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UNIVERSITAT AUTÒNOMA DE BARCELONA
Departament de Farmacologia, de Terapèutica i de Toxicologia
TROMBOSIS ARTERIAL Y SU
INHIBICIÓN MEDIANTE TRES
ESTRATEGIAS DE CONTROL
DEL RIESGO CARDIOVASCULAR
Sonia Sánchez Gómez
2003
a Daniel
a mi familia
a mis amigos
Agradecimientos
I
AGRADECIMIENTOS
Agradecimientos
II
Agradecimientos
III
Si realizo un cálculo aproximado del tiempo que he invertido en la realización de la Tesis Doctoral,
me doy cuenta que le he dedicado prácticamente un 20% de mi vida. Durante todo este tiempo he tenido la
oportunidad de introducirme en el mundo de la ciencia y de aprender muchísimas cosas. También he tenido la
suerte de conocer a gente fantástica que ha estado conmigo y me ha apoyado en todo momento, sin la cual no
habría podido llevar a cabo este proyecto. Por ello quisiera darles las gracias a todas esas personas.
En primer lugar quiero agradecer a Lina Badimon que me acogiese en el grupo, cuando yo ya
había perdido la esperanza de poderme dedicar a la investigación. Gracias a ella y a su dirección, pude
aprender gran cantidad de técnicas y adquirir un conocimiento considerable de la patología cardiovascular.
Al inicio de mi estancia en el grupo pude conocer a gente que actualmente ya no se encuentra en él,
como José, que fue mi guía durante todo el tiempo que compartimos. Fue él quien me enseñó todo sobre el
procedimiento de trombosis ex vivo y me introdujo en el uso de animales de experimentación y en la
farmacología. Es más, colaboró conmigo en la realización de algunos trabajos que aparecen en esta tesis. Él,
Toni y Teresita me ayudaron mucho en mis inicios como investigadora. A Susanna y Antonio les agradezco
enormemente sus consejos y enseñanzas sobre las primeras técnicas laboratoriales que aprendí. Pero en esa
época, la persona con quien más compartí y que me proporcionó más apoyo, tanto técnicos como personales,
fue Núria. Todavía me acuerdo como empezamos juntas a aprender a utilizar técnicas nuevas para nosotras y
el apoyo mutuo cuando surgían dificultades, ¡muchísimas gracias!
Tengo que agradecer muchísimo toda la ayuda que me han proporcionado Maya, Pablo, Rosa,
Maribel, Olga y Vannesa por su colaboración en todos los trabajos de esta Tesis, sin ellos, ésta hubiese sido
irrealizable. También tengo presente la gran cantidad de ocasiones en que Laura y Gemma me
proporcionaron ayuda en los experimentos de trombosis. Y como no, a Oriol, por la paciencia que tuvo al
enseñarme las diferentes técnicas de histología, y sobretodo a utilizar el sistema de análisis de imagen. Pude
contar con la ayuda de Vicenta, Xevi y Marta para la realización de técnicas de biología molecular, Nia me
ayudo con los Westerns y gracias a Teresa pude poner a punto la técnica de actividad procoagulante.
Respecto a la escritura de la Tesis, a parte de gran ayuda de Lina, agradezco a Itziar sus ideas y consejos, y a
Vicenta, a Teresa y a mi tutor, Joan Costa, su esfuerzo en la corrección de la misma. Igualmente, me
acuerdo de la gente de Sant Pau, Pepe, Cristina, Berta, Jordi, Javi, Marta, Silvia...; y del CID, Jureck,
Judith, Albert, Sandra, Oriol, Marta, Silvia..., todos ellos también han colaborado de alguna manera a que
yo haya podido finalmente completar esta Tesis.
Fuera del laboratorio, quiero darles las gracias a todos mis amigos por los buenos ratos que he pasado
con ellos y por sus ánimos durante este periodo tan importante de mi vida.
Sin duda, de quien más fuerza y apoyo he recibido durante esta etapa ha sido de mi familia. Ellos,
han estado conmigo incansablemente, cuando estaba contenta y motivada, y sobretodo, cuando surgían
Agradecimientos
IV
dificultades y mi ánimo decaía. Mis padres siempre me impulsaron a seguir, a pesar de ver el gran sacrificio
que suponía llevar a cabo tal proyecto, nunca dudaron de mí. Dani en realidad ha participado en esta Tesis
casi tanto como yo, ha estado conmigo en todo momento, me ha ayudado siempre que lo he necesitado, me ha
llevado a donde hiciese falta, y sobretodo, me a dado el sostén y el ánimo suficiente para seguir, durante todo
este tiempo. ¡Gracias por tu apoyo incondicional y tu enorme paciencia!
Abreviaturas
V
ABREVIATURAS
Abreviaturas VI
Abreviaturas
VII
111In Indio-111
4S Scandinavian Simvastatin Survival Study
A Adventicia
AII Angiotensina II
AA Ácido araquidónico
ACD Ácido cítrico-dextrosa
ADP Difosfato de adenosina
ALT Alanina Aminotransferasa
AMPc Monofosfato cíclico de adenosina
ANOVA Análisis de la varianza
apo B Apoproteína B
aPTT Tiempo parcial de tromboplastina activada
ASA Ácido acetilsalicílico (aspirina)
AST Aspartato aminotransferasa
AUC Área bajo la curva
BSA Albúmina bovina sérica
BUN Nitrógeno ureico plasmático
CARE Colesterol and Recurrent Events Trial
cDNA Ácido desoxiribonucleico codificante
CML Célula/s musculare/s lisa/s
Cox Ciclooxigenasa
cpm Cuentas por minuto
DAB Diamino bencidina
DEPC Dietilpirocarbonato
ECA Enzima convertidora de la angiotensina
EDTA Ácido etilenodiamino-tetraacético
EEM Error estándar de la media
ELISA Ensayo inmunoabsorbente con enzima conjugado
EIA Ensayo inmunoabsorbente
eNOS Óxido nítrico sintasa endotelial
Fb Fibrina
FITC Fluoresceína (isotiocianato)
FPP Farnesil-pirofosfato
g Unidad de gravedad
Abreviaturas VIII
GAPDH Gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa
GDP Difosfato de guanosina
GGPPc Geranilgeranil-pirofosfato trans trans cis
GGPPt Geranilgeranil-pirofosfato trans
GP Glucoproteína
GTP Trifosfato de guanosina
HC Hiperlipémico control
HCT Hematocrito
HDL Lipoproteína de alta densidad
HGB Hemoglobina
HMG-CoA 3-Hidroxi-3-metilglutaril coenzima A
HMWK Quininógeno de alto peso molecular
HP Hiperlipémico pravastatina
HPETE Hidroxiperóxidos del ácido eicoxatetraenoico
HS Hiperlipémico simvastatina
HTB Ácido 2-hidroxi-4-trifluorometil-benzoico
I Íntima
ICAM-1 Moléculas de adhesión intercelulares
IFN-γ Interferón gamma
IL-1 Interleucina 1
iNOS Óxido nítrico sintasa inducible
IP3 Inositol 1, 4, 5-trifosfato
IPP Isopentil-pirofosfato
ISIS-2 Second International Study of Infarct Survival
i.m. Intramuscular
i.v. Intravenoso/a
kDa Kilodalton
L Lumen
LAD Arteria coronaria izquierda descendente
LDL Lipoproteína de baja densidad
LDL-ox Lipoproteína de baja densidad oxidada
LPS Lipopolisacárido
LS Lesión
M Túnica media
Abreviaturas
IX
MCH Hemoglobina corpuscular media
M-CSF Factor estimulante de colonias de monocitos
MCP-1 Proteína quimiotáctica de monocitos
MMP Metaloproteinasas
mRNA Ácido ribonucleico mensajero
NC Normolipémico control
NF-κB Factor de transcripción kappa B
NO Óxido nítrico
NOS Óxido nítrico sintasa
NSAID�s Fármacos antiinflamatorios no esteroideos
PAF Factor de activación plaquetar
PAI-1 Inhibidor del activador tisular del plasminógeno
pb Pares de bases
PCR Reacción en cadena de la polimerasa
PD Deposición plaquetaria
PDGF Factor de crecimiento derivado de plaquetas
PEG Polietilenglicol
PGHS Prostaglandina H sintasa
PGI2 Prostaciclina
PLA2 Fosfolipasa A2
PLT Plaqueta/s
p.o. Oral
Post-tto Post-tratamiento
PRP Plasma rico en plaquetas
PT Tiempo de Protrombina
RBC Glóbulos rojos
RT Transcriptasa reversa
rFVIIai Factor VIIa recombinante humano con el centro activo desactivado
rRNA Ácido ribonucleico ribosomal
rTFPI Inhibidor de la vía del factor tisular recombinante
rt-PA Activador tisular del plasminógeno recombinante
S Subendotelio
SDS Docecil sulfato sódico
ST Superficie total
Abreviaturas X
T Trombo
T.A. Temperatura ambiente
TEMED NNN’N’-tetra-metiletilendiamina
TF Factor tisular
TFPI Inhibidor de la vía del factor tisular
TFS Triflusal
TGF-β Factor de crecimiento transformante
TNF Factor de necrosis tumoral
t-PA Activador tisular del plasminógeno
TRITC Rodamina (tetrarodamina isotiocianato)
tRNA Ácido ribonucleico de transferencia
TX Tromboxano
VCAM-1 Moléculas de adhesión de células vasculares
VCM Volumen corpuscular medio
VLDL Lipoproteína de muy baja densidad
vs. versus
vWF Factor de von Willebrand
WBC Glóbulos blancos
WOSCOPS West of Scotland Coronary Prevention Study
Índice
XI
ÍNDICE
Índice
XII
Índice
XIII
AGRADECIMIENTOS I
ABREVIATURAS V
ÍNDICE XI
PRESENTACIÓN 1
INTRODUCCIÓN 5
FORMACIÓN Y EVOLUCIÓN DE LA PLACA ATEROSCLERÓTICA........... 7
LA DISFUNCIÓN ENDOTELIAL............................................................................. 7
Factores Derivados del Endotelio.......................................................................... 8
Mecanismos de Disfunción Endotelial..................................................................10
EL INICIO DE LA LESIÓN: LA ESTRÍA GRASA....................................................11
PROGRESIÓN DE LA PLACA ATEROSCLERÓTICA.............................................12
ESTABILIDAD DE LA PLACA. PROCESO ATEROTROMBÓTICO.......................14
Factores Locales.................................................................................................15
Severidad de la Lesión Vascular, Importancia del Factor Tisular............................15
Fuerzas Hemodinámicas de Flujo.....................................................................16
Superficie del Trombo Residual.......................................................................17
Vasoconstricción..........................................................................................17
Factores Sistémicos: Estado Hipertrombótico Sistémico.......................................18
TROMBOSIS ARTERIAL........................................................................................ 20
PLAQUETAS......................................................................................................... 20
Activación Plaquetar...................................................................................... 22
Adhesión Plaquetar..................................................................................... 22
Secreción y Agregación Plaquetar.................................................................. 23
COAGULACIÓN SANGUÍNEA............................................................................. 25
FIBRINOLISIS....................................................................................................... 28
Índice
XIV
ESTRATEGIAS TERAPÉUTICAS DESTINADAS AL TRATAMIENTO DE LA ATEROTROMBOSIS......................................................................................... 30
INHIBICIÓN DE LA CICLOOXIGENASA.............................................................. 31
La Vía de la Ciclooxigenasa............................................................................... 31
Los Salicilatos: Aspirina y Triflusal.................................................................... 33
Farmacocinética......................................................................................... 34
Farmacodinámica ...................................................................................... 35
Farmacología Clínica.................................................................................. 38
INHIBICIÓN DE LA VÍA DEL FACTOR TISULAR............................................... 39
El Factor VIIa Recombinante Humano con el Centro Activo Desactivado: FFR-rFVIIa...................................................................................................... 41
INHIBICIÓN DE LA HMG-CoA REDUCTASA...................................................... 43
La Vía del Mevalonato...................................................................................... 43
Inhibidores de la HMG-CoA Reductasa............................................................. 44
Farmacocinética......................................................................................... 45
Farmacodinámica ...................................................................................... 46
Farmacología Clínica.................................................................................. 49
MODELOS EXPERIMENTALES ANIMALES..................................................... 51
ATEROSCLEROSIS.................................................................................................. 51
TROMBOSIS.............................................................................................................. 53
OBJETIVOS 57
MÉTODOS 61
DISEÑO EXPERIMENTAL...................................................................................... 63
MODELO EXPERIMENTAL................................................................................... 64
GRUPOS DE ANIMALES Y ADMINISTRACIÓN DE FÁRMACOS....................... 64
Estudio con Inhibidor del Factor Tisular, FFR-rFVIIa......................................... 64
Estudio con Inhibidores de la Ciclooxigenasa..................................................... 65
Estudio con Inhibidores de la HMG-CoA Reductasa........................................... 67
Índice
XV
DETERMINACIONES SANGUÍNEAS.................................................................... 69
RECOGIDA DE LAS MUESTRAS DE SANGRE..................................................... 69
RECUENTO DE CÉLULAS SANGUÍNEAS............................................................ 70
PARÁMETROS BIOQUÍMICOS............................................................................. 70
COAGULACIÓN SANGUÍNEA.............................................................................. 71
ACTIVIDAD PROCOAGULANTE DEL FACTOR TISULAR CIRCULANTE........... 72
Obtención de Extractos a partir de Sangre Total..................................................... 73
Tratamiento in vitro de los Extractos...................................................................... 73
Determinación de la Actividad Procoagulante del Factor Tisular.......................... 73
NIVELES PLASMÁTICOS DE FFR-rFVIIa............................................................. 73
LIPOPROTEÍNAS PLASMÁTICAS......................................................................... 75
AGREGACIÓN PLAQUETAR EX VIVO.................................................................. 76
ESTUDIO DEL TROMBO FORMADO SOBRE PARED VASCULAR LESIONADA.............................................................................................................. 78
SUBSTRATOS VASCULARES............................................................................... 79
Tratamiento Local de la Pared Vascular con FFR-rFVIIa................................... 80
MARCAJE DE PLAQUETAS.................................................................................. 80
DETERMINACIÓN DE LA DEPOSICIÓN PLAQUETAR........................................ 81
BIODISTRIBUCIÓN DE LAS PLAQUETAS EN EL ORGANISMO......................... 86
ESTUDIO DE LA COMPOSICIÓN DEL TROMBO................................................. 87 LOCALIZACIÓN FACTOR TISULAR EN EL TROMBO Y EN LA PARED
VASCULAR............................................................................................................ 88
ANÁLISIS DE LA PLAQUETA: EXPRESIÓN DE RHO A ACTIVADO.......... 88
OBTENCIÓN DE LAS PLAQUETAS...................................................................... 89
EXTRACCIÓN DE PROTEÍNA: FRACCIÓN DE MEMBRANA............................. 89 DETERMINACIÓN DE LOS NIVELES DE RHO A ACTIVADO............................. 90
EVALUACIÓN DE LAS LESIONES VASCULARES...........................................90
VALORACIÓN MACROSCÓPICA DE LAS LESIONES: EXTENSIÓN DE LA LESIÓN................................................................................................................. 90
ESTUDIO HISTOLÓGICO DE LA PARED VASCULAR........................................ 91
Preparación de Especímenes.............................................................................. 91
Índice
XVI
Engrosamiento de la Íntima............................................................................... 92
Contenido Lipídico de la Lesión........................................................................ 93
Inmunohistoquímica......................................................................................... 93
Marcaje por Inmunofluorescencia............................................................... 94
Marcaje por Inmuno-Peroxidasa por el Sistema Avidina-Biotina....................... 95
Análisis de Imagen y Cuantificación de los Marcadores...................................... 96
ANÁLISIS DE COX, MCP-1 Y eNOS A NIVEL DE mRNA Y PROTEÍNA EN LA PARED VASCULAR.................................................................................... 97
RECOGIDA DE TEJIDOS PARA LA OBTENCIÓN DE RNA Y PROTEÍNA........... 97
EXTRACCIÓN DE RNA Y PROTEÍNA.................................................................. 98
ANÁLISIS DEL RNA............................................................................................. 99 Cuantificación del RNA y Verificación de la Integridad del RNA........................ 99
Amplificación del RNA: RT-PCR..................................................................... 99
Transcripción Reversa del mRNA............................................................. 100
Reacción en Cadena de la Polimerasa: PCR................................................ 100
PCR semicuantitativa....................................................................... 101
PCR a tiempo real........................................................................... 102
ANÁLISIS DE LA PROTEÍNA............................................................................... 105 Electroforesis en Gel de Poliacrilamida............................................................ 105 Tranferencia a Membrana de Nitrocelulosa................................................. 106
Western Blot................................................................................................... 106
ANÁLISIS ESTADÍSTICO..................................................................................... 108
SOLUCIONES.......................................................................................................... 109
RESULTADOS 113
ESTUDIO CON INHIBIDOR DEL FACTOR TISULAR, FFR-rFVIIa............ 115
PARÁMETROS HEMATOLÓGICOS Y BIOQUÍMICOS BASALES....................... 115
TIEMPO DE PROTROMBINA............................................................................... 116
Índice
XVII
NIVELES PLASMÁTICOS DE FFR-rFVIIa.............................................................. 118 CORRELACIÓN ENTRE LOS NIVELES PLASMÁTICOS DE FFR-rFVIIa Y EL
TIEMPO DE PROTROMBINA............................................................................... 119
AGREGACIÓN PLAQUETAR EX VIVO................................................................ 119
TROMBO FORMADO SOBRE PARED VASCULAR LESIONADA....................... 121
Trombo Formado sobre Pared Vascular Sana...................................................... 121
Marcaje de las Plaquetas. Parámetros Hematológicos y de Coagulación............ 121
Tratamiento in vivo................................................................................ 123
Deposición Plaquetaria.................................................................... 123
Deposición Total..................................................................... 123
Deposición Axial..................................................................... 125
Correlación entre el Tiempo de Protrombina y los Niveles de FFR-rFVIIa en Plasma y la Deposición Plaquetaria..................................................... 127
Composición del Trombo.................................................................. 128
Cuantificación de la Fibrina Presente en el Trombo................................. 130
Tratamiento in vitro............................................................................... 132
Deposición Plaquetaria.................................................................... 132
Localización de Factor Tisular en los Substratos Vasculares y en el Trombo..... 133
Actividad Procoagulante del Factor Tisular Circulante....................................... 135
Trombo Formado sobre Pared Vascular Aterosclerótica..................................... 136
Marcaje de las Plaquetas. Parámetros Hematológicos y de Coagulación............ 136
Tratamiento in vivo................................................................................ 137
Deposición Plaquetaria.................................................................... 137
Cuantificación de la Fibrina Presente en el Trombo.................................. 139
ESTUDIO CON INHIBIDORES DE LA CICLOOXIGENASA……................. 140
TRATAMIENTO AGUDO………………………………...…………………...... 140
Trombo Formado sobre un Trombo Preformado sobre Pared Vascular Lesionada: Trombosis Secundaria…...…...…………………….…….…...... 141
Marcaje de las Plaquetas. Parámetros Hematológicos y de Coagulación............ 141
Deposición Plaquetar.............................................................................. 142
TRATAMIENTO CRÓNICO…………………………….……………..……....... 144
Seguimiento de los Parámetros Hematológicos y Bioquímicos.….….……….. 144
Índice
XVIII
Trombo Formado sobre un Trombo Preformado sobre Pared Vascular Lesionada: Trombosis Secundaria……...……………….…...…...………... 145
Marcaje de las Plaquetas. Parámetros Hematológicos y de Coagulación.............146
Deposición Plaquetar.............................................................................. 147
Composición del Trombo........................................................................ 148
Efecto de la Aspirina y del Trifusal sobre la Expresión de Cox-1 y Cox-2 en la Pared Vascular...................................................................................... 149
Expresión Génica de Cox-1 y Cox-2.......................................................... 150
Expresión Proteica de Cox-2.................................................................... 151
ESTUDIO CON INHIBIDORES DE LA HMG-CoA REDUCTASA…….….. 153
TRATAMIENTO CON ESTATINAS DURANTE 50 DÍAS....………….………........ 153
Evolución del Peso y de los Parámetros Hematológicos, Bioquímicos y de Coagulación....……………………………………..…………....……........ 154
Evolución de los Lípidos Plásmáticos..............................................................156
Colesterol Total y Triglicéridos................................................................ 156
Lipoproteínas........................................................................................158
Agregación Plaquetar ex vivo..........................................................................160
Trombo Formado sobre Pared Vascular Lesionada...........................................162
Marcaje de las Plaquetas. Parámetros Hematológicos y de Coagulación............ 162
Deposición Plaquetaria............................................................................ 163
Deposición Plaquetar en Condiciones de Flujo Laminar Paralelo y
Alta Velocidad de Cizalladura........................................................... 163
Deposición Plaquetar en Condiciones Flujo no Laminar no Paralelo y Velocidad de Cizalladura Variable (Estenosis Vascular)............................. 165
Correlación entre los Lípidos Plasmáticos y la Deposición Plaquetaria............ 169
Composición del Trombo........................................................................ 171
Análisis de la Plaqueta: Expresión de Rho A Plaquetario............................... 171
Lesiones Vasculares...................................................................................... 172
Extensión de la Lesión............................................................................ 172
Engrosamiento de la Capa Íntima Aórtica y Coronaria................................... 174
Correlación entre los Lípidos Plasmáticos y el Tamaño de la Lesión Arterial..... 176
Índice
XIX
Composición de la Lesión........................................................................ 177
Contenido Lipídico de la Lesión.......................................................... 177
Componentes de la Lesión Vascular..................................................... 178 Correlación entre los Lípidos Plasmáticos y la Composición de la
Lesión Arterial...................................................................................... 184
Correlación entre el Tamaño y la Composición de la Lesión Aórtica................ 184
Expresión Génica de MCP-1, eNOS y Cox (1 y 2) en la Pared Vascular............ 185
Expresión de MCP-1............................................................................... 185
Expresión de eNOS................................................................................. 186
Expresión de Cox-1 y Cox-2..................................................................... 187
TRATAMIENTO CON ESTATINAS DURANTE 100 DÍAS.......……......……....... 188
Evolución del Peso y de los Parámetros Hematológicos, Bioquímicos y de Coagulación....…………………………………………………....….. 189
Evolución de los Lípidos Plásmáticos............................................................. 191
Colesterol Total y Triglicéridos................................................................ 191
Lipoproteínas........................................................................................193
Lesiones Vasculares...................................................................................... 195
Extensión de la Lesión............................................................................ 196
Engrosamiento de la Capa Íntima Aórtica y Coronaria................................... 198
Correlación entre los Lípidos Plasmáticos y el Tamaño de la Lesión Arterial..... 200
Composición de la Lesión........................................................................ 200
Contenido Lipídico de la Lesión.......................................................... 200
Componentes de la Lesión Vascular..................................................... 202 Correlación entre los Lípidos Plasmáticos y la Composición de la
Lesión Arterial...................................................................................... 205
Correlación entre el Tamaño y la Composición de la Lesión Aórtica................ 206
Expresión Génica de MCP-1, eNOS y Cox (1 y 2) en la Pared Vascular............ 207
Expresión de MCP-1.............................................................................. 207
Expresión de eNOS................................................................................ 208
Expresión de Cox-1 y Cox-2.................................................................... 210
DISCUSIÓN 211
INHIBIDOR DEL FACTOR TISULAR, FFR-rFVIIa......................................... 216
Índice
XX
TROMBOSIS............................................................................................................... 218
INHIBIDORES DE LA CICLOOXIGENASA..................................................... 223
TROMBOSIS............................................................................................................... 224
EXPRESIÓN DE LA CICLOOXIGENASA VASCULAR........................................ 227
INHIBIDORES DE LA HMG-CoA REDUCTASA............................................. 231
EVOLUCIÓN DE LOS LÍPIDOS PLASMÁTICOS................................................... 233
TROMBOSIS............................................................................................................... 235
DESARROLLO DE LA LESIÓN ATEROSCLERÓTICA......................................... 242
Tamaño y Composición de la Lesión…........................................................... 243
Expresión Génica de MCP-1, eNOS, Cox-1 y Cox-2….................................... 247
MCP-1…..............................................................................................248
eNOS…............................................................................................... 248
Cox-1 y Cox-2…................................................................................... 250
LIMITACIONES DEL ESTUDIO ........................................................……....… 252
CONCLUSIONES 255
REFERENCIAS 261
Presentación 1
PRESENTACIÓN
Presentación 2
Presentación 3
Las enfermedades cardiovasculares derivadas de la progresión de la
aterosclerosis se encuentran entre las principales causas de mortalidad y morbilidad en
los países occidentales. La aterosclerosis es una patología multifactorial, que se
caracteriza por tener una progresión lenta y silenciosa, hasta alcanzar tal grado de
severidad que desencadena un evento isquémico. El fenómeno trombótico es clave en la
evolución de la patología isquémica y contribuye tanto al crecimiento de la placa como
a la oclusión definitiva del vaso cuando una placa inestable se fisura o fractura
(aterotrombosis). Debido a la complejidad y a los numerosos procesos que intervienen
en esta patología, actualmente existen diversas líneas farmacológicas destinadas a su
tratamiento. Los fármacos antitrombóticos han sido y son ampliamente utilizados en la
práctica clínica para el tratamiento del proceso agudo, y de entre ellos el más
representativo es probablemente la aspirina, un inhibidor plaquetario del grupo de los
salicilatos (inhibidores de la ciclooxigenasa). La aspirina ha demostrado ser efectiva en
la prevención de eventos vasculares en diferentes ensayos clínicos, tanto a corto como a
largo plazo (Patrono C, 2001). Sin embargo, a pesar de los beneficios obtenidos con los
salicilatos y otros antitrombóticos, estos grupos farmacológicos no erradican
completamente los eventos trombóticos (Harker L et al., 1996), por lo que nuevos
compuestos han sido objeto de investigación. Entre los más prometedores se encuentran
los inhibidores directos de la trombina y los inhibidores de la producción de trombina
(inhibidores del factor tisular). Este último grupo es de aparición muy reciente y todavía
no se utiliza en el tratamiento de la patología isquémica cardiovascular.
Por otro lado, el descubrimiento de que la hiperlipemia supone un factor de
riesgo para la enfermedad cardiovascular, ha motivado que se haya realizado en los
últimos años un gran esfuerzo por encontrar nuevos fármacos hipolipemiantes. De entre
estos cabe destacar los fibratos y, más recientemente, los inhibidores de la 3-hidroxi-3-
metilglutaril coenzima A (HMGCoA) reductasa o estatinas, ambos ampliamente
utilizados en la práctica clínica. Aunque estos fármacos han conseguido reducir los
eventos cardiovasculares de forma significativa (Sheperd J et al., 1995; Scandinavian
Simvastatin Survival Study Group, 1994; Sacks FM et al., 1996; The Long-Term
Intervention with Pravastatin in Ischaemic Disease (LIPID) Study Group, 1998; Heart
Protection Study Collaborative Group, 2002; Schwartz GG et al., 2001; Sever PS et al.,
2003), su mecanismo de acción no está completamente aclarado. Un hecho a resaltar, es
que el beneficio clínico observado en los pacientes aparece antes de que se detecte
Presentación 4
regresión de las placas ateroscleróticas (Vaugham CJ et al., 2000), lo cual sugiere que
probablemente existan efectos adicionales beneficiosos además de los relacionados con
la reducción de los lípidos plasmáticos y la regresión de la placa.
Por lo tanto, este trabajo se ha centrado en el estudio de los mecanismos de
acción de determinados grupos farmacológicos destinados al tratamiento de la patología
aterotrombótica (los salicilatos, los inhibidores del factor tisular y las estatinas), con la
finalidad de esclarecer la manera por la cual son capaces de aportar beneficios
apreciables desde el punto de vista clínico.
Introducción 5
INTRODUCCIÓN
Introducción 6
Introducción 7
FORMACIÓN Y EVOLUCIÓN DE LA PLACA
ATEROSCLERÓTICA
La aterosclerosis es un fenómeno patológico caracterizado por una respuesta
inflamatorio-proliferativa de la pared vascular a diferentes agentes lesivos. Las lesiones
ateroscleróticas progresan de manera crónica y asintomática a lo largo de los años y
tardíamente pueden provocar sintomatología clínica como resultado de una reducción
crónica o aguda (aterotrombosis) de la luz arterial. Esta patología afecta principalmente
la capa íntima de las arterias de calibre mediano y grande, tales como la aorta, arterias
femorales, carótidas, cerebrales, coronarias y renales.
LA DISFUNCIÓN ENDOTELIAL
El endotelio vascular desarrolla un gran número de funciones en el
mantenimiento de la homeostasis vascular (Vane JR et al., 1990). Proporciona una
superficie no trombogénica y no adherente para leucocitos a través de la cual se realiza
el intercambio de numerosas substancias entre la sangre y los tejidos. Contribuye al
mantenimiento del tono vascular mediante el balance de producción y liberación de
substancias vasodilatadoras, como el óxido nítrico (NO) y la prostaciclina (PGI2), y
vasoconstrictoras, como la endotelina, el tromboxano A2 (TXA2) y la angiotensina II
(AII). Además, puede modular el tono y el crecimiento de las células musculares lisas
(CML), así como la coagulación, la fibrinolisis y la adhesión de células sanguíneas a la
pared vascular (Furchgott RF & Vanhoutte PM, 1989; Moncada S et al., 1991;
Vanhoutte PM, 1997), mediante diversos factores promotores e inhibidores del
crecimiento, moduladores de la inflamación (moléculas de adhesión) y factores
hemostáticos y trombolíticos, como el activador tisular de plasminógeno (t-PA) y el
inhibidor de t-PA tipo 1 (PAI-1) (DiCorleto PE & Gimbrone MA Jr, 1996). En
condiciones normales existe un equilibrio entre las acciones de estos factores, pero en
presencia de factores de riesgo cardiovascular tales como hiperlipidemia, hábito
tabáquico, hipertensión arterial, diabetes, infecciones, hiperhomocisteinemia y otros,
este equilibrio se altera provocando respuestas anormales del endotelio.
Introducción 8
Consecuentemente, la proliferación del músculo liso, la vasoconstricción, la actividad
trombótica y la adhesión de las células sanguíneas pasan a ser fenómenos
predominantes (Furchgott RF & Vanhoutte PM, 1989; Ross R, 1993).
La hipercolesterolemia actúa sobre las células endoteliales produciendo
alteraciones de la función vascular. De hecho, la disfunción de la respuesta vasomotora
endotelial precede incluso al desarrollo aterosclerótico y está relacionada con niveles
anormalmente elevados de lípidos plasmáticos. Esto se ha demostrado en varios
estudios en los que se observó que la vasodilatación dependiente del endotelio estaba
disminuida en animales y en pacientes hipercolesterolémicos sin presencia de
alteraciones estructurales vasculares evidentes (Verbeuren TJ et al., 1986; Creager MA
et al., 1990).
La presión de rozamiento del flujo sanguíneo sobre el endotelio es también un
factor relevante en la disfunción endotelial, ya que estimula la liberación de substancias
vasoactivas, provoca cambios en la expresión de los genes, del metabolismo celular y de
la morfología celular (Traub O & Berk BC, 1998; Malek AM et al., 1999). Se ha
demostrado que áreas del árbol arterial sometidas a baja presión de rozamiento y flujo
con turbulencias presentan disfunción endotelial. Estas condiciones de flujo se producen
en los puntos de bifurcación arterial y provocan el desarrollo de lesiones
ateroscleróticas.
A partir del momento en que el endotelio presenta alteraciones de su
funcionalidad, se produce la entrada de monocitos, lípidos plasmáticos y proteínas
dentro de la pared arterial, así como la activación de fenómenos inflamatorios que dan
lugar a la formación de la estría grasa, primer paso de la formación de la placa
aterosclerótica.
Factores Derivados del Endotelio
De entre todos los factores derivados del endotelio, el NO parece desempeñar un
papel fundamental a través de sus acciones relajantes, antiproliferativas, antitrombóticas
Introducción 9
y antioxidantes. Por todas sus funciones se la considera la molécula antiaterogénica por
excelencia (Cooke JP & Tsao PS, 1994). El NO se genera por la acción de la óxido
nítrico sintetasa (NOS) sobre el aminoácido L-arginina (Bredt DS, 1991). Se conocen
tres isoenzimas NOS (Knowles RG & Moncada S, 1995), dos constitutivas que
sintetizan pequeñas cantidades de NO, la NOS-I del tejido neurológico (Mayer B et al.,
1991) y la NOS-III de la célula endotelial (eNOS) (Pollock JS et al., 1991); y una
inducible, la NOS-II (iNOS). Esta última isoenzima se expresa especialmente en los
macrófagos por la acción de citocinas proinflamatorias (interleucina-1 (IL-1), interferon
γ) y sintetiza grandes cantidades de NO (Stuehr DJ et al., 1991; Änggard E, 1994;
Nathan C & Xie QW, 1994). A concentraciones elevadas, el NO es citotóxico y
desempeña un papel en la respuesta inmune de los macrófagos ante las bacterias y otros
patógenos. Ambas NOS, la eNOS constitutiva y la iNOS inducible, coexisten en la
célula endotelial. La forma constitutiva sintetiza NO por periodos breves cuando es
estimulada por substancias vasodilatadoras, y la inducible sintetiza NO de forma
sostenida y prolongada cuando el estímulo parte de citocinas proinflamatorias, como el
factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) (Loscalzo J & Welch G, 1995; Jones CJH et al.,
1995). El NO tiene una vida media muy corta (3-5 segundos) (Moncada S et al., 1991),
y es muy susceptible de oxidación dando lugar a nitritos (NO2-) y nitratos (NO3
-)
(Ignarro LJ, 1990).
El estímulo físico que más influye en la generación de NO, es la presión de
rozamiento sobre la pared del vaso, cuanto mayor es ésta, mayor es la producción de
NO (Cooke JP & Tsao PS, 2001). La presión de rozamiento provoca la apertura de
canales de K+ dependientes de Ca2+, este hecho posibilita la entrada masiva de Ca2+ al
citoplasma que estimula directamente la eNOS generando mayor cantidad de NO
(Miura H et al., 2001).
Como antagonista del NO, la célula endotelial libera AII por la acción de la
enzima convertidora de la angiotensina (ECA). A través de los receptores AT1, la AII
provoca efectos contrarios a los del NO, como vasoconstricción, expresión de moléculas
de adhesión, estimulación de factores de crecimiento y proliferación celular, acciones
protrombogénicas, oxidantes y proinflamatorias. Todas estas acciones facilitan la
iniciación y la progresión de la aterosclerosis (Johnston CI, 1992). Dependiendo hacia
donde se incline el equilibrio entre el NO y la AII, prevalecerá una acción
Introducción 10
vasodilatadora y antiaterogénica, o vasoconstrictora y proaterogénica. Hay que tener en
cuenta que en el endotelio existen otras vías metabólicas que controlan el tono vascular,
como la vía de la ciclooxigenasa (Cox) que da lugar a la PGI2, la cual provoca la
liberación de AMPc, responsable de la vasodilatación. Existen dos isoformas de este
enzima, la Cox-1 que se expresa constitutivamente en diferentes tipos celulares, entre
los que se encuentran las células endoteliales y las plaquetas (Pollock JS et al., 1991), y
la Cox-2 que es inducida por diferentes productos de la inflamación y se encuentra en
células endoteliales, CML y macrófagos de la pared vascular (DeWitt et al., 1983;
Herschman HR, 1996; Schönbeck U et al., 1999; Stemme V et al., 2000). Esta última
isoforma se ha relacionado con en el proceso aterosclerótico (Ross R, 1993; Gordon D,
1996; Schönbeck U et al., 1999; Baker C et al., 1999). Estudios recientes demuestran
que posiblemente la Cox-2 vascular es la principal fuente de PGI2, tanto en individuos
sanos como en pacientes ateroscleróticos (Catella-Lawson F et al., 1999; McAdam BF
et al., 1999).
