Transformação Genética de Milho via Agrobacterium tumefaciens¹ainfo.· Thiago Henrique Leite²,

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    Transformao Gentica de Milho via Agrobacterium tumefaciens

    Thiago Henrique Leite, Andra Almeida Carneiro

    Trabalho financiado pelo FAPEMIG

    Estudante do Curso de Engenharia Ambiental da UNIFEMM, Bolsista PIBIC do Convnio

    FAPEMIG - Embrapa

    Pesquisadora da Embrapa Milho e Sorgo

    Introduo

    Originrio do Mxico, o milho evoluiu de uma gramnea selvagem (Zea mays

    ssp. parviglumis) para uma espcie domesticada altamente produtiva devido a

    interveno humana. Entre os anos de 1976 e 2010, a produtividade do milho no Brasil

    aumentou mais de 200%, sendo que a rea utilizada para o plantio cresceu apenas 18%

    CONAB, 2012). Estes resultados foram devidos em grande parte a rigorosos programas

    de seleo e melhoramento de cultivares.

    Enquanto os programas tradicionais de melhoramento continuam exercendo um

    papel fundamental na melhoria das caractersticas agronmicas do milho, tecnologias

    recentes, geradas em funo dos enormes progressos alcanados pela biologia molecular

    e celular nos ltimos anos, permitem que novas ferramentas sejam agregadas a estes

    programas no desenvolvimento de novas cultivares com maiores rendimentos agrcolas,

    constituio nutricional diferenciada e tolerantes a diferentes estresses biticos e

    abiticos.

    A biotecnologia est gerando um grande nmero de genes passveis de serem

    utilizados para a melhoria gentica do milho, e as tcnicas de transformao de plantas

    podero ser empregadas para alterar a funcionalidade in vivo destes genes via

    complementao, superexpresso ou silenciamento. Progressos expressivos foram

    conseguidos no desenvolvimento da tecnologia de transformao gentica de milho na

    ltima dcada. A transformao gentica do milho, considerada por algum tempo

    recalcitrante, tornou-se, atualmente, um procedimento de rotina para vrios gentipos na

    maioria dos laboratrios pblicos e privados trabalhando com esta cultura (GORDON

    KAMM et al., 1990; FRAME et al., 2002; ISHIDA et al., 2007).

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    Durante vrios anos a transformao de monocotiledneas via Agrobacterium

    tinha uma eficincia muito baixa, entretanto, recentemente, este cenrio est mudando, e

    esta metodologia de transferncia gnica tem se tornado o mtodo de escolha para este

    grupo de plantas (ISHIDA et al., 1996). Este mtodo de transformao utiliza um

    sistema natural de transferncia de genes desenvolvido pela Agrobacterium. Esta

    bactria encontrada no solo capaz de causar tumores em vegetais na regio da

    infeco. Estes tumores resultam da presena do plasmdeo Ti ou plasmdeo indutor de

    tumor na clula bacteriana. O plasmdeo Ti uma molcula circular grande (200 a 800

    kb) de DNA fita dupla que pode se replicar independentemente do genoma da

    Agrobacterium tumefaciens (GELVIN, 2003). Localizado no plasmdeo Ti se

    encontram duas regies importantes para a transferncia de genes da bactria para a

    planta, a regio do T-DNA e a regio vir. As regies dos T-DNAs de plasmdeos

    selvagens contm genes que comandam a produo de opinas e hormnios, tais como

    auxina e citocinina, pela clula vegetal. As opinas so aminocidos utilizados apenas

    pela Agrobacterium como fonte de carbono e nitrognio, enquanto os hormnios so

    responsveis pela induo de tumores em vegetais. O T-DNA tem, aproximadamente,

    entre 10 e 30 Kb e suas extremidades so delimitados por duas sequncias de 25 pb

    altamente homlogas, denominados extremidades direita e esquerda. A Agrobacterium

    selvagem transfere o seu T-DNA atravs das membranas das clulas vegetais e o

    incorpora no DNA genmico da planta. O processamento do T-DNA e sua transferncia

    para a clula vegetal devido em grande parte a atividade de virulncia das protenas

    codificadas na regio vir (GELVIN, 2003).

    Para viabilizar a utilizao da Agrobacterium em processos biotecnolgicos de

    transferncia de genes para plantas necessrio que os genes endgenos do T-DNA

    causadores de tumor sejam inativados e que os genes exgenos GDI e GMS sejam

    inseridos entre as extremidades direita e esquerda do T-DNA. O plasmdeo

    recombinante resultante novamente colocado na Agrobacterium para ser transferido

    para clulas vegetais (GELVIN, 2003). Tecidos ou clulas transformados podem ser

    utilizados para regenerao de plantas transgnicas (HIEI et al., 1994; ISHIDA et al.,

    1996).

    Por ser muito grande, o plasmdeo Ti difcil de ser manipulado, portanto,

    foram criados os vetores binrios (BEVAN, 1984), os quais so menores e capazes de

    multiplicar tanto em Agrobacterium como em E. coli e fceis de manipular em

    laboratrio. Estes vetores possuem um T-DNA artificial, no qual diferentes transgenes

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    podem ser inseridos e uma origem de replicao compatvel com o Ti na

    Agrobacterium. Os vetores binrios so introduzidos em Agrobacterium desarmadas, ou

    seja, em Agrobacterium que carregam plasmdeos Ti que tiveram a regio do T-DNA

    removida. O Ti de Agrobacterium desarmadas ainda possui a regio de virulncia (vir),

    sendo seus genes capazes de agir in trans para transferir o T-DNA recombinante do

    vetor binrio (GELVIN, 2003).

