quais paulatinamente vm sendo
substitudos por medicamentos contendo as substncias ativas deles extrados ou
seus derivados sintticos (SOUZA et al., 2007; SIMES et al., 2003).
A falta de progresso deveu-se s inmeras limitaes existentes como os
mtodos qumicos de anlise que consistiam no uso de reaes para degradar,
derivatizar e identificar grupos funcionais, e a necessidade de grandes quantidades
da substncia a ser analisada, que na maioria das espcies so isoladas na ordem
de miligramas (SOUZA et al., 2007).
Foi a partir do advento dos mtodos fsicos de purificao e de anlise, como
a cromatografia gasosa (GC), a cromatografia lquida de alta performance (HPLC), a
espectroscopia na regio do Visvel, Ultravioleta e Infravermelho, alm da
Ressonncia Magntica e Espectrometria de Massas, que a rea dos produtos
naturais pde se desenvolver (SOUZA et al., 2007).
O desenvolvimento da qumica analtica, designadamente, atravs dos
modernos mtodos cromatogrficos, espectromtricos, e radioimunolgicos,
apoiados em aparelhos cada vez mais sofisticados, possibilitou um melhor
conhecimento da composio qumica dos frmacos vegetais e da estrutura dos
seus componentes ativos (PEREIRA et al., 2005).
Tambm foram desenvolvidos bioensaios simplificados, que podem ser
utilizados em bancadas de laboratrios de qumica e so teis para direcionar a
seleo de extratos, fraes e substncias a serem isoladas (HAMBURGER e
HOSTETTMANN, 1991; MCLAVGHLIN et al., 1993).
Todas essas novas possibilidades analticas permitem rapidez no isolamento
e identificao de substncias ativas inditas e na aquisio de informaes sobre
constituintes em amostras complexas como os extratos vegetais, alm do
reconhecimento de molculas j conhecidas, que de outro modo requereriam
investimentos em tempo e recursos materiais para os processos de isolamento e
identificao.
Frente a todo esse progresso, a substituio progressiva das plantas
medicinais e dos seus extratos pelos compostos reconhecidos como responsveis
pela sua ao farmacolgica, no representou apenas o surgimento de um grupo
novo de substncias, mas originou a identificao de uma nova possibilidade de
interveno teraputica (TRRES et al., 2005; SIMES et al., 2003).
5
O principal motivo para essa substituio o difcil controle de qualidade
qumica, fsica, farmacolgica ou toxicolgica dos extratos vegetais. Contudo, apesar
destas mudanas, a diversidade gentica vegetal bastante expressiva e poucas
espcies (15 a 17%) tm sido cientificamente estudadas para a avaliao de suas
qualidades, eficcia clnica e segurana (TEIXEIRA et al., 2003; CALIXTO, 2007;
SOARES et al.,2006).
No Brasil, a Resoluo RDC 17, prope o estudo das espcies para
comercializao, mas independente disso, as feiras livres e ervanrios, algumas
pequenas indstrias e farmcias continuam comercializando tais espcies
desconhecidas cientificamente (TOLEDO et al., 2003).
Apesar dos riscos, a crescente comercializao prova clara de que a
maioria da populao de baixa e mdia renda continua recorrendo s plantas
medicinais como nico alvio para seus males (IMS, 1992; SIMES et al., 2003;
GUIMARES et al., 2007). No incio da dcada de 1990, a Organizao Mundial de
Sade (OMS) divulgou que 65 80% da populao dos pases em desenvolvimento
dependiam das plantas medicinais como nica forma de acesso aos cuidados
bsicos de sade (VEIGA JNIOR et al., 2005; BAGATINI et al., 2007).
No Brasil, at 1996, a estimativa do consumo de medicamentos sintticos era
em torno de 63%, adquiridos por apenas 20% da populao. O restante utilizava os
produtos de origem natural, principalmente as plantas medicinais e seus extratos,
como a principal ou a nica opo teraputica. Atualmente, 82% da populao
brasileira aproximadamente, utiliza produtos base de ervas (AQUINO, 2007).
A recorrncia devido ao fato de que, mesmo com a grande evoluo da
medicina convencional a partir da segunda metade do sculo XX, ainda existem
dificuldades bsicas na sua utilizao pelas populaes carentes, que vo desde o
acesso aos centros de atendimentos hospitalares obteno de exames e
medicamentos (VEIGA JNIOR et al., 2005).
Alm disso, a facilidade na aquisio de plantas, o baixo custo, a eficincia na
preveno e no tratamento de doenas, e a tradio do uso de plantas medicinais,
contribuem para a grande utilizao desses produtos naturais pelas populaes dos
pases em desenvolvimento (SIMES et al., 2003).
Observa-se assim, a importncia e a necessidade de se chegar no apenas
ao fitoterpico (simples preparao tradicional a partir de partes de uma espcie
6
medicinal que tenha avaliada sua eficcia, inocuidade e qualidade), mas tambm ao
farmacoterpico (composto quimicamente definido e com atividade farmacolgica
determinada). Tudo isso de acordo com as exigncias da legislao em vigor e
considerando os aspectos de preservao das reservas naturais dentro da
perspectiva do desenvolvimento sustentvel (DI STASI, 1996; TOLEDO et al., 2003).
Neste contexto social em que as plantas medicinais adquirem importncia
como agentes teraputicos, faz-se necessrio no s a busca de provas cientficas
quanto segurana e eficcia teraputica destas plantas, mas tambm o apoio
governamental com o objetivo de aproximar grupos de pesquisadores
interdisciplinares, multifuncionais e interinstitucionais, privilegiando aquelas
pesquisas que compreendem toda a cadeia de produo de determinada espcie de
interesse at a determinao de doses e ensaios clnicos, contribuindo desta forma,
para o desenvolvimento de novos fitoterpicos e farmacoterpicos (BRESOLIN e
CECHINEL FILHO, 2003; TOLEDO et al., 2003).
1.1 Objetivo Geral
Contribuir para o estudo fitoqumico, guiado pelo bioensaio de inibio da
linfoproliferao in vitro, da espcie Zeyheria tuberculosa (Vell) Bureau.
1.2 Objetivos Especficos
Determinao e quantificao por RMN H1 dos princpios ativos do extrato
das folhas de Zeyheria tuberculosa (Vell) Bureau.
