Transpozibilní elementy

Transpozóny = mobilní genetické elementy

úseky DNA schopné přenosu na jiné (další) místo genomu (transpozice)

U Prokaryot i všech dosud analyzovaných Eukaryot (s výjimkou parazita Plasmodium falciparum)

- u rostlin tisíce rodin (až 80% genomu)- živočichové 3-45%, houby 2-20%

Způsoby množení / přenosu

• „CUT and PASTE“– vyštěpení a přenos transpozónu do jiného místa genomu

– pouze přeskočení, bez pomnožení

• „COPY and PASTE“ – opakované kopírování, kopie se vkládá do nového místa– původní element zůstává, počet kopií ~ počtu kopírování

• kopírování přes RNA intermediát nebo• přímé vložení kopírované DNA

Ne všechny transpozóny kódují

potřebné enzymatické aktivity

• Autonomní elementy – kódují gen, jehož produkt zajistí přenos/replikaci

• Neautonomní elementy – odvozené od autonomních

– ztratily geny potřebné pro přenos, ale mohou být mobilizovány jinými (příbuznými) autonomními elementy

– mají cis sekvence potřebné k mobilizaci (!)

Klasifikace transpozónů

Nature Rev. Genet. 2008

1. Třídy: Dle toho, zda je či není intermediátem při replikaci RNA

• DNA transpozóny• Retrotranspozóny

2. Podtřídy: Dle mechanismu replikace (u DNA transpozómů)3. Řády: Dle základních strukturních rysů4. Nadčeledi: Dle sekvenční příbuznosti

Základní typy TE dle transpozice

Lisch 2013, Nature Rev. Genet.

Rollingcircle

replication???

Retrotranspozóny DNA transpozóny

Třída II: DNA transpozóny

DNA transpozóny - podtřída I: - kódují transpozázu, na okrajích jsou invertované repetice

- složitý proces transpozice – vazba IR, štěpení (transpozáza), štěpení cílové sekvence, syntéza DNA, ligace

- zdvojení krátké sekvence (2-8 bp) v místě začlenění = footprint po opětovném vyštěpení

Množení DNA transpozónů?

Přesuny a množení DNA transpozónů

+ opravy zlomu po vyštěpení TE podle homologního úseku druhé chromatidy (tedy možnost rekonstrukce původní sekvence i s TE = namnožení)

Mechanismus aktivace při replikaci? Hemimetylovaný stav?

DNA transpozóny - podtřída I

- klastrování – častěji začlenění v blízkosti původní inserce

- většinou několik až několik set kopií v genomu

př.: - Ac, Spm, Mu (kukuřice), Tam (Antirrhinum), TphI (petunie),

TagI (Arabidopsis), Stowaway, Tourist >10 000 kopií, každých 30kbp

(u kukuřice, inserce do TA bohatých sekvencí)

- MULE (Mutator-like elements) u rýže – mobilizováno přes 1000 genových fragmentů – 5 % je exprimováno! – evoluce nových genů

Pack-MULE (fragmenty více různých genů)

- mutované neautonomní formy Ac/Ds (Ds1, Ds2), Spm/dSpm

CO MŮŽE A CO NESMÍ NEAUTONOMNÍ DNA TRANSPOZÓN ZTRATIT?

DNA transpozónypodtřída II:

řád: Helitron – jednovláknový zlom, vytěsnění vlákna, vložení

- Rep/helikase-like, replication protein A-like

- u kukuřice 4 až 10 tis. mobilizovaných gen.úseků

((řád: Mavericks – není u rostlin (!) zřejmě vyštěpena ssDNA, poté mimo-chromozomální replikace a integrace))

Třída I: Retrotranspozóny

Retrotranspozóny- replikace přes RNA intermediát (četnější potomstvo!)- velikost 1-13kbp (x SINE), až milióny kopií (až 40-80% genomu)- často v heterochromatinových oblastech, v euchromatinu především mezi geny - zřejmě důsledek selekčního tlaku

Řád: LTR – nejvýznamnější TE u rostlin

- podobné retrovirům- LTR (long terminal repeat): promotor, terminátor, přímá repetice- krátké zdvojení cílové sekvence- proteáza, RT, RNáza H, integráza, nukleokapsidový protein (!)

