日消外会誌 29(10):1953～ 1963,1996年

Two color aow cytOmetry法を用いた DNAお よび

PCNA量 定量による大腸癌の悪性度の評価

福岡大学医学部第 2外科

吉 武 裕 明

大腸癌100471について two color aow cytometry法 を用いて核 DNA量 とPCNA labeling rate

(PCNA LR)を 測定 し,臨 床病理学的因子 との関係を検討 した。DNA diplold(DD)は 33例,DNA

aneuploid(DA)は 67例であった。同一検体で 1次抗体を除いたものをnegadve controlとして cut

off値の調整を行い PCNA LRを 測定した。PCNA LRの 平均値は60.25±14.31%で あった。PCNA

LRは ,DDに 比べて DAで 高値を示した(p<0.05).PCNA LRが 高値で DAの 癌は,PCNA LRが

低値で DDの 癌に比ベ リンパ節転移,INF,Dukes分 類で stageの進行 した症例を多 く認めた (p<

001,p<001,p<0.05).予 後は,DDの 癌 とDAの 癌 との間に有意差を認めなかったが,PCNA LR

が高値で DAの 癌は,PCNA LRが 低値で DDの 癌によヒベ有意に不良であった (p<0.05)。 こ のよう

に迅速かつ客観的評価に優れるaow cytometryに よる核 DNA量 とPCNA LRの 検討は,大 腸癌の

悪性度の判定に有用な手段の 1つ と考えられた。

Key words: flow cytometry, DNA, PCNA, colorectal cancer

はじめに

近年種々のモノクローナル抗体が開発され,そ れら

の now cytometry(FCM)へ の応用は免疫学や腫瘍学

の分野で広 く活用されている。PCNA(増 殖細胞核抗

原,prOliferating cell nuclear antigen)は,DNAの

複製に必須であるDNA polymerase δ の補助蛋白で

あ り,増 殖細胞マーカーと｀して注目を浴びてきてい

る1).抗PCNAモ ノクローナル抗体は特に免疫組織学

的に広 く利用されてきているが,標 本の固定条件の違

いにより陽性率がかなり異なることから,そ の検索に

は限界があるともされているの31_方 ,FCMで は

PCNAを 用いて培養細胞の増殖活性 を検索する報告

により,そ の信頼性は認められている4)～ω.

本研究ではDNA ploidy pattern(DPP)で 一般的

に予後が良いとされているDNA diploid(DD)で も予

後不良例が存在 し,逆 に予後不良 といわれ るDNA

aneuploid(DA)で 予後が良好な症例が存在するため,

抗 PCNAモ ノクローナル抗体を用いてそのような症

例の鑑別が可能かどうかを目的に,ま た FACScanを

使 用 しtwo‐color染 色 法 で DPPと PCNA LR

<1996年 5月 8日受理>別 刷請求先 :吉武 裕 明

〒81480 福 岡市城南区七隈 7-45-1 福 岡大学医

学部第 2外科

(PCNA陽 性率,PCNA labeling rate)の関連を検討

し,よ り有用な大腸癌悪性度のパラメーターとするこ

とを試みたので報告する.

対 象

1990年6月 から1993年1月 までに福岡大学第 2外 科

教室で手術された単発大腸癌症例のうち,新 鮮標本か

らFCMで DNA ploidyと PCNA LRを 測定 しえた

100例を対象とした。内訳は男55例,女 45例で,平 均は

638± 10.9歳であった。

方 法

切除手術後,直 ちに大腸痛組織で壊死組織の少ない

短軸方向の周堤の一部を採取 して,compoundで 包埋

後,液 体窒素中 (-196°C)に 凍結保存 した。

(1)腫瘍核 DNA量 および PCNA量 測定

1)新 鮮凍結標本の処理

腫瘍組織5mna3を phosphate buffered saline(PBS)

で 十分に洗浄後,PBSを 加えながら金属メッシュ(212

/m)上 で限科用ハサ ミを用いて細切 した。 1%par_

aformaldehyde(PFA)に て室温 ・2分 問固定後,純

メタノールで-20°C・ 10分間固定 し,01%TritOn X―

100含PBSを 加えながらナイロンメッシュ (45/m)で

濾過 して細胞浮遊液を作製した。検鏡によって Sngle

cell suspendonを確認後,こ の細胞浮遊液を二分し,

24(1954)

Fig. 1 Procedure of double staining \\. ith FITC

labeled ant i -PCNA monoclonal ant ibodv and Pl

NIinc i : rg a f resh t issue ( i rnrnr ' ) on the sta in less -s teel nresh (212)

\ \ iash cel ls in co ld phosphatc buf fcred sal ine ( l ' i lS) . p l l 7 .4

Incubate cel ls in lg i r para{omralc lehlc lc for ? min

\Vash cells in l ' l-lS.