Mecanismos de Disfunción Endotelial
Se han estudiado los posibles mecanismos relacionados con la alteración del
metabolismo del NO que pueden motivar disfunción endotelial. Parece ser que una
disminución de la disponibilidad del substrato para la síntesis de NO (L-arginina),
debido a la hipercolesterolemia, podría ser responsable de respuestas vasculares
anormales (Girerd XJ, 1990). Otro posible mecanismo, es el aumento de la
concentración de peroxinitrito (ONOO-), producto resultante de la oxidación del NO,
con gran potencial oxidante y mediador del daño vascular (Beckman JS & Crow JP,
1993). Además, el peroxinitrito puede iniciar la oxidación de las lipoproteínas de baja
densidad (LDL), una vez que éstas han quedado atrapadas en la zona subendotelial
(White CR et al., 1994). Numerosos estudios demuestran que las LDL oxidadas, y en
menor medida las LDL nativas (no oxidadas), son capaces de inhibir la relajación
dependiente del endotelio (Tanner FC et al., 1991), y se ha sugerido que estas
lipoproteínas inhiben la activación de la vía L-arginina/NO, e incluso que reducen la
actividad y la expresión de la NOS. Así Vidal F et al. (1998) y Martínez-González J et
Introducción 11
al. (2001c) han demostrado que concentraciones aterogénicas de LDL nativas reducen
la expresión de NOS-III en células endoteliales humanas en cultivo.
EL INICIO DE LA LESIÓN: LA ESTRÍA GRASA
Las primeras lesiones ateroscleróticas macroscópicamente visibles son la estrías
grasas, las cuales pueden ya manifestarse en la aorta y en la arterias coronarias durante
las primeras décadas de vida y consisten básicamente en una acumulación de lípidos en
la íntima vascular (Stary HC et al., 1994). El primer factor que determina la formación
de la estría grasa es el transporte de LDL hacía la pared vascular. Las LDL son
lipoproteínas muy ricas en colesterol, que provienen en su mayor parte del metabolismo
de las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), y su función básica consiste en la
distribución del colesterol a los diferentes tejidos. Las LDL son rápidamente
transportadas a través del endotelio y se unen a los proteoglicanos que conforman la
matriz extracelular (Nievelstein PFEM et al., 1994). Los proteoglicanos a su vez tienen
una alta capacidad de producir alteración y retención de las LDL en la íntima
contribuyendo a la acumulación lipídica y al inicio de la formación de la estría grasa
(Camejo G et al., 1993). Debido al estado de estrés oxidativo provocado por la
disfunción endotelial, las LDL retenidas en el espacio subendotelial son oxidadas
(Steinberg D, 1997). La acumulación de LDL oxidadas, altamente inflamatorias y
citotóxicas, motivan la activación de una respuesta inflamatoria que provoca la
atracción de monocitos y linfocitos-T hacia la lesión, y una vez se encuentran dentro de
la íntima vascular los monocitos se convierten en macrófagos. (Ross R, 1993; Ross R,
1999). Además de las LDL modificadas, la homocisteína, la AII y productos
microbianos también inducen inflamación en la zona de la lesión (Libby P, 2002). Las
LDL oxidadas inducen la producción por parte de las células endoteliales y CML de
diferentes activadores de monocitos y linfocitos-T, como la proteína quimiotáctica de
monocitos-1 (MCP-1) (Valente AJ et al., 1992). La expresión de MCP-1 y otros genes
inflamatorios se halla bajo el control del factor de transcripción NF-κB (Barnes PJ &
Karin M, 1997). La activación de este factor puede desempeñar un papel clave desde las
fases tempranas de la formación de la placa, ya que se ha demostrado que está presente
de forma activa en las lesiones ateroscleróticas (Collins T, 1993; Brand K et al., 1996).
Introducción 12
Las LDL oxidadas y otros factores proinflamatorios, como la IL-1, la trombina y
el factor de necrosis tumoral (TNF) inducen la expresión de moléculas de adhesión, que
promueven la adhesión de los leucocitos (monocitos y linfocitos-T) al endotelio, y del
factor estimulante de colonias de monocitos (M-CSF) (Rajavashisth TB et al., 1990).
Entre las moléculas de adhesión se encuentran las selectinas, como la selectina E y la
selectina P (Vora DK et al., 1994), y las inmunoglobulinas, como ICAM-1 y VCAM-1
(Cybulsky MI & Grimbone MA Jr, 1991). El M-CSF, que también está controlado por
NF-κB, es el responsable de la diferenciación de los monocitos a macrófagos. Esta
diferenciación conlleva la expresión de los receptores basurero (scavenger) (Geng YJ et
al., 1995). Estos receptores, a diferencia de los receptores LDL normales, no son
regulados a la baja por la presencia de altas concentraciones de colesterol intracelular,
por lo que los macrófagos captan y acumulan a través de estos receptores grandes
cantidades de LDL modificadas (oxidadas, acetiladas, etc) transformándose en células
�espumosas�. La causa de que el receptor LDL no reconozca a las LDL oxidadas
(modificadas) se debe a que el proceso de oxidación induce cambios en la parte proteica
de la lipoproteína (apo B), que en cambio, sí es reconocida por los receptores basurero
de los macrófagos (Brown MS & Goldstein JL, 1990).
Al contrario que las LDL, las lipoproteínas de alta densidad (HDL) tienen una
función protectora, sobretodo en las fases iniciales de la aterosclerosis, ya que
disminuyen la oxidación de las LDL (Parthasarathy S et al., 1990), así como la
formación de la estría grasa (Badimon JJ et al., 1989), debido a su función en el
transporte reverso del colesterol (Gordon DJ et al., 1989).
PROGRESIÓN DE LA PLACA ATEROSCLERÓTICA
La estría grasa puede progresar hasta la formación de la placa, aunque, no todas
las estrías grasas progresan (Freedman D et al., 1988). Hay dos factores clave en la
progresión de la lesión: la proliferación y migración de CML, y la acumulación lipídica
en macrófagos y CML. Los macrófagos juegan el papel central del proceso ya que están
presentes desde el inicio de la lesión. Como ya se ha mencionado anteriormente, bajo la
acción de MCP-1, M-CSF y otras citocinas, los macrófagos son activados y se
Introducción 13
incrementa su capacidad de oxidación de lipoproteínas y la secreción de factores de
crecimiento así como diversas citocinas inflamatorias (Murakami T & Yamada N,
1996); entre ellas destacan nuevamente MCP-1, M-CSF, IL-1 y TNF, y también
interferon gamma (IFN-γ) (Libby P & Ross R, 1996). Estas citocinas siguen
estimulando la expresión de moléculas de adhesión y citocinas por parte de las células
endoteliales y CML, favoreciéndose así un círculo vicioso de captación, proliferación y
activación de monocitos-macrófagos, expresión de receptores basurero, captación de
LDL modificadas y transformación en células espumosas, lo que se traduce en una
acumulación incontrolada de lípido en el espacio subendotelial.
Junto a los macrófagos, las CML son el componente principal de la lesión
aterosclerótica. Su migración y proliferación está estimulada por factores de
crecimiento, como el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), la AII y la
trombina, liberados por plaquetas, macrófagos y CML (Ferns GAA, 1991; Ross R,
1993). Incluso las propias lipoproteínas favorecen la proliferación de las CML
(Björkerud S & Björkerud B, 1995). Además, las CML al igual que los macrófagos,
también captan y acumulan LDL modificadas transformándose en células espumosas
(Llorente-Cortes V et al., 1998, Llorente-Cortes V et al., 2002). Las CML son la fuente
de la matriz extracelular de la placa (Andreeva ER et al., 1997), cuyo componente
principal es el colágeno tipo I, el cual confiere a la placa una gran estabilidad
estructural. La síntesis del colágeno tipo I está fundamentalmente promovida por el
factor de crecimiento transformante (TGF-β) segregado por los macrófagos y CML
(Bahadori L et al., 1995).
Las plaquetas también juegan un papel importante en el desarrollo de la lesión,
ya que se adhieren al endotelio disfuncional, a los macrófagos o al colágeno expuesto, y
liberan citocinas y factores de crecimiento, como el PDGF y la trombina, que
contribuyen a la migración y proliferación de CML y monocitos (Bombeli T et al.,
1998; Martínez-González J et al., 2001b).
Con la sucesión de los procesos mencionados, la estría grasa se va haciendo más
compleja a lo largo del tiempo y se recubre por una o más capas de CML y tejido
conectivo, que darán lugar a la cápsula fibrosa.
Introducción 14
ESTABILIDAD DE LA PLACA. PROCESO ATEROTROMBÓTICO
El factor predominante que afecta a la estabilidad de las placas ateroscleróticas
es la proporción entre matriz extracelular y contenido lipídico (Stary H, 1989; Davies
MJ et al., 1990). Las placas están formadas por un núcleo lipídico, compuesto
básicamente por colesterol libre y ésteres de colesterol acumulados en el interior de
macrófagos (células espumosas), separado de la luz arterial por un caparazón
fibromuscular y una capa de células endoteliales.
Las placas ateroscleróticas producen síntomas clínicos mediante dos
mecanismos:
1. Por crecimiento de la placa hasta alcanzar un tamaño umbral que reduce u obstruye
completamente el paso de la sangre. Este tipo de lesiones representan la mayor parte
de los procesos ateroscleróticos, pero suponen una pequeña proporción de los
episodios clínicos, ya que son lesiones bastante estables. Su estabilidad se debe a un
elevado componente celular y de matriz extracelular.
2. Por rotura o fisura de la placa induciendo la formación de un trombo. Este tipo de
placas causan la mayoría de episodios clínicos (Falk E, 1989). Los estudios
patológicos demuestran que las placas ateroscleróticas que tienden a romperse están
compuestas comúnmente por una masa de lípidos separados del lumen vascular por
una cubierta fibrosa delgada (Richarson PD et al., 1989). Las placas que se rompen
tienden a ser relativamente blandas y a tener una concentración elevada de colesterol
y de sus ésteres. El adelgazamiento de la fina cubierta fibrosa que cubre el núcleo
lipídico precede a la rotura de la placa. Mediante estudios angiográficos,
angioscópicos y patológicos se ha establecido un clara asociación entre la fisura de
la placa o su ulceración y el desarrollo de la angina inestable, el infarto de miocardio
y la muerte súbita de carácter isquémico (Badimon L et al., 1992b; Badimon JJ et
al., 1993). Además, la trombosis mural formada sobre la placa rota, es también
importante en la progresión de las placas ateroscleróticas, incluso en ausencia de
síntomas clínicos (Falk E, 1985).
Introducción 15
Una vez formada la lesión aterosclerótica, todos aquellos fenómenos que
reduzcan su contenido en colágeno o disminuyan la presencia de CML que lo producen,
debilitarán la cápsula fibrosa y harán que la placa sea más vulnerable y propensa a la
rotura. Las células espumosas son determinantes en este aspecto, ya que son capaces de
digerir la matriz extracelular por fagocitosis directa o por la secreción de enzimas
proteolíticas, como los activadores del plasminógeno (t-PA), TNF-α, y una variedad de
metaloproteinasas (MMP) de la matriz celular (colagenasas, gelatinasas y estromelinas)
(Fuster V et al., 1992b; Ross R, 1999). Además, la producción de tóxicos, como los
radicales libres oxidantes y productos de la oxidación lipídica, también contribuyen al
daño vascular y a la inestabilidad de la placa.
La rotura de la placa supone la desendotelización de la pared vascular y la
exposición de las capas interiores ricas en colágeno, factor tisular (TF), lípidos y otros
factores, que activan la agregación plaquetar y la formación de un trombo que puede ser
oclusivo e impedir de forma súbita la circulación de la sangre o en cualquier caso,
contribuir al crecimiento de la lesión aterosclerótica que produce una lesión silente.
Existen una serie de factores locales y sistémicos que pueden determinar el tamaño,
localización y composición de los trombos.
Factores Locales
Severidad de la Lesión Vascular, Importancia del Factor Tisular
La rotura de la placa provoca la exposición de componentes de su interior que
inducen la trombosis. Se ha demostrado mediante estudios experimentales, que cuando
el trombo plaquetar se forma sobre lesiones vasculares leves (pared vascular
desendotelizada), éste es lábil y tiende a fragmentarse si sobre él actúan fuerzas de
cizalladura elevadas. Sin embargo, cuando la lesión es más grave y se exponen los
componentes de zonas más profundas del vaso, se produce una intensa agregación
plaquetaria con formación de un trombo mural, que se acompaña de la formación de
trombina a través de las vías de coagulación, tanto intrínseca (activada en superficie)
como extrínseca (dependiente del TF), dando como resultado la formación de fibrina,
Introducción 16
que da estabilidad al trombo plaquetario y lo une firmemente a la pared vascular. El
trombo formado en este caso, es estable incluso en condiciones de cizalladura elevadas
(Badimon L et al., 1986).
Se ha demostrado que el núcleo graso o ateroma es el componente más
trombogénico de las placas (Fernández-Ortiz A et al., 1994) y el TF (o tromboplastina
tisular), presente en grandes cantidades este tipo de lesiones, parece ser el
desencadenante de la reacción trombótica en cascada (Toschi V et al., 1997). Estos
resultados sugieren que el TF es un determinante importante de la trombogenicidad de
las lesiones ateroscleróticas cuando sufre rotura espontánea o mecánica. Las LDL
oxidadas contenidas en la lesión también inducen trombosis, ya que aumentan la
agregación plaquetaria promoviendo la liberación de TXA2 (Carvalho ACA et al.,
1974).
Fuerzas Hemodinámicas de Flujo
Las zonas de estenosis vascular que están provocadas por el engrosamiento de la
pared (presencia de una lesión aterosclerótica, o de un trombo sobre una lesión que
protuye en la luz del vaso) aumentan considerablemente la fuerza de cizalladura y
alteran el flujo (Zarins CK et al., 1983), mientras que en los vasos normales la fuerza de
cizalladura es menor y el flujo es de tipo laminar paralelo. El aumento de la fuerza de
cizalladura provoca que aumente considerablemente la deposición de plaquetas en la
zona estenosada (Badimon L & Badimon JJ, 1989), al tiempo que la desaceleración del
flujo sanguíneo que existe en la zona postestenótica produce una separación de las
líneas de flujo y la aparición de zonas de recirculación que pueden favorecer el depósito
de fibrina. La consecuencia de estos fenómenos es la formación de un trombo plaquetar
fijo en la zona de máxima estenosis que se continúa con una gran red de fibrina en la
que se hallan atrapados glóbulos rojos. El incremento de la fuerza de cizalladura que se
produce en las áreas de estenosis, así como los factores mencionados anteriormente,
contribuyen a la rotura de la placa, especialmente cuando éstas son blandas y grasas
(Fuster V et al., 1988).
Introducción 17
Superficie del Trombo Residual
Una vez se ha formado el trombo sobre una lesión aterosclerótica que ha sufrido
rotura, éste puede lisarse por fibrinolisis fisiológica (o inducida farmacológicamente).
La presencia del trombo mural residual predispone a la oclusión trombótica recurrente
del vaso (Van Lierde et al., 1990; Fuster V et al., 1990; Davies SW et al., 1990; Gulba
DC et al., 1991). Se han identificado dos factores que contribuyen que a este proceso.
En primer lugar, un trombo mural residual estrecha la luz del vaso, lo que produce un
aumento de la tasa de cizalladura, que facilita la activación y depósito de las plaquetas
en la lesión (Badimon L & Badimon JJ, 1989; Lassila R et al., 1990). En segundo lugar,
la presencia de un trombo fragmentado genera una superficie de gran poder
trombogénico, así, el depósito de plaquetas sobre el trombo residual se ve incrementado
entre dos y cuatro veces en comparación con una lesión profunda de una arteria
(Badimon L et al., 1988). Este fenómeno es debido en parte a la trombina atrapada en la
red de fibrina en el área de formación del trombo (Badimon L et al., 1989; Francis CW
et al., 1983), así pues, después de la lisis parcial del trombo, la trombina queda expuesta
a la sangre circulante, de forma que se produce la activación de las plaquetas y del
sistema de coagulación generándose nuevos procesos de trombosis (trombosis
secundaria).
Vasoconstricción
Varios estudios han sugerido que el vasoespasmo es importante en la
patogénesis de la enfermedad aterotrombótica (Hackett D et al., 1987). La interacción
de plaquetas con la pared vascular y la liberación de substancias vasoactivas, como la
serotonina y el TXA2, contribuyen a la reducción del flujo sanguíneo (Lam JYT et al.,
1987; Ashton JH et al., 1986).Además, las arterias ateroscleróticas tienen un tono
vascular anormal debido a una deficiencia NO, lo cual conduce a una vasoconstricción
incrementada al producirse la liberación de serotonina y TXA2 por parte de las plaquetas
(Badimon L et al., 1992a; Badimon L, 2001).
Introducción 18
Factores Sistémicos: Estado Hipertrombótico Sistémico
Un estado trombogénico o hipercoagulable de la sangre circulante puede
promover la formación local de trombos (Fuster V et al., 1992a; Fuster V et al., 1992b),
este hecho confirma que los factores añadidos a la placa aterosclerótica son de gran
importancia en el riesgo trombótico. Diferentes factores sistémicos están asociados a un
aumento de la reactividad de la sangre y a la trombogenicidad.
El aumento de los niveles plasmáticos de catecolaminas puede inducir la
activación plaquetar y la generación del trombo (Badimon L et al., 1990b; Badimon L
et al., 1999), lo cual podría vincular condiciones de estrés con el desarrollo de trombosis
arterial. Se ha observado un aumento en la reactividad plaquetaria en fumadores que
podría estar relacionado con estímulos de las catecolaminas (Winniford MD et al.,
1986; Fuster V et al., 1981; Blann AD et al., 1998). La hipercolesterolemia también está
relacionada con un estado de hipercoagulabilidad de la sangre y aumento de la
reactividad de las plaquetas (Hunt BJ, 1990; Badimon JJ et al., 1991; Thompson SG et
al., 1995; Henry PD et al., 1995). Las LDL tienen un efecto directo sobre las plaquetas,
ya que aumentan la relación colesterol/fosfolípidos de la membrana plaquetar (Opper C
et al., 1995), así como los niveles de TXB2 (Carvalho ACA et al., 1974; Stuart MT et
al., 1980; Davi G et al., 1992), y de trombina intraplaquetarios (Aoki I et al., 1997),
haciéndolas más reactivas. Un factor de riesgo descubierto recientemente es la
homocisteína, esta substancia aumenta la actividad del TF en células endoteliales,
inhibe la expresión de trombomodulina en la superficie de la célula endotelial y la unión
de la antitrombina III al heparan sulfato endotelial, que como resultado supone una
reducción de las propiedades anticoagulantes del endotelio normal (Boers GH, 1997; de
Jong SC et al., 1998). La lipoproteína (a) (Lp(a)), molécula similar a la LDL en su
configuración (Berg K, 1963), es otro factor de riesgo para la aterotrombosis. Así, la
apoproteína (a), una glicoproteína que forma parte de la estructura de la Lp(a), tiene una
estructura muy similar a la del plasminógeno (McLean JW et al., 1987), al que inhibe
de manera competitiva, disminuyendo la fibrinolisis y aumentando así la predisposición
a las complicaciones trombóticas (Edelberg JM et al., 1990; Loscalzo J, 1990). Niveles
elevados de fibrinógeno, factor VII (Meade TW et al., 1986) y TF en plasma (Suefuji H,
1997; Key NS, 1998; Giesen PL et al., 1999), así como de inhibidor del activador de
Introducción 19
plasminógeno-1 (PAI-1) (Paramo JA et al., 1985; Olofsson BO et al., 1989) también se
han identificado como factores de riesgo para sufrir episodios trombóticos.
Figura 1. Representación esquemática de la evolución de la placa aterosclerótica. Tras los insultos iniciales se produce disfunción endotelial: las células endoteliales expresan moléculas de adhesión que facilitan la migración de los monocitos y linfocitos-T a favor de un gradiente quimiotáctico producido por las lipoproteínas oxidadas (LDL-ox) y citocinas quimiotácticas como la proteína quimiotáctica de monocitos (MCP-1). Bajo la acción del factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), los monocitos se diferencian a macrófagos, expresan los receptores basurero y acumulan grandes cantidades de lípidos convirtiéndose en células espumosas. Los macrófagos segregan múltiples citocinas (entre ellas el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF)) que promueven la migración de células musculares lisas (CML) de la túnica media a la íntima y su proliferación. Hay zonas de la íntima en las que se produce adhesión de plaquetas, que una vez activadas liberan citocinas como el PDGF. Activadas por factor de crecimiento transformante (TGF-β) de los macrófagos, las CML sintetizan el colágeno I, principal componente de la capa fibrosa. Las fases más avanzadas de la lesión se caracterizan por una acumulación de lípidos y un empobrecimiento celular debido en parte a la apoptosis de CML y macrófagos. En las placas con un alto contenido en macrófagos se produce la degradación de la cápsula fibrosa por parte de las proteasas, como las metaloproteasas (MMP), que son segregadas por los mismos. De este modo se favorecen la rotura de la placa y la exposición al torrente sanguíneo de factores procoagulantes como el propio colágeno y el factor tisular (TF), conduciendo a la formación de trombos y a la aparición de accidentes isquémicos agudos (Modificado de Sánchez S a partir de Guijarro C et al., 1997).
Íntima MCP-1
TF LDL-ox MMP
Cápsula Fibrosa
LDL-ox
Endotelio
Luz Vascular
Túnica Media CML
Lámina Elástica Externa
Monocito
LDL
Moléculas de Adhesión
Colágeno TF
Célula Espumosa
Macrófago
M-CSF PDGF
TGF-β
Núcleo Lipídico
Trombo de Plaquetas y Fibrina
DISFUNCIÓN ENDOTELIAL
ADHESIÓN MIGRACIÓN
PROLIFERACIÓN ACTIVACIÓN
PLACA FIBRO- LIPÍDICA
PLACA COMPLICADA
Linfocitos-T Plaquetas Adheridas
PDGF
Introducción 20
TROMBOSIS ARTERIAL Como ya se ha comentado, diversos procesos determinan la formación del
trombo arterial. Básicamente son tres vías metabólicas las que dan lugar al trombo: la
activación plaquetaria, el proceso de coagulación y la fibrinolisis.
PLAQUETAS
En la trombosis arterial, la activación de las plaquetas y su deposición en zonas
alteradas de la pared vascular ocupan un papel preponderante, produciéndose trombos
ricos en plaquetas y pobres en plasma y eritrocitos (al contrario que en la trombosis
venosa, donde se forman trombos ricos en fibrina y eritrocitos).
Las plaquetas son pequeños fragmentos de citoplasma envueltos por una
membrana con forma de disco que se generan a partir de los megacariocitos. Están
compuestas de la mayoría de los componentes celulares excepto DNA, ya que carecen
de núcleo (mitocondrias, microtúbulos, aparato de Golgi (a veces) y ribosomas). Sus
constituyentes principales son:
• Citoesqueleto: constituido por proteínas como actina y miosina, que se encargan de
la movilidad y la forma de la plaqueta. Ambas proteínas son responsables de los
drásticos cambios conformacionales que se producen en la plaqueta durante su
activación (Holmsen H, 1990a).
• Membrana: los lípidos de la membrana son importantes no sólo estructural sino
también funcionalmente. La mayor proporción corresponde a fosfolípidos y el resto
a lípidos neutros, sobre todo colesterol. La proporción entre ambos es importante ya
que condiciona la viscosidad de la membrana y su capacidad de respuesta. La
activación de la plaqueta precipita el metabolismo de varios fosfolípidos de
membrana derivados del fosfatidilinositol (flip/flop).
Introducción 21
• Gránulos Secretores: hay dos tipos, los gránulos densos que contienen
oligonucleótidos fosfatos en diversas formas químicas (ATP, ADP, GTP y otras),
calcio y serotonina, y los gránulos alfa, que contienen factores de coagulación
(fibrinógeno, factor V, factor de von Willebrand (vWF), factor XI, proteína S, PAI-
1, cininógeno de alto peso molecular-HMWK-), factores de crecimiento como
PDGF y el TGF-β, y otras proteínas. También hay lisosomas ricos en hidrolasas
ácidas (Holmsen H & Weiss HJ, 1979). El 60% del calcio celular se encuentra en el
interior de los gránulos densos y se secreta al citoplasma en cuestión de
milisegundos cuando las plaquetas se estimulan (Holmsen H, 1990b). Entre los
factores de coagulación, el fibrinógeno es la proteína que se encuentra en mayor
proporción en la plaqueta (12%).
• Glicoproteínas: hay al menos 30 tipos de glicoproteínas (GP) en la membrana que
cumplen funciones de receptor y que se podrían definir como integrinas, es decir
receptores que median la adhesión de productos solubles y de la matriz extracelular;
pero que también participan en la regulación de diversas funciones celulares (Clark
EA & Brugge JS 1995).
En la plaqueta, la familia más abundante de integrinas incluye los receptores
GPIIb-IIIa, GP Ia-IIa, GP Ic-IIa y los receptores de fibronectina y vitronectina. Cada
plaqueta contiene aproximadamente entre 50.000 y 80.000 moléculas de GP IIb-IIIa,
que supone un 2% de la proteína plaquetar total. El complejo IIb-IIIa es un
heterodímero dependiente de calcio, asociado no covalentemente a la superficie
plaquetar (Fitzgerald LA & Philips DR, 1985), consistente en dos glicoproteínas
transmembrana: GP IIb y GP IIIa. Su ligando principal es el fibrinógeno, pero se enlaza
además al vWF, a la vitronectina y a la trombospodina. La secuencia Arg-Gly-Asp
(RGD), presente en las proteínas adhesivas, es la mediadora del enlace ligando-receptor
(Cheresh DA et al., 1989). Así, el fibrinógeno contiene dos secuencias RGD en la
cadena α, además tiene una secuencia dodecapeptídica que se encuentra en la zona
carboxiterminal de la cadena γ, que también participa en la unión al recepto GP IIb-IIIa
(Kloczewiack M et al., 1984).
Introducción 22
La familia de integrinas que incluyen la glicoproteínas ricas en leucina está
representada por el complejo GP Ib y el GP V. Existen aproximadamente unas 25.000
moléculas de GP Ib en cada plaqueta. Este receptor está formado por dos subunidades,
la GP Ibα y la GP Ibβ que forman un complejo 1:1 con otra glicoproteína, la GP IX,
formando una estructura transmembrana (Fox JEB et al., 1988). La función principal de
este receptor es enlazarse con el vWF fijado en el subendotelio e iniciar el proceso de
adhesión plaquetar. El GP Ib no se enlaza al vWF plasmático, debido a que esta
molécula requiere un cambio conformacional que se produce cuando ésta se une a la
matriz extracelular, para ser reconocida por el receptor.
Activación Plaquetar
El proceso de activación plaquetar se puede resumir en una primera fase de
adhesión de la plaqueta a la pared o zona lesionada del vaso, la extensión de la plaqueta
sobre la superficie endotelial expuesta, la secreción del contenido granular de las
plaquetas y la formación de un agregado o masa de plaquetas y la amplificación del
proceso de coagulación, que lleva a la formación de una red de fibrina que refuerza el
lábil tapón de plaquetas (Badimon L et al., 1995). También se produce, como paso final,
el reclutamiento de otras células hemáticas (eritrocitos, neutrófilos y monocitos) que
dan lugar a trombos mixtos. La eficacia de reclutamiento plaquetario dependerá del
substrato subyacente y de la geometría local.
Adhesión Plaquetar
Las plaquetas no se adhieren al endotelio vascular normal, sino únicamente a las
zonas donde éste se encuentra alterado. A velocidades de cizalladura elevadas (a más de
800 s-1) es necesaria la presencia de vWF en el endotelio que se enlaza al receptor
plaquetar GP Ib (Weiss HJ et al., 1973). Por esta razón, las personas que sufren la
enfermedad de von Willebrand, en la que existe una deficiencia del vWF (Sakariassen
KS et al., 1979), presentan un tiempo de sangría elevado a velocidades de cizalladura
elevadas, pero no a bajas, ya que a baja velocidad de cizalladura esta función la realiza
Introducción 23
el colágeno que se enlaza al receptor plaquetar GP Ia-IIa (Sakariassen KS et al., 1986).
El receptor GP IIb-IIIa también participa en la adhesión plaquetar como sitio de enlace
adicional al vWF (Hawiger J, 1987).
Secreción y Agregación Plaquetar
Los procesos de secreción y agregación plaquetar se desencadenan por la acción
de ciertos agonistas, tales como el ADP (procedente de eritrocitos hemolizados), el
colágeno (procedente de capas profundas de la pared vascular dañada) o la trombina
(generada durante la cascada de la coagulación) que se unen a receptores de membrana
y activan diversos procesos intracelulares, como son la desaparición de los microtúbulos
que mantienen la forma discoidal de la plaqueta, y la formación de pseudópodos
(Escolar G et al., 1986). Estos agonistas inducen además, la liberación al citoplasma
plaquetar del calcio almacenado en el sistema tubular denso. El calcio, por su parte, es
un mediador importante de la activación plaquetaria (Colman RW & Walsh PN, 1987)
que induce la contracción y secreción del contenido granular de las plaquetas.
Tras la activación inducida por los agonistas que actúan en la superficie de la
plaqueta, se producen tres efectos principales:
a) Secreción del contenido de los gránulos intracelulares de la plaqueta.
b) Exposición de receptores de superficie para proteínas plasmáticas adhesivas,
principalmente fibrinógeno y vWF.
c) Alteración de la estructura lipídica de la membrana plaquetaria, que conlleva a la
amplificación de la coagulación sanguínea (Badimon L et al., 1990a).
Específicamente, al unirse los agonistas de la agregación (ADP, serotonina,
epinefrina, colágeno, trombina, factor de activación plaquetar -PAF-, TXA2) a los
receptores de membrana de la plaqueta se desencadenan las cascadas de los segundos
mensajeros intracelulares. Se produce entonces la hidrólisis del fosfatidilinositol, que se
Introducción 24
encuentra en la membrana plaquetaria, debido a la acción de la fosfolipasa C, dando
lugar a inositol 1, 4, 5-trifosfato (IP3) y diacilglicerol. Estos dos intermediarios
movilizan a su vez el calcio desde el sistema tubular denso, provocando la secreción de
los gránulos de la plaqueta y la exposición del receptor GP IIb-IIIa en la superficie. El
incremento de la concentración de calcio citosólico facilita la liberación de ácido
araquidónico (AA) a partir de los fosfolípidos de la membrana por acción de la
fosfolipasa A2, éste es metabolizado a TXA2, mediante la acción de la Cox y la
tromboxano sintasa. El TXA2 difunde fuera de la célula, interacciona con los receptores
plaquetarios de superficie y activa nuevas plaquetas (Huang EM & Detwiler TC, 1986;
Colman RW & Walsh PN, 1987; Kroll MH & Schafer AI, 1989; Marcus A & Safier
LB, 1993), esta molécula, además de favorecer la continuación de la agregación, es un
potente vasoconstrictor.
En el curso de la activación, las plaquetas muestran los receptores para factores
de la coagulación específicos. El factor Va, secretado por la plaqueta o proveniente del
plasma, se fija en la superficie y forma un complejo con el factor Xa, que cataliza la
conversión de protrombina a trombina (Mann KG, 1984). La trombina, a parte de ser un
enzima clave en la cascada de la coagulación, donde actúa transformando el fibrinógeno
en fibrina insoluble, es uno de los más potentes agonistas conocidos de la activación y
el reclutamiento plaquetarios. En las zonas de lesión arterial, se produce la exposición
de TF que desencadena la activación de factores de la coagulación y la rápida
generación de trombina, que es el principal mediador de la activación plaquetaria
(Krishnaswamy S et al., 1992).
La activación de las plaquetas se inhibe cuando los niveles de AMP cíclico
(AMPc) están incrementados, ya que facilita la entrada de calcio en sus depósitos,
reduciendo su disponibilidad en la plaqueta. Cuando los niveles de AMPc aumentan, el
calcio libre se secuestra en el sistema tubular denso y se inhibe la actividad de la
fosfolipasa A2 (Brass LF et al., 1994). Éste es el mecanismo de acción de algunos
inhibidores de la función plaquetaria, como la PGI2 y el NO. Generalmente, los
agonistas de la activación plaquetaria inhiben la formación de AMPc bloqueando la
adenilciclasa, y otros compuestos aceleran el metabolismo del AMPc mediante la
activación de la fosfodiesterasa (Sakon M et al., 1994).
Introducción 25
En condiciones patológicas, cuando se produce la rotura de una placa
aterosclerótica, el colágeno que queda expuesto, y sobretodo la trombina, que se forma
por activación de la cascada de la coagulación, tienen un gran peso en la estimulación
del proceso de agregación. En este caso, el papel que juegan estos dos agonistas es más
importante que el del ADP, ya que se encuentra a una concentración fisiológica
relativamente baja, o incluso que el TXA2, que se puede encontrar inhibido por medios
farmacológicos (Stein B et al., 1991).
Una vez la plaquetas se han activado, forman enlaces plaqueta-plaqueta a través
de la unión del fibrinógeno plasmático a los receptores GP IIb-IIIa (Hawiger J, 1987),
dando lugar al agregado plaquetario (Peerschke EIB, 1985). Éste se vuelve estable y se
une firmemente a la superficie vascular lesionada, gracias a la fibrina formada durante
el proceso.
COAGULACIÓN SANGUÍNEA
La función fisiológica de la coagulación es prevenir las hemorragias, de manera
que éste es un proceso que refuerza el tapón plaquetar mediante la creación de fibras
insolubles de fibrina. La fibrina se forma a partir del fibrinógeno, que es soluble, por la
acción de una enzima proteolítica, la trombina, que normalmente se encuentra en forma
de protrombina. Ésta se activa a través del sistema de la coagulación que implica una
serie de reacciones en cadena que integran zimógenos (proteínas susceptibles de ser
activadas a enzimas a través de una proteolísis limitada) y cofactores (activadores
enzimáticos no proteolíticos).
Clásicamente en el mecanismo de la coagulación sanguínea se distinguían dos
vías de activación: la vía extrínseca, que se iniciaba cuando el TF o tromboplastina
tisular se exponía al plasma; y la vía intrínseca, que se activaba por contacto con la
superficie vascular sin endotelio. Aunque inicialmente se pensó que eran vías
independientes, hoy en día se sabe que varios enzimas interaccionan en los dos sistemas
(Osterud B, 1990; Rapaport SI & Rao L, 1995).
Introducción 26
Recientes investigaciones sobre la coagulación sanguínea resaltan la
preponderancia de la vía del TF, anteriormente denominada vía extrínseca (Bauer KA,
1997; Carmeliet P & Collen D, 1998; Cawthron KM et al., 1998), donde la expresión
del TF constituye el más importante iniciador de la coagulación a través de la formación
de un complejo con el factor VII. Todas las reacciones que se desencadenan cuando se
activa la vía del TF se producen en la superficie de diferentes tipos celulares. Las
plaquetas proveen la superficie más eficiente para la generación de trombina, por lo que
el agregado plaquetario constituye una gran superficie procoagulante en la zona de
lesión vascular. Además de las plaquetas, es necesaria la presencia de células o restos de
membranas que expresen TF en su superficie para que se pueda desarrollar todo el
proceso (Monroe DM et al., 1994).
El TF es una pequeña glicoproteína de membrana, que pertenece a la
superfamilia de los receptores del tipo citocinas (Edginton T et al., 1991). Ésta proteína,
se distribuye en gran número de tejidos normales formando parte de las cápsulas
fibrosas que rodean a los órganos (Drake TA et al., 1989). En las arterias el TF es
abundante en la adventicia donde predominan los fibroblastos, mientras que
prácticamente no se encuentra en la túnica media (Maynard JR et al., 1977). Las células
en contacto directo con la sangre, como las células endoteliales, no lo expresan
constitutivamente, pero lo pueden sintetizar tras ser inducidas por citocinas,
endotoxinas, infecciones víricas, trombina y algunos factores de crecimiento (Camerer
E et al., 1996). La trombosis se desencadena cuando se produce una lesión vascular o se
expone los componentes del interior de la placa aterosclerótica, que expresan TF, a la
circulación sanguínea (Zeldis SM et al., 1972; Nemerson, 1988; Fuster V et al., 1996;
Fuster V et al., 1997). Trabajos recientes afirman que las moléculas de TF provienen de
los restos de membranas resultantes de la muerte por apoptosis de macrófagos
contenidos en el núcleo graso (Mallat A, et al., 1999), y de microvesículas asociadas a
TF que son secretadas a partir de las CML que componen la lesión (Schecter et al.,
2000). Recientemente se ha descubierto que existe un pool de TF en la circulación
sanguínea, libre o en monocitos, que es potencialmente activo (Suefuji H, 1997; Key
NS, 1998; Giesen PL et al., 1999).
