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Überexpression von s-Adenosylhomocysteinhydrolase in
Epstein-Barr-Virus-positiven Burkitt-Lymphomzellen
Von der Medizinischen Fakultät
der Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen
zur Erlangung des akademischen Grades
eines Doktors der Medizin
genehmigte Dissertation
vorgelegt von
Claudine Maret
aus
Paderborn
Berichter: Herr Universitätsprofessor
Dr. med. Klaus Ritter
Herr Universitätsprofessor
Dr. med. Johann Lorenzen
Tag der mündlichen Prüfung: 19. Dezember 2003
Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar.
2
Inhaltsangabe 1. Einleitung ...................................................................................................................... 4
1.1. Das Epstein-Barr -Virus ............................................................................................ 4 1.2 Strategien zur Bekämpfung EBV-assozierter Tumore.............................................. 7 1.3 Problemstellung......................................................................................................... 8
2. Material und Methoden ..................................................................................................... 9 2.1 Material ..................................................................................................................... 9
2.1.1 Instrumente........................................................................................................ 9 2.1.2 Zellinien ............................................................................................................ 9
2.1.2.1 Zellinie Raji................................................................................................. 10 2.1.2.2 Zellinie B95-8 ............................................................................................. 10
2.1.3 Primer .............................................................................................................. 10 2.1.4 Antikörper ....................................................................................................... 11 2.1.5 Kits und Chemikalien....................................................................................... 11
2.2 Methoden................................................................................................................. 13 2.2.1 Kulturtechniken............................................................................................... 13
2.2.1.1 Kultivierung von Bakterien......................................................................... 13 2.2.1.2 Kultivierung von eukaryontischen Zellen ................................................... 14 2.2.1.3 Zellzählung.................................................................................................. 15
2.2.2 Methoden rekombinanter DNA-Technologie ................................................. 16 2.2.2.1 Plasmidpräparation aus Bakterienzellen ..................................................... 16 2.2.2.2 Nukleinsäurepräparation aus eukaryontischen Zellen................................. 16 2.2.2.3 Konzentrationsbestimmung von DNA und RNA........................................ 17 2.2.2.4 Spaltung der DNA mit DNase I .................................................................. 17 2.2.2.5 DNA-Präzipitation ...................................................................................... 17 2.2.2.6 Spaltung von DNA mit Restriktionsenzymen............................................. 18 2.2.2.7 Synthese von cDNA .................................................................................... 19 2.2.2.8 Polymerase-Kettenreaktion (PCR).............................................................. 19 2.2.2.9 PCR mit dem Light-Cycler ......................................................................... 22 2.2.2.10 Sequenzieren von DNA............................................................................ 24 2.2.2.11 Agarose-Gelelektrophorese..................................................................... 26 2.2.2.12 Konstruktion eines Expressionsvektors für AHCY in eukaryontischen Zellen............................................................................................................................ 27 2.2.2.13 DNA Transfektion durch Elektroporation................................................ 28
2.2.3 Immunologische Methoden............................................................................. 29 2.2.3.1 Bestimmung der DNA-Syntheserate ........................................................... 29 2.2.3.2 Immunfluoreszenz-Test (IFT) ..................................................................... 29 2.2.3.3 Proteinisolierung aus eukaryontischen Zellen............................................. 31 2.2.3.4 Western Blot................................................................................................ 31 2.2.3.4.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ............................ 32 2.2.3.4.2 Elektroblot ................................................................................................ 35 2.2.3.4.3 Färbung der Proteine mit Ponceau S ........................................................ 36 2.2.3.4.4 Immunblot ................................................................................................ 36 2.2.3.5 Durchflußzytometrie ................................................................................... 37
3. Ergebnisteil...................................................................................................................... 40 3.1 Konstruktion eines Expressionsvektors für AHCY ................................................ 40
3.1.1 Amplifikation von AHCY durch RT-PCR...................................................... 40 3.1.2 Darstellung des Expressionsvektors................................................................ 41
3.1.2.1 Konstruktion des Donorvektors .................................................................. 41
3
3.1.2.2 Transformation von E.coli PIR 1-Zellen mit dem pUni/V5-His-TOPO-Vektor........................................................................................................... 41
3.1.3 TOPO-Cloning-Reaktion in E.coli TOP 10-Zellen mit dem pcDNA3.1-E-Vektor ............................................................................................................... 44
3.2 Überexpression von AHCY in eukaryontischen Zellen.......................................... 46 3.2.1 Transfektion von Raji-Zellen mit pcDNA3.1-AHCY..................................... 46
3.2.1.2.1 Etablierung einer semiquantitativen PCR mit AHCY und GAPDH........ 48 3.2.2 Nachweis der Überexpression von AHCY...................................................... 50 3.2.3 Nachweis der AHCY-Überexpression auf Proteinebene ................................ 51 3.2.4 Zellwachstum nach Transfektion mit pcDNA3.1 und -AHCY....................... 53 3.2.5 BrdU-Test........................................................................................................ 54 3.2.6 Immunfluoreszenztest ..................................................................................... 55 3.2.7 BZLF1 / BHRF1-PCR..................................................................................... 56 3.2.8 Facs Scan......................................................................................................... 58 3.2.9 Versuche mit dem Light Cycler ...................................................................... 59
4. Diskussion ....................................................................................................................... 61 4.1 Klonierung von AHCY in einen Expressionsvektor ............................................... 61 4.2 Transfektion/Expression von pcDNA3.1-AHCY in Raji-Zellen ............................ 62 4.3 Effekte der AHCY-Überexpression in Raji-Zellen................................................. 63
5 Ausblick .......................................................................................................................... 72 6 Zusammenfassung........................................................................................................... 73 7 Referenzen....................................................................................................................... 74 8 Abkürzungen ................................................................................................................... 84
4
1. Einleitung
1.1. Das Epstein-Barr -Virus
Im Jahre 1964 entdeckten Anthony Epstein und Yvonne Barr elektronenmikroskopisch im
Zytoplasma von B–Lymphozyten, die aus den Biopsien eines Burkitt-Lymphoms stammten,
Partikel, die morphologisch den bekannten Herpes-Viren ähnelten. Im Labor von Gertrude
und Werner Henle zeigte eine Nukleinsäureanalyse, daß es sich um ein bis dahin nicht
bekanntes Herpes-Virus handelte. Das Virus wurde nach den Entdeckern Epstein-Barr-Virus
(EBV) genannt (Henle, 1968).
Bei dem EBV handelt es sich um ein humanes Herpesvirus, das der Subfamilie
Gammaherpesvirinae, Gattung der Lymphocryptoviren, zuzuordnen ist. Es hat einen Partikel-
durchmesser von 120-200 nm und besitzt ein Genom von ca. 170 kb.
Im Inneren des Viruspartikels befindet sich ein Proteincore, das mit dem doppelsträngigen
linearen DNA-Genom assoziiert ist. Diese Struktur ist von einem ikosaedrischen Capsid
umgeben, das aus mehreren Virusstrukturproteinen besteht. Das Capsid wird von einer
Hüllmembran umgeben, die sich von der inneren Kernmembran ableitet. Zwischen beiden
Strukturen befindet sich das Tegument, das verschiedene regulatorisch aktive Proteine enthält.
Verschiedene EBV-Isolate zeigen im Genom unterschiedliche Deletionen und Variationen, es
läßt sich jedoch eine Grundstruktur bestimmen: 5 singuläre Bereiche (U1-U5, unique regions)
sind durch 4 interne (IR1-IR4, internal repeats) und terminale repetitive Sequenzen (TR,
terminal repeats) voneinander getrennt. Die terminalen Wiederholungssequenzen an den
Enden des linearen Genoms sind für die Zirkularisierung des viralen Genoms im
Latenzstadium und bei der Aktivierung von Bedeutung (Oka, 1985).
Im Viruspartikel liegt die doppelsträngige EBV-DNA linear vor, im Kern von infizierten
Zellen ist die virale DNA über die TR-Sequenzen ringförmig geschlossen. Das Genom
besteht aus ca. 80-100 offenen Leserastern, die eine gleich hohe Anzahl von Proteinen
vermuten lassen (Baer et.al., 1984). Mehr als 50 RNA-Polymerase II-Promotoren wurden
identifiziert (Oka, 1984). Obwohl von nur etwa 30 Genen die Funktion bekannt ist. Die
meisten der bislang charakterisierten Genprodukte sind für den lytischen Zyklus relevant. In
latent infizierten Zellinien wurden bisher 11 exprimierte EBV-Gene identifiziert, die für zwei
nicht translatierte RNA`s (EBV-encoded RNA`s, EBER`s), sechs EBV-nukleäre Antigene
(EBNA1, -2, -3A, -3B, -3C und –LP) und drei latente Membranproteine (LMP1, -2A, -2B)
kodieren (Kieff und Liebowitz,1990).
Abb. 1: Vereinfachte Darstellun
Die Infektion mit dem E
Speichel stellt die Haup
`kissing disease`. Das V
lytischer Zyklus ablaufen
Die Primärinfektion mit E
entwickelt sich in etwa 50
selbstlimitierenden Autoi
Virusinfektion führt zur
über 40 Jahren sind Virus
Durch epidemiologische
Untersuchungen läßt sich
Tumorerkrankungen asso
Lymphom (10 Fälle pro
Lytischer Zyklus in Bsetzung von Viren in
Freisetzung von Vireinfektion von B-Zelle
Lytische Infektion voEpithelzellen
Infektiöse Viren im S
Orale Aufnahme von EBV meist durch Speichelkontakt
Infektion von Epithelzellen und B-Lymphozyten
g des Verl
BV erfo
tinfektion
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Infektion zirkulierender B-Zellen
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rankung (Hallee
gen Persistenz des
nette et al., 1990).
Infektionsexper
aß das EBV eine
, wie z.B. mit
Kinder in Zentr
. Frei-webe
Transformation und Immortalisierung
Nach 30-60 Bei
Reaktivierung5
n beim Menschen
leimhaut des Naso-Pharyngealraumes.
die anglo-amerikanische Bezeichnung
n (siehe Abb.1), in denen sowohl ein
ebenslang latenten Persistenz sind.
meist inapparent. Im jugendlichen Alter
ild der infektiösen Mononukleose, einer
et al., 1974; Ritter et al., 1994). Die
Virus. Mehr als 90% aller Menschen
imente an Primaten und in-vitro-
transformierende Potenz besitzt und mit
dem endemisch auftretenden Burkitt-
al-Afrika und Papua-Neuguinea), dem
Aufrechterhaltung der latenten Infektion
Zyklen der Zellteilung Aktivierung
Ausbildung von Lymphomen
6
Nasopharynx-Karzinom (10 Fälle pro 100.000 Personen in Südchina und Südostasien) und
dem Hodgkin-Lymphom (1,5 Fälle pro 100.000 Menschen).
Vom Epstein-Barr-Virus gibt es zwei unterschiedliche Subtypen, Typ A und Typ B, die sich
in verschiedenen Genen unterscheiden, wie z. B. EBNA-2, EBNA-3a, EBNA-3b und EBNA-
3c (Sample et al., 1990). Der EBV-Typ A immortalisiert B-Zellen wesentlich effizienter als
der Typ B (Rickinson et al., 1987). Einige Untersuchungen weisen daraufhin, daß das EBV-
Typ B nur in immungeschwächten Populationen eine Transformation der B-Zellen
hervorrufen kann (Shibata et al., 1993; Royle et al., 1991).
Die EBV-Subtypen zeigen ein unterschiedlich epidemiologisches Verhalten. Die Prävalenz
von Typ A ist in westlichen Ländern und Brasilien häufig (Chen et al., 1996; Kyaw et al.,
1992), der Typ B dagegen wird regelmäßig in Äquatorialafrika gefunden (Young et al., 1987).
Die Transformation von Zellen erfolgt im Stadium der Viruslatenz. Es werden drei Formen
der EBV-Latenz anhand des Genexpressionsmuster unterschieden (Masucci und Ernberg,
1994):
- Latenz 1: Expression von EBNA1, EBER 1, -2 (z.B. Zellen des Burkitt-
Lymphoms (BL))
- Latenz 2: Expression von EBNA1, EBER1, -2, LMP1, -2A, -2B (z.B. Zellen des
Nasopharynx-Karzinoms (NPC))
- Latenz 3: Expression aller 11 latenten Gene (z.B. EBV-infizierte Zellinien)
Aus dem Stadium der Latenz kann das Virus spontan in den lytischen Zyklus eintreten oder
es kann durch externe Stimuli induziert werden, wie z.B. durch Anti-Immunglobulin-
Antikörper, 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-Acetat (TPA), Basenanaloga oder spezifische
Ganglioside (Rodrigez et al., 2001, Schaade et al., 1999). Bei der Reaktivierung des lytischen
EBV-Zyklus spielt die Proteinkinase C (PKC) eine zentrale Rolle. Diese Serin/Threonin-
Kinase, die an Proliferations- und Differenzierungsvorgängen beteiligt ist, vermittelt die
lytische Reaktivierung nach Stimulation mit z.B. TPA oder anti-Immunglobulin-Antikörpern.
Die aktivierte PKC kann die Transkription des „immediate early“-Gens BZLF1 induzieren,
ein zentraler Schalter des lytischen Zyklus, und mit dem assozierten Protein Zta interagieren.
Zta bindet an den lytischen Replikationsursprung des EBV, wodurch eine Interaktion
zwischen dieser Bindungsstelle und dem viralen DNA-Polymerase/ Helicase/ Primase-
Komplex möglich wird. Dies ist Voraussetzung für die Virusreplikation. Ferner dient das Zta-
Protein als Transkriptionsfaktor für Promotoren zellulärer und viraler Gene, die
7
Konsensussequenzen für die Bindung des Faktors AP-1 enthalten (Farrell et al., 1989, Speck
et al., 1997).
In früheren Untersuchungen wurde gezeigt, daß mit dem Gangliosid LM1 stimulierte Burkitt-
Lymphom-Zellen der Linie Raji eine Aktivierung des lytischen Zyklus, eine
Wachstumshemmung und Aspekte der Zelldifferenzierung aufwiesen. Dem liegen komplexe
Veränderungen im Genexpressionsmuster zugrunde ( Schaade et al., 1999).
Durch ‚differential-display-RT-PCR‘ und ‚suppression-subtractice-hybridisation-PCR‘
wurden 35 Gene identifiziert, deren Expression nach LM1-Behandlung moduliert wurde
(Schaade et al., 2000, Kleines et al., 2000). Dazu gehört unter anderem das Gen für S-
Adenosylhomocystein-Hydrolase (AHCY). Das zelluläre Enzym AHCY spielt eine
entscheidende Rolle bei Transmethylierungsreaktionen und kontrolliert die Replikation
verschiedener Viren. Vermutlich ist es auch an der EBV-Replikation beteiligt.
In Mammalia-Zellen ist AHCY das einzig bekannte Enzym, daß die Hydrolyse von S-
Adenosylhomocystein (AdoHcy) zu Homocystein und Adenosin katalysiert.
Die Aktivität aller S-Adenosylmethionin(AdoMet)-abhängigen Methyltransferasen ist
abhängig von der Höhe des intrazellulären AdoHcy-Spiegels. Dieses Molekül wirkt als
Produktinhibitor und wird durch das Enzym AHCY kontrolliert. Solche Transmethylierungs-
reaktionen kommen im gesamten Organismus vor. AHCY kann daher als genereller Regulator
biologischer Transmethylierungsprozesse angesehen werden (Turner et al., 2001).
Da Inhibitoren der AHCY antivirale (z.B. CMV, Rabiesvirus, RS-Virus), antiparasitäre
(Leishmania (Leishmaniasis), Plasmodium (Malaria), Trypanosomen (Afrikanische
Schlafkrankheit)) und auch anti-arthritische und immunsuppressive Eigenschaften besitzen,
ist das Enzym zum Gegenstand intensiver pharmakologischer Forschung geworden.
1.2 Strategien zur Bekämpfung EBV-assozierter Tumore Bisherige Strategien in der Therapie EBV-assozierter Tumore bestehen je nach Tumorstadium
aus Operation, Radio- und/oder Polychemotherapie,. Die Chemotherapie mit kurativer
Zielsetzung wird beim Hodgkin-Lymphom nach dem COPP- (Cyclophosphamid, Vincristin,
Procarbazin und Prednison) bzw. nach dem BEACOPP-Schema (s. COPP-Therapeutika plus
Etoposid) durchgeführt. Die Chemotherapie ist mit erheblichen Nebenwirkungen verbunden,
da auch gesunde Zellen geschädigt werden können. Es besteht im besten Fall eine relative
Spezifität für die Tumorzellen. Als mögliche Nebenwirkungen können die Myelosuppression,
8
Stomatitis, Enterokolitis, Übelkeit, Erbrechen und die Toxizität für Herz, Lunge, Nieren,
Nervensystem erwähnt.
Eine neue Strategie im Kampf gegen EBV-assozierte Tumore zielt darauf ab, virushaltige
Tumorzellen, durch die Induktion des lytischen Zyklus und der anschließenden Lyse dieser
Zellen bei der Freisetzung von Virionen, in Anwesenheit antiviraler Chemotherapeutika zu
vernichten (Gutierrez et al., 1996, Westphal et al., 1999). Bisher wurde die lytische
Reaktivierung in vitro und in vivo durch externe Stimuli wie Bestrahlung, Butyrate oder durch
Überexpression von Induktoren des lytischen Zyklus, wie BZLF1, erreicht. In Anwesenheit
von antiviralen Substanzen, wie Ganciclovir, wurden so entartete Zellen effizient zerstört,
ohne eine Virusfreisetzung auszulösen.
Die Kombination aus geeigneten Induktoren des lytischen Zyklus und bewährten antiviralen
Chemotherapeutika dürfte ein vielversprechender Ansatz zur Therapie EBV-assozierter
Tumore sein. Ein kürzlich neu entdeckter Induktor des lytischen Zyklus ist das Gangliosid
LM1.
1.3 Problemstellung In früheren Untersuchungen war gezeigt worden, daß die aus dem Burkitt-Lymphom
stammende Zellinie Raji nach Stimulierung mit dem körpereigenen Gangliosid LM1 eine
Aktivierung des lytischen Zyklus, eine Wachstumshemmung, Zelldifferenzierung und
komplexe Veränderungen im Genexpressionsmuster aufwies. Bei einem der induzierten Gene
handelt es sich um S-Adenosylhomocystein-Hydrolase (AHCY), einem Schlüsselenzym der
Transmethylierungsreaktion.
Ziel dieser Arbeit ist es, die Funktion des Genes AHCY zu charakterisieren und die
Wirkungsweise auf die EBV-Latenz in Raji-Zellen zu untersuchen.
