TP FAC AU CUBE DE L’UNIVERSITE DE GRENOBLE

•  Sujet : Modification des structures cellulaires au cours de la mitose marquages fluorescents

• Introduction :Le 16 mai 2011, nous sommes allés au CUBE de Grenoble. Et ce dans le but de découvrir d’une façon différente le phénomène de mitose déjà étudié en classe. Les cellules étudiées ici même sont des fibroblastes de souris. Nous voulons mettre en évidence l’organisation de la tubuline et celle des chromosomes dans la cellule en mitose comparativement à la cellule en interphase. Nous allons réaliser notre observation au microscope à fluorescence. C’est pour cela que nous allons faire des marquages fluorescents sur les lamelles fournies. C’est donc la technique d’immunofluorescence que nous allons mettre en œuvre. Cette technique consiste dans l’utilisation d’anticorps qui « reconnaissent » une protéine donnée (ici ce sera la tubuline). On excitera par la suite la préparation avec une lumière verte, dans ce cas, et la tubuline emmétra de la lumière rouge.

PROTOCOLE EXPERIMENTAL ET EXPLICATION :1/ incuber avec PBS_BSA 1%Cette solution a pour intérêt de permettre aux anticorps de se fixer comme il le faut sur la préparation. Et pas ailleurs ou sur les mauvaises protéines.2/Sur l’une des lamelles mettre de l’anticorps tubuline : Cela va permettre de marquer, par la suite, les protéines de tubuline.Sur l’autre lamelle mettre la solution contrôle : On va ainsi avoir un spot témoin. Ce sera une expérience témoin. On ne verra rien sur cette lamelle si le marquage est bien fait.3/Lavages au PBS : Tous les lavages, et ce jusqu’à la fin, vont servir à rendre la lamelle propre et prête pour mettre une autre solution et finir la préparation.4/ Solution révélatrice : Cette solution préparée à la dernière minute par la biologiste sert à mettre en évidence la fluorescence de la tubuline et de l’ADN.5/Recouvrir à l’aide de papier aluminium : Laissées à la lumière, on ne pourra plus observer de fluorescence. En effet tout l’effet de la solution révélatrice serait dissipé. C’est une des raisons pour lesquelles la biologiste fait cette préparation à la dernière minute.6/ Lavages : La raison est toujours la même.7/ Montage de la lamelle avec le bleu de Hoechst : Après avoir laissé sécher les lamelles on monte la lame avec du bleu de Hoechst pour que l’on puisse observer l’ADN. En effet cette molécule fluorescente va directement se fixer sur l’ADN.8/ On conserve à l’obscurité jusqu’à l’observer au microscope : En effet la lumière aurait un effet inhibiteur et on n’aurait plus de fluorescence lors de notre observation microscopique.

ACTIVITE INTEGREEEn attendant notre tour pour l’observation microscopique…

Tout d’abord nous devons connaître les conditions de culture des cellules :

• Une température voisine de 37°C• Il faut que les cellules soient dans un milieu riche en

nutriments : sucres (glucose), protéines (brique de fabrication = acides aminés) et des vitamines

• Il faut aussi un pH constant à 7,4, c’est la quantité de CO₂ qui régule ce pH.

• La concentration saline elle aussi doit être respectée.• Les biologistes fournissent des facteurs de

croissance,ils envoient des signaux de prolifération, on ajoute un « cocktail » sous forme de sérum de veau.

• On ajoute aussi des antibiotiques pour éviter la prolifération de bactéries.

• Et surtout, toutes les manipulations sont faites avec du matériel stérile à usage unique.

• Protocole : On prend des boites de pétris contenant des cellules en culture. On retire le milieu (liquide rose) et on rince avec du PBS. Puis on met de la trypsine EDTA. On observe directement au microscope. On retire la trypsine et on remet du milieu de culture. On observe au microscope.

Remarque : nous avons fait la remarque qu’en aspirant la trypsine on risque d’aspirer aussi les cellules car elles se sont détachées du fond de la boite. C’est pourquoi il ne faut pas enlever toute la trypsine.

Observation avant l’experience :

On voit bien que les cellules sont étendus . Elles s’accrochent au font de la boite de pétris.

Observation avec la trypsine :

On voit que les cellules on une forme ronde et elles bougent. On peut en conclure qu’elle se sont détachées du font de la boite à pétri.

Observation en remettant le milieu de culture :

Les cellules sont encore ronde mais quelques une commencent à se déformer. On en conclu que les cellules n’adhèrent pas encore au font de la boite.