Incubate cel ls in absol t r tc nrctha,r , r l a t 20 C f t r r l l ) r r r i r r

\ \ 'ash cel ls in t ' l lS, pH 7 1, ,uhi 'c l l c , ,n ta ins ' l ' r i ton - \ 1(10.0 l ' )11

I" i l ter throogh n l lon meshes ( .1 . r4nr)

Wash cel ls iu I ' l lS

t ) iv ide in to tq 'o tubcs

contro l . )

DNAお よび PCNA量 定量による大腸用の悪性度の評価

Fig,2 DNA alld PCNA

cancer cells as identined

( ×2 0 ( ) )

H消 外会誌 29巻 10号

expressloll lll colonic

by imnlunofluorescencc

1)モ3S(11)()/rl) PISS(11)(|″1)

FI1 'C Conjugated monoclon:r l nrouse \ louse Ig() (50p1)

Vヽash alld rcstisperld cclis il、1'13S

Add Pr()pidium lodide(1()/資/nll)

FC〕vl allalvsis

一方は対象細胞 (l X 106cellS)にFITC(nuoresceill

isothiOcyanate)標識抗 PCNAモ ノクローナル抗体

PCNA(DAKO,PC‐ 10;10μ19を 4°C・ 1時 間反応

後 prOpidium iodide(PI)(10μg/ml)で 核 DNAを 二

重染色 し,他 方はPI染 色のみの negadve controlと

した (Fig口192).

2)DNAヒ ス トグラム とDNA/PCNAサ イ トグラ

ム

PACScan(Becton Dickinson, USA)を 使用 し 1

～ 2X104個 の細胞の核 DNA量 とPCNA量 を同時 に

測定 した。標本 内の正常組織 の核 DNA量 を control

of colorectal cancer

b ) D N A a n e u p l o l d

F i g。3 D N A h i s t o g r a m

a ) D N A d i p l o i d

」いＯＥコＥ　一一ｏΦ

、ゅＯＥョＥ　一一ｏ０

PI(DNA)oontentP I ( O N A ) c o n t e n t

1996年10月

とし,DPPは ,GO/Gl peakが 単一の症例をDNA

diploid(DD), 2つ以上GO/Gl peakの あるものを

DNA aneuploid(DA)と 分類した (ng,3).DNA/

25(1955)

PCNAサ イトグラムは,X軸 に核 DNA量 をY軸 に

PCNA量 を表示した.PCNA LRは ,negative control

におけるFITCの 最高蛍光強度をcut or値とし,測定

Fig. 4 PI-FITC two parameter analysis of colorectal cancer

a ) D N A d i p l o i d b ) D N A a n e u p l o i d

Fig. 5 PI-FITC two parameter analysis of colorectal cancer

a ) D N A d i p t o i d け DNA aneu口loid

Fis. 6 Colorectal cancer cells which are reactive immunohistologically withanti-PCNA monoclonal antibody ( x 200)

やＥＤヤ宮０一０一一」

中一０やＥ０００卜一」

やＥＯヤＥ００　（＜え０」）０い一」

中ＥＯヤＥ００　（くた０」）０卜一」

c o n t r o I

P I ( D N A ) l o n t e n t

c 0 n t r 0 l

P10NA)oontent

P i ( D N A )●o n t e n t P l ( D N A ) c o n t e n t

26(1956)

Table l Ciassincation into

ploidy pattern and PCNA

I- lV group by DNAlabeling rate

DNAお よび PCNA景 定景による大腸癌の悪性度の評価 日 消外会誌 29巻 10号

gr(〕up I :PCNA

II:PCNA

III:PCNA

IV:PCNA

L R < 5 6 a n d D N A d i p l o i d

L R≧ 5 6 a n d D N A d i p 1 0 i d

L Rく 6 3 a n d D N A a n e u p l o i d

L R≧ 6 3 a l l d D N A a n e u p l o i d

Total

細胞数中の染色陽性細胞数の割合 とした (Fig.4,5).

(2)PCNAの 免疫組織学的検討

1)処 理過程 と染色方法

20例については新鮮凍結標本からcryostatで厚さ5

/mの 凍結切片を作製し,PFA/純 メタノールで固定後

ABC法 にて PCNA免 疫組織染色を施 した。

2)PCNA陽 性率の判定

光学顕微鏡にて,異 なる5視 野で癌細胞500～1,000

個あた りの核が赤色を示す PCNA陽 性細胞率を算出

した(Fig.6).判定にあたってはこれを3回 繰 り返 し,

その平均値を PCNA陽 性細胞率 とした。

(3)臨 床病理学的検討

臨床病理学的項 目は大腸痛取扱い規約Dに よった。

Dukes分 類ヤまTurnbullら 3)ャこょるDukes分 類変法を

用いた。臨床病理学的因子 との関係 については,

PCNA LRと DPPか ら下言己の 4群 に分 けて検討 を

行った (Table l).