1.3 Justificativa
O nosso grupo faz parte do projeto do Milnio do Semi-rido para o estudo da
biodiversidade do Semi-rido nordestino, cabendo ao grupo realizar o estudo
fitoqumico (determinao do princpio ativo) de cinco espcies de plantas escolhidas
pelo IMSEAR (INSTITUTO DO MILNIO DO SEMI-RIDO), com base em um
trabalho de seleo de plantas ativas quanto atividade tripanocida,
linfoproliferao, inibio de NO e atividade antibitica. Entre estas cinco espcies
7
encontra-se a Zeyheria tuberculosa, cuja frao clorofrmica da partio do extrato
bruto das folhas, feita pelo IMSEAR, apresentou-se ativa quanto inibio da
linfoproliferao e por isso a planta nos foi enviada para o isolamento do(s)
princpio(s) ativo(s) responsvel(is) por esta atividade.
8
2. REFERENCIAL TERICO
2.1 A espcie Zeyheria tuberculosa (Vell.) Bureau
A espcie Zeyheria tuberculosa (Vell.) Bureau (Figura 01), de acordo com a
linha filogentica de Arthur Cronquist (BASTOS, 2008) apresenta a seguinte
classificao sistemtica:
Domnio: Eukaryota
Reino: Plantae
Sub reino: Viridaeplantae
Filo: Tracheophyta
Sub filo: Euphyllophytina
Infra filo: Radiatopses
Classe : Magnoliopsida
Sub classe : Lamiidae
Super ordem: Lamianae
Ordem: Scrophulariales
Famlia: Bignoniaceae
Gnero: Zeyheria
Espcie: Zeyheria tuberculosa (Vell.) Bureau
Figura 01. Zeyheria tuberculosa; (a) Folhas e Flores, (b) Frutos, (c) Sementes (d) Casca (e) Madeira.
Fonte: http://www.achetudoeregiao.com.br/Arvores/Zeyheria_tuberculosa.htm, acessado em novembro de 2007.
a
b c d e
http://zipcodezoo.com/Key/Plantae/Eukaryota_Domain.asphttp://zipcodezoo.com/Key/Plantae/Plantae_Kingdom.asphttp://zipcodezoo.com/Key/Plantae/Viridaeplantae_Subkingdom.asphttp://zipcodezoo.com/Key/Plantae/Tracheophyta_Phylum.asphttp://zipcodezoo.com/Key/Plantae/Euphyllophytina_Subphylum.asphttp://zipcodezoo.com/Key/Plantae/Radiatopses_Infraphylum.asphttp://zipcodezoo.com/Key/Plantae/Magnoliopsida_Class.asphttp://zipcodezoo.com/Key/Plantae/Lamiidae_Subclass.asphttp://zipcodezoo.com/Key/Plantae/Lamianae_Superorder.asphttp://zipcodezoo.com/Key/Plantae/Scrophulariales_Order.asphttp://zipcodezoo.com/Key/Plantae/Bignoniaceae_Family.asphttp://zipcodezoo.com/Key/Plantae/Zeyheria_Genus.asphttp://www.achetudoeregiao.com.br/Arvores/Zeyheria_tuberculosa.htm
9
A famlia Bignoniaceae, representada por mais de 100 gneros e 800
espcies com distribuio pantropical, sendo o maior nmero de espcies desta
famlia encontradas no Neotrpico (MACHADO et al., 2006).
O gnero Zeyheria composto pelas espcies Z. barbata Miq., Z. digitada
Miq., Z. fluviatilis Miq., Z. hamburiana Corr. Mello, Z. kuntzei K. Shum., Z.
surinanmensis Miq., Z. velloziana Miers, Z. montana Mart., Z. digitalis (Vell.) Hoehne
e Z. tuberculosa (Vell) Bureau (BASTOS, 2008).
A espcie Z. tuberculosa recebe vrios nomes populares como ip-tabaco,
ip-felpudo, bucho-de-carneiro, bucho-de-boi, ip branco, bucho de bode e ocorre no
Brasil em rea de mata atlntica a florestas decduas de So Paulo a Pernambuco,
em altitudes de 50-1000 m (ZIDKO, 2002; LUCCHESE, 2006).
A rvore de mdio a grande porte, atinge mais de 30 m de altura. Possui
folhas em tufos terminais, opostas cruzadas, pentadigitadas, grandes (40-60 cm de
comprimento x 25-40 cm de largura), com pecolo longo (15-30 cm), grosso, rolio e
felpudo. A folha inteira, assim como o resto da planta, recoberta por um tomento
espesso, semelhante a um veludo, pulverulento, sendo desta caracterstica a origem
do nome felpudo (FERREIRA e LUZ, 1985).
A inflorescncia surge aps a brotao das folhas, em pancula terminal com
20-30 cm, densa, ereta, piramidal, felpuda, com dezenas de pequenas flores (menos
de 2 cm) pouco vistosas. O fruto possui cpsula do tipo sliqua, lenhosa, grande
(desde 13x10 cm at 20x15 cm), achatada, oval a oblonga e externamente
muricada, isto , revestida de densas expanses semelhantes a um plo grosso,
com 1-2 cm de espessura, pulverulentas, sendo esta a razo do nome da espcie, Z.
tuberculosa, termo alusivo a pequenas salincias; pelo mesmo motivo, vulgarmente
tambm conhecida por bucho-de-boi (FERREIRA e LUZ, 1985).
As sementes so aladas, achatadas; ncleo cordiforme, branco-amarelado,
felpudo, com 2 cm ou menos de dimetro e no possuem dormncia, germinando
facilmente entre 1 e 2 semanas quando colocadas sob uma fina camada de solo ou
palha umidoso (FERREIRA e LUZ, 1985).
Espcies pertencentes famlia Bignoniaceae (Jacaranda micranta Cham.,
Tabebuia caraiba Bur., Tecoma sambucifolia Kunth e T. stans L.) foram bastante
utilizadas como anestsico, antiinflamatrio, anticoncepcional, antisifiltico e
antireumtico por culturas indgenas da Amrica do Sul (BASTOS, 2008).
10
Quanto s espcies do gnero Zeyheria, as razes da Z. montana so
bastante usadas na medicina popular contra as doenas de pele. H indicao de
que o extrato aquoso da Z. tuberculosa seja utilizado no tratamento do cncer, e
estudos biolgicos realizados com o caule desta espcie revelou atividade
antimicrobiana (BASTOS, 2008; SILVEIRA et al., 1975; WEINBERG et al., 1976). A
frao clorofrmica desta espcie apresentou-se ativa quanto inibio da
linfoproliferao, em testes feitos pelo IMSEAR.
