Upload
daktari
View
50
Download
2
Embed Size (px)
DESCRIPTION
Transzl áció prokariótákban. 30S. 30S *. ( 30S + IF1, IF2, IF3, fMet-tRNS Met ). k 1. ( preiniciációs komplex). 30S * + mRNA. PK. k -1. k 2. ( iniciációs komplex). PK. IK. k -2. k 3. ( transzlációs komplex). IK. TK. A transzláció hatékonyságát meghatározó elemek. - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
Transzláció prokariótákban
A transzláció hatékonyságát meghatározó elemek
30S 30S*
30S* + mRNA PKk1
k-1
PKk2
k-2
IK
IK TKk3
( 30S + IF1, IF2, IF3, fMet-tRNSMet)
( preiniciációs komplex)
( iniciációs komplex)
( transzlációs komplex)
K1 nagy, ha az SD és a rRNS közti kölcsönhatás erős.
k2 a SD és a transzlációs start kodon közti távolság,
és a régió másodlagos szerkezetének függvénye.
A transzláció hatékonyságát meghatározó elemektechnikai megközelítés
Shine - Dalgarno szekvencia
GGAGG a tökéletes komplementer a 16S rRNS 3'végéhez,
pl. GAAG GGAG mutáció (maltóz operon) 10 x növekedés a termék mennyiségében
a SD szekvencia hosszának növelése nem feltétlenül növeli a transzlációtHasonlóan a promóterekhez, túl erős kötődés a SD szekvencia és a 16S rRNS 3’ vége között a transzlációt gátolhatja.
Transzlációs start kodon
kodon gyakoriság
AUG 91 %
GUG 8 %
UUG 1 %
Az AUG előtti szekvenciák
20x-os különbség
UAU, CUU >> UUC, UCA, AGG ("-1 triplet)
G-k kerülendők
Az AUG utáni szekvenciák
30x -oskülönbségek lehetnek
AAA(Lys) > AAG(Lys) > UUU(Phe), AUC/A(Val), GUA(Ala)...
A természetes gének között is az AAA(Lys) és GCU(Ala)
transzlációs szabályozás a 2. kodonnal
+10 régió AT gazdag
Távolság a start kodon és a SD között
- meglehetősen érzékeny, általban 4 - 13 bázispár megengedett.
- Génfüggő, egy gén esetén általában csak kicsit változhat.
A köztes szekvencia összetétele
“A” jó, ha van (2x-es stimulus), “C” mindegy
“U” a "-4"-es pozícióban hatékony “G” gátol (3x-os
gátlás)Upstream nemtranszlálódó szekvencia
Nem nagyon vizsgált, de kell, mert eltávolítása megszünteti a transzlációt (ld lac).
Minimum 10 bp kell. Esetleg valamilyen faktorok kötődnek hozzá.
Kodon felhasználási preferencia
Bár a kodonok gyakorlatilag univerzálisak,
a különböző sejtféleségek különböző gyakorisággal használják
az azonos aminosavakat kódoló tripleteket.
Ha a termeltetendő fehérje génjének kodon használata
nagyon eltér a gazdasejtétől, akkor meg kell szintetizáltatni a gént
a gazda sejt preferenciájának megfelelően.