Hierzu mußten folgende Aufgaben gelöst werden:
- Klonierung des AHCY in den humanen Expressionsvektor pcDNA3.1 und Transfektion
des Konstruktes in die Zellinie Raji
- Überexpressionsnachweis auf Transkript- und Proteinebene mittels PCR, RT-PCR und
Western Blot
- Analyse der Transfektionseffekte (Zellwachstumsüberprüfungen, Immunfluoreszenztest
(IFT), Untersuchung verschiedener Oberflächenmarker, differenzielle Genexpression)
9
2. Material und Methoden
2.1 Material 2.1.1 Instrumente
- BioDoc Analyze (Kamera) - Biometra, Göttingen
- CASY 1, Zellzähler - Schärfe-System, Reutlingen
- Tischzentrifuge 5451C, 5403 - Eppendorf, Hamburg
- Zentrifuge RC 5C Plus - Sorvall, Bad Homburg
- Gene Quant II (Photometer) - Pharmacia Biotech, Freiburg
- Light-Cycler - Roche, Mannheim
- Microplate Scanning Spectrometer (Power Wave 200) - Bio-Tek Instruments, USA
- Speed Vac, concentrator 5301 - Eppendorf, Hamburg
- Thermocycler UNO II - Biometra, Göttingen
- Thermomixer 5436 - Eppendorf, Hamburg
- Transphor electrophoresis unit - Hoefer, San Francisco, USA
- FACSCalibur - Becton Dickenson, Heidelberg
- Gene PulserTM - Bio Rad, München
2.1.2 Zellinien
- Raji (Stamm ATCC) - ATTC, USA
- Raji (Stamm ATCC, Göttingen) - Universität Göttingen
Abt. Med. Mikrobiologie
nach freundlicher
Zurverfügungstellung
- B95-8 (Miller & Lipman, 1973) - ATTC, USA
10
2.1.2.1 Zellinie Raji
Zellen der Zellinie Raji ist es aufgrund einer Deletion im BHLF2-Gen für das virale
Capsidantigen nicht möglich einen kompletten lytischen Zyklus zu durchlaufen (Decaussin,
1995). Bei der Reaktivierung des EBV werden verschiedene frühe Genprodukte wie Early
Antigen, EBNA1, BZLF1 und BHRF1 gebildet; es kommt jedoch nicht zur Produktion und
Freisetzung intakter Virionen. An der Zelloberfläche wird der EBV-Rezeptor CD21
exprimiert. Die Kultivierung erfolgt unter den unter 2.2.1.2 beschriebenen Bedingungen.
2.1.2.2 Zellinie B95-8
Die Zellinie B95-8 entstand nach Infektion von B-Lymphozyten aus Schimpansen. Sie tragen
den EBV-Rezeptor CD 21 auf der Zelloberfläche und sie sind in der Lage einen kompletten
lytischen Zyklus zu durchlaufen und funktionsfähige Virionen freizusetzen. Die Kultivierung
erfolgt unter den unter 2.2.1.2 beschriebenen Bedingungen.
2.1.3 Primer
- AHCY-3’ ges. (20pmol/µl) 19mer -5´-c act acc gct act gag agc- 3´
- AHCY-5’ ges. (20pmol/µl) 18mer -5´-gcc gcc agc atg tct gac- 3´
- Amp 3 (20pmol/µl) 18mer -5´-gaa ctg gat ctc aac agc- 3´
- Amp 5 (20pmol/µl) 19mer -5´-gct aga gta agt agt tcg c- 3´
- BHRF-A (20pmol/µl) 20mer -5´-ttc tct tgc tgc tag ctc ca- 3´
- BHRF-B (20pmol/µl) 25mer -5´-tac gca tta gag acc act ttg agc c- 3´
- BZLF 3´ (20pmol/µl) 20mer -5´-ggc agc agc cac ctc acg gt- 3´
- BZLF 5´(20pmol/µl) 20mer -5´-ttc cac agc ctg cac cac tg- 3´
- GapDH-A (20pmol/µl) 24mer -5´-cgg agt caa cgg att tgg tcg tat- 3´
- GapDH-B (20pmol/µl) 24mer -5´-agc ctt ctc cat ggt ggt gaa gac- 3´
11
2.1.4 Antikörper
- Anti-EA-D (R3), Quelle: Maus (monklonal) - ABI, Columbia,USA
- Anti-Maus-Ig, FITC-gekoppelt, Kaninchen (polyklonal) - DAKO, Glostrup, DK
- Anti-EBNA 1 (monoklonal) - ABI, Columbia,USA
- Anti C3, FITC-gekoppelt, Ziege (monoklonal) - ICN Biomedicals, USA
- Anti-AHCY, Maus (monoklonal) - Dr. Hershfield, NC, USA
- Anti-Maus-Ig-HRP, Kaninchen (monoklonal) - DAKO, Glostrup, DK
2.1.5 Kits und Chemikalien
- 100bp-DNA -Marker (Fragmentgröße 0-3.000 bp) - MBI Fermentas, St. Leon.
- 1kb-DNA-Marker (Fragmentgröße 250 bp-10.000 bp) - MBI Fermentas, St Leon.
- 1M H2SO4 - Merck, Darmstadt
- β-Mercaptoethanol - Merck, Darmstadt
- ABI Prism BigDye Terminator Ready Reaction Kit - Perkin Elmer, Weiterstadt
- Agarose - Sigma, Deisenhofen
- Ammoniumpersulfat - Sigma, Deisenhofen
- Anorganische Salze - Sigma, Deisenhofen
- Cell Proliferation ELISA (BrdU-Test) - Roche, Mannheim
- DEPC - Sigma, Deisenhofen
- Dithiothreitol (DTT) - Sigma, Deisenhofen
- EchoTM-Adapted Expression Vector (pcDNA3.1-E) - Invitrogen,Groningen, NL
- EchoTM-Cloning System (pUni/V5-His TOPO) - Invitrogen,Groningen, NL
- Ethanol - Merck, Darmstadt
- Ethidiumbromid - Sigma, Deisenhofen
- Evans Blue - Sigma, Deisenhofen
12
- Fetales Kälber Serum (FKS) - Sigma, Deisenhofen
- First-Strand cDNA synthesis Kit - Am. Pharmacia, Freiburg
- Gel blot Papier (GB002, GB003) - Schleicher&Schuell,
- Glycin - Sigma, Deisenhofen
- High Pure Plasmid Isolation Kit - Roche, Mannheim
- Isopropanol - Sigma, Deisenhofen
- Meerschweinchen Komplement C3D - ICN Biomedicals, USA
- L-Glutamine (200mM) - Sigma, Deisenhofen
- Methanol - Merck, Darmstadt
- N,N,N´,N´-tetramethylethylenediamine (TEMED) - Serva, Heidelberg
- Nicht-essentialle Aminosäuren (100x) - Biochrom KG, Berlin
- Nonidet P-40 - Sigma, Deisenhofen
- PCR-Gefäße - Sartorius, Göttingen
- Penicillin-(200mM)-Streptomycin (1mg/ml)-Lösung - Sigma, Deisenhofen
- Performance Optimized Polymer 6´(POPTM-6) - Perkin Elmer, Weiterstadt
- Wasserstoffperoxid (H2O2) - Merck, Darmstadt
- Pipettenspitzen (1µl – 1000µl) - Eppendorf, Hamburg
- Ponceau S - Serva, Heidelberg
- QIAamp Blood Kit - Qiagen, Hilden
- QIAamp DNA Mini Kit - Qiagen, Hilden
- Qiagen Plasmid Maxi Kit - Qiagen, Hilden
- Qiagen Plasmid Purification Mini Kit - Qiagen, Hilden
- Restriktionsenzyme & Puffer - MBI Fermentas, St. Leon.
- RNase Inhibitor - Roche, Mannheim
- RNeasy Mini Kit - Qiagen, Hilden
- RPMI-1640 Medium - Sigma, Deisenhofen
Dassel
13
- Sartolab P-Filter, 0,2µm Porengröße - Sartorius, Göttingen
- Sodiumdodecyl sulfat (SDS) - Sigma, Deisenhofen
- Taq DNA Polymerase - Qiagen, Hilden
- Tris base - Sigma, Deisenhofen
- Tween 20 - Sigma, Deisenhofen
- Zellkulturflasche (25 u. 75 qcm) - Greiner, Frickenhausen
2.2 Methoden
2.2.1 Kulturtechniken
Eine Bakterien- oder Zellkultur dient zur Vermehrung von Bakterien oder Zellen in einem
geeigneten Nährmedium.
Um optimale Wachstumsbedingungen zu schaffen, müssen organische Energiequellen und
Mineralien vorhanden sein. Je nach Art des Organismus muß das Nährmedium einen
bestimmten Gehalt an Sauerstoff und Kohlendioxid haben. Ein definierter pH-Wert ist
ebenfalls unerlässlich. Im allgemeinen wurden Kulturen bei 37 °C und Zellkulturen mit einer
5% CO2-Atmosphäre inkubiert.
Nährmedien können flüssig sein oder durch einen Gehalt von 1,5 – 2% Agarose eine feste
Konsistenz aufweisen.
Prokaryontische und eukaryontische Zellen werden unter unterschiedlichen Bedingungen
kultiviert.
2.2.1.1 Kultivierung von Bakterien
Die Mikroorganismen wurden bei 37 °C unter Schütteln in flüssigem Nährmedium kultiviert
oder in Petri-Schalen auf Nährmedium, das durch 1,5 % Agarose verfestigt wurde.
Für die Kultivierung von E. coli wurde das Luria-Bertani (LB)-Medium verwendet:
14
LB-Medium: NaCl 1,0 % (w/v)
Pepton 1,0 % (w/v)
Hefeextrakt 0,5 % (w/v) in Aqua bidest.
Nach Autoklavierung des Nährmediums können zum Zweck der Selektion Antibiotika
zugegeben werden:
Ampicillin Endkonzentration: 50µg/ml
2.2.1.2 Kultivierung von eukaryontischen Zellen
Zellen der Zellinien B95-8 und Raji wurden in 50 ml oder 200 ml Kulturgefäßen (Greiner)
kultiviert. Das Kulturvolumen betrug 15 bzw. 50 ml. Bei größeren Volumina ist keine
optimale Sauerstoff- und CO2-Versorgung gewährleistet. Die Anzucht erfolgte bei 37 °C in
5 %iger CO2-Atmosphäre in supplementiertem RPMI-1640-Medium (Sigma). Zweimal pro
Woche wurden die Zellen mit frischem Medium versorgt. Dabei wurde immer die Hälfte des
Volumens in den Flaschen ausgetauscht.
FKS wurde mit Sartolab P-Filtern steril filtriert und 30 Minuten bei 56 °C hitzeinaktiviert,
bevor es zu dem RPMI-Medium gegeben wurde.
Zusätze für RPMI-1640:
10 % Fetales Kälber Serum (FKS)
2 % Antibiotika [Penicillin –Streptomycin-Lösung]
2 % L-Glutamin
0,2 % Nicht-essentielle Aminosäuren
Zur Kryokonservierung wurden 15 ml einer drei bis vier Tage alten Zellkultur bei 400 g für
10 min abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 1 ml
Einfriermedium A vorsichtig resuspendiert. 1 ml Einfriermedium B wurde hinzugefügt. Der
Ansatz wurde vorsichtig durchmischt und in 2-ml-Einfrierröhrchen überführt. Die Röhrchen
wurden über 24 h langsam auf –70 °C abgekühlt und anschließend in Behältern mit
flüssigem Stickstoff (-180 °C) gelagert.
15
Lösung A (für zehn Kryo-Gefäße):
RPMI-1640 7,5 ml
FKS 2,5 ml
Lösung B (für zehn Kryo-Gefäße):
RPMI-1640 5,5 ml
FKS 2,5 ml
DMSO 2,0 ml
Um Mammalia-Zellen wieder in Kultur zu nehmen, wurden die Einfrierröhrchen in einem 37
°C-Wasserbad aufgetaut bis nur noch ein kleines Stückchen Eis übrig war. Dann wurden die
Röhrchen zur Vermeidung einer Kontamination kurz in Ethanol (70 %ig) getaucht und
anschließend unter der Sterilbank geöffnet. Der Inhalt wurde in 10 ml vorgewärmtes,
supplementiertes RPMI-1640-Medium überführt. Der Anteil des fetalen Kälberserums wurde
auf 20 % erhöht, um den gestressten Zellen das Wachstum zu erleichtern.
Die Kultur wurde bei 200 g für 5 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde in 4 ml
supplementiertem Medium resuspendiert. Nach erneuter Pelletierung wurden die Zellen in 10
ml supplementiertem Medium aufgenommen, in Kulturflaschen überführt und im Brutschrank
kultiviert.
2.2.1.3 Zellzählung
Für die Zellzählung wurde der Zellzähler CASY1 (Schärfe-System) verwendet. Das Gerät
misst mittels einer 150 µm Kapillare den Widerstand der durchfließenden Lösung. Der
Widerstand am Meßpunkt ist vom Volumen und dem phyiologischen Zustand der Zellen
abhängig. Der Messbereich wurde so gewählt, daß Verfälschungen durch Fremdpartikel
weitgehend ausgeschlossen werden konnten. Lebende Zellen der Zellinien B95-8 und Raji
sind zwischen 8-20 µm groß. Die Messung erfaßt die Lebendzellzahl, da die abgestorbenen
Zellen eine vergleichsweise geringe Widerstandsänderung verursachen. 50 µl der zu
quantifizierenden Zellsuspension wurden in 10 ml isotoner Salzlösung (CASYton, Schärfe-
System) verdünnt und gemessen.
16
2.2.2 Methoden rekombinanter DNA-Technologie
2.2.2.1 Plasmidpräparation aus Bakterienzellen
Für eine schnelle Isolierung kleinerer Plasmid-DNA-Mengen (bis zu 10 µg) war eine
Minipräparation ausreichend, bei größeren Plasmid-DNA-Mengen war eine Maxipräparation
erforderlich.
Bei beiden Verfahren erfolgte die Auflösung der Zellwände durch alkalische Lyse. Das Lysat
wurde mit RNase A behandelt, um die RNA abzubauen und die Zellreste, wie auch die
chromosomale DNA, wurden ausgefällt.
Die Minipräparation wurde durchgeführt wie in der Gebrauchsanleitung des High Pure
Plasmid Isolation Kit (Roche) beschrieben. Der Überstand wurde auf eine Nukleinsäure-
bindende Säule transferiert, an die Nukleinsäuren in Gegenwart von Puffern mit hoher
Salzkonzentration binden. Nach einigen Waschschritten, die nötig sind, um die Salze,
Proteine, RNA und andere zelluläre Kontaminationen zu eliminieren, kann die Plasmid-DNA
mit einem Puffer von geringer Salzkonzentration eluiert werden.
Zur Plasmid-Maxipräparation wurden Säulen der Firma Qiagen verwendet. Hier wurde die
aufgeschlossene Zellsuspension in einer gering konzentrierten Salzlösung an eine Säule
gebunden. RNA, Proteine und die Zellreste wurden mit hoch konzentriertem Salzpuffer
eluiert. Anschließend wurde die DNA durch Zugabe eines Eluationspuffers gewonnen.
2.2.2.2 Nukleinsäurepräparation aus eukaryontischen Zellen
Zur Isolation der Gesamt-DNA eukaryontischer Zellen wurde das QIAamp Blood Kit
(Qiagen) verwendet, zur Isolierung der Gesamt-RNA das RNeasy Mini Kit (Qiagen).
Nach der Zellyse wurde die DNA an eine Säule gebunden. Verschiedene Waschschritte
eliminierten Proteine und RNA. Anschließend konnte die DNA mit Wasser eluiert werden.
Die Durchführung folgte den Herstellerempfehlungen.
Für die RNA-Isolierung wurden 106 der zu untersuchenden Zellen zunächst zentrifugiert. Das
Pellet wurde in einen Puffer resuspendiert, der ß-Mercaptoethanol enthielt, um die RNasen zu
inhibieren. Zur Zellyse wurden die Zellen auf eine QIAshredder Säule (Qiagen) aufgebracht.
Anschließend wurde das Zellysat auf eine Nukleinsäure-bindende Säule transferiert. Nach
einigen Waschschritten zur Eliminierung von DNA und Verunreinigungen konnte die RNA
mit DEPC Wasser eluiert werden. Um Kontaminationen mit RNasen zu vermeiden, wurden
17
die ganze Zeit über auch hier Handschuhe getragen und doppelt autoklavierte Pipettenspitzen
verwendet. Es wurde nach Herstellerangaben gearbeitet.
2.2.2.3 Konzentrationsbestimmung von DNA und RNA
Die Messung der DNA- und RNA-Konzentrationen erfolgte photometrisch (Pharmacia
Biotech) bei 260 nm.
Eine Extinktion von 1,0 entsprach einer DNA- Konzentration von 50 µg/ml oder einer RNA-
Konzentration von 40 µg/ml.
2.2.2.4 Spaltung der DNA mit DNase I
Nach der RNA-Isolierung verbleibt immer noch eine kleiner Rest DNA im Eluat, der die
Probe bei weiteren Analysen z.B. RT-PCR stören könnte. Um diese DNA zu spalten, wurde
die Probe in Gegenwart von DNase inkubiert.
DNase I ist eine Doppelstrang-spezifische Endonuklease. Nach Zugabe von DNase I und
DNase-Puffer, gemäß dem unten stehenden Pipettierschema, wurde die Probe 45 Minuten bei
37 °C inkubiert; im Anschluß daran wurde das Enzym 10 Minuten bei 95 °C denaturiert.
Pipettierschema:
RNase Inhibitor 2 µl
10x DNase Puffer 4 µl
DNase (1:10) 2 µl
RNase freies Wasser 2 µl
Probe 30 µl
2.2.2.5 DNA-Präzipitation
Zur Reinigung, Konzentrierung und/oder Umpufferung wurde eine DNA-Fällung durch-
geführt.
Dazu wurde die DNA-Lösung mit 0,1 Volumen 3M Na-Acetat-Lösung und 2 Volumen
eiskaltem absoluten Ethanol gemischt. Nach einer 20 minütigen Inkubationszeit bei –20 °C
18
wird die gefällte DNA bei 13000 rpm für 20 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand
wird dekantiert und das Pellet mit Ethanol (70 %ig) gewaschen. Es folgt eine Zentrifugation
für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend wurde das Pellet in TE-Puffer
resuspendiert.
TE-Puffer:
Tris 1 M 10 ml
Na2EDTA 0,5 M 2 ml
Aqua bidest. ad 1000 ml
2.2.2.6 Spaltung von DNA mit Restriktionsenzymen
Zur Identifizierung kann DNA mit Restriktions-Endonukleasen verdaut werden.
Restriktions-Endonukleasen erkennen eine spezifische Basensequenz von vier bis acht Basen
Länge in doppelsträngiger DNA und schneiden sie an einer definierten Stelle innerhalb dieser
Konsensussequenz. Die resultierenden Fragmente haben eine vorhersagbare Größe.
Für einen analytischen Verdau wurde ein Standard-Reaktions-Mix erstellt und 1 Stunde bei
37 °C inkubiert. Die Analyse erfolgte durch Agarose-Gelelektrophorese.
Standard Reaktionsmix:
DNA (200 ng-1µg) x µl
10x Puffer 1 µl
Restriktionsenzyme (10U/µl) 1 µl
Aqua bidest. ad 10 µl
Verwendete Restriktionsenzyme/-Puffer:
Bam H1 MBI Fermentas
Xho I MBI Fermentas
Roter Puffer (10 x) MBI Fermentas
Xho I Puffer (10 x) MBI Fermentas
19
2.2.2.7 Synthese von cDNA
Zur Durchführung der PCR von RNA-haltigen Proben muß die RNA zunächst in cDNA
umgeschrieben werden. Die Reverse Transkriptase katalysiert diese Reaktion.