A literatura descreve o estudo fitoqumico de trs espcies do gnero
Zeyheria: a Z. Montana M., onde da madeira (extratos benznico e etanlico) foi
isolada uma naftoquinona, o Lapachol (1), e das razes os quinides -Lapachona
(2), o Desidro--Lapachona (3) e o 4-hidroxi--Lapachona (4) (JCOME et al., 1999;
MAGANHA et al., 2006); a Z. digitalis (Vell.), de onde foi isolado a D-glicose (5), o
cido Vertrico (6), a Vanilina (7), o Lapachol (1), a lignana Zeyherol (8) e o
-Sitosterol (9) (SILVEIRA et al., 1975; FACCIONE et al., 2004); e a Z. tuberculosa
(Vell) Bureau, onde do extrato da folha foram isolados a lignana Zeiherol (8), os
flavonides 5,6,7-Trimetoxiflavona (10), 5,6,7,8-Tetrametoxiflavona (11), 4-Hidroxi-
5,6,7,8-Tetrametoxiflavona (12) e 3,5,7,8-Tetrametoxiflavona (13), o Lapachol (1), -
Lapachona (2), o Desidro--Lapachona (3) o 4-Hidroxi--Lapachona (4) e o -
Sitosterol (9) (BASTOS, 2008; GRAHAM et al., 2000; KUTNEY e HANSSEN, 1971;
WEINBERG et al.; 1976).
O
O
O
O OH
(1) (2)
O
O
O
O
O OH
(3) (4)
11
O
OH
HO
OH
HO
HO
O
O
OHO
O
OH
O
(5) (6) (7)
OH
O O
OH
OH O
H
HO
(8) (9)
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
(10) (11)
O
O
O
O
O
OH
O
O
OO
O
O
O
(12) (13)
12
2.2 Linfoproliferao
A Linfoproliferao est relacionada imunomodulao, que um mecanismo
fisiolgico de regulao da resposta imunolgica, que estimula ou suprime esta
resposta. Portanto, a imunomodulao divide-se em imunoestimulao e
imunossupresso (RUBEL, 2006).
A imunoestimulao implica diretamente na estimulao do sistema imune e
potencializao da resposta de defesa. Ao contrrio, a imunossupresso implica
principalmente no decrscimo da atividade do sistema imune, ocorrendo devido a
vrios fatores genticos, ambientais e teraputicos, favorecendo o estabelecimento
de infeces, mas sendo, porm, de suma importncia no sucesso dos transplantes
(PATWARDHAN et al., 1990; MAKARE et al., 2001).
A imunossupresso pode ser no-especfica, como na administrao de
agentes imunossupressores (medicamentos, radiao) ou pela diminuio de
linfcitos, ou pode ser especfica como na dessensibilizao ou administrao
simultnea de antgenos e drogas imunossupressivas, sendo uma das principais
causas da imunossupresso a administrao de frmacos para impedir a rejeio de
um rgo transplantado ou o transplante de medula ssea (SILVA e FIGUEIREDO,
1998).
Nas ltimas dcadas, o aumento do nmero de rgos transplantados levou a
um incremento e aperfeioamento da teraputica imunossupressora, objetivando a
preservao do rgo transplantado com um mnimo de efeitos colaterais para o
doente. Mais de 40 doenas decorrentes de respostas imunolgicas so passveis
de tratamento com agentes inibidores da resposta imune (STITES et al., 2000).
As respostas imunes e inflamatrias podem ser modificadas por certas
classes de frmacos: Os corticosterides, com ao moduladora da ativao de
macrfagos (essa ativao leva produo de NO entre outros mediadores
imunolgicos) e linfcitos, que suprimem as respostas imunes e reduzem a
inflamao; e os imunossupressores no corticosterides que impedem a rejeio de
rgos transplantados e podem ser utilizados no tratamento da doena auto-imune
(RUDNICK, 2003).
Considerando as necessidades de controle e equilbrio entre as duas
atividades (a imunoestimulao e a imunossupresso) para o funcionamento
http://www.lookfordiagnosis.com/mesh_info.php?term=imunossupressores&lang=3http://www.lookfordiagnosis.com/mesh_info.php?term=radia%C3%A7%C3%A3o&lang=3http://www.lookfordiagnosis.com/mesh_info.php?term=linf%C3%B3citos&lang=3http://www.lookfordiagnosis.com/mesh_info.php?term=ant%C3%ADgenos&lang=3
13
imunolgico normal, a busca por novos medicamentos com baixa toxicidade e mais
eficazes no tratamento das imunopatologias, e o fato da grande diversidade vegetal
do nosso planeta poder ser uma importante fonte de substncias com atividade
imunomoduladora, desde a dcada de 80 a identificao e caracterizao de
compostos naturais com atividade imunomodulatria tem se apresentado como rea
de interesse cientfico (COSTA et al., 2008; PHILLIPSON, 2003).
A linfoblastognese, ou ensaio de proliferao de linfcitos, um dos modelos
in vitro empregados para avaliar o efeito desses compostos naturais sobre a
proliferao celular (DEVI et al., 2003).
2.3 Consideraes Gerais sobre Ressonncia Magntica Nuclear (RMN)
A espectroscopia de RMN foi desenvolvida no final da dcada de 1940
objetivando-se o estudo das propriedades de ncleos atmicos. Em 1951, os
qumicos perceberam que a espectroscopia de RMN tambm poderia ser usada para
determinar as estruturas de substncias orgnicas (SILVERSTEIN, 1998).
Segundo esse estudo, os ncleos de alguns elementos, como 1H e 13C,
comportam-se como se fossem ms girando em torno de um eixo. Desta forma, se
um composto contendo H1 ou C13 for colocado em um campo magntico muito forte
e irradiado simultaneamente com energia eletromagntica, os seus ncleos podem
absorver energia atravs de um processo chamado de ressonncia magntica.
Nesse contexto, ressonncia refere-se transio do spin nuclear entre os nveis
de energia e em resposta radiao de radiofreqncia (KOSKELA, 2005;
SILVERSTEIN, 1998).
Essa absoro de energia quantizada e produz um espectro caracterstico
para o composto, sendo a absoro medida em espectrmetros de RMN. Para isso
dois tipos de espectrmetros podem ser utilizados: os de Onda Contnua (OC) e os
de Transformada de Fourier (TF) (BENTO, 1997; GIL e GERALDES, 1987).
Mtodo de Onda Contnua (CO):
No espectrmetro de onda contnua utiliza-se um m que gera um campo
magntico e um oscilador de freqncia de rdio. A condio de ressonncia pode
14
ser obtida de duas maneiras: irradiando a amostra com energia eletromagntica de
freqncia varivel, enquanto que o campo magntico mantido constante, ou ainda
irradi-la com freqncia constante, enquanto a fora do campo magntico variada
(KOSKELA, 2005).
Estas duas abordagens so chamadas de freqncia varrida e campo varrido,
respectivamente, e nas duas tcnicas, a amostra est em continua irradiao da
radiofreqncia transmitida. Cada ncleo excitado individualmente, levando-se
vrios minutos para ser fornecido o espectro, originado diretamente como uma
funo da freqncia (BENTO, 1997; WILLIAMS e FLEMING, 1987).
