TRABAJO FINALOBTENCIÓN DE

DEXTRANOIntegrantes :

•Caceda Lara, Liliana •Flores Olivares , Diana

Introduccion ◦ Toda la producción industrial de este biopolímero se realiza a

partir de métodos biotecnológicos, mediante dos vías de Fermentación, a partir de sacarosa y con la participación de la bacteria Leuconostoc mesenteroides B512, principalmente. Se obtienen así cadenas muy largas (dextranos nativos o crudos), que posteriormente habrá que fragmentar hasta conseguir tamaños más adecuados a su aplicación final, mediante un proceso de hidrólisis y Síntesis enzimática: Se hace crecer un microorganismo que produce la enzima de interés, llamada dextransacarasa. Cuando se tiene la cantidad deseada, se adiciona sacarosa al medio y dicha enzima produce la polimerización a dextrano.

DEXTRANO  ◦ Polisacárido de alto peso

molecular

◦ Estructura: D-glucosa unidos por EG alfa (1,6)

◦ Son diversos estructuralmente◦ Generalmente se producen por

Streptococcus, Acetobacter y Leuconostoc en medios con sacarosa

el dextrano es un polisacárido complejo y ramificado formado por numerosas moléculas de glucosa; unidades en cadenas de longitud variable (de 10 a 150 kilodaltons). La cadena consiste en uniones glucosídicas α1->6 entre moléculas de glucosa, mientras que las ramificaciones empiezan en uniones α1->4 (en algunos casos también en uniones α1->2 y α1->3).

Cepa.◦Muchos Organismos producen Dextranos, pero solo el Leuconostoc

Mesenteroides y el L. Dextranicum (Lactobacteriaceae) Son utilizados para la producción,comercialmente.

Fuente : Benchmark ( 2002),

I.REACCIONES QUE INTERVIENEN EN LA SINTESISDE DEXTRANO

Figura 2. Reacciones que intervienen en la formación del dextrán.

Según Gonzales (1985), en la industria alimentaria se utilizan para preparar dulces que posean una textura interior adecuada, mientras que la industria de la pintura, los éteres y ésteres mixtos de dextranos son usados como agentes lacantes. Además, determinadas columnas cromatográficas cuentan con dextranos como fase fija.Su campo de aplicación más importante es, sin duda, la medicina:‐ Se utilizan disoluciones de dextranos como sustitutos del plasma sanguíneo, ya que sus propiedades osmóticas y reológicas son similares. Su aplicación en este sentido es cada vez menor, y se considera más conveniente la del dextrano al 3,5 % para hemodiluciones terapéuticas reológicas.‐ La sal sódica del éster del ácido sulfúrico y dextrano (complejo dextrano-sulfato) tiene propiedades anticoagulantes similares a la heparina.‐ Pueden formar complejos con el hierro, con lo que pueden ser usados para el tratamiento de anemias ferropénicas cuando es inviable la administración oral de sumplementos.‐ La versatilidad del dextrano viene dada por sus propiedades: es neutro y soluble en agua, fácilmente filtrable, biocompatible, biodegradable y estable durante más de cinco años.

Aplicaciones:

IV. MEDIO DE CULTIVOK2HPO4 0,6 g

- KH2PO4 0,6 g

- NH4Cl 3 g

- MgSO4 0,1 g

- CaCl2 0,02 g

- Glucosa 25 g

- Acetáto sódico 20 g

- Aminoácidos (ala, arg, asn asp,cis, glu, gln, gly, his, iso, leu, lis, met, phe, pro, ser, thr, trp, tyr, val).

100-200 g de cada uno

- Purinas y pirimidinas (adenina, guanina, uracilo, xantina).

10 mg de cada una

Vitaminas (biotina, folato, ácido nicotínico, piridoxal, piridoxamina, piridoxina, riboflavina, tiamina,

0,01-1 mg de cada una

Elementos traza 2-10 g

(Fe, Co, Mn, Zn,

Cu, Ni, Mo)

Agua destilada 1000 ml

pH7

V. PRODUCCION DE DEXTRANO A NIVEL INDUSTRIAL.La síntesis de dextrano se realiza por fermentación bacteriana o enzimática. El microorganismo empleado es Leuconostoc mesenteroides de las cepas NRRL B-512F, 512 y B1299; sólo con la cepa B-512F se produce dextrano a escala industrial, a partir de sacarosa comercial, Gonzales (1985). El sustrato más comúnmente empleado es la sacarosa en concentraciones aproximadas de 5%; y en fermentación enzimática puede ser hasta más o menos 20% y se obtiene una concentración de dextrano de 20 g/L.

Figura 2. Diagrama del pretratamiento realizado a los residuos de

cáscaras de naranja, piñal cachaza.