Introducción 27
En el sistema de coagulación sanguínea se pueden distinguir cuatro grupos de
reacciones (Nemerson Y, 1990):
a) Activación por contacto: la exposición de superficies desencadenantes de la
activación por contacto de la pared vascular (sulfatidas, glucosaminoglicanos),
activan el factor XI mediante el factor Hageman (factor XII). El factor XIa activa el
factor IX, que forma un complejo con el factor VIIa y dan lugar al factor Xa.
b) Vía del TF: la exposición del TF en la zona lesionada, activa la formación del
complejo TF-factor VII a partir de factor VII de la circulación. Este complejo, que
se forma en la superficie de la célula que expresa TF, cataliza la transformación de
los factores X y IX a factores Xa y IXa, respectivamente. Al igual que en la etapa
anterior, el factor IXa forma un complejo catalítico con el factor VIIIa en la
superficie plaquetaria, que transforma el factor X en factor Xa.
c) Conversión de protrombina a trombina y formación de fibrina: el factor Xa forma
un complejo con el factor Va, que transforma la protrombina en trombina. Ésta
libera los fibrinopéptidos A y B del fibrinógeno, dando lugar a la formación de
monómeros y polímeros de fibrina.
d) Mecanismos inhibitorios del sistema de la coagulación: existen una serie de
inhibidores proteolíticos que limitan y controlan la velocidad y magnitud de la
coagulación (proteína C activada, antitrombina III, α2-macroglobulina, α1-tripsina).
Dentro de la vía del TF se distinguen dos etapas diferentes:
1. La etapa de iniciación: en la que se producen cantidades limitadas de trombina a
partir de pequeñas cantidades de factor Xa formado por el complejo TF-factor VIIa,
en la superficie de la célula que expresa TF. Estas pequeñas cantidades de trombina
formada inicialmente, son las que activan a las plaquetas.
Introducción 28
2. La etapa de amplificación: que se caracteriza por la formación explosiva de
trombina. Las plaquetas, una vez han sido activadas en la primera etapa, soportan el
complejo factor IXa-factor VIIIa en la superficie, que forma grandes cantidades de
factor Xa; este factor junto al factor Va forman un segundo complejo en la plaqueta,
que da lugar a grandes cantidades de trombina (Monroe DM et al., 1994; Rappaport
SI, 1995). La trombina formada en la segunda etapa, es la que da lugar a la
formación final de fibrina.
Muchos de los zimógenos y cofactores de este sistema necesitan Calcio y/o
vitamina K para ser activos. Gran cantidad de anticoagulantes se basan en esta
dependencia, algunos de ellos quelan el calcio, como el citrato o el EDTA, y otros
inhiben la vitamina K (anticoagulantes orales). Otro tipo de anticoagulantes son los
inhibidores de la trombina, como la heparina, que inhibe indirectamente la trombina
potenciando la actividad de la antitrombina III, o la hirudina, que produce una
inhibición directa.
La trombina, como se ha visto en los apartados de trombosis, juega un papel
central en la hemostasia y la trombosis, ya que actúa -de manera muy importante- sobre
la activación plaquetaria y sobre múltiples substratos del sistema de la coagulación.
También hay que mencionar su capacidad de mediación de la proliferación celular en la
zona lesionada (Badimon L et al., 1994; Turpie AGG et al., 1995), que tiene
importancia a más largo plazo.
FIBRINOLISIS
Como en la mayoría de los sistemas fisiológicos, el sistema hemostático consiste
en un delicado balance entre dos acciones contrapuestas. Si sólo existieran los sistemas
descritos en las secciones anteriores, el sistema circulatorio se encontraría en un
permanente estado de hipercoagulabilidad. Esto no ocurre ya que existe un sistema
fibrinolítico cuya función consiste básicamente en degradar las mallas de fibrina ya
formadas y llevar a la dilución del coágulo. Éste es un sistema complicado con muchos
Introducción 29
puntos de autorregulación en el que el enzima que degrada la fibrina es la plasmina
(Brakman P & Kluft C, 1992). El plasminógeno (precursor de la plasmina) se encuentra
normalmente inactivado, y para su activación requiere del t-PA, el cual lo activa con
una gran afinidad cuando ambas moléculas se encuentran enlazadas a la superficie de la
fibrina. La plasmina, que se encuentra libre en el plasma, es rápidamente inactivada por
la α2-antiplasmina. El sistema fibrinolítico se regula también mediante inhibidores
específicos de los activadores del plasminógeno, como el PAI-1.
Figura 2. Diagrama simplificado de la interacción plaqueta-pared y las enzimas de la coagulación. La adhesión de las plaquetas a los sitios de reconocimiento se produce en las áreas lesionadas del endotelio. Cuando la lesión es más severa, la adhesión, extensión y agregación de nuevas plaquetas contribuye a la formación de un trombo mural. La exposición de factor tisular (TF) a la circulación desencadena la activación de la vía del TF cuando forma el complejo con el factor VIIa, como consecuencia se genera una primera cantidad de trombina capaz de activar plaquetas y a partir de ahí acontece una verdadera formación explosiva de trombina. La vía por contacto, aunque en menor medida, también inicia la coagulación a través del factor de Hageman. Además de la trombina, la agregación plaquetaria es potenciada por otros agonistas presentes en el microambiente (flechas con signo +), mientras que existen vías espontáneas de inhibición, de la activación plaquetaria y de los enzimas de la coagulación (flechas con signo -), derivadas del endotelio vecino normal. IIa, trombina; TF, factor tisular; ATIII, antitrombina; NO, óxido nítrico; F. Hag., factor de Hageman (Modificado de Sánchez S a partir de Badimon L et al., 1995 y Kjalke M et al., 1997).
IX
IXa
X
Xa
II
Va
PLAQUETA ACTIVADA
vWF TFVIIa
MONOCITOX
Xa VaII
IIa
VIII/vWF VIIIa
VaV
TF
IXIXa
VIIa
X
XaII
IIa
VIIIa
Va
PLAQUETA ACTIVADA
VIIIa
IIa PLAQUETA ACTIVADA
Fg
F Hag
FibrinógenoFIBRINA
ADP
Colágeno
NOPGI2
TXA2
Serotonina
--
--
+
+
++
+
PARED LESIONADA
Heparina
Trombomodulina
Proteina C
- -
ATIII
-
- +
IX
IXa
X
Xa
II
Va
PLAQUETA ACTIVADAPLAQUETA ACTIVADA
vWF TFVIIa
MONOCITOX
Xa VaII
IIa
VIII/vWF VIIIa
VaV
TF
IXIXa
VIIa
X
XaII
IIa
VIIIa
Va
PLAQUETA ACTIVADA
VIIIa
IIa PLAQUETA ACTIVADAPLAQUETA ACTIVADA
Fg
F Hag
FibrinógenoFIBRINA
ADP
Colágeno
NOPGI2
TXA2
Serotonina
--
--
+
+
++
+
PARED LESIONADA
Heparina
Trombomodulina
Proteina C
- -
ATIII
-
- +
XIa
Introducción 30
ESTRATEGIAS TERAPÉUTICAS DESTINADAS AL
TRATAMIENTO DE LA ATEROTROMBOSIS
Debido a la complejidad y los numerosos procesos que intervienen en la
patología aterotrombótica, se han desarrollado un gran número estrategias
farmacológicas destinadas a su tratamiento. Éstas se podrían dividir en dos grandes
líneas:
1. La reducción del proceso agudo mediante terapia antitrombótica. La inhibición de la
formación del trombo se consigue mediante fármacos que actúan a diferentes
niveles del proceso:
• Fármacos Antiagregantes: actúan sobre las plaquetas impidiendo su activación y
agregación. Entre ellos se encuentran los inhibidores de la Cox (salicilatos,
NSAID�s), los antagonistas del receptor plaquetario GP IIb-IIIa, los antagonistas
del receptor de la serotonina y los inhibidores de la movilización del calcio.
• Fármacos Anticoagulantes: bloquean la cascada de coagulación a diferentes
niveles impidiendo la formación de fibrina. Los más conocidos son los
inhibidores de la trombina, los inhibidores de la vitamina K (anticoagulantes
orales), y más recientemente los inhibidores de la formación de trombina
mediante el bloqueo de la vía del TF.
• Fármacos Trombolíticos: activan la fibrinolisis, potenciando así la disolución del
trombo. Algunos fármacos trombolíticos son la estreptoquinasa y el t-PA
recombinante (IV rt-PA).
Introducción 31
2. La prevención del proceso aterotrombótico mediante la reducción de los factores de
riesgo. Ésta estrategia se centra básicamente en la reducción de los niveles
plasmáticos de lípidos mediante la administración de fármacos hipolipemiantes.
Éste grupo de fármacos consigue frenar la evolución de las placas ateroscleróticas
previniendo así su rotura y complicaciones trombóticas. Existen al menos dos tipos
de hipolipemiantes, los fibratos y los inhibidores de la 3-hidroxi-3-metilglutaril
coenzima A reductasa (HMG-CoA reductasa), también llamados estatinas.
A continuación se explican algunos de los grupos farmacológicos citados y las
rutas metabólicas sobre las que actúan, teniendo en cuenta su importancia en esta tesis
doctoral.
INHIBICIÓN DE LA CICLOOXIGENASA
La Vía de la Ciclooxigenasa
El primer paso en la conversión del ácido araquidónico (AA) en eicosanoides
está catalizado por el enzima ciclooxigenasa (Cox), también conocido como
prostaglandina H sintasa (PGHS). Entre los eicosanoides se encuentran las
prostaglandinas, la PGI2 y el TXA2, con diversas funciones fisiológicas. Su producción
está iniciada por diversos estímulos físicos y químicos; como los mediadores de la
inflamación y hormonales, los cuales actúan mediante la interacción con receptores de
membrana que están acoplados a proteínas reguladoras G (Burch RM & Axelrod J,
1987). A través de ellas, o bien por un incremento de la concentración de iones calcio en
el citosol, se produce una activación de las fosfolipasas (fundamentalmente la PLA2),
que hidrolizan los fosfolípidos de la membrana celular, liberando el AA (Burch RM &
Axelrod J, 1987; Okajima F & Ui M, 1984). Una vez liberado, el AA se metaboliza por
dos vías oxidativas, la vía de la Cox y la vía de la lipooxigenasa, que originan dos
grupos de substancias activas diferentes, los eicosanoides y los hidroxiperóxidos del
ácido eicoxatetraenoico (HPETE), respectivamente.
Introducción 32
Por la acción de la Cox el AA se transforma en prostaglandina G2 (PGG2), y ésta
en el endoperóxido prostaglandina H2 (PGH2). Ambas son inestables y sufren una
rápida transformación, mediada por enzimas, en prostaglandinas más estables (PGD2,
PGE2 y PGF2). La PGH2 puede ser transformada por acción de tromboxanosintasa, en
TXA2, compuesto inestable con gran actividad vasoconstrictora y proagregante
plaquetario, que se convierte rápidamente en TXB2, estable pero inactivo. La PGH2
también puede ser transformada por la prostaciclinsintasa en prostaciclina, de actividad
vasodilatadora y antiagregante, que sufre una rápida hidroxilación no enzimática a 6-
keto-PGF1α (Moncada S & Vane JR, 1979). El resto de prostaglandinas tienen funciones
diversas: mediadoras de la inflamación, protectoras de la mucosa gástrica y participan
en la funcionalidad renal y ovárica. La Cox está presente en la mayoría de las células, y
una vez activada transforma el AA en PGH2, pero cada tipo celular tiene una sintasa
específica que determina el producto final. En el caso de las plaquetas el producto final
de la vía es el TXA2 ya que expresan tromboxanosintasa, en cambio las células
endoteliales producen PGI2 a través de la prostaciclinsintasa (Williams CS & Dubois
RN, 1996).
Existen dos isoformas de la Cox, una constitutiva (Cox-1) y una inducible (Cox-
2) (Simmons DL et al., 1989; Smith WL et al., 1996). La Cox-1 se expresa de manera
fisiológica en numerosos tejidos entre los que se encuentran el endotelio vascular y las
plaquetas. Por otro lado, la expresión de Cox-2 puede ser inducida por estímulos
inflamatorios (endotoxinas, citocinas, mitógenos) en diferentes tipos celulares
implicados en inflamación (Herschman HR, 1996; Pairet M & Engelhardt G, 1995; Wu
KK, 1995), siendo responsable de la producción de eicosanoides mediadores del
proceso inflamatorio. Asimismo, es quimiotáctica para leucocitos (Simon L, 1999).
Recientemente, se ha descrito que la Cox-2 también está implicada en funciones
fisiológicas como la producción de PGI2 a nivel vascular (Catella-Lawson F et al.,
1999; McAdam BF et al., 1999). Además, Viñals M et al. (1997) describió que las HDL
estimulan la producción de PGI2 por CML debido a una inducción de esta isoforma. Ya
que la PGI2 es beneficiosa en el proceso aterosclerótico, el hecho de que sea el producto
mayoritario de la Cox-2, sugiere un papel protector de este enzima.
Introducción 33
Figura 3. Representación esquemática de la vía de la Ciclooxigenasa (Cox) (Williams CS & Dubois RN, 1996).
Los Salicilatos: Aspirina y Triflusal
El compuesto farmacológico que tradicionalmente representa a los inhibidores
de la Cox, es un derivado sintético del ácido salicílico, el ácido acetilsalicílico (ASA),
popularmente conocido como aspirina (Figura 4). Este compuesto se introdujo en la
terapéutica a finales del siglo XIX y se convirtió en el analgésico-antipirético más
utilizado y actualmente se considera el patrón farmacológico de los analgésicos no
opiáceos. Además, el descubrimiento de su mecanismo de acción, hace escasamente 30
años, permitió la extensión de su uso a la prevención y tratamiento de los fenómenos
tromboembólicos. Existe un gran número de salicilatos derivados de la aspirina y
muchos de ellos se utilizan en procesos inflamatorios y como analgésicos. La aspirina
también tiene múltiples usos, pero es el fármaco de primera elección para los procesos
Fosfolípidos de la Membrana Celular
Fosfolipasa AA
PGG2
PGH2
Cox-1 Cox-2
Tipo Celular Específico
PGE sintasa PGF sintasa PGI sintasa TXA sintasa
PGE2 PGFα2 TXA2 PGI2
Riñón Ovario Plaquetas Endotelio Vascular CML
PGD sintasa
PGD2
Endotoxinas Citocinas Mitógenos
Estímulo
Introducción 34
trombóticos. A partir del ácido acetilsalicílico se sintetizaron nuevos compuestos más
específicos para este tipo de procesos, entre estos se encuentra el triflusal (ácido-2-
acetoxi-4-(trifluorometil)-benzoico, y su metabolito el ácido 2-hidroxi-4-trifluorometil-
benzoico (HTB) (Figura 4).
Figura 4. Estructura química del ácido salicílico y su derivado acetilado, el ácido acetilsalicílico, y del triflusal y su principal metabolito, el HTB.
Farmacocinética
Los fármacos antiinflamatorios no esteroideos (NSAID�s), también conocidos
como salicilatos, en general se absorben con rapidez una vez ingeridos, básicamente en
el intestino delgado superior y una pequeña parte en el estómago. Tras la administración
oral se obtienen concentraciones plasmáticas apreciables a los 2-30 minutos y máximas
a los 60-120 minutos (Rowland M et al., 1972) y la biodisponibilidad de la forma no
hidrolizada es 70%. El porcentaje de unión de la aspirina a proteínas plasmáticas
depende de su concentración y oscila entre 25-95%, y su vida media plasmática es de 15
minutos. El triflusal se une en un 99% a proteínas plamáticas y su vida media es de 30
minutos. La aspirina sufre un rápido proceso de hidrólisis tras su absorción mediante
esterasas presentes fundamentalmente en el hígado, pulmón, plasma y glóbulos rojos,
aunque el proceso comienza en la mucosa gastrointestinal durante la fase de absorción.
El proceso de metabolización da lugar a ácido salicílico, entre otros compuestos, que es
un metabolito activo. El triflusal también es metabolizado rápidamente, mediante
desacetilación, transformádose en HTB, su principal metabolito activo. El HTB tiene
una semivida mucho mayor que el triflusal (35 horas).
CO2H
O CH3
O
CO2H
OH
Ácido Acetilsalicílico Ácido Salicílico
CO2
O CH3
O
CF3 Triflusal
CO2H
O
CF3
HTB
Introducción 35
Farmacodinámica El mecanismo de acción de la aspirina, el triflusal, así como de otros salicilatos,
consiste en la acetilación de un residuo de serina situada en la posición 530 de la cadena
polipeptídica de la Cox, lo cual conduce a una inhibición irreversible del enzima. De
esta manera, se interrumpe la transformación del AA en sus derivados ciclooxigenados,
inhibiendo los mecanismos fisiopatológicos en los que éstos están implicados. Debido a
la gran cantidad de mecanismos en los que está implicada la Cox, los salicilatos
producen amplitud de acciones, y no todas ellas beneficiosas. Mediante la inhibición de
los eicosanoides mediadores de la inflamación, se producen acciones analgésicas,
antipiréticas y antiinflamatorias; a través de la inhibición de la producción de TXA2 en
plaquetas se produce un efecto antitrombótico, pero como contrapartida modifican la
producción de PGI2 vascular, efecto contrapuesto al de la inhibición plaquetaria, y de
varias prostaglandinas implicadas en la funcionalidad de numerosos órganos (Castillo J
et al., 1995).
En las plaquetas, la aspirina produce una acetilación irreversible de la Cox, con
lo cual reduce la producción de TXA2 (Roth GJ & Majerus PW, 1975; Roth GJ &
Calverley DC, 1994). Como las plaquetas son anucleadas, y por tanto incapaces de
llevar a cabo las síntesis proteica, no pueden reponer la actividad enzimática, por lo que
la inhibición plaquetaria se prolonga durante toda la vida de la plaqueta (8-9 días). En
humanos, una dosis oral de 50 mg de aspirina es suficiente para inhibir la síntesis
plaquetaria de TXA2 durante 3 días (Mohri H & Ohkubo T, 1993). La aspirina inhibe
también la agregación secundaria inducida por la trombina, colágeno o AA, debido a
que inhibe la producción plaquetaria de diacilglicerol (Werner MH et al., 1991), aunque
este efecto es menos duradero que la inhibición de la Cox y depende de la dosis
administrada. Es importante resaltar que la inhibición de la Cox no excluye de forma
absoluta el papel trombogénico de las plaquetas, pues éstas pueden ser activadas a
través de otras rutas. Esto contribuye a explicar los fracasos terapéuticos observados en
ensayos clínicos y en la práctica diaria en relación con el uso de la aspirina como
profilaxis antitrombótica (Chesebro JH & Fuster V, 1987; Antiplatelet Trialists�
Collaboration, 1988 y 1994; Antithrombotic Trialists� Collaboration, 2002). A través
del mismo mecanismo de acetilación de la Cox, la aspirina inhibe la síntesis de PGI2 por
el endotelio vascular, que ejerce un efecto contrario al TXA2, ya que inhibe la
Introducción 36
agregación plaquetaria y es vasodilatadora. La PGI2 inhibe la activación plaquetaria
mediante la estimulación de la adenilciclasa, lo que conlleva a un incremento del
AMPc. Como ya se ha comentado anteriormente, el AMPc facilita la entrada de calcio
en sus depósitos, reduciendo su disponibilidad en la plaqueta, mientras que el TXA2
facilita el paso inverso. Los efectos contrapuestos de la aspirina sobre la agregación
plaquetaria y sobre la capacidad antitrombótica del endotelio vascular suponen un
problema en la terapia antitrombótica conocido como el �dilema de la aspirina� (Preston
FE et al., 1981; Cruz JP et al., 1992) (Figura 5). El efecto sobre la PGI2 vascular es
dosis-dependiente, y a diferencia de las plaquetas, carentes de núcleo, en el endotelio
vascular se produce una regeneración del complejo enzimático de la Cox. Debido a esta
característica, la manera de obtener una inhibición de la Cox plaquetaria sin afectar la
Cox vascular consiste en la administración de dosis bajas de aspirina (50-75 mg) que
consigan una inhibición de la síntesis de TXA2 plaquetario sin afectar de la síntesis
vascular de PGI2 (Vial JH et al., 1990; Fitzgerald GA et al., 1991).
Figura 5. Efectos antagónicos del ácido acetilsalicílico (ASA) sobre los procesos de agregación plaquetaria, �Dilema de la aspirina� (Vial JH et al., 1990; Fitzgerald GA et al., 1991).
AA
PGH2
PGG2
TXA2 PGI2
PLAQUETAS ENDOTELIO VASCULAR
Ácido Acetilsalicílico
Cox
VASOCONSTRICCIÓN PROAGREGACIÓN
VASODILATACIÓN ANTIAGREGACIÓN
Introducción 37
El fármaco antiagregante ideal debería inhibir la síntesis de TXA2, respentando
la de PGI2, e incrementar los niveles de AMPc. Según esta premisa se diseñó el triflusal.
Este derivado de la aspirina inhibe de manera irreversible la Cox, pero con menor
potencia, y además inhibe la fosfodiesterasa plaquetaria, enzima responsable de la
metabolización del AMPc (Cruz JP & Sánchez de la Cuesta F, 1995). Su metabolito, el
HTB, también inhibe la Cox, pero más débilmente que el triflusal, e inhibe la
fosfodiesterasa con mucha más potencia que su antecesor (10 veces más). Respecto a la
PGI2 vascular, el triflusal y el HTB inhiben su síntesis, pero son necesarias
concentraciones mil veces superiores a las de aspirina, y diez veces superiores que las
necesarias para su efecto como antiagregante plaquetario (Cruz JP et al., 1992). Ya que
el triflusal una vez administrado, se metaboliza rápidamente a HTB, el cual tiene una
vida media mucho más larga, lo efectos obtenidos básicamente se deben a éste último,
con lo que el resultado es la inhibición de la formación de TXA2 y un incremento de
AMPc en la plaqueta, mientras que a nivel vascular no se afecta la PGI2.
Respecto a otros efectos de los salicilatos, el mecanismo mediante el cual estos
compuestos tienen un efecto antiinflamatorio, es a través de la inhibición de la isoforma
Cox-2, implicada en los procesos inflamatorios. La inhibición de esta isoforma se
consigue con dosis superiores a las antitrombóticas, debido a que es rápidamente
regenerada por las células nucleadas. Esto explica la diferencia de dosificación y del
intervalo de administración de la aspirina, cuando se utiliza como fármaco
antiinflamatorio o como antiplaquetario. Recientemente se ha descrito que los salicilatos
ejercen la acción antiinflamatoria a través de un mecanismo independiente de la
inhibición de la Cox-2, mediante la inhibición del factor de transcripción NF-κB (Kopp
E & Ghosh S, 1994; Bayón Y et al., 1999), factor que participa activamente en el
proceso inflamatorio controlando diversos genes de inflamación (Barnes PJ & Karin M,
1997).
Los salicilatos clásicos inhiben las dos isoformas de Cox, pero en estos últimos
años se han sintetizado nuevos compuestos que inhiben selectivamente la Cox-2 con la
finalidad de obtener un efecto antiinflamatorio aislado, evitando los efectos colaterales
que acompañan a la inhibición de la Cox-1 constitutiva (a nivel vascular, gástrico, etc).
Sin embargo, diversos estudios clínicos relacionados con la patología cardiovascular
Introducción 38
han demostrado que los inhibidores de la Cox-2 no son tan beneficiosos como se
esperaba, ya que se observó una reducción en los niveles de prostaciclina vascular tanto
en pacientes de riesgo como en voluntarios sanos, acompañada de mayores niveles de
TXA2 debido a la falta de inhibición de la Cox-1 plaquetaria, por lo que se obtuvo una
situación de vasoconstricción generalizada que favorecía los procesos aterotrombóticos
(Catella-Lawson F et al., 1999; McAdam BF et al., 1999). Estos resultados indican que
la Cox-2 no es exclusiva de procesos inflamatorios y que probablemente también
participa en procesos fisiológicos. Con el uso de salicilatos que inhiben ambas
isoenzimas, el equilibrio prostaciclina-TXA2 se mantiene y por ello, se obtiene como
resultado global un beneficio en la enfermedad isquémica coronaria.
Farmacología Clínica
La aspirina demostró ser efectiva en la prevención de eventos vasculares en
diferentes ensayos clínicos, pero los resultados obtenidos en éstos fueron muy
heterogéneos. En el estudio ISIS-2 (Second International Study of Infarct Survival) la
administración de 163 mg de aspirina durante 5 días, a partir de 24 horas de mostrar
síntomas de infarto de miocardio, redujo en un 23% el riesgo de mortalidad vascular y
un 46-49% el reinfarto (Patrono C, 2001). El tratamiento a largo plazo también
demostró ser efectivo en la prevención del infarto de miocardio en pacientes de riesgo
medio y alto. Dos ensayos realizados en hombres, con riesgo cardiovascular reducido o
elevado, en los que la aspirina se administró a largo plazo (Physicians� Health Study y
Thrombosis Prevention Trial), mostraron una reducción de los eventos vasculares pero
no de la mortalidad vascular (Patrono C, 2001). En el meta-análisis Antiplatelet
Trialists� se obtuvieron resultados similares (reducción de la incidencia de los eventos
cardiovasculares en un 25%) (Antiplatelet Trialists� Collaboration, 1988 y 1994). Se ha
observado que dosis bajas de aspirina son tan efectivas en la patología cardiovascular,
como dosis más elevadas. Incluso se ha descrito una mayor incidencia de accidentes
cardiovasculares en pacientes tratados con dosis altas, lo cual se atribuye al efecto de los
salicilatos sobre la producción de PGI2 vascular (Catella-Lawson F et al., 1999;
McAdam BF et al., 1999). Estudios clínicos muestran que el triflusal y la aspirina tienen
una efectividad similar en la prevención de la patología cardiovascular, aunque
Introducción 39
comparado con esta última, el triflusal muestra mayor efectividad en la prevención de
los eventos cerebrovasculares (Cruz-Fernández JM et al., 2000).
A pesar de que los ensayos clínicos sugieren un beneficio con la terapia con
aspirina en pacientes ateroscleróticos, su uso clínico diario y su estudio en diversos
modelos animales sugieren que este compuesto no es del todo efectivo en la inhibición
de la aterotrombosis, ya que sólo bloquea una de las numerosas vías de activación
plaquetaria (Folts JD et al., 1999).
INHIBICIÓN DE LA VÍA DEL FACTOR TISULAR
A pesar de que la aspirina y la heparina han sido utilizadas tradicionalmente en
el tratamiento de la patología isquémica coronaria, no han demostrado prevenir en su
totalidad los eventos trombóticos (Chesebro JH & Fuster V, 1987; Antiplatelet Trialists�
Collaboration, 1988 y 1994). Esto se debe a que la aspirina y otros fármacos del mismo
grupo, como se ha comentado en el apartado anterior, no bloquean totalmente la
activación plaquetaria, ya que sólo afectan la formación de TXA2. Por otro lado, la
actividad inhibitoria de la heparina sobre la trombina se ve limitada ya que el trombo
residual, presente en la zona lesionada de la arteria, contiene trombina activa unida a
fibrina que es poco accesible para la heparina, y además en la zona del trombo se
produce liberación de factor plaquetario 4, así como del monómero de fibrina II, los
cuales inhiben a la heparina (Weitz JI et al., 1990; Fitzgerald DJ & Fitzgerald GA,
1989), de manera que la trombosis se sigue activando.
Por esta razón, diferentes estrategias alternativas han sido estudiadas. Estas se
basan en la interrupción del reclutamiento plaquetario y de la formación de fibrina
mediante la inhibición directa de la trombina (Hanson SR & Harker L, 1988). Un
ejemplo de este grupo farmacológico es la r-Hirudina (Badimon L et al., 1989),
molécula sintética que inhibe irreversiblemente y de manera competitiva a la trombina.
Las moléculas de hirudina y otras antitrombinas específicas son al menos diez veces
más pequeñas que el complejo heparina-antitrombina III, no tienen inhibidores naturales
y, por tanto, tienen una mayor accesibilidad a la trombina. Se ha demostrado que la
Introducción 40
inhibición específica de la trombina es mucho más eficaz para inhibir la progresión del
crecimiento del trombo en las zonas de daño arterial, que la aspirina, la heparina o
ambas a la vez (Meyer BJ et al., 1994). El inconveniente de estos fármacos es que
alteran la función hemostática prolongando el tiempo de sangría (Topol EJ, 1993;
Antman EM, TIMI 9ª Investigators, 1994; GUSTO IIa Investigators, 1994) y lo hacen
de manera proporcional al efecto antitrombótico obtenido.
Un mecanismo con el que se consigue la disminución de los riesgos
hemorrágicos de los agentes antitrombóticos, consiste en la inhibición de la formación
de trombina. Para ello se utilizan inhibidores de las proteasas de la cascada de la
coagulación, que concretamente inhiben la generación de trombina dependiente de la
vía del TF. Diferentes trabajos han estudiado el efecto de los inhibidores del TF en la
trombosis desencadenada sobre lesiones vasculares y se ha observado que se consigue
un efecto antitrombótico sin prolongar el tiempo de sangrado (Harker L et al., 1996).
Incluso, la lesión al cabo de varios días es menor cuando se ha administrado un
inhibidor del TF (Jang Y et al., 1995; Harker L et al., 1996; Asada Y et al., 1998). Entre
los diferentes inhibidores del TF estudiados se encuentran:
• Inhibidor del TF recombinante humano (rTFPI): Este compuesto es una molécula
recombinante del inhibidor del TF humano (TFPI ó LACI). Es un inhibidor de
proteinasas trivalentes tipo Kunitz que se encuentra en la sangre de manera
fisiológica. Su mecanismo de acción consiste en la inhibición del segundo dominio
tipo Kunitz del factor Xa y del primer dominio tipo Kunitz del complejo factor
tisular-factor VIIa. Como resultado de su unión a estos factores se forma un
complejo cuaternario que contiene el factor Xa-TFPI-factor VIIa/TF que inactiva la
vía del TF (Girard TJ et al., 1989; Wesselsch R et al., 1992; Han X et al., 1999;
Badimon JJ et al., 1999).
• Anticuerpos contra el TF: Se unen al TF y bloquean la formación del complejo TF-
factor VIIa, inhibiendo la vía del TF de la coagulación (Badimon JJ et al., 1999).
Introducción 41
• Factor VIIa inhibido (rFVIIai): El factor VIIa es un enzima de la cascada de la
coagulación, muy parecido a la tripsina, que pertenece al grupo de las proteasas de
la serina homóloga. Actúa hidrolizando substratos específicos en el residuo arginilo
(Coggins JR et al., 1974). El rFVIIai es una molécula recombinante del factor VIIa
humano que tiene su centro activo inactivado. El centro activo se puede inhibir con
péptidos de clorometil cetona arginina, según el tipo de inhibidor utilizado se
obtiene el FFR-rFVIIa (D-Phe-Phe-Arg clorometil cetona) o el DEGR-rFVIIa
(dansyl-Glu-Gly-Arg- clorometil cetona) (Kettner C & Shaw E, 1981). Cuando el
rFVIIa está presente en el lugar de la lesión, compite con el factor VIIa fisiológico,
por su unión al TF formándose el complejo TF-rFVIIa, que no es funcional (Rao L
& Ezban M, 2000).
El Factor VIIa Recombinante Humano con el Centro Activo
Desactivado: FFR-rFVIIa
El FFR-rFVIIa (Novo Nordisk, Dinamarca) es un fármaco de reciente
descubrimiento que todavía está en fase experimental y aún no está disponible para su
uso en patologías trombóticas. Los efectos de este compuesto han sido parcialmente
estudiados in vitro e in vivo. Respecto a los datos farmococinéticos, existe un estudio en
humanos, donde se administró una sola dosis intravenosa de FFR-rFVIIa, que muestra
que su tiempo de vida media se encuentra aproximadamente entre 4 y 6 horas, y que
éste es un fármaco relativamente seguro y bien tolerado (Erhardsten E et al., 2001).
Por lo que se refiere a la farmacodinámica, el mecanismo de acción del FFR-
rFVIIa se basa en su unión al TF y consecuente inactivación del complejo formado por
ambos. El FFR-rFVIIa tiene la misma afinidad que el factor VIIa por enlazarse al TF
funcional (a las zonas activas del TF), pero este compuesto se une con una afinidad seis
veces mayor que el factor VIIa al TF inactivo (a las zonas inactivas) (Sorensen BB et
al., 1997; Sorensen BB & Rao L, 1998). Esta unión es reversible, ya que la presencia de
una mayor cantidad de moléculas de factor VIIa en la zona de la reacción son capaces
de desplazar el FFR-rFVIIa unido a TF (Golino P et al., 1998). Al unirse al TF el FFR-
rFVIIa induce una prolongación del tiempo de la protrombina (PT) (prueba laboratorial
Introducción 42
que evalúa la vía del TF), sin afectación del tiempo parcial de tromboplastina activada
(aPTT) (prueba laboratorial que evalúa la vía por contacto), agregación plaquetaria, ni
del tiempo de sangrado (Rao L & Ezban M, 2000; Erhardsten E et al., 2001). Este
efecto sobre el PT ya se aprecia a los 15 minutos de la administración intravenosa, y
puede perdurar durante unas 8 horas (Erhardsten E et al., 2001).
Diferentes estudios in vitro con modelos celulares de la vía del TF, han
demostrado que el FFR-rFVIIa disminuye la producción de trombina y la activación
plaquetaria (Kjalke M et al., 1997). También se ha observado una disminución en la
deposición de plaquetas y de fibrina en modelos in vivo y ex vivo después de administrar
sistémicamente FFR-rFVIIa (Lindahl AK et al., 1993; Kirchhofer D et al., 1995), así
como un menor engrosamiento de la neoíntima varias semanas después de la inducción
de una lesión arterial (Harker LA et al., 1997; Courtman DW et al., 1998). La
aplicación local de FFR-rFVIIa en la zona lesionada del vaso también disminuye la
trombosis (Golino P et al., 1998).
Además de los efectos directos y a corto plazo del FFR-rFVIIa, la inhibición del
TF durante unas pocas horas (el tiempo de vida media es corto), induce efectos que
persisten durante mucho más tiempo. El complejo TF-FVIIa activa una serie de eventos
de señalización intracelular, como la elevación del calcio intracelular (Rottingen JA et
al., 1995), la activación de la proteína-quinasa de actividad mitógena (MAP) (Poulsen
LK et al., 1998) y la alteración de la expresión génica. Cuando el FFR-rFVIIa forma el
complejo con el TF, las respuesta de señalización intracelular no se producen (Pendurthi
UR et al., 1997). Se sabe que la trombina activa el gen del TF, posiblemente la
inhibición de la formación de trombina por el FFR-rFVIIa suponga una menor
expresión de este gen (Rao L & Ezban M, 2000). De hecho, un efecto similar ha sido
descrito inhibiendo el TF con TFPI (Hamik K et al., 1999). Estos efectos a más largo
plazo están relacionados con la reducción de la restenosis por el FFR-rFVIIa y otros
inhibidores del TF. Por tanto, la inhibición de la vía del TF da lugar a diversos efectos
beneficiosos más allá de los esperados a nivel de la coagulación sanguínea.
Introducción 43
INHIBICIÓN DE LA HMG-CoA REDUCTASA
La Vía del Mevalonato
La vía del mevalonato es la ruta metabólica a través de la cual se produce la
biosíntesis de colesterol a partir del 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A (HMG-CoA)
(Figura 6). La primera reacción de esta vía es la reducción del HMG-CoA a mevalonato,
catalizada por el enzima HMG-CoA reductasa, enzima clave debido a su carácter
limitante de la vía. El mevalonato es además precursor de los isoprenoides, productos
imprescindibles en el funcionamiento de la célular (Goldstein JL & Brown MS, 1990).