Mtodo de Transformada de Fourier (TF)
Ao contrrio do mtodo OC, no qual cada ncleo irradiado com freqncias
consecutivas, a amostra irradiada por um pulso curto e poderoso de rdio
freqncia, que excita todos os ncleos simultaneamente. Quando os ncleos
relaxam, produzem um sinal complexo chamado decaimento livre da induo (FID)
(GIL e GERALDES, 1987; SILVA, 2002).
Um computador converte as informaes que so fornecidas como uma funo
do tempo (FID) para um formato em funo da freqncia, atravs de uma operao
matemtica chamada Transformada de Fourier, produzindo um espectro em poucos
segundos. Neste espectro podem ser explorados, entre outras caractersticas, o
deslocamento qumico (posio do sinal), os acoplamentos (interaes) mostrados
pelos sinais desdobrados e a rea do pico (integrao) (HOLLER et al., 2002).
Deslocamento Qumico () em ppm
Em uma determinada molcula alguns ncleos esto em regies de maior
densidade eletrnica do que os outros e, como resultado, os ncleos absorvem
energia em foras de campos magnticos ligeiramente diferentes.
Conseqentemente, os sinais para esses prtons ocorrem em posies diferentes
no espectro de RMN. A posio na qual um sinal aparece no espectro de RMN
chamada deslocamento qumico, e esse deslocamento depende do ambiente
15
magntico de cada ncleo, do efeito anisotrpico, do efeito do solvente e das
ligaes de hidrognio (GIL e GERALDES, 1987; SILVERSTEIN, 1998).
Os deslocamentos qumicos so medidos em uma escala de (). Diz-se que os
sinais esquerda do espectro aparecem em campo baixo (alta frequncia) e aqueles
direita aparecem em campo alto (baixa frequncia). Uma caracterstica observada
a relao entre o nmero de sinais no espectro e o nmero de diferentes tipos de
ncleos de hidrognio no composto (PARELLA,1998; WILLIAMS e FLEMING, 1987).
Acoplamento (J) em Hz
A multiplicidade de um sinal em um espectro de RMN aparece como uma
conseqncia das interaes magnticas entre ncleos com spin (I 0) transmitido
atravs das ligaes da molcula e isto conhecido como acoplamento escalar
(spin-spin). O sinal de RMN de um ncleo acoplado para n ncleos equivalentes
com spin I ser dividido em um multipleto com (2nI+1) linhas (KOSKELA, 2005).
distncia, em hertz (Hz), entre duas linhas, ou seja, entre dois picos adjacentes
de um sinal de RMN desdobrado, chamado de constante de acoplamento (J). No
caso do acoplamento a trs ligaes em fragmentos H-C-C-H, o J ir depender do
ngulo diedro, no qual a relao de Karplus correlaciona o valor da constante de
acoplamento com o ngulo diedro (SILVA, 2002; MACKIN, 1996).
Integrao
No clculo das reas de cada sinal, o mais importante no a sua altura, mas a
rea abaixo deste sinal. Esta rea proporcional ao nmero de hidrognios que
deram origem ao sinal. O programa que gera o espectro mede essas reas
automaticamente e constri curvas de integrao sob cada sinal (SHOOLERY, 1972;
SILVERSTEIN, 1998).
Relaxao Nuclear
Existem dois tipos principais de processos de relaxao em RMN: a relaxao
spin-rede (ou longitudinal) e a relaxao spin-spin (ou transversal). A relaxao
16
longitudinal um decaimento exponencial de primeira ordem, caracterizado por um
tempo de relaxao T1 (tempo de vida mdio dos ncleos no estado de maior
energia). A relaxao transversal tambm um processo de primeira ordem, que
pode ser caracterizada por um tempo de relaxao T2, sendo a causa do
alargamento das linhas de RMN (MACKIN, 1996; HOLLER et al., 2002).
RMN de 13C
Os espectros de C13 so normalmente menos complexos e mais fceis de
interpretar do que os espectros de RMN H1. Um aspecto dos espectros de RMN de
13C que simplifica o processo de interpretao que cada ncleo de carbono em
uma molcula orgnica produz apenas um pico de RMN de C13, isto por que os
efeitos do acoplamento carbono-carbono, responsveis pelo desdobramento de
sinais em picos mltiplos, so cancelados (HOLLER et al., 2002; PARELLA,1998).
Os ncleos de C13 so de baixa abundncia, de pequena razo giromagntica e
de sensibilidade baixa. Os espectros de RMN de C13 s podem ser obtidos por
espectrmetros de pulso de RMN TF, onde se torna possvel o acmulo de FIDs
(HOLLER et al., 2002; REIF et al., 1996).
DEPTs
Na interpretao de um espectro de RMN de C13 de grande utilidade
identificar quais sinais pertencem ao ncleo de C (quaternrio), CH (metnico), CH2
(metilnico) e CH3 (metila). Para as aplicaes de rotina, os experimentos DEPT 90
e DEPT 135, so suficientes. O DEPT 90 gera somente os sinais dos grupos CH,
enquanto que o DEPT 135 gera sinais negativos para os ncleos de carbono em
grupos CH2 e sinais positivos para os grupos CH e CH3 (SILVA, 2002).
Experimentos de RMN Bidimensionais
- COSY (Homonuclear Correlation Spectroscopy)
17
Um dos experimentos de RMN 2D aplicado ao 1H chamado de
espectroscopia de correlao 1H - 1H (COSY). No espectro COSY, sinais de
correlao so observados quando dois ncleos interagem um com o outro atravs
de um acoplamento escalar. Com esta tcnica possvel estabelecer as correlaes
entre os hidrognios que esto acoplados por 2-3JH,H (acoplamentos geminais e
vicinais), discernindo a multiplicidade dos sinais do espectro de RMN 1H (PARELLA,
1998; KAISER, 2000).
- HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence)
Atravs dessa tcnica, que depende dos acoplamentos 1JC,H, pode-se
distinguir os carbonos que contm os hidrognios j anteriormente assinalados no
espectro de RMN1H, ou vice-versa. O espectro apresenta um eixo horizontal,
dimenso F2, que corresponde ao H e um eixo vertical, dimenso F1,
correspondente ao C (KAISER, 2000; SILVA et al., 2005).
- HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation)
O experimento HMBC, normalmente realizado para a caracterizao estrutural
de molculas orgnicas naturais e sintticas, uma tcnica de correlao
heteronuclear que fornece informaes sobre as interaes escalares entre prtons
e carbonos a longa distncia e separados por duas, trs ou quatro ligaes
covalentes (SILVA et al., 2005; RICCIO et al., 2003).