    O primeiro protocolo de transformao de milho mediada por Agrobacterium

    com alta eficincia foi relatado em 1996 por um grupo de pesquisadores da Japan

    Tobacco Inc. (ISHIDA et al., 1996). Eles foram capazes de infectar embries imaturos

    de milho A188 utilizando vetores superbinrios (pSB131 ou pTOK233) (ISHIDA et al.

    1996). O plasmdeo superbinrio desenvolvido por Komari (1990) contm uma cpia

    extra dos genes de virulncia virB, virC e virG. Trabalhos subsequentes mostraram que

    a transformao de milho mediada por Agrobacterium tambm era possvel com a

    utilizao de vetores padres (FRAME et al., 2002). Para o milho a tcnica de

    Agrobacterium foi relatada resultar em alta eficincia com alto nmero de eventos

    contendo apenas uma ou um baixo nmero de cpias do transgene no genoma quando

    comparado com a biobalstica (ISHIDA et al., 1996; ZHAO et al., 2001; GORDON-

    KAMM et al., 1990; FRAME et al., 2002; LUPOTTO et al., 2004; HUANG; WEI,

    2005; ISHIDA et al., 2007).

    O objetivo deste trabalho foi estabelecer condies para uma melhor infeco

    dos embries imaturos de milho por Agrobacterium tumefaciens. Os resultados

    mostraram que a otimizao do protocolo de infeco resultou em um aumento da

    eficincia de transformao de milho HiII.

    Material e Mtodos

    Construo gnica: Foi utilizada a construo gnica pTF102. Esta construo contm

    o gene reprter GUS sob o controle do promotor 35S e o marcador de seleo o gene

    bar. A expresso do gene GUS (-glucuronidase) foi analisada por ensaios

    histoqumicos (JEFFERSON et al., 1987). Utilizou-se um estereoscpio da marca Zeiss

    Stemi SV 11 para visualizao da expresso de GUS (Zeiss, So Paulo, SP, Brasil).

    Parmetros testados durante a infeco de embries imaturos de milho com

    Agrobacterium tumefaciens: (i) perodo de estocagem das espigas de milho a 4 oC antes

    da transformao (1 e 2 dias); (ii) Tempo de permanncia dos embries imaturos de

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    milho em meio de infeco durante o perodo de coleta (30 e 120 min.); (iii) Tempo de

    permanncia dos embries em cocultivo com Agrobacterium tumefaciens a 19 oC; (iv)

    Tamanho do embrio imaturo utilizado (>1,5 mm e

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    embries. Na Figura 1, pode-se observar, atravs das manchas azuis, que no existe

    diferena na qualidade da infeco quando as espigas so estocadas por 24 h a 4 oC

    quando comparadas com espigas frescas. O tempo de permanncia dos embries em

    meio de coleta (meio de infeco sem Agrobacterium) parece influenciar na qualidade

    da infeco pois o menor tempo neste meio (30 min.) apresentou o melhor resultado

    (Figura 2). Maior quantidade de manchas azuis foi detectada quando os embries

    permaneceram no meio de coleta por apenas 30 min. quando comparados com embries

    mantidos neste meio por 120 min. Outro fator que parece ter influncia no processo de

    infeco dos embries pela Agrobacterium o estdio evolutivo destes. Embries de at

    2 mm de comprimento apresentaram nveis de infeco pela Agrobacterium maiores do

    que aqueles com mais de 2 mm (Figura 3). Outro parmetro testado foi o tempo em que

    o embrio de milho permaneceu em contato com a Agrobacterium. Nossos resultados

    mostraram que aps sete dias de cocultivo a infeco foi melhor do que aps 3 dias

    (Figura 3). Portanto, na transformao gentica de embries de milho HiII via

    Agrobacterium tumefaciens EHA101 esto sendo adotados os parmetros estabelecidos

    neste estudo. Isto , embries de milho com at 2 mm de comprimento, frescos ou

    estocados a 4 oC, por at 24 h so utilizados como explantes para a transformao

    gentica. O perodo de contato entre a bactria e os embries de sete dias.

    Utilizando este protocolo para transformao de milho com construes gnicas

    contendo diferentes genes de interesse, por exemplo, dreb2A, cry, AltSB, tem-se obtido

    uma frequncia de transformao da ordem de 1,5%.

    Figura 1: Tempo de estocagem das espigas de milho a 4 oC antes da transformao usando Agrobacterium tumefaciens . (a) Espigas mantidas por 1 dia a 4 oC; (b) espigas mantidas por 2 dias a 4 oC.

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    Agradecimentos

    FAPEMIG e Embrapa pelo apoio.

    Referncias

    BEVAN, M. W. Binary Agrobacterium tumefaciens vectors for plant transformation. Nucleic Acids Research, London, v. 12, p. 8711-8721, 1984.

    Figura 2: Tem