I群 :PCNA LR(56%未 満)で DD

II群 :PCNA LR(56%以 上)で DD

III群:PCNA LR(63%未 満)で DA

IV群 :PCNA LR(63%以 上)で DA

患者の転帰については1995年9月 現在であらわし,

腫瘍死を死亡 として扱った。

(4)統 計学的解析

統計学的検定ヤこはだ‐test, generalized Wilcoxon

testおよび Kruskal,Wallls testを 用い,生 存曲線は

Kaplan Meier法 にて求 め,generalized Wilcoxon

testおよび log rank testにて生存率の解析を行った。

成 績

1,腫 瘍核 DNA量 と分布様式

大腸癌100例の DPPは ,DD 33例 (33%),DA 67例

( 6 7 % ) であった。測 定 精 度 の 指 標 とな るC V 値

(coettcient of variation) ヤま, peak channei number

と高さの半分の幅よ り%で 表 されるが,そ の平均 は

464± 108%(2.3～ 70%)で あった。 ま た,DAに お

Table 2 Relationship between DNA ploidy pattern

and PCNA labr l ing rate

Cヽ (%) DI PCNA LR(%)

Diplo id

Aneuploid

4 7 7 ±1 0 9

458± 108

1 0

1 5 2 ±0 2 4 談薬i掛蕊]“p<005

いて腫場組織内の正常 2倍体の位置 と検体の 2倍 体の

位置の比率より算出するDNA index(DI)は ,1.2か

ら3_0の範囲に分布 し,平 均値152± 024で あった。

11<DI<1_5が 29例,DI≧ 1.5が38例であった (Table

2).

2. PCNA LR

PCNA LRの 平 均 は,60,25± 14_31°/。

(135～ 903%)で あった。ABC法 によるPCNA免 疫

組織染色陽性では,腫 場細胞の核内に赤色に染色され

る物質を認めることができる(Fig.6)。そこで両者が

同時に測定された20911について,PCNA LRと PCNA

陽性細胞率 とを比較するとY=16.22+06868・ X,r=

0.6864(p<0001)と 有意な相関関係を認めた (Fig.

7).

3.DIと PCNA LR

DIと PCNA LRと の間に有意の相関を認めなかっ

た。

4, DPPと PCNA LR

DD群 および DA群 におけるPCNA LRの 平均値

はそれぞれ5557± 1476%,62.56± 13_60%で ,DPP

によって DD群 とDA群 との間に PCNA LRに 有意

差を認めた (p<0.05)(Table 2).

5.臨 床病理学的因子 との関係

DPPと 臨床病理学的因子との間には,組 織型,壁 深

達度,脈 管侵襲,INF, リ ンパ節転移 (n因子),腹 膜

播種性転移 (P因子),肝 転移 (H因 子),組 織学的進

行度,Dukes分 類のいずれ とも関連 を認めなかった

(Table 3).

PCNA LRと 臨床病理学的因子を検討すると,組 織

型では,PCNA LRは 分化型腺癌に比べて低分化型腺

癌で高値を示 し,両 群間で有意差を認めた(p<0.05).

壁深達度では,PCNA LRは ss(al)も しくはsi(ai)

でやや低下したが,m,sm群 とmp以 上群で比較する

と,mp以 上群で有意の高値を示 した(p<0.05).脈 管

侵襲では,陽 性の程度が高度になるにつれて PCNA

LRは 高値を示し,lyO lとly2,3および VO,1とv2,3との間

に有意差を認めた (p<0.05).INFに 関しては浸潤性

Factor Diplold Aneuploid

Sex

Histological type

Depth of invasion

M

F

well

mode

poor

others

m

sm

mp

ss(a1)

s (a2)

si (ai)

( 5 7 6 )

(42 4)

(42 5)

( 5 1 5 )

( 3 0 )

( 3 0 )

( 3 0 )

( 6 1 )

( 6 1 )

( 1 8 2 )

(63 6)

( 3 0 )

3 6 ( 5 3 7 )

31(46 3)

31(46 3)

28(41 7)

6 ( 9 0 )

2 ( 3 0 )

1 ( 1 5 )

2 ( 3 ( ) )

10(14 9)

13(19 4)

39(58 2)

2 ( 3 0 )

Lymphatic vessel invasion

Venous invasion

INF

Lymph node metasyasis

Liver metastasis

Peritoneal dissemination

Iy

β

γ

n0

n ( 十 )

( ― )

( 十 )

( ― )

( 十)

1

1

1,

8

4

1(

1〔

2

1〔

1こ

2(

i

31

( 1 2 1 )

(45 5)

(33 3)

( 9 1 )

( 1 2 1 )

( 5 1 5 )

(24 2)

( 1 2 1 )

(48 5)

(45 5)

( 6 1 )

(54 5)

(45 5)

(78 9)

( 2 1 1 )

(93 9)

( 6 1 )

5 ( 7 5 )

39(58 2)

15(22 4)

8 ( 1 1 9 )

7 ( 1 0 4 )

44(65 7)

9 ( 1 3 4 )

7 ( 1 0 5 )

19(28 4)

40(59 7)

8 ( 1 1 9 )

42(62 7)

25(37 3)

59(88 1)

8 ( 1 1 9 )

64(95 5)

3 ( 4 5 )

Histological stage

Dukes classification

Ｏ

Ｉ

Ｈ

ＩＩＩ

ＩＩＩ

ＩＶ

Ａ

Ｂ

Ｃ

Ｄ

1 ( 5 0 0 )

4(73 3)

12(69 2)

5(64 3)

4(63 6)

7(63 2)

6 ( 1 8 2 )

12(36 4)

9(27 2)

6 ( 1 8 2 )

1 ( 5 0 0 )

11(26 7)

27(30 8)

9(35 7)

7(36 4)

12(36 8)

15(22 4)

24(35 8)

20(29 9)

8 ( 1 1 9 )

1996年10月

T a b l e 3 R e l a t i o n s h i p b e t w e e n D N A p l o i d y

terns and clinicopathological IIndings in

colonic cancer

27(1957)

類では,Dukeぎ Dを 除 くとstageが進行するにつれて

PCNA LRは 高値 を示 し,Dukes'Aと Dukes'B以

下,Dukeぎ A,Bと Duens'C,Dの 間には有意差を認

めた (p<001)(Table 4).