Uno de los primeros isoprenoides de la vía es el isopentenil-pirofosfato (IPP), que es el
precursor de la isopentiladenina y participa en la síntesis del RNA de transferencia. El
IPP es a su vez, precursor del farnesil-pirofosfato (FPP). La condensación de dos
moléculas de FPP por acción de la escualenosintasa da lugar al colesterol. Por otro
lado, la condensación del FPP con IPP da lugar al geranilgeranilpirofosfato trans
(GGPPt) o geranilgeranilpirofosfato trans-trans-cis (GGPPc). El GGPPc es el precursor
del dolicol, un isoprenoide de cadena larga que participa en el proceso de glicosilación
de proteínas (Carroll KK et al., 1992). El GGPPt y el FPP están implicados en la
modificación post-transcripcional de las proteínas. Existen numerosas proteínas que han
de someterse a este proceso para ser funcionales, entre ellas se encuentran las proteínas
G y las Rho GTPasas (Van AL & D�Souza-Schorey C, 1997; Hall A, 1998). Las Rho
GTPasas, miembros de la superfamilia Ras de pequeñas proteinas unidas a GTP, son los
substratos que más se someten a la modificación post-transcripcional mediante
isoprenalización. La familia Rho está constituida por tres tipos de proteínas, Rho, Rac y
Cdc42. Tras la isoprenalización de Rho, el Rho inactivo (unido a GDP) situado en el
citosol es activado (unido a GTP) y se transloca a la membrana. Los diferentes
miembros de la familia Rho tienen funciones específicas relacionadas con la
organización del citoesqueleto de actina, la transcripción genética, transducción del
señal, conformación de la célula, motilidad, secreción, proliferación, y estabilidad del
RNA mensajero.
Introducción 44
Figura 6. Representación esquemática de la vía del mevalonato (Takemoto M & Liao JK, 2001).
Inhibidores de la HMG-CoA Reductasa
En 1973, Endo A (1992) descubrió el primer inhibidor de la HMG-CoA
reductasa, la mevastatina o compactina, a partir de una cepa de Penicillium citrinum.
Actualmente existen varios inhibidores de la HMG-CoA, también conocidos como
estatinas. Este grupo de fármacos son los hipolipemiantes de primera elección en la
patología cardiovascular. Entre las estatinas más importantes están la lovastatina,
Acetil-CoA
Mevalonato
Isopentil-PP
Farnesil-PP
Isopentiladenina tRNA
Geranilgeranil-PPc
Dolicol
Cis-prenil transferasa
Trans-prenil transferasa
Geranilgeranil-PPt
Proteínas isopreniladas (Familia Rho)
Escualeno
Colesterol
Escualeno sintasa
Isoprenalización Ras
HMG-CoA reductasa
HMG-CoA
Introducción 45
simvastatina, pravastatina, fluvastatina, atorvastatina y cerivastatina. Todas ellas inhiben
la biosíntesis del colesterol, sin embargo, en los últimos años se está demostrando que
su espectro de actividad es cada vez mayor (Laufs U, Liao J, 2000; Takemoto M, Liao J,
2001).
Figura 7. Inhibidores de la HMG-CoA reductasa (estatinas) que se emplean actualmente en la clínica. La lovastatina, simvastatina y pravastatina se obtienen de la fermentación de cultivos de hongos, y la fluvastatina, atorvastatina y cerivastatina son sintéticas.
Farmacocinética
La biosíntesis del colesterol se produce principalmente en el hígado, aunque
también tiene lugar en otros órganos, sobretodo en el bazo y las gónadas, donde es el
precursor de hormonas esteroideas. Se ha encontrado que la selectividad tisular de las
diferentes estatinas está determinada por su carácter lipófilo, de manera que aquellas
H H
Introducción 46
que tienen un carácter más hidrófilo presentan en principio una mayor
hepatoselectividad (Roth BD et al., 1991).
Los datos farmacocinéticos en pacientes hipercolesterolémicos muestran que la
fluvastatina tiene la mejor biodisponibilidad (98%), la simvastatina la tiene elevada (60-
85%) y la más baja la tienen la pravastatina y lovastatina (30-35%). Todos, excepto la
pravastatina se fijan en gran medida a las proteínas plasmáticas (>95%). La semivida
plasmática de todos los inhibidores, oscila entre 1 y 3 horas, excepto para la
atorvastatina, que es de 14 horas. Además, la atorvastatina tiene dos metabolitos
activos, el PD152873 y el PD 142545 (Lea AP & McTavish, 1997).
Farmacodinámica
Las estatinas son inhibidores competitivos de la HMG-CoA (Ki ≈ 0,5-10 nM),
actúan por interacción con dos zonas del centro activo del enzima: la región de unión
del hidroximetilglutarilo y un bolsillo hidrófobo al que se unen los anillos aromáticos o
hidrófobos. La forma farmacológicamente activa de las estatinas es la hidroxiácida y no
lactónica, ya que ésta mimetiza la estructura de transición en la reducción de HMG-CoA
por HMG-CoA reductasa, es lo que se denomina un análogo del estado de transición
(Nakamura CE & Abeles RH, 1985). Por lo tanto, la atorvastatina y la pravastatina se
administran en forma hidroxiácida activa, mientras que la simvastatina y la lovastatina
requieren la metabolización del anillo lactónico al hidroxiácido.
Tal como se ha mencionado previamente, los metabolitos del mevalonato
participan en muchas funciones celulares, por lo que su inhibición mediante estatinas
puede motivar la alteración de otras actividades además de la reducción de los niveles
de colesterol (Figura 8). A nivel cardiovascular se ha descrito que las estatinas tienen
los siguientes efectos:
Introducción 47
• Pared arterial: mediante su acción hipolipemiante, las estatinas inducen una
modesta regresión del tamaño de la lesión y significativos cambios en su
composición que hacen la lesión más estable (Koh KK, 2000; Fukumoto Y et al.,
2001). Estos cambios de composición se basan en la reducción de la acumulación de
de lípidos, macrófagos y de su producción de MMP y TF (Aikawa M et al., 2001).
Las estatinas inhiben la expresión de MMP y TF mediante mecanismos
dependientes e independientes de la reducción del colesterol (Bourcier T & Libby P,
2000; Aikawa M et al., 2001; Fukumoto Y et al., 2001). Las estatinas también
inhiben la proliferación de las CML (Soma MR et al., 1993; Martínez-González J &
Badimon L, 1996; Guijarro C et al., 1998; Fukumoto Y et al., 2001), lo cual frena la
progresión de la lesión. Este mecanismo es independiente de los niveles de
colesterol y se produce mediante la inhibición de la isoprenalización de Rho, el cual
es el mediador de la inducción de la proliferación de CML a través de PDGF (Laufs
U et al., 1999). Estudios recientes sugieren propiedades antiinflamatorias de estos
compuestos, ya que reducen el contenido de células inflamatorias en la placa
aterosclerótica (Vaughan CJ et al., 2000). Se ha descrito que las estatinas inhiben la
activación del factor de transcripción NF-κB, factor implicado en la transcripción de
diferentes mediadores de la inflamación, ya que impiden la isoprenalización
necesaria para su activación (Ortego M et al., 1999; Hernández-Presa MA et al.,
2002). Finalmente, se ha descrito que las estatinas mejoran la disfunción endotelial,
ya que reducen el estrés oxidativo (Rikitake Y et al., 2001) y aumentan la
producción de NO a través de la inducción de eNOS y la estabilización de su RNA
mensajero (mRNA) (Laufs U et al., 1998; Kureishi Y et al., 2000; Martínez-
González J et al., 2001c). El mecanismo mediante el cual inducen eNOS también es
independiente de su acción hipolipemiante y se produce a través de la inhibición de
Rho (Laufs U et al.,1998).
• Trombosis: la hipercolesterolemia aumenta la reactividad plaquetar in vivo
(Badimon JJ et al., 1991) e in vitro (Rosenson RS & Lowe GDO, 1998), y se ha
sugerido que la disminución de los niveles de lípidos por medios farmacológicos
reduce la reactividad plaquetar (Schor K, 1990). Varios estudios mostraron una
menor deposición plaquetaria en modelos de trombosis ex vivo con varias estatinas
(Lacoste L et al., 1995, 1996; Alfón J et al., 1999a y 1999b; Rauch U et al, 2000b;
Dangas G et al., 2000). Los mecanismos sugeridos se basan en la reducción de la
Introducción 48
producción de TXA2 (Notarbartolo A et al., 1995) y la modificación del contenido
en colesterol de la membrana plaquetaria (Oshamah H et al., 1997; Lijnen P et al.,
1996). También se han descrito efectos sobre los factores de coagulación. En el
apartado anterior se ha comentado la inhibición de TF en macrófagos (Aikawa M et
al., 2001; Fukumoto Y et al., 2001), lo que implica una reducción de la
trombogenicidad de la pared vascular. Hay estudios que demuestran una reducción
de la producción de trombina y de varios factores de coagulación en pacientes
hipercolesterolémicos tratados con estatinas, en los que se redujo la coagulación
sanguínea (Szczeklik A et al., 1999; Undas A et al., 2001). Se han obtenido
reducciones de los niveles de PAI-1 con estatinas y otros hipolipemiantes,
potenciándose así la fibrinolisis (Koh KK, 2000). El efecto sobre el fibrinógeno es
contradictorio, ya que se han descrito reducciones e incrementos (Koh KK, 2000).
Figura 8. Esquema representativo de la inhibición de Rho por las estatinas. Las estatinas inhiben la HMG-CoA reductasa, bloqueando la síntesis de isoprenoides y colesterol. El isoprenoide geranilgeraniol (GG) se une a Rho, permitiendo su activación y translocación a la membrana celular (Modificado de Sánchez S a partir de Laufs U & Liao K, 2000).
Rho inactivo
GG
GDP
Pi
GG
GDP Rho inactivo
GG
GTP Rho activo
Rho inactivo GDP
PPi Geranilgeranil-PPt
GDP
GTP
ESTATINAS
ESTATINAS
ESTATINAS
ESTATINAS
Acetil-CoA HMG-CoA
HMG-CoA reductasa
X Isopentil-PP Geranil-PP Farnesil-PP
Colesterol
Translocación
Mevalonato
CitoesqueletoActina
RegulaciónGénica
Introducción 49
Respecto a la actividad de cada una de las estatinas, según estudios de inhibición
en varios tipos celulares, la pravastatina es la menos potente en lo que respecta a la
inhibición de la HMG-CoA reductasa, pero es la que presenta mayor selectividad
hepática. Las seis estatinas siguen el siguiente orden de magnitud en función de su
actividad: cerivastatina >> atorvastatina = fluvastatina = lovastatina = simvastatina >>
pravastatina (Roth BD et al., 1991; Lea AP & McTavish, 1997).
Farmacología Clínica
Las estatinas inducen disminuciones significativas de los niveles de colesterol
total, colesterol LDL y triglicéridos (en menor proporción), y a la vez aumentan la
concentración de colesterol HDL. El mecanismo de reducción lipídica se basa en que el
enzima HMG-CoA reductasa es limitante en la biosíntesis del colesterol (Goldstein JL
& Brown MS, 1977), y como resultado de su inhibición se reduce la síntesis hepática de
LDL. Para compensar esta reducción de LDL, el hígado aumenta la captación del LDL
circulante mediante una regulación al alza de los receptores hepáticos de LDL. El
resultado es la disminución de la concentración plasmática de LDL. En algunas
estatinas, el mecanismo de acción también está relacionado con la inhibición de la
secreción hepática de VLDL y LDL (Burnett JR et al., 1997).
En la Tabla 1 se resumen los resultados de diversos ensayos clínicos realizados
con pacientes y voluntarios sanos, en los que se estudió el efecto hipolipemiante de las
estatinas (Lea AP & McTavish, 1997). Según estos ensayos, la atorvastatina tiene una
potencia ligeramente superior a la simvastatina en cuanto a las reducciones de colesterol
total, LDL y triglicéridos. Sin embargo, la potencia hipocolesterolémica de ambas es
superior a la de la pravastatina a dosis equivalentes. La pravastatina y la simvastatina
incrementan de manera similar el colesterol HDL, y la atorvastatina lo hace con menor
potencia.
Introducción 50
Fármaco Dosisa Sujetos Col. totalb Col. LDLb Col. HDLc Triglicéridosb
A 40 x 2 Vol. sanos 34 48 2 25
A 10 x 26 Hipercolest. 26 35 1* 21
A 20-80 x 4 Hipercolest. 32-39 35 27-37
P 10 x 6 Hipercolest. 16 22 5 6
P 20 x 6 Hipercolest. 20 29 7 11
S 10 x 6 Hipercolest. 23 32 7 13
S 20 x 6 Hipercolest. 28 38 7 14
Tabla 1. Ensayos clínicos en los que se evaluaron las propiedades hipolipolipemiantes de diversos inhibidores de la HMG-CoA reductasa; A, indica atorvastatina; P, pravastatina y S, simvastatina; a, dosis en mg/día x semanas de tratamiento; b, porcentaje de la reducción; c, porcentaje del incremento (* reducción). Adaptado de Lea AP & McTavish, 1997.
El uso de simvastatina en el estudio 4S (Scandinavian Simvastatin Survival
Study Group, 1994) y pravastatina en los estudio CARE (Sacks FM et al., 1996) LIPID
(The Long-Term Intervention with Pravastatin in Ischaemic Disease (LIPID) Study
Group, 1998) y WOSCOPS (Sheperd J et al., 1995) demostró que estas estatinas
diminuyen el colesterol y a la vez proporcionan un beneficio terapéutico tanto en
prevención secundaria (4S y CARE) como primaria (WOSCOPS). En el ensayo 4S una
dosis media diaria de 27 mg de simvastatina indujo un descenso del 35% de los niveles
de colesterol LDL y una disminución del 34% de las muertes por causa cardiovascular y
en el número de infartos definidos. El estudio WOSCOPS fue el primero en evaluar los
beneficios de la reducción de los niveles de colesterol con un inhibidor de la HMG-CoA
reductasa en prevención primaria. En el grupo de pacientes al que se administró una
dosis de 40 mg/día de pravastatina se observó una reducción del número de infartos de
miocardio y de muertes por enfermedad cardiovascular (31%).
Sin embargo, el beneficio terapéutico que se observa se produce antes de que
pueda haberse producido regresión de la placa aterosclerótica. Así, el estudio MAAS
halló que se producía un efecto significativo en la mejora de la morfología arterial sólo
tras 4 años de tratamiento con estatinas (MASS investigators, 1994). Por otro lado,
fueron necesarios 9 años en el estudio POSCH para obtener beneficio clínico mediante
una intervención que reducía únicamente el colesterol plasmático a una concentración
similar a la de las estatinas (Buchwald H et al., 1995). Los beneficios clínicos del
Introducción 51
estudio 4S empezaron a observarse a partir de los dos años (Scandinavian Simvastatin
Survival Study Group, 1994), mientras que en estudio HPS (Heart Protection Study
Collaborative Group, 2002) el tratamiento con simvastatina produjo beneficios en
pacientes de elevado riesgo cardiovascular, de manera independiente a las
concentraciones de colesterol plasmático. En los estudios MIRACL (Schwartz GG et
al., 2001) y ASCOT (Sever PS et al., 2003) la atorvastatina redujo los eventos
isquémicos antes de finalizar el primer año de tratamiento, periodo de tiempo
insuficiente para obtener cambios significativos en las lesiones vasculares. Estos hechos
junto a los datos experimentales ya mencionados anteriormente, hacen suponer que el
efecto beneficioso de las estatinas provenga de actividades colaterales a nivel de la
célula periférica, este tipo de efectos se denominan efectos pleiotrópicos. Por lo tanto,
existe una serie de factores que participan directamente en el proceso aterotrombótico
que pueden verse afectados por el tratamiento con los inhibidores de la HMG-CoA
reductasa. Es por ello que hay un gran interés en su investigación con el fin de
determinar aquellos efectos diferenciales que provienen de cada uno de ellos.
MODELOS EXPERIMENTALES ANIMALES
ATEROSCLEROSIS
La utilización de modelos de aterosclerosis in vivo e in vitro ha ayudado
enormemente a la comprensión de los mecanismos implicados en la patología
aterosclerótica, así como a la elaboración de estrategias antiateroscleróticas.
En función de cómo desarrollan esta patología se distinguen dos tipos de
animales: ateroresistentes y aterosensibles. Los primeros no padecen la enfermedad de
manera espontánea (perro, conejo, rata, ratón, cobaya), mientras que los segundos sí
(cerdo, pollo, pato, mono). Estas diferencias se deben al tipo de perfil lipídico y al
metabolismo de la pared arterial (enzimas implicadas en el catabolismo aeróbico de la
glucosa, hidrólisis del ATP y lipólisis). Además, las especies aterosensibles se
Introducción 52
caracterizan por un mayor contenido de proteoglicanos en la pared arterial (Hadjiisky P
et al.,1991).
El conejo se ha utilizado en muchas ocasiones como modelo de aterosclerosis
(Amstrong ML & Heistad DD, 1990), ya que aunque no desarrollan aterosclerosis
espontánea, la administración de una dieta hipercolesterolémia (0,5% a 4% de colesterol
en la dieta) induce un rápido desarrollo de lesiones vasculares, y además el coste de
mantenimiento es bajo. En los protocolos típicos de inducción de aterosclerosis, los
conejos se someten a esta dieta durante 8 a 16 semanas y en poco tiempo alcanzan la
hipercolesterolemia. El inconveniente de este modelo es que las lesiones desarrolladas
son muy diferentes a las lesiones humanas, ya que tienen un contenido lipídico y de
macrófagos mucho mayor, y el índice de hipercolesterolemia es extremadamente
elevado.
El cerdo y el mono son mejores modelos de la aterosclerosis desarrollada en
humanos. La utilización de diferentes razas de monos en numerosos estudios ha
contribuido de manera enorme al conocimiento de la patología aterosclerótica (Malinov
MR & Maruffo CA, 1965), pero actualmente este animal no se utiliza de manera
intensiva debido al elevado coste y a factores relacionados con la especie (peligro de
extinción). El cerdo también es un buen modelo debido a que desarrolla lesiones
ateroscleróticas de manera espontánea. Tiene muchas similitudes con la especie
humana, incluyendo el tamaño y distribución de las arterias, localización del
engrosamiento de la íntima en estado normal, distribución de las lipoproteínas
plasmáticas y respuesta a las dietas hiperlipémicas (Kim DN et al., 1984). Debido a
esto, en los últimos años se ha multiplicado el número de trabajos que utilizan el cerdo
como modelo de aterosclerosis. Los inconvenientes de este modelo son el coste y las
dificultades que implica su mantenimiento y manipulación.
Los modelos más recientes de aterosclerosis son los animales genéticamente
modificados (transgénicos). El ratón transgénico con disrupción en el gen de la
apolipoproteína E (ApoE KO) se ha utilizado en numerosos trabajos en los últimos años
(Zhang SH et al., 1992), ya que desarrolla hiperlipidemia y lesiones ateroscleróticas.
Éste modelo tiene como ventaja su fácil manejo debido a su reducido tamaño. Se ha
observado que en el ratón ApoE KO la distribución de las lesiones es muy diferente a la
Introducción 53
de los humanos, y además no se produce rotura espontánea de la placa, por ello la
utilidad de éste y de otros ratones transgénicos como modelos de la aterosclerosis
humana, todavía ha de ser probada.
TROMBOSIS
El uso de modelos experimentales de trombosis arterial in vivo y ex vivo supone
un paso obligado para la comprensión de los mecanismos que participan en la
trombogénesis, así como para evaluar posibles agentes antitrombóticos.
En cuanto a los modelos in vivo, la primera fase consiste en la inducción de una
lesión vascular que simule la aterosclerótica o la que se produce tras la rotura de una
placa, que desencadena el proceso trombótico. También se simula la lesión producida
tras intervención intracoronaria (angioplastia) para el estudio de la reestenosis. Un modo
de obtener un modelo de lesión aterosclerótica es inducir este tipo de lesiones en
animales de experimentación (Hasler-Rapacz et al., 1995), no obstante este método es
largo, complicado y muy costoso. La alternativa consiste en inducir una lesión profunda
de la pared al tiempo que se aplica una estenosis (Folts JD et al., 1982), mediante el
método de lesión intravascular inducida por un balón (angioplastia) se consigue lesionar
el vaso en mayor o menor grado, según la intensidad aplicada (Steele PM et al., 1985;
Adams PC et al., 1987). Otro método, también utilizado consiste en exponer un material
trombogénico a la circulación sanguínea, como el ADP (Bourgain RH et al., 1984).
Los modelos ex vivo consisten básicamente en cámaras de perfusión que
permiten evaluar la deposición plaquetaria. Estos modelos son especialmente útiles en
estudios mecanísticos, ya que permiten modular la mayoría de los parámetros, sobre
todo las condiciones de flujo (velocidad y fuerza de cizalladura) y el substrato reactivo.
Al determinar estas condiciones a priori se evita la variabilidad inherente al sistema in
vivo, por lo que ésta es la principal ventaja respecto a estos modelos. También permiten
evaluar posibles materiales protésicos para ser utilizados en cirugía cardiovascular. Con
esta intención se desarrollan técnicas que permiten estudiar el efecto de la exposición de
diversos productos a la circulación sanguínea en condiciones de flujo controladas. En
Introducción 54
1973, Baumgartner describió el diseño de una cámara de perfusión anular (Baumgartner
HR, 1973) que fue posteriormente modificada (Baumgartner HR et al., 1976). No
obstante, este sistema tenía el inconveniente de ser difícilmente adaptable a materiales
protésicos, y los vasos que se empleaban debían tener unas dimensiones determinadas.
Por otro lado, otras cámaras que se desarrollaron para el estudio de materiales protésicos
no se pueden adaptar a sustratos biológicos (Grabowski EF et al., 1976). Así mismo,
hay cámaras de perfusión planas en las que la superficie reactiva, que es un
portaobjetos, se cubre con componentes purificados de tejido conectivo, o de matriz
extracelular producidos por células endoteliales en cultivo (Muggli R et al., 1980). La
cámara desarrollada por Badimon L es cilíndrica, por lo que imita la forma del sistema
circulatorio, y además permite emplear tanto sustratos biológicos como protésicos
(Badimon L et al., 1986). La mayor ventaja respecto a las anteriores es que las
condiciones de flujo es un parámetro que está totalmente controlado con esta cámara, y
no supone un factor de variación como sucede en muchos modelos de trombosis.
La cámara de perfusión Badimon es la que se ha empleado en la realización de
este trabajo, se ha caracterizado con detalle, sobre todo en lo que respecta a las
condiciones de flujo (Badimon L et al., 1987). El flujo de esta cámara de perfusión es
paralelo y parabólico en todo el recorrido. Aunque la forma del canal que se expone al
sustrato vascular no es del todo circular, sino en forma de U, se ha demostrado que este
aspecto sólo modifica ligeramente las condiciones de velocidad de cizalladura en el
sustrato.
En la sección de Métodos se indica las velocidades de cizalladura de las cámaras
que se emplearon en este estudio. La velocidad de cizalladura (γ) depende directamente
de la velocidad de avance de la sangre (V) e inversamente del diámetro de la cámara
(d), según la siguiente fórmula:
Esta cámara de perfusión se ha aplicado al estudio de los mecanismos que
desencadenan la trombosis y se ha demostrado que, por ejemplo, el núcleo ateromatoso
γ = 8 x V/d
Introducción 55
es la parte más trombogénica de la lesión aterosclerótica (Fernández-Ortiz A et al.,
1994). Además ha servido para demostrar el efecto antitrombótico de la r-Hirudina
(Badimon L et al., 1989), el efecto del sustrato trombogénico y de la velocidad de
cizalladura sobre la formación del trombo (Badimon L et al., 1987), la efectividad de
fármacos antiagregantes (Badimon JJ et al., 1997) y antitrombóticos (Badimon JJ et al.,
1999).
De lo anteriormente expuesto, podría concluirse que la búsqueda de los
mecanismos de formación del trombo y su regulación, son objetivos prioritarios para el
control de la transformación de la aterosclerosis como enfermedad crónica-silenciosa,
en el síndrome isquémico agudo. Por ello, en esta tesis nos hemos propuesto evidenciar
los efectos antitrombóticos de tres grupos de fármacos que abordan estrategias muy
diversas de control de determinadas vías metabólicas, pero que pueden tentativamente
converger en la reducción de la manifestación clínica de la aterosclerosis, por la vía de
la trombosis.
Introducción 56
Objetivos 57
OBJETIVOS
Objetivos 58
Objetivos 59
La aterotrombosis es un proceso patológico complejo que se desarrolla en varias
etapas y en el que intervienen numerosos factores. Existen dos fases claramente
diferenciadas en esta patología. En la primera fase, se desarrolla la lesión aterosclerótica
de una manera crónica y asintomática; en la segunda, generalmente cuando la lesión
está ya avanzada, se produce la rotura de la misma seguida de la formación de un
trombo que ocasiona la oclusión aguda del vaso dando lugar a sintomatologías de tipo
isquémico. Debido a estas etapas diferenciadas del proceso aterotrombótico, existen dos
grandes líneas destinadas a su prevención y tratamiento:
1. el tratamiento de la aterotrombosis, que consiste en la reducción de la trombosis
mediante terapia antitrombótica. La inhibición de la formación del trombo se
consigue mediante fármacos que actúan sobre las plaquetas, impidiendo su
activación y agregación, sobre la cascada de coagulación, bloqueándola a diferentes
niveles, o incluso sobre la fibrinolisis, potenciando la disolución del trombo.
2. la estrategia basada en la prevención, que consiste en la reducción y/o control de los
factores de riesgo. En el contexto de esta tesis, una de las vías de prevención es la
reducción de los niveles plasmáticos de lípidos. Esto se consigue modificando los
hábitos alimenticios y/o administrando fármacos hipolipemiantes. Mediante el uso
de estos fármacos se consigue frenar la evolución de las placas ateroscleróticas
previniendo así su rotura y complicaciones trombóticas. Se ha observado que
algunos de estos compuestos van más allá y son capaces de actuar a otros niveles.
El objetivo de esta tesis, por tanto, se ha dirigido a determinar la eficacia de
diferentes moléculas, utilizadas ya de forma rutinaria en el tratamiento de la patología
cardiovascular o todavía en fase experimental, y dirigidas a la inhibición de la
aterotrombosis, así como evaluar a qué niveles de este proceso pueden estar ejerciendo
acciones. En función de las vías metabólicas evaluadas y su inhibición, se han
determinado los siguientes objetivos:
Objetivos 60
Objetivo 1: evaluar la contribución de la vía del factor tisular (TF) a la aterotrombosis.
Para ello se ha estudiado específicamente:
1. 1. Efecto del bloqueo del TF sobre los parámetros de coagulación y la
agregación plaquetar ex vivo.
1. 2. Efecto del bloqueo del TF sobre la formación del trombo desencadenado por
pared vascular sana lesionada y aterosclerótica.
1. 3. Localización del TF en el trombo y en las estructuras de la pared vascular
expuestas a la sangre.
Objetivo 2: evaluar la contribución de la vía de la ciclooxigenasa (Cox) y sus
metabolitos a la aterotrombosis. Para ello se ha estudiado específicamente:
2. 1. Efecto del bloqueo de la Cox sobre la formación del trombo desencadenado
por un trombo residual formado sobre pared vascular lesionada (trombosis
secundaria).
2. 2. Efecto del bloqueo de la Cox sobre la expresión de la Cox en la pared
vascular sana.
Objetivo 3: evaluar el efecto de la inhibición de la HMG-CoA reductasa sobre la
aterotrombosis. Para ello se ha estudiado específicamente:
3. 1. Efecto sobre la agregación plaquetar ex vivo.
3. 2. Efecto sobre la formación del trombo sobre pared vascular lesionada.
3. 3. Efecto sobre el desarrollo de la lesión aterosclerótica: tamaño, composición
(lípidos, fibrinógeno, CML, macrófagos y TF), y expresión génica (MCP-1,
eNOS, Cox-1 y Cox-2).
Métodos 61
MÉTODOS
Métodos 62
Métodos 63
DISEÑO EXPERIMENTAL
En el siguiente esquema se describe el diseño experimental realizado en este
trabajo. Se realizaron tres estudios en los cuales se evaluaron tres grupos de fármacos
que intervienen a diferentes niveles del proceso aterotrombótico. En el primer estudio se
evaluó el efecto in vivo e in vitro del FFR-rFVIIa, un inhibidor del TF, sobre la
trombosis, para ello se utilizó el cerdo como modelo experimental. En el segundo
estudio se determinó el efecto de la administración aguda y crónica de aspirina, triflusal
y HTB, inhibidores de la Cox (salicilatos), sobre la trombosis desencadenada por un
trombo residual (trombosis secundaria), así como sobre la expresión de Cox vascular,
en conejos. Finalmente, en el tercer estudio se analizó el efecto de la pravastatina y la
simvastatina, dos inhibidores de HMG-CoA reductasa (estatinas), sobre la trombosis y
sobre el desarrollo de la lesión aterosclerótica en cerdos hiperlipémicos.
Dieta Hiperlipémica(100/150 días) + Placebo/Pravastatina/Simvastatina (50/100 días)
Dieta Normolipémica(100/150 días) + Placebo (50/100 días)
Lípidos Plasmáticos
Estudio con Inhibidores de la HMG-CoA reductasa (CERDO)
Expresión Vascular de Cox-1, Cox-2, MCP-1 y e-Nos Vascular (RT-PCR)
Aterogénesis
Extensión de la Lesión Engrosamiento Íntima (Histología)
Composición de la Lesión (Inmunohistoquímica)
Tamaño de la Lesión
Trombosis
Plaquetas Expresión de Rho A(Western blot)
Estudio con Inhibidores de la Cox (CONEJO)
ESTUDIO AGUDO: Placebo/Aspirina/Triflusal/HTB (1 administración i.v.)
TrombosisDeposición Plaquetar ex vivo (Radioactividad)
ESTUDIO CRÓNICO: Placebo/Aspirina/Triflusal (1 administración/día/8 días p.o.)
Trombosis
Trombo formado sobre trombo residual (2º)
Expresión Vascular de Cox-1 y Cox-2 (RT-PCR/Western blot)
Deposición Plaquetar ex vivo (Radioactividad)
Deposición Plaquetas/Fibrina ex vivo (Inmunohistoquímica)
Trombo formado sobre trombo residual (2º)
Coagulación
Trombo formado sobre pared vascular
Deposición Plaquetar ex vivo (Radioactividad)
Deposición Plaquetas/Fibrina ex vivo (Inmunohistoquímica)
Agregación Plaquetar ex vivo
Coagulación
Estudio in vivo: 1 administración FFR-rFVIIa i.v.
Estudio in vitro: ttosubstratos vascularescon FFR-rFVIIa
Trombosis
Trombo formado sobre pared vascular
Deposición Plaquetar ex vivo (Radioactividad)Deposición Plaquetas/Fibrina ex vivo (Inmunohistoquímica)
Agregación Plaquetar ex vivo
Niveles plasmáticos FFR-rFVIIa (EIA)
Trombosis Trombo formado sobre pared vascular
Estudio con Inhibidor del TF (CERDO)
Localización TF en Trombo y Pared Vascular (Inmunohistoquímica)
Deposición Plaquetar ex vivo (Radioactividad)
Actividad Procoagulante TF circulante
Coagulación
Dieta Hiperlipémica(100/150 días) + Placebo/Pravastatina/Simvastatina (50/100 días)
Dieta Normolipémica(100/150 días) + Placebo (50/100 días)
Lípidos Plasmáticos
Estudio con Inhibidores de la HMG-CoA reductasa (CERDO)
Expresión Vascular de Cox-1, Cox-2, MCP-1 y e-Nos Vascular (RT-PCR)
Aterogénesis
Extensión de la Lesión Engrosamiento Íntima (Histología)
Composición de la Lesión (Inmunohistoquímica)
Tamaño de la Lesión
Trombosis
Plaquetas Expresión de Rho A(Western blot)
Estudio con Inhibidores de la Cox (CONEJO)
ESTUDIO AGUDO: Placebo/Aspirina/Triflusal/HTB (1 administración i.v.)
TrombosisDeposición Plaquetar ex vivo (Radioactividad)
ESTUDIO CRÓNICO: Placebo/Aspirina/Triflusal (1 administración/día/8 días p.o.)
Trombosis
Trombo formado sobre trombo residual (2º)
Expresión Vascular de Cox-1 y Cox-2 (RT-PCR/Western blot)
Deposición Plaquetar ex vivo (Radioactividad)
Deposición Plaquetas/Fibrina ex vivo (Inmunohistoquímica)
Trombo formado sobre trombo residual (2º)
Coagulación
Estudio con Inhibidores de la Cox (CONEJO)
ESTUDIO AGUDO: Placebo/Aspirina/Triflusal/HTB (1 administración i.v.)
TrombosisDeposición Plaquetar ex vivo (Radioactividad)
ESTUDIO CRÓNICO: Placebo/Aspirina/Triflusal (1 administración/día/8 días p.o.)
Trombosis
Trombo formado sobre trombo residual (2º)
Expresión Vascular de Cox-1 y Cox-2 (RT-PCR/Western blot)
Deposición Plaquetar ex vivo (Radioactividad)
Deposición Plaquetas/Fibrina ex vivo (Inmunohistoquímica)
Trombo formado sobre trombo residual (2º)
Coagulación
Trombo formado sobre pared vascular
Deposición Plaquetar ex vivo (Radioactividad)
Deposición Plaquetas/Fibrina ex vivo (Inmunohistoquímica)
Agregación Plaquetar ex vivo
Coagulación
Estudio in vivo: 1 administración FFR-rFVIIa i.v.
Estudio in vitro: ttosubstratos vascularescon FFR-rFVIIa
Trombosis
Trombo formado sobre pared vascular
Deposición Plaquetar ex vivo (Radioactividad)Deposición Plaquetas/Fibrina ex vivo (Inmunohistoquímica)
Agregación Plaquetar ex vivo
Niveles plasmáticos FFR-rFVIIa (EIA)
Trombosis Trombo formado sobre pared vascular
Estudio con Inhibidor del TF (CERDO)
Localización TF en Trombo y Pared Vascular (Inmunohistoquímica)
Deposición Plaquetar ex vivo (Radioactividad)
Actividad Procoagulante TF circulante
CoagulaciónEstudio in vivo: 1 administración FFR-rFVIIa i.v.
Estudio in vitro: ttosubstratos vascularescon FFR-rFVIIa
Trombosis
Trombo formado sobre pared vascular
Deposición Plaquetar ex vivo (Radioactividad)Deposición Plaquetas/Fibrina ex vivo (Inmunohistoquímica)
Agregación Plaquetar ex vivo
Niveles plasmáticos FFR-rFVIIa (EIA)
Trombosis Trombo formado sobre pared vascular
Estudio con Inhibidor del TF (CERDO)
Localización TF en Trombo y Pared Vascular (Inmunohistoquímica)
Deposición Plaquetar ex vivo (Radioactividad)
Actividad Procoagulante TF circulante
Coagulación
Métodos 64
MODELO EXPERIMENTAL
Se utilizaron dos modelos experimentales: conejo y cerdo. Los conejos
utilizados fueron machos White New Zealand con un peso aproximado de 2,5 kg,
adquiridos de un criador local (B&K Universal). Los cerdos, hembras de cruce
comercial (25% Duroc, 25% Pietrain, 25% Landrace y 25% Landrace Belga)
provenientes de una granja local, tenían un peso aproximado de 35-40 kg en el estudio
con FFR-rFVIIa, y de 20 kg al inicio del estudio con estatinas. Los animales se
mantuvieron estabulados al menos una semana antes del inicio del experimento, es decir
antes de la toma de la muestra basal de sangre y de la administración de fármacos. Cada
especie dispuso de una zona de estabulación dotada de ventilación y temperatura
regulada (20ºC), y con un ciclo luz-oscuridad de 12 horas (7,00-19,00 horas); todos los
animales se estabularon individualmente.