Die Reverse Transkriptase, eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, synthetisiert einen
homologen DNA-Strang. Zu Beginn der Reaktion bindet ein Primer an die RNA. Dabei
handelte es sich entweder um einen Oligo d(T)-Primer, der an den Poly-A-Schwanz der
eukaryontischen RNA bindet oder um einen Zufallsprimer [pd(N)6], dessen Hexanukleotide
an komplementäre Basensequenzen binden. Für PCR-Reaktionen, die ein Produkt
amplifizieren, das größer als 400 bp ist, wurde die cDNA-Synthese mit Oligo d(T)-Primern
durchgeführt, bei kleineren Produkten mit [pd(N)6]-Primern.
Zunächst wurde die RNA für 10 Minuten bei 65 °C denaturiert. Danach wurde ein Reaktions-
Mix hinzugefügt, der aus den unten angegebenen Komponenten bestand. Die reverse
Transkription (First Strand cDNA Reaction Mix, Pharmacia) lief innerhalb von 1 Stunde bei
37 °C ab.
Reaktionsmix:
Reverse Transkriptase + dNTP 11 µl
Primer 1 µl
DTT (Dithiothreitol) 1 µl
RNA 20 µl
2.2.2.8 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Die PCR bietet eine schnelle und zuverlässige Methode ein spezifisches DNA-Fragment bis
zu einer Größe von 20 kb zu amplifizieren.
Die DNA-Probe wurde mit Taq-DNA-Polymerase, dNTPs und zwei Oligonukleotid-Primern
versetzt, die das gewünschte DNA-Fragment flankieren.
In jedem Zyklus wurden die beiden DNA-Stränge durch Hitze voneinander gelöst, die Primer
banden an die komplementären Positionen in den DNA-Strängen und die DNA-Polymerase
katalysierte die Synthese des komplementären Stranges. Der Gebrauch von hitzebeständiger
DNA-Polymerase, z.B. Taq-Polymerase, ersparte die Notwendigkeit nach jedem
20
Denaturierungsschritt wieder neue Polymerase hinzuzufügen. Jeder einzelne PCR-Zykus
verdoppelte die Anzahl der DNA-Stränge. 20 Zyklen der PCR-Amplifikation erhöhen mit
hoher Spezifität die Anzahl der Zielsequenz um den Faktor 106.
Für die PCR wurde das Taq DNA Polymerase Kit (Qiagen) nach Angaben des Herstellers
verwendet. Alle PCR Reaktionen hatten ein Endvolumen von 50 µl. Die Zusammensetzung
entsprach dem unten aufgeführten Pipettierschema. Die Reaktion wurde in einem
Thermocycler (Biometra) mit heizbarem Deckel (105 °C) durchgeführt.
Pipettierschema:
2,5 mM dNTP 10 µl
10x PCR-Puffer 5 µl
Taq-Polymerase (5 U/µl) 0,5 µl
5´-Primer (20pmol/µl) 1 µl
3´-Primer (20pmol/µl) 1 µl
DNA (~ 100ng) x µl
Aqua bidest ad 50 µl
Thermocycler-Bedingungen für spezifische PCR-Reaktionen:
1. Adenosylhomocystein-Hydrolase-PCR
Das AHCY-Gen kodiert für ein Produkt, das in in-vivo für Methylierungsprozesse
verantwortlich ist.
1. 2min 94°C
2. 1min 94°C
3. 45s 56°C
4. 2min 72°C
5. 7min 72°C
6. ∞ 4°C
35 Zyklen
21
2. Glycerinaldehyd-3-phospatdehydrogenase-PCR
GAPDH ist ein Standard-Gen, das in jeder eukaryontischen Zelle gleichmäßig exprimiert
wird. Seine Expression wird zur Normalisierung der Expression anderer Gene verwendet.
1. 2min 94°C
2. 1min 94°C
3. 45s 56°C
4. 1min 72°C
5. 7min 72°C
6. ∞ 4°C
2. ß-Lactamase-Gen-PCR
Das ß-Lactamase-Gen (Ampicillinresistenz-Gen) ist Teil verschiedener Vektoren. Ist es in der
isolierten DNA vorhanden, dient es als Bestätigung für eine erfolgreiche Transfektion einer
Zelle mit einem Vektor.
1. 2min 94°C
2. 1min 94°C
3. 45s 56°C
4. 1min 72°C
5. 7min 72°C
6. ∞ 4°C
3. BZLF1-PCR
Das BZLF1-Gen, ein Gen des EBV-Genoms, wird während der viralen Latenz nicht
exprimiert. Der Nachweis seiner Expression ist ein Zeichen für die Reaktivierung des Virus
und den Übergang in den lytischen Zyklus.
1. 2min 94°C
2. 1min 94°C
3. 1min 57°C
4. 1min 72°C
5. 7min 72°C
6. ∞ 4°C
35 Zyklen
35 Zyklen
40 Zyklen
22
4. BHRF1-PCR
Ein EBV-kodiertes Gen, das während viralen Latenz als lytisches Transkript inaktiv bleibt.
Der Nachweis seiner Expression ist ein Zeichen für die Virus-Reaktivierung.
1. 2min 94°C
2. 1min 94°C
3. 30s 55°C
4. 1min 72°C
5. 7min 72°C
6. ∞ 4°C
5. Semiquantitative AHCY-/GAPDH-PCR
Nach der „Primerdropping“-Methode wurde die GAPDH-Expression nachgewiesen. Zur
Durchführung siehe bitte Wong,1994.
Die AHCY-Primer lagen bereits bei Beginn der PCR in der Lösung, zu Beginn des Zyklus 4
wurde pro PCR-Gefäß 1 µl GAPDH-Primer A und 1 µl GAPDH-Primer B (jeweils 20
pmol/µl) hinzugefügt.
1. 2min 94°C
2. 1min 94°C
3. 45s 56°C
4. 2min 72°C
5. 7min 72°C
6. ∞ 4°C
2.2.2.9 PCR mit dem Light-Cycler
Der Light-Cycler besteht aus zwei Komponenten: der Cycler-Komponente und der
Fluorimeter-Komponente. Diese beiden Teile arbeiten zusammen, um Anwendungen wie
Produktanalyse, Quantifizierung und Mutationsanalyse zu vereinfachen. Anders als bei einem
normalen PCR-Gerät, dessen Zyklen mehrere Stunden brauchen, benötigt die Amplifikation
im Light-Cycler nur etwa 30 Minuten.
Die Reaktionen fanden in einer Glaskapillare statt. Ihr optimiertes Oberflächen-Volumen-
Verhältnis garantierte sehr schnelle Temperaturanpassungen innerhalb des Reaktions-
gemisches. Im Ergebnis bedeutete dies, daß ein Zyklus ungefähr 30-45 sec dauerte.
40 Zyklen
28 Zyklen
23
SYBR Green I ist eine Substanz, die spezifisch an doppelsträngige DNA bindet und
fluoresziert. Sie ermöglichte eine Quantifizierung des Amplifikats. Um das Amplifikat zu
charakterisieren, wurde nach dem Amplifikationsprozeß eine Schmelzpunktanalyse
durchgeführt. Der Schmelzpunkt ist für jedes PCR-Produkt charakteristisch.
Für die Amplifikation von DNA im Light-Cycler wurde der Light-Cycler Fast Start DNA
Master SYBR Green I Kit (Roche) benutzt. Dieses Kit beinhaltete einen gebrauchsfertigen
Schnellstart-Reaktions-Mix mit Schnellstart-Taq-Polymerase und doppelstrang-DNA-
spezifische SYBR Green I –Lösung für die Markierung des Amplifikats.
Die Schnellstart-Taq-Polymerase ist eine modifizierte Form der hitzestabilen Taq-DNA-
Polymerase, die bei Raumtemperatur inaktiv ist, da temperatursensitive Antikörper das
Zentrum des Enzyms blockieren. Das modifizierte Enzym wurde durch Denaturierung der
Antikörper bei hohen Temperaturen aktiviert.
Der Master Mix wurde mit den DNA-Proben gemischt und in Light-Cycler-Kapillaren
überführt, die mit einem Stopfen verschlossen wurden. Die Proben wurden für 30 Sekunden
bei 2000 rpm (Eppendorf, Labfuge) zentrifugiert, bevor sie in den Rotor des Light Cycler-
Instrumentes gesetzt wurden.
In dieser Untersuchung wurden folgende Primer eingesetzt: LFA1 3’ und -5’, RAI 3’ und -5’,
L6/TAX 3’ und –5’, G(S)α 3’ und –5’, PUF 3’ und -5’, TOB 3’ und -5’, MCH4 3’ und -5’,
TRAF3 3’ und -5’ und SOD1 3’ und -5’. Diese Primer wurden aufgrund früherer
Erkenntnisse gewählt, wobei das Gangliosid LM1 die Transkription der genannten Gene in
Lymphomzellen modulierte (Schaade et al., 1999).
Die gewählten Annealingtemperaturen ergeben sich aus folgender Formel (Thein & Wallace,
1986):
Annealing-Temperatur [°C]: Tm= 2°C (Anzahl der [A+T]) + 4°C (Anzahl der [G+C])
Mastermix:
SYBR Green I 2 µl
5´-Primer (10 pmol/µl) 1 µl
3´-Primer (10 pmol/µl) 1 µl
MgCl2 0,8 µl (= 2 mM Endkonzentration)
Template DNA x µl
Steriles Wasser ad 20 µl
24
40 Zyklen
Bei der GAPDH-PCR mußte die MgCl2-Konzentration auf 1,6 µl (=3 mM Endkonzentration)
adaptiert werden.
Light-Cycler-Bedingungen:
1. 10 min 95°C Aktivierung der Taq-Pol.
2. 0 s 95°C Denaturierung von DNA
3. 10 s 55-58 °C Primer-abhängige Annealingtemperatur
4. 13-59 s 72°C Produkt-abhängige Elongationszeit
5. 0 s 95°C
6. 10 s 65°C Beginn der Schmelzkurve
7. 0 s 95°C Temperatur steigt in 0,2°C Schritten bis 95°C
8. 1 min 40°C Kühlphase
2.2.2.10 Sequenzieren von DNA
Zur eindeutigen Identifizierung eines amplifizierten DNA-Fragmentes ist eine DNA-
Sequenzierung geeignet.
Zu Beginn vervielfältigt das Enzym DNA-Polymerase die komplementären Kopien der DNA,
die sequenziert werden sollen. Diese DNA wird als Ausgangsstrang gebraucht. Die DNA-
Polymerase vereint vier Deoxynukleotid-Triphosphate (dNTP´s), dATP, dCTP, dGTP und
dTTP zu einem komplementären Polynukleotid-Strang, der sich in 5´-3´-Richtung verlängert.
Der Startpunkt ist die freie 3´-OH-Position des Primers. Des weiteren wird ein wenig 2´,3´-
Dideoxynukleosid-Triphosphat (ddNTP) von jeder Base hinzugefügt. Wird die Dideoxy-Base
in die sich verlängernde Polynukleotid-Kette eingebaut, anstelle des korrespondierenden
Deoxynukleotids, kommt es zum Kettenabbruch. Es wird nur wenig ddNTP eingesetzt, so daß
durch statistischen Kettenabbruch an jeder Basenposition eine ganzen Reihe unterschiedlich
langer Ketten gebildet werden. Für die spezifische Detektion ist jedes der 4 ddNTP´s kovalent
an ein unterschiedlich fluoreszierenden Chromophor gekoppelt.
Die Fragmente wurden entsprechend ihren Längen in der Gel-Elektrophorese aufgetrennt und
die endständige Base wurde über ihr charakteristisches Fuoreszenzspektrum identifiziert.
25
Für die Sequenzierung wurde das ABI Prism BigDye Terminator Ready Reaction Kit
verwendet. Die Sequenz-Reaktion wurde im Performance Optimised Polymer 6´(POPTM-6)
im ABI-Prism Sequencer (310 Genetic Analyser) aufgetrennt.
Terminator Ready Reaktionsmix:
- A-Terminator markiert mit dichloro[R6G]
- C-Terminator markiert mit dichloro[ROX]
- G-Terminator markiert mit dichloro[R110]
- T-Terminator markiert mit dichloro[TAMRA]
- Desoxynucleosid Triphosphat (dATP, dCTP, dTTP, dGTP)
- Taq-DNA Polymerase, MgCl2, Tris/HCl-Puffer, pH 9,0
Reaktionsmix:
Terminator Ready Reaktionsmix 8 µl
Sequenzierungsprimer [3´ or 5´] (3,2 pmol/µl) 1 µl
Doppelsträngige DNA (200-500 ng) x µl
Deionisiertes Wasser ad 20 µl
Thermocycler Bedinungen:
1. 2 min 96°C
2. 30 s 96°C
3. 15 s 50°C
4. 4 min 60°C
Nach der Reaktion wurde das Produkt über Nacht gefällt (s. 2.2.2.5), entsprechend der
Hersteller-Empfehlung, um überschüssige Nuleotid-Lösungen zu entfernen. Anschließend
wurde 20 Minuten bei 14000 rpm (Eppendorf, Labfuge) zentrifugiert, gefolgt von einem
Waschschritt mit 70 %igem Ethanol und einem weiteren Zentrifugationsschritt (5 Minuten,
14000 rpm). Das Produkt wurde für 10 Minuten bei 30 °C im Speed Vac getrocknet und in
24 µl Template Suppression Reagent (TSR) resuspendiert. Anschließend wurden die Proben
gevortext, dann 10 Minuten bei 95 °C denaturiert und sofort auf Eis gekühlt.
25 Zyklen
A
2
D
M
D
e
N
d
G
D
d
l
U
o
s
1
v
A
M
k
u
e
D
u
Terminator Rhodamine Farbstoff Farbe im ABI Prism Elektropherogramm
ddATP dR6G grün
ddCTP dROX rot
ddGTP dR110 blau
ddTTP dTAMRA schwarz
26
bb. 2: Verwendete 2´,3´-Dideoxynukleosid-Triphosphate mit spezifischem Chromophor
.2.2.11 Agarose-Gelelektrophorese
ie Elektrophorese, d.h. die gerichtete Bewegung von Ionen im elektrischen Feld, ist eine
ethode zur Trennung biologischer Moleküle. Agarosegele haben eine definierte
urchlässigkeit für Moleküle. Die molekulare Auftrennung geschieht durch Gelfiltration in
inem elektrischen Feld.
ach einer DNA-Spaltung oder einer PCR ist es wichtig, die resultierende Fragment-Größe
er DNA zu bestimmen. Für Fragment-Längen zwischen 1 – 15 kb wurden 0,8 %ige TAE-
ele verwendet, für kleinere Fragmente wurden 1,5 %ige TBE-Gele verwendet.
oppelsträngige DNA wurde durch planare, aromatische Kationen sichtbar gemacht, wie z.B.
as Ethidium-Ion, das in die α-Helix der DNA interkaliert und unter UV-Licht sichtbar
euchtet.
m Gele herzustellen, wurden 4 bzw. 7,5 g Agarose abgewogen und in 500 ml 1 x TAE-
der 0,5 x TBE-Puffer suspendiert. In einer Mikrowelle wurde die Suspension gekocht bis
ich die Agarose vollständig gelöst hat. Vor der Zugabe von Ethidium-Bromid (Stammlösung
0 mg/ml) mußte die Agarose-Lösung auf 65 °C abkühlen. Es wurde eine Endkonzentration
on 0,1 µg/ml Ethidium-Bromid-Gel eingestellt.
nschließend wurde das flüssige Gel in eine Gelkammer mit Kamm gegossen. Nach 15
inuten war Gel soweit ausgehärtet, daß es in die Elektrophorese-Kammer gegeben werden
onnte, die entsprechend dem Gel mit 1 x TAE oder 0,5 x TBE-Puffer befüllt war. Die
nterschiedlichen Puffer optimierten das Laufverhalten und die Auftrennung der DNA im
lektrischen Feld.
ie Proben und ein DNA-Marker wurden im Verhältnis 1:10 mit 10 x Blau-Marker gemischt
nd in die Taschen des Gels pipettiert. Die Elektrophorese lief bei Raumtemperatur mit einer
Spannung von 5 Volt/cm Elektrodenabstand bis eine gute Auftrennung erreicht wurde. Im
Anschluß an die Elektrophorese wurde das Gel zur Dokumentation unter UV-Licht
fotografiert.
1x TAE-Puffer (Tris-Acetat/EDTA):
Tris 40 mM
Essigsäure 40 mM
EDTA 1 mM
0,5x TBE-Puffer (Tris-Borat/EDTA):
Tris 45 mM
Borsäure 45 mM
EDTA 1 mM
10x Blaumarker: Ficoll 10 % (w/v)
Bromphenolblau 0,25 % (w/v)
Xylemcyanol 0,25 % (w/v)
EDTA 0,25 M
2.2.2.12 Konstruktion eines Expressionsvektors für AHCY in eukaryontischen Zellen
Die Klonierung wurde mit Hilfe des EchoTM-Cloning-Systems (Invitrogen) durchgeführt.
Dieses System basiert auf dem Univector-Plasmid-Fusion-System (UPS), das schnell und
einfach das interessante Gen mit einem Akkzeptorvektor rekombiniert. Es wird eine
einschrittige Klonierungsstrategie genutzt, um das PCR-Produkt in einen entsprechenden
Plasmidvektor einzusetzen, aus dem damit der Donorvektor entsteht (s.Abb.3).
Abb. 3: EchoTM Clonin
27
g System (Cre-lox seiten-spezifische Rekombination)
28
Zur Konstruktion des Expressionsvektors wurden 4 µl des AHCY-PCR-Produktes aus der
präparativen PCR in das Echo-Cloning-System entsprechend der Herstellerangaben
eingesetzt.
Zunächst wurde durch Ligation des AHCY-PCR-Produkts in den Vektor pUni/V5-His-TOPO
der Donorvektor pUni-AHCY konstruiert und in E.coli PIR1 selektiert. Der durch Plasmid-
Minipräparation hergestellte Vektor pUni-AHCY wurde mit dem Akzeptorvektor pcDNA3.1-
E in Gegenwart von Cre-Rekombinase inkubiert. Über die Cre-lox-Sequenzen, die auf Donor-
und Akzeptor-Vektor vorhanden sind, kam es zur sequenzspezifischen Rekombination
zwischen beiden Vektoren und es entstand der Fusionsvektor pcDNA-AHCY, bei dem das
AHCY-Gen unter die Kontrolle eukaryontischer Promotor-Sequenzen geriet, die auf dem
Akzeptorvektor kodiert waren. Die Selektion des erfolgreich fusionierten Plasmids pcDNA-
AHCY geschah nach Transfektion von E.coli-TOP 10-Zellen auf Kanamycin-haltigem
Nährboden: Der Donorvektor allein konnte aufgrund seines ungeeigneten
Replikationsursprungs nicht in E.coli-TOP 10 repliziert werden. Der Akzeptorvektor wies
keine Kanamycin-Resistenz auf. Bakterien, die diesen Vektor enthalten, werden ausselektiert.
Nur der Vektor pcDNA-AHCY wies nach der Fusion von Donor- und Akzeptorvektor einen
geeigneten Replikationsursprung und eine Kanamycin-Resistenz auf und konnte so selektiert
werden.