Alternatív megoldás: a gazdasejt kodon preferenciájának megváltoztatása,
ritka kodonokhoz tartozó tRNS gének bevitelével
[gbbct]: 50 CDS's (13879 codons)
Sphingomonas paucimobilis
AmAcid Codon Number /1000 Fraction Gly GGG 208.00 14.99 0.17 Gly GGA 70.00 5.04 0.06 Gly GGT 117.00 8.43 0.10 Gly GGC 827.00 59.59 0.68 Glu GAG 476.00 34.30 0.60 Glu GAA 318.00 22.91 0.40 Asp GAT 297.00 21.40 0.35 Asp GAC 558.00 40.20 0.65 Val GTG 386.00 2 7.81 0.43 Val GTA 40.00 2.88 0.04 Val GTT 65.00 4.68 0.07 Val GTC 412.00 29.69 0.46 Ala GCG 630.00 45.39 0.40 Ala GCA 142.00 10.23 0.09 Ala GCT 108.00 7.78 0.07 Ala GCC 687.00 49.50 0.44 Arg AGG 35.00 2.52 0.04 Arg AGA 12.00 0.86 0.01 Ser AGT 24.00 1.73 0.04 Ser AGC 232.00 16.72 0.3 Lys AAG 465.00 33.50 0.86 Lys AAA 76.00 5.48 0.14 Asn AAT 151.00 10.88 0.37 Asn AAC 252.00 18.16 0.63
Met ATG 376.00 27.09 1.00 Ile ATA 19.00 1.37 0.03 Ile ATT 117.00 8.43 0.17 Ile ATC 570.00 41.07 0.81 Thr ACG 228.00 16.43 0.33 Thr ACA 29.00 2.09 0.04 Thr ACT 41.00 2.95 0.06 Thr A CC 383.00 27.60 0.56 Trp TGG 250.00 18.01 1.00 End TGA 37.00 2.67 0.74 Cys TGT 21.00 1.51 0.11 Cys TGC 167.00 12.03 0.89 End TAG 5.00 0.36 0.10 End TAA 8.00 0.58 0.16 Tyr TAT 213.00 15.35 0.56 Tyr TAC 170.00 12.25 0.44 Leu TTG 71.00 5.12 0.06 Leu TTA 4.00 0.29 0.00 Phe TTT 8 6.00 6.20 0.14 Phe TTC 542.00 39.05 0.86 Ser TCG 204.00 14.70 0.31
Kodon felhasználási preferencia – táblázat
egy adott gén esetén a kodon preferencia alapján a gén E. coli-ban,vagy élesztőben való expresszálhatósága in silico becsülhető.
STOP kodonSTOP kodon
UAA
UGA
UAG
kötődő faktor
RF1, RF2
RF1
RF2
UAA >> UGA, UAG
Az esetek 80 %-ában:UAAU
KÉT CISZTRONOS EXPRESSZIÓS RENDSZER
1 Cisztronos rendszer
ATG struktúrgén
5’ 3’
SD
mRNS
2 Cisztronos rendszer termeltetendő fehérje
2. STOP
1. STOP
ATG 1. cisztron5’ 3’
1. SD
ATG 2. cisztron
2. SDmRNS
STOP
Az 1. cisztron tetszőlegesen tervezhetú, de:- ne legyen túl hosszú, hogy ne terhelje feleslegesen a sejtet (felesleges műtermék) néhány aminosav- AT gazdag legyen a másodlagos struktúrák elkerülése végett.
1 Cisztronos rendszer
ATG struktúrgén
5’ 3’
SD
mRNS
2 Cisztronos rendszer termeltetendő fehérje
2. STOP
1. STOP
ATG 1. cisztron5’ 3’
1. SD
ATG 2. cisztron
2. SDmRNS
STOP
Az 1. cisztron STOP kodon pozíciója a 2. cisztron Shine-Dalgarno szekvenciájához
képest meghatározó a transzláció hatékonysága szempontjából.
PÉLDA bGH (marha növekedési hormon)Egy cisztronos rendszerben < 0.4 % fehérjeKét cisztronos rendszerben 1. cisztron ...GGAGGAATAACATATG...2. cisztron.elrendeződésben 24 % fehérje termeltethető
Kifordított – antiriboszómális kötőhelyen alapuló - rendszer
PROTEOLÍZIS
Abnormális fehérjék proteolitikus lebontási mechanizmusa
E. coli-ban
Abnormális fehérjék,sejten belüli
aggregátumok ATP függő endoproteázok
polipeptidek< 1500 Da
endoproteázok
peptidek aminosavak
oldékony mono-, di- és tripeptidázok
La (Lon) a fő ATP függő proteáz
87 kDa egységekből felépülő homotetramer,
ATP és Mg2+ függő, az ATP-áz aktivitás nem a polipeptid kötés
felbontásához, hanem a degradálandó fehérjén való végiglovagláshoz kell,
in vitro 2 ATP/ peptidkötés, in vivo ez változhat, és ennél nagyobb.
hasonló fehérjék előfordulnak magasabbrendűekben is, pl. egy máj
mitondriális proteáz immunológiailag keresztreaktív
abnormális fehérjék, és rövid élettartamú (pl. szabályozó fehérjék bontása)
szerin proteáz, hidrofób jellegű szekvenciáknál hasít
alapállapotban inaktív, a szubsztrát fehérje hozzákapcsolódása aktiválja,
a lon gén terméke, és a sokk fehérjékhez kapcsolódó szabályozás alatt áll:
32 faktor, ami a htpR (rpoH) gén terméke
inaktív proteáz(4 ADP)
proteinszubsztrát
4 ADP
4 ATP - Mg2+
alloszterikus aktiválásaktív proteáz
(4 ATP)
4 PO43-
4 Mg 2+
Proteolitikus ciklus
Genetikai vonatkozások
léteznek inszerciós, deléciós lon mutánsok
A lon- mutáció másodlagos hatásai Poliszaharid burok képzés (főleg alacsonyabb hőmérsékleten, mint 34oC)Megoldás:
37oC-on növeszteni galE struktúrgének inaktiválása cps (capsule) struktúrgének inaktiválása rcsB, rcsA szabályozó régió mutánsok
A lon mutánsok UV érzékenyek
DNS sérülés filamentációGazdag médiumon akár letális is lehetok: SOS indukálható sejtosztódás inhibitor SulA.