La alimentación se llevó a cabo con pienso comercial de conejos (1.879 Kcal/kg,
B&K Universal) y de cerdos de engorde (2.309 Kcal/kg, C-1, C.I.A.). Los cerdos que
recibieron dieta hiperlipémica (estudio con estatinas) se alimentaron con pienso normal
de engorde al que se adicionó 1% de ácido cólico, 2% de colesterol y 20% de sebo de
ternera (3.501 Kcal/kg). A todos los animales se les administró una cantidad diaria de
pienso equivalente al 3-3,5% del peso corporal y el agua se administró ad libitum.
GRUPOS DE ANIMALES Y ADMINISTRACIÓN DE FÁRMACOS
Los animales se pesaron antes de la realización del procedimiento experimental
con el fin de calcular la dosis de fármaco y/o la ración de pienso, así como para evaluar
su estado de salud. En los procedimientos crónicos el pesado se realizó semanalmente.
Estudio con Inhibidor del Factor Tisular, FFR-rFVIIa
En este estudio el tratamiento se realizó de forma aguda, mediante una única
administración de FFR-rFVIIa (cedido por Mirella Ezban, Novo Nordisk, Dinamarca).
Métodos 65
Tras las determinaciones en situación basal, los animales fueron tratados mediante bolo
intravenoso (i.v.) de FFR-rFVIIa, el mismo día en que se realizó el experimento (Figura
1). Los estudios duraron un máximo de 2 horas, ya que la vida media de este fármaco es
de 4-6 horas. De manera preliminar se utilizaron diferentes dosis a fin de determinar la
dosis mínima con efecto antitrombótico: 0,1 mg/kg (n=3), 0,5 mg/kg (n=5), 1 mg/kg
(n=3) y 2 mg/kg (n=1). El estudio de trombosis se realizó con las dosis de 0,5, 1 y 4
mg/kg (n=11). Un grupo adicional de animales (n=3), que no recibió ningún tipo de
tratamiento, se destinó al estudio del tratamiento local de la pared vascular con FFR-
rFVIIa (in vitro).
Figura 1. Esquema representativo del protocolo experimental seguido en la primera parte del estudio con inhibidor del TF, en el que se administró FFR-rFVIIa in vivo (i.v.). El modelo experimental utilizado fue el cerdo.
Estudio con Inhibidores de la Ciclooxigenasa
Los experimentos realizados en conejo se dividieron en dos partes, según la
duración del tratamiento: tratamiento agudo, una sola administración del fármaco i.v.
el mismo día del procedimiento experimental; y tratamiento crónico, una
administración diaria del fármaco por vía oral (p.o.) durante una semana (Figura 2). En
ambos protocolos, además de los grupos de conejos que recibieron tratamiento, se uso
un grupo de animales control como inductor de trombosis primaria.
• Sacrificio: Obtención Muestras
Situación Basal Situación Post-tratamiento
FFR-rFVIIa en bolo i.v.
1-2 horas 1-2 horas
• Determinaciones sanguíneas • Trombosis
• Determinaciones sanguíneas • Trombosis
• Preparación del animal • Heparinización
Métodos 66
En la primera parte del estudio, los animales se dividieron en cuatro grupos
según el fármaco administrado: aspirina (ácido acetil salicílico de lisina), triflusal (ácido
2-acetoxi-4-(trifluorometil)-benzoico), HTB (ácido 2-hidroxi-4-trifluorometilben-zoico)
y placebo. Se les administró un único bolo i.v. de aspirina (5 mg/kg), triflusal (10
mg/kg), HTB (10 mg/kg) o suero fisiológico (placebo/control).
En la segunda parte, los conejos se dividieron en tres grupos: control (placebo),
aspirina y triflusal. Los animales fueron tratados oralmente una vez al día, durante 8
días. Al igual que en el estudio con FFR-rFVIIa, se utilizaron varias dosis de aspirina
(10, 20, 30 mg/kg/día) y triflusal (15, 30, 40 mg/kg/día) con el fin de hallar la dosis
mínima con efecto antitrombótico. Para asegurar que los conejos ingirieran el total de la
dosis diaria de los fármacos se procedió de la siguiente manera: 500 mg de cada uno de
los fármacos se disolvieron en 25-50 ml de cloroformo y se pulverizaron sobre 100 g de
pienso normal, que se dejó secar bajo una corriente de aire en una campana de
extracción durante toda la noche. Este pienso se almacenó a 4ºC y se empleó a lo largo
de la siguiente semana. Asimismo, se preparó pienso sin fármaco pulverizando una
cantidad equivalente del solvente sobre el pienso, que se empleó en los animales del
grupo control. Ambos fármacos y el placebo se administraron en una sola toma diaria
por las mañanas. Para asegurar la ingestión completa del fármaco, se dispuso una rejilla
de acero en cada comedero cubriendo el pienso normal y sobre ésta, se colocó el pienso
con el fármaco. Una vez ingerido el mismo, se retiraba la rejilla de manera que el
animal tuviera acceso al resto del alimento.
La concentración de fármaco según este procedimiento es de 5 mg por g de
pienso, para calcular la dosis de pienso para cada animal se siguió la siguiente fórmula:
Pienso (g) = Peso del animal (kg) . Dosis (mg/kg) / 5 (mg/g pienso)
Métodos 67
Figura 2. Esquema representativo del protocolo experimental seguido en el estudio con inhibidores de la Cox, en el que se utilizó el conejo como modelo experimental. La figura A y B corresponden a los estudios con administración aguda (i.v.) y crónica (p.o.) de salicilatos, respectivamente.
Estudio con Inhibidores de la HMG-CoA Reductasa
Los cerdos alimentados con dieta hiperlipémica se dividieron en 3 grupos según
el tratamiento administrado: control (placebo), simvastatina y pravastatina. Para
administrar los fármacos, éstos se mezclaron con una pequeña cantidad de pienso, la
cual se administró poco antes de la ración diaria de pienso hiperlipémico. Se realizó un
estudio preliminar con varias dosis de cada estatina (pravastatina 5 y 10 mg/kg/día y
simvastatina 2,5 y 5 mg/kg/día) para elegir la más adecuada para el estudio definitivo.
Placebo/Aspirina/Triflusal (p.o.)
Inicio tratamiento con SALICILATOS (p.o.)
8 días
• Trombosis • Sacrificio: Obtención Muestras
Día 0 Día 8
Determinaciones sanguíneas B
• Preparación del animal • Heparinización Aspirina/Triflusal/HTB/Placebo en bolo i.v.
Sacrificio
Placebo/Aspirina/Triflusal
• Determinaciones sanguíneas • Trombosis
1-3 horas
A
30 minutos
Métodos 68
En el estudio se incluyó además un grupo de animales control (placebo) alimentados
con dieta normolipémica.
Los animales recibieron dieta hiperlipémica durante 50 días, y a partir de este
momento se inició el tratamiento con estatinas sin modificar la dieta. El estudio se
dividió en dos etapas según la duración del tratamiento (Figura 3): a) tratamiento con
placebo/estatinas (pravastatina 5 mg/kg/día, simvastatina 5 mg/kg/día) durante 50 días;
y b) tratamiento con placebo/estatinas (pravastatina 5 mg/kg/día, simvastatina 2,5
mg/kg/día) durante 100 días.
Figura 3. Esquema representativo del protocolo experimental seguido en los grupos hiperlipémicos dentro del estudio con estatinas. La figura A y B corresponden a los grupos de animales sometidos a dieta hiperlipémica y tratamiento durante 100 y 150 días, respectivamente. El grupo normolipémico control, siguió el mismo protocolo experimental, pero recibió dieta normal y placebo. El modelo experimental utilizado fue el cerdo.
Dieta Hiperlipémica
Dieta Hiperlipémica + Pravastatina/Simvastatina/Placebo
Inicio tratamiento
50 días 100 días
• Sacrificio: Obtención Muestras
Día 0 Día 50 Día 150 Día 28 Día 100
Determinaciones sanguíneas
Día 135 Día 85
B
Dieta Hiperlipémica Dieta Hiperlipémica +
Pravastatina/Simvastatina/Placebo
Inicio tratamiento
50 días
• Trombosis • Sacrificio: Obtención Muestras
Día 0 Día 50 Día 100 Día 28 Día 85
Determinaciones sanguíneas A
50 días
Métodos 69
DETERMINACIONES SANGUÍNEAS
A partir de muestras sanguíneas, se realizaron diferentes determinaciones para
detectar posibles alteraciones y/o efectos de los fármacos y dietas utilizados. En los tres
estudios y a los tiempos descritos en las Figuras 1, 2 y 3 se determinaron los parámetros
bioquímicos y de coagulación sanguínea, así como el recuento de células sanguíneas.
Además, en el estudio con FFR-rFVIIa se analizaron los niveles plasmáticos de este
fármaco y la actividad procoagulante del TF en plasma y sangre total, y en el estudio
con estatinas se determinaron los niveles de las lipoproteínas ya que se utilizó un
modelo hiperlipémico. La agregación plaquetaria ex vivo también fue evaluada en estos
dos estudios, con el fin de analizar como influían los fármacos y la dieta administrados,
en la funcionalidad plaquetaria in vitro.
RECOGIDA DE LAS MUESTRAS DE SANGRE
En los conejos tratados de manera crónica, se realizaron determinaciones
sanguíneas antes de comenzar la administración del fármaco (medición basal) y al
finalizar el tratamiento. Las muestras de sangre se obtuvieron por punción de la arteria
central de la oreja y se recogieron en citráto sódico 3,8% (1:10).
En los cerdos del estudio con estatinas, se practicó una determinación basal (día
0), una serie de determinaciones periódicas a lo largo del periodo de dieta y tratamiento
(día 28, 50, 85, 100, 135), y la última el día anterior al sacrificio (día 100 ó 150). Tras
un ayuno nocturno de 12 horas, los animales se sedaron con una administración
intramuscular (i.m.) de azoperona (8 mg/kg, Stressnil ®, Esteve), seguida de un bolo de
tiobarbital sódico (10 mg/kg, B. Braum) i.v., y la sangre se recogió en citrato sódico
3,8% (1:10) y/o en EDTA (1:13) por punción de la arteria femoral o vena marginal
auricular, según el volúmen a extraer.
En los tres estudios se realizaron varias determinaciones a partir de sucesivas
muestras sanguíneas obtenidas a lo largo del procedimiento experimental de trombosis
Métodos 70
(circuito extracorpóreo ex vivo). En el caso de tratamiento agudo, se diferenciaron dos
tipos de muestras: basales y post-tratamiento, dependiendo si éstas se obtenían antes o
después de la administración del fármaco. La sangre se recogió en citrato sódico a partir
de un cateter situado en la arteria carótida.
Los parámetros bioquímicos y de coagulación, los niveles de FFR-rFVIIa en
plasma y las lipoproteínas plasmáticas se determinaron en plasma obtenido por
centrifugación de la sangre total a 1.200 g durante 15 minutos. Todas las
determinaciones se realizaron con plasma fresco, excepto en el estudio de los niveles de
FFR-rFVIIa, donde éste se guardó congelado a –80ºC.
RECUENTO DE CÉLULAS SANGUÍNEAS
El recuento de las células sanguíneas se realizó con un contador automático
(System 9000, Serono) a partir de sangre total anticoagulada con citrato. Este
instrumento basa su medida en la diferencia de conductividad que existe entre las
células sanguíneas (hematíes, leucocitos y plaquetas) y el diluyente en que están
resuspendidas. De esta manera se determinó el recuento de glóbulos rojos (RBC),
glóbulos blancos (WBC) y plaquetas (PLT), así como el hematocrito (HTC), la
hemoglobina (HGB), el volumen (MCV) y la hemoglobina corpuscular medios (MCH).
PARÁMETROS BIOQUÍMICOS
Las determinaciones bioquímicas se realizaron con un autoanalizador de química
seca (Ekctachem, Kodak) a partir de muestras de plasma (anticoagulado con citrato o
EDTA). Este aparato trabaja con unas placas que contienen los reactivos necesarios para
que se produzca una reacción colorimétrica al añadir suero o plasma. A continuación,
determina la absorbancia producida que se traduce en concentración del parámetro
mediante una curva patrón que se encuentra previamente establecida.
Métodos 71
Se determinaron los siguientes parámetros bioquímicos en todos los estudios:
alanina aminotransferasa (ALT), aspartato aminotransferasa (AST), creatinina,
nitrógeno ureico plasmático (BUN) y proteínas plasmáticas totales. Además, en los
estudios con estatinas donde se utilizó modelo hiperlipémico se determinaron: colesterol
total, colesterol HDL y triglicéridos.
COAGULACIÓN SANGUÍNEA
El fibrinógeno, el tiempo de protrombina (PT) y el tiempo parcial de
tromboplastina activada (aPTT) se determinaron con un coagulómetro automático (ST4,
Diagnostica Stago) en plasma (anticoagulado con citrato). La técnica consiste en
incubar muestras de plasma con determinados componentes que inducen su
coagulación. El aparato detecta, gracias a unos sensores electromagnéticos, el tiempo
que tarda en formarse el coágulo, obteniéndose el resultado bien en segundos, bien en
una unidad de concentración si disponemos de una curva patrón.
Para determinar la concentración plasmática de fibrinógeno, se calcula el tiempo
que tarda en coagular el plasma (diluido 1:10) al añadir un exceso de trombina
(Diagnostica Stago), ya que existe una proporcionalidad entre el tiempo de coagulación
y la concentración de fibrinógeno. Mediante una curva patrón realizada con diferentes
concentraciones de fibrinógeno (Diagnóstica Stago), es posible expresar el tiempo de
coagulación en función de la concentración de fibrinógeno hallada.
El PT permite determinar el nivel de coagulación a través de la vía extrínseca o
vía del TF. La determinación del PT se efectúa añadiendo TF (tromboplastina hística;
Diagnóstica Stago), inductor de esta vía, y cloruro cálcico, que aporta el calcio
necesario para la coagulación, al plasma. La coagulación se desencadena por la reacción
del factor VII del plasma con el TF exógeno. El tiempo que tarda en coagular el plasma,
dependerá de las concentraciones de los factores V, VII, y X, protrombina y
fibrinógeno.
Métodos 72
Mediante el aPTT se determina el estado de coagulación a través de la vía
intrínseca o por contacto. Para determninar el aPTT, se agregan al plasma: caolín, que
es una sustancia inerte que provoca la activación rápida del sistema de contacto;
cefalina, que aporta los fosfolípidos necesarios para la interacción normal de algunos
factores de coagulación, y cloruro cálcico (Diagnostica Stago). El aPTT puede
prolongarse por déficit de cualquier factor de coagulación, excepto de los factores VII y
XIII. Además, es útil para valorar el grado de inhibición de la coagulación mediante
heparina. La heparina es cofactor de la antitrombina III (Verstraete M et al., 1990), por
lo que su administración prolonga el aPTT.
Durante el experimento de trombosis se monitorizaron los niveles de
fibrinógeno, PT y aPTT. La determinación del aPTT sirvió para llevar un control de la
heparinización. Para ello, los valores obtenidos de aPTT tras la administración de
heparina, se normalizaron respecto al valor basal. Normalmente se alcanza un nivel
óptimo de coagulación en el sistema de perfusión extracorpóreo cuando esta relación es
menor de 3 (300%). La determinación de fibrinógeno y PT no están influidas por la
heparina, ya que los reactivos utilizados llevan un inhibidor específico de éste, de
manera que no interfiere en las mediciones.
ACTIVIDAD PROCOAGULANTE DEL FACTOR TISULAR
CIRCULANTE
En el estudio con FFR-rFVIIa se determinó la actividad procoagulante del TF en
sangre total. Se analizaron muestras basales y tras la administración sistémica de FFR-
rFVIIa. Además, se testaron muestras donde se aplicó FFR-rFVIIa in vitro. Este
procedimiento consiste en obtener un extracto de restos de membranas celulares y
vesículas contenidas en la sangre, mediante lisado y ultracentrifugación. A partir de este
extracto, donde está contenido el TF, se realiza un test de actividad de TF añadiendo los
factores de coagulación y otros componentes necesarios para que lleve a cabo la
reacción (etapa de iniciación de la vía del TF). El nivel de actividad se determina
mediante una reacción colorimétrica, que se mide por espectofotometría.
Métodos 73
Obtención de Extractos a partir de Sangre Total Se obtuvo sangre anticoagulada con citrato, y una parte fue procesada para
obtener plasma. La sangre total se congeló en nitrógeno líquido y se guardó a –80ºC
hasta su procesamiento. Los extractos se obtuvieron como se explica a continuación:
100 µl de sangre total se sometieron a dos ciclos de congelación (nitrógeno
líquido) y descongelación (T.A.), seguidamente se incubaron a 37ºC durante 15
minutos. Se mezclaron 100 µl de muestra con 900 µl de TBS-EDTA 0,1 M y se
ultracentrifugaron durante 15 minutos a 436.000 g (4ºC) (Rotor TLA 130, Optima Max
Beckman). Se eliminó el sobrenadante y el precipitado, formado por restos de vesículas
y/o membranas celulares, se resuspendió en 1000 µl de TBS-EDTA 0,1 M y se
ultracentrifugó, este procedimiento se realizó dos veces. El precipitado obtenido se
resuspendió en 1000 µl de HBSA y nuevamente se ultracentrifugó. Finalmente, se
resuspendió en 100 µl (extracto de sangre) de HBSA.
Tratamiento in vitro de los Extractos
Un grupo de extractos obtenidos a partir de sangre basal fue tratado con FFR-
rFVIIa. A una porción de cada muestra se le adicciónó HBSA (control), y a otra una
dosis de fármaco equivalente a 0,0125 mg/ml de sangre total, se incubó a T.A. durante 5
minutos y a continuación se determinó su actividad procoagulante.
Determinación de la Actividad Procoagulante del Factor Tisular
Esta técnica reproduce la etapa de iniciación de la vía del TF mediante la
adicción de vesículas de fosfolípidos, que sirven de soporte de la reacción; calcio,
indispensable para la activación de los factores de coagulación; extractos de sangre, que
contienen TF; factor VIIa, que forma un complejo con el TF; y factor X, que es el
substrato del complejo factor VIIa-TF. La reacción da lugar a factor Xa como producto
final. Para medir la producción de factor Xa se añade un substrato cromogénico
Métodos 74
específico de este factor, que tras reaccionar con éste produce color cuya intensidad es
proporcional grado de actividad procoagulante. El proceso seguido fue el siguiente:
Se adicionaron 20 µl de vesículas de fosfatidilserina:fosfatidilcolina 500 µM
(30:70) (Sigma), 20 µl de cloruro cálcico 25 mM a 20 µl de extracto. Tras agitar, se
añadieron 20 µl de factor VIIa 20 nM (Calbiochem), se incubó en agitación durante 15
minutos (T.A.). Seguidamente se adicionaron 20 µl de factor X 1,5 µM (Calbiochem) y
nuevamente se incubó durante 15 minutos. La reacción se paró añadiendo 50 µl de
TBS-BSA 0,1%-EDTA 300 µM. A continuación se añadieron 25 µl de substrato
cromogénico del factor Xa 0,01 mUI/ml (Sigma). Se incubó durante 15 minutos a 37ºC
y se determinó la absorvacia a 405 nm.
NIVELES PLASMÁTICOS DE FFR-rFVIIa
A partir del plasma obtenido a lo largo del procedimiento experimental del
estudio con FFR-rFVIIa, se analizaron los niveles plasmáticos de FFR-rFVIIa. Las
determinaciones se realizaron en el laboratorio de donde procedía este fármaco
(NovoNordisk, Dinamarca), con la que se colaboró en la realización de este estudio
(Mirella Ezban).
El FFR-rFVIIa se determinó mediante la técnica de ELISA tipo sandwich (kit
EIA para detectar FVII, Dako), según las instrucciones de la casa comercial. Ésta
técnica utiliza un anticuerpo monoclonal contra FVIIa humano, que también reconoce
FFR-rFVIIa, que se encuentra fijo en una fase sólida y a él se unen las móleculas de
FFR-rFVIIa contenidas en el plasma. Al añadir seguidamente, un segundo anticuerpo
contra FFR-rFVIIa (policlonal de conejo), que se enlaza la zona de FFR-rFVIIa
expuesta, se forma un complejo anticuerpo-FFR-rFVIIa-anticuerpo. Posteriormente, se
hace reaccionar con un anticuerpo anti-conejo unido a peroxidasa, que reconoce al
segundo anticuerpo contra FFR-rFVIIa. Finalmente, la peroxidasa reacciona con su
substrato y se produce una reacción colorimétrica, cuya intensidad se mide mediante un
espectrofotómetro.
Métodos 75
LIPOPROTEÍNAS PLASMÁTICAS
La determinación de las lipoproteínas plasmáticas se realizó en los cerdos del
estudio con estatinas. Se obtuvieron muestras de sangre en EDTA periódicamente a lo
largo de todo el periodo experimental. Se empleó el método validado por el Lipid
Research Clinic Program (Lipid Research Clinic Program, 1974). Éste es un método
que combina dos propiedades de las lipoproteínas: a) la diferencia de densidad para
aislar las VLDL mediante ultracentrifugación y b) la precipitación de las lipoproteínas
que contienen la apoproteína B-100 (sobre todo LDL) mediante reactivos determinados
(ácido fosfotúngstico o polietilenglicol). Se procedió de la siguiente manera:
En un tubo para ultracentrífuga (Beckman) se dispensaron 2,4 ml de plasma y
cuidadosamente se añadieron 1,6 ml de solución salina, obteniéndose así 2 fases
diferenciadas. Posteriormente, se centrifugó a 105.000 g en una ultracentrífuga (L-60,
rotor SW60, Beckman) durante 18 horas. Inmediatamente, se recogió con precaución la
banda superior de color blanquecino, correspondiente a las VLDL (fracción 1, f1); se
determinó su volumen (Vol1), así como la concentración de colesterol mediante un kit
comercial (Medical Diagnostics). Tras la homogeneización del infranadante restante
(f2), también se determinó su concentración de colesterol. Un volumen de 500 µl de esta
mezcla se homogeneizó con una solución 20% PEG 8.000 (1:1), se dejó reposar durante
30 minutos y se centrifugó durante 30 minutos a 5.000 g. Mediante este procedimiento
se obtuvo un precipitado blanquecino correspondiente a las LDL, y un sobrenadante
donde se encontraban las HDL, este sobrenadante (f3) se recogió y se determinó la
concentración de colesterol (Figura 4). Finalmente, se calcularon las concentraciones
plasmáticas de colesterol contenido en cada tipo de lipoproteína mediante las siguientes
fórmulas:
VLDL = (f1) x Vol1/ 2,4
HDL = (f3) x 2 x (4-Vol1)/2,4
LDL = [(f2) x (4-Vol1)/2,4] - HDL
Métodos 76
Para validar el método, se comprobó que la suma de las tres fracciones fuera
equivalente al colesterol total (±10%).
Figura 4. Esquema representativo del protocolo de obtención y determinación de las fracciones lipoproteícas (VLDL, LDL y HDL).
AGREGACIÓN PLAQUETAR EX VIVO Los estudios de agregación se realizaron en sangre total mediante un
agregómetro de impedancia, y en plasma rico en plaquetas (PRP) mediante un
agregómetro óptico, a partir de sangre anticoagulada con citrato. Esta técnica consiste
en la adición al PRP o sangre, de diferentes concentraciones de agonistas que activan la
agregación plaquetaria, así mientras algunos actúan a través del receptor GP IIb-IIIa,
tales como colágeno, ADP, trombina o ácido araquidónico (Galvez A et al., 1986), otros
como la botrocetina, lo hacen a través del GP Ib (Read MS et al., 1989). De esta manera
se pueden evaluar diversas vías de activación plaquetaria.
El agregómetro de impedancia se basa en la diferencia de conductividad que se
produce entre dos electrodos sumergidos en sangre total cuando se activa la agregación.
Esta conductividad se registra, de manera que se obtiene una curva que presenta un
máximo, que es la agregación máxima (en ohmios); una pendiente, que indica la
velocidad con la que agregan las plaquetas y un tiempo de latencia desde que se añade
plasma 2,4 ml
Solución Salina 0,%
1,6 ml
105.000 g, 18 h LDL +
HDL
f1
f2
LDL +
HDL 0,5 ml
PGE 8.000 0,5 ml
5.000 g, 30 min HDL
LDL
f3
VLDL
Métodos 77
el agonista. El principio del agregómetro óptico es prácticamente el mismo que el de
impedancia, pero en vez de conductividad, registra cambios en la transmisión de la luz
que se producen cuando las plaquetas contenidas en PRP se agregan (Figura 5).
La agregación plaquetar ex vivo se determinó en los estudios con FFR-rFVIIa y
con estatinas, y se procedió como se explica a continuación:
• Agregación en sangre total: una vez obtenida la sangre, el hematócrito se ajustó al
20% con solución salina y se repartió en alícuotas de 1 ml, que se mantuvieron a
37ºC. Se indujo agregación plaquetaria añadiendo colágeno a las siguientes
concentraciones: 3, 5, 10 µg/ml.
• Agregación en PRP: se obtuvo PRP centrifugando la sangre a 320 g durante 10
minutos. El número de plaquetas se ajustó a 3x105/µl diluyendo el PRP con plasma,
este se repartió en alícuotas de 500 µl que se mantuvieron a 37ºC. A continuación se
añadieron diversas concentraciones de ADP (5, 10, 20 µM) y de colágeno (3, 5, 10
µg/ml).
En ambos ensayos se registró la agregación máxima o la detectada a los cinco
minutos, la pendiente de la agregación y el tiempo de latencia.
Métodos 78
Figura 5. Gráfico representativo de la curva obtenida en el agregómetro tras la adición del agonista plaquetario. La agregación máxima (ohmios para sangre total, % para PRP) corresponde a la zona más elevada de la curva a los 5 minutos (recta discontinua), el tiempo de latencia es el intervalo de tiempo entre la adición del agonista y el inicio de la formación de la curva (flecha discontinua), y la pendiente mide la inclinación máxima de la esta.
ESTUDIO DEL TROMBO FORMADO SOBRE
PARED VASCULAR LESIONADA
Para evaluar el efecto de los diferentes fármacos estudiados sobre la trombosis,
se estudió la deposición plaquetar al perfundir sustratos vasculares en una cámara de
perfusión cilíndrica (Badimon L et al., 1987). Con el fin de cuantificar el número de
plaquetas que se depositan, previamente se aísla una muestra de plaquetas de sangre del
animal, se marcan con un isótopo radiactivo y se reinyectan. La medición de la
radiactividad en el substrato y su posterior análisis, permite valorar la deposición
inducida en condiciones determinadas, tales como al realizar un tratamiento
farmacológico, al modificar la trombogenicidad del substrato o la velocidad de
cizalladura.
Adición Agonista
0
1
2
3
4
25
50
0
75
0 5 6 7 81 2 3 4
Tiempo (minutos)Tiempo Latencia
Agregación Máxima (a los 5 minutos)
Agr
egac
ión
(ohm
ios)
Agr
egac
ión
(%)
100
Métodos 79
En los conejos se evaluó la deposición plaquetar sobre un trombo preformado
sobre un substrato vascular, como modelo de trombosis secundaria (residual), para ello
se perfundió sangre con plaquetas no marcadas radiactivamente procedente de un
animal sano (inductor), y posteriormente sangre con plaquetas marcadas de un animal
tratado o placebo (Meyer B et al., 1994).
SUBSTRATOS VASCULARES
La pared vascular se utiliza como desencadenante de la deposición plaquetar
(trombo). En el caso de la pared vascular normal se utilizaron dos modelos de lesión
arterial: lesión ligera (erosión vascular), que tiene una reducida trombogenicidad e
induce poca deposición plaquetaria; y lesión severa (rotura vascular), mucho más
trombogénica que la anterior e induce una gran deposición de plaquetas en su superficie.
Además, se utilizó pared vascular aterósclerótica como modelo de lesión (severa) más
próximo a las situaciones clínicas. En los tres estudios realizados se utilizaron varios
tipos de substratos vasculares:
1. Estudio con Inhibidor del Factor Tisular, FFR-rFVIIa: debido a que el contenido en
TF está aumentado en las lesiones ateroscleróticas, en este estudio se emplearon dos
tipos de substratos vasculares: aortas de cerdos normales, como modelo de pared
vascular no aterosclerótica, y aortas humanas, que contenían lesiones
ateroscleróticas avanzadas, como modelo de pared vascular aterosclerótica.
2. Estudio con Inhibidores de la Ciclooxigenasa: se utilizaron aortas de conejos como
modelo de lesión ligera. Debido a que la pared vascular de las aortas de conejo era
muy delgada y era prácticamente imposible eliminar la capa subendotelial,
procedimiento necesario para obtener lesión severa (ver más adelante en este
apartado), se utilizaron aortas de cerdo como modelo de este tipo de lesión.
3. Estudio con Inhibidores de la HMG-CoA reductasa: se emplearon aortas de cerdo,
como modelo pared vascular lesionada ligera y severamente.
Métodos 80
Las aortas de cerdo y de conejo se recogieron en mataderos locales en el
momento del sacrificio de los animales, y las humanas se obtuvieron a partir de
autopsias. Una vez obtenidas, se mantuvieron en PBS, se limpiaron y se eliminó la capa
adventicia. A continuación se cortaron en segmentos de aproximadamente 3 cm de largo
y se congelaron a –20ºC hasta el experimento, en el caso de aortas ateroscleróticas las
lesiones se caracterizaron macroscópicamente. El día del experimento se descongelaron
en PBS, se abrieron longitudinalmente y se cortaron en segmentos de 1 cm de ancho.
El modelo de lesión ligera se obtuvo al exponer la superficie de la arteria a la
circulación sanguínea, esta estructura se denomina subendotelio ya que las células
endoteliales han sido destruidas mediante el proceso de congelación (pared vascular
deendotelizada o erosionada). El modelo de lesión severa se consiguió exponiendo la
túnica media del vaso, para ello se separó la capa subendotelial con la ayuda de unas
pinzas (Badimon L et al., 1987, Badimon JJ et al., 1991).
Tratamiento Local de la Pared Vascular con FFR-rFVIIa
En el estudio del efecto local del FFR-rFVIIa, los substratos vasculares de cerdo
y humanos (subendotelio y túnica media) fueron incubados con una solución del
fármaco (2 mg/ml) durante 5 minutos a T.A..
MARCAJE DE PLAQUETAS
El 111Indio (111In) se emplea de forma habitual para el marcaje radiactivo de
plaquetas (Hawker RJ et al., 1978) y otras células sanguíneas, como leucocitos (Doherty
PW et al., 1978) y granulocitos (Weibler BJ et al., 1979). El marcaje de plaquetas se ha
aplicado a la detección in vivo de trombos vasculares (Goodwin DA et al., 1978) y para
el análisis de la cinética plaquetar (Heaton WA et al, 1979). En este trabajo se utilizó la
oxina como quelante transportador del 111In . El marcaje de células aisladas con 111In se
basa en que al mezclar una solución de 111In-oxina con las células, este complejo, que
es lipófilo, atraviesa la membrana celular. Posteriormente, se produce una reacción en la
Métodos 81
oxina se libera y el 111In firmemente enlazado a las estructuras intracelulares (Thakur
ML et al, 1977). El marcaje de las plaquetas se realizó el día anterior al experimento de
trombosis para permitir una completa biodistribución de las plaquetas marcadas
(Badimon L et al., 1986). Se procedió de la siguiente manera:
Se extrajo sangre (cerdos <50 kg, 43 ml; cerdos >50 kg, 86 ml; conejos, 13 ml)
en ACD-Anticoagulante (7:50). Se obtuvo PRP (ver apartado Agregación Plaquetar ex
vivo) y se centrifugó (15 minutos, 1.200 g) para separar el plasma sobrenadante del
precipitado las plaquetas. Las plaquetas se lavaron 2 veces con ACD-Salino (15
minutos, 1.200 g), y la suspensión en ACD-Salino se incubó con 111In-oxina
(Amersham) (10-12 µCi/kg de peso corporal del animal) durante 20 minutos (T.A.). Se
determinó la dosis (dosis 1, d1) en un dosímetro (Atomlab 100, Biodex) y
posteriormente se centrífugo (800 g, 10 minutos) para obtener las plaquetas marcadas.
El precipitado de plaquetas se resuspendió en plasma, se realizó el recuento de plaquetas
y se midió la dosis de radioactividad (d2). Finalmente, la suspensión se inyectó por la
vena marginal de la oreja del animal. Para verificar el grado de marcaje de las plaquetas,
se realizaron las siguientes determinaciones:
1) Eficiencia del marcaje (%) = d2/d1 x 100.
2) Viabilidad de las plaquetas (porcentaje de radiactividad unida a plaqueta): a 480
µl de solución salina se agregó 20 µl de la suspensión de plaquetas marcadas y
se separó el sobrenadante del precipitado mediante centrifugación (3 minutos,
13.000 g). Se determinó la radiactividad (como cpm) presente en el precipitado
(rpellet) y en el sobrenadante (rsn) con un contador gamma (Wizard, Wallac).
Viabilidad (%) = [rpellet/ (rpellet + rsn)] x 100
DETERMINACIÓN DE LA DEPOSICIÓN PLAQUETAR
Tras mantener los animales en ayuno nocturno, los cerdos se tranquilizaron con
azoperona (8 mg/kg i.m., Stressnil ®, Esteve), seguidamente se les anestesió mediante
Métodos 82
un bolo de tiobarbital sódico (10mg/kg, B. Braum) i.v., y a lo largo del procedimiento
experimental se mantuvo una infusión de este anestésico diluido en suero fisiológico (6-
8 mg/kg/h). Los conejos se anestesiaron con una mezcla de ketamina (35 mg/kg) y
xilazina (5 mg/kg) administrada i.m., a lo largo del procedimiento se les fue
administrando dosis adicionales según necesidad. La vena yugular y la arteria carótida
contralateral fueron canuladas con tubos de polietileno de calibre adecuado para impedir
la activación de la agregación plaquetar. A los animales se les inyectó un bolo i.v. de
50 U/kg de heparina (Liquemine ®, Roche), que en los cerdos se siguió de una infusión
de 50 U/kg/hora, ya que el procedimiento era más largo. Estas dosis impiden la
activación de la coagulación en el sistema extracorpóreo sin modificar
significativamente la deposición plaquetar (Badimon L et al. 1986). Se estableció un
circuito arteriovenoso con tubos de silicona y una bomba peristáltica (Masterflex,
modelo 7518-10) a una velocidad de 10 ml/min (ver Figura 6).
Se emplearon dos tipos de cámaras de perfusión en las cuales se colocaron los
substratos vasculares. Las características de estas cámaras se resumen en la Tabla 1. En
el estudio con estatinas, se modificó la cámara de perfusión original con la intención de
obtener un modelo de estenosis similar a las descritas en coronarias humanas. A la
cámara de 0,2 cm de anchura de canal se añadió un fragmento de goma para obtener una
protuberancia constante en el interior del canal de 4,5 mm de longitud y 60-70% de
reducción de la luz del canal, una vez colocado el substrato (Badimon L & Badimon JJ,
1989) (Figura 7). En este modelo, la velocidad de cizalladura no es constante a lo largo
del canal, ya que se produce una reducción de su luz. En la zona de estenosis la
velocidad de cizalladura es mucho mayor que en las zonas proximal y distal. Además, a
diferencia del modelo con diámetro de canal constante donde las líneas de flujo son
paralelas y el flujo laminar, en el modelo de estenosis se producen anomalías del flujo y
la líneas de flujo no son paralelas en todo el recorrido del canal.
Cámara Longitud del canal (cm)
Anchura del canal (cm)
Área del canal (cm2)
Velocidad de cizalladura (seg-1)*
1 2,5 0,1 0,25 1700
2 2,5 0,2 0,50 212
Tabla 1. Dimensiones y propiedades reológicas de la cámaras de perfusión empleadas. * Ref: Badimon L et al., 1987.