2.2.2.13 DNA Transfektion durch Elektroporation
Bei der Elektroporation werden eukaryontische Zellen kurzen elektrischen Impulsen
ausgesetzt. Diese elektrischen Impulse führen zu nanometergroßen Poren in der
Plasmamembran. Die DNA diffundiert direkt durch diese Poren in das Zellcytoplasma. Diese
Methode ist sehr effektiv und kann sowohl für transiente als auch für stabile Transfektionen
genutzt werden.
Für diesen Vorgang wurden 107 Zellen 10 Minuten bei 1600 rpm (Heraeus Christ, Labfuge)
zentrifugiert. Nach zwei Waschschritten mit je 10 ml PBS (s. 2.2.3.2) wurde das Pellet in 500
µl PBS resuspendiert und mit 20 µl DNA vermischt und in eine Elektroporationsküvette
(Elektrodenabstand 0,4 cm) überführt. Die Probe wurde eisgekühlt.
Das Elektroporationgerät wurde auf 625 V/cm Elektrodenabstand und 500 µF eingestellt, die
Küvette wurde zwischen die Elektroden plaziert und der Impuls ausgelöst. Nach dem
elektrischen Impuls wurde die Küvette schnell mit 1 ml vorgewärmten Medium (RPMI 1640
mit Zusätzen, s.2.2.1.2) versetzt. Nach 5 minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden
29
die Zellen in Zellkulturflaschen überführt und es wurde mehr Medium (maximal 18 ml)
zugefügt. Anschließend wurde bei 37 °C inkubiert.
2.2.3 Immunologische Methoden
2.2.3.1 Bestimmung der DNA-Syntheserate
Die Zellvermehrung ist mit der Replikation genomischer DNA verbunden, so daß die DNA-
Neusynthese als Parameter für die Zellproliferation und auch für die Regulation der DNA-
Synthese verwendet werden kann.
Um die DNA-Syntheserate zu bestimmen, wurde ein Cell Proliferation ELISA verwendet.
Das Verfahren beruht auf dem Einbau von 5-Bromo-2´-Deoxyuridin (BrdU) in die
genomische DNA sich teilender Zellen. Das BrdU kann immunologisch detektiert werden.
Die 1 x 105 Raji-Zellen/Mikrotiterplattenvertiefung wurden für 2 Stunden mit einer BrdU-
Lösung versetzt. BrdU wurde statt Thymidin in die neu synthetisierte DNA eingebaut. Dann
wurde das Medium entfernt, die Zellen fixiert und die DNA wurde durch Zugabe einer
Fixierungs- und einer Denaturierungslösung in einem Schritt denaturiert. Ein Anti-BrdU-
POD-Antikörper mit Substrat wurde hinzugefügt, der das eingebaute BrdU band. Diese
Reaktion wurde mit einer Stopplösung versetzt. Das Reaktionsprodukt wurde durch eine
Absorptionsmessung mit einem Spektrophotometer (Modell: Scanning Multiwell, BioTek
Instruments) bei 430 nm quantifiziert. Alle Arbeitsschritte wurden entsprechend der
Herstellerangaben durchgeführt.
2.2.3.2 Immunfluoreszenz-Test (IFT)
Immunfluoreszenz-Teste sind für den mikroskopischen Nachweis von Antigenen in
histologischen und zytologischen Präparaten oder von Antikörpern in Seren gut geeignet.
Beim direkten IFT werden Zellen auf einem Objektträger (OT) fixiert und mit einem
Antikörper überschichtet, der an das gesuchte Antigen bindet. Durch Fluoreszenzmarkierung
können die Immunkomplexe mit dem Fuoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden.
Dieses Verfahren wurde zum Nachweis des frühen Antigens “early antigen” (EA) eingesetzt.
Zunächst wurde mit einem Anti-EA-Antikörper (Maus) inkubiert, der dann im nächsten
30
Schritt mit dem fluoreszenzmarkierten Anti-Maus-Antikörper (Kaninchen) sichtbar gemacht
wurde.
Zunächst wurden 105 Zellen der zu untersuchenden Raji-Population gewonnen und durch
Zentrifugation bei 1600 rpm für 10 Minuten präpariert. Nach zwei Waschschritten mit PBS,
wobei die Zellen in jeweils 1 ml PBS aufgenommen, leicht geschüttelt und erneut
zentrifugiert worden sind, wurde das Pellet in 100-200 µl PBS resuspendiert. Die
Zellsuspension wurde auf absolut fettfreie OT pipettiert, wobei die Zelldichte unter dem
Mikroskop kontrolliert wurde. Die Zellen sollten dicht aneinander liegen, aber nicht
überlappen. Die OT wurden mindestens 30 Minuten luftgetrocknet. Vorgekühltes Aceton
diente der Fixierung der Zellen auf dem OT. Nach 10 Minuten bei –20 °C wurden die OT bei
Raumtemperatur vollständig luftgetrocknet.
Der 1. AK, der gegen das gesuchte Antigen gerichtet war, wurde im Verhältnis 1:500 in PBS
verdünnt. 10 µl dieser Antikörperlösung wurden in jede OT-Öffnung pipettiert. Es folgte eine
30 minütige Inkubationszeit in einer feuchten Kammer bei 37 °C. Anschließend wurden die
OT dreimal mit PBS gewaschen, wobei die OT aufrecht in ein PBS-gefülltes Gefäß gegeben
und 5 Minuten leicht geschüttelt wurden. Die OT wurden durch Absaugen der überschüssigen
Flüssigkeit mit Saugpapier leicht getrocknet.
Der 2. AK, der gegen den primären Antikörper gerichtet war, war fluoreszenzmarkiert. Er
wurde geeignet in PBS verdünnt und 10 µl dieser Antikörperlösung pro OT-Öffnung
aufgetragen. Die Inkubationszeit betrug 30 Minuten bei 37 °C in einer feuchten Kammer. Es
schlossen sich drei weitere Waschschritte an (s.o.), im letzten Waschschritt wurden 50 µl
eines Kontrastmittels (Evans Blue) hinzugefügt.
Anschließend wurden die OT mit Anti-Fading-Lösung und einem Deckglas bedeckt. Die OT
liessen sich für mehrere Tage bei –20 °C aufbewahren.
Early Antigen:
1. Anti-EA-D (R3), Maus 1:500 in PBS
2. Anti-Maus IgG-FITC, Kaninchen 1:20 in PBS
PBS:
NaCl (w/v) 8 g
KCl (w/v) 0,2 g
31
Na2HPO4 (w/v) 1,44 g
KH2PO4 (w/v) 0,24 g
Aqua bidest. ad 1000 ml (pH 7,4)
Anti-FadingLösung:
p-Phenyldiamin 0,1% (w/v) 100 mg
Glycerin 90% (v/v) 90 ml
PBS (pH 7,2) 10% (v/v) 10 ml
Bicarbonat Puffer (pH 9,0), 0,5 M ad pH 8,0
2.2.3.3 Proteinisolierung aus eukaryontischen Zellen
Es wurden 1 x 106 Raji-Zellen zentrifugiert und 2 x mit PBS gewaschen (5000 rpm, 15
Minuten , Eppendorf-Zentrifuge 5415 C).
Dem Zellpellet wurden 100 µl Lysispuffer hinzugefügt, anschließend wurden die Zellen
resuspendiert. Es folgten 3 Einfrierzyklen (-70 °C/ Raumtemperatur). Vollständig
desintegriert wurde das Zellysat im Ultraschallbad für 10 Minuten. Anschließend wurde der
Zelldebris durch Zentrifugation (14000 rpm, 5 Minuten) abgetrennt und der Überstand bei
–20 °C gelagert.
Lysispuffer:
Harnstoff 9,5 M 28,53 g
Nonidet P-40 2 % (w/v) 1 ml
β-Mercaptoethanol 5 % (w/v) 2,5 ml
Aqua bidest ad 50 ml
2.2.3.4 Western Blot
Mit dem Blot (Towbin et al, 1979) werden Gel-elektrophoretisch aufgetrennte Antigene von
einem Gel auf eine Trägermembran transferiert und dort fixiert. Proteine von Interesse können
anschließend nachgewiesen werden.
Die zu untersuchenden Proben wurden in der SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (s.
2.2.3.4.1) aufgetrennt und auf eine Trägermembran transferiert. Die Membran wird
32
anschließend mit einem unmarkiertem Antikörper versetzt, der spezifisch ist für das
Zielprotein. Der so gebundene Antikörper wird durch einen zweiten Meerrettich-Peroxidase-
markierten Antikörper (s. 2.2.3.2) sichtbar gemacht.
2.2.3.4.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Das Polyacrylamid-Gel (PAGE) polymerisiert durch eine radikal-induzierte Reaktion von
Acrylamid und N,N´-Methylenbisacrylamid. Die freien Radikale entstehen durch den
chemischen Zerfall von Ammoniumpersulfat. Der Gellösung wurde N,N,N´,N´-
Tetramethylethylendiamin (TEMED) hinzugefügt, um die freien Radikale zu stabilisieren.
Die physikalischen Gegebenheiten des Gels und seine Porengröße werden durch die Menge
des Polyacrylamides und durch das Mengenverhältnis der Komponenten zueinander
bestimmt.
Ammoniumpersulfat wurde bei –20 °C gelagert und durfte erst kurz vor Gebrauch aufgetaut
werden. Alle anderen Lösungen waren sterilfiltriert bei 4 °C lagerbar.
Folgenden Lösungen wurden benötigt:
Acrylamidstammlösung:
Acrylamid (2x) 30 % (w/v)
Bisacrylamid (2x) 0,8 % (w/v)
Trenngelpuffer:
Tris/HCl (pH 8,8) 1,5 M
SDS 0,4 % (w/v)
Sammelpuffer:
Tris/HCl (pH 6,8) 0,5 M
SDS 0,4 % (w/v)
Ammoniumpersulfat:
Ammoniumpersulfat 10 % (w/v) [aliquotiert bei –20°C gelagert]
Probenpuffer (denat. 2x):
Tris/HCl (pH 6,8) 125 mM 514 g
SDS 4 % (w/v) 0,4 g
Glycerin 20 % (v/v) 2 ml
β-Mercaptoethanol 10 % (v/v) 1 ml
Bromphenol Blau 0,03 % (w/v) 0,008 g
DTT 10 % (w/v)
Aqua bidest ad 10 ml
Elektrophoresepuffer (10x):
Tris 0,25 M 60,55 g
Glycin 1,9 M 285,27 g
SDS 1 % (w/v) 20 g
Aqua bidest ad 2000 ml
Für die Auftrennung denaturierter Proteine wurde ein 13 %iges Polyacrylamid (PAA) -Gel
verwendet.
Sammelgel: 5 % (w/v) Polyacrylamid
2,5 ml Acrylamid Stammlösung
3,75 ml Sammelpuffer (4x)
8,7 ml Aqua bidest
15 µl TEMED
100 µl Bromphenolblau
75 µl Ammoniumpersulfat
Trenngel:
5% (6 Gele, 0,75mm) Polyacrylamid
2,5 ml
3,75 ml
8,7 ml
15 µl
100 µl
Acrylamid Stammlösung
Sammelpuffer (4x)
Aqua bidest.
TEMED
Bromphenolblau
75 µl Ammoniumpersulfat
13% (6 Gele, 0,75mm)
Polyacryamid
16 ml
9,4ml
11,65 ml
30 µl
50 µl
250 µl
Acrylamid-Stammlösung
Trenngelpuffer (4x)
Aqua bidest.
TEMED
Bromphenolblau (1%(w/v))
33
Ammoniumpersulfat
Abb. 4: Gelkammer
Die Trenngelmischung wurde unter leichte
Wasserstrahlpumpe entgast, bis keine Luftbläsc
durch Zugabe von Ammoniumpersulfat der Poly
wurde in die Gelkammer gegossen. Die Oberfläc
überschichtet, um einen Luftabschluß zu erreichen
Methanollösung konnte nach ca. 30 Minuten abg
cm bei einer Schichtdicke von 0,75 mm.
Die Sammelgellösung wurde ebenfalls entga
zugegeben wurde, wurde das Gel auf das po
sprechende Gelkamm wurde eingesteckt. Nach
beendet und die fertigen Gele konnten aus de
längerfristige Aufbewahrung wurden die Gele i
Austrocknung zu verhindern und bei 4 °C gelagert
Die Gele wurden vorsichtig mit Wasser abgewasc
in die Elektrophoresekammer eingesetzt. Die Ano
1 x Elektrophoresepuffer befüllt. Die Kämme wurd
Die zu analysierende Proteinlösung wurde aus Ra
mechanischen Zerstörung der Zellen wurde das L
mit SDS-Probenpuffer gemischt, dem vorher no
worden war. Diese Mischung wurde für 10 Minu
mit einer Hamilton-Spritze auf das Gel aufgetrage
Vorderplatte
Rückplatt34
m Schwenken 2 Minuten mit einer
hen mehr aufstiegen. Anschließend wurde
merisierungsprozeß gestartet. Das Gemisch
he des Gels wurde mit 20%igem Methanol
und eine glatte Oberfläche zu erhalten. Die
egossen werden. Die Gelgröße betrug 7 x 9
st. Nachdem das Ammoniumpersulfat
lymerisierte Trenngel gegossen. Der ent-
ca. 20 Minuten war die Polymerisation
m Behälter genommen werden. Für eine
n feuchtes Papier eingeschlagen, um eine
.
hen, um Gelrückstände abzulösen und dann
den- und die Kathodenkammer wurden mit
en vorsichtig entfernt.
ji-Zellen aufgereinigt (s. 2.2.3.3). Nach der
ysat sowie ein entsprechender Marker 1:1
ch 10 % Dithiothreithol (DTT) zugesetzt
ten bei 95 °C erwärmt. Die Proben wurden
n. Die Elektrophorese lief mit 20 mA/Gel.
Kamm
Spacer
Die Elektrophorese war beendet, wenn die Bromphenolblaufront aus dem unteren Rand des
Gels austrat. Die Glasplatte wurde vorsichtig mit einem Sklapell abgelöst und die
Abstandhalter entfernt. Das Gel konnte nun weiterverarbeitet werden (s.2.2.3.4.2).
2.2.3.4.2 Elektroblot
Nach der SDS-PAGE (s.2.2.3.4.1) wurden die Proteine mittels eines elektrophoretischen
Transfers vom Gel auf eine Nitrocellulose-Membran überführt. Dafür wurde das Gel so
plaziert, daß die eine Gelseite direkten Kontakt mit dem Nitrocellulose-Membran hat. Oben
und unten (im Sandwich-Verfahren, s. Abb. 5) waren Gel und Membran von Whatman 3MM-
Papier, 2 grobporösen Schaumstoffstücken und einer Plastikhalterung umschlossen. Um ein
Überhitzen zu vermeiden, sowie auch Luftblasen zwischen Gel und Membran, wurde alles
Elektrophorese-Puffer überschichtet (external, Haake K 15).
Das Konstrukt wurde in den Elektrophorese-Behälter gesetzt, der mit Standard-Platin-
Elektroden und Triglycerin-Elektrophorese-Puffer (pH 8,3) versehen ist. Die Nitrocellulose
(NC)-Membran wird dabei in Richtung der Anode eingesetzt. Über Nacht wandern die
Proteine im elektrischen Feld bei 20 V und 400 mA zur Anode und bleiben an der
Blotmembran haften.
Blot Puffer:
Tris 25 mM (w/v) 12,1 g
Glycin 192 mM (w/v) 57,7 g
Methanol 10 % (w/v) 400 ml
Aqua bidest ad 4000 ml
Anode
Schaumstoff
Whatman 3MM-Papier
Nitrocellu-lose Filter
KathodeSchaumstoff-matte
Whatman 3MM-Papier
Gel
Abb.5: Schematische
Darstellung einer Elektro-
bloteinrichtung
35
36
2.2.3.4.3 Färbung der Proteine mit Ponceau S
Die Protein-Färbung mit Ponceau S-Lösung (Serva, 0,2% Ponceau S in 3%
Trichloressigsäure) wird benutzt, um Proteine auf der Nitocellulose-Membran (NC) sichtbar
zu machen. Die Ponceau S-Markierung ist reversibel und kann unter fließendem Wasser
abgewaschen werden. Diese Substanz stört weder die Antikörperbindung, noch die Funktion
der Meerrettich-Peroxidase beim anschließenden Immunblot.
Für die Proteinfärbung mit Ponceau S sollte die NC-Membran feucht sein und für 2-3
Minuten unter leichtem Schütteln in der Lösung inkubiert werden. Sobald die Proteinbanden
sichtbar wurden, wurde die Färbung durch kurzes Waschen mit Wasser gestoppt. Um mit den
immunologischen Verfahren fortzufahren, sollte das Ponceau-Rot durch Waschen unter
fließendem Wasser entfernt werden.
2.2.3.4.4 Immunblot
Zur Hintergrundabsättigung wurde die Membran für 30 Minuten unter leichtem Schütteln in
ein Bad aus PBS mit 10 % FKS gelegt. Anschließend wurde sie für 1 Stunde mit dem
primären Antikörper inkubiert, der gegen das Zielprotein gerichtet war (Anti-AHCY, 1:10000
in PBS mit 10 % FKS). Die Inkubation fand in einer Petrischale statt und wurde unter
leichtem Schütteln durchgeführt. Im Anschluß wurde die Membran herausgenommen und 3 x
für je 5 Minuten mit Waschpuffer gewaschen.
Im nächsten Inkubationschritt wurde ein POD-markierter Antikörper (AK) hinzugefügt. Der
erste Antikörper stammt aus Mäusen, so daß als zweiter Antikörper ein polyklonaler
Kaninchen Anti-Maus-Antikörper verwendet wurde. Die Verdünnung des 2. AK in PBS- mit
10 % FKS betrug 1:1000. Die Inkubation dauerte 1 Stunde und wurde unter leichtem
Schütteln durchgeführt. Es schlossen sich 3 weitere Waschschritte an.
Die Meerrettich-Peroxidase, die an den zweiten Antikörper gebunden war, katalysierte eine
Reaktion, in der das farblose POD-Substrat zu einer farbigen Substanz reduziert wurde, die
das Protein von Interesse lokalisierte. Sobald Banden erkennbar wurden, wurde die Reaktion
mit Wasser gestoppt. Die Membran wurde getrocknet und das Ergebnis dokumentiert.
Waschpuffer:
Tween 20 0,05 % (v/v) 5 ml
PBS ad 1000 ml
37
PBS-:
KH2PO4 [0,2M] 2 mM (v/v) 10 ml
Na2HPO4 [0,2M] 9 mM (v/v) 45 ml
NaCl 180 mM (w(v) 10,52 g
Aqua bidest ad 1000 ml (pH 7,2)
PBS: s. 2.2.3.2
POD-Substrat:
Diaminobenzidinhydrochlorid 2 % (w/v) 2 g
Wasserstoffperoxid (3%) (v/v) 200 µl
PBS- ad 100 ml
2 g Diaminobenzidinhydrochlorid wurden in 100 ml PBS- gelöst und als Stammlösung bei
–20 °C gelagert (in Aliqots zu je 1 ml). Ein Aliqot wurde vor Gebrauch aufgetaut und mit 100
ml PBS- verdünnt. Zur Herstellung einer Gebrauchslösung wurde dieser Verdünnung 200 µl 3
%iges Wasserstoffperoxid hinzugefügt. Die Lösung war einige Tage bei 4 °C stabil.