Subclass化における検討では, I～ IV群間で組織

型,深 達度,脈 管侵襲,P因 子,H因 子,組 織学的に

stageにおいて有意差を認めなかった。一方,INF,n

因子,Dukes分 類ではそれぞれ I～IV群間に有意差を

認めた (p<0.01, p<001, p<005)(Table 5).

6.累 積生存率

大腸癌100例における累積生存率,治癒切除が施行さ

れた79例の累積生存率 とその各 stage別の累積生存率

についての検討を行った。

1)DNA ploidy patternと 生存率

DD群 に比べて DA群 の予後が悪い傾向を示 したも

のの,両群間において有意差を認めなかった(Fig.8).

さらに各 stage別の累積生存率で も有意差 を認めな

かった。次にDA群 の中でもDNA量 の多寡による生

存率の影響を検討するためにDA群 を1.1<DI<1.5,

DI≧ 1.5の 2群 に分けたが,DI≧ 1.5群が予後不良の傾

向 を示 した ものの各群間に有意差 を認 めなかった

(Fig。 9)。

2)PCNA LRと 生存率

PCNA LRが 60%以 上の陽性率を示 した症例 を H

群,60%未 満の症例を L群 として両群間の累積生存率

の比較を行ったところ,L群 に比べて H群 が予後不良

の傾向を示し両群間に有意差を認めた(p<0.05)(Fig.

10)。しかし,各 stage別の H群 ,L群 別累積生存率で

は両者間に差を認めなかった。

3)Subclass化 と生存率

I～ IV群間の累積生存率は,II,IV,III, I群 の順

に予後が良好の傾向を示 し,全 症例では I群 に比べて

IV群が予後不良の傾向を示し,両 群間に有意差を認め

た(p<0.05)(Fig,11).各 stage別の累積生存率では

有意差を認めなかった。

7.再 発 との関連について

PO,HO,nO,M(一 )の 大腸癌に対 して治癒切除手

術が施行された57症例の局所 ・転移再発について検討

を行った。無再発群は53例,局 所 ・転移再発群は 4例

(局所 2例 ,肝 1例 , リンパ節 1例 )で あった (Table

6).

1)DNA ploldy patternと 再発

DD群 とDA群 の両群間において,再 発数に有意差

を認めなかった。

pat―

the

: %

になるほどPCNA LRは 有意の高値 を示 した (p<

0.01)。リンパ節転移程度 との関連性はなかったが,転

移陰性 〔nO〕に比べて,転 移陽性 〔n(十 ))で PCNA

LRは 高値を示し両群間に有意差を認めた (p<0.01),

腹膜播種性転移および肝転移については,転 移陽性 P

(十)・H(十 )と PCNA LRの 間に有意差を認めなかっ

た。組織学的進行度では,stage IV症例を除 くとstage

が進行するにつれて PCNA LRは 高値を示 し,stage

O, I とstage II以二L, stage O, I, II とstage IIIa以

上,stage O,I,II,IIIaとstage IIIb以上の間に有意

差を認めた (p<0.05,p<001,p<005)。 Dukes分

28(1958)

Fig. 7 The relationship between PCNA labelingrate and positive staining of PCNA

Fig. 8 Relationship between DNA ploidy patternand survival rates

1 0 0 0 1 5 0 0

DarS atter sur98ry

b) Cura t i ve opora t rd casss

0 5 0 0 1 o 0 0 1 5 0 0

Days after Sur98ry

2)PCNA LRと 再発

再発数は L群 に比べ H群 で有意に多 く,再 発群の

PCNA LRは ,無 再発群 よりも有意に高値を示 した

(p < 0 . 0 5 )。

3)Subclass化 と再発

無再発群 (53例)と 局所 ・転移再発群 (4例 )と の

検討では Iと II群間,IIIとIV群間に有意差 を認めた

(p<0,01).