Métodos 83
El sustrato vascular se colocó en el interior de la cámara, y ésta en un baño a
37ºC, a continuación se perfundió la sangre durante 5 ó 10 minutos. Antes y después de
perfundir la sangre sobre el substrato, se perfundió PBS (60 segundos) con el fin de
eliminar aquellas células que no estuvieran firmemente adheridas a la superficie
vascular. En los experimentos en que se trataron los substratos localmente con FFR-
rFVIIa se utilizó Tyrode buffer en vez de PBS, para asegurar el aporte de calcio
necesario para la función de este compuesto.
Figura 6. Representación esquemática la cámara de perfusión y del circuito extracorpóreo en el cerdo. El substrato vascular (10 x 30 mm) se coloca en la cámara de perfusión, ésta se coloca en un baño atemperado a 37ºC y se conecta mediante tubos de silicona y polietileno a la arteria carótida y a la bomba peristáltica. La sangre sale succionada por la bomba a velocidad constante (10 ml/min) y pasa primero por la cámara; a continuación se recircula al animal por la vena yugular. Antes y después de perfundir la sangre se lava el circuito con PBS, el cual se desecha. Al finalizar la perfusión se extrae el substrato vascular con cuidado y se determina la radiactividad. Deposición plaquetaria, PD.
Métodos 84
Figura 7. Diagrama de una sección longitudinal de un substrato vascular montado en la cámara Badimon de 0,2 cm de diámetro de canal, con estenosis de 60-70%. Las líneas de flujo aparecen representadas y se observa la pérdida de paralelismo debido a la estenosis.
En el estudio realizado en conejos, donde se estudió la trombosis desencadenada
por un trombo preexistente (secundaria), en primer lugar los substratos fueron
perfundidos por sangre del animal inductor, cuyas plaquetas no estaban marcadas
radiactivamente, para formar el trombo primario. Una vez finalizada la primera
perfusión, y tras el lavado con PBS, se llevó a cabo una segunda perfusión con sangre
del animal tratado/control, con plaquetas marcadas, con el fin de formar el trombo
secundario inducido por el trombo preexistente. Además de la trombosis secundaria, en
el grupo control se realizaron perfusiones sobre pared vascular (trombosis primaria)
para estandarizar el método (Figura 8).
Una vez finalizada la perfusión, los substratos se fijaron en paraformaldehido
4% y se determinó la radiactividad presente en el substrato mediante un contador de
radioactividad gamma (Wizard 1470, Wallac). Periódicamente se tomaron muestras de
sangre en las que se determinó el recuento plaquetar (PLT/ml), la actividad (cpm/ml) y
la lisis de plaquetas. Para determinar cambios en los niveles de radiactividad unida a
plaqueta, se centrifugó un pequeño volumen de sangre (500 µl) durante 3 minutos a
13.000 g y se separó el sobrenadante del precipitado, y se calculó la proporción de
plaquetas no lisadas (viabilidad) según la fórmula descrita en el apartado de Marcaje de
Plaquetas. Al concluir todas las perfusiones los animales se sacrificaron con una
sobredosis i.v. de tiobarbital sódico o KCl (2 M).
4,5 mm
Estenosis 60-70%
Métodos 85
Figura 8. Representación esquemática del crecimiento del trombo inducido por la presencia de un trombo primario. Los esquemas A y B se refieren a los protocolos realizados en el grupo control (placebo), donde se estudió la trombosis desencadenada por substratos vasculares (primaria) a los 5 minutos (A), así como la trombosis desencadenada por un trombo preexistente (secundaria) (B). En el esquema C se muestra el protocolo de trombosis secundaria en los grupos de tratamiento.
El recuento radiactivo de los substratos vasculares se normalizó teniendo en
cuenta la radiactividad en sangre y el recuento de plaquetas del animal específico: si
conocemos el recuento de plaquetas (PLT/ml) y la actividad en sangre (cpm/ml)
podemos averiguar las plaquetas por unidad de actividad (PLT/cpm). De este valor se
resta la radiactividad que no proviene de las plaquetas (por lisis de éstas). Este dato se
traslada a la actividad obtenida en el substrato (cpm) por lo que obtenemos el número
total de plaquetas (PLT). Finalmente, se divide este valor entre el área del substrato
(cm2) que se expone a la circulación sanguínea, obteniéndose finalmente el resultado en
número de plaquetas por unidad de superficie (PLT/cm2).
Para obtener una mayor información sobre la deposición plaquetar se determinó
su dependencia axial, es decir la deposición obtenida a lo largo del substrato. Para ello,
cada substrato se dividió en cinco secciones: las secciones de entrada y salida, de 2 mm
Trombo Primario: sangre sin marcar
perfusión 5’ (conejo A)
Trombo Secundario: sangre marcada
perfusión 5’ (conejo B) 1) Control 2) Aspirina 5 mg/kg (i.v.) 3) Triflusal 10 mg/kg (i.v.) 4) HTB 10 mg/kg (i.v.) 5) Aspirina 30 mg/kg (p.o. 8 días) 6) Triflusal 40 mg/kg (p.o. 8 días)
Inductor
Trombo Primario: sangre sin marcar
perfusión 5’ (conejo B)
Control
Control
Trombo Primario: sangre sin marcar
perfusión 5’ (conejo B) perfusión 5’ (conejo A)
Trombo Secundario: sangre marcada
Inductor
A
B
C
Métodos 86
de longitud cada una, que fueron desechadas, y las secciones a (proximal), b (media) y c
(distal), que se contaron por separado. En los substratos perfundidos en cámara de
perfusión sin estenosis, se obtuvieron todas las secciones del mismo tamaño, 7 mm
aproximadamente (Figura 9A). En cambio, en los substratos perfundidos en cámara con
estenosis, los segmentos seriados eran de tamaños diferentes: secciones a y c de 5 mm y
sección b de 11 mm (Figura 9B). De esta manera se obtuvo la totalidad del segmento
central sometido a estenosis. Tras el recuento radioactivo, la sección b se mantuvo con
fijador para su tratamiento posterior.
Figura 9. Esquema representativo de los segmentos obtenidos para el estudio de la deposición axial, a partir de substratos vasculares perfundidos en la cámara de perfusión Badimon en condiciones normales (Figura A) y con estenosis (Figura B).
BIODISTRIBUCIÓN DE LAS PLAQUETAS EN EL ORGANISMO
Una vez sacrificados los animales, se extrajeron los siguientes órganos: corazón,
bazo, hígado, pulmones y riñones, se pesaron y se determinó la radiactividad (cpm/g) en
muestras de los mismos. Asimismo, se determinó la radiactividad en varias muestras de
sangre. Para determinar la radiactividad total en sangre se asumió que la volemia era
equivalente al 8% del peso del cerdo. Con estos datos se pudo determinar la
biodistribución plaquetar en los principales órganos receptores de plaquetas del
organismo. Normalmente, las plaquetas se concentran en sangre e hígado; aunque en el
bazo también suele haber cantidades significativas. Es importante que la cantidad
presente en el pulmón sea baja, pues indica que no se reinyectaron microcoágulos en el
sistema circulatorio. En la Tabla 2 se resume los valores medios de biodistribución
A
7 mm 7 mm 7 mm
a b c
B
5 mm 5 mm 11 mm
a b c
Métodos 87
obtenidos en todos los animales, donde se puede apreciar que la radioactividad se
concentró mayoritariamente en sangre, seguida del hígado y del bazo.
PARÁMETRO Radiactividad relativa (%) Corazón 0,14 ± 0,02 Riñón 0,26 ± 0,04 Pulmón 2,7 ± 0,4 Bazo 14 ± 3 Hígado 23 ± 5 Sangre 50 ± 4
Tabla 2. Valores medios de la biodistribución de plaquetas (% de la radiactividad total) en los principales órganos receptores de plaquetas del organismo en todos los animales utilizados en este trabajo.
ESTUDIO DE LA COMPOSICIÓN DEL TROMBO
Como complemento al estudio de deposición plaquetaria, se analizó la
composición del trombo mediante inmunohistoquímica. Para ello, se seleccionaron los
substratos vasculares en los que la deposición plaquetaria fue equivalente al valor medio
± 20%. Se procesó la sección central (sección b) y se realizó marcaje de plaquetas y
fibrina mediante inmunofluorescencia. Las muestras se procesaron según se describe en
el apartado de Inmunohistoquímica: Preparación de los Especímenes y Marcaje por
Inmunofluorescencia, y se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios:
Diana Descripción Proveedor
Plaquetas Policlonal (conejo) anti-vWF humano F3520, Sigma Immunochemicals
Fibrina Monoclonal (ratón), antifibrina porcina
Cedido por el Dr. Gaffney, NIBSC, Gran Bretaña
Fibrinógeno Policlonal (conejo) anti-fibrinógeno humano F9902, Sigma Immunochemicals.
En las muestras de cerdo se realizó una inmunofluorescencia doble utilizando
anticuerpos primarios anti-plaquetas (1:50) y anti-fibrina y (1:100). En las muestras de
conejo se realizaron inmunofluorescencias simples utilizando anticuerpos primarios
Métodos 88
anti-plaquetas (1:50) y anti-fibrinógeno (1:50), para la detección de fibrina, además los
trombos se tiñeron mediante la técnica de Tinción de Tricrómico de Masson (ver
apartado de Engrosamiento de la Íntima) para evaluar su aspecto. En el estudio con
FFR-rFVIIa, además se cuantificó la fibrina depositada en los substratos con lesión
severa, tal como se describe en el apartado de Análisis de Imagen y Cuantificación de
Marcadores: a partir de cada substrato, se seleccionaron 3 cortes histológicos, de cada
uno se tomaron al menos 5 imágenes a 20 aumentos, se midió el área ocupada por la
fibrina en cada caso y se calculó el valor medio.
LOCALIZACIÓN FACTOR TISULAR EN EL TROMBO Y EN LA
PARED VASCULAR
En el estudio con FFR-rFVIIa se inmunolocalizó el TF en las estructuras de la
pared vascular (no aterosclerótica) expuestas a la circulación sanguínea y en el trombo.
El TF se detectó mediante inmunohistoquímica como se describe en el apartado de
Inmunohistoquímica: Preparación de los Especímenes y Marcaje por Inmuno-
Peroxidasa por el Sistema Avidina-Biotina.
ANÁLISIS DE LA PLAQUETA: EXPRESIÓN DE
RHO A ACTIVADO
A partir de plaquetas procedentes de cerdos del estudio con estatinas, se realizó
el análisis del contenido en proteína Rho A activado (situado en la membrana
plaquetaria) mediante la técnica de Western blot, ya que se ha relacionado esta proteína
con la funcionalidad plaquetaria.
Métodos 89
OBTENCIÓN DE LAS PLAQUETAS
Las plaquetas se obtuvieron el mismo día que se realizó el procedimiento de
trombosis ex vivo. Se extrajeron 20 ml de sangre en ACD-anticoagulante (7:50). Se
obtuvo PRP y se centrifugó (1.200 g, 15 minutos). Tras elimanar el plasma
sobrenadante las plaquetas se resuspendieron en ACD-salino. Se procedió a su recuento
y posteriormente se repitió la centrifugación (1.200 rpm, 15 minutos). Finalmente, se
eliminó el sobrenadante y se obtuvo un precipitado de plaquetas.
EXTRACCIÓN DE PROTEÍNA: FRACCIÓN DE MEMBRANA
Los niveles de Rho A plaquetario se determinaron en la membrana (Rho A
activado). Para obtener esta fracción proteica se procedió de la siguiente manera:
Se añadió 750 µl de Tampón de Lisis por cada 4x106 plaquetas y se agitaron
durante 10 minutos a 4ºC. Para obtener la máxima disociación de los componentes
celulares, la mezcla se sonificó durante 10 segundos tres veces y el homogenizado
obtenido se congeló a -80ºC durante 20 minutos. Tras la descongelación, las muestras
de centrifugaron (4.000g , 5 minutos a 4 ºC) para eliminar los restos celulares. Para
separar las proteínas de la membrana de las del citoplasma, la mezcla se ultracentrífugó
(L-60, rotor SW60, Beckman) a 112.500 g a 4ºC durante 1 hora. En el sobrenadante
correspondía a las proteínas del citoplasma y el precipitado a las de membrana. Se
eliminó el sobrenadante y se obtuvo la fracción de membrana. Para ello, las muestras se
disolvieron en tampón de lisis-Tritón 1%, incubando a 4ºC en agitación, y centrifugando
(1.400 g, 15 minutos, 4ºC). Finalmente, se recogió el sobrenadante que contenía las
proteínas de membrana.
Métodos 90
DETERMINACIÓN DE LOS NIVELES DE RHO A ACTIVADO
Para determinar los niveles de Rho A (peso molecular de 24 kDa) en primer
lugar se determinó la cantidad de proteína de cada muestra mediante el método de BCA,
después se realizó electroforesis en gel de poliacrilamida (15 %) y finalmente Western
Blot, para el cual se utilizaron anticuerpos monoclonales de ratón anti-Rho A humano
(Santa Cruz Biotechnology) como anticuerpo primario (1:200) y antiglobulinas de
ratón (Dako) como anticuerpo secundario (1:10.000). Estas técnicas se describen en el
en el apartado de Análisis de Cox, MCP-1 y e-Nos a nivel de mRNA y Proteína en la
Pared Vascular: Análisis de la Proteína.
EVALUACIÓN DE LAS LESIONES VASCULARES
Para evaluar el efecto de las estatinas sobre el desarrollo de la lesión, en los
cerdos tratados con estos fármacos se evaluó el tamaño y composición de las lesiones
ateroscleróticas desarrolladas en diferentes zonas del sistema arterial (arteria aorta
torácica y abdominal, y arteria coronaria izquierda descendente (LAD)).
VALORACIÓN MACROSCÓPICA DE LAS LESIONES:
EXTENSIÓN DE LA LESIÓN
La valoración macroscópica de las lesiones se realizó mediante la determinación
de la extensión de la lesión en varios segmentos de la arteria aorta: segmento central de
la aorta torácica (zona de ramas intercostales) y segmento de la aorta abdominal (entre
la zona de la bifurcación de las arterias ilíacas y renales). Los segmentos vasculares se
fijaron en paraformaldehido 4% durante 6-8 horas. A continuación, se tiñeron con
solución de Herxmeheimer, utilizada para la tinción de lípidos (color rojo) (Smith A &
Bruton J, 1977). Se procedió como se describe a continuación:
Métodos 91
Se extrajeron los tejidos de la solución fijadora, se lavaron con agua del grifo (1
hora), se sumergieron en solución Herxheimer y se dejaron en agitación suave durante
30 minutos. Finalmente, se lavaron varias veces con alcohol 70% hasta que
desapareciese completamente el exceso de tinción. Los segmentos vasculares se
visualizaron con una cámara de vídeo (SSC-M0370CE, Sony) y mediante un analizador
de imágen (Visilog 4.1.5), se determinaron las siguientes áreas: superficie recubierta de
lípidos (LS), que es la zona de la lesión y queda teñida de rojo, y superficie total del
vaso (ST). La extensión de la lesión se expresó como (LS/ST) x 100 (Figura 10).
Figura 10. Esquema de la superficie de un fragmento de arteria (ST) con lesiones ateroscleróticas tras tinción con solución de Herxmeheimer. La zona lesionada aparece en color rojo (LS).
ESTUDIO HISTOLÓGICO DE LA PARED VASCULAR
El tamaño y la composición de la lesión aterosclerótica se determinaron en
segmentos de aorta abdominal distal (a nivel de la bifurcación con las arterias ilíacas) y
en la LAD (zona proximal).
Preparación de Especímenes
Las muestras se fijaron con paraformaldehido 4% durante 6-8 horas. A
continuación se crioprotegieron con solución de sacarosa 30% a 4ºC y se incluyeron en
OCT Compound (Miles Inc). Se realizaron cortes seriados de 5 µm mediante un
criostato (Jung CM 300, Leica), que se depositaron sobre portaobjetos gelatinizados al
1% y 2%.
LS
ST LS
LS
Métodos 92
Engrosamiento de la Íntima
Los cortes depositados sobre portaobjetos gelatinizados (1%) se tiñeron según el
método Tricrómico de Masson, a fin de identificar las diferentes estructuras de la pared
vascular. Este método se basa en la distinta afinidad de los colorantes (según su carácter
ácido o básico) a las proteínas celulares. Así, el colágeno y las células musculares lisas
(CML) que abundan en la capa media, se tiñen respectivamente de color azul y rojo, los
núcleos de color negro y el endotelio queda poco teñido (Smith A & Bruton J, 1977).
Se procedió como se indica a continuación:
Se secaron los portaobjetos a 37ºC (15 minutos), se fijaron en solución de Bouin
durante 2 horas y se lavaron con agua del grifo. A continuación, los tejidos se tiñeron
con tinción Azul Celeste (12 minutos) y se lavaron con agua destilada. Tras esta tinción,
se tiñeron con Hematoxilina de Mayer (12 minutos) y se lavaron con agua del grifo
hasta la aparición de color azul. Para diferenciar los tejidos se introdujeron durante 30
segundos en alcohol ácido y nuevamente se lavaron con agua del grifo. Después se
tiñeron con fucsina ácida (20 minutos) y se lavaron con agua destilada. Posteriormente,
los tejidos se trataron con ácido fosfomolíbdico 1% (4 minutos) y se introdujeron en
solución de azúl de metileno (3 minutos). Se lavaron con agua destilada y se trataron
con ácido acético 1% (2 minutos). Se deshidrataron mediante una serie de alcoholes,
primero se lavaron con agua destilada, después se sumergieron en alcohol 90% y
seguidamente en alcohol absoluto (3 minutos). Finalmente, los cortes se trataron con
Histoclear (National Diagnotic) (3 minutos), se secaron y se montaron con Histomount
(National Diagnotic).
Una vez teñidos, los cortes se observaron a través de una lupa (SZH10,
Olympus) y se determinó el engrosamiento de la íntima arterial mediante un analizador
de imagen. Se calcularon las siguientes áreas y longitudes (Figura 11): área de la luz
vascular (a=L), área envuelta por la elástica interna (b=L+I) y área envuelta por la
elástica externa (c=L+I+M). A partir de estas tres medidas se realizaron los siguientes
cálculos:
Métodos 93
Figura 11. Esquema y cálculos de las áreas determinadas en los vasos estudiados mediante el sistema de análisis de imagen. I, íntima; L, lúmen; M, túnica média; A, adventicia.
Contenido Lipídico de la Lesión
A partir de cortes histológicos depositados sobre portaobjetos gelatinizados
(1%), se realizó una tinción de lípidos mediante la técnica de tinción Oro, para
determinar y cuantificar el contenido lipídico de la lesión. Se procedió de la siguiente
manera:
Los tejidos se secaron a 37ºC (40 minutos) y se fijaron durante 1 hora en
solución formol cálcico. Seguidamente se secaron y se lavaron con isopropanol 60%.
Los portaobjetos se sumergieron en solución Oro durante 15 minutos y después se
diferenciaron en isopropanol 60% (2 veces durante 1 minuto). Se lavaron con agua
destilada y se tiñeron con Hematoxilina de Mayer (3 minutos). Se volvieron a lavar,
primero con agua del grifo y después con agua destilada. Finalmente, se secaron con
cuidado y se montaron en Glicergel (Dako).
Inmunohistoquímica
Esta técnica se basa en el empleo de anticuerpos mono o policlonales
(anticuerpos primarios) que reconocen proteínas (antígenos) específicamente. Estos
Media = c-b = (L+I+M) - (L+I) = M
Íntima = b-a = (L+I) - L = I
% Estenosis = [I /(L+I)] x 100
Engrosamiento íntima = I/M A
a b c
I
L
M
Métodos 94
anticuerpos reaccionan posteriormente con anticuerpos (policlonales) específicos para
cada especie (anticuerpos secundarios) que están conjugados con marcadores. A partir
de los marcadores se obtienen señales visibles, haciendo posible la detección de las
zonas de unión entre el antígeno y el anticuerpo primario.
Marcaje por Inmunofluorescencia
En este tipo de inmunohistoquímica se utilizan marcadores fluorescentes visibles
mediante luz ultravioleta. Como marcadores se utilizaron la fluoresceína (luz verde) y la
rodamina (luz roja). Se realizó un marcaje doble para inmunolocalizar fibrinógeno y
CML, y un marcaje simple para marcar macrófagos. Para ello, se utilizaron los
siguientes anticuerpos:
Diana Descripción Proveedor
Fibrinógeno Policlonal (conejo) anti-fibrinógeno humano F9902, Sigma Immunochemicals
CML Monoclonal (ratón), anti-alfa-actina de CML humanas M851, Dako
Macrófagos Policlonal (conejo) anti-proteína pabBp46 de monocitos/macrófagos de cerdo*
pabBp46, producido en nuestro laboratorio
Secundario, fluoresceína
Inmunoglobulinas de cabra anti-conejo conjugadas con FITC
T1659 Sigma Immunochemicals
Secundario, fluoresceína
Inmunoglobulinas de cabra anti-ratón conjugadas con FITC F0479, Dako
Secundario, rodamina
Inmunoglobulinas de cerdo anti-conejo conjugadas con TRITC R156, Dako
* pabBp46 es una proteína obtenida a partir de monocitos de cerdo que todavía no ha sido identificada (datos sin publicar).
Procedimiento seguido fue el siguiente:
Se secaron los cortes a 40ºC (45 minutos) y posteriormente lavaron dos veces
con PBS (10 minutos). A continuación, se permeabilizaron los tejidos mediante una
con una solución PBS-1% Twen 20 (10 minutos) y se bloquearon con BSA 2% (30
minutos). La incubación con los anticuerpos primarios se efectuó incubando los tejidos
Métodos 95
durante 2 horas con una solución BSA 1% con anticuerpos anti-fibrinógeno (1:50) y
anti-CML (1:25) en la misma mezcla, en el caso del marcaje doble, o anticuerpos anti-
monocitos/macrófagos (1:50), en el caso del marcaje simple. Tras tres lavados con PBS-
1% Twen 20 (10 minutos), las muestras se incubaron (1 hora) con los anticuerpos
secundarios (en solución BSA 1%) anti-ratón y anti-conejo (1:50) mezclados para el
marcaje doble, y anticuerpos anti-conejo (1:50) para el marcaje simple. A continuación,
se realizaron cuatro lavados de con PBS (10 minutos). Los cortes secados se montaron
en Glicergel (Dako) y se conservaron protegidos de la luz.
Marcaje por Inmuno-Peroxidasa por el Sistema Avidina-Biotina
En los casos en que la inmunofluorescencia no fue suficientemente sensible para
detectar el antígeno deseado, se utilizaron técnicas que permiten mayor amplificación de
las señales. Se utilizó la ampliación con avidina/biotina y detección por peroxidasa. En
esta técnica la detección del antígeno se lleva a cabo mediante una reacción
colorimétrica que se produce cuando la peroxidasa, que está unida a la avidina, actúa
sobre su substrato. Las señales se visualizaron a través de un microscopio óptico con
luz blanca. Con esta técnica se realizó el marcaje simple de TF. Los anticuerpos
utilizados fueron los siguientes:
Diana Descripción Proveedor
TF Policlonal (oveja) anti-TF de conejo No 4513, American Diagnostic
Secundario, biotina
Inmunoglobulinas de conejo anti-oveja conjugadas con Biotina BA-5000, Vector Laboratories
El procedimiento se realizó en condiciones similares a las descritas para
inmunofluorescencia, con las siguientes modificaciones:
Tras el secado y lavado de los portaobjetos con PBS, se realizó el tratamiento de
bloqueo de peroxidasas endógenas, sumergiendo los tejidos en la solución de bloqueo
de peroxidasas (30 minutos). Después del bloqueo de las muestras con BSA 2%, se
bloqueó la biotina endógena con un kit específico de bloqueo Avidina-Biotina (Vector
Métodos 96
Laboratories), incubando con avidina durante 15 minutos y lavando tres veces BSA 1%
(5 minutos), y repitiendo el mismo procedimiento con biotina. La incubación con los
anticuerpos primarios y secundarios, se realizó con anticuerpos anti-TF (1:50) y
anticuerpos anti-cabra (1:200) en solución BSA 1%, respectivamente. Tras la
incubación los anticuerpos secundarios y los lavados, los cortes se trataron con la
solución “ABC reagent” (Vector Laboratories) kit durante 30 minutos, esta solución
contiene avidina unida a peroxidasa, que se une a la biotina del anticuerpo secundario.
Después de lavar 3 veces con PBS (5 minutos) las muestras se trataron con diamino
bencidina (DAB) diluida 1:10 en el tampón de DAB comercial (Boehringer Mannheim),
que es el substrato con el cual reacciona la peroxidasa, hasta observar un cambio de
color de los tejidos. A continuación, los portaobjetos se trataron con alcoholes, solución
Histoclear y se montaron con Glicergel (National Diagnotic), tal como se describe en el
apartado de Engrosamiento de la Intima. En las muestras en las que había mucho
marcaje de fondo, se utilizó suero de cabra 10% para el bloqueo y la incubación con
anticuerpos.
Análisis de Imagen y Cuantificación de los Marcadores
Todos los cortes de tejido procesados para inmunohistoquímica y tinción de
lípidos, se observaron mediante un microscopio binocular de luz transmitida o
fluorescencia (modelo Vanox de marca Olympus). La captación de imágenes se realizó
mediante una cámara digital en color Sonny 3CCD. Se cuantificó la extensión del área
ocupada por cada uno de los marcadores mediante un analizador de imagen acoplado al
microscopio (Visilog 4.1.5., Noesis). A partir de 3 cortes histológicos de cada muestra,
se tomaron al menos 5 imágenes (en función del tamaño del vaso) por cada corte, a 20
aumentos. En cada imagen, se realizaron las siguientes medidas: el área teñida (at) y el
área de la íntima visible en la imagen (ai), la proporción de cada marcador presente en
la lesión se calculó como (at/ ai) x 100. Finalmente, se calculó la media de los valores
obtenidos en cada una de las imágenes para cada muestra. Además se realizó el
siguiente cálculo:
Métodos 97
• Área Total ocupada por el marcador: (at/ ai) x Área de la Íntima
En los casos en que había una diferencia significativa del tamaño de los vasos
(LAD), el área total ocupada por el marcador se normalizó por el área de la media, que
teóricamente es un parámetro constante e independiente del tamaño de las lesiones, o al
menos lo es cuando las lesiones son tempranas. Este cálculo se realizó como se indica a
continuación:
• Área Total ocupada por el marcador /Área de la Media:
ANÁLISIS DE COX, MCP-1 Y eNOS A NIVEL DE
mRNA Y PROTEÍNA EN LA PARED VASCULAR
Se estudió la expresión vascular de Cox-1, Cox-2, MCP-1 y eNos, proteínas
implicadas en la funcionalidad vascular y en el proceso aterosclerótico, para determinar
si estaban afectados por los fármacos. En el estudio con inhibidores de la Cox, se
evaluaron los niveles de RNA mensajero (mRNA) de las dos isoformas de la Cox (Cox-
1 y Cox-2); y de proteína de Cox-2, ya que para Cox-1 (conejo) no se consiguieron
anticuerpos específicos. En el estudio con estatinas se evaluó la expresión de mRNA de
MCP-1, e-Nos, Cox-1 y Cox-2.
RECOGIDA DE TEJIDOS PARA LA OBTENCIÓN DE RNA Y
PROTEÍNA
Para la obtención de mRNA y proteína se utilizó el segmento de la aorta que va
desde el cayado hasta la bifurcación de las iliacas, en los conejos; y el segmento de
(at/ ai) x Área de la Íntima
Área de la Media
Métodos 98
aorta abdominal comprendido entre la zona de la bifurcación de las arterias ilíacas y la
arteria celíaca, en los cerdos. En algunos casos se separó la túnica media (capa inferior)
de la capa superior, que contiene la capa íntima y el subendotelio, para analizarlas por
separado. Una vez extraídos los segmentos, se congelaron rápidamente en nitrógeno
líquido, se pulverizaron y se mantuvieron a –80ºC hasta su procesamiento.
EXTRACCIÓN DE RNA Y PROTEÍNA
La extracción de proteína y RNA se realizó mediante el método de Tripure
(Boehringer Mannheim), el cual permite la obtención de RNA y de proteína a partir de
una misma muestra de tejido. Este procedimiento se basa en un mejora del método de
aislamiento de RNA desarrollado por Chomczynski y Sacchi (Chomczynski P,1993;
Chomczynski P & Sacchi N, 1987).
Para evitar la degradación del RNA por RNAsas, en todo el procedimiento se
utilizó material esteril, agua autoclavada y tratada con DEPC, y se trabajó siempre con
guantes. Se procedió de la siguiente manera:
El tejido se homogeneizó en el reactivo de Tripure (100 mg de tejido en 2 ml de
Tripure) con ayuda de un Polytron y seguidamente se eliminaron los restos celulares del
tejido mediante centrifugación. Se añadió cloroformo a la mezcla (0,2 ml por ml de
Tripure) y se centrífugó, obteniéndose una solución que contenía tres fases: una fase
superior acuosa, donde se encontraba el RNA, una interfase, que contenía el DNA, y
una fase inferior que contenía la proteína. Una vez separada la fase superior, el RNA se
obtuvo mediante precipitación con isopropanol (0,5 ml por ml de Tripure) y lavando
con etanol 75%. La proteína se aisló a partir de la fase inferior, mediante eliminación
por centrifugación de los restos celulares, seguido de la precipitación de la proteína con
isopropanol (1,5 ml por cada ml de Tripure), lavado con hidrocloruro de guanidinio 0,3
M (2 ml por ml de Tripure) y etanol absoluto. Finalmente, se eliminaron los
sobrenadantes en cada caso, y se resuspendió el RNA en agua tratada con DEPC y la
proteína en SDS 1%.
Métodos 99
ANÁLISIS DEL RNA
El nivel de expresión de Cox-1, Cox-2, eNos y MCP-1 se determinó por RT-
PCR. Para ello, el mRNA se convirtió a cDNA, y a partir de éste se llevó a cabo la
reacción de PCR de cada gen analizado. Finalmente, el producto amplificado fue
cuantificado.
Cuantificación del RNA y Verificación de la Integridad del RNA
Para determinar la concentración del RNA, se midió la absorvancia a 260 nm de
1-2 µl de la solución acuosa de RNA. Una absorvancia de 1 OD equivale a una
concentración aproximada de RNA de 40 µg/µl en la muestra original.
La integridad del RNA se comprobó mediante electroforesis en gel de agarosa
1%, la cual permite separar el RNA según un gradiente de tamaño. Para ello 0,5-1 µg de
RNA diluidos en tampón de muestras 1x, se cargaron en un gel de agarosa 1% en
solución TBE 1x, y se dejaron correr a 100 V. Las bandas de RNA obtenidas se
examinaron con un transiluminador de luz ultravioleta (Gel-Doc 1000, Bio-rad). Se
observaron las bandas ribosomales 18S y 28S, así como una banda menos intensa
correspondiente a RNA de menor tamaño. La ausencia de bandas o la presencia de una
cola (smear) son indicativas de la degradación del RNA de las muestras.
Amplificación del RNA: RT-PCR
Para detectar del RNA mensajero (mRNA) correspondiente a Cox-1, Cox-2,
MCP-1 y eNos, se aplicaron dos técnicas: la transcripción reversa del mRNA (RT) y la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La primera técnica consiste en convertir el
mRNA a cDNA unicatenario mediante el enzima transcriptasa reversa (RT); a
continuación se amplifica en varios órdenes la cantidad de cDNA bicatenario mediante
la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Métodos 100
Transcripción Reversa del mRNA
La conversión el mRNA en cDNA está catalizada por el enzima transcriptasa
reversa (SuperScript II Rnase H-RT, Life Technologies). Como cebadores se emplearon
oligo (dT)12-18, los cuales se hibridan con las colas poli(A) del extremo 3’ que están
presentes en la mayoría de los mRNA de las células eucariotas. El procedimiento
seguido fue el siguiente:
Se mezclaron 1-2 µg de RNA, 1 µl de oligo (dT)12-18 (0,5 µg/µl) y agua DEPC
hasta un volumen final de 12 µl. La mezcla se incubó a 70ºC (10 minutos) y a
continuación se dejó en hielo. Se añadieron 4 µl de tampón de síntesis de cadena 5X
(Gibco), 1 µl de mezcla de nucleotidos dNTP (10 mM), 2 µl de DTT 0,1 M (Gibco) y 1
µl de SuperScript II Rnase H¯ Reverse Transcriptase (Gibco) a cada muestra, y toda la
mezcla se incubó a 42ºC durante 55 minutos. Finalmente, se incubó a 70ºC durante 15
minutos y posteriormente se enfrió en hielo para parar la reacción.
Reacción en Cadena de la Polimerasa: PCR
La reacción en cadena de la polimerasa permite amplificar específicamente
cualquier secuencia de DNA a partir de una mezcla de diversas secuencias genómicas.
Los componentes principales de la reacción PCR son los oligonucleotidos cebadores
sentido y antisentido, la mezcla de nucleótidos y el enzima Taq Polimerasa.
La técnica de PCR se basa en la copia de una cadena de cDNA mediante una
serie de ciclos repetidos (entre 25 y 40), cada uno de los cuales consta de 3 fases con
diferentes temperaturas que permiten la desnaturalización de las cadenas de DNA
(95ºC), la hibridación de los cebadores (50-60ºC) y la elongación de la cadena por la
Taq Polimerasa (72ºC). Una vez amplificado el cDNA se cuantifica y se normaliza en
función de la expresión de un gen constitutivo (GAPDH, rRNA ribosomal 18S), para
obtener valores comparables. En este trabajo aplicaron dos tipos de técnicas de
amplificación de cDNA, que se diferencian fundamentalmente por el sistema de
cuantificación del producto amplificado: PCR semicuantitativa y PCR a tiempo real.
Métodos 101
Para la selección de los cebadores se recurrió a la base de datos GeneBank
dónde se buscaron secuencias conservadas de los genes estudiados, y se eligieron de
diferentes zonas del DNA para obtener un producto de una longitud determinada.
PCR semicuantitativa
Se pusieron a punto las condiciones de PCR para cada uno de los genes
evaluados, así como para cada especie estudiada. Las secuencias seleccionas para los
diferentes cebadores utilizados fueron sintetizadas por Gibco y se muestran en la Tabla
3. La descripción de las fases y el número de ciclos aplicados se describen en la Tabla 4.
Especie Secuencia diana Cebador sentido (5'-3') Cebador antisentido (5'-3') Tamaño del
producto (pb)
GAPDH GTCACCAGGGCTGCTTTTAA ACGGAAGGCCATGCCAGTGA 652
COX-1 TCAATGCCACCTTCATCCGG ATCCAGCACCTGGTACTTGA 466 Conejo
COX-2 TCAGCCACGAGCAAATCCT GTGATCTGGATGTCAGCACG 282
GAPDH TTCACCACCATGGAGAAGGC GCAGGGATGATGTTGTGGGC 265
e-NOS CCCAGCCAACGTGGAGATCAC GGACACCACGTCATACTCATCC 889 Cerdo
MCP-1 CCTTCTGTGCCTGCTGCTCA GTCAGCACAGATCTCCTTG 215
Tabla 3. Cebadores sentido y antisentido y tamaño del producto esperado.
Fase Ciclos Tiempo Temperatura Objetivos
1 1 3 min 95ºC Desnaturalización inicial
2
GAPDH (conejo y cerdo): 30 COX-1: 35 COX-2: 30 e-NOS: 35 MCP-1:32
45 seg 45 seg 45 seg 1 min 45 seg
45 seg 45 seg 45 seg 2 min 45 seg
1 min 30 seg1 min 30 seg1 min 30 seg
3 min 1 min 30 seg
95ºC
GAPDH(conejo y cerdo): 56ºC COX-1: 56ºC COX-2: 56ºC e-NOS: 60ºC MCP-1: 56ºc
72ºC
Desnaturalización
Hibridación cebadores
Elongación cadenas
3 1 2 min 72ºC Elongación final
Tabla 4. Condiciones de amplificación por PCR.