2.2.3.5 Durchflußzytometrie
Die Durchflußzytometrie wurde mit einem FACSCalibur-Analysen-Gerät (Becton
Dickenson) durchgeführt. Sie dient zur Analyse von Einzelzellen in Suspension auf
Grundlage von Fluoreszenz und Streulichteigenschaften.
Das FACS-Gerät besteht aus einem Flüssigkeitssystem und einem optischen System. Durch
das unter Druck stehende Flüssigkeitssystem werden die Zellen mittels eines Trägerstroms
mit konstanter Geschwindigkeit einzeln an einem Laser vorbeigeführt. Das auftreffende Licht
wird dabei nicht in alle Richtungen gleichmäßig gestreut. Der größte Teil wird entlang des
einfallenden Lichtstrahls gestreut und wird daher als Vorwärtsstreulicht (forward scatter =
FSC) bezeichnet. Da kleine Zellen Licht weniger streuen, stellt das Vorwärtsstreulicht in
erster Linie ein Maß für die Zellgröße dar. Das im rechten Winkel zum einfallenden Licht
gestreute Licht hängt hauptsächlich von der Granularität der Zellen ab und wird als
Seitwärtsstreulicht (side scatter = SSC) bezeichnet.
Darüber hinaus kann der Laser an Antikörper gebundene Chromogene zur Aussendung von
Lichtquanten anregen. Diese werden verstärkt, in elektrische Impulse umgewandelt und von
38
Sensoren detektiert. Dazu werden an verschiedene Oberflächenmoleküle der Zellen
spezifischen Antikörper gebunden, die mit verschiedenen Fluoreszenzstoffen markiert sind.
Dabei erlaubt der hier verwendete FACSCalibur durch einen zusätzlichen Argonlaser eine
gleichzeitige Analyse von vier verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen. Die Ergebnisse können
mit Hilfe der Software CellQuest entweder einzeln im Histogramm oder gegeneinander im
DotPlot aufgetragen werden.
Für diese Analyse wurden mit pcDNA3.1-AHCY-infizierte Raji-Zellen, Positiv- und
Negativkontrolle 5 Minuten bei 1300 rpm (Eppendorf Zentrifuge 5415C, Rotor F-45-18-11)
zentrifugiert. Das Pellet wurde in 600 µl sterilfiltriertem PBS aufgenommen. In drei FACS-
Analysenröhrchen wurden die Antikörper vorgelegt. Dazu wurden jeweils 200µl der in PBS
aufgenommenen Zellen gegeben. Nach Vortexen wurde der Ansatz für 15 Minuten bei
Raumtemperatur im Dunkeln zur Antikörperbindung inkubiert. Zum Entfernen der
ungebundenen Antikörper wurde dem Ansatz anschließend 2 ml sterilfiltriertes PBS
zugegeben, der Ansatz wurde 5 Minuten bei 1300 rpm (Heraeus Sepatech Megafuge 1.0,
Rotor BS4402/A) zentrifugiert und das Pellet in 200 µl sterilfiltriertes PBS aufgenommen.
Eine Lagerung bis zur Analyse erfolgte maximal 12 Stunden bei 4 °C im Dunkeln.
Die Auswahl der zu untersuchenden Oberflächenantigene ergab sich aus Voruntersuchungen,
bei denen normale B-Lymphozyten mit dem EBV infiziert worden waren und so eine
Primärinfektion ausgelöst wurde. Dabei wiesen folgende Oberflächenantigene (s. Abb. 6) eine
verstärkte Aktivität auf (Schaade et al., 1999).
Abb. 6: In der FACS-Analyse untersuchte Oberflächenantigene und ihre Funktion
Oberflächenantigen Funktion
CD11a CD19 CD21 CD23 CD30 CD40 CD44 CD54 CD58
1) Barclay et al., 1997; 2) Lotz5) Imai und Tsujisaki, Prow; 6
Interzelluläre Adhäsion und Kostimulation B-Zellmarker, Komponente des Signaltrans-duktionskomplexes CD19/21/81/leu-13 1) B-Zellmarker, Rezeptor für die Komplement-komponente C3d und EBV Entzündungsfördernde Funktion, bindet die Integrinekomplexe CD11b/18 und CD11c/18 1) Interaktion mit CD153, kostimuliert T-Zellproli- feration2), involviert in T-Zell-vermittelte Apoptose2)
Involviert in Wachstum, Differenzierung und Isotypen-"switchung"3)
Involviert in Bindung an Endothelzellen, induziert Cytokinausschüttung und T-Zellaktivierung, evtl. involviert in Tumormetastasierung4) Interaktion mit CD11a/18 oder CD11b/18, führt zu Immunreaktionen und/oder Entzündungen5) Aktivator von Killerzellen, bindet CD2 6)
39
e, Prow; 3) Gordon et al., Prow; 4) Liao und Pratel, Prow; ) Takeuchi, Prow
3. Ergebnisteil
3.1 Konstruktion eines Expressionsvektors für AHCY
3.1.1 Amplifikation von AHCY durch RT-PCR
In einem ersten Schritt wurde aus RNA von Raji-Zellen die AHCY-Sequenz mittels RT-PCR
amplifiziert. Aus 10 ml einer gut bewachsenen Raji-Zellkultur (ca. 107 Zellen) wurde RNA
isoliert (s.2.2.2.2). Die RNA wurde mit dem pd(N)6–Zufallsprimer in cDNA umgeschrieben
(s. 2.2.2.7). Es folgte eine PCR, bei der AHCY mit den Primern AHCY 5‘ und AHCY 3‘ (s.
2.1.3) amplifiziert wurde (s. 2.2.2.8). Bei der anschließenden Elektrophorese (s. 2.2.2.11)
wurde das PCR-Produkt auf ein 0,8 %iges TAE-Gel aufgetragen und ca. 45 Minuten bei 75
mA aufgetrennt.
Abbildung 7 zeigt die
der AHCY hat eine
Kontroll-DNA-Leiter
Zellen erfolgreich die
1 2 3 4 5
1420 bp
40
Abb.7: AHCY-RT-PCR aus Raji-Zellen
1. Spur: 3 µl Reaktion a
2. Spur: 3µl Parallelreaktion b
3. Spur: Negativkontrolle (Wasser als Template)
4. Spur: 1 kb-Leiter
5. Spur: 100 bp-Leiter
erfolgreiche Amplifikation des Gens AHCYaus Raji-Zellen. Das Gen
Größe von 1420 bp (s. Spur 1), was durch Vergleich mit dem 1 kb-
(s. Spur 4) bestätigt wurde. Das bedeutet, daß in der RNA von Raji-
Gensequenz von AHCY nachgewiesen und präpariert werden konnte.
1636 bp
500 bp
41
3.1.2 Darstellung des Expressionsvektors
3.1.2.1 Konstruktion des Donorvektors
Die Probe mit dem amplifizierten AHCY-Gen wurde in das EchoTM Cloning System
eingesetzt (s.2.2.2.12). Dieser Schritt dient dazu die vorliegende DNA mit Donorvektor, dem
Vektor pUni/V5-His-TOPOR, zu ligieren.
4 µl des PCR-Produktes werden dabei eingesetzt. Der erfolgreich hergestellte Donorvektor
besitzt eine Größe von 2,3 kb (laut Herstellerangaben) plus 1,4 kb des eingeführten AHCY-
Gens.
3.1.2.2 Transformation von E.coli PIR 1-Zellen mit dem pUni/V5-His-TOPO-Vektor
Der darzustellende Donorvektor, pUni/V5-His-TOPOR, mit einem innenliegenden
Kanamycin-Resistenz-Gen, wurde in E.coli-Zellen des Stammes PIR 1 transformiert (s.
2.2.2.12). Dieser Stamm besitzt das mutante 116 pir-Allel, das die Anzahl der Plasmidkopien
auf 250 Kopien/Zelle anhebt.
Selektiert wurde auf LB-Platten mit 50 µl/ml Kanamycin. Es wurden ca. 20 Kolonien pro LB-
Platte festgestellt. Anschließend erfolgte die DNA-Isolierung (s. 2.2.2.2) der selektierten
Kolonien. Die gereinigte DNA wurde nacheinander mit zwei Restriktions-Enzymen
geschnitten, da die verwendeten Enzyme bei verschiedenen Pufferbedingungen optimal
arbeiten. Zunächst wurde mit der Restriktionsendonuklease BamH1 (s.2.2.2.6) an Position
511 bp der AHCY-Gensequenz geschnitten. G/gatcc lautet die Basensequenz, die von diesem
Enzym erkannt wird. Vor dem zweiten Endonuklease-Verdau mit Xho I wurde eine Ethanol-
Fällung durchgeführt (s.2.2.2.5). Das zweite Enzym ist Xho I, das im Roten Puffer arbeitet.
Das Enzym schneidet nicht in der AHCY-Sequenz, sondern innerhalb der Erkennungssequenz
an Position 2245 bp und linearisiert damit das Konstrukt.
Spur 1: Klon 1 Spur 5: Kl
Spur 2: Klon 2 Spur 6: Kl
Spur 3: Klon 4 Spur 7: 10
Spur 4: Klon 11 Spur 8: Ne
Die Proben wurden auf ein 0,8 %iges TAE-Ge
der Orientierung des AHCY-Gens im
Elektrophorese eine Bande von 500 bp oder v
entsprach dem gesuchten Produkt. Zusätzlich e
13000 bp. Die Produkte der Klone 11 und 14
positiv (s.Abb.8), was an den Plasmidresten
Orientierung im Vektor. Klon 1 erschien als re
Die Klone 2, 4, und 13 wiesen jeweils eine 800
Dieses Ergebnis wurde durch die Sequenzierun
erhaltene Sequenz wurde mit einer Sequenz-D
Klone 1, 11 und 14. In Abb.9 ist der ents
dargestellt. Aufgrund der Homologie wurde d
Gensequenz identifiziert.
1 2 3 4 5 6 7 8
Abb. 8: Elektrophorese nach Spaltung mit den
Restriktionsenzymen BamH1 und Xho I
o
o
0
g
l
p
o
r
z
i
e
g
a
p
i
Plasmidreste
800 bp
500 bp
42
n 13
n 14
bp-Leiter
ativkontrolle (Wasser als Template)
aufgetragen. Aufgrund der Schnittstellen und
Uni/V5-His-TOPO-Vektor wurde in der
n 800 bp Größe erwartet. Die 500 bp-Bande
schienen die Reste des Plasmids in Höhe von
lagen auf Höhe der 500 bp und waren damit
u erkennen ist. Das Gen besitzt die richtige
ner Vektor pUni/V5-His-TOPOR ohne Insert.
r- Bande auf.
des Genproduktes (s. 2.2.2.10) bestätigt. Die
tenbank verglichen. Sequenziert wurden die
rechende Homologievergleich mit Klon 14
e Sequenz der Klone 11 und 14 als AHCY-
43
Query: 142 tgccgccagcatgtctgacaaactgccctacaaagtcgccgacatcggcctggctgcctg 201 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct: 38 tgccgccagcatgtctgacaaactgccctacaaagtcgccgacatcggcctggctgcctg 97 Query: 202 gggacgcaaggccctggacattgctgagaacgagatgccgggcctgatgcgtatgcggga 261 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct: 98 gggacgcaaggccctggacattgctgagaacgagatgccgggcctgatgcgtatgcggga 157 Query: 262 gcggtactcggcctccaagccactgaagggcgcccgcatcgctggctgcctgcacatgac 321 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct: 158 gcggtactcggcctccaagccactgaagggcgcccgcatcgctggctgcctgcacatgac 217 Query: 322 cgtggagacggccgtcctcattgagaccctcgtcaccctgggtgctgaggtgcaagtggt 381 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||| Sbjct: 218 cgtggagacggccgtcctcattgagaccctcgtcaccctgggtgctgaggtgc-agtggt 276 Query: 382 ccagctgcaacatcttctccacccaggaccatgcggcggctgccattgccaaggctggca 441 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct: 277 ccagctgcaacatcttctccacccaggaccatgcggcggctgccattgccaaggctggca 336 Query: 442 ttccggtgtatgcctggaagggcgaaacggacgaggagt-cctgtggtgcattgagcaga 500 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||| Sbjct: 337 ttccggtgtatgcctggaagggcgaaacggacgaggagtacctgtggtgcattgagcaga 396 Query: 501 ccctg-actt-aaggac-ggcccct-aacatgattctggac-acgggggc 545 ||||| |||| |||||| ||||||| ||||||||||||||| |||||||| Sbjct: 397 ccctgtacttcaaggacgggcccctcaacatgattctggacgacgggggc 446 Abb. 9: Homologievergleich des AHCY mit der Sequenz-Datenbank
44
Die obere Reihe der Abb. 9 zeigt die von der Datenbank (NCBI-BLAST) angegebene
Sequenz des AHCY, die untere Reihe zeigt das Ergebnis der Sequenzierung des Klons 14 im
Vergleich. Es lies sich eine 98 %ige Übereinstimmung feststellen. Der Homologievergleich
zeigt in sieben Positionen eine Nichtübereinstimmung der Nuleotide, die aber keinen Einfluß
auf die Aminosäuresequenz hatten, weshalb mit dieser Probe weitergearbeitet wurde.
Aufgrund der Homologie wurde die Sequenz der Klone 14 und 11 eindeutig als AHCY-
Gensequenz identifiziert. Klon 1 erschien als leerer pUni/V5-His-TOPO-Vektor und diente in
den folgenden Experimenten als Negativkontrolle.
Die Maxi-Präparation (s. 2.2.2.1) von Klon 1 und 14 erbrachte die Plasmid-DNA mit der die
nachfolgende Rekombination und Transformation durchgeführt wurde. Die daraus ebenfalls
hergestellten Glycerin-Stabs (s.2.2.1.2) lagern dauerhaft bei –70 °C.
3.1.3 TOPO-Cloning-Reaktion in E.coli TOP 10-Zellen mit dem pcDNA3.1-E-Vektor
Der eindeutig identifizierte Klon pUni/V5-His-TOPO-AHCY wurde in den Expressionsvektor
pcDNA3.1-E-EchoTM-Adapted-Expression-Vector (s. 2.2.2.12) einkloniert. Donor- und
Akzeptorvektor bilden durch die Cre-lox seitenspezifische Rekombination ein Fusionsplasmid
(10729 bp), das in E.coli-Zellen des Stammes TOP 10 transfiziert wurde.
Die erfolgreiche Rekombination wurde durch die Kanamycin-Resistenz bestätigt. Der
Donorvektor wird durch den für E.coli TOP 10 ungeeigneten Replikationsursprung
ausselektiert.
Es folgte eine DNA-Isolierung (s. 2.2.2.2) und eine Spaltung mit dem Restriktions-Enzym
der Endonuklease SspI (s.2.2.2.6). Dieses Enzym schneidet das Fusionsplasmid am bla-
Promotor (Promotor für Ampicillin-Resistenz) und linearisiert die Plasmid-DNA. Ein
positiver Klon ließe eine einzelne Bande bei ca. 12000 bp erwarten. Über eine Agarose-Gel-
Elektrophorese (s. 2.2.2.11) ließen sich die Proben isolieren, die eine erfolgreiche
Rekombination/ Transformation gezeigt haben.
45
Spur 1-10: Proben
Spur 11: 1 kb-Leiter
Spur 12: Negativkontolle
Die Darstellung einer einzelnen Bande bei 12000 bp in Abb. 10 zeigt, daß das Restriktions-
Enzym das Fusionsplasmid linearisiert hat. Bei dem auf 0,8 %igem TBE-Gel aufgetragenen
Proben waren die Klone in den Spuren 1, 4, 5, 7 und 9 positiv.
Von einem der positiven Klone (Probe 4) und von einem reinen pcDNA3.1-E-Vektor wurde
eine Maxi-Präparation (s.2.2.2.1) durchgeführt, um mit der aufgereingten Plasmid-DNA
weitere Versuche durchzuführen. Die daraus angefertigten Glycerin-Stabs lagern bei –70 °C.
Abb. 10: Restriktions-Enzym-Verdau des Vektors pcDNA3.1 /-AHCY mit SspI
positive Bande
Spur 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
12 000 bp
2036 bp
3.2 Überexpression von AHCY in eukaryontischen Zellen 3.2.1 Transfektion von Raji-Zellen mit pcDNA3.1-AHCY
Durch die Elektroporation (s. 2.2.2.13) diffundiert die zugegebene DNA in die durch die
elektrischen Impulse geschaffenen Poren der Zellmembran von Raji-Zellen.
Zum Nachweis der erfolgreichen Transfektion von Raji-Zellen mit dem Plasmidvektor, wurde
das auf dem pcDNA3.1-Vektor liegende ß-Lactamase-Gen (Ampicillin-Resistenzgen, Basen
10594-10692 des komplementären Stranges) nachgewiesen. Dies erforderte nach der
Elektroporation zunächst eine DNA-Isolierung (s. 2.2.2.2) und anschließend eine PCR mit ß-
Lactamase-Primern (s. 2.2.2.8). Aufgetragen wurde das PCR-Produkt auf ein 1,5 %iges TBE-
Gel. Das Ampicillin-Resistenzgen besitzt eine Größe von 420 bp und läßt in der Höhe eine
Bande erwarten.
Abb. 11: ß-Lactamase-PCR nach erfolgter Elektroporation
Deutlich sichtbar z
des Ampicillin-Re
werden, daß die T
AHCY-ligierten V
500 bp
1 2 3 4 5 6 7 8
Spur 1: Klon 1 pcDNA3.1-AHCY
Spur 2: Klon 2 pcDNA3.1-AHCY
Spur 3: Klon 3 pcDNA3.1-AHCY
Spur 4: Klon 4 pcDNA3.1
Spur 5: Klon 5 pcDNA3.1
Spur 6: Klon 6 pcDNA3.1
Spur 7: Negativkontrolle ohne DNA-Zugabe
46
eigt Abb. 11 in allen Proben eine Bande bei 420 bp, womit ein Fragment
sistenzgens ß-Lactamase nachgewiesen wurde. Damit konnte gezeigt
ransfektion des pcDNA3.1-Vektors in die Raji-Zellen, sowohl mit dem
ektor als auch mit dem Kontrollvektor erfolgreich war.
Um zu prüfen, ob durch die Transfektion mit dem pcDNA3.1-AHCY-Vektor eine AHCY-
Expression stattfindet, wurde eine RNA-Isolierung durchgeführt (s. 2.2.2.2). Anschließend
folgte eine cDNA-Synthese (s. 2.2.2.7), und es wurde ein DNaseI-Verdau (s. 2.2.2.4)
angeschlossen. Die DNaseI-Spaltung dient der Eliminierung kontaminierender DNA-Reste,
die bei anschließender PCR stören würden. Die PCR-Produkte der AHCY-PCR (s. 2.2.2.8)
wurden auf ein 1,5 %iges TAE-Gel aufgetragen. Es wird eine durch die AHCY-Größe
bedingte Bandengröße von 1400 bp erwartet.