Fuente: Rodríguez y Henry Hanssen (2007)

 

PROCESO BIOTECNOLOGICO PARA LA OBTENCION DE DEXTRANO

CEPA LIOFILIZADA DE Leuconostoc mesenteroides NRRL B512

ACTIVACIÓN DE LA BACTERIA LEUCONOSTOC• posteriormente resuspendida y

conservada en una solución de glicerol al 20% a -20 °C

PREINÓCULO10 ml de caldo LM esterilizado

INOCULOSegunda etapa de multiplicación en fermentador

subcultivos en tubos Eppendorf (1,5 mL)

Cultivos: incubados en matraces

Existen tres etapas

ETAPA DE PROPAGACIÓN

SINTESIS ENZIMATICA DEL DEXTRAN

RECUPERACION DEL DEXTRAN

La producción de dextrán consta de tres etapas principales. La primera es la

propagación del microorganismo, a partir de una cepa pura, en el laboratorio y

su propagación posterior en la planta, hasta obtener una cantidad suficiente que

permita tener una elevada concentración de la enzima dextransucrasa

generada por él.

Proceso de biosíntesis del dextrano

1.1.1. ACTIVACION

La cepa puede ser suministrada por un Instituto como Biotecnología (IBT,

Morelos). Donde es liofilizada y posteriormente resuspendida y conservada

en una solución de glicerol al 20% a -20 °C. Luego de la activación, se realiza

subcultivos en tubos Eppendorf (1,5 mL), que dan origen a los pre inóculos.

El crecimiento es monitoreado mediante el método de peso seco.

El medio estándar para su activación y mantenimiento presentó la siguiente

composición.

(medio LM): glucosa (2%), extracto de levadura(20 g/L), K2HPO4 (20 g/L),

MgSO4 .7H2O (0,2 g/L),CaCl2.2H2O (0,05 g/L), FeSO4 (0,01 g/L),

MnSO4.7H2O(0,01 g/L), NaCl (0,01 g/L) (Munguía Canales, IBT,envío

electrónico, 2005).

a. Condición del proceso

‐ El pH del medio se ajusta a 6,7 con H3PO4 y NaOH (0,1 N).

‐ Los cultivos se incuban en matraces a 27 °C en condiciones aerobias

‐ agitador orbital a una velocida dde 150 r. p. m.

‐ tiempo : 24 horas

1.1.1. PRE- INOCULO

se prepara previamente un preinóculo en caldo LM, el cual se esteriliza a 15

psig durante 15 minutos; esta preparación consiste en tomar “dos asadas”

de una suspensión de células incubadas a 27 °C por 24 horas y añadirlas al

preinóculo consistente en 10 mL de caldo LM estéril

a. Condiciones del proceso

‐ incubando a 30 °C

‐ 18-20 horas.

‐ Velocidad de 100 rpm

1.1.2. INÓCULO

Se prepara el inóculo con el sustrato previamente tratado y pasteurizado

correspondiente a cada montaje. La inoculación se realiza a partir de 5 mL

de preinóculo

a. Condiciones del proceso se incuba a una temperatura :

‐ 30ºC aproximadamente, agitación de 150 r. p. m.

‐ tiempo de 12-18 horas, verificando el crecimiento celular este

valor depende de todos los factores del proceso.

‐ Rodríguez y Hanssen (2007) en las pruebas que hicieron, de

acuerdo con lo arrojado en la fase pre-experimental, el período de

incubación del inóculo fue de 12 horas, tiempo en el cual el cultivo

se encuentran la parte final de la fase exponencial de crecimiento

correspondiente a una concentración de células de105 unidades

formadoras de colonia (UFC)/mL. Estevalor se fijó para facilitar la

reproducibilidad de los ensayos.

 

1. SINTESIS ENZIMATICA DEL DEXTRAN

En la segunda etapa se realiza la síntesis enzimática del dextrán en

una solución de sacarosa que contiene, además, extracto de

levadura, una fuente de fosfato como tampón, trazas de sales de

algunos metales como Magnesio, Manganeso, Hierro e Hidróxido

de Sodio para neutralizar el exceso de ácido formado durante la

fermentación.

 

2.RECUPERACION DEL DEXTRAN

La tercera etapa contempla la recuperación del dextran por medio

de una precipitación en alcohol etílico, lavado, reprecipitación,

disolución, secado, molinado y envasado.

  

Figura 5: síntesis enzimática y recuperación del dextranoFuente: (Bogdan 1997)

BIORREACTOR◦ Biorreactores son los tanques donde los sistemas, procesos y

organismos vivos llevan a cabo las transformaciones de la materia prima en productos de valor comercial . Los biorreactores deben dar , por lo tanto , las condiciones optimas para que tales conversiones se realicen con sus máximas tasas, sin duda alguna, se entiende el rol central que juega el biorreactor para que las industrias biotecnológicas sean exitosas. (Byong H.Lee ,1996)

Esquema de un fermentador tipo tanque agitado de escala industrial

◦H ~ 15 m de alto ◦D ~ 4,2 m de diámetro◦ Tiene líneas de vapor para

realizar la esterilización in situ de las válvulas, cañerías y sellos. Se debe esterilizar también el aire que ingresa por filtración o por calentamiento.