- NOESY (Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy)
O NOESY tem o aspecto de um COSY e a sua utilizao permite que
correlaes espaciais, estreitamente espaadas, entre ncleos sejam observadas
simultaneamente em uma nica experincia. Assim, esta tcnica mostra as
correlaes que envolvem interaes devidas ao NOE entre hidrognios que esto
espacialmente prximos, estabelecendo a configurao de cada hidrognio na
molcula, podendo definir a geometria molecular do composto em estudo (BENTO,
1997; KAISER, 2000).
18
3. EXPERIMENTAL
3.1 Local de Realizao do Trabalho
A coleta do material botnico foi realizada em Salinas (MG) pelo grupo de
botnica da Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS), dentro do projeto
do Milnio de estudo da biodiversidade nordestina (IMSEAR).
Os procedimentos de preparao do extrato e de isolamento, purificao e
identificao estrutural dos constituintes qumicos do extrato etanlico das folhas de
Z. tuberculosa foram realizados nos Laboratrios de Pesquisa em Recursos Naturais
(Figura 02-a), e de Ressonncia Magntica Nuclear (Figura 02-b), do Instituto de
Qumica e Biotecnologia da Universidade Federal de Alagoas.
Os ensaios de atividades biolgicas (inibitria da linfoproliferao) dos
extratos e fraes de Z. tuberculosa foram realizados no Laboratrio de Engenharia
Tecidual e Imunofarmacologia do Centro de Pesquisas Gonalo Muniz da Fundao
Oswaldo Cruz em Salvador-BA.
Figura 02. Laboratrio de Pesquisa em Recursos Naturais (a), Laboratrio de
Ressonncia Magntica Nuclear (b)
3.2 Material Botnico
A espcie Z. tuberculosa foi coletada em agosto de 2006, na cidade de
Salinas (MG), pela Dra. Tnia Ribeiro, e selecionada no projeto do Milnio de estudo
da biodiversidade nordestina IMSEAR. Uma exsicata encontra-se depositada no
Herbrio de Plantas Medicinais da UEFS em Feira de Santana (BA), com o n 186.
a b
19
3.3 Material, Equipamento, Mtodo de Extrao e Purificao
3.3.1 Solventes - Os solventes utilizados foram: etanol, hexano, clorofrmio, acetato
de etila, acetona, metanol e gua destilada, sendo que na preparao do extrato
bruto, nas parties, filtraes e colunas cromatogrficas os solventes utilizados
foram destilados no Laboratrio de Pesquisa em Recursos Naturais, enquanto que
nas cristalizaes e recristalizaes foram utilizados solventes de grau PA (Merck).
3.3.2 Anlise cromatogrfica - O adsorvente utilizado nas filtraes e separaes
cromatogrficas em coluna foi o gel de slica G 60 (70-230 Mesh ASTM, Merck,
Darmstadt - Alemanha) e nas anlises feitas atravs de cromatografia em camada
delgada (CCD) utilizou-se como adsorvente a slica gel 60 PF254 da Merck
(Darmstadt - Alemanha). Na preparao das placas de CCD foi utilizado um
espalhador mecnico com espessura de 0,25 mm, para a distribuio da suspenso
de slica com gua destilada (10 mL) sobre as placas de vidro, que foram ativadas
em estufa a 100 por uma hora. Tambm foram utilizadas placas de CCD da Merck
(Merck, Darmstadt - Alemanha); o comprimento e o dimetro das colunas utilizadas
variaram conforme as quantidades das amostras e de gel de slica utilizados. A
quantidade da slica foi de 20 a 25 vezes a quantidade da amostra.
3.3.4 Reveladores - Os cromogramas nas cromatoplacas foram visualizados por
irradiao com Luz na regio do Ultravioleta (UV), nos comprimentos de onda 254 e
366 nm, por imerso em cuba com Iodo, seguindo-se por borrifao com Sulfato
Crico, ou Anisaldedo, ou soluo de cido Fosfomolibdico 5% ou soluo de
Liebermann-Burchard. As placas aps borrifao foram aquecidas em estufa por 5
minutos, a 100 C.
- Para a soluo de Sulfato Crico dissolveu-se 2,1 g de Ce(SO4)2 em uma soluo
contendo 21 mL de H2S04 e 50 mL de gua destilada. Em seguida adicionou-se mais
gua destilada completando o volume da soluo para 300 mL.
- Para a soluo de Anisaldedo foi preparada uma mistura de 3 mL de Anisaldedo
com 150 mL de cido Actico Glacial, a qual foi adicionada a uma soluo de 6 mL
de H2S04 e 141 mL de gua destilada.
20
- Para a soluo de cido Fosfomolibdico 5% dissolveu-se 5 g de cido
Fosfomolbdico em 100 ml de lcool Etlico a quente (80-90C), por 5 minutos.
- Para a soluo de Liebermann-Burchard misturou-se 50 mL de Anidrido Actico
com 10 gotas de cido Sulfrico concentrado.
3.3.5 Mtodo de Extrao - Na preparao do extrato etanlico utilizou-se uma
forrageira para triturao das folhas (Nogueira, Itapia - So Paulo) e um extrator de
ao inoxidvel para extrao (Fabra - So Paulo). As concentraes das solues
contendo grandes volumes de solventes foram efetuadas em evaporador rotativo
sob presso reduzida, enquanto que as solues contendo pequenos volumes foram
concentradas temperatura ambiente em capela de exausto.
3.3.6 Mtodo de Purificao - O procedimento de isolamento do princpio ativo do
extrato etanlico envolveu um conjunto de tcnicas seqenciais como: a partio
lquido-lquido, a coluna filtrante de slica, a cromatografia em coluna de slica e
cristalizao. Esse conjunto de tcnicas fez-se necessrio por que o extrato bruto da
planta utilizada rico em diversos componentes e sua anlise cromatogrfica direta
seria extremamente trabalhosa, por isso o uso prvio da partio lquido-lquido e da
coluna filtrante permitiu o fracionamento do extrato etanlico bruto em misturas
menos complexas e em nmero pequeno, facilitando o trabalho de isolamento. A
pureza das substncias isoladas foi visualizada pela obteno de uma s mancha na
placa cromatogrfica, utilizando-se diferentes sistemas de eluentes.
3.3.7 Espectrmetros - Os espectros de RMN unidimensionais (H1, C13, DEPT 135,
DEPT 90) e bidimensionais (HSQC, HMBC, COSY e NOESY) foram realizados em
espectrmetro BRUKER AVANCE (400 MHz para H1 e 100 MHz para C13). Os
deslocamentos qumicos dos sinais dos carbonos dos solventes deuterados
utilizados foram expressos em escala de (delta). A espectrometria de massas foi
realizada em aparelho Shimadzu, modelo GCMS-QP5050A acoplado ao
cromatgrafo gasoso. Foram obtidos os espectros de massas por ionizao qumica
com isobutano no modo positivo. Os espectros na regio do Infravermelho da
substncia ZTC9, foram feitos em soluo de KBr na forma de pastilhas.
