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Vaso sanguíneo

Células mesenquimales

Células epitelialesPolaridad arriba-abajo

EMT

MET

Polaridad arriba-abajo

Polaridad frente-atrás

Polaridad frente-atrás

Transición Epitelial-Mesenquimal (EMT) en Cáncer Mamario

Alejandro Cervantes Arias, David J. Argyle

University of Edinburgh, The Roslin Institute

Estudiante de Doctorado

Introducción

La Transición Epitelial-Mesenquimal (EMT) es un proceso presente durante la

embriogénesis, carcinogénesis, metástasis y recurrencia tumoral. Durante este proceso, las

células epiteliales pierden sus características y adquieren propiedades mesenquimales: pérdida de

adhesión celular, aumento en movilidad e invasividad, resistencia a apoptosis, y cambios

morfológicos. Este complejo proceso involucra diversos factores de transcripción y posteriores

objetivos transcripcionales epiteliales y mesenquimales, incluyendo E-Cadherina, �-catenina,

Fibronectina, y Vimentina. Particularmente, la vía de señalización del Factor de Crecimiento

Transformante beta (TGF-B) es crucial para la inducción de la EMT, durante la cual las células

de cáncer mamario pueden adquirir características de célula madre (célula troncal). Mi proyecto

de investigación se ha basado en la evaluación del TGF-B como promotor del proceso de EMT

durante la metástasis en carcinoma mamario de HUMANOS, perros y gatos. Además, hemos

trabajado investigando un posible vínculo entre la EMT y la teoría de las células madre de cáncer

a través del tratamiento celular con TGF-B.

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Objetivos:

Hemos demostrado que el TGF-B puede inducir EMT en células de carcinoma mamario

de humanos, perros y gatos, y aparentemente también permite que las células adquieran

características de célula madre; como resistencia a la apoptosis y auto-renovación. Si logramos

confirmar esto, el TGF-B puede ser un blanco para bloquear la EMT durante el progreso del

cáncer y así, desarrollar una potencial cura.

Resultados:

Las células estimuladas con TGF-B mostraron morfología mesenquimal (forma alargada) y

un visible incremento en marcadores mesenquimales y factores de transcripción así como una

disminución en marcadores epiteliales confirmado por análisis de Western Blot. También

mostraron mayor habilidad de invasión en ensayos de cierre de herida. Las células estimuladas

migraron mas rápido que las no estimuladas, colonizando así la herida. Además, la habilidad

para formar mamo-esferas (las cuales son representativas de células madre de cáncer) fue mayor

en células estimuladas, mostrando a su vez incremento en marcadores mesenquimales,

sugiriendo un vínculo entre la EMT y las células madre de cáncer. Se llevaron a cabo estudios de

expresión de proteína mediante los cuales confirmamos que las células estimuladas expresan

marcadores mesenquimales en mayor proporción que las no estimuladas.

Finalmente, células estimuladas y no estimuladas fueron clasificadas en CD133+ y

CD133- (CD133 es un marcador de células madre) para así poder evaluar su respuesta a agentes

quimioterapéuticos. Las células fueron expuestas a diferentes concentraciones de los

quimioterapéuticos Doxorubicina y Mitoxantrona, donde se pudo observar que en las células

clasificadas como CD133-, las estimuladas con TGF-B mostraron mayor resistencia.

Cambios morfológicos:

Se observaron cambios en morfología celular en líneas celulares de carcinoma mamario

de perros (REM), gatos (CMC) y humanos (MCF7), en donde las células sin tratamiento

permanecían con morfología epitelial mientras las células tratadas con TGF-B a 10ng/ml

mostraron morfología mesenquimal (forma alargada y pérdida de contacto celular), lo cual puede

ser el primer paso de invasión y metástasis en células cancerosas.

Grupo control (MCF7) MCF7 + TGF�

Formación de mamo-esferas:

Las células tratadas pudieron formar de manera más fácil y rápida células esferoidales en un

medio de cultivo sin suero y con bajos niveles de glucosa en recipientes de baja adherencia a una

densidad baja. Estas esferas son representativas de células madre de cáncer.

Cambios a nivel molecular:

Se realizaron estudios de expresión de proteínas por medio de análisis de Western Blot, en donde

se pudo confirmar que las células tratadas expresaban marcadores mesenquimales en mayor

proporción comparadas con las células no tratadas. Así mismo, los marcadores epiteliales se vieron

reducidos significativamente en las células estimuladas con TGF-�.

Ensayo de cierre de herida:

Posterior a realizar una “herida” con una punta de pipeta de 200 µl en pozos cubiertos por

células, se compararon las distancias relativas de migración, en donde pudimos observar que las

células tratadas con TGF-� cerraron la herida más rápido que las células no tratadas, dando a entender

que su respuesta migratoria es mejor. Tanto las células de carcinoma mamario canino como las de

carcinoma mamario felino que fueron estimuladas con TGF-� migraron más rápido que las no

estimuladas. Para calcular el porcentaje de la distancia relativa de migración se utilizó esta fórmula:

% = 100 (A-B) /A, en donde A = ancho de herida antes de incubación y B = ancho de herida después

de incubación.

Ensayo de quimio-sensibilidad:

Previamente se separaron las células CD133+ y CD133- (CD133 es un marcador de células

madre) para evaluar la respuesta a quimioterapia de células que supuestamente deben ser mas

resistentes. Se sometieron las células a diferentes concentraciones de los agentes quimioterapéuticos

REM CMC MCF7

Doxorubicina y Mitoxantrona, en donde se observo que entre las células CD133-, las tratadas con

TGF-� mostraron más resistencia que las no tratadas.

Conclusiones

Estos datos confirmaron que durante la EMT, las células de carcinoma mamario adquieren

características de células madre mediante TGF-B, sugiriendo que la EMT y el fenotipo de célula

madre están estrechamente relacionados durante la migración celular y metástasis. Estos hallazgos

indican que la vía del TGF-B puede ser un blanco importante para el desarrollo de terapias nuevas

contra el cáncer y su progreso.

Perspectivas:

• Interferencia de ARN por medio de siRNA de ciertos genes como Tribbles1,

posiblemente involucrados en este proceso.

• Ensayos de invasión celular in vitro.

• Ensayos de invasión celular in vivo utilizando la membrana corio-alantoidea de

embriones de pollo como modelo (membrana con alto número de vasos sanguíneos).

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