PURIFICACIÒN DE DEXTRANO

◦ Baudrit . V. 2012.El jugo del desecho de piña inoculado se incubó por 18 horas a 29 °C, sin agitación.

◦ Al finalizar el período de incubación se centrifugó por 30 minutos a 5000 rpm, para eliminar las células.

◦ Al sobrenadante se descartó y al precipitado blanco se le agregó agua hasta disolverlo, para iniciar el proceso de purificación.

◦ Se centrifuga de nuevo en las mismas condiciones y al sobrenadante se le agrega etanol (1/1 volumen). El dextrano obtenido se seca.

Factores que influyen ––pH del medio

• Rodríguez, O (2007) reporto que el valor de pH inicial del medio arrojó buenos resultados cerca de la neutralidad (6,5-7,0), similar a lo reportado con los medios a base de sacarosa comercial, donde el valor óptimo de crecimiento celular se encuentra en 6,9 la mayor producción de polímero sobre cada sustrato fue en promedio de 0,575 g/L ajustando el medio en un valor de 6,7.

Factores que influyen – temperatura del medio

◦Rodríguez, O (2007) reporto que a una temperatura de 25 °C se lograba una concentración promedio de polímero de 0,666 g/L y una concentración celular de 3,2 g/L. Es recomendable trabajar dentro de la zona óptima de crecimiento de L. mesenteroides (20-30 °C).

Factores que influyen ––Concentración del sustrato

◦Rodríguez, O (2007) .En cuanto a la concentración de sustrato en el medio, se obtuvo con cada sustrato un valor promedio de 0,402 g/L de polímero a una concentración de 30 g/L.

◦Se seleccionaron niveles entre la concentración mínima requerida por el microorganismo de acuerdo con la fase preliminar, ya que, aunque existió producción de dextrano en baja concentración, el crecimiento celular observado fue muy pobre, lo que se corroboró Salou.P (1994) y Smith.M (1998) .

◦La concentración máxima fue la de cada sustrato, para aprovechar sus propiedades. Los niveles y variables seleccionadas según los resultados obtenidos en esta etapa se describen en la tabla 2 .

Cuadro . Diseño Experimental

Fuente : Rodríguez, O (2007). OBTENCIÓN DE DEXTRANO Y FRUCTOSA, UTILIZANDO RESIDUOS AGROINDUSTRIALES CON LA CEPA Leuconostoc mesenteroides NRRL B512-F

Producción de dextranos –Proceso Convencional◦ Se inicio durante la segunda Guerra Mundial.◦ La producción de dextrano se incremento considerablemente .◦ Fracciones de peso molecular de alrededor de 75000 en

soluciones al 6% han sido empleadas como sustitutos de plasma en transfusiones sanguíneas (dextrano-clinico).

◦ Con una concentración de 100 g/l es posible obtener 25 g/l de dextrano .

Producción de dextranos –Proceso Convencional

◦ El pH inicialmente de 7 disminuye por acción del acido láctico producido hasta alcanzar valores inferiores a 5.0 al final del proceso .

◦ El proceso dura unas 16 horas y la temperatura se mantiene entre 26-29ºC .

◦ Terminado el proceso la dextrano es precipitado con metanol o etanol, previa eliminación de células.

Producción de dextranos –Proceso Convencional◦ Si se desea prepara dextrano clinica , se redisuelve al 5-6 % y

se hidroliza con HCL o H2SO4 (pH =1) en condiciones de temperatura y tiempo controlados para obtener el peso molecular deseado .

◦ Empleando una precipitación fraccionada , es posible obtener dextrano clínico con rendimientos del 38-40% con respecto a la dextrano nativa (Garibay.G,2004)

BIBLIOGRAFIA◦ Byong H.1996.Fundamentos de la Biotecnología de Alimentos.◦ Baudrit.V.2012 . Biosíntesis de dextranos de alto peso

molecular mediante la inoculación con Leuconostoc mesenteroides, var. mesenteroides (ATCC 10830) de jugos residuales de la agroindustria de la piña: síntesis y caracterización de hierro-dextranos.Rev.Uruguay.

◦ Rodríguez, O .2007. OBTENCIÓN DE DEXTRANO Y FRUCTOSA, UTILIZANDO RESIDUOS AGROINDUSTRIALES CON LA CEPA Leuconostoc mesenteroides NRRL B512-F.Rev.Nº 7.Colombia.

◦Garibay .G.2004.Biotecnologìa Alimentaria.Editorial Limusa.Mexico.

◦GRACIAS!!!!!!!! .