Métodos 102
Se procedió como se explica a continuación:
En un tubo de PCR se dispensaron 2 µl de la solución de cDNA, 2,5 µl de
tampón PCR 10x (Gibco), 2,5 µl de mezcla de nucleotidos dNTP (2 mM), 0,375 µl de
cebador sentido (75 ng/µl), 0,375 µl de cebador antisentido (75 ng/µl), 0,125 µl de Taq
Polimerasa (5 U/µl) (Gibco) y agua Milli-Q estéril hasta un volumen final de 27 µl.
Una vez preparadas las muestras, se dejaron en hielo hasta el momento de introducirlas
en el termociclador (Genius, Techne).
Se programaron las condiciones de la PCR en el termociclador, se introducieron
las muestras y se llevó a cabo el procedimiento. Para evaluar el cDNA obtenido
mediante la técnica de PCR se realizó una electroforesis en gel de agarosa 2%, la cual
permite separar el DNA según un gradiente de tamaño y comprobar que la banda
obtenida corresponde a la esperada, así como determinar la intensidad de ésta. Se
corrieron 10 µl de cDNA amplificado en tampón de muestras (6x) en un gel de agarosa
2% con bromuro de etidio 4% a 100 W. La imagen del gel se captó bajo luz ultravioleta
y se determinó la intensidad de la banda (Gel-Doc 1000, Bio Rad). Finalmente, los
resultados se normalizaron con el estándar interno GAPDH.
PCR a tiempo real
A diferencia de la PCR semicuantitativa, la PCR a tiempo real muestra la
cantidad de cDNA que se está amplificado en cada momento. Por ello, además de los
cebadores, la Taq Polimerasa y la mezcla de oligonucleótidos, es necesaria una sonda
que hibride con el cDNA, y en el momento de la amplificación emita fluorescencia, de
manera que a mayor cantidad de producto amplificado, mayor emisión de fluorescencia.
Esta sonda, es una secuencia de nucleótidos (sentido, 5'-3') que se hibrida en el
segmento de cDNA que se amplifica, en cualquier zona comprendida entre las
secuencias de hibridación de los cebadores sentido y antisentido. La sonda tiene unido
un fluorocromo (FAM), que se libera y emite fluorescencia en el momento que la Taq
Polimerasa accede a la zona de unión de la sonda al cDNA.
Métodos 103
Para llevar a cabo la técnica de PCR a tiempo real se utilizaron los reactivos y el
termociclador de Applied Biosystem (Abi Prism 7000). Las secuencias de los diferentes
cebadores se seleccionaron de manera que el producto final no superase los 100 pb.
Tanto las sondas como los cebadores se diseñaron para que se pudiesen aplicar las
mismas condiciones de temperatura y tiempo en todos los casos. Las secuencias de los
cebadores y de las sondas utilizadas fueron diseñadas con el programa informático
Primer Express y se muestran en la Tabla 5. Las secuencias del control interno rRNA
18S no aparecen en esta tabla porque es un producto preparado por la casa comercial
(ref. 4319413E).
Especie Secuencia diana Cebador sentido (5'-3') Cebador antisentido (5'-3') Sonda (5'-3')
COX-1 TGCTCATGCGCCTGGTACT TCGTGCCGTGTTGTAGGT ACAGTGCGTTCCAAC Cerdo
COX-2 TTAGAAGCGTCTATGGTGACATT
TCTGGGCGAGGCTTTTCTAC
ATGCCATGGAGCTGTATCCTGCCCTT
Tabla 5. Cebadores sentido y antisentido y tamaño del producto esperado.
La descripción de las fases de temperatura y tiempo que se aplicaron se
describen a continuación, en todos lo casos se realizaron 40 ciclos:
Fase Ciclos Tiempo Temperatura Objetivos
1 1 10 min 95ºC Desnaturalización inicial
15 seg 95ºC Desnaturalización
1 min 60ºC Hibridación cebadores 2 40
30 seg 72ºC Elongación cadenas
Se procedió de la siguiente manera:
Para cada muestra se dispensan 2-4 µl de cDNA, 25 µl de TaqMan PCR Master
Mix 2x , 2,5 µl de Sonda TaqMan (250 nM), 1,25 µl de cebador sentido Cox-1 (300 nM)
ó 1,6 µl de cebador sentido Cox-2 (300 nM), 1,88 µl de cebador antisentido Cox-1 (300
nM) ó 1,43 µl de cebador antisentido Cox-2 (300 nM), y agua Milli-Q estéril hasta un
volumen final de 50 µl. Para la reacción con el estandard interno rRNA 18S, se
Métodos 104
CT CT CT Línea de corte
0
1
2
3
4
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Ciclos
Fluo
resc
enci
a (R
n)añadieron 2-4 µl de cDNA, 25 µl de TaqMan PCR Master Mix 2x , 2,5 µl de mezcla de
cebadores rRNA 18S y sonda TaqMan y agua Milli-Q estéril hasta un volumen final de
50 µl. Se dispensaron 25 µl de la mezcla final por pocillo en una placa de 96 pocillos
para PCR (Applied Biosystem), de manera que cada muestra se analizó por duplicado.
Inmediatamente se tapó la placa con un plástico adhesivo para evitar la evaporación del
contenido durante el proceso. Tras la programación de las condiciones de amplificación,
la placa se introdujo en el termociclador (Abi Prism 7000, Applied Biosystem) y se dejó
correr el programa.
La cuantificación se llevó a cabo determinando el ciclo en el cual comenzaba la
amplificación exponencial (CT), donde el producto de amplificación era proporcional a
la cantidad inicial. Un gráfico mostraba la evolución de la amplificación en función de
los ciclos, en el que el eje de las “x” correspondía al número de ciclos y el de las “y” a
la cantidad de cDNA (nivel de fluorescencia) (Figura 12). Con ayuda del programa
informático del termociclador se evaluaron los gráficos que mostraban la amplificación
de cada muestra y se determinó la recta de corte de la curva (zona de amplificación
exponencial), obteniéndose así las unidades de cuantificación (CT). Finalmente, los
resultados se expresaron normalizados por el estandar interno rRNA 18S.
Figura 12. Gráfico representativo que muestra la evolución de la amplificación cDNA en función del número de ciclos (eje de las “x”) mediante la técnica de PCR a tiempo real. La cantidad de cDNA amplificado se mide con fluorescencia (eje de las “y”). La cuantificación se expresa como número de ciclos obtenido a un mismo nivel de fluorescencia (CT ) de los diferentes cDNA amplificados. La línea de corte para determinar el CT se sitúa en la zona de crecimiento constante de las curvas.
Métodos 105
ANÁLISIS DE LA PROTEÍNA
Los niveles de proteína de Cox-2 se determinaron por Western blot. Para ello las
muestras de proteína se corrieron mediante electroforesis en gel de acrilamida al 7,5% y
seguidamente se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa, que se incubó con los
anticuerpos primarios (anti-Cox-2) y secundarios. Finalmente, la señal se reveló en un
film radiográfico.
Electroforesis en Gel de Poliacrilamida
Las proteínas se separaron mediante electroforesis discontinua en condiciones
desnaturalizantes, la cual permite separar proteínas en función de su masa molecular.
Se utilizó el método descrito por Laemmli UK et al. (1970), que consiste en que las
proteínas migren a través de un gel concentrador o apilador (superior) y uno separador
(inferior). El gel inferior o separador favorece la separación de las proteínas en función
de su tamaño. Para el estudio de Cox-2, de 72 kDa, se utilizó un gel de 7,5% de
acrilamida para obtener la banda en la zona central del gel. En todos los casos se
utilizaron equipos de electroforesis Mini-Protean II (Bio-Rad, USA), y se procedió
como se describe a continuación:
A 25 µg de proteína, cuantificada según el método BCA (Pierce, USA) (Smith
PK et al., 1985), se le añadió tampón de aplicación a las muestras (x2) y se incubó a
95ºC (5 minutos), para desnaturalizar las proteínas. La mezcla se sembró en el gel
apilador, y la electroforesis se corrió en tampón de elución a 60 W hasta que el frente
pasó al gel de acrilamida 7,5%. Una vez las proteínas se situaron en el gel separador, se
aumentó a 100 W hasta finalizar la electroforesis.
Métodos 106
1 2 3 4 5 6
Tranferencia a Membrana de Nitrocelulosa
Tras la electroforesis, las proteínas contenidas en el gel de acrilamida se
transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Éste procedimiento consiste en aplicar
corriente eléctrica de manera que las proteínas migran del gel a la membraba y se unen a
ésta por medio de un enlace covalente, que es muy estable. Se procedió como se explica
a continuación:
El gel se extrajo cuidadosamente del soporte de electroforesis y se montó el
sandwich de transferencia en el cassette apropiado (Mini-protean II, Bio-rad) con las
siguientes capas, todas ellas empapadas con el tampón de transferencia:
1) esponja
2) 2 capas de papel Whatman
3) gel de acrilamida
4) membrana de nitrocelulosa
5) 2 capas de papel Whatman
6) esponja
A continuación se cerró el cassette y se colocó en el soporte de transferencia
(Mini-protean II, Bio-rad). Se aplicó un amperaje de 0,4 A durante 2 horas y la reacción
se realizó a 4ºC en tampón de transferencia. Las bandas de proteínas transferidas a la
membrana de nitrocelulosa se visualizaron con tinción Rojo de Ponceau, de esta manera
se confirmó que su distribución a lo largo del gel era correcta y que la cantidad de
proteína era similar entre las diferentes muestras.
Western Blot
Los niveles de Cox-2 se determinaron mediante la técnica de Western blot
(Twbin H et al., 1979). En este procedimiento, las proteínas transferidas a una
membrana de nitrocelulosa son expuestas a anticuerpos (primarios) que se unen
Métodos 107
específicamente a una proteína determinada. La reacción se visualiza añadiendo un
anticuerpo secundario unido covalentemente a peroxidasa que reconoce al anticuerpo
primario. Finalmente, la membrana se expone a una solución que contiene luminol, el
cual reacciona con la peroxidasa y como resultado se produce una emisión de luz que
será captada en el film radiográfico durante el revelado.
Los anticuerpos utilizados fueron los siguientes:
Diana Descripción Proveedor
Cox-2 Policlonal (conejo) anti- Cox-2 humano P0161, Oxford Biomedical
Secundario, peroxidasa
Inmunoglobulinas de cabra anti-conejo conjugadas con peroxidasa P0217, Dako
El procedimiento seguido fue el siguiente:
La membrana de nitrocelulosa se saturó con solución de bloqueo durante 1 hora
y a continuación, se incubó con el anticuerpo primario anti-Cox-2 en agitación (1:5.000
en solución de bloqueo, 1 hora). Se lavó con TBS-Tween (2 lavados de 15 minutos) y
con TBS (2 lavados de 15 minutos). Seguidamente se incubó con el anticuerpo
secundario (1:10.000 en solución de bloqueo) en las mismas condiciones que el
anticuerpo primario. Nuevamente se realizaron lavados con TBS-Tween y TBS. Se
añadió el reactivo SuperSignal (Pierce), substrato de la peroxidasa, y se incubó durante
6 minutos. Tras eliminar los restos del reactivo y secar la membrana, se colocó sobre un
film radiográfico en un cassette de revelado y se dejó contactando durante unos
segundos. El film se reveló y se fijó sumergiéndolo unos segundos correlativamente en
solución de revelado, agua y solución de fijación. Se probaron diferentes tiempos de
contactación de la membrana con el film hasta obtener señal sin que ésta estuviese
saturada. Finalmente, la intensidad de las bandas obtenidas se cuantificaron mediante un
densitómetro (Molecular Devices).
Métodos 108
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
La evaluación estadística del efecto de los tratamientos farmacológicos aplicados
en las diferentes variables analizadas, se realizó en varias fases. En la mayoría de los
casos, debido a que el tamaño de muestra no era elevado, no se asumió que los datos se
distribuyeran de manera normal y se aplicaron los tests no paramétricos de Kruskal-
Wallis, para el análisis de más de dos grupos, y la prueba U de Mann-Whitney, para
analizar las diferencias entre dos grupos. En cambio, cuando el número de datos lo
permitía, se utilizó el análisis de la varianza (ANOVA), para evaluar diferencias entre
varios grupos, o la prueba t de Student no apareada con especificación bilateral, para
comparar dos grupos. Algunas determinaciones que aparecen en este trabajo se tomaron
a partir de los mismos individuos antes y después de aplicar un tratamiento
farmacológico, en este caso se consideró que los datos estaban apareados y se evaluaron
mediante el test no paramétrico de Wilcoxon. Para estudiar el grado de correlación entre
variables, se calculó el coeficiente de correlación (r2) mediante la regla de los cuadrados
mínimos, cuando el tamaño de muestra era elevado (distribución normal), y la regresión
no paramétrica de Spearman, cuanto el número de datos era reducido (distribución no
normal).
Los datos se expresan como media ± EEM (error estándar de la media) y la
significación estadística se estableció al nivel de p<0,05. Todos los cálculos estadísticos
se realizaron con el programa informático StatView para ordenadores Macintosh.
Métodos 109
SOLUCIONES
• ACD-anticoagulante: Ácido cítrico 0,8%, citrato trisódico dihidrato 2,2%, dextrosa
2,45%, ajustar pH a 5.
• ACD- salino: ACD-anticoagulante 14,4% en solución salina, ajustar pH a 6,50.
• Ácido fosfomolíbdico 1%: Ácido fosfomolíbdico 1% en agua destilada.
• Acrilamida/bisacrilamida (30/0,8%): Acrilamida 30%, N-N’-bismetilén acrilamida
0,8%; almacenar preservada de la luz.
• Agua libre de RNAsas: Tratada con dietilpirocarbonato (DEPC).
• Alcohol ácido: Ácido clorhídrico concentrado 1% en alcohol 70%.
• Azul celeste: Azul celeste B 0,5%, Sulfato amónico férrico 5%, glicerina 14%. El
sulfato amónico férrico se disuelve en agua destilada fría con agitación, el azul
celeste se añade a esta solución y la mezcla se hierve durante unos minutos. Tras
enfriar la solución se filtra y se añade la glicerina.
• Azul de metileno: Azul de metileno 2%, ácido acético 2,5%. Añadir el azul de
metileno a agua hirviendo, a continuación el ácido, enfriar y filtrar.
• Bromuro de etidio, 10 mg/ml, solución stock: pastilla de 100 mg diluida en agua
DEPC, almacenar protegido de la luz.
• BSA 1%: BSA 1% en PBS-Tween 20 0,1%.
• BSA 2%: BSA 2% en PBS-Tween 20 0,1%.
• Citrato sódico 3,8%: Citrato trisódico dihidratado 4,3%.
• Cloruro cálcico 25 mM: cloruro cálcico 25 mM en TBS-BSA 0,1%.
• EDTA: EDTA 5%, ajustar el pH a 7,4.
• Fijador de Bouin: Formalina 3,4%, ácido acético 7% en solución saturada de ácido
pítrico.
• Formol cálcico: Clorato cálcico 16,7%, paraformaldehido 6,7%.
• Fucsina ácida: Fucsina ácida 0,5%, ácido acético glacial 0,5%. Añadir la fucsina
ácida a agua hirviendo. Agregar el ácido acético y filtrar.
• Gel agarosa 1%: Agarosa 1%, bromuro de etidio (0,5 µg/ml), en TBE (1x); fundir
la agarosa en microondas y disolver. Verter sobre un molde de geles cuando se haya
enfriado lo suficiente y dejar gelificar con un peine adecuado.
Métodos 110
• Gel agarosa 2%: Agarosa 2%, bromuro de etidio (0,2 µg/ml), en TBE (1x); preparar
igual que el gel agarosa 1%.
• Gel de acrilamida 4% (apilador): 0,5 ml de Tris-HCl 0,5 M pH 6,8, 0,26 ml de
solución de Acrilamida/Bisacrilamida (30/0,8%), 20 µl SDS 10%, 1,22 ml de H2O
Milli-Q, 10 µl de persulfato amónico 15% y 2 µl de TEMED. Verter entre los dos
cristales del equipo para geles de electroforesis sobre el gel separador ya gelificado,
y dejar gelificar con un peine adecuado durante 20 minutos.
• Gel de poliacrilamida 15% (separador): 1,25 ml de Tris-HCl 0,5 M pH 6,8, 2,25 ml
de solución de acrilamida/bisacrilamida (30/0,8%), 50 µl de SDS 10%, 1,17 ml de
H2O Milli-Q, 25 µl de persulfato amónico 15% y 2,5 µl TEMED. Verter entre los
dos cristales del equipo para geles de electroforesis, añadir un capa fina de
isopropanol y dejar gelificar durante 20 minutos. Eliminar el isopropanol, secar y
verter el la mezcla para el gel apilador (4%).
• Gel de poliacrilamida 7,5% (separador): 1,25 ml de Tris-HCl 0,5 M pH 6,8, 1,25 ml
de solución de acrilamida/bisacrilamida (30/0,8%), 50 µl de SDS 10%, 2,43 ml de
H2O Milli-Q, 25 µl de persulfato amónico 15% y 2,5 µl TEMED. Preparar como el
gel separador al 15%.
• HBS: Cloruro sódico 137 mM, cloruro potásico 5,38 mM, glucosa 5,55 mM y
HEPES 10mM. Ajustar el pH a 7,5.
• HBSA: albúmica sérica bovina (BSA) 0,1% en HBS.
• Hematoxilina de Mayer: Hematoxilina 0,1%, sulfato alumínico potásico 5%, ácido
cítrico 0,1%, hidrato de cloral 5%, iodato sódico 0,02%. La hematoxilina, el sulfato
alumínico potásico y el iodato sódico se disuelven en agua caliente con agitación. Se
añaden el hidrato de cloral y el ácido cítrico; la mezcla se hierve durante 5 minutos,
se deja enfriar y se filtra.
• Hidrocloruro de guanidinio 0,3 M: Hidrocloruro de guanidinio 0,3 M en etanol 75%.
• HTB, para administración i.v.: HTB 250 mM, NaOH 0,43N, ajustar el pH a 7,0.
• Paraformaldehido 4%: Cloruro sódico 0,9 %, paraformaldehido 4%, en PBS. Diluir
el paraformaldehido con agitación y aplicando calor hasta observar que la solución
queda transparente, evitar la ebullición (<80ºC), dejar enfriar y filtrar.
• PBS, pH 7,40: Cloruro potásico 2,68 mM, cloruro sódico 136,8 mM,
dihidorenofosfato de potasio 1,46 mM, hidrogeno de disodio dodecahidrato 8 mM.
• PBS-Tween 20 1%: Tween 20 1% en PBS
Métodos 111
• PBS-Tween 20 0,1%: Tween 20 0,1% en PBS
• PBS-Tween 0,05%: Twen 20 0,05% en PBS
• PEG 8.000 20%: PEG 8.000 20% en tampón glicina 0,2 M, pH 9,0.
• Persulfato amónico 15%: Persulfato amónico 15% en agua; preparadar al momento.
• Rojo de Ponceau: Ponceau 2 mg/ml, ácido acético glacial 1%.
• SDS 1%: Lauril sulfato sódico 1%.
• Solución de bloqueo de peroxidasas: Peróxido de hidrógeno 3% en metanol.
• Solución de bloqueo para inmunohistoquímica: Tween 20 0,05%, albúmica sérica
bovina (BSA) 1% en PBS.
• Solución de bloqueo para Western blot: Leche descremada en polvo 5%, Tris (pH
7,5) 10 mM, cloruro sódico 100 mM, Tween 20 0,05%.
• Solución de carbonato, pH 9,6: Carbonato 0,1 M.
• Solución de gelatinización de portaobjetos:
1. Gelatinización 2% (Inmunohistoquímica): gelatina 2%, cromo III potasio sulfato
dodecahidrato 0,5%.
2. Gelatinización 1% (histología convencional): gelatina 2%, cromo III potasio
sulfato dodecahidrato 0,5%.
Disolver la gelatina en agua caliente y agregar el sulfato. Los portaobjetos se
introducen en la solución durante varios segundos, se escurren y se dejan secar.
• Solución del substrato de la peroxidasa: 0-dihidrocloride fenilenediamina 0,42
mg/ml en solución citrato 0,2 M, pH 5,0, y peróxido de hidrógeno 0,3%.
• Solución Herxheimer: Sudán III 0,5%, Sudán IV 0,5%, en solución alcohol acetona
proporción 1:1. Agitar durante 1 hora y filtrar. Guardar protegido de la luz.
• Solución salina: Cloruro sódico 0,9%.
• Solución suero de cabra 10%: Tween 20 0,05%, suero de cabra 1% en PBS.
• SuperSignal Ultra (Pierce): Solución de luminol y solución de peróxido estable
(1:1).
• Tampón glicina 0,2 M, pH 9,0: Glicina 0,2 M.
• Triflusal, para administración i.v.: Triflusal 250 mM en bicarbonato sódico 60 mM.
• Tampón de aplicación a las muestras (2x): Tris-HCl 60 mM, glicerol 20%, (v/v),
SDS 4% (p/v), azul de bromofenol 0,05% (p/v); ajustar el pH a 6,8.
• Tampón de carga (6x): Glicerol 30%, azul de bromofenol 0,25%, xilencianol FF
0,25%.
Métodos 112
• Tampón de elución (10x): Glicina 1,92 M, Tris 0,25 M, SDS 1% pH 8,3-8,5.
• Tampón de lisis: Tris-HCl pH 7,5 0,01 mM, HCl 150 mM, PMSF 3 mM, DTT 0,1
mM, leucopeptin 0.02%, aprotinin 1,02x106 µg/ µl. Añadir el PMSF en el último
momento ya que es muy inestable.
• Tampón de lisis-tritón 1%: Tritón 1% en tampón de lisis.
• Tampón Hepes, pH 7,40: Cloruro sódico 137 mM, cloruro potásico 2,6 mM, Hepes
15 mM.
• Tampón del gel apilador (x4): Tris-HCl 0,5 M pH 6,8; 0,4% SDS.
• Tampón del gel separador (x4): Tris-HCl 1.5 M pH 8,6-8,8; 0.4 % SDS.
• Tampón de transferencia, pH 7,5: Tris 25 mM, glicina 192 mm, metanol 20%.
• TBE: Tris-borato 90 mM, EDTA 2 mM, pH 8,0.
• TBS (inmunohistoquímica): Tris (pH 7,5) 10 mM, cloruro sódico 100 mM. Ajustar
pH a 7,5.
• TBS (actividad procoagulante TF): Tris 50mM y cloruro cálcico 150 mM. Ajustar
pH a 7,5.
• TBS-BSA 0,1%: albúmica sérica bovina (BSA) 0,1% en TBS.
• TBS-EDTA 0,1 M, pH 7,5: EDTA 0,1 M en TBS. Ajustar el pH a 7,5.
• TBS-BSA 0,1%-EDTA 300 µM, pH 7,5: EDTA 300 µM en TBS-BSA 0,1%.
Ajustar el pH a 7,5.
• TBS-Twen: Tris (pH 7,5) 10 mM, cloruro sódico 100 mM, Twen 20 0,05%.
• Tinción Oro: Dextrina 1% en aceite rojo saturado en isopropanol 99%.
• Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8: Trizma 0,5 M, ajustar el pH a 6,8 con ácido clorídrico.
• Tyrode buffer: Bicarbonato sódico 11,9 mM, dextrosa 3,5 mM, cloruro magnésico
0,9 mM, cloruro cálcico 1 mM, en tampón Hepes.
• Vesículas de fosfatidilserina:fosfatidilcolina (30:70) 500 µM: Fosfatidilserina 30%:
fosfatidilcolina 70% 0,5 mM en TBS. Preparar la proporción de los dos fosfolípidos
y evaporar el metanol bajo nitrógeno para evitat la oxidación. Añadir el TBS y
sonicar a 4ºC hasta obtener una solución transparente, guardar a 4ºC. Realizar una
dilución 1:10.
Resultados
113
RESULTADOS
Resultados
114
Resultados
115
ESTUDIO CON INHIBIDOR DEL FACTOR
TISULAR, FFR-rFVIIa
Se evaluó el efecto de un inhibidor del TF sobre la trombosis arterial, ya que se
ha propuesto que este factor es determinante en la activación y desarrollo del trombo.
Inicialmente se estudiaron diferentes dosis de FFR-rFVIIa (0,1; 0,5; 1 y 2 mg/kg), que
se administraron a los cerdos mediante bolo intravenoso. Los parámetros fisiológicos y
niveles de fármaco en plasma se determinaron con todas las dosis. Sin embargo, para
estudiar la agregación plaquetar y la trombosis sobre pared vascular no aterosclerótica,
se eligieron las dosis intermedias de 0,5 y 1 mg/kg. Posteriormente, se evaluó el efecto
del FFR-rFVIIa sobre la trombosis en presencia de lesión aterosclerótica, y teniendo
como referencia los resultados obtenidos sobre pared sana, se aplicaron las dosis de 1 y
4 mg /kg.
PARÁMETROS HEMATOLÓGICOS Y BIOQUÍMICOS BASALES
El día anterior a la inducción experimental de trombosis, se determinaron los
parámetros hematológicos y bioquímicos en situación basal, así como el pesado de los
animales en todos los grupos (Control n=3; FFR-rFVIIa 0,1 mg/kg n=3; 0,5 mg/kg n=3;
1 mg/kg n=5; 2 mg/kg n=1). El peso medio de los animales fue de 39,7±3,3 kg. Los
datos referentes a los parámetros hematológicos y bioquímicos se resumen en las Tablas
1 y 2, respectivamente. No se encontraron diferencias significativas entre grupos en
ningún caso.
Resultados
116
GRUPO CONTROL FFR-rFVIIa 0,1 mg/kg
FFR-rFVIIa 0,5 mg/kg
FFR-rFVIIa 1 mg/kg
FFR-rFVIIa 2 mg/kg
RBC (x106/ mm3) 6,0 ± 0,5 5,2 ± 0,4 5,4 ± 0,2 5,5 ± 0,2 5,5
PLT (x103/ mm3) 413 ± 69 591 ± 47 475± 79 484 ± 38 631
HCT (%) 32,0 ± 0,8 28,5 ± 1,1 30,2 ± 0,4 29,4 ± 1,6 32,7
MCV (micron mm3) 47 ± 8 55 ± 3 56 ± 4 53 ± 1 59
MCH (pico grams) 16,7 ± 0,9 17,5 ± 1,0 17,7 ± 0,6 17,0 ± 0,2 19,0
HGB (%) 9,8 ± 0,3 9,0 ± 0,6 9,5 ± 0,3 9,6 ± 0,5 10,5
WBC (x103/ mm3) 14,6± 1,1 11,7 ± 0,7 14,7 ± 1,8 13,5 ± 1,1 21,5
Tabla 1. Parámetros hematológicos basales en los diferentes grupos de tratamiento (Control n=3; FFR-rFVIIa 0,1 mg/kg n=3; 0,5 mg/kg n=3; 1 mg/kg n=5; 2 mg/kg n=1).
GRUPO CONTROL FFR-rFVIIa 0,1 mg/kg
FFR-rFVIIa 0,5 mg/kg
FFR-rFVIIa 1 mg/kg
FFR-rFVIIa 2 mg/kg
AST (U/L) 23,6 ± 5,4 12,7 ± 2,2 29,7 ± 10,7 24,8 ± 7,2 57,0
ALT (U/L) 51± 7 33 ± 3 44 ± 7 39 ± 6 50
BUN (mg/dl) 11,2 ± 0,6 11,0 ± 0,9 7,7 ± 1,8 11,0 ± 0,9 7,1
Creatinina (mg/dl) 1,1 ± 0,1 0,9 ± 0,1 0,8 ± 0,1 0,8 ± 0,1 1,0
Proteínas Totales (g/dl) 5,2 ± 0,3 5,1 ± 0,4 4,4 ± 0,6 5,2 ± 0,3 3,7
Glucosa (mg/dl) 136 ± 20 121 ± 15 123 ± 29 114 ± 10 131
Tabla 2. Parámetros bioquímicos basales en los diferentes grupos de tratamiento (Control n=3; FFR-rFVIIa 0,1 mg/kg n=3; 0,5 mg/kg n=3; 1 mg/kg n=5; 2 mg/kg n=1).
TIEMPO DE PROTROMBINA
Los animales fueron tratados con diferentes dosis de FFR-rFVIIa (FFR-rFVIIa
0,1 mg/kg, n=3; FFR-rFVIIa 0,5 mg/kg, n=3; FFR-rFVIIa 1 mg/kg, n=5; FFR-rFVIIa 2
mg/kg, n=1) mediante una única administración intravenosa (i.v.). Se determinó el PT a
partir de sucesivas muestras sanguíneas obtenidas a diferentes tiempos a lo largo del
procedimiento experimental, en situación basal y a partir de los 15 minutos de
administrar FFR-rFVIIa (post-tto) (las determinaciones se realizaron entre el minuto 15
Resultados
117
y 130). En la Tabla 3 se muestran los valores medios de PT obtenidos en los diferentes
grupos de dosis. Todas la dosis de FFR-rFVIIa aumentaron significativamente el valor
medio de PT respecto a su valor basal (p<0,001), también se encontraron diferencias
significativas entre grupos de dosis (p<0,001). La evolución de los valores de PT a lo
largo del tiempo en los cuatro grupos se expone en la Figura 1, donde también se
aprecian las diferencias entre dosis.
GRUPO FFR-rFVIIa 0,1 mg/kg
FFR-rFVIIa 0,5 mg/kg
FFR-rFVIIa 1 mg/kg
FFR-rFVIIa 2 mg/kg
Periodo Basal Post-tto Basal Post-tto Basal Post-tto Basal Post-tto
PT (segundos) 13,5±0,2 17,8±0,4* 14,3±0,3 25,4±0,5*† 13,7±0,1 29,1±0,4*†‡ 14,2±0,1 43,5±0,7*†‡#
Tabla 3. Valores medios de PT obtenidos en los diferentes grupos de dosis en situación basal y a partir de los 15 minutos de la administración de FFR-rFVIIa (post-tto) (las determinaciones se realizaron entre el minuto 15 y 130) (FFR-rFVIIa 0,1 mg/kg, n=10; FFR-rFVIIa 0,5 mg/kg, n=9; FFR-rFVIIa 1 mg/kg, n=15; FFR-rFVIIa 2 mg/kg, n=3). * p< 0,05 vs. valor basal, † p< 0,05 vs. grupo tratado con la dosis de 0,1 mg/kg; ‡ p< 0,05 vs. grupo tratado con la dosis de 0,5 mg/kg y # p<0,05 vs. grupo tratado con la dosis de 1 mg/kg.
Figura 1. Evolución de los valores de PT a lo largo del tiempo en los diferentes grupos de dosis. El FFR-rFVIIa se administró en el minuto 0, y las determinaciones post-tratamiento se realizaron entre el minuto 15 y 130. El valor medio del PT en situación basal para cada grupo de dosis, aparece representado en el minuto 0.
0
10
20
30
40
50
60
0 0,25
0,5 0,75
1 1,25
1,5 1,75
2 2,25
Tiempo (minutos)
PT (s
egun
dos)
FFR-rFVIIa 0,1 mg/kg FFR-rFVIIa 0,5 mg/kg FFR-rFVIIa 1 mg/kg FFR-rFVIIa 2 mg/kg
0 30 60 90 120
Resultados
118
NIVELES PLASMÁTICOS DE FFR-rFVIIa
A partir de las mismas muestras de plasma utilizadas para la determinación del
PT, se determinaron los niveles de FFR-rFVIIa. Los valores medios en plasma de este
compuesto se muestran en la Tabla 4. Éstos fueron significativamente diferentes entre
grupos de dosis (p<0,001), y además se correlacionaron de manera positiva con la dosis
administrada (r2=0,936, p=0,0001). En la Figura 2 está representada la cinética del FFR-
rFVIIa y también se aprecian diferencias significativas entre grupos de dosis.
GRUPO FFR-rFVIIa 0,1 mg/kg
FFR-rFVIIa 0,5 mg/kg
FFR-rFVIIa 1 mg/kg
FFR-rFVIIa 2 mg/kg
Periodo Basal Post-tto Basal Post-tto Basal Post-tto Basal Post-tto
FFR-rFVIIa (ng/ml) 0 728±140* 0 3225±405*† 0 8032±1049*†‡ 0 14880±1911*†‡#
Tabla 4. Valores medios de FFR-rFVIIa en plasma obtenidos en los diferentes grupos de dosis en situación basal y a partir de los 15 minutos de la administración de FFR-rFVIIa (post-tto) (las determinaciones se realizaron entre el minuto 15 y 130) (FFR-rFVIIa 0,1 mg/kg, n=10; FFR-rFVIIa 0,5 mg/kg, n=9; FFR-rFVIIa 1 mg/kg, n=15; FFR-rFVIIa 2 mg/kg, n=3). * p< 0,05 vs. valor basal, † p< 0,05 vs. grupo tratado con la dosis de 0,1 mg/kg; ‡ p< 0,05 vs. grupo tratado con la dosis de 0,5 mg/kg y # p<0,05 vs. grupo tratado con la dosis de 1 mg/kg.
Figura 2. Cinética de los niveles plasmáticos de FFR-rFVIIa en los diferentes grupos de dosis. El FFR-rFVIIa se administró en el minuto 0, y las determinaciones post-tratamiento se realizaron entre el minuto 15 y 130. Los niveles de FFR-rFVIIa basales (< límite detección, ≈ 0) para cada grupo de dosis, aparecen representados en el minuto 0.
FFR-rFVIIa 0,1 mg/kg FFR-rFVIIa 0,5 mg/kg FFR-rFVIIa 1 mg/kg FFR-rFVIIa 2 mg/kg
0
5000
10000
15000
20000
25000
0 0 , 2 5 0 , 5 0 , 7 5 1 1 , 2 5 1 , 5 1 , 7 5 2 2 , 2 5
Tiempo (minutos)
FFR
-rFV
IIa
(ng/
ml)
0 30 60 90 120
Resultados
119
CORRELACIÓN ENTRE LOS NIVELES PLASMÁTICOS DE FFR-
rFVIIa Y EL TIEMPO DE PROTROMBINA
Como se ha demostrado en los apartados anteriores, el tratamiento con FFR-
rFVIIa afecta al tiempo de protrombina, indicador de la vía extrínseca (vía del TF) de la
cascada de la coagulación. En los grupos tratados con dosis mayores de este compuesto
se obtuvieron valores de PT más elevados. Como se aprecia en la Figura 3, se obtuvo
una correlación positiva y altamente significativa entre estos dos parámetros (r2= 0,82;
p=0,0001).
Figura 3. Correlación entre las concentraciones plasmáticas de FFR-rFVIIa y los valores de PT en los diferentes grupos de dosis (r2= 0,82; p=0,0001).
AGREGACIÓN PLAQUETAR EX VIVO
La agregación plaquetar ex vivo se estudió a partir de una muestra de sangre
obtenida en situación basal y a los 15 minutos de administrar FFR-rFVIIa (dosis de 0,5
y 1 mg/kg). Se evaluó la agregación plaquetar en sangre total inducida por colágeno y
en plasma rico en plaquetas (PRP) inducido por colágeno y ADP (Figura 4). Al
comparar los resultados obtenidos en situación basal y tras la administración de FFR-
PT (segundos)
FFR
-rFV
IIa
(ng/
ml)
0
4000
8000
12000
16000
20000
10 15 20 25 30 35 40 45 500
PT (segundos)
FFR
-rFV
IIa
(ng/
ml)
0
4000
8000
12000
16000
20000
10 15 20 25 30 35 40 45 500
Resultados
120
rFVIIa en cada grupo (0,5 mg/kg y 1 mg/kg), no se observaron diferencias en ningún
caso.
Figura 4. Agregación plaquetar ex vivo en los dos grupos de dosis antes (control) y después de la administración de FFR-rFVIIa (tratamiento) (FFR-rFVIIa 0,5 mg/kg, grupo A, n=3; FFR-rFVIIa 1 mg/kg, grupo B, n=4). Se estudió la agregación en sangre total a la que se añadió colágeno como agonista (A, B, C) y plasma rico en plaquetas (PRP) al que se agregó colágeno (D, E, F) o ADP (G, H, I). La agregación se expresa en términos de agregación máxima (A, D, G), velocidad de agregación o pendiente (B, E, H) y tiempo de latencia (C, F, I).