DNAお よびPCNA量 定量による大腸癌の悪性度の評価 日 消外会誌 29巻 10号

９８

８８

７０

側

５０

４０

３０

２８

Table 4 Relationship between PCNA labeling rateand clinicopathological findings in the coloniccancer

Ⅲ:p < 0 0 1 , ⅢⅢ: p < 0 0 5

考 察

FCM法 の開発により迅速かつ客観的なDNA測 定

が可能 となり悪性腫瘍における核 DNA量 の意義につ

いて詳細に検討されるようになってきた,FCMは 核

DNA量 を測定できるばか りでな く,細 胞の種々の抗

原量 といった他のパラメーターと同時に測定すること

力Sできる。Two color now cytOmetryは , 1つ の細

胞に2種 の抗体を用いて二重染色 し同時に2つ の細胞

抗原を測定する手法で,細 胞を同時多元的に解析でき

るのが特徴であり,さ らにはmulti‐parameter analy

s i s も可 能 で あ るの. 実 際, F C M に よ るm u l t i p a r ‐

仰

肺淵

判

判

７０‐合）

母

運

一Ｇた

こ争∽

Factor PCNA LR

Sex

Histological type

Depth of invasion

mp

報 (al)

s(a2)

s i ( a l )

Ｍ

Ｆ

ｗｅｌｌ

ｍｏｄｅ

ｐ。。ｒ

ｏｔｈｅｒｓ

ｍ

ｓｍ

動

一引

ゴ

十一　十一　十一　十一　十一　十一　十一　十一　十一　十一　十一　十一

Lymphatic vessel invasion

Venous invasion

I N F

Lymph node metasyasis

Liver metastasis

Peritoneal dissemination

β

γn0

n ( + )

( ― )

( 十 )

( ― )

( 十 )

Ｌ郵

Ｌ郵

孔ゴ

計

２８９４８２２８６２０８０３面８３８５０３０５５９６４４３３７２７

一凱一一立北封封一一±‐‐．地凱主主主主

８

７６

９０

７

３５

２‐

１６

５

９３

０５

４４

２５

４０

３８

・８

９８

３

監撤は徹五撤徹６９撤骸仏血位撤伍臥伍

Histological stage

Dukes classification

Ｏ

Ｉ

ＩＩ

‐Ｉ‐

Ｍ

Ⅳ

Ａ

Ｂ

Ｃ

Ｄ

コ

郵

５．一劇抑ｎ沼測河抑メ

５

．

１４

‐５

‐３

‐２

‐０

‐３

‐６

９

‐２

確理的印∽般取理碑酸

sm a)Ali caseS

Factor group I [V

Sex

Histological type

Depth of invasion

ＭＦ

ｗｅｌｉｍｏｄｅ叩ｏｔｈｅｒｓｍSM

mp

ss (a1 )s (a2)

si (ai)

9 ( 5 6 2 )

7(43 8)

10(62 5)

6(37 5)

0

0

1(6 25)

2 ( 1 2 5 )

2 ( 1 2 5 )

4(25 0)

6(37 5)

1(6 25)

1 0 ( 5 8 8 )

7 ( 4 1 2 )

4(23 5)

11(64 7)

1 ( 5 9 )

1 ( 5 9 )

0

0

0

2 ( 1 1 8 )

15(88 2)

0

1 7 ( 5 1 5 )

16(48 5)

17(51 5)

13(39 4)

1 ( 3 0 )

2 ( 6 1 )

1 ( 3 0 )

2 ( 6 0 )

6 ( 1 8 2 )

9(27 3)

15(45 5)

0

1 9 ( 5 5 9 )

15(44 1)

14(41 2)

15(44 1)

5 ( 1 4 7 )

0

0

0

4 ( 1 1 8 )

4 ( 1 1 8 )

24(70 6)

2 ( 5 8 )

Lymphatic vesel invasion

Venous invasion

INF

Lymph node metasyasis

Liver metastasis

Peritoneal dissemination

ly

β

γ

n0

n ( 十 )

( ―)

( 十)

( ― )

(十 )

4 ( 2 5 0 )

9(56 3)

2 ( 1 2 5 )

1 ( 6 2 )

3 ( 1 8 8 )

8(50 0)

3 ( 1 8 8 )

2 ( 1 2 4 )

10(62 5)

5 ( 3 1 3 )

1 ( 6 2 )

13(81 3)

3 ( 1 8 7 )

13(81 3)

3 ( 1 8 7 )

15(93 8)

1 ( 6 2 )

0

6(353)

9(529)

2(118)

1(59)

9(52 9)

5(29 4)

2 ( 1 1 8 )

6(35 3)

10(58 8)

1 ( 5 9 )

5(29 4)

12(70 6)

13(76 5)

4(23 5)

16(94 1)

1 ( 5 9 )

3 ( 9 1 )

20(60 6)

8(24 2)

2 ( 6 1 )

4 ( 1 2 1 )

24(72 7)

4 ( 1 2 1 )

1 ( 3 1 )

14(42 4)

19(57 6)

0

24(72 7)

9(27 3)

31(93 9)

2 ( 6 1 )

32(97 0)

1 ( 3 0 )

2 ( 5 9 )

19(55 9)

7(20 6)

6 ( 1 7 6 )

3 ( 8 9 )

20(58 8)

5 ( 1 4 7 )

6 ( 1 7 6 )

5 ( 1 4 7 )

2 1 ( 6 1 8 )

8(23 5)

18(52 9)

16(47 1)

28(82 4)

6 ( 1 7 6 )

32(94 1)

2 ( 5 9 )

Histological stage

Dukes classification**

Ｏ

Ｉ

Ｈ

Ｉ Ｉ Ｉ

ＩＩ Ｉ

Ｉ Ｖ

Ａ

Ｂ

Ｃ

Ｄ

1 ( 6 3 )