Megoldás:- ne használjunk yeast extraktot, hanem tryptont- sulA mutánsok
Ti (Clp) a másik ATP függő proteáz
81 (ClpA) és 21 kDa (ClpP) alegységekből álló heterodimer,ez multimerizálódik, a natív enzim kb 700 kDa móltömegű
ATP és Mg2+ faktorok szükségesekhidrofób részeknél hasít, de a specificitás eltér a La-tól
az alegységek külön multimerizálódnak
HtpR szabályozás alatt áll
Tulajdonság Ti (Clp) proteáz ClpP ClpA
aktivitás fehérje degradációATP hidrolízis mellett
peptidázATP független
ATP-ázfehérje aktivált
Kofaktor Mg2+ - Mg2+
Inhibítor MalNEt, iPr2P-F iPr2P-F MalNEt
Stabilizálás ATP, glicerin hőstabil ATP, glicerin
natív méret 700 kDa 260 kDa 160 kDa
alegységek 6 ClpA + 12 ClpP 21 kDa 81 kDa
Genetikai vonatkozások
Rendelkezésre állnak clp mutánsok
a mutáns egyedül nem, de a lon- nal együtt hatékony
Egyéb proteázok
OmpT külső membránhoz kapcsolódó proteáz
DegP periplazmatikus proteáz T4 fág fertőzés stabilizálja a fehérjéket
pin gén terméke: La inhibitor
E. coli törzs genotípus Kiindulási törzs Megjegyzés
lon mutánsok
SG1117 gal lac lon-146::Tn10 leu
sup+ rec+ HB101 Tetraciklin
rezisztens, jól transzformálható
SG12041 gal, lon-510 sulA recA C600 nincs filamentációRec-
lon htpR mutánsok
SG21163 lon-510 supFts htpRam165 MC4100 hőmérséklet érzékeny
lon clp mutánsok SG12044 gal lon-510 sulA
clpA319::kan C600 kanamycin
rezisztens
lon clp htpR mutánsok
SG21173 lon-510 supFts htpRam165 clpA319::kan lac
MC4100 kanamycin rezisztens,
hőmérséklet érzékeny
Példák proteázaikban mutáns E. coli törzsekre
FÚZIÓS FEHÉRJÉK
A fúziót gén szinten hozzuk létre úgy, hogy a fúziós partnerek génjeit
a megfelelő leolvasási keretben úgy klónozzuk össze,
hogy az 5’ vég felőli génhez tartozó transzlációs stop kodon ne szerepeljen.
Így egy polipeptidláncot kapunk, amelyben a kiinduási fehérjék egymást
követő régiókként helyezkednek el.
ELŐNYEI
1. Kis peptidek esetén a fúzió proteolitikus stabilitást jelenthet 2. Óriási előny a tisztítás során, affinitás oszlopok 3. szignálpeptiddel való fúzió, szekretált fehérje (limitált) 4. Az in vitro hasítás sokszor pontosabb,
intaktabb N-terminális szekvenciát eredményez
Oldhatatlan
"iclusion bodies"trpEII, vagy cII,
nincs proteolízis, differenciális centrifugálással az "inclusion body" könnyen tisztítható,
probléma: nem aktív fehérjepl sometostatin, inzulin A, B,
ellenanyag termelés
Oldható forma
biológiailag aktív fehérje,
affinitás oszlopon való tisztítás
problémák a stabilitással,
kevésbé jósolható
Fúziós fehérjék oldhatósága
Egyéb hasznosítási lehetőségek
1. a szignál peptidekkel való fúzió előnyei (ld. később)
a periplazmában, illetve az extracelluláris térben oxidatívabb környezet,diszulfid hidak kialakulása, pl. EGF, IGF
A periplazmában az összfehérje 4%-a található, értelemszerűenkevesebb proteáz,könnyebb tisztítás
2. A fúzionált fehérje linkerként szolgál, és így a kívánt fehérje immobilizálható
3. funkcionális, struktúrális vizsgálatok, pl. immunológiai felhasználásalkalmasan választott fúziós partner esetén nincs szükség hasításra.