21
3.3.8 Polarmetro - A rotao ptica foi realizada em polarmetro Rudolph Research
Analytical (AUTOPOL IV, Automatic Polarimeter), em cubeta de 10 cm, utilizando-se
o comprimento de onda de 589 nm a temperatura de 26,6 C.
3.4 Etapas de Isolamento do Princpio Ativo
3.4.1 Preparao do Extrato Etanlico Bruto das Folhas de Z. tuberculosa
As folhas secas de Z. tuberculosa (5400 g) foram trituradas a p em uma
forrageira (Nogueira, Itapira So Paulo). O material depois de pulverizado foi
submetido extrao com 20 L de Etanol a 90 % a temperatura ambiente (261 C)
por 3 dias e filtrado. O procedimento de extrao com o resduo foi repetido por trs
vezes. Aps evaporao do solvente por destilao a presso reduzida em aparelho
rotatrio a 50 C e remoo da gua residual em dessecador obteve-se o respectivo
extrato bruto (600,45 g), identificado como ZTB.
3.4.2 Partio Lquido-Lquido do Extrato ZTB das Folhas de Z. tuberculosa
Uma suspenso de 100 g do extrato etanlico bruto em uma soluo de
gua/Metanol (3:2) foi extrada sucessivamente com Hexano (4 x 500 mL),
Clorofrmio (4 x 500 mL), Acetato de Etila (4 x 500 mL) e Butanol (4 x 500 mL). O
processo foi realizado seis vezes. Aps remoo do solvente por destilao a
presso reduzida foram obtidas seis fraes em Hexano (ZTP1) (90,30 g; 13,59 %),
Clorofrmio (ZTP2) (223,60 g; 33,65 %), Acetato de Etila (ZTP3) (25,40 g; 3,82 %);
Butanol I (ZTP4) (15,45 g; 2,33 %), Butanol II (ZTP5) (20,70 g; 3,11 %) e
Hidroalcolica (ZTP6) (220,5 g; 20,39 %) (Fluxograma 1, p. 22).
A partio com Butanol deu origem a duas fraes: ZTP4 e ZTP5. Isto
aconteceu porque medida que a fase butanlica foi sendo concentrada as
primeiras coletas apresentaram-se como sendo um concentrado oleoso, j as
ltimas coletas quando concentradas mostraram-se slidas, por isso a fase foi
separada em duas fraes, butanlica I (oleosa) e butanlica II (slida).
No projeto do Milnio do Semi-rido estas fraes j tinham sido preparadas
e submetidas aos ensaios de atividade inibitria da linfoproliferao, na
22
FIOCRUZ/BA. A frao clorofrmica apresentou-se ativa quanto inibio da
linfoproliferao. Por isso, a ZTP2 tambm foi a frao escolhida, nesta nova
partio, para dar continuidade ao processo de isolamento do princpio ativo.
Fluxograma 1. Partio Lquido-Lquido do Extrato ZTB das Folhas de
Z. tuberculosa.
3.4.3 Filtrao da Frao ZTP2 Proveniente do Extrato ZTB
Aps solubilizao em Clorofrmio, a frao ZTP2 (215,0 g) foi incorporada
em gel de slica ativada utilizando como solvente: Hexano, Clorofrmio, Metanol e
mistura dos mesmos, fornecendo nove fraes identificadas conforme mostra a
23
tabela 01, as quais foram submetidas anlise comparativa atravs de CCD e
reveladas com Anisaldedo, Sulfato Crico e/ou vapores de Iodo.
A anlise das fraes provenientes da ZTP2 em CCD serviu de suporte para
esta prxima cromatografia, onde foi selecionada para fracionamento a frao em
clorofrmio identificada por ZTF3. Esta frao foi escolhida porque estava mais pura
a olho nu.
Tabela 01. Filtrao da Frao ZTP2 Proveniente do Extrato ZTB
Frao da Filtrao Peso da Amostra
Hexano (ZTF1) 0,40 g
Hexano/Clorofrmio 1:1 (ZTF2) 105,80 g
Clorofrmio (ZTF3) 10,80 g
Clorofrmio/Metanol 2% (ZTF4) 15,75 g
Clorofrmio/Metanol 5% (ZTF5) 12,25 g
Clorofrmio/Metanol 10% (ZTF6) 21,25 g
Clorofrmio/Metanol 20% (ZTF7) 24,50 g
Clorofrmio/Metanol 1:1 (ZTF8) 13,25 g
Metanol (ZTF9) 9,00 g
3.4.4 Filtrao da Frao ZTF3 Proveniente da Frao ZTP2
A frao ZTF3 (10,50 g) de cor verde-escura, aps solubilizao em
clorofrmio, foi incorporada em slica gel ativada e submetida a cromatografia em
uma coluna de slica (200 g). Foram utilizados como solventes: Hexano, Clorofrmio,
Metanol e mistura dos mesmos, fornecendo oito fraes, conforme mostra a tabela
02 (p. 24).
Essas fraes foram submetidas anlise comparativa atravs de CCD e
reveladas com Anisaldedo, Sulfato Crico e/ou vapores de Iodo.
24
Tabela 02. Filtrao da Frao ZTF3 Proveniente da Frao ZTP2
Frao da Filtrao Peso da Amostra
Hexano/Clorofrmio 1:1 (ZTF3.1) 0,06 g
Clorofrmio (ZTF3.2) 2,55 g
Clorofrmio/Metanol 2% (ZTF3.3) 5,25 g
Clorofrmio/Metanol 5% (ZTF3.4) 1,80 g
Clorofrmio/Metanol 10% (ZTF3.5) 0,50 g
Clorofrmio/Metanol 20% (ZTF3.6) 0,16 g
Clorofrmio/Metanol 1:1 (ZTF3.7) 0,07 g
Metanol (ZTF3.8) 0,03 g
3.4.5 Filtrao da Frao ZTF3.3 Proveniente da Frao ZTF3
Aps a anlise das fraes da filtrao da ZTF3 atravs de cromatografia em
camada delgada (CCD) e revelao com Sulfato Crico, foi realizada ento uma
filtrao com a frao identificada como ZTF3.3 (5,0 g) de maior massa. Esta frao
foi solubilizada em Clorofrmio e incorporada em gel de slica ativada utilizando
como solventes: Hexano, Clorofrmio, Metanol e mistura dos mesmos, fornecendo
cinco fraes, identificadas como mostra a tabela 03.
