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TruSeq DNA PCR-

Free Sample Prep

のご紹介

酒井 名朋子

Sr Technical Applications Scientist

イルミナ株式会社

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Outline

1. TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep kitのご紹介

2. 従来のTruSeq DNA キットとの違い

3. TruSeq DNA PCR-Free の操作手順とベストプラクティス

4. トラブルシューティング

3

TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep kit のご紹介

半日で終わるPCR-Free プロトコル

– ビーズで行うサイズセレクション

ビーズもキットに含まれます。

Gel free

– 2 種類のinsert sizeに対応

350bp と550bp

– LT (24 sample) とHT (96 sample) をご用意

Reference 配列に対して高いCoverage

– GapとPCR biasをクリア

– high GC/AT rich regionsに対しても高いCoverage

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TruSeq DNA PCR-Free Sample Prepのご紹介

-Data 品質の改善

PCRによるバイアスを低減

Library 間のバイアスとギャップを低減

GC/AT リッチな領域のCoverageを増加

*詳細はData sheetをご確認ください。

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従来のTruSeq DNA キットとの違い

-特徴について

従来のTruSeqDNA TruSeq DNA PCR-Free

PCR step の有無 有 無

平均Insert サイズ 300-400bp (gel size selectionの場合)

350 bp

550 bp

Input DNA 量 1ug 1ug (350bp)

2ug (550bp)

1kitでのサンプル数 LT: 48サンプル

HT: 96サンプル

LT: 24サンプル

HT: 96サンプル

Indexの数 LT: 24 種類 (kit A, kit Bで12種類ずつ)

HT: 96種類

ご準備いただくビーズ AMPure XP beads SPBビーズはkitに付属

所要時間 1-2日 ～5時間

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従来のTruSeq DNA キットとの違い -手順について

TruSeq DNA TruSeq DNA PCR-Free

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TruSeq DNA とTruSeq DNA PCR-Free Sample Prep

どちらのキットを使用するか？

アプリケーション TruSeq DNA TruSeq DNA

PCR-Free

Whole Genome

解析 Yes YES

TruSeq

Enrichment YES NO

メチル化解析 YES

(LT only) NO

DNA の量が限られている場合

YES

(1ug)

Yes

(1ug/2ug)

推奨リード長 ≤ 2x101 ≤ 2x101 for 350 bp

≤ 2x151 for 550 bp

http://www.illumina.com/applications/detail/sequencing/dna_sequencing.ilmn

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TruSeq DNA PCR-Free Sample Prepの手順

-手順と重要なポイント

A) DNAの断片化

B) 平滑末端化

C) サイズセレクション

D) 3’ Add A

E) Adapterのライゲーション

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TruSeq DNA PCR-Free Sample Prepの手順

-ビーズによるSize Selection

C) 断片のサイズ分布を限定する

– Bead によるsize selection

350 bp

550 bp

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TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep の手順 Sample Purification ビーズ (SPB)

ビーズはKit に含まれます

サイズセレクションと精製に使用

希釈に使用するビーズの使用量でDNAのサイズ分布を決定

http://core-genomics.blogspot.jp/2012/04/how-do-spri-beads-work.html

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TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep の手順 -2段階ビーズ精製によるサイズセレクション

希釈無しで

ビーズを使用

Magnet に

乗せる

上清を捨てる

EtOH でWash

Pellet を乾燥させる

beads を

RSBに懸濁

Step 1: 高分子側を除く Step 2: 低分子側を除く

※上清にターゲットサイズ分布を含むDNAが含まれます。

※希釈無しビーズがターゲットサイズのDNAを吸着し、RSBに

懸濁するまでビーズと結合をしています。

使用済ビーズを捨てる

ビーズの希釈

サンプルとビーズの混合

Magnetに

乗せる

上清を保持

希釈率はインサートサイズにより異なる

上清にDNAが含まれる

第2段階では希釈無でビーズを使用

DNAはビーズに吸着

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断片化されたDNA,

サイズセレクション前 サイズセレクション後

Size Selection Workflow 2段階ビーズ精製によるサイズセレクション

Step 1:

高分子側を除去

Step 2:

低分子側を除去

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TruSeq DNA PCR-Free Sample Prepの手順 手順と重要なポイント

E) Adapterのライゲーション

– BioAnalayzer結果ではLibrary サイズが高分子側に出現

– 定量はqPCRにて行う

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TruSeq DNA PCR-Free librariesの定性評価 Bioanalyzer 結果

Bioanalyzer フォークアダプターが原因で高分子側に結果が出る

Libraryの定性評価には有効、定量評価には無効

350bp

550bp

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TruSeq DNA PCR-Free librariesの定量評価 qPCR による定量

完全なLibraryのみqPCRで定量可能

qPCR 最終的なLibraryの定量にはqPCR を使用

KAPA社製 kit （standard付き）を推奨

-Bioanlayser とQubit は定量には無効

-Picogreen による定量は再現性が低い

×

× ×

×

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qPCRでの定量方法 定量レンジ 2-40nM

User Guideに記載のあるqPCR による定量法

できるだけ多容量で定量を行うこと(2µl)

誤差を防ぐため、スタンダードは独立に調整すること

Fragment size別に異なるLibrary長を計算に使用すること

x Bioanalzyerの定量結果は使用不可

計算例

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TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep 代表的なトラブルシューティング例

問題 内容 トラブルシュート

収量が低い

• 収量が極端に低い • 期待値: ≥2nM

• qPCRにて定量 • ユーザーガイドを参照

• KAPA kitと付属の standard

• qPCR の定量手順を確認

• Input DNAのQualityが低い・量が少ない

• ビーズ精製中のハンドリングでサンプルをLost

期待しない

サイズ分布

• ビーズの操作手順をチェック

• 低収量につながる

• BioAnalyzerトレースが有効

• サイズセレクションのステップを確認

• 希釈を確認

• Input DNAが分解されている

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Questions?