Observation au microscope au grossissement x1000

Nous avons dans ce tableau la représentation photographiée et schématisée de l’interphase et des différentes étapes de la mitose. Nous avons réussi à reconnaître toutes ces photos grâce à nos connaissances acquises auparavant en cours.

Les molécules que nous avons marquées sont situées :Dans le noyau pour l’ADN, mais seulement pendant l’interphase car dès que la mitose commence, il y a désintégration de l’enveloppe nucléaire. Donc par la suite, la molécule d’ADN se retrouve dans le cytoplasme.Quant à la tubuline elle se trouve dans le cytoplasme pendant l’interphase. Pendant la mitose, tout se mélange, donc la tubuline est toujours dans le cytoplasme. Ce qui change c’est seulement l’organisation de cette tubuline.On peut distinguer une cellule en interphase par la seule structure de la tubuline en fils « d’araignée ». Alors que lorsqu’elle est en mitose elle est plus concentrée et se trouve aux pôles de la masse d’ADN.Pour observer nos lames nous utilisons un microscope à fluorescence. On joue entre la lumière verte et une autre lumière proche des UV, pour observer la fluorescence rouge de la tubuline et bleue de l’ADN.Pour que notre observation ne soit pas faussée nous nous trouvions dans une pièce dans laquelle nous avions fait le noir. Même lors de nos observations, nous n’oubliions pas de mettre le shuter pour limiter la « consommation » de la fluorescence. Et ce en attendant l’arrivée de la biologiste.

Photo Schéma Observation

InterprétationOn observe une masse bleue au centre. Tout autour de cette masse on distingue une substance filamenteuse. Puisque les fils sont en rouge, on peut dire que c’est de la tubuline. Or on sait que la tubuline est éparpillée dans la cellule pendant l’interphase seulement. C’est pourquoi, on peut affirmer que l’on est en présence d’une interphase.

On s’intéresse à la masse bleue située au bas à gauche. Elle est beaucoup plus condensée que les autres sur la photo. A un pôle de celle-ci, on remarque une zone rouge vif. On sait que lors de la mitose la chromatine se condense pour former les chromosomes. C’est exactement ce que l’on observe. Ainsi, on peut dire que la zone rouge au pôle correspond en fait à la formation d’un centriole du fuseau de tubuline. On est au tout début de cette formation : c’est donc la prophase.

On s’intéresse à la masse bleue indépendante. On observe deux zones rouges fluorescentes. Entre ces deux zones on a la conglomération de la zone bleue. Sur un plan que l’on peut qualifier d’équatorial. Les deux zones rouges sont en fait les extrémités du fuseau en tubuline. Or, on sait de notre cours en classe que lors de la métaphase, les chromosomes migrent à l’équateur de la cellule. Puisque c’est exactement le cas de figure qui nous est présenté ici.

On observe comme pour la photo précédente, deux zones rouges. Cependant cette fois- ci on arrive à distinguer deus masses bleues qui se détachent en formant des V symétriques. On a là la séparation du matériel chromosomique en deux « paquets » égaux. Ce n’est pas tout à fait la télophase puisque l’on ne distingue pas encore la formation de deux cellules bien distinctes.

On s’intéresse aux deux masses bleues qui sont encore reliées entre elles. Elles forment une sorte de grande cellule en forme de Huit. Cette forme de huit nous rappelle le phénomène d’étranglement caractéristique de la cellule animale lors de la télophase (à la fin). On a donc deux cellules qui sont en train de se former. C’est donc sans aucun doute que l’on peut affirmer que c’est une télophase.

ConclusionDans une cellule en interphase l’ADN est concentré au niveau du noyau et la tubuline est répartie dans le cytoplasme. Lors de la prophase les molécules d’ADN se condensent au centre de la cellule et la tubuline commence à former le fuseau. Puis pendant la métaphase la tubuline forme le fuseau est les chromosomes s’y fixent et s’alignent au niveau de l’équateur. Ensuite lors de l’anaphase les chromosomes sont séparés et chaque chromatide est emporté d’un coté de la cellule par la tubuline. Enfin pendant la télophase la cellule mère se séparent, les molécules d’ADN se décondensent et le fuseau commence à se désorganiser, la tubuline s’éparpille dans la cellule en formation.

CommentairesCe TP, outre son caractère scientifique, nous a permis de réaliser nous-mêmes certaines photos que l’on ne voyait que dans nos livres. En plus nous avons pu manipuler du matériel sophistiqué. Prenons par exemple les deux microscopes que nous avons utilisé (grossissement x1000 par exemple). Nous avons pu aussi découvrir les salles de TP à la Fac et nous avons eu un petit aperçu du métier de chercheur.

Fin