LTR retrotranspozóny - replikace

- replikace analogická retrovirům

- LTR (U3, R, U5)

- PBS (primer binding site): tRNA primer

- přeskoky mezi templáty (přímý repeat - R)

Příklady retrotranspozónů s LTR

Ty1- copia group

BARE-1, ječmen, 12,1 kbp, >50 000 kopií, transkript v listech a kalusuOpie –1, kukuřice, 8,7 kbp, >30 000 kopií, kořeny, listy, integrace do LTRPREM-2, kukuřice, 9,5 kbp, >10 000 kopií, mikrosporyTnt1, tabák, 5,3 kbp, >100, protoplasty, kořeny, - aktivace po poranění, ataku patogenu, integrace do euchromatinu

Ty3 – gypsy grouppotenciální předci živočišných retrovirů, někdy i env-like sekvence

Athila, A.t., 10,5 kbp, >10000, paracentromerické oblastiAthila-1-1, A.t., 12 kbp, 730, env-like sekvenceCinful-1, kukuřice, 8,6 kbp, 20000, listy, env-like sek.

Retrotranspozóny bez LTR LINE (long interspersed nuclear elements)SINE (short interspersed nuclear elements)

LINE- fylogeneticky zřejmě nejstarší, předchůdci transpozónů s LTR- 5´oblast – promotor; 3´oblast - terminátor

Cin4, kukuřice, 1-6,8kbp, 50-100, různě zkrácené formy

SINE- využívají aparát (RT) jiných transpozónů (neautonomní)- odvozeny od produktů RNA polymerázy III (tRNA, 7SLRNA, (rRNA)) - < 500 nt

LINE

APE – endonuclease, RH – RNase H

Regulace aktivity transpozónů- regulace vlastními mechanismy i hostitelem (individuálně)

- většinou neaktivní – metylace (siRNA + RdDM, CMT2/3 + KYP)

- jedna z možných příčin vzniku metylace DNA- „heterochromatinizace“ nutná i pro zachování integrity genomu (brání rekombinaci mezi kopiemi TE na různých místech genomu)

- vývojově ovlivněná aktivita:

- větší ochrana meristémů („zárodečné linie“) oproti diferencovaným somatickým buňkám? – u rostlin ne zcela odlišené!- nárůst metylace Spm a Mu v průběhu vývoje listů, demetylace v časných fázích vývoje- aktivace v centrální buňce zárodečného vaku a veget. jádře pylu

- aktivace ovlivněna vnějšími podmínkami, př.: - Tam1 u hledíku (1000x při 15°C)- Reme1 u melounu – aktivace UV zářením- Tnt1 u tabáku po poranění či infekci (inserce do euchromatinu)

Význam transpozónů

navozování mutací = zvyšování variability

- modulace exprese (aktivace, represe, vývojová, stresová)- tvorba nových genů- evoluce genomů

- u rostlin na TE chybí geny, které přímo zvyšují fitness (rezistence apod.)

- zvýšení fitness náhodně navozenou mutací (př. při aktivaci stresovými podmínkami) – velmi nízká pravděpodobnost …

velký význam při domestikaci (šlechtění) rostlin!

Mutace působené transpozóny~ místo začlenění (různé preference: GC, AT, transkrib.,…)~ charakter nesených regulačních sekvencí

Cis/Promotor 5´UTR exon intron exon 3´UTR terminátor

- modulace exprese (časově i místně) – promotor, enhancery - změny ve stabilitě transkriptu a postranskripčních úpravách (sestřih) - UTR, introny, terminátor

- změna sekvence výsledného proteinu (vč. footprintů), předčasná terminace translace, vznik chimerických genů,…

- exony, introny

Regulace genové exprese transpozóny

př. réva: inaktivace exprese TF VvmybA1 (regulace antokyanových

genů) přítomností retrotranspozónu z rodiny Gypsy

(Kobayashi et al. 2004, Science)

Regulace genové exprese transpozónypř. Kukuřice - inaktivace genu CCT (odpověď na délku fotoperiody) inzercí CACTA-like elementu (DNA TE) do promotorové oblasti – rozšíření pěstování do mírného pásma (kvetení za dlouhého dne)

př. kukuřice - blok větvení (TE enhancer OE inhibitoru)(Yang et al. 2013, PNAS)

(Butelli et al. 2012, Plant Cell)

př. pomeranč

Ruby – myb TF (regulace antokyanových genů)

- aktivovaný inzercí TF

PROČ byly TE tak významnév domestikaci?