Essas fraes foram submetidas anlise comparativa atravs de CCD
usando Sulfato Crico como revelador. Todas as fraes desta filtrao mostraram
ser iguais na CCD e por isso foram reunidas e fracionadas em uma coluna
cromatogrfica.
Tabela 03. Filtrao da Frao ZTF3.3 Proveniente da Frao ZTF3
Frao da Filtrao Peso da Amostra
Hexano/Clorofrmio 30 % (ZTF3.3.1) 2,20 g
Hexano/Clorofrmio 30 % (ZTF3.3.2) 1,30 g
Hexano/Clorofrmio 1:1 (ZTF3.3.3) 1,15 g
Hexano/Clorofrmio 1:1 (ZTF3.3.4) 0,10 g
Clorofrmio (ZTF3.3.5) 0,05 g
25
3.4.6 Fracionamento Cromatogrfico I, Cristalizao e Recristalizao das
Fraes Reunidas da Filtrao da ZTF3.3
O material obtido aps a reunio das fraes da filtrao da ZTF3.3 (4,80 g),
foi solubilizado em Clorofrmio, incorporado em slica (8 g) e submetido a uma
cromatografia em coluna de slica gel. Foram utilizados como fase mvel os
seguintes solventes: Hexano, Clorofrmio, Metanol e misturas destes. Foram
coletadas 85 subfraes com um volume de 5 mL cada. Essas subfraes, aps
anlise comparativa atravs de CCD, utilizando-se diferentes sistemas de eluentes e
revelao com cido fosfomolibdico e sulfato crico, foram reunidas conforme a
Tabela 04 (p. 26).
As subfraes, na anlise comparativa atravs de CCD, mostravam uma
grande quantidade de clorofila. O trabalho de isolamento de constituintes de extratos
de folhas normalmente apresenta como problema a remoo da clorofila, pois a sua
natureza qumica e cor forte se torna um problema na purificao dos compostos.
Para a remoo da clorofila, as fraes foram lavadas com acetona. O
processo foi satisfatrio, possibilitando a cristalizao de um slido de cor branca,
que foi separado de sua gua-me de cor verde por filtrao em funil de buckman.
O slido foi solubilizado com Etanol (P. A.), a quente, a seguir submetido a
ultrassom e aps 24 h, foi filtrado em um funil de Bchner. Seguiram-se
recristalizaes de cada subfrao e anlise em CCD. A subfrao (48 78)
mostrou dois pontos na placa e devido quantidade foi selecionada para
fracionamento em coluna (II).
As subfraes (1), (2 - 4) e (79 - 85) no foram trabalhadas devido pequena
quantidade e complexidade demonstrada em CCD. As demais subfraes
codificadas conforme mostra a Tabela 04 (p. 26) demonstraram em CCD apenas um
ponto na placa, e apesar da semelhana entre si receberam cdigos diferentes e
foram levadas para anlise de RMN.
26
Tabela 04. Fracionamento Cromatogrfico das Fraes Reunidas da Filtrao da Frao ZTF3.3
Subfraes Reunidas
Condio de Eluio Massa (g) das Subfraes
Substncias Isoladas
(1) Clorofrmio/Hexano 1:1 0,12
(2 4) Clorofrmio/Hexano 2:1 0,08
(5 9) Clorofrmio/Hexano 2:1 0,59 ZTC1
(10 19) Clorofrmio/Hexano 2:1 0,68 ZTC2
(20 21) Clorofrmio/Hexano 2:1 0,24 ZTC3
(22 31) Clorofrmio/Hexano 2:1 1,04 ZTC4
(32 34) Clorofrmio 0,53 ZTC5
(35 47) Clorofrmio 1,98 ZTC6
(48 78) Clorofrmio/Metanol 5 % 4,55
(79 85) Clorofrmio/Metanol10 % 0,04
3.4.7 Fracionamento Cromatogrfico II, Cristalizao e Recristalizao da
Subfrao (48 78) Proveniente da Coluna I
A subfrao (48 78) (4,00 g), proveniente da coluna I foi solubilizada em
Clorofrmio/Metanol 5%, incorporada em gel de slica e submetida a uma
cromatografia em coluna de slica (100 g). Foram coletadas 56 subfraes com um
volume mdio de 5 mL cada, utilizando-se como fase mvel Hexano, Clorofrmio,
Metanol e mistura destes. Essas subfraes, aps anlise comparativa atravs de
CCD, utilizando-se diferentes sistemas de eluentes e revelao com cido
Fosfomolibdico e Sulfato Crico, foram reunidas em 8 grupos (Tabela 05, p 27).
27
Tabela 05. Fracionamento Cromatogrfico da Subfrao (48 78)
Subfraes Reunidas Condio de Eluio Massa(g) Substncias Isoladas
(1 3) Hexano/Clorofrmio (30%, 40%, 50%)
0,81
(4 12) Hexano/Clorofrmio (60%, 80%)
0,31
(13 19) Clorofrmio e
Clorofrmio/Metanol (2%, 5%)
0,41 ZTC7
(20 26) Clorofrmio/Metanol (5%, 10%)
0,18 ZTC8
(27 31) Clorofrmio/Metanol (10%, 20%)
0,17 ZTC9
(32 34) Clorofrmio/Metanol (20%)
0,30
(35 42) Clorofrmio/Metanol
(20%, 50%) 0,79
(43 56) Metanol 0,39
As subfraes (1 - 3) e (4 - 12) so oleosas e mostraram-se complexas em
CCD, As subfraes (32 - 34), (35 - 42) e (43 - 56) demostraram, aps anlise
comparativa em CCD, possuirem o mesmo slido encontrado na subfrao (27 - 31),
alm de vrias outras substncias, e por isso no foram trabalhadas. As subfraes
(13 - 19), (20 -26) e (27 - 31), apresentaram um nico ponto em CCD, foram
solubilizadas com Etanol (P. A.) a quente, a seguir submetido a ultrassom. Aps 24
h, foram filtradas em um funil de Bchner.
Aps recristalizaes sucessivas em Etanol, obteve-se um produto slido de
cor branca, para cada uma das trs amostras codificadas como mostra a Tabela 05.
Estas trs subfraes foram submetidas anlise de RMN.
28
3.4.8 Fracionamento Cromatogrfico III, Cristalizao e Recristalizao da
Frao ZTF3.2
A frao ZTF3.2, tabela 02 (p. 24), (2,30 g) foi lavada com acetona, seguindo-
se cristalizao de grande quantidade de um slido de cor branca, que foi separado
de sua gua-me de cor verde com o auxlio de uma pipeta. O slido foi ento
recristalizado em Etanol (PA). A anlise em CCD mostrou mais de um ponto na
placa, sendo necessrio o seu fracionamento cromatogrfico.