Control Grupo A Tratamiento Grupo A
Tratamiento Grupo BControl Grupo B
0
1
2
3
4
2 4 6 8 10 12
Concentración colágeno (mg/ml)
Tie
mpo
de
Lat
enci
a (m
in) C
0
10
20
30
40
50
2 4 6 8 10 12Concentración colágeno (mg/ml)
Agr
egac
ión
máx
ima
(ohm
ios)
0
2
4
6
8
2 4 6 8 10 12Concentración colágeno (mg/ml)
Pend
ient
e
0
20
40
60
80
100
2 7 12 17Concentración Cólageno (mg/ml)
Agr
egac
ión
máx
ima
(%)
0
20
40
60
80
100
2 7 12 17Concentración Cólageno (mg/ml)
Pend
ient
e
D E
A B
0
1
2
3
4
5
2 7 12 17Concentración Cólageno (mg/ml)
Tie
mpo
de
laté
ncia
(min
)
0
0,04
0,08
0,12
0,16
2 7 12 17
Concentración ADP (mM)
Tie
mpo
de
late
ncia
(min
)
F
0
20
40
60
80
100
2 7 12 17
Concentración ADP (mM)
Agr
egac
ión
máx
ima
(%)
0
20
40
60
80
100
2 7 12 17
Concentración ADP (mM)
Pend
ient
e (%
)
G H I
Colágeno µg/ml Colágeno µg/ml Colágeno µg/ml
Colágeno µg/ml Colágeno µg/ml
ADP µg/ml ADP µg/ml ADP µg/ml
Sangre Total Sangre Total Sangre Total
PRP PRP PRP
PRP PRP PRP
Resultados
121
TROMBO FORMADO SOBRE PARED VASCULAR LESIONADA
El efecto del FFR-rFVIIa sobre la trombosis se evaluó en dos tipos de substratos
vasculares, pared vascular sana y aterosclerótica. El tratamiento se aplicó de manera
sistémica (in vivo), mediante un único bolo intravenoso, y localmente (in vitro),
incubando los substratos vasculares con el fármaco. En los experimentos in vivo, se
realizaron perfusiones en situación basal (control) y tras la administración del fármaco
(a partir del minuto 15 hasta el minuto 130).
Trombo Formado sobre Pared Vascular Sana
El estudio de la trombosis desencadenada por pared vascular sana lesionada se
realizó administrando FFR-rFVIIa sistémica y localmente. En el estudio in vivo los
animales se dividieron en dos grupos según la dosis recibida (0,5 mg/kg, n=3; y 1
mg/kg, n=4). Un tercer grupo de animales sin tratar se utilizaron para el estudio in vitro
con FFR-rFVIIa (n=3).
Marcaje de las Plaquetas. Parámetros Hematológicos y de Coagulación
El marcaje de las plaquetas se realizó el día anterior al experimento de
trombosis. Los parámetros relacionados con el marcaje y el nivel de anticoagulación así
como los valores hematológicos (obtenidos durante el experimento) pueden condicionar
en gran medida los resultados del experimento de deposición plaquetar por lo que es
importante una valoración detallada de los mismos.
En la Tabla 5 se resumen los datos del marcaje, y en la Tabla 6 y 7 los valores
medios de coagulación y hematológicos durante los experimentos. En los parámetros de
marcaje no se encontraron diferencias entre los grupos experimentales. En lo que se
refiere a los parámetros hematológicos los valores oscilaron dentro del rango de
normalidad para la especie. En los dos grupos de tratamiento, se observó que el PT (%
respecto al basal) aumentó significativamente de forma dosis-dependiente entre el
Resultados
122
minuto 15 y 130 tras la administración de FFR-rFVIIa. El fibrinógeno y el aPTT no se
modificaron de manera relevante con el tratamiento. Los valores obtenidos en el grupo
control destinado al estudio in vitro con FFR-rFVIIa, fueron similares a los valores
basales de los grupos de tratamiento in vivo.
PARÁMETRO CONTROL FFR-rFVIIa 0,5 mg/kg
FFR-rFVIIa 1 mg/kg
Viabilidad de plaquetas (%) 98,5 ± 0,2 98,9 ± 0,4 97,5 ± 1,6 Eficiencia (%) 87 ± 6 90 ± 4 90 ± 3 Plaquetas inyectadas (x106) 9,1 ± 1,9 7,3 ± 0,9 9,8 ± 1,8 Dosis inyectada (µCi) 303 ± 68 280 ± 30 342 ± 36
Tabla 5. Resumen del marcaje de plaquetas en los tres grupos de tratamiento (Control, n=3; FFR-rFVIIa 0,5 mg/kg, n=3; FFR-rFVIIa 1 mg/kg, n=4).
PARÁMETRO FFR-rFVIIa 0,5 mg/kg
FFR-rFVIIa 1 mg/kg
Periodo Basal Post-tto Basal Post-tto aPTT (% basal) 261 ± 43 230 ± 8 304 ± 53 238 ± 26 PT (% basal) 96 ± 4 175 ± 15* 102 ± 5 211 ± 12*† Fibrinógeno (mg/dl) 180 ± 3 155 ± 4 179 ± 20 178 ± 18 RBC (x106/µl) 4,8 ± 0,2 5,5 ± 0,2 5 ± 0,2 5,4 ± 0,3 HCT (%) 26,6 ± 1,2 29,7 ± 0,8 26,7 ± 1,2 29,3 ± 0,8 PLT (x106/µl) 409 ± 65 383 ± 49 422 ± 34 419 ± 33
Tabla 6. Principales valores medios de coagulación y hematológicos obtenidos durante el experimento de deposición plaquetar en los dos grupos de tratamiento (FFR-rFVIIa 0,5 mg/kg, n=3; FFR-rFVIIa 1 mg/kg, n=4). * p< 0,05 vs. valor basal, ‡ p< 0,05 vs. grupo tratado con la dosis de 0,5 mg/kg .
PARÁMETRO Grupo control (tratamiento in vitro)
aPTT (% basal) 251 ± 33 PT (% basal) 93 ± 1 Fibrinógeno (mg/dl) 157 ± 5 RBC (x106/µl) 5,8 ± 0,1 HCT (%) 32,0 ± 0,3 PLT (x106/µl) 438 ± 60
Tabla 7. Principales valores medios de coagulación y hematológicos obtenidos durante el experimento de deposición plaquetar en el grupo control destinado al estudio del FFR-rFVIIa in vitro (n=3).
Resultados
123
Tratamiento in vivo
Se estudió el efecto inhibidor de FFR-rFVIIa sobre la formación y crecimiento
de un trombo mural sobre pared vascular sana con dos niveles de lesión: ligera, que
simula situaciones de erosión vascular, y severa, que simula situaciones de ruptura de la
integridad del vaso. Los experimentos se realizaron a alta (1700 s-1) y baja (212 s-1)
velocidad de cizalladura, prefundiendo durante 5 y 10 minutos.
Deposición Plaquetaria
Deposición Total
En el grupo control, se estudió la deposición plaquetaria sobre lesión vascular
ligera (Figura 5A) y severa (Figura 5B), en las dos velocidades de cizalladura. En los
dos tipos de lesión, la deposición fue significativamente mayor a alta velocidad de
cizalladura en vasos perfundidos durante 5 (lesión ligera, p<0,05; lesión severa,
p<0,005) y 10 minutos (lesión ligera p<0,005; lesión severa, p<0,01). Además, la
deposición plaquetaria sobre lesión severa aumentó significativamente con el tiempo de
perfusión (Figura 5B) (1700 s-1, p<0,005; 212 s-1, p<0,01). Los resultados obtenidos
muestran que la deposición plaquetaria sobre vasos erosionados (deendotelizados) es
relativamente baja y que no aumenta con el tiempo de perfusión si la velocidad de
cizalladura es baja. Por el contrario, sobre lesión severa la deposición es alta y crece
exponencialmente con el tiempo de perfusión.
La infusión de FFR-rFVIIa no tuvo efectos significativos sobre la deposición
plaquetaria en pared vascular erosionada, como se muestra en la Figura 6. Mientras que
la presencia de lesión vascular severa desencadenó un efecto trombótico que fue
inhibido por el tratamiento i.v. con FFR-rFVIIa (0,5 y 1 mg/kg). En la Figura 7 se
muestra que este compuesto inhibió significativamente la deposición de plaquetas a alta
(Figura 7A) (perfusiones 10 minutos, 1700 s-1, p<0,005) y a baja velocidad de
cizalladura (Figura 7B) (perfusiones 5 minutos, p<0,005; perfusiones 10 minutos,
p<0,005).
Resultados
124
Figura 5. Deposición plaquetar total sobre pared vascular con lesión vascular ligera (A) y severa (B) a alta y a baja velocidad de cizalladura (1700 s-1 y 212 s-1), en el grupo control (lesión ligera: 1700 s-1, 5 minutos, n=7; 212 s-1, 5 minutos, n=7; 1700 s-1, 10 minutos, n=7; 212 s-1, 10 minutos, n=7) (lesión severa: 1700 s-1, 5 minutos, n=14; 212 s-1, 5 minutos, n=14; 1700 s-1, 10 minutos, n=14; 212 s-1, 10 minutos, n=14). * p<0,05 respecto a 212 s-1; † p<0,05 vs. perfusiones de 5 minutos.
Figura 6. Deposición plaquetar total sobre pared vascular con lesión ligera (subendotelio) a alta (1700 s-
1) (A) y a baja velocidad de cizalladura (212 s-1) (B) durante 5 y 10 minutos, en los tres grupos de dosis (Control, n=7; FFR-rFVIIa 0,5 mg/kg, n=3; FFR-rFVIIa 1 mg/kg, n=4).
1700 s-1
212 s-1
0
5
10
15
20
25
0 5 10Tiempo de Perfusión (minutos)
DEP
OSI
CIÓ
N P
LAQ
UET
AR
IA(x
106 p
laqu
etas
/cm
2 )A
*
*
0
40
80
120
160
0 5 10Tiempo de Perfusión (minutos)
DEP
OSI
CIÓ
N P
LAQ
UET
AR
IA(x
106 p
laqu
etas
/cm
2 )
B
*
*†
†
0
10
20
30
40
50
0 5 10Tiempo de Perfusión (minutos)
DEP
OSI
CIÓ
N P
LAQ
UET
AR
IA(x
106 p
laqu
etas
/cm
2 )
A
ControlFFR-rFVIIa 0,5 mg/kgFFR-rFVIIa 1 mg/kg
B
0
10
20
30
40
50
0 5 10
Tiempo de Perfusión (minutos)
DEP
OSI
CIÓ
N P
LAQ
UET
AR
IA(x
106 p
laqu
etas
/cm
2 )
Resultados
125
Figura 7. Deposición plaquetar total sobre pared vascular con lesión severa (túnica media) a alta (1700 s-1) (A) y a baja velocidad de cizalladura (212 s-1) (B) durante 5 y 10 minutos, en los tres grupos de dosis (Control, n=14; FFR-rFVIIa 0,5 mg/kg, n=6; FFR-rFVIIa 1 mg/kg, n=8). * p<0,05 vs. grupo control.
Deposición Axial
Al analizar la deposición plaquetaria en los tres segmentos en que se dividió el
substrato (deposición axial) se obtuvo un patrón característico (segmento a > segmento
b > segmento c) la mayoría de las veces (Figura 8 y 9). Al igual que en los resultados de
deposición total, el FFR-rFVIIa no redujo significativamente la deposición axial sobre
lesión ligera en ninguno de los tiempos evaluados ni a alta ni a baja velocidad de
cizalladura (Figura 8). Por el contrario, sobre lesión severa FFR-rFVIIa redujo la
deposición axial a ambas velocidades de cizalladura a los 10 minutos (Figuras 9B y
9D), y a baja velocidad de cizalladura a los 5 minutos (Figura 9C), aunque la
significación no siempre se alcanzó en los tres segmentos axiales.
0
40
80
120
160
0 5 10Tiempo de Perfusión (minutos)
DE
POSI
CIÓ
N P
LA
QU
ET
AR
IA(x
106 p
laqu
etas
/cm
2 )
0
40
80
120
160
0 5 10Tiempo de Perfusión (minutos)
DEP
OSI
CIÓ
N P
LAQ
UET
AR
IA(x
106 p
laqu
etas
/cm
2 )A
*
*
ControlFFR-rFVIIa 0,5 mg/kgFFR-rFVIIa 1 mg/kg
B
* *
*
Resultados
126
Figura 8. Deposición plaquetar axial sobre pared vascular con lesión ligera a alta (A, B) y a baja velocidad de cizalladura (C, D), durante 5 (A, B) y 10 minutos (C, D) en los tres grupos de dosis.
0
5
10
15
20
Co n tro l FFR- rFVIIa0 . 5 mg /kg
FFR- rFVIIa 1mg / kg
DEP
OSI
CIÓ
N A
XIA
L (x
106 p
laqu
etas
/cm
2 )
B
0
15
30
45
60
Co n tro l FFR- rFVIIa0 . 5 mg /kg
FFR- rFVIIa 1mg /kg
DEP
OSI
CIÓ
N A
XIA
L (x
106 p
laqu
etas
/cm
2 )
C
0
10
20
30
40
Co n tro l FFR- rFVIIa FFR- rFVIIa 1
DEP
OSI
CIÓ
N A
XIA
L (x
106 p
laqu
etas
/cm
2 )A
0
5
10
15
Co n tro l FFR- rFVIIa0 . 5 mg / kg
FFR- rFVIIa 1mg /kg
DEP
OSI
CIÓ
N A
XIA
L (x
106 p
laqu
etas
/cm
2 )
D
5 minutos 10 minutos
1700
s-121
2 s-1
Segmento a Segmento b Segmento c
Control FFR-rFVIIa FFR-rFVIIa 0,5 mg/kg 1 mg/kg
Control FFR-rFVIIa FFR-rFVIIa 0,5 mg/kg 1 mg/kg
Control FFR-rFVIIa FFR-rFVIIa 0,5 mg/kg 1 mg/kg
Control FFR-rFVIIa FFR-rFVIIa 0,5 mg/kg 1 mg/kg
Resultados
127
Figura 9. Deposición plaquetar axial sobre pared vascular con lesión severa a alta (A, B) y a baja velocidad de cizalladura (C, D) durante 5 (A, B) y 10 minutos (C, D) en los tres grupos de dosis. * p<0,05 vs. grupo control en el segmento a, † p<0,05 vs. grupo control en el segmento b y ‡ p<0,05 vs. grupo control en el segmento c.
Correlación entre el Tiempo de Protrombina y los Niveles de FFR-rFVIIa en Plasma y
la Deposición Plaquetaria
En apartados anteriores pudimos ver que existe una relación entre la dosis
administrada de FFR-rFVIIa y el tiempo de protrombina (PT). Para comprobar si estos
parámetros también estaban relacionados con la deposición plaquetar, se realizó un
análisis de correlación estadístico para cada una de las condiciones de velocidad de
cizalladura, tiempo de perfusión y substrato desencadenante. No se encontró una
0
30
60
90
120
Co n tro l FFR- rFVIIa0 . 5 mg / kg
FFR- rFVIIa 1mg / kg
DEP
OSI
CIÓ
N A
XIA
L (x
106 p
laqu
etas
/cm
2 )
0
60
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180
240
300
Co n tro l FFR- rFVIIa0 . 5 mg / kg
FFR- rFVIIa 1mg /kg
DEP
OSI
CIÓ
N A
XIA
L (x
106 p
laqu
etas
/cm
2 )
0
20
40
60
80
Co n tro l FFR- rFVIIa0 . 5 mg /kg
FFR- rFVIIa 1mg /kg
DEP
OSI
CIÓ
N A
XIA
L (x
106 p
laqu
etas
/cm
2 )
0
10
20
30
40
50
Co n tro l FFR- rFVIIa0 . 5 mg / kg
FFR- rFVIIa 1mg /kg
DEP
OSI
CIÓ
N A
XIA
L (x
106 p
laqu
etas
/cm
2 )
* † ‡
B
C
A
D
* † ‡
‡ *
‡ † ‡ *
5 minutos 10 minutos
1700
s-121
2 s-1
Segmento a Segmento b Segmento c
Control FFR-rFVIIa FFR-rFVIIa 0,5 mg/kg 1 mg/kg
Control FFR-rFVIIa FFR-rFVIIa 0,5 mg/kg 1 mg/kg
Control FFR-rFVIIa FFR-rFVIIa 0,5 mg/kg 1 mg/kg
Control FFR-rFVIIa FFR-rFVIIa 0,5 mg/kg 1 mg/kg
Resultados
128
correlación significativa entre el PT y los niveles plasmáticos de FFR-rFVIIa y
deposición plaquetaria sobre lesión ligera en ningún caso (Tabla 8). La deposición
plaquetaria sobre pared vascular con lesión severa se correlacionó de manera inversa y
significativa con el PT y con los niveles de FFR-rFVIIa plasmáticos (Tabla 9).
Condiciones Subendotelio 5 min 1700 s-1
Subendotelio 5 min 212 s-1
Subendotelio 10 min 1700 s-1
Subendotelio 10 min 212 s-1
PARÁMETRO r2 p r2 p r2 p r2 p
PT (segundos) 0,002 0,86 0,06 0,38 0,006 0,8 0,04 0,47
FFR-rFVIIa (ng/ml) 0,02 0,66 0,005 0,81 0,002 0,87 0,2 0,11 Tabla 8. Correlación (r2) entre el PT (% respecto el basal) y los niveles de FFR-rFVIIa plasmáticos y deposición plaquetar sobre lesión ligera en las diferentes condiciones de velocidad de cizalladura y tiempo de perfusión (n=14 en todas las condiciones).
Condiciones Túnica Media 5 min 1700 s-1
Túnica Media 5 min 212 s-1
Túnica Media 10 min 1700 s-1
Túnica Media 10 min 212 s-1
PARÁMETRO r2 p r2 p r2 p r2 p
PT (segundos) 0,05 0,25 0,24 0,008 0,21 0,014 0,26 0,007
FFR-rFVIIa (ng/ml) 0,05 0,25 0,21 0,013 0,23 0,011 0,114 0,08 Tabla 9. Correlación (r2) entre el PT (% respecto el basal) y los niveles de FFR-rFVIIa plasmáticos y deposición plaquetar sobre lesión severa en las diferentes condiciones de velocidad de cizalladura y tiempo de perfusión (n=28 en todas las condiciones).
Composición del Trombo
El análisis de la composición del trombo se realizó en el segmento central de los
substratos perfundidos (segmento axial b) procedentes del grupo control y del grupo
tratado con la dosis de 1 mg/kg de FFR-rFVIIa. La fibrina y las plaquetas presentes en
el trombo se detectaron mediante tinción inmunohistoquímica. En el grupo control, los
trombos formados sobre lesión severa, tanto a alta como a baja velocidad de cizalladura,
estaban formados por una capa de fibrina sobre la cual estaban depositadas las plaquetas
formando agregados. Sin embargo, en el grupo tratado con FFR-rFVIIa se observaron
algunos agregados de plaquetas, pero la cantidad de fibrina estaba muy reducida (Figura
10). Los trombos formados sobre lesión ligera estaban formados por plaquetas
depositadas directamente sobre el subendotelio sin formar agregados y sin
prácticamente presencia de fibrina (Figura 11).
Resultados
129
Figura 10. Trombos formados sobre lesión severa a alta (A,C) y baja velocidad de cizalladura (B, D), en el grupo control (A, B) y en el grupo tratado con FFR-rFVIIa 1 mg/kg (C,D). Las plaquetas aparecen teñidas en rojo y la fibrina en verde (x200 aumentos).
Figura 11. Trombos formados sobre lesión ligera a alta (A,C) y baja velocidad de cizalladura (B, D), en el grupo control (A, B) y en el grupo tratado con FFR-rFVIIa 1 mg/kg (C,D). Las plaquetas aparecen teñidas en rojo (x200 aumentos).
A
L
C
L
L
B
D
L
A
C
L
L
DL
B
L
Resultados
130
Cuantificación de la Fibrina Presente en el Trombo
La deposición de fibrina se evaluó semicuantitativamente mediante un programa
de análisis de imagen. Estas determinaciones se realizaron en los trombos formados
sobre lesión severa, ya que sobre subendotelio sólo se observó deposición de plaquetas.
En la Figura 12 se muestra la deposición de fibrina en el grupo control, a alta y a baja
velocidad de cizalladura, a lo largo del tiempo, y se aprecia que es dependiente del
tiempo. Sin embargo, a diferencia de la deposición plaquetaria, la deposición de fibrina
no resultó afectada por la velocidad de cizalladura, ya que la evolución en el tiempo fue
similar en los dos casos. La Figura 13 compara los resultados obtenidos en el grupo
control y en el grupo tratado con 1 mg/kg de FFR-rFVIIa. La deposición fue inferior en
este último grupo a ambas velocidades de cizalladura, pero esta diferencia sólo fue
significativa a los 10 minutos a 1700 s-1 (p<0,05). Al no observarse diferencias entre
velocidades de cizalladura, se analizaron conjuntamente todos los datos y el resultado se
muestra en la Figura 14. Igualmente, la cantidad de fibrina fue inferior en el grupo
tratado con FFR-rFVIIa respecto al grupo control en ambos tiempos de perfusión,
aunque sólo se halló significación a los 10 minutos (p<0,01).
Figura 12. Deposición de fibrina sobre pared vascular con lesión vascular severa en el grupo control a alta (1700 s-1) y a baja velocidad de cizalladura (212 s-1) (5 minutos, 1700 s-1, n=3, 212 s-1, n=3; 10 minutos, 1700 s-1, n=3; 212 s-1, n=3).
1700 s-1
212 s-1
0
1500
3000
4500
6000
0 5 10
Tiempo de Perfusión (minutos)
DE
POSI
CIÓ
N F
IBR
INA
(mic
ras2 )
Resultados
131
Figura 13. Deposición de fibrina sobre pared vascular con lesión vascular severa a alta (1700s-1 ) (A) y a baja velocidad de cizalladura (212 s-1) (B) en el grupo control (5 minutos, 1700 s-1, n=3; 212 s-1, n=3; 10 minutos, 1700 s-1, n=3; 212 s-1, n=3) y en el grupo tratado con 1 mg/kg FFR-rFVIIa (5 minutos, 1700 s-1, n=2, 212 s-1, n=3; 10 minutos, 1700 s-1, n=3, 212 s-1, n=2). * p<0,05 vs. grupo control.
Figura 14. Deposición de fibrina sobre pared vascular con lesión vascular severa en ambas velocidades de cizalladura durante 5 y 10 minutos en el grupo control (5 minutos, n=6, 10 minutos, n=5) y en el grupo tratado con 1 mg/kg de FFR-rFVIIa (5 minutos, n=5, 10 minutos, n=5). * p<0,05 vs. grupo control.
Control
FFR-rFVIIa 1 mg/kg
*
A B
0
1500
3000
4500
6000
0 5 10Tiempo de Perfusión (minutos)
DE
POSI
CIÓ
N F
IBR
INA
(mic
ras2 )
0
1500
3000
4500
6000
0 5 10Tiempo de Perfusión (minutos)
DE
POSI
CIÓ
N F
IBR
INA
(mic
ras2 )
0
1500
3000
4500
6000
5 minutos 10 minutos
DEP
OSI
CIÓ
N F
IBR
INA
(micr
as2 )
*
Control FFR-rFVIIa 1 mg/kg
Resultados
132
Tratamiento in vitro
Una vez evaluado el efecto del tratamiento sistémico con FFR-rFVIIa sobre la
trombosis, se evaluó la deposición plaquetaria sobre substratos tratados localmente con
este compuesto para determinar si el TF, al que se une el FFR-rFVIIa, se encontraba en
la pared vascular. Para ello se trataron substratos vasculares sanos y se perfundieron con
sangre procedente de animales control (n=3). Se perfundieron substratos con lesión
vascular ligera y severa, a alta y a baja velocidad de cizalladura durante 5 minutos.
Deposición Plaquetaria
La Figura 15A muestra la deposición plaquetaria al perfundir con sangre no
tratada pared vascular sana con lesión ligera, a alta y baja velocidad de cizalladura. La
deposición fue menor en pared vascular tratada con FFR-rFVIIa respecto a la tratada
con suero fisiológico (control) cuando se perfundió a alta velocidad de cizalladura, pero
no se encontraron diferencias significativas. A baja velocidad de cizalladura la
deposición fue similar en los dos grupos de substratos. Tampoco se hallaron diferencias
significativas en pared vascular sana con lesión severa (Figura 15B).
Figura 15. Deposición plaquetar total sobre pared vascular sana con lesión vascular ligera (A) y severa (B) a alta y a baja velocidad de cizalladura (1700s-1 y 212 s-1) tratada localmente con suero fisiológico (control) (1700 s-1, n=13; 212 s-1, n=11) y con FFR-rFVIIa (2 mg/ml) (1700 s-1, n=12; 212 s-1, n=10).
0
25
50
75
100
1700 s-1 212s-1
DEP
OSI
CIÓ
N P
LAQ
UET
AR
IA (x
106 p
laqu
etas
/cm
2 )
0
5
10
15
20
Control FFR-rFVIIa 2mg/kg
DEP
OSI
CIÓ
N P
LAQ
UET
AR
IA (x
106 p
laqu
etas
/cm
2 )
Control FFR-rFVIIa 2 mg/ml
1700 s-1 212 s-1 1700 s-1 212 s-1
A B
Resultados
133
Localización de Factor Tisular en los Substratos Vasculares y en el Trombo
A partir de los mismos substratos destinados al estudio de la trombosis, se
realizó el estudio de la presencia de TF (inmunohistoquímica) en el trombo, así como en
las diferentes estructuras de la pared vascular expuestas a la circulación sanguínea.
Tanto en el grupo control como en el tratado con FFR-rFVIIa (1 mg/kg), el trombo
formado sobre subendotelio (lesión ligera) no presentaba TF (Figura 16A y 16B),
mientras que el trombo formado sobre túnica media (lesión severa) era altamente
positivo para TF (Figuras 16C y 16D). Además, al evaluar los mismos substratos con
lesión severa teñidos por inmunofluorescencia para detección de fibrina (Figura 16E y
16F), se halló colocalización de ésta con TF. En la pared vascular no se encontró
prácticamente marcaje de TF.
Resultados
134
Figura 16. Micrografías de pared vascular con lesión vascular ligera (A y B) y severa (C, D, E y F) en el grupo control (A, C y E) y tratado con 1 mg/kg de FFR-rFVIIa (B, D y F) que se perfundieron en las cámaras de perfusión (x400 aumentos). En color marrón oscuro aparece el factor tisular, que se encuentra en el trombo formado sobre lesión severa, y en verde (inmunofluorescencia) la fibrina que colocaliza con el factor tisular del trombo. L, indica lumen; M, túnica media; S, subendotelio; T, trombo; TF, factor tisular; y Fb, fibrina.
L
A
M
S
B
M L
S
C
M L
T TF
D
M
L
T
TF
F
M
L
Fb
E
M
L
Fb
Resultados
135
Actividad Procoagulante del Factor Tisular Circulante
Para determinar la presencia de TF potencialmente activo en la sangre y el efecto
del FFR-rFVIIa sobre éste, se determinó su actividad procoagulante en extractos de
membranas celulares y vesículas obtenidos a partir de sangre de los grupos control y
tratado con 1 mg/kg de FFR-rFVIIa. También se determinó la actividad del TF en
extractos de sangre control incubados con solución HBSA (control) y 0,0125 mg/ml de
FFR-rFVIIa.
La Figura 17 muestra los resultados de actividad procoagulante del TF en
sangre. Se halló actividad del TF en ambos grupos, y el tratamiento tanto in vivo como
in vitro la inhibió significativamente (Figura 17A, p<0,005; Figura 17B, p<0,0001). La
inhibición fue mucho más acusada en el tratamiento in vitro (88%) que en el tratamiento
in vivo (25%).
Figura 17. Actividad procoagulante del factor tisular (TF) en extractos de sangre total en el grupo control (n=9) y el grupo tratado con 1 mg/kg de FFR-rFVIIa (n=9) (A), y en extractos de sangre total del grupo control incubados in vitro con solución HBSA (control, n=5) y con FFR-rFVIIa (0,0125 mg/ml, n=5) (B).
A B
*
* 0
50
100
150
Control FFR-rFVIIa1mg/kg
AC
TIV
IDA
D P
RO
CO
AG
UL
AN
TE
TF
(%)
0
50
100
150
Control FFR-rFVIIa0,0125 mg/ml
AC
TIV
IDA
D P
RO
CO
AG
UL
AN
TE
TF
(%)
Resultados
136
Trombo Formado sobre Pared Vascular Aterosclerótica
Debido a que no se halló prácticamente TF en la pared vascular sana, se evaluó
el efecto del FFR-rFVIIa sobre la trombosis desencadenada por pared vascular
aterosclerótica (humana), que contiene gran cantidad de TF. El tratamiento se realizó de
manera sistémica. En función de los resultados obtenidos sobre pared vascular sana, se
eligió la dosis de 1 mg/kg (n=4), pero además se evaluó una dosis superior, 4 mg/kg
(n=1), debido a la mayor presencia de TF en la zona de formación del trombo. Se
realizaron perfusiones de 10 minutos a alta y baja velocidad de cizalladura.
Marcaje de las Plaquetas. Parámetros Hematológicos y de Coagulación
En las Tablas 10 y 11 se resumen los datos del marcaje de coagulación y
hematológicos durante los experimentos. Todos los valores, exceptuando el PT, se
hallaron dentro de los intervalos de normalidad y se produjeron modificaciones
significativas debidas al tratamiento. Como ya se ha comentado en apartados previos, el
PT (% respecto al basal) aumentó significativamente (entre el minuto 15 y 130) tras la
administración de FFR-rFVIIa.
PARÁMETRO FFR-rFVIIa 1 mg/kg
FFR-rFVIIa 4 mg/kg
Viabilidad de plaquetas (%) 96,7 ± 0,2 97,6
Eficiencia (%) 97,2 ± 0,2 98,0
Plaquetas inyectadas (x106) 7,4 ± 0,8 7,1
Dosis inyectada (µCi) 252 ± 1 250 Tabla 10. Resumen del marcaje de plaquetas en los grupos de tratamiento (FFR-rFVIIa 1 mg/kg, n=4; FFR-rFVIIa 4 mg/kg, n=1).
Resultados
137
PARÁMETRO FFR-rFVIIa 1 mg/kg
FFR-rFVIIa 4 mg/kg
Periodo Basal Post-tto Basal Post-tto aPTT (% basal) 181 ± 25 174 ± 3 122 ± 1 162 ± 1 PT (% basal) 92 ± 2 171 ± 3* 78 ± 1 168 ± 3* Fibrinógeno (mg/dl) 205 ± 10 147 ± 9 144 ± 3 139 ± 2 RBC (x106/µl) 4,6 ± 0,1 4,8 ± 0,1 4,8 ± 0,1 4,8 ± 0,1 HCT (%) 25,5 ± 0,4 24,2 ± 1,0 26,5 ± 0,6 26,1 ± 0,2 PLT (x106/µl) 387 ± 16 393 ± 8 487 ± 14 461± 2
Tabla 11. Principales valores medios de coagulación y hematológicos obtenidos durante el experimento de deposición plaquetar en los grupos de tratamiento (FFR-rFVIIa 1 mg/kg, n=4; FFR-rFVIIa 4 mg/kg, n=1). * p< 0,05 vs. valor basal.
Tratamiento in vivo
Deposición Plaquetaria
Las Figuras 18 y 19 muestran la deposición total y axial obtenidas tras exponer
pared vascular aterosclerótica a la circulación sanguínea en los tres grupos de
tratamiento. Se halló una gran variabilidad en los valores causada por la heterogeneidad
de las lesiones ateroscleróticas expuestas. Por ello, a pesar de las tendencias descritas no
se obtuvo significación estadística en todos los casos.
En condiciones de alta velocidad de cizalladura, se observó una tendencia a una
menor deposición plaquetaria, sobretodo con la dosis de 4 mg/kg (Figura 18A). Al
realizar el análisis de la deposición axial se observó una tendencia más acusada con
ambas dosis, incluso se obtuvo significación estadística en algunos segmentos
(segmento b en el grupo tratado con 1 mg/kg, y segmento c en el grupo tratado con 4
mg/kg) (Figura 18B). A baja velocidad de cizalladura, ambas dosis inhibieron la
deposición plaquetaria respecto al control, aunque sólo la dosis de 4 mg/kg lo hizo de
manera significativa (p<0,05) (FFR-rFVIIa 1 mg/kg, p=0,07). Este efecto inhibitorio
también se observó en la deposición axial, sobretodo en los segmentos b y c (Figura
19B). El patrón típico de la deposición axial (segmento a > segmento b > segmento c)
sólo se cumplió en algunos casos, sobretodo en condiciones de alta velocidad de
cizalladura (Figuras 18B y 19B).
Resultados
138
Figura 18. Deposición plaquetar total (A) y axial (B) sobre pared vascular aterosclerótica a alta velocidad de cizalladura (1700 s-1), en los tres grupos de dosis (Control, n=19; FFR-rFVIIa 1 mg/kg, n=14; FFR-rFVIIa 4 mg/kg, n=6). Gráfica A: * p<0,05 vs. grupo control; Gráfica B: * p<0,05 vs. grupo control en el segmento a, y ‡ p<0,05 vs. grupo control en el segmento c.
Figura 19. Deposición plaquetar total (A) y axial (B) sobre pared vascular aterosclerótica a baja velocidad de cizalladura (212 s-1), en los tres grupos de dosis (Control, n=19; FFR-rFVIIa 1 mg/kg, n=14; FFR-rFVIIa 4 mg/kg, n=8). Gráfica A: * p<0,05 vs. grupo control; Gráfica B: ‡ p<0,05 vs. grupo control en el segmento c.
‡
0
100
200
300
400
Control FFR-rFVIIa1 mg/kg
FFR-rFVIIa4 mg/kg
DE
POSI
CIÓ
N P
LA
QU
ET
AR
IA
(x10
6 pla
quet
as/c
m2 )
Segmento cSegmento a Segmento b
0
100
200
300
400
Control FFR-rFVIIa1 mg/kg
FFR-rFVIIa4 mg/kg
DE
PO
SIC
IÓN
PL
AQ
UE
TA
RIA
(x
106
plaq
ueta
s/cm
2 )
*
A B
0
100
200
300
400
Control FFR-rFVIIa1 mg/kg
FFR-rFVIIa4 mg/kg
DE
POSI
CIÓ
N P
LA
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ET
AR
IA
(x10
6 pla
quet
as/c
m2 )
A B
‡
Segmento cSegmento a Segmento b
0
100
200
300
400
Control FFR-rFVIIa1 mg/kg
FFR-rFVIIa4 mg/kg
DE
PO
SIC
IÓN
PL
AQ
UE
TA
RIA
(x
106
plaq
ueta
s/cm
2 )
*
Resultados 139
Cuantificación de la Fibrina Presente en el Trombo
Se seleccionaron subtratos (segmento axial b) representativos de cada grupo, se
localizó la fibrina mediante inmunohistoquímica y se cuantificó (análisis de imagen). La
Figura 20 muestra la deposición de fibrina en los tres grupos. Tanto a alta como a baja
velocidad de cizalladura las dosis de 1 y 4 mg/kg de FFR-rFVIIa inhibieron
significativamente la fibrina depositada en sobre los substratos ateroscleróticos (1700 s-
1, p<0,05; 212 s-1, p<0,05).
Figura 20. Deposición de fibrina sobre pared vascular aterosclerótica a alta (1700 s-1) (A) y baja (212 s-1) (B) velocidad de cizalladura, en los tres grupos de dosis (Control, n=4; FFR-rFVIIa 1 mg/kg, n=4; FFR-rFVIIa 4 mg/kg, n=4). * p<0,05 vs. grupo control.
A B
* * * *
0
10000
20000
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40000
Control FFR-rFVIIa1 mg/kg
FFR-rFVIIa4 mg/kg
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INA
(mic
ras
2 )
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Control FFR-rFVIIa1 mg/kg
FFR-rFVIIa4 mg/kg
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2 )