- umělý výběr- skokové změny vlastností (změna regulace exprese)

Význam v evoluci genů

- inserční mutageneze (předčasná terminace), footprinty

- možná účast v multiplikaci genů - přímo či zprostředkovaně přes homologní rekombinaci

- výhodné mít genové rodiny s různou regulací, popř. záložní kopie genů

- tvorba bezintronových kopií genů (reverzní transkripcí)

- mohou se podílet na tvorbě zcela nových genů – např. fúzí přenášených fragmentů stávajících genů (helitrons, MULE)

- geny, původně transpozónového původu byly mnoha eukaryotickými organismy „domestikovány“ pro nové funkce (př. telomerázy, syncitin, ….)

Vliv TE na celkovou architekturu genomu

- tvoří většinu repetitivní DNA v genomech rostlin (heterochromatin) až 80 % genomu

- mohou způsobovat chromozomální přestavby

Změny na úrovni genomu

• Chromozómové přestavby (zlomy, inverze, delece, duplikace, translokace)- změny vazbových skupin, speciace (sterilita hybridů)

• Zvětšování genomu („genomic obesity“)

příčiny - vlastní transpozice (nové inserce) x homologní rekombinace (repetitivní sekvence)

základní mechanismus bránící zvětšování genomu (u 2n druhů bavlníku až 3 násobné rozdíly ve velikosti genomu díky

aktivní rekombinaci; Hawkins 2009 PNAS)

Gen pro transpozázu(indukovatelná exprese)

Ds

Transpozónová mutageneze- především u Arabidopsis- DNA transpozóny z kukuřice: Ac/Ds, Spm/dSpm – nízká frekvence- dvoukomponentní systém

rostlina s neautonomnímelementem v genu rezistence

R

Selekce rezistentních rostlin = s transpozicí neautonomního elementu

V další generaci selekce rostlin bez transpozázy

DsR

Modifikace - vyštěpením aktivovaná exprese represoru transkripce genu pro transpozázu

- možnost určení místa začlenění (např. TAIL PCR)

- častá mutageneze přilehlých oblastí (20 % v 1Mb okolí)

- reintrodukcí transpozázy je někdy možné mutaci revertovat

Transpozónová mutageneze

Objevení transpozónůBarbara McClintock (1902-1992)

Nobelova cena za Fyziologii and Medicínu 1983

za objevení (poznání podstaty) mobilních genetických elementů kukuřice 1940-1950

Objevení transpozónů (B. McClintock)

- studium chromozomálních zlomů u kukuřice

- zvýšený výskyt zlomů v určité oblasti (= marker nazvaný „dissociation“ Ds)

- poloha markeru ale nebyla po křížení s některými liniemi stabilní, a přesouvala se na jiná místa (= linie nesoucí „activator“ Ac)

- u jedné linie způsobil přesun Ds markeru ztrátu purpurového zbarvení obilek

- světlá barva obilek (c) způsobená inzercí Ds elementu však nebyla při křížení s liniemi nesoucími Ac stabilním znakem - objevovaly se obilky s purpurovými skvrnami

• c/c/c = světlé obilky • C/c/c nebo C/C/c nebo C/C/C = purpurové zbarvení

- triploidní endosperm

Transpozice a zbarvení obilek

• pokud dojde k reverzi c na C, začne se v buňce tvořit červený pigment a vytvoří se skvrna na světlém pozadí, čím dříve ve vývoji obilky dojde k reverzi, tím je skvrna větší

• B. McClintock vyvodila, že “c” alela vznikla začleněním neautonomního transpozónu “Ds” do “C” alely (Ds = dissociation)

• reverze c na C je způsobena transpozicí Ds elementu z c alely, která je zprostředkována autonomním transpozonem “Ac”

(Ac = activator)

PROČ tak vysokáfrekvence transpozice?

Barbara McClintock (1902-1992)

1951: formulovala základní koncept epigenetiky"[T]he progeny of two (such) sister cells are not alike with respect to the types of gene alteration that will occur. Differential mitoses also produce the alterations that allow particular genes to be reactive. Other genes, although

present, may remain inactive. This inactivity or suppression is considered to occur because the genes are ‘covered' by other nongenic chromatin materials. Gene activity may be possible only when a physical change in this covering material allows the reactive components of the gene to be ‘exposed' and thus capable of functioning.“