4(25 0)

7(43 7)

1 ( 6 3 )

0

3 ( 1 8 7 )

5 ( 3 1 3 )

8(50 0)

0

3 ( 1 8 7 )

0

0

5(295)

4(23 5)

4(23 5)

4(23 5)

1 ( 5 9 )

4(23 5)

9(52 9)

3 ( 1 7 7 )

1 ( 3 0 )

7(24 2)

13(39 4)

5 ( 1 5 2 )

4 ( 9 1 )

3 ( 9 1 )

11(33 3)

11(33 3)

8(24 2)

3 ( 9 2 )

0

3(88)

14(412)

4(118)

8(118)

9(26 4)

4 ( 1 1 8 )

13(38 2)

12(35 3)

5 ( 1 4 7 )

1996年10月

( ):%,Ⅲ :p<001,ⅢⅢ:p<005

ameter解析を用いた臨床応用例 として,婦人科領域で

の smearを 用 いた癌 検 診 の ス ク リーエ ングが あ

る1の111最近,細胞の増殖 と密接に関連 した物質に対す

る抗体が作製され,通 常の免疫学的手法によって細胞

の増殖能を簡単に知ることが可能になったが, これら

の増殖マーカーの細胞レベルでの定量的解析には,客

観性のあるFCMの 利用が便利で,精 度さらには測定

に要する時間のうえからも有用と考えられる。

細胞核 DNA量 の研究については,Atkin12jにより

細胞核 DNA量 が癌の進展や予後を反映する重要な因

子であると報告されて以来,肺癌lめ,食道癌lり

,胃癌1"

においても研究が進められ,臨 床病理学的所見 とは独

立 した意味で DPPや 予後 と密接に関係 しているとい

29(1959)

う報告がみられている。大腸癌では,核 DNA量 と臨床

病理学的因子 との関連については,種々の報告1い～1めを

みるが,わ れわれの結果からは,DPPと 組織型,壁 深

達度,脈 管侵襲,INF,n因 子,P因 子,H因 子,組 織

学的 stage,Dukes分 類 との間には有意な相関関係を

認めず,ま た DIも いずれの因子 とも有意な相関を認

めなかった。

また,近 年,種 々の悪性腫瘍において増殖能や腫瘍

関連抗原の発現が,そ の悪性度 と関係するであろうこ

とが報告されてきている1り.増殖細胞の指標 として,従

来3H_thymidine(3H_TdR)や 5‐bromodeoxyuridine

( B r d U )によるS期細胞の i n v i v o標識が行われてき

たが, i n v i v o標識 は3 H _ T d Rによる放射性被 曝や

Table 5 Clinicopathological findings in view of DNA ploidy pattern andPCNA labeling rate

30(1960)

Fig. 9 Relationship between DNA index and sur.vival rate

s 1 9 a ) A l l c a s e s

DNAお よびPCNA量 定量による大腸癌の悪性度の評価 日 消外会誌 29巻 10号

1 0 0 0 1 5 0 0

Days after Sur,ary

b ) C u r a t i v o o p 6 r a t s d c a s . s

1 8 0 0 1 5 0 0Deys aft6r Sura。「y

Fig. 10 Relationship between PCNA labeling rateand survival rates

0 5 0 0 1 0 0 0 1 5 0 0

DarS 8fter Surgery

b ) C u r a t i v 8 0 , 3 r a t e t c a s e s

1 0 0 0

Days after Sur9ery

Fig. 11 Survival rates according to I-IV groups

by PCNA labeling rate and DNA ploidy pattern

s 1 p e ) A l l c a s a s

1 0 0 0 1 5 0 0

32ys after Surgery

S1p b) Cura t iv r oP l ra ted c8s .sGroug I ln=13)

1 0 8 0 1 5 0 0

D8,S after Sur38r,

BrdUの 発癌性に問題があり,現 在では行われていな

い.こ れに代って,各 種モノクローナル抗体の開発に

より,DNA合 成酵素であるDNA polymerase αや増

殖期核分画抗原であるKl-67など細胞内に存在する蛋

白を染色することによって,増 殖細胞が識別できるよ

うになってきた2の211

PCNAは cyclinともよばれる)停ヒス トン核蛋白質

(分子量36kD,等 電点4.8)で,増 殖サイクルの主 とし

て Gl後 期からS期 にかけて細胞核内に蓄積 し,細 胞

増殖に直接関与 しているDNA合 成酵素であるDNA

polymeraseび の補助因子 として機能 していることが

知 られている1ンの.抗 PCNA抗 体は特に免疫組織化学

的手法にて広 く利用されており,基 礎的および臨床分

野に有益な情報を提供 している。Robbinsら 2りはヒト

の悪性腫瘍において PCNA陽 性細胞の比率が多い腫

瘍組織ほど組織学的悪性度や分裂指数が高いことを,

西村 ら24)はヒト大腸腫瘍 において PCNA陽 性細胞の

比率が腫瘍の異型度 と相関していたことを報告してい

る.