A frao ZTF3.2 (2,30 g) foi solubilizada em Clorofrmio, incorporada em gel
de slica e submetida a uma cromatografia em coluna de gel de slica (50 g). Foram
coletadas 35 subfraes com um volume mdio de 5 mL cada, utilizando-se como
fase mvel Hexano, Clorofrmio e mistura destes.
Essas subfraes, aps anlise comparativa atravs de CCD, utilizando-se
diferentes sistemas de eluentes e revelao com cido fosfomolibdico e sulfato
crico, mostraram-se puras e semelhantes s subfraes (ZTC 1 - 6) j isoladas da
coluna I. Apesar da semelhana, as fraes 10, 19 e 27, escolhidas de forma
aleatria, receberam cdigos diferentes como ZTC10, ZTC11 e ZTC12 (Tabela 06),
sendo ento enviadas para identificao e posterior comparao com as subfraes
isoladas da coluna I.
Tabela 06. Fracionamento Cromatogrfico da Frao ZTF3.2
Subfraes Condio de Eluio Massa (g) Substncias Isoladas
(10) Clorofrmio/Hexano
2:1 0,06 ZTC10
(19) Clorofrmio/Hexano
2:1 0,11 ZTC11
(27) Clorofrmio/Hexano
2:1 0,09 ZTC12
29
3.5 Prospeco Fitoqumica
Foram realizados os testes de prospeco fitoqumica com o extrato ZTB das
folhas da Zeyheria tuberculosa, seguindo-se a descrio de Matos, 1997. Os
mtodos utilizados nesta abordagem so apenas qualitativos. Para os testes foram
utilizados sete tubos de ensaio, numerados de 1 a 7. Em cada tubo foram colocados
3 mg do extrato solubilizados em 4 mL de Etanol.
3.5.1. Teste para Fenis e Taninos
Para esse teste foram utilizadas duas solues que j estavam preparadas:
- Soluo de cloreto frrico (FeCl3) Adicionou-se 9 g de FeCl3 em 50 mL de
gua destilada contendo 2 mL de cido clordrico 3 mol.L-1. Em seguida completou-
se o volume para 100 mL com etanol, em um balo volumtrico.
- Soluo de HCl 3 mol.L-1 Adicionou-se 33,3 mL de HCl concentrado em
gua destilada suficiente para 100 mL de soluo, em um balo volumtrico.
No tubo de ensaio de nmero 1 foram adicionadas trs gotas de soluo
alcolica de FeCl3 1 mol.L-1. Agitou-se bem e observou-se a variao de cor e a
formao de precipitado verde escuro abundante. Este resultado foi comparado com
um teste em branco, usando-se gua e FeCl3. A colorao variando entre azul e
vermelho indicativo de fenis. A formao de um precipitado azul escuro indica a
presena de taninos piroglicos (taninos hidrolisveis). A cor verde indica a presena
de taninos flobabnicos (taninos condensados ou catquicos).
3.5.2 Teste para Antocianinas, Antocianidinas e Flavonoides
Para este teste foi preparada um soluo de NaOH 1 mol.L-1 dissolvendo-se 4
g deste reagente em gua destilada para 100 mL de soluo em balo volumtrico.
O tubo de nmero 2 foi acidulado com HCl 3 mol.L-1 a pH 3 e os tubos 3 e 4 foram
alcalinizados com NaOH 1 mol.L-1 a pH 8,5 e 11, respectivamente. A observao de
30
qualquer mudana da colorao da soluo foi interpretada como mostrado na
tabela 07.
Tabela 07. Variao de Colorao Observada nos Tubos (I)
Constituintes
Cor
Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4
cido pH = 3
Alcalino pH = 8,5
Alcalino pH = 11
Antocianinas e Antocianidinas Vermelha Lils Azul Prpura
Flavonas, Flavonis e Xantonas - - Amarela
Chalconas e Auronas Vermelha Vermelha - Vermelho Prpuro
Flavanonis - - Vermelho Laranja
3.5.3 Teste para Leucoantocianidinas, Catequinas e Flavononas
O tubo 5 foi acidulado por adio de HCl 3 mol.L-1 at pH 1 - 3 e o tubo 6 foi
alcalinizado com NaOH 1 mol.L-1 at pH 11. Os tubos foram cuidadosamente
aquecidos. Foi observada modificao na colorao por comparao com os tubos
com pH correspondentes usados no teste anterior. A interpretao dos resultados foi
feita como mostrado na tabela 08.
Tabela 08. Variao de Colorao Observada nos Tubos (II)
Constituintes
Cor
Tubo 5 Tubo 6
Meio cido Meio Alcalino
Leucoantocianidinas Vermelha -
Catequinas (Taninos Catquicos) Pardo-amarelada -
Flavononas - Vermelho Laranja
31
3.5.4 Teste para Flavonis, Flavanonas, Flavanonis e Xantonas
No tubo de nmero 7, foram adicionados alguns miligramas de magnsio
granulado e 0,5 mL de HCl concentrado. Aguardou-se o trmino da reao indicado
pelo fim da efervescncia. Comparou-se a cor dos tubos 5 e 7 (acidificados). O
aparecimento ou intensificao da cor vermelha indicativo da presena de
flavonis, flavanonas, flavanonis e/ou xantonas, livres ou seus heterosdios.
3.5.5 Teste para Esteroides e Triterpenoides
Adicionou-se 10 mL de uma soluo etanlica do extrato em um bquer e
deixou-se secar em banho-maria. Extraiu-se o resduo seco do bquer com trs
pores de 2 mL de CHCl3. Filtrou-se a soluo clorofrmica em um pequeno funil
fechado com um pouco de algodo, coberta com uma pequena quantidade de
Na2SO4 anidro, para um tubo de ensaio bem seco. Adicionou-se 1 mL de anidrido
actico e agitou-se suavemente. Juntou-se cuidadosamente trs gotas de H2SO4
concentrado. Tornou-se a agitar suavemente, e foi observado se havia o rpido
desenvolvimento de cores. A colorao azul seguida da verde permanente um
indicativo da presena de esterides livres. A colorao parda at vermelha indica
triterpenides pentacclicos livres.
3.5.6 Teste para Saponinas
Os resduos insolveis em clorofrmio, separados no teste anterior, foram
solubilizados em gua destilada e a soluo foi filtrada para um tubo de ensaio.
Agitou-se fortemente o tubo com a soluo, por trs minutos e observou-se a
formao da espuma. Uma espuma persistente e abundante (colarinho) indica a
presena de saponinas.
32
3.5.7 Teste para Alcalides
O extrato foi colocado em um tubo de ensaio, solubilizado com metanol e
submetido CCD. Aps eluio, a placa foi revelada com reagente de Dragendorff.
O surgimento de manchas de cor alar