Wie in Abb. 12 zu e
mit dem pcDNA3.1
pcDNA3.1-Kontroll
prüfung wurde eine
1 2 3 4 5
500 bp
47
rkennen ist, wurde das AHCY-Gen exprimiert. In Spur 3 zeigt die Probe
-AHCY-Vektor eine stärkere Bande als die Probe in Spur 4 mit dem
vektor. Dies könnte der Hinweis auf eine Überexpression sein. Zur Über-
semiquantitative PCR durchgeführt.
Spur 1: 1 kb-Marker
Spur 2: 100 bp-Marker
Spur 3: Probe mit pcDNA3.1-AHCY-Vektor
Spur 4: Probe mit pcDNA3.1-Vektor
Spur 5: Negativkontrolle mit H2O
1400 bp
Abb. 12: AHCY-PCR nach
Elektroporation mit pcDNA3.1/-AHCY
48
3.2.1.2.1 Etablierung einer semiquantitativen PCR mit AHCY und GAPDH
Zum Nachweis einer Überexpression des AHCY-Gens in pcDNA3.1-AHCY-transfizierten
Raji-Zellen, wurde GAPDH, ein “Housekeeping”-Gen das regelmäßig in Säugetier-Zellen
vorkommt und gleichmäßig während des Zellzyklus exprimiert wird, als Standard für die
AHCY-Expression verwendet. Hierzu wurde zunächst der Thermocycler-Zyklus gewählt, bei
dem im exponentiellen Anstieg eine meßbare Zunahme des AHCY-PCR-Produktes auftrat (s.
2.2.2.8).
Abb. 13: Nachweis der AHCY-Expression
Die PCR wurde über 30 Zyklen durchgeführt. Bei Zyklus 22, 24, 26, 28 und 30 (von links
nach rechts auf der Abb. 13) wurde eine Probe entnommen und auf einem 1,5%igen TAE-Gel
aufgetragen. In der obenstehenden Abbildung wird ersichtlich, daß es zu einem
kontinuierlichen Anstieg von AHCY-DNA kommt.
Spur 1: AHCY-Expression nach Zyklus 22
Spur 2: AHCY-Expression nach Zyklus 24
Spur 3: AHCY-Expression nach Zyklus 26
Spur 4: AHCY-Expression nach Zyklus 28
Spur 5: AHCY-Expression nach Zyklus 30
1 2 3 4 5 6
2036 bp 1018 bp
49
In einem weiteren Schritt wurde eine konkurrierende PCR mit den Primern für AHCY und
GAPDH durchgeführt (s. 2.2.2.8).
Spur 1: AHCY-Primer: 28 Zyklen, GAPDH: 24 Zyklen
Spur 2: AHCY-Primer: 28 Zyklen, GAPDH: 22 Zyklen
Spur 3: AHCY-Primer: 28 Zyklen, GAPDH: 20 Zyklen
Spur 4: AHCY-Primer: 28 Zyklen, GAPDH: 18 Zyklen
Spur 5: AHCY-Primer: 28 Zyklen, GAPDH: 16 Zyklen
Spur 6: Negativkontrolle
Spur 7: 1 kb-Marker
Die Produkte wurden auf ein 2%iges TAE-Gel aufgetragen.
Die AHCY-Primer durchliefen in allen Proben 28 PCR-Zyklen, wie in Versuch zu Abb. 13
ermittelt, während die GAPDH-Primer, wie in Abb. 14 dargestellt, jeweils 2 PCR-
Zykuslängen weniger durchliefen. Die Bandenstärke zeigte, daß bei GAPDH-Zyklus 22
ähnliche Signalintensitäten der PCR-Produkte von AHCY und GAPDH vorlagen. Somit
wurden Zyklus-Bedingunen gefunden, in denen beide Produkte im exponentiellen Bereich
lagen. Für AHCY waren 28 Zyklen und für GAPDH 22 Zyklen erforderlich.
AHCY-Bande bei 1420 bp
GAPDH-Bande bei 306 bp
1 2 3 4 5 6 7
Abb. 14: PCR mit Primern für AHCY und GAPDH zur Kalibrierung der PCR-Bedingungen für eine semiquantitative AHCY-PCR
2036 bp
517 bp
3.2.2 Nachweis der Überexpression von AHCY
Vorraussetzung für die nachfolgenden Untersuchungen war die Überexpression des AHCY-
Gens.
Nach Elektroporation (s. 2.2.2.13), RNA-Isolierung (s. 2.2.2.2), cDNA-Synthese (s. 2.2.2.7)
und DNaseI-Verdau (s. 2.2.2.4) folgte eine semiquantitative PCR (s. 2.2.2.8) des AHCY-Gens
gegen GAPDH als Referenz.
Abb. 15: Nachweis der Überexpression von AHCY mit GAPDH als Referenzbande
Die PC
Überex
im Ve
untersu
Kontro
Grunda
läßt sic
den ges
Daß es
und 4.
kontinu
AHCY-Bande
GAPDH-Bande
1 2 3 4 5 6 7 8
2036 bp
517 bp
Spur 1: Probe 1 pcDNA3.1-AHCY Spur 5: Probe 3 pcDNA3.1-AHCY
Spur 2: Probe 1 pcDNA3.1 Spur 6: Probe 3 pcDNA3.1
Spur 3: Probe 2 pcDNA3.1-AHCY Spur 7: Negativkontrolle mit H2O
Spur 4: Probe 2 pcDNA3.1 Spur 8: 1 kb-Marker
R-Produkte wurden a
pression von AHCY i
rgleich zu den Zelle
chten Parallelansätze
llansätzen wurde ebe
ktivität entspricht. Al
h die GAPDH-Bande
amten Zellzyklus expr
sich vermutlich um ei
Tag nach Elektropo
ierlich abnahm. Die P
50
uf ein 2%iges TAE-Gel aufgetragen. In Abb. 15 ist die starke
n Zellen dargestellt, die mit pcDNA-AHCY transfiziert wurden,
n, die mit dem Kontrollvektor transfiziert wurden. Die drei
wiesen eine wesentlich verstärkte AHCY-Expression auf. In den
nfalls AHCY exprimiert, aber nur sehr schwach, wie es der
s Referenz und zur Vergleichbarkeit der Proben untereinander,
heranziehen, da dieses “Housekeeping”-Gen gleichmäßig über
imiert wird.
ne transiente Transfektion handelte, zeigten Kontrollen des 1., 2.
ration, die darauf hinwiesen, daß die AHCY-Überexpression
roben wurden auf ein 2%iges TAE-Gel aufgetragen (s. Abb. 16).
51
Es erfolgte am 1., 2. und 4. Tag nach Elektroporation eine RNA-Isolierung (s. 2.2.2.2),
cDNA-Synthese (s. 2.2.2.7), DNaseI-Verdau (s. 2.2.2.4) und eine semiquantitative
AHCY/GAPDH-PCR (s. 2.2.2.8).
Abb. 16: AHCY-Expression nach 1., 2. und 4. Tag
Spur 1: Probe mit pcDNA3.1-AHCY 1. Tag
Spur 2: Probe mit pcDNA3.1-AHCY 2. Tag
Spur 3: Probe mit pcDNA3.1-AHCY 4. Tag
Spur 4: Probe mit pcDNA3.1 4. Tag
Spur 5: Probe mit pcDNA3.1-AHCY 1. Tag 1:10 verdünnt
Spur 6: Probe mit pcDNA3.1-AHCY 2. Tag 1:10 verdünnt
Spur 7: Probe mit pcDNA3.1-AHCY 4. Tag 1:10 verdünnt
Spur 8 : Probe mit pcDNA3.1 4. Tag 1:10 verdünnt
Spur 9: 1 kb-Marker
Die Abbildung 16 zeigt die Abnahme der AHCY-Expression vom 1. bis zum 4. Tag. GAPDH
ist nur schwach zu erkennen. Die abnehmende Expression im Verlaufe mehrerer Tage ließ
sich in weiteren Versuchen bestätigen. Das Ergebnis zeigt eine transiente Expression an.
3.2.3 Nachweis der AHCY-Überexpression auf Proteinebene
Am 1. Tag nach Transfektion mit pcDNA3.1 /-AHCY wurden die Proteine aus den Raji-
Zellen isoliert (s. 2.2.3.3). Die Proteine wurden mittels SDS-Page aufgetrennt und auf eine
Nitrocellulose-Membran transferiert. Mit der Ponceau S-Färbung (s. 2.2.3.4.3) wurden die
1 2 3 4 5 6 7 8 9
2036 bp 1018 bp
Proteine auf der Membran sichtbar dargestellt. Es folgte die Immundarstellung (s. 2.2.3.4.4)
von AHCY mit spezifischen Antikörpern (vgl. Abb 17).
In Abb.17 wurden die Proben in zwei parallelen Ansätzen mit pcDNA3.1-AHCY
abwechselnd mit den pcDNA3.1-Proben aufgetragen. Spur 5 stellt eine Kontrolle gegen nicht-
transfizierte Raji-Zellen dar und Spur 6 zeigt einen Protein-Rainbow-Marker.
Es ließ sich z
quantitativ m
Protein AHC
Marker bestä
Die AHCY-Ü
Translation
Zellverhalten
da es sich u
Tagen nicht m
Abb.17: Immunblot mit Darstellung des AHCY-Proteins
AHCY-Protein mit 47,6 kDa
1 2 3 4 5 6
220 kDa
45 kDa
Spur 1: Probe 1 pcDNA3.1-AHCY Spur 4: Probe 2 pcDNA3.1
Spur 5: Kontrolle mit nativen
Raji-Zellen
Spur 6: Molekularmassen-
Marker
Spur 2: Probe 1 pcDNA3.1
Spur 3: Probe 2 pcDNa3.1-AHCY
52
eigen, daß in Probe 1 und 2 die mit pcDNA3.1-AHCY-transfizierten Raji-Zellen
ehr AHCY-Protein gebildet haben als die pcDNA3.1-Zellen. Das menschliche
Y besitzt eine Größe von 47,660 kDa, dessen Bandenhöhe durch den farbigen
tigt wurde.
berexpression bewirkt offenbar eine deutliche Steigerung der Transkription und
des AHCY-Proteins. Wie es sich mit der Transkription/Translation und dem
über längere Zeit verhält, kann zu diesem Zeitpunkt noch nicht gesagt werden,
m einen vorübergehenden Transfektionseffekt handelt, der schon nach wenigen
ehr meßbar war.
3.2.4 Zellwachstum nach Transfektion mit pcDNA3.1 und -AHCY
Die Anzahl der Zellen wurde am 1., 2., 4. und 8. Tag nach Elektroporation gemessen
(s.2.2.3.1).
Bei der Auswertung dieser Ergebnisse zeigte sich, daß die Raji-Zellen, in die der Vektor
pcDNA3.1-AHCY transfiziert worden war, sich innerhalb der ersten 48 Stunden kaum
veränderten (Faktor 1,15), in den folgenden 48 Stunden veranderthalbfachten bis
verdoppelten sich die Zellen (Faktor 1,21-1,95) und blieben dann relativ gleich bis zum 8.Tag
(Faktor 0,94).
Die Zellen, in die nur der Kontrollvektor pcDNA3.1 transfiziert worden war, zeigte in allen
Versuchen ein sehr ähnliches Wachstumsverhalten (s. Abb.18). Innerhalb der ersten 48
Stunden blieb die Zellzahl annähernd gleich, nach weiteren 48 Stunden verdoppelt sie sich
fast (Faktor 1,93) und bleibt bis zum 8. Tag fast gleich.
Die Ergebnisse sind zur Verdeutlichung in Abb.18 dargestellt.
Ab
Ergebnis der Zellzählung nach Transfektion
00
05
05
05
05
05
05
05
05
05
06
Zellz
ahl SAH transfizierte Zellen
Vektor transfizierte Zellen
0.E+
1.E+
2.E+
3.E+
4.E+
5.E+
6.E+
7.E+
8.E+
9.E+
1.E+1x106
9x105
8x105
7x105
6x105
5x105
4x105
3x105
2x105
1x105
0
53
b. 18: Ergebnis der Zellzählung nach Transfektion
1.T ag 1.T ag 2.T ag 2.T ag 4.T ag 4.T ag 8.T ag 8.T ag
Tage nach Trans fe k tion
54
3.2.5 BrdU-Test
Am 2. und am 4. Tag wurde die Zellproliferation durch Bestimmung der DNA-
Neusyntheserate untersucht.
Abbildung 19 veranschaulicht die DNA-Syntheserate der transfizierten Zellen.
Tage nach Transfektion2 2 4 4
DN
A-Sy
nthe
sera
te /R
el.E
inhe
iten
0,0
0,1
0,2
Schwarz dargestellt ist die Syntheserate der pcDNA3.1-AHCY-transfizierten Raji-Zellen am
2. und am 4.Tag nach Transfektion. Hellgrau unterlegt ist die DNA-Syntheserate der
pcDNA3.1-transfizierten Kontrollen zum gleichen Zeitpunkt.
Die DNA-Syntheserate der mit AHCY transfizierten Zellen war am 2.Tag mit 0,175 (rel.
Einheiten) um den Faktor 2,2 höher als bei den pcDNA3.1-transfizierten Zellen, fiel dann bis
zum 4.Tag auf 0,35, in den Bereich der Kontrollzellen ab.
Die Überexpression des AHCY-Gens induzierte eine kurzfristige, starke DNA-Synthese, die
jedoch am 4. Tag auf ein Viertel abfiel. Dieser Effekt konnte zeitlich nicht weiter verfolgt
werden, da es sich um eine transiente Transfektion handelte, deren Aktivität am 4.Tag nicht
mehr meßbar war (s. 3.2.2).
Abb. 19: Zellproliferationsmessung
55
3.2.6 Immunfluoreszenztest
Mittels des Immunfluoreszenztest (IFT) wurde untersucht, welche Auswirkungen die AHCY-
Überexpression auf die Latenz des EBV hat. Der Versuch wurde wie unter 2.2.3.2 am 1., 2.
und 4. Tag nach Transfektion durchgeführt. Die Auswertung erfolgte anschließend durch
Zählen der fluoreszierenden, EA-positiven Zellen (s. Abb 21).
Die Ergebnisse sind in Abb. 21 dargestellt.
Es wurde die Expression des EBV Early-Antigen (EA) untersucht (s. Abb.20). Am 1. Tag
nach Transfektion zeigten die AHCY-transfizierten Raji-Zellen eine um den Faktor 2,7
stärkere EA-Expression als die Vektor-transfizierten Zellen (p= 0,003). Am 2. Tag betrug der
Faktor 2,1 (p= 0,03) und am 4. Tag 2,44 (p= 0,0005).
Es läßt sich feststellen, daß die AHCY-Überexpression Raji-Zellen zu einer verstärkten EA-
Expression anregt. Dieser Effekt geht zeitlich sogar noch über die nachweisbare AHCY-Gen-
Überexpressionsphase (1.und 2. Tag nach Transfektion) hinaus, da am 4. Tag ebenfalls noch
eine verstärkte EA-Expression festzustellen ist.
Die Immunfluoreszenzuntersuchungen sind in Abb. 21 dargestellt.
Abb. 20: Nachweis der EA-Expression in AHCY-transfizierten Zellen und Kontrollzellen
Tage nach Transfektion0 1 1 2 2 4 4
EA-p
ositi
ve Z
elle
n / 1
0000
0 Ze
llen
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90unbehandelte Raji-ZellenSAH-transfizierte ZellenVektor-transfizierte Zellen
56
3.2.7 BZLF1 / BHRF1-PCR
Am 1., 2. und 4. Tag nach Transfektion mit pcDNA3.1/-AHCY wurde aus Raji-Zellen RNA
isoliert, ein DNaseI-Verdau und eine cDNA-Synthese durchgeführt, um im Anschluß daran
zwei verschiedene PCR-Produkte nachzuweisen. Die eine PCR erfolgte mit BZLF1-Primern
(s. 2.2.2.8), die andere mit BHRF1-Primern (s. 2.2.2.8). Beide Gene sind an der Reaktivierung
des lytischen Zyklus von EBV beteiligt.
1.Tag EA (pcDNA3.1-AHCY) EA (pcDNA3.1)
2. Tag EA (pcDNA3.1-AHCY) EA (pcDNA3.1)
EA Negativkontrolle (Raji) EA Positivkontrolle (B 95-8)
Abb. 21: Expression von EA in Raji-Zellen, die mit pcDNA3.1 oder pcDNA3.1-AHCY transfiziert wurden
Es wurden BZLF1-Fragmente mit 182 bp Größe erwartet, als Positivkontrolle dienten B95-8-
Zellen, die sowohl BZLF1 als auch BHRF1 kontinuierlich exprimierten. Als Negativkontrolle
wurden unbehandelte Raji-Zellen verwendet.
Im Ergebnis lies sich in einer Spur auf Höhe von 182 bp eine BZLF1-Bande nachweisen. Es
handelte sich dabei um eine mit pcDNA3.1-AHCY-transfizierte Probe. Die anderen
pcDNA3.1-AHCY-transfizierten Proben, alle Proben mit transfiziertem Kontrollvektor und
die Negativkontrolle wiesen keine Banden auf. Die Positivkontrolle zeigte, wie zu erwarten,
ebenfalls eine Bande bei 182 bp (nicht dargestellt).
Das Ergebnis der PCR mit BHRF1-Primern am 1. Tag nach Transfektion ist übereinstimmend
mit dem Ergebnis der BZLF1-PCR. Eine Probe mit pcDNA3.1-AHCY-transfizierten Zellen
zeigte eine BHRF1-Bande bei 211 bp, während alle weiteren Proben keine Bande aufwiesen.
Die positiven Proben beider PCR’s wurden erneut auf ein 2 %iges TBE-Gel aufgetragen, das
in Abb. 22 dargestellt ist.
Spur 1: 100 bp-Leiter Spur 3: positive B
Spur 2: positive BZLF1-Probe (182 bp) Spur 4: Negativko
Am 1. Tag nach Transfektion konnte in beiden Fällen die E
des BHRF1-Gens nachgewiesen werden. Die Reaktivierung d
die Überexpression des AHCY am 2. und 4. Tag nach Tra
dieser Gene nicht nachweisbar.
1 2 3 4
500 bp
100 bp
Abb.22:positive BZLF1- und BHRF1-Proben
57
HRF1-Probe (211 bp)
ntrolle
xpression des BZLF1-Gens und
es lytischen EBV-Zyklus durch
nsfektion war eine Expression
58
3.2.8 Facs Scan
Der Versuch wurde durchgeführt wie unter 2.2.3.5 beschrieben.
Die mit pcDNA3.1/-AHCY-transfizierten Raji-Zellen wurden auf die Oberflächenmarker
CD11a, CD19, CD21, CD23, CD30, CD40, CD44, CD54, CD58 und HLA-DR untersucht
(Funktion unter 2.2.3.5 beschrieben).
Abb. 23:
Darstellung der FACS Scan-Ergebnisse nach Transfektion mit pcDNA3.1/-AHCY mit
Expression der Merkmale CD19, CD21, CD40 und CD58
Der schwarz hinterlegte Teil der Facs-Histogramme in Abb. 23 zeigt die pcDNA3.1-AHCY
transfizierten Zellen, der hellgrau hinterlegte Teil die pcDNA3.1-transfizierten Zellen.
Bei vier Oberflächenmarkern ließen sich Veränderungen bei Transfektion mit pcDNA3.1-
AHCY und pcDNA3.1 feststellen. Es handelt sich dabei, um CD19, CD21, CD40 und CD58,
die in allen vier Fällen einen Anstieg der Expression nach AHCY-Überexpression zeigten.