4. megfelelő hasítás után az intakt fehérje tetszőleges biokémiai, biofizikai vizsgálata
A fúziós fehérjék tisztításának elve
I. 1. affinitás kromatográfia
II. hasítás III. 2. affinitás kromatográfia
tiszta fehérje
fúziós partner
célfehérje
A fúziós fehérjék típusai I.
I. Szekréció
S XTP
Megjegyzés
pl. humán növekedési hormonalkalikus foszfatáz szignál
szekvenciával
II. Polimerizáció
X X
TP fehérje-élettartam növekedés,pl. proinzulin 1-2 percről 60 perc,
IGF 200x-os növekedés
III. C-terminális fúzió
A X
TP a fúziós partner intakt szabályozó régiója használható, pontosabb proteolitikus hasítás
IV. N-terminális fúzió
X BTP amino terminális szekvenciák
meghatározása, a proteolititkus hasítás csonkot hagyhat a “B” N-terminálisán
A fúziós fehérjék típusai II.
V. A szekréció és a C-terminális fúzió kombinációja
A XS
TPa termék folyamatosan kinyerhető
affinitáskromatográfiával
VI. Kettős fúzió
A X B
TP
A XB
TP
X A B
TP
nagy tisztaságú, nagy stabilitású termék,
hátrány: két tisztítás, hasítás
szükséges
VII. Szekréció-inszerció
X IS
TPmembrán fehérjék
termeltetése a membránban
Fehérje Származási hely molekulasúly (kDa)
szekréció
ligand
-galaktozidáz
Escherichia coli 116 - TPEG, APTG
Protein A Staphylococcus aureus
31 + IgG
Z szintetikus 7 + IgG
CAT Escherichia coli 24 + klóramfenikol
sztreptavidin Streptomyces 13 + biotin
PhoS Escherichia coli 36 + hidroxilapatit
Protein G Streptococci 28 + albumin
MBP Escherichia coli 40 + keményítô
GST Escherichia coli 26 - glutation
poliarginin szintetikus 1-3 - ioncsere
poliglutamát szintetikus 1-2 - ioncsere
polihisztidin szintetikus 1-7 + Ni2+, Zn2+, Cu2+
Fúziós partnerfehérjék
CAT: klóramfenikol-acetiltranszferáz; Z: A Protein A fehérje IgG kötô doménje; PhoS: foszfát kötô fehérje; MBP: maltóz-kötô fehérje; GST: glutation S-transzferáz;
TPEG: p-aminofenil--d-tiogalaktozidáz; APTG: p-aminofenil--d-tiogalaktozid.
FÚZIÓS FEHÉRJÉK HASÍTÁSI MÓDOZATAI I.
KÉMIAIhasító ágens
hasítási hely
brómcián - Met
hangyasav - Asp Pro -
hidroxilamin - Asn Gly -
ENZIMATIKUS
aminopeptidázok 1 - 3 aminosavat hasítanak az N-terminálisról
karboxipeptidázok1 - 2 aminosavat hasítanak a C-terminálisról
FÚZIÓS FEHÉRJÉK HASÍTÁSI MÓDOZATAI II.