そこで,本 研究では FCMで の PCNA LRの 測定法

について検討 した。PCNAの 応用上の問題点 として,

PCNAは 固定条件の影響を受けやす く,通常の10%ホ

母

ｏ】選

電＞一〓湯

３

ｏ葛仁一雲一チＬ〓

1 0 0

90

00

70

80

50

40

30

20

1くDIく15(1=29)

D l二1. 5 ( n = 3 8 )

００

００

００

７０

８０

５ ０

４ ０

３０

２０

１０

０

８

ｏ電“一母〓Ｌ湯

８

０ヤ淫

再ｉ壬テ

1

的

００

９０

冊

７０

冊

５０

４０

３０

２０

＝

８

８

ｏ電“一軍一こ房

仰

００

３８

８０

７０

６０

５０

制

Ｇ

ｏや運

電二≡」云

a ) l l l c a s o s

Recurrence

( 十) ( 一 )

DNA ploidy pat tern DiploidAneuploid

1 8 ( 3 1 6 )

39(68 4)

2 ( 1 1 1 )

2 ( 5 1 )

16(88 9)

37(94 9)

PCNA LR・ ・ 7155± 1236 5483± 14

Ｌ

Ｈ

34(59 6)

23(40 4)

0

4 ( 1 7 4 )

3 4 ( 1 0 0 )

19(82 6)

group* Ｉ

ＩＩ

ｍ

Ｉｖ

13(22 8)

5 ( 8 8 )

22(38 6)

17(29 8)

0

2(400)

0

2 ( 1 1 8 )

13(100)

3(60 0)

22(100)

15(88 2)

1996年10月

ルマ リンに48時間以上浸漬されたものは染色性の低下

を免れないとされている251中野 ら2いはェタノール も

しくは緩衡ホルマ リン固定を行っており,本 研究では

新鮮生細胞をPFA/メ タノール固定し良好の結果を得

ている。また,Carciaら2のはァルコール系固定パ ラ

フィン切片を用いて,免 疫組織化学的な PCNA陽 性

スコアと,同 一症例の新鮮材料を用いた FCMで 得 ら

れた増殖活性 とがほぼ一致することを示 した。本研究

では,PCNA陽 性 ・陰性の境界をFCMで 陽性率を算

定する際の一般的な方法であるnegative controlにお

けるFITC標 識最高点 とした2働1"。この境界により算

定された PCNA LRは ,免 疫組織化学染色で測定した

PCNA陽 性率 とほぼ一致していることから,サ イ トグ

ラム上でのこの境界区分は妥当と考えられる。

その結果,PCNA LRは 病理組織学的所見 とよく相

関し,低 分化腺癌, リンパ節転移陽性,脈 管侵襲陽性

中等度以上 で有意 に高値 を示 し,INF,組 織学 的

stage,Dukes分類の進んでいるもので,有意に高値を

示 した。菊山ら3いは BrdUを 用いた実験腫瘍の検討か

ら,腫 瘍倍増時間 (tumOr doubling time)はDNA合

成期 (S期)細胞標識率 と負の相関関係を示すと報告し

ており,DNA合 成期細胞標識率が高値の癌は,浸潤が

著 しく,ま た増殖速度 も速い可能性があると考えられ

た.Waldmanら 31)は勝眺癌で Brdu標 識率 とPCNA

標識率は相関してお り増殖能 も高いことを報告してお

り,本 研究の結果で n(十 )群 ,INFの 進んでいるも

ので PCNA LRが 有意に高値を示したことは,増 殖速

度が速 く,浸 潤の著 しい癌,ま た高い転移能を持つ癌

とPCNA LRが 相関することを示唆 していると考え

られる。

31(1961)

DPPと PCNA LRと の関係を検討すると,DA群 が

DD群 に'ヒベて高い PCNA LRを 示 したことより,増

殖能の高い癌が DAを 呈するという報告3のと矛盾しな

↓ゝ。 そ こで DPPと PCNA LRか ら対 象 を I群

―PCNA LR(56%未 満)で DD,II群 ―PCNA LR

(56%以 上)で DD,III群 ―PCNA LR(63%未 満)で

DA,IV群 一PCNA LR(63%以 上)で DAの 4群 に分

類 し検討を行ったところ,II群 は I群 に比べ,IV群 は

III群よりn(十 )お よび INF,Dukes分 類において進

行 した症例が有意に多 く認められ,大 腸癌の悪性度の

判定にDPPと PCNA LRの 併用が意味あるものと考

えられた。

予後は,大 腸癌では一般にDA群 はDD群 に比べ予

後不良で予後半J定の重要な因子の 1つ とも考えられて

いる1。3り.自験例の検討でも,両群間に有意差はなかっ

たが DA群 の方が DD群 に比べ予後が悪い傾向を示

し,ま た組織学的 stageを考慮 しても同様の傾向を認

めた。また,Petersenら33)はDIが 15前 後の腫瘍が予

後が最 も悪いと報告している。そこで,われわれもDA

群の DNA量 の多寡による生存率の差について検討 し

た。DAを 1.1<DI<1.5,DI≧ 15の 2群 に分けそれぞ

れの生存率を解析 したところ,DI≧ 1.5が予後不良の

傾向を示したものの 2群 間に有意差を認めなかった。

DNA量 が多い腫瘍の予後が悪 くなる機序 としては,

癌の増殖や浸潤,転 移を促進させる遺伝子の増幅の関

与などが推察されるが未だに明らかにされていない。

自験例では,DIと PCNA LRと の間に相関関係を認

めなかった。

大腸癌におけるPCNA LRと 予後に関する報告は

多 くはない34L 胃癌において,中 野 ら2的はPcNA LR

Table 6 Recurrence in view of DNA ploidy pattern, PCNA labeling rateor I-IV groups by DNA ploidy pattern and PCNA labeling rate