Der Anstieg der Oberflächenmerkmale ist ein Zeichen für Aktivierungsvorg
der Zelle. Die weiteren Oberflächenmarker, die untersucht wurden, zeig
änderung in ihrer Expression.
3.2.9 Versuche mit dem Light Cycler
Mit dem Light Cycler-Instrument (s. 2.2.2.9) wurde die Analyse der differentie
Genaktivität durchgeführt. Untersucht wurden folgende Gene:
- LFA1 (ein Leukozytenadhäsionsprotein)
- L6/TAX (60S ribosomales Protein L6)
- RAI (ein plazentarer Ribonukleaseinhibitor)
- G(S)α (ein Guanin-Nukleotid-bindendes Protein)
- PUF (Nukleosid-diphosphat-kinase 3)
- TOB (Protein der Zellzykluskontrolle)
- MCH4 (apoptotische Cystein-Protease)
- TRAF3 (CD40-assozierter Faktor)
- SOD1 (Cu/Zn Superoxid-dismutase)
Oberflächenmarker Probe (Anzahl) Kontrolle (Anzahl) Signifikanz
CD19
CD21
CD40
CD58
255,4 +/- 39,1 112,7 +/- 13,1
237,3 +/- 34,7 114,5 +/- 13,7
360,1 +/- 79,7 183,0 +/- 29,9
236,6 +/- 43,7 119,0 +/- 12,2
< 0,005
< 0,005
ä
te
ll
< 0,01
< 0,01
59
nge innerhalb
n keine Ver-
en
60
Die Gene wurden nach ihrer möglichen Rolle in der EBV-modulierten Zelltransformation
ausgewählt. In früheren Vesuchen zeigten sich diese Gene aktivierbar durch Gangliosid LM1-
Behandlung (Kleines, 2000).
Es ließ sich in mehrfach wiederholten Untersuchungen in keinem dieser Fälle Veränderungen
der Genaktivität nachgeweisen, was darauf hinweist, daß die AHCY-Überexpression zu dem
untersuchten Zeitpunkt keine Induktion bei den genannten Genen auslöst. Möglicherweise
sind sie an der Reaktivierung des EBV-Zyklus nicht beteiligt oder es sind weitere Faktoren
nötig, um sie zu induzieren.
61
4. Diskussion
Das Epstein-Barr-Virus (EBV) ist ein Herpes-Virus und bekannt als der Erreger der
infektiösen Mononukleose. Über die Schleimhaut des Naso-Pharyngealraumes gelangt das
Virus in den Körper und infiziert u.a. B-Lymphozyten, in denen es lebenslang persistiert
(Gutierrez et al., 1997).
Das EBV-Virus wird mit einigen Tumorerkrankungen in Verbindung gebracht, wie dem
Burkitt-Lymphom, dem Nasopharynx-Karzinom und dem Hodgkin-Lymphom (Hanto et al.,
1983; Hamilton-Dutoit et al., 1991). Zudem wurde das EBV-Genom in den Kernen von reifen
T-Zell-Lymphomen nachgewiesen (Tokunaga et al., 1993). Die Initiation der Zell-
transformation geschieht aus dem Stadium der Viruslatenz.
Äußere Faktoren wie die Applikation von 10-O-Tetradecanoylphorbol-13-Acetat (TPA),
Anti-IgM-Antikörper oder dem Gangliosid IV3NeuAc-nLcOse4Cer (LM1) können das
Wiedereintreten in den lytischen Zyklus bewirken. Die Behandlung mit LM1 zeigte zudem
eine Wachstumshemmung und Differenzierungsaspekte (Schaade et al., 1999). Die
Untersuchung der Genexpressionsmuster von 24 ausgewählten Genen zeigte Veränderungen.
Eines davon war das Gen für S-Adenosylhomocystein-Hydrolase (AHCY).
In der vorliegenden Arbeit werden die Effekte der Überexpression von AHCY in Burkitt-
Lymphom-Zellen der Zellinie Raji untersucht.
4.1 Klonierung von AHCY in einen Expressionsvektor
Das EchoTM Cloning System basiert auf einem Plasmid-Fusions-System, das schnell und
einfach das zu untersuchende Gen in einen Akzeptorvektor rekombiniert. Der Vorteil dieser
Methode liegt in dem Cre-lox seitenspezifischen Rekombinationssystem des Bakteriophagen
P1 (Abremski et al., 1983; Sternberg et al., 1981). Ein Donorvektor mit ligiertem Gen von
Interesse fusioniert in gerichteter Rekombination mit einem Akzeptorvektor, woraus ein
Expressionsvektor entsteht, der das „Insert“ in gerichteter Orientierung unter Kontrolle der
eukaryontischen Promotorsequenz bringt.
Ein frisches A-tail PCR-Produkt (AHCY) wurde in den Donorvektor pUni/V5-His-TOPO
kloniert. Die Transfektion dieses Vektors erfolgte in E. coli-Zellen des Stammes PIR1. Die
entstandenen Klone wurden auf Antibiotika-haltigen Nährmedien selektiert und über
62
Sequenzierung identifiziert. Das Sequenzierungsergebnis wurde mit einer Sequenz-Datenbank
verglichen und es zeigte sich im Homologievergleich eine 98 %ige Übereinstimmung mit der
bekannten AHCY-Sequenz. Dieser Donorvektor fusionierte in einem weiteren Schritt mit
dem Akzeptorvektor pcDNA3.1-E. E.coli-Zellen des Stammes TOP10 wurden mit dem ent-
standenen Expressionsvektor pcDNA3.1-AHCY transfiziert.
Als Alternative zur Sequenzierung wäre auch ein Restriktionsenzym-Verdau mit
unterschiedlichen Enzymen möglich. Dabei würde das gewünschte Konstrukt an mehreren
bekannten Positionen geschnitten, so daß in einer anschließenden Agarose-Gel-
Elektrophorese ein für das Produkt spezifisches Bandenmuster erkennbar wäre. Der Vorteil
der Sequenzierungsmethode liegt in der schnellen, einfachen Verarbeitung der Proben und der
Möglichkeit dabei gleichzeitig Mutationen oder Veränderungen innerhalb des Gens und
dessen Relevanz festzustellen.
Um die Effekte der AHCY-Überexpression zu untersuchen, wurde der Vektor in Raji-Zellen
transfiziert. Als Negativkontrolle diente der Vektor pcDNA3.1-E ohne innenliegendes
Genprodukt.
4.2 Transfektion/Expression von pcDNA3.1-AHCY in Raji-Zellen Der Vektor pcDNA3.1-AHCY wurde für Überexpressionsuntersuchungen in Raji-Zellen
transfiziert. Kontrollzellen wurden mit pcDNA3.1 als leerem Vektor behandelt. Die Methode
der Wahl war die Elektroporation bei der durch einen elektrischen Impuls die Zellmembran
durchlässig wird und die vorliegende DNA hineindiffundieren kann. Die Elektroporation ist
relativ aggressiv für die Zellen, fast 1/3 der Zellen überleben diese Behandlung nicht
(Maniatis et al., 1989). Eine weitere Transfektionsmethode wird durch das SuperFectTM
System angeboten. Hierbei wird das Gen von Interesse in ein Liposom eingebracht, das in
einem weiteren Schritt mit der Zellmembran der zu transfizierenden Zelle fusioniert. Dabei
gelangt das entsprechende Gen in die Zelle. Diese Methode ist verglichen mit der
Elektroporation genauso effizient; sie hat sogar den Vorteil für die Zellen weniger aggressiv
zu sein (Maniatis et al., 1989). Desweiteren muß insgesamt weniger DNA eingesetzt werden
als es bei der Elektroporation der Fall ist. Der Nachteil der SuperFect-Methode liegt darin,
daß hierbei um den Faktor 10 weniger Zellen transfiziert werden und das Material für die
anschließenden Versuche nicht ausreichte. Die folgenden Transfektionen wurden deshalb mit
der Elektroporationsmethode durchgeführt.
63
Einen Tag nach der Transfektion wurde durch Amplifikation des Ampicillin-Resistenz-Gens,
das auf dem Vektor verankert ist, die gelungene pcDNA3.1-Aufnahme überprüft. Die
erfolgreiche Transfektion konnte nach allen Elektroporationen gezeigt werden.
Die AHCY-Überexpression konnte in den ersten Tagen nachgewiesen werden, wobei die
deutlichste Überexpression am 1. Tag zu verzeichnen war, die dann zum 2. und noch mehr
zum 4. Tag hin abfiel. Dies ist beweisend für eine transiente Transfektion. Die Ursache für
diese transiente Transfektion liegt darin, daß der transfizierte Vektor von den Raji-Zellen
nicht amplifiziert werden kann und sich somit nach wenigen Zellteilungen verliert. Mit einem
Vektor, der sich als Insert in das Genom der Zielzelle integriert, wäre es möglich eine stabile
Zellinie zu züchten und mit ihr längerfristige Überexpressionseffekte zu untersuchen.
Mit der verstärkten Expression des AHCY-Gens ging eine verstärkte Transkription/
Translation des AHCY-Proteins einher. Gezeigt werden konnte dies im Western Blot, wobei
hier ebenfalls am 1. posttransfektionalem Tag der deutlichste Effekt erkennbar war. Die
pcDNA3.1-AHCY-Banden des 1. Tages waren wesentlich stärker als die der Kontrollgruppe
(pcDNA3.1). Bereits am 2. Tag ließ sich dies nicht mehr eindeutig nachweisen. Darüber ob es
sich hierbei um ein funktionstüchtiges Protein handelt bzw. welche Auswirkungen dies auf
den Zellmetabolismus hat, kann hier nicht beantwortet werden. In Anbetracht der Tatsache,
daß es sich hier um eine nur kurzfristige, transiente Transfektion handelt, müssen die
Untersuchungen der Effekte der AHCY-Überexpression ihren Schwerpunkt auf den ersten
Tag nach der Transfektion legen.
4.3 Effekte der AHCY-Überexpression in Raji-Zellen
Während bei der Behandlung mit dem Gangliosid LM1 eine Wachstumshemmung und
Differenzierungsvorgänge zu beobachten waren (Schaade et al., 1999), ließen sich in dieser
Untersuchung keine signifikanten Wachstumsunterschiede feststellen zwischen pcDNA3.1-
AHCY-transfizierten Zellen und denen der Kontrollgruppe. Bis zum 2. Tag blieb die Zellzahl
in beiden Gruppen annähernd gleich, um sich bis zum 4. Tag fast zu verdoppeln. Bis zum 8.
Tag läßt sich nur noch ein leichter Anstieg der Zellzahl beider Populationen verzeichnen. Die
Elektroporation ist eine zellschädigende Methode der Transfektion, die Zellen sind starkem
Streß ausgesetzt. Die transfizierten Zellen müssen sich nach der Elektroporation zunächst
einmal erholen, was erklärt, warum sie bis zum 2. Tag kaum wachsen. Eine Veränderung
64
durch die AHCY-Überexpression ließ sich in Bezug auf das Zellwachstum nicht feststellen,
da sich beide untersuchte Zellpopulationen nicht signifikant voneinander unterschieden.
Anders sieht es aus bei der Untersuchung der DNA-Syntheserate der transfizierten Zellen. Die
mit pcDNA3.1-AHCY-transfizierten Zellen zeigten am 2. Tag nach Transfektion eine 2,3 x
höhere DNA-Syntheserate als die Kontrollgruppe. Dieser Effekt sank bis zum 4. Tag stark ab,
bei den pcDNA-AHCY-transfizierten Zellen auf 20 % des Wertes vom 2. Tag und damit lag
die Syntheserate noch unter der der Kontrollgruppe. Die Kontrollgruppe selbst fiel in ihrer
DNA-Syntheserate ebenfalls vom 2. auf den 4. Tag auf 60 % des Vorwertes.
Es ist denkbar, daß die durch die Elektroporation „gestressten“ Zellen sich bis zum 2. Tag
erholt haben, um dann erstmal überschießend DNA zu synthetisieren, was den Abfall am 4.
Tag erklären würde. Die DNA-Syntheserate korreliert zeitlich mit dem AHCY-
Überexpressionseffekt, jedoch nicht mit der Raji-Zellwachstumsrate. Die Überexpression
induziert kurzfristig eine starke DNA-Synthese, wobei in zukünftigen Arbeiten zu prüfen
wäre, welche Abschnitte der DNA synthetisiert werden oder ob davon das gesamte Genom
betroffen ist. Dieser Effekt der starken DNA-Synthese hat zumindest bis zum 4. Tag nach
Transfektion keinen Effekt auf das Zellwachstum.
Eines der Gene, dessen verändertes Expressionmuster untersucht wurde, ist das BZLF1-Gen.
Es gehört zu der Familie der AP1-Transkriptionsfaktoren und spielt eine zentrale Rolle bei
der Reaktivierung des lytischen Zyklus. Seine Expression initiert in latent infizierten B-Zellen
den Übergang aus der Latenz in die aktive Phase mit lytischer Virusvermehrung (Speck et al.,
1997). BZLF1 ist eines der ersten Gene, die im Reaktivierungsprozeß des EBV
transkriptionell aktiviert werden (Sinclair et al., 1992). Eine Darstellung der Abläufe zum
Aktivierungsprozeß findet sich in Abb. 24.
Bei der Untersuchung im Rahmen dieser Arbeit zeigte sich eine gesteigerte Transkription des
BZLF1-Gens am 1. Tag nach der Transfektion. An den folgenden Tagen war dieser Effekt
mittels PCR nicht mehr nachweisbar. Wahrscheinlich war der Überexpressionseffekt von
AHCY am 1. Tag groß genug, BZLF1 zu aktivieren. Als die Überexpression dann abfiel, sank
die BZLF1-Aktivierung ebenfalls und ließ sich nicht mehr nachweisen.
Ein weiteres Gen, dessen Expressionsveränderungen untersucht wurden, ist das lytische
Transkript des BHRF1-Gens. Als ein strukturelles und funktionelles Homolog des Anti-
Apoptose-Proteins Bcl-2 moduliert BHRF1 den Zellzykus und schützt z.B. die durch
Bestrahlung geschädigte Zellen vor der Apoptose (Huang et al., 1999). Das BHRF1-Gen wird
sowohl in der EBV-Latenzphase als auch in der lytischen Replikation exprimiert. Das
65
BHRF1-Transkript des lytischen Zyklus kann spezifisch durch PCR nachgewiesen werden,
was für die Untersuchung vorteilhaft ist (Austin et al., 1988; Marchini et al., 1991).
Nach AHCY-Überexpression ließ sich am 1. Tag nach Transfektion eine BHRF1-Expression
nachweisen, nicht jedoch an einem der darauf folgenden Tage (s. 3.2.6). Die Ergebnisse der
BHRF1-Expression sind praktisch mit denen der BZLF1-Expression identisch.
Sowohl die BZLF1- als auch die BHRF1-Transkription zeigte einen ähnlichen Effekt wie die
AHCY-Überexpression selbst. Am 1. posttransfektionalem Tag war die AHCY-Über-
expression am stärksten, fiel vom 2. auf den 4. Tag nach Transfektion so deutlich ab, daß eine
Überexpression nicht mehr nachweisbar war. Die Transkriptionen der Gene BZLF1 und
BHRF1 spiegeln dieses Ergebnis wider. Nur eine kontinuierlichere Stimulationszeit, also
länger als 1-2 Tage, könnte zu einer kontinuierlichen Expression führen.
Wird das EBV aktiviert und tritt in den lytischen Zellzyklus ein, werden eine Reihe EBV-
spezifischer Antigene gebildet (Epstein et al., 1979). Dazu gehört u.a. das ‚early antigen‘
(EA), das für die Replikation des Virus benötigt wird (Epstein et al., 1979). Es ist eines der
ersten Antigene, die im Reaktivierungsprozeß aktiviert werden.
Für diese Untersuchung wurde ein Immunfluoreszenztest durchgeführt. Spezifische
Antikörper gegen EA wurden eingesetzt, als Positivkontrolle dienten B95-8-Zellen. Es zeigte
sich, daß am 1.Tag nach Transfektion die Rate der EA-positiven Raji-Zellen bei den
pcDNA3.1-AHCY-transfizierten Zellen 2,7 x höher lag als die mit pcDNA3.1-transfizierten
Kontrollen. Am 2. Tag gab es ebenfalls eine hohe Expression der pcDNA3.1-AHCY-
transfizierten Zellen (Faktor 2,1), am 4.Tag lag der Faktor bei 2,4.
Der AHCY-Überexpressionseffekt zeigt eine EBV-Aktivierung, die offensichtlich über die
Expressionszeit hinausging, denn EA wurde nach Abfall der AHCY-Expression weiterhin
verstärkt exprimiert.
Zusammenfassend läßt sich festgestellen, daß eine AHCY-Überexpression zu einer
Aktivierung des BZLF1-Gens, BHRF1-Gens und zu einer verstärkten EA-Synthese führt.
Diese Ergebnisse belegen den Eintritt des EBV in den lytischen Zyklus.
In früheren Untersuchungen konnte gezeigt werden, daß monozytäre Zellen einen
Wachstumsstopp bei immortalisierten Zellen auslösen kann (Ritter et al., 1986). Das
Gangliosid IV3NeuAC-nLcOse4Cer wurde als Auslöser dieses Effektes identifiziert.
Desweiteren wurde gezeigt, daß durch Stimulation von EBV-positiven B-Zell-
Lymphomzellen mit diesem Gangliosid der lytische EBV-Zyklus induziert wurde, erkennbar
66
am Ansteigen der lytischen EBV-Antigene und der Freisetzung von EBV-Genom (Schaade et
al., 1999). Für eine Gangliosid-Beteiligung sprechen auch Ergebnisse über das Gangliosid
GM2. Es verursacht eine Wachstumshemmung durch Inhibierung des Platelet-derived-
growth-(PDG-)-Faktors (Wu et al., 1999).
Bislang wurde die Überführung aus der viralen EBV-Latenz in den Replikationszyklus durch
Aktivierung des lytischen Zyklus hauptsächlich durch Induktion mit 10-O-
Tetradecanoylphorbol-13-Acetat (TPA) oder Ig M-Antikörper untersucht. Dabei wurde
gezeigt, daß die Proteinkinase C (PKC) für das extrazelluläre Signal benötigt wird (Davies et
al., 1991; Bister K et al., 1979). So lassen sich die mit TPA-behandelten Zellen bei
gleichzeitiger Anwesenheit eines PKC-Inhibitors nicht in den lytischen Zyklus überführen
(Hayashi et al., 1992).
Ein Ziel bei der Untersuchung der AHCY-Signalkaskade ist das den lytischen Zyklus
induzierende virale Gen BZLF1. Es korreliert in seinem Auftreten mit der Aktivierung der
PKC (Baumann et al., 1998; Daibata et al., 1994). Es wird vermutet, daß PKC eine
Schlüsselrolle in dieser Signalkaskade zufällt, da sie die meisten Transkriptionsfaktoren
induziert, die den BZLF1-Promotor im Zuge der Virusreaktivierung aktivieren (Speck et al.,
1997).
In der Studie der Gangliosid IV3NeuAC-nLcOse4Cer-behandelten Lymphomzellen (Schaade
et al., 2000) wurde eine erhöhte Transkription des Gens für S-Adenosyhomocystein-
Hydrolase (AHCY) gefunden. Weitere Gene, die verstärkt exprimiert wurden, waren die Gene
für Phospholipase A2 (PLA2) und für ein Thioredoxin-Homolog.
AHCY kommt eine Schlüsselrolle in Methylierungsprozessen zu. Hauptsächlich S-
Adenosylmethionin ist der Donor für Methylgruppen in Transmethylierungsreaktionen
(Mertens et al., 1983). In dieser Reaktion wird S-Adenosylmethionin zu S-
Adenosylhomocystein umgesetzt, dem Substrat des Enzyms AHCY.
In weiteren Untersuchungen wurde festgestellt, daß AHCY-Inhibitoren die Virusreplikation
von verschiedenen Viren, wie beispielsweise dem Cytomegalievirus, verhindern (Snoeck et
al., 1993), denn zur Reifung der viralen mRNA ist die 5‘-Methylierung durch AHCY
unerläßlich (De Clerq et al., 1990; Montgomery et al., 1982). Wird die Aktivität der AHCY
durch Inhibitoren verhindert, steigt die Konzentration von S-Adenosylhomocystein an und die
5‘-Methylierung von viraler mRNA wird verhindert, was sich sowohl negativ auf die
Translation viraler Transkripte als auch auf die virale Enzymaktivität auswirkt.
Es kann vermutet werden, daß ein erhöhter intrazellulärer AHCY-Spiegel eine erhöhte Rate
an Transmethylierungsreaktionen und viralen 5‘-Methylierungen bedingt. Dadurch würde die
67
Translation der EBV-wichtigen Proteine, wie z.B. BZLF1, dem Hauptfaktor für den
Übergang von viraler Latenz zum produktiven lytischen Zyklus, gefördert (Schaade et al.,
2000).
Zusätzlich katalysiert AHCY die Reaktion von Phosphatidylethanolamin zu
Phosphatidylcholin, dem Substrat der PLA2. Eine erhöhte PLA2-Transkription wurde
ebenfalls in der Untersuchung der Gangliosid-behandelten Lymphomzellen gefunden. Dieses
Enzym ist Teil einer PKC-vermittelten Signalkaskade.
Aus den genannten Erkenntnissen ergab sich folgende schematische Arbeitshypothese, die
dieser Arbeit zugrunde liegt:
Abb. 24: Darstellung der Arbeitshypothese (AHCY: S-Adenosylhomocystein-Hydrolase; PLA2: Phospholipase
A2; PKC: Proteinkinase C; EBV: Epstein-Barr Virus Genom; CDS: kodierende Sequenz; Prom: Promotor
Region; EBV-kodierendes Gen BZLF1; Sp1/Sp3: Transkriptionsfaktoren), (Schaade et al., 2000)
Es scheint für AHCY verschiedene Wege zu geben, den lytischen EBV-Zyklus zu
reaktivieren. Zum einen scheint die Möglichkeit zu bestehen, daß AHCY direkt die
Virusreaktivierung durch Aktivierung des Methylierungssystems anregt, zum anderen gibt es
den indirekten Weg der PKC-Aktivierung über die Phospholipase A2.
In der vorliegenden Arbeit konnte durch AHCY-Überexpression eindeutig nachgewiesen
werden, daß es zu einer verstärkten Expression der Gene BZLF1 und BHRF1 kommt. Ebenso
Phosphatidylethanolamin
Phosphatidylcholin
Arachidonsäure
PKC
Methylierung
AHCY
PLA2
1 2
1: Methylierung des 5‘-Endes2: Phophorylierung
Sp1/Sp3
EBV
CDS Prom
BZLF1
68
belegen die Ergebnisse des Immunfluoreszenztests den Übergang von der viralen Latenz in
den lytischen Zyklus des EBV. Diese Ergebnisse bestärken die Wahrscheinlichkeit der
Arbeitshypothese.
PKC ist zusätzlich an Differenzierungsprozessen beteiligt (Dekker et al., 1994; Mischak et al.,
1993). Bei der Untersuchung zur differentiellen Genaktivität wurden die Gene ausgewählt,
die sich in früheren Studien durch das Gangliosid LM1 aktivierbar gezeigt hatten (s.3.2.8). Es
stellte sich heraus, daß unter dieser Versuchsreihe keine veränderte Aktivität der untersuchten
Gene feststellbar war, was zum einen daran liegen könnte, daß der AHCY-
Überexpressionszeitraum zu kurz war, um diese Genaktivitäten zu modulieren oder daß
weitere Faktoren dafür nötig sind, die noch nicht bekannt sind. Denkbar ist ebenfalls, daß –
bezugnehmend auf auf die schematische Arbeitshypothese – der direkte Weg der BZLF1-
Aktivierung über das Methylierungssystem eingeschlagen wurde, ohne daß die Signalkaskade
über PKC genutzt wurde. Damit wäre erklärbar, warum sich die Genaktivität nach
Gangliosidbehandlung (mit Aktivierung der PKC) verändert hat, nicht aber nach alleiniger
AHCY-Überexpression.
In der Durchflußzytometrie wurden die pcDNA3.1-AHCY-transfizierten Zellen auf eine
Expressionsveränderung von spezifischen Oberflächen- oder CD-Markern (cluster of
differentiation) untersucht. Die Funktion verschiedener untersuchter CD-Marker liegt in der
Zell-Zell-Erkennung und als Kofaktor oder Rezeptor innerhalb von Signalkaskaden (Barclay
et al., 1997).
Es konnte gezeigt werden, daß sich verschiedene Oberflächenfaktoren, die Marker CD19,
CD21, CD40 und CD 58, am 7. Tag nach Transfektion und AHCY-Überexpression anders
verhielten als die der Kontrollgruppe.
Das Oberflächenantigen CD19 ist ein Differenzierungsmarker der B-Zell-Reihe und reguliert
die Antigen-Rezeptor-Signaltransduktion in reifen B-Zellen. In frühere Studien war
nachgewiesen worden, daß Zellen des Multiplen Myeloms die Fähigkeit zur CD19-
Expression verloren haben (Ishikawa et al., 2002).
Der Anstieg des CD19-Oberflächenmarkers bei EBV-reaktiven Zellen, wird interpretiert als
eine zelluläre Antwort auf die Reaktivierung des Virus in seiner Funktion als Teil des
Antigen-Rezeptor-Signaltransduktionssystems.
Bei CD21 handelt es sich um ein Glykoprotein der Zellmembranen reifer B-Zellen, an den
natürlicherweise die Komponenten iC3b und C3d des Komplementsystems binden (Cooper et
al., 1990). Das Epstein-Barr-Virus nutzt den CD21-Rezeptor um sich Zutritt zu den B-Zellen
69
zu verschaffen. Das virale Glykoprotein gp350 bindet an den CD21-Rezeptor, die
Komplementkomponente C3d imitierend (Barclay et al., 1997). Weitere virale Glykoproteine,
gH, gL und gp42, werden anschließend für die Penetration durch die Zellmembran benötigt
(Molesworth et al., 2000). Es wurde nachgewiesen, daß CD21 für das EBV nicht unbedingt
notwendig ist, um Lymphozyten oder epitheliale Zellen zu infizieren. Es scheint zusätzliche
zelluläre Moleküle zu geben, die dem Virus Zutritt in die Zelle verschaffen können (Janz et
al., 2000).
Auffällig ist, daß in EBV-positiven Tumoren kein CD21 auf der Zelloberfläche nachgewiesen
werden konnte (Kim et al., 1998; Burogs et al., 2000). Der Verlust des Membranrezeptors
könnte eine immunphänotypische Eigenschaft in der Veränderung zu neoplastischen Zellen
sein, womit eine Ähnlichkeit zu CD19, das auf Zellen des Multiplen Myeloms ebenfalls nicht
nachzuweisen ist, besteht.
Eine weitere Erklärung für den CD21-Verlust bei EBV-positven Tumorzellen ist, daß die
Zellen die CD21-Expression herunterregeln, um eine Mehrfachinfektion zu vermeiden.
Im Rahmen dieser Untersuchung war eine verstärkte CD21-Expression bei den pcDNA3.1-
AHCY transfizierten Zellen auffällig. Dieses Ergebnis steht im Widerspruch zu der
Untersuchung, in der Gangliosid LM1-behandelte Raji-Zellen in den lytischen Zyklus
übertraten und die CD21-Expression reduziert wurde (Schaade et al., 1999). Nachdem sich
das Verwechseln von Proben- und Kontrollgefäßen als unwahrscheinlich herausgestellte
durch weitere Untersuchungen, die mit den gleichen Kontrollzellen durchgeführt worden
waren, liegt die Möglichkeit nahe, daß es bei der AHCY-Überexpression einen weiteren Weg
der EBV-Aktivierung gibt, z.B. die mögliche direkte Methylierung des BZLF1-Promotors,
während bei der Gangliosid-Stimulation der Signalweg über die Proteinkinase C lief. Es
könnte in weiteren Versuchen, die sich an diese Arbeit anschließen, untersucht werden, ob die
PKC und PLA2 nach AHCY-Überexpression ebenfalls verstärkt exprimiert werden.
Zu beachten bleibt die Tatsache, daß der Versuch der Durchflußzytometrie 7 Tage nach der
Transfektion durchgeführt wurde, also zu einem Zeitpunkt, an dem die AHCY-
Überexpression schon lange nicht mehr nachweisbar war. Diese Überexpression war bereits
am 4. postransfektionalem Tag in der semiquantitativen PCR nicht mehr erkennbar. Es ist
denkbar, daß CD21 unmittelbar nach Wiedereintritt in den lytischen Zyklus vermindert
exprimiert wurde, sich dieser Effekt über die Zeit aber aufgehoben hat, möglicherweise im
Sinne einer überschießenden Gegenreaktion, in der viel CD21 gebildet wurde.
CD40 gehört zu der Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor (TNF-R)-Familie, die eine wichtige
Rolle bei der T-Zell-vermittelten B-Lymphozyten-Aktivierung spielt. Die CD40-
70
Signalkaskade, z.B. die Bindung an TNF1-assozierte Faktoren (TRAF’s) und zusätzliche
Signalproteine, führt zu einer Aktivierung von Kinasen und Transkritionsfaktoren (Bishop et
al., 2001). Auch Einflüsse auf Proliferation und Immunglobulin-„switching“ gehört zu seinen
Funktionen. In Anbetracht der Erkenntnisse, daß die CD40-CD40-Liganden-Interaktion für
eine normale zelluläre Immunantwort nötig ist, um eine T-Zell-vermittelte Aktivierung von
Monozyten/Makrophagen, eine proinflammatorische Zytokinproduktion und Leuko-
zytenextravasation anzuregen (Netea et al., 2002), scheinen die Ergebnisse der vorliegenden
Arbeit schlüssig, in der nachgewiesen wurde, daß CD40 nach EBV-Reaktivierung verstärkt
auf den Zelloberflächen vorlag. Interessant ist in diesem Zusammenhang auch, daß es Studien
gibt, die zeigen konnten, daß eine verstärkte CD40-Expression selbst über eine eigene CD40-
Signalkaskade zu einer EBV-Reaktivierung führen kann. Es gibt offenbar verschiedene Wege
das EBV wieder in seinen lytischen Zyklus zu überführen, sie alle münden jedoch in der
Aktivierung des BZLF1-Gens (Fukuda et al., 2000).
Der Oberflächenmarker CD58 nimmt durch seine Bindung an CD2 die Funktion eines
Adhäsionsmoleküls ein, das sich auf benachbarten Zellen befindet. Mit ihrer Bindung stellen
sie eine ideale Distanz her für die Rezeptor-Liganden-Reaktion der zytotoxischen T-Zellen
(Tibaldi et al., 2002).
In dem Versuch der vorliegenden Arbeit zeigte sich, daß in der Zellpopulation mit
vorangegangener AHCY-Überexpression mehr CD58 auf den Zellen zu finden war als in der
Kontrollpopulation. Bei den Zellen dieses Versuchs handelt es sich um Raji-Zellen, einem
EBV-positivem Stamm aus Burkitt-Lymphomzellen, von denen bekannt ist, daß die CD58-
Expression herunterregelt ist (Griffin et al., 1992; Busson et al., 1992).
Die Ergebnisse dieser Arbeit korrelieren insofern zu früheren Veröffentlichungen als daß nach
EBV-Infektion B-Zellen zunächst einmal vermehrt CD58 bilden (Calender et al, 1990). Selbst
die relativ kurze AHCY-Überexpressionszeit scheint ausgereicht zu haben, um die Zellen auf
Infektionsschutz des Gesamtorganismus einzustellen. Mit einem erhöhten Level an CD58 gibt
es verstärkt die Möglichkeit von zytotoxischen T-Zellen eliminiert zu werden und damit die
Infektion einzudämmen.
Zusammenfassend kann eine AHCY-Überexpression auf Transkriptions- und Proteinebene
nachgewiesen werden. Als Folge wird das BZLF1-Gen aktiviert und die EA-Synthese
induziert. Das beweist, daß eine AHCY-Überexpression zur Reaktivierung des lytischen
EBV-Zyklus führt. Verschiedene Oberflächenmerkmale werden im Zuge des
Reaktivierungsprozesses in ihrer Expression moduliert. Dies zeigt eine fortschreitende
71
Differenzierung der Zellen an. Diese Differenzierung dürfte für die Virusreaktivierung eine
Voraussetzung sein.
72
5 Ausblick
Die Transfektion war nur transient. Es ist wichtig herauszufinden, welche Wirkung eine
anhaltende AHCY-Überexpression entfaltet. Ein Ziel zukünftiger Arbeiten wird es sein die
Erkenntnisse der intrazellulären Signalprozesse und Effekte auch auf andere Zellsysteme zu
übertragen.
Neue Therapieansätze könnten darauf zielen latent virusinfizierte, maligne Zellen durch
Virusreaktivierung abzutöten. Dazu müssen nicht-toxische Wege gefunden werden, den
lytischen Zyklus zu reaktivieren. Endogene Ganglioside könnte diese Substanz sein.
73
6 Zusammenfassung Das Ziel der Arbeit war es, die Wirkung der Überexpression von s-Adenosylhomocystein-
Hydrolase (AHCY) auf EBV-genomhaltige-Burkitt-Lymphomzellen der Linie Raji zu
untersuchen. Dabei stand die morphologische und funktionelle Charakterisierung im
Vordergrund der Untersuchungen.
Das AHCY-Genprodukt wurde mit Hilfe der RT-PCR amplifiziert und in einem Zweischritt-
System in den humanen Expressionsvektor pcDNA3.1-E kloniert. Die erfolgreiche
Transformation in E.coli TOP10-Zellen wurde durch Wachstum auf Selektivmedien überprüft
und das Insert durch Sequenzierung identifiziert.
Die Raji-Zellen wurden durch Elektroporation mit dem Konstrukt transfiziert. Der Erfolg
wurde durch die Amplifikation des ß-Lactamase-Gens auf dem Expressionsvektor getestet.
Die erfolgreiche Überexpression des AHCY-Gens wurde auf Transkript- und Proteinebene
mittels semiquantitativer PCR und Western Blot nachgewiesen.
Als Ergebnis der Überexpression wurden folgende Effekte gemessen:
- Anstieg des frühen Epstein-Barr-Virus-Antigens „early antigen“ (EA), gemessen
im Immunfluoreszenztest über die AHCY-Überexpressionszeit hinaus;
- Nachweis von BZLF1- und BHRF1- (lytisches Transkript) Genprodukten am 2. Tag
nach Transfektion;
- Anstieg der DNA-Neusynthese am 2. Tag nach Transfektion;
- unverändertes Wachstumsverhaltens im Vergleich zu den Kontrollzellen;
- veränderte Expression von Oberflächenmarkern mit signifikantem Anstieg der
Antigene der CD19, CD21, CD40 und CD 58;
- keine Aktivitätsveränderung der untersuchten Gene gemessen mittels differentieller
Genanalyse.
Die neu gewonnenen Erkenntnisse bereiten den Weg, die zur Aktivierung des latent
persistierenden EBV notwendige Reaktionsfolge aufzuklären. Dies ist ein wichtiger Schritt
zur Therapie EBV-assozierter Tumore.
74
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8 Abkürzungen - A. bidest. Aqua bidestilled
- A. dest. Aqua destilled
- AHCY S-Adenosylhomocystein-Hydrolase
- AK Antikörper
- bp Basenpaare
- BrdU 5-Bromo-2‘-Deoxyuridin
- cDNA copy Desoxyribonukleinsäure
- Da Dalton
- DNA Desoxyribonukleinsäure
- DNase Desoxyribonuklease
- DTT Dithiothreithol
- E.coli Escherichia coli
- EA Early antigen
- EBV Epstein-Barr-Virus
- FKS fetales Kälberserum
- IFT Immunfluoreszenztest
- kb Kilobasen
- LB-Medium Luria-Bertani-Medium
- mRNA messenger RNA
- NC-Membran Nitrozellulose-Membran
- ori Origin of replication
- OT Objektträger
- PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese
- PBS Phosphat buffered saline
- PCR Polymerase Chain Reaction
- PKC Proteinkinase C
- PLA2 Phospholipase 2
- RNA Ribonukleinsäure
- RNase Ribonukleinase
- rpm rotations per minute
- RT Raumtemperatur
- RT-PCR Reverse Transkriptase-PCR
85
- SDS Sodiumdodecylsulfat
- TAE Trisacetat-EDTA
- TBE Trisborat-EDTA
- TEMED Tetramethylethylendiamin
- TSR Template Suppression Reagent
- U Unit
- UV ultraviolett
86
Danksagung An dieser Stelle möchte ich mich ganz besonders und sehr herzlich bei Herrn Prof. Dr. K.
Ritter bedanken, der mir die Möglichkeit und sehr gute Bedingungen geschaffen hat diese
Arbeit zu erstellen.
Bei Dr. Michael Kleines bedanke ich mich für die gute Betreuung und die konstruktiven
Anregungen zur Korrektur meiner geschriebenen Kapitel.
Dank gebührt auch all den Kolleginnen und Kollegen, mit denen ich zusammen gearbeitet
habe. Die Zeit im Labor hat mir sehr viel Freude gemacht und es ist schön festzustellen, daß
gute Freundschaften dabei entstanden sind. Namentlich erwähnen möchte ich Antje Pätz. Sie
brachte mir mit viel Geduld u.a. die Tricks und Tücken von Computern näher, ohne sie läge
die vorliegende Arbeit nicht in der Form vor.
Name: Claudine Maret
Geburtsdatum: 15.05.72
Geburtsort: Paderborn
Curriculum vitae
Schulbildung
1978 – 82 Stephanus-Grundschule in Paderborn
1982 – 83 Realschule Am Niesenteich
1983 – 88 Realschule Schloß Neuhaus
1988 – 91 Pelizaeus-Gymnasium in Paderborn
Studium
87
1991 – 92 Studium der Biologie an der GHS Kassel
1992 – 94 Studium der Chemie an der GHS Paderborn
1994 – 96 Studium der Humanmedizin als „Externe“ an der RWTH Aachen
1996 – 98 Studium der Medizin an der Universität Ulm
1998 – 03 Studium der Medizin an der RWTH Aachen
88