Endopeptidázok
ENZIMATIKUS
ENZIM HASÍTÁSI HELY
kollagenáz - Pro - Val Gly - Pro -
enterokináz - Asp - Asp - Asp - Lys
Xa faktor - Ile - Glu - Gly - Arg
trombin - Gly - Pro - Arg
tripszin - Arg, Lys
klosztripain - Arg
Ala64-szubtilizin - Gly - Ala - His - Arg
Nómenklatúra:szekréció: az extracelluláris térbeexport: az sejtmembránokba vagy a periplazmatikus térbe
A fehérje szekréció
Előnyei
A tisztítás sokkal egyszerűbb, esetleg folyamatos üzemű lehet
Az periplazma illetve az extracelluláris tér sokkal oxidatívabb, korrektebb protein folding
A fehérje degradáció sokkal csekélyebb mértékű, proteolitikusan
stabilabb termékek
Baktériumok membránszerkezete
SZEKRÉCIÓ E. coli-ban
nem hatékony vagy nem teljes transzport a membránon keresztül alacsony transzport-kapacitás, stresszválasz, idő előtti fehérjedegradáció
ha a transzporthoz a fehérje poszttranszlációs módosítása szükséges,akkor ennek hiánya
kis molekulákra, mint növekedési faktorok vannak jó eredmények nagy molekulák esetén problémák lehetnek,
pl az ER hiánya (módosítások színhelye) vannak fehérjék, amelyek nem szekretálhatóak,
esetleg letális, pl -galaktozidáz fúziós fehérjék exportja
Fő protein transzport mechanizmusok bacteriumokban
Sec útvonal: egyszerű kofaktor mentes polipeptidekre
Tat útvonal: több alegységes enzimekre, amelyek kofaktorokat is tartalmaz(hat)naktranszport: a fehérje összeszerelődése után
SRP, signal recognition particle, és receptoraE. coli homológ: Ffh forty five homolog, FtsY
Poszttranszlációs transzport
Kotranszlációs transzport
- szignál szekvencia, - szignál peptidázok, szignál peptidázI (lep), Ala-X-Ala felismerőhely - szignál peptidázII (lsp), szignál szekvenciák eltávolítása lipoproteinekrôl - sec A, B, D, E, Y gének mutációja a prekurzorok felhalmozódásához vezet, Némi átfedés van közöttük.
- Régebben prl nómenklatúra is volt - SecA, 102 kDa, citoplazmatikus, és belső membránkötött, ATP-áz aktivitás, kölcsönhatás a szállítandó fehérjével
- SecB szekréció kompetens konformációért felelős
- SecYEFG a csatorna kialakításáért felelős
- SecD a periplazmatikus térbe való “leválásért”
Sec útvonal E. coli-ban
SZIGNÁL SZEKVENCIÁK GRAM- BAKTÉRIUMOKBAN I.
Standard szignál peptid
COOH
“N” “H” “C”
1K vagy R
hidrofób hélix, sok A és L,nem lehet P, K, R, D, E, H, R
fordulatPG
hasítóhely
AGS
-1 +1
AX
semleges vagynegatív
fM Gfordulat
AVS
-3
Lipoprotein szignál peptid
“C”
COOH
“N” “H”
1K vagy R
hidrofób hélix, sok A és L,nem lehet P, K, R, D, E, H, R
hasítóhely
AG
-1 +1
Dlipoprotein kiválasztó
szignál
semleges vagynegatív
fM
L
Gram-pozítív baktériumok
a szignál peptid szignifikánsan hosszabb kiterjedtebb “H” régió
a “H” régióban a Leu dominál
nem olyan szigorú a (-1, -3) szabály
a hasítóhely után nincs kitüntetett aminosav
SZIGNÁL SZEKVENCIÁK II.
Eukarióták
az eukarióta szekretált fehérjéket az E. coli export mechanizmusafelismer(het)i, illetve fordítva
A Sec függő fehérje transzlokáció modellje
E. coli-ban
ATP
ADP+Pi
SPáz Y E G
A
B
Y E G
A
ATP
ADP+Pi
Y E G
A
D
H+
H+
periplazma
citoplazma
INICIÁCIÓ TRANSZLOKÁCIÓ KISZABADULÁS
N+ C+
C N
citoplazma
Átjutás a C-terminális véggel,
ez az áltatános
Átjutás az N-terminális véggel,
inszerció
A Sec útvonal - másképpen
A Sec útvonal - másképpen
A prokarióta és eukarióta transzportmechanizmusokösszehasonlítása
Az SRP (Ffh-FtsY) útvonal
A Sec és az SRP közötti választás: “trigger” faktor
membrán fehérjékre jellemző
Twin-arginine szignál peptid
n-régió c-régióh-régió
N
+moderáltanhidrofóbS/T-R-R-x-F-L-K
n-region c-region
Sec szignál peptid
h-region
Nerősen
hidrofób
+
Signal sequences for targeting
SRP: erősen hidrofób szignál, nem hasad le
A periplazmitikus hidrogenázok bioszintézise citoplazmatikus összeszerelődési modell
Periplazma
Citoplazma
csatorna
Holoenzim
kofaktor(ok)prekurzor
szignál peptid
citoplazma
membrán
periplazma
N NN
N
C
C
CC
TatATatE
TatB
TatC
The twin-arginine translocase (Tat) proteins
cciitoplatoplazmazma
TatCTatB TatA
membrmembráánn
aktív formát felvettaktív formát felvett enzimenzim
A TAT modell