32(1962)

平均値44%で 2群 に分けたところ,PCNA LRが 44%

を越える群は,そ れ以下の群よりも予後不良の傾向を

示したと報告している.本研究の結果では,PCNA LR

の平均値である60%以 上の陽性率を示 した症例 を H

群,60%未 満の症例をL群 として両群間の累積生存率

の比較を行ったところ,L群 に比べて H群 が予後不良

の傾向を示した。

これまで癌患者の予後を推定 し,治 療方針の決定を

目的とした核 DNA量 測定の論文が多 く発表されてい

る。すなわち,生物学的にheterogenousである癌忠者

おのおのの予後を,高 い精度で予測することは,臨 床

医学上きわめて重要である。現在のところでは,こ の

核 DNA量 の変異すなわち DPPの みで患者の予後を

確 実 に判 断す る こ とは不可能 で あ り,DIに 加 え

proliferative fractionの有用性が注目されているもの

の核 DNA量 の測定のみで患者の予後を推測すること

はできないともいわれている35鴻ω.さ らに,DPPを 考

える場合,多 くの悪性腫瘍において DAは 高い頻度で

みられ,DAの みをとりあげたのでは,当然ながら不十

分 と思われる。したがって予後判定は,他 の因子 も考

慮 して総合的に行 うことでより正確 となると考えられ

る。そこで前述の I～ IV群間で予後の検討を行ったと

ころ,II群 よりもI群 ,IV群 よりIII群で予後良好の傾

向が示され,DPPと PCNA LRを 併用するとより詳

細な予後判定ができる可能性が示唆された。一方,悪 性腫瘍の治癒切除術後の再発は予後を左右

する重要な因子であり,ま た再発危険例を予知し,迅

速に適切な治療 と経過観察を行 うことは臨床上重要な

ことである。本研究の結果では,DD群 とDA群 の両群

間において再発数に差を認めなかった力S,PCNA LR‐

H群 は再発例が多 く,さ らに, I～ IV群における無再

発例 と再発例の検討では, I群 よりII群で,III群より

IV群で再発に有意に多 く認めたことより,PCNA LR

が,高い転移能を持つ癌の鑑別の一指標になり,DD群

とDA群 の中で もさらに増殖能が高 く悪性度の高い

癌を見分けることができると考えられた。

以上,癌 の生物学的悪性度を知るひとつの手がかり

として,FCMに よる腫瘍細胞核 DNA量 の測定が脚

光 を浴び大腸癌の予後判定に広 く応用されるように

なったが,DAの 出現は悪性腫瘍に特有な現象ではな

く,また,DAの 細胞のみからなる悪性腫瘍 も少なくな

いため,核 DNA量 のみを病変の悪性度の診断に用い

るには限界があり,そ の悪性度 と関係するであろう腫

瘍の増殖能をPCNA LRで 評価することにより予後

DNAお よび PCNA量 定量による大腸癌の悪性度の評価 日 消外会誌 29巻 10号

判定 をより正確 にできると考 えられた。Two color

aow cytometry法 による大腸癌 の悪性度の報告 は少

な く,迅 速でかつ客観的評価に優れ る FCMを 用いた

DPPと PCNA LRの 測定は,大 腸癌の悪性度の判定

に有用な手段 と 1つ となる可能性が示唆された。

文 献

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Evaluation of DNA and PCNA by Two Color Flow CytometricAnalysis in Colorectal Cancers

Hiroaki YoshitakeSecond Department of Surgery, School of Medicine, Fukuoka University

Two color flow cytometric analysis of DNA and a labeling rate of proliferating cell nuclear antigen(PCNA LR) was performed on cancer cells of 100 cases with colorectal carcinoma in relation toclinicopathological factors. DNA analysis demonstrated a diploid pattern in 33 cases and aneuploid in 67cases. The mean of PCNA LR was significantly higher in cases with aneuploid pattern than in those withdiploid pattern. Regarding as lymph node metastasis, IFNy and advanced Dukes classification were morefrequent in cases with high PCNA LR and aneuploid pattern than in those with low PCNA LR and diploidDNA (p<0.01, p<0.01, p<0.05), respectively. The survival rate was signif icantly lower in cases withhigh PCNA LR and aneuploid pattern than in those with low PCNA LR and diploid pattern. These resultssuggest that DNA-PCNA dual fluorescence analysis by flow cytometry might give effective parameter onevaluation of malignant potency of the colorectal carcinoma.

Reprint requestss Hiroaki Yoshitake The Second Department of Surgery, School of Medicine, Fukuo-ka UniversityFukuoka, 